Técnicas de Biologia Molecular
em microbiologia Clínica
Prof.Doutor José Cabeda
Quantificação e caracterização de
ácidos nucleicos
Espectrofotometria
 Electroforese
 Revelação dos ácidos nucleicos
 Fotografia
 Sistemas computadorizados de aquisição de imagem
 Quantificação de bandas em geis
 Reacções de restrição
 Sistemas R/M
 Montar uma reacção de restrição

Espectrofotometria
 Lei

de Bert-Lambert
C=eA
 max
 L=1
cm
 A(suporte)
 A(solvente)
Espectrofotometria

Lei de Bert-Lambert

C=eA
 max
 L=1
cm
 A(suporte)
 A(solvente)
Espectofotometria
Espectrofotometria

Lei de Bert-Lambert

C=eA
 max
 L=1
cm
 A(suporte)
 A(solvente)
 A(contaminantes)
Quantificação de DNA
max=260 nm
 max(proteínas) =280 nm
 ref =320 nm
 Concentração = f(OD260). Se L=1cm:






dsDNA 1OD=50µg/ml
ssDNA 1OD=40µg/ml
ssRNA 1OD=40µg/ml
Oligos 1OD=20µg/ml (varia muito com a sequência)
  ( 260) 
.Pureza  f 

  ( 280) 


Quantificação e caracterização de
ácidos nucleicos
Espectrofotometria
 Electroforese
 Revelação dos ácidos nucleicos
 Fotografia
 Sistemas computadorizados de aquisição de imagem
 Quantificação de bandas em geis
 Reacções de restrição
 Sistemas R/M
 Montar uma reacção de restrição

Fazer um gel de
agarose
Electroforese
ELECTROFORESE
 V=IR
 P=I2R

A resistência é inversamente proporcional á secção e á
força iónica da solução
TIPOS DE GEIS

Agarose (TAE e TBE)






Seakam
Nusieve
Nusieve 3:1
outras (LMP, HGT, etc)
formamida como desnaturante
Acrilamida


Acrilamida/bisacrilamida /TEMED
/peróxido de amónio
SDS como desnaturante


Horizontais
Verticais
Electroforese em campo pulsado
(PFGE)
Electroforese Capilar
Electroforese em capilares de pequeno
diâmetro (cerca de 50 µm de diâmetro
interno)
 Utiliza campos eléctricos muito elevados
(20-30 kV), já que os capilares dissipam o
calor com muita eficiência
 Separações muito boas, num período de
tempo inferior.

Electroforese Capilar (II)

Fluxo Electro-osmótico (FEO):
 A superfície do capilar de vidro-silica contém grupos
funcionais carregados negativamente, os quais atraem iões
carregados positivamente. Estes iões migram para o pólo
negativo, carregando consigo moléculas do solvente.
 Moléculas neutras viajam á velocidade do FEO
 Moléculas positivas são mais rápidas que o FEO
 Moléculas negativas são mais lentas que o FEO
 todas as moléculas migram para o pólo negativo (com
velocidade que depende da sua carga e do seu peso
molecular), onde podem ser detectadas com o mesmo tipo de
aparelhagem utilizado em HPLC.
Electroforese capilar (III)
Quantificação e caracterização de
ácidos nucleicos
Espectrofotometria
 Electroforese
 Revelação dos ácidos nucleicos
 Fotografia
 Sistemas computadorizados de aquisição de imagem
 Quantificação de bandas em geis
 Reacções de restrição
 Sistemas R/M
 Montar uma reacção de restrição




REVELAÇÃO DOS ÁCIDOS
NUCLEICOS
Brometo de etidio e análogos
Radioactividade
 32P e 33P
 35S
 125I
 14C
 3H
 Tempos de exposição
 Cassetes com e sem ecran repetidor
 Necessidade de secagem dos geis
Nitrato de prata
Marcação de sondas

Radio-isótopos
32
 P
 33P
 35S
 3H
 14C
 125I
Marcação de sondas
Digoxigenina
 Biotina


detecção directa da cadeia dupla
Enzimas para a marcação de
sondas
Polimerases
 Actividade exonucleolitica
 Temp. optima
 estabilidade térmica
 TdT

Tipos de sondas
Oligonucleótidos
 inserts de plasmideos
 prod. de PCR

Quantificação e caracterização de
ácidos nucleicos
Espectrofotometria
 Electroforese
 Revelação dos ácidos nucleicos
 Fotografia
 Sistemas computadorizados de aquisição de imagem
 Quantificação de bandas em geis
 Reacções de restrição
 Sistemas R/M
 Montar uma reacção de restrição

Fotografia
FOTOGRAFIA
Abertura do diafragma
 Tempo de exposição
 Focagem e profundidade de foco
 Filtros necessários
 Tipos de fotos Polaroid
 Sistemas alternativos

Quantificação e caracterização de
ácidos nucleicos
Espectrofotometria
 Electroforese
 Revelação dos ácidos nucleicos
 Fotografia
 Sistemas computadorizados de aquisição de imagem
 Quantificação de bandas em geis
 Reacções de restrição
 Sistemas R/M
 Montar uma reacção de restrição

Aquisição computorizada de
imagens de geis
Quantificação e caracterização de
ácidos nucleicos
Espectrofotometria
 Electroforese
 Revelação dos ácidos nucleicos
 Fotografia
 Sistemas computadorizados de aquisição de imagem
 Quantificação de bandas em geis
 Reacções de restrição
 Sistemas R/M
 Montar uma reacção de restrição

