Eletroforese em gel diferencial
(Difference gel electrophoresis -DIGE)
José Maurício Maciel Cavalcante
PPGCV-UECE
Eletroforese em gel diferencial
(Difference gel electrophoresis -DIGE)
É uma metodologia de eletroforese (2D) onde é utilizado até três diferentes
amostras de proteínas marcadas com corantes fluorescentes (Ex.: Cy3, Cy5,
Cy2) antes da eletroforese 2D. Após a corrida eletroforética, o gel é
escaneado com o comprimento de onda de excitação de cada corante um
após o outro. É utilizado para observação de mudanças no perfil proteico
entre amostras.
Ex: Perfil de proteínas de pacientes saudáveis e doentes.
Vantagem sobre a eletroforese 2D tradicional:
- Evita diferenças do perfil eletroforético devido à variações entre géis
- Consome menos tempo
Eletroforese em gel diferencial
(Difference gel electrophoresis -DIGE)
CyDye
Família cianinas (corantes sintéticos)
Três corantes com diferentes
comprimentos de onda de excitação e
emissão:
Cy2,Cy3 e Cy5
Eletroforese em gel diferencial
(Difference gel electrophoresis -DIGE)
Eletroforese em gel diferencial
(Difference gel electrophoresis -DIGE)
Eletroforese em gel diferencial
(Difference gel electrophoresis -DIGE)
Marcação mínima (minimum labelling)
Corante ligado à N-hidroxi-succinimidila (NHS)
Ligação covalente ao resíduo de lisina da proteína
Eletroforese em gel diferencial
(Difference gel electrophoresis -DIGE)
Marcação mínima (minimum labelling)
• Marcação de 1-2% das proteínas disponíveis e
 apenas uma única lisina/proteína é marcada (“um corante por proteína”)
• Carga da lisina  carga do CyDye: pI da proteína não é alterado.
• Corante x PM das proteínas marcadas
 proteínas de baixa massa molecular
• Pode ser utilizado para espectrometria de massa
• Alta sensibilidade: detecta até 125 pg de proteína
Eletroforese em gel diferencial
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Marcação por saturação (saturation labelling)
• Apenas Cy3 e Cy5 podem ser modificados para técnica
• Usado para pequenas quantidades de proteína 5 µg
• Corantes ligados à maleimida
 ligação covalente ao grupo tiol dos resíduos de cisteína
Todos os resíduos de cisteína são marcadas
• Corantes possuem carga elétrica neutra,
 não altera pI das proteínas
Eletroforese em gel diferencial
(Difference gel electrophoresis -DIGE)
Observações sobre a preparação das amostras
- Anfólitos e DTT – competem com a ligação do marcador com a lisina
Não podem estar presentes antes da reação
- pH 8,5 – Maior eficiência para marcação
- [proteína]: 1–10 mg/ml (ótimo 5 mg/ml)
Eletroforese em gel diferencial
(Difference gel electrophoresis -DIGE)
Observações sobre a preparação das amostras
- 1 μl sol. de trabalho (400 pmol) em vol. de amostra com 50 μg de proteína
- Homogenização (vortex)
- Centrifugação (sobrenadante)
- Incubação em gelo 30 min no escuro
Obs: pode ser processada imediatamente ou armazenada -70oC/ 3 meses
Eletroforese: placas de vidro de baixa fluorescência
Eletroforese em gel diferencial
(Difference gel electrophoresis -DIGE)
Uso do padrão interno
- Utilizado para eliminar a variação entre géis com uso da técnica DIGE
(experimentos multi-amostra).
- Uso de um pool das alíquotas proteicas
- Utilizado em todos os géis DIGE
- Permite medir a quantidade de proteína de cada amostra em relação ao
padrão interno
- Possibilita <10% de variação no nível de expressão proteica, com 95% de
confiança
Eletroforese em gel diferencial
(Difference gel electrophoresis -DIGE)
Gel
Cy2
Cy3
Cy5
1
Pooled internal
standard
Control 1
Sample A1
2
Pooled internal
standard
Sample B2
Control 2
3
Pooled internal
standard
Control 3
Sample B1
4
Pooled internal
standard
Sample B3
Sample A3
5
Pooled internal
standard
Sample B4
Sample A4
6
Pooled internal
standard
Sample A2
Control 4
Exemplo de desenho experimental com DIGE com um controle
(Control) e três tratamentos (A,B,C), cada um com três repetições
(1,2,3)
Eletroforese em gel diferencial
(Difference gel electrophoresis -DIGE)
Eletroforese em gel diferencial
(Difference gel electrophoresis -DIGE)
Digitalização das imagens
Typhoon 9400 (GE Helthcare)
Autoradiografia
Fluorescência excitação azul (457, 488 nm) (Cy2)
Fluorescência excitação verde (532 nm)(Cy3)
Fluorescência excitação vermelho(633 nm) (Cy5)
Quimoluminescência
Eletroforese em gel diferencial
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Software para a análise de experimentos com DIGE
DeCyder (v7.0 - GE Healthcare)
- Análise diferencial in-gel
- Análise de variação biológica
(entre geis)
- Módulo de análise estatística
- Remoção de artefatos
- Subtração background
Plataforma: R$124.195,40
Obrigado!