Amplificação (clonagem) dos
genes e seu armazenamento
• Sistemas celulares-> bactérias, vírus, células
eucarióticas;
• Sistemas acelulares-> Reação em cadeia da
polimerase (PCR)
Reação em cadeia da polimerase
(PCR)
• 1985- Kary Mullis inventou a reação em cadeia
da polimerase (PCR) durante uma viagem de
carro ao longo da costa da Califórnia. Sua ideia
foi a concepção de uma técnica genial,
relativamente simples, que funciona como
complemento perfeito para a clonagem
gênica.
• Novas
disciplinas
surgiram
como
consequência direta da invenção da PCRecologia molecular, arqueologia biomolecular,
ciência forense.
Reação em cadeia da polimerase
(PCR)
Reação em cadeia da polimerase
(PCR)
Bibliotecas Genômicas
e de cDNA
Departamento de Biologia Celular e Molecular
Bibliotecas
São coleções de sequencias de DNA usadas
para armazenar informação-> coleção de
genes recombinantes.
Ex. de usos:
• isolamento de um gene específico;
• sequenciamento;
• clonagem;
• identificação de genes em diferentes
especies;
• análise de proteínas relacionadas;
Etc...
Tipos de Bibliotecas:
Biblioteca Genômica : uma coleção de clones
de DNA representando o genoma de um
organismo
Biblioteca de cDNA : coleção de clones com
insertos de DNA complementar (cDNA)
sintetizada a partir de moleculas de mRNA de
uma célula
Fontes de DNA para a Biblioteca
• DNA Genomico : o DNA genômico é cortado e pequenos pedaços são clonados.
Vantagem : todo o genoma é cortado e clonado em pequenos pedaços - pega toda a
sequencia.
Desvantagem : vem um monte de lixo.
Dois métodos:
• 1. fragmentação randômica do DNA em pequenos pedaços que são
ligados a oligonucleotídeos, as pontas contêm sítios de restrição.
• 2. Fragmentos parcialmente digeridos com enzima de restrição. Pode
variar o tempo de digestão ou quantidade de enzima.
•
cDNA : DNA sintetizado a partir do mRNA com a transcriptase reversa.
Vantagem : somente os genes expressos são selecionados.
Desvantagem : não é possivel selecionar sequencias de controle ou íntrons e
frequentemente dependem do nível de expressão gênica.
Biblioteca genômica como fazer?
Acompanhamento da Reação: visualização em
eletroforese em gel de agarose
• Variando o tempo de digestão
ou quantidade de enzima
Biblioteca genômica
Biblioteca genômica
Biblioteca de cDNA
Biblioteca de cDNA
Síntese de
cDNA
•oligo-dT anela na cauda
poly-A.
• Síntese da primeira fita
de DNA a partir do mRNA
em presença da
transcriptase reversa
Síntese de cDNA
•Remoção da fita original de RNA
com:
Calor, alcali ou RNAse H.
•Formação de grampo na
extremidade 3’ e extensão do
grampo com DNA polimerase
•S1 nuclease (que corta bases não
pareadas)
•Ligação de linkers com DNA ligase e
clonagem em um vetor.
Vetores de clonagem
Vetores
• São usados para amplificar uma molécula de DNA . O
DNA tem que ser inserido em um vetor de clonagem.
• Um plasmídio tem uma origem de replicação e é capaz
de replicar em bactérias.
• Os vetores são geneticamente modificados gerando:
- Plasmídeos;
- Fagos;
- Cosmídeos
- BAC’s e
- YAC’s
Vetores para bibliotecas de DNA
Plasmideos
• Plasmideos são circulares,
dupla fita e encontrados em
bactérias.
•
Podem replicar idependentemente podendo ter
de poucas bases a 100 Kb.
•
Pode carrear fragmentos de até 10 kb
•
Plasmideos tem uma origem de replicação,
marcador de seleção e sitios de restrição.
•
Após cultivo o clone pode ser recuperado
facilmente após a lise das celulas e o
fragmento de DNA ou mantido indefinitamente
em glicerol a –70 0C.
Biblioteca genômica: Bacteriofago
λ (Lambda)
• Para clonar insertos de 10 a 20 Kb
• Bibiotecas em plasmídeos
comportam insertos de até 10 Kb
O genoma do Bacteriofago λ
Biblioteca Genômica: Bacteriofago λ
Biblioteca de Cosmideo
Permite a clonagem de
fragmentos de até 45 kb
BACs: Bacterial Artificial Chromosomes
• Baseado no
bacteriofago P1, o
Plasmideo F e a região lacZ
do plasmideo pUC
• É um plasmideo com
baixo número de cópias
• Permite fragmentos
de 50-300kb
YACs:Yeast Artificial Chromosomes
Permite insertos de até 500 kbs
YACs replicam como plasmideos em
bacterias quando sem inserto de DNA.
Assim que os fragmentos são inseridos,
YACs são transferidos para células, e
replicam como cromossomos eucarióticos
Triagem dos clones
de interesse
Triagem do Clone Recombinante
Biblioteca de Bacteriofagos ou plasmideos
Plaqueamento da Biblioteca
Triagem por:
Sondagem por Hibridização
Sondagem Imunológica
Hibridização
• O DNA em fita simples pode parear com outro DNA
ou RNA desde que este possua região complementar.
• Técnicas que aplicam a hibridização:
– Southern blot: DNA digerido por enzima de restrição é
separado em um e de eletroforese
– Northern blot: usa RNA no gel ao invés do DNA
– Hibridização in situ : usando um tecido
– Hibridização de colonias : detecção de clones
Processo de hibridização
• O DNA é aquecido a alta temperatura ou em
presença de NaOH e desnatura. As fitas
complementares a sonda anelam. Após
lavagem somente as sondas ligadas ficam.
• Estringência: Qual a necessidade de
homologia perfeita para que as fitas se
mantenham ligadas?
DEPENDE DA ESTRINGENCIA
Em BAIXA concentração de sal
ALTA temperatura (Depende da quantidade de
GC)
MAIOR a necessidade de complementariedade.
• Autorradiografia. Sonda marcada
impressiona o filme de raioX.
Processo de hibridização
Processo de hibridização
Hibridização com sonda radioativa
Hibridização com sonda não
radioativa
Hibridização com sonda não
radioativa
Sondagem imunológica
Sondagem imunológica
Southern hybridization (DNA)
Triando uma Biblioteca: Hibridização de colônias
Hibridização de Colônias
A sonda pode ser sintetizada?
Triagem de biblioteca Genômica:
II.Colônia Imunoensaio
A sonda é um anticorpo, as colônias são crescidas e a proteína
recombinante é expressa
Triando uma Biblioteca Genômica:
II.Colônia Imunoensaio
A quimioluminescencia também irá impressionar o filme de raio-X
Biblioteca Genomica: Bacteriofago λ
Plaques - Bacteriofago λ
Triando uma biblioteca de fago λ
• Fagos recombinantes inseridos em
bactérias são plaqueados resultando
na formação de plaques;
• As partículas de fagos e o genoma
do fago são transferidos para um
filtro de nitrocelulose;
• O filtro é incubado com uma sonda
radioativa para um determinado gene;
• Fago com o gene de interesse é
identificado por autoradiografia e este
clone pode ser isolado e inoculado em
um novo hospedeiro para mais uma amplificação.