Integração de histogramas
Quantificação e caracterização de
ácidos nucleicos
Espectrofotometria
 Electroforese
 Revelação dos ácidos nucleicos
 Fotografia
 Sistemas computadorizados de aquisição de imagem
 Quantificação de bandas em geis
 Reacções de restrição
 Sistemas R/M
 Montar uma reacção de restrição

Reacção de restrição
SISTEMAS R-M

Protecção contra DNA estranho

TIPO I: pouco frequentes (1%)
TIPO II: (93% das enzimas)

reconhecem sequencias simétricas cortando
entre as sequencias
 As endonucleases requerem Mg2+ e as
metiltransferases requerem sadenosylmetionina
 endonucleases compostas por um homodimero
 metiltransferases compostas por monomero

SISTEMAS R-M

TIPO IIs:
como as Iis, mas com sequencias de
reconhecimento assimétricas e interrompidas
 local de corte a até 20 nucleótidos da sequência
reconhecida
 Metilação efectuada po 2 metilases (uma para
cada cadeia, podendo ser metiladas bases
diferentes em cada cadeia)



TIPO III: pouco frequentes (<1%)
TIPO IV: as restantes
MONTAR UMA
REACÇÃO DE RESTRIÇÃO




Instabilidade térmica
Concentração de glicerol
Tampão de reacção
Actividade enzimática:
 1UI digere 1µg de DNA em 50µl em uma hora
 conformação e pureza do DNA
 utilizar 2-3 x mais enzima
 volume total > 50µl
 Homogeneizar por pipetagem
 Verificar a temperatur de reacção
Genética Molecular
em Medicina Transfusional
Técnicas de estudo de mutações
desconhecidas
Prof.Doutor José Cabeda
Técnicas de estudo de mutações
desconhecidas


Métodos Baseados No Tm
 Melting Profiles and GC clamps
 DGGE
• Perpendicular
• Paralelo
 CDGE
 TTGE
Métodos Baseados na conformação
 SSCP
 HA
 CSGE
“Melting Profiles”





Vários domínios de fusão
As moléculas de DNA fundem por etapas
Moléculas parcialmente fundidas migram mais devagar no gel
Moléculas totalmente fundidas migram de acordo com o seu Pm
Podem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão total
Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis (DGGE)


Gradiente de desnaturação
 Químico
 Temperatura
O gradiente pode ser:
 Perpendicular ao
campo eléctrico
 Paralelo ao campo
eléctrico
Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis (DGGE)
heteroduplexes
homoduplexes
Constant Denaturing Gel
Electrophoresis (CDGE)
Temporal Temperature Gradient
Gel Electrophoresis (TTGE)



Não existe um gradiente no gel,
em cada momento da corrida
Existe uma temperatura
crescente ao longo da corrida
Em cada momento, a migração
em cada molécula depende de
esta já ter atingido ou não
algum domínio de fusão
Temporal Temperature Gradient
Gel Electrophoresis (TTGE)
Vantagens


Mais fácil de fazer os
geis
Mais reprodutível de
gel para gel
Desvantagens

Mais difícil de acertar
a gama de Tm
Métodos baseados na
conformação


Conformação do dsDNA
 não depende da sequência
 A conformação de homodupletos é diferente da
dos heterodupletos
 A conformação dos heterodupletos depende da
sequencia de “mismatch”
Conformação do ssDNA
 depende da sequência (forma zonas de dupleto
intramolécular, dependentes da sequência)
Single Strand Conformation
Polimorfism (SSCP)





dsDNA é desnaturado
dsDNA é diluido
Renaturação rápida
Corrida em condições semidesnaturantes e a temperaturas
fixas
Resultado depende muito de:
 Temperatura de corrida
 Concentração de
desnaturante
 Presença de certos
químicos (ex: glicerol, etc)
WT1
mutantes
WT2
Heteroduplex Analysis (HA)



Heterodupletos causam
 Distorção na conformação
 Migração no gel mais lenta
Heterodupletos podem existir por:
 Co-amplificação por PCR de heterozigotos
 Introdução de DNA WT e M no mesmo PCR
Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e
WT+M
Heteroduplex Analysis (HA)
Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp)
 Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou
DEM) aumenta a sensibilidade da HA
 A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente
semi-desnaturante que aumenta a resolução do
HA

Conformation Sensitive Gel
Electrophoresis


Principio:
 Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a
capacidade de mutações pontuais produzirem alterações
conformacionais.
Método:
 Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina
e 100% PEG e 15% formamida (desnatirante)
 Pode utilizar-se BAP ou PDA como “crosslinker”,
aumentando a força do gel e tamanho dos seus poros
 Utilizar fragmentos com 300-800 bp
Hibridização
desnaturar
Hibridização
Adicionar sonda
Hibridização
Hibridização
Adicionar substracto
Dot-Blot
Variações
Hibridização em microplaca
 hibridização reversa

DEIA
(hibridização reversa em microplaca)
(detecção com anti-dsDNA)
Inno-Lippa
Hibridização em filtro
 Várias sondas por filtro dispostas em tiras
(tipo código de barras)
 Hibridização reversa
 Marcação no produto do PCR

Resultados do INNO-LIPA
MEIA
Southern
Blot
Northern Blot

Semelhante ao Southern
 Utiliza RNA e não DNA
 Não utiliza reacções de restrição