FIBROSE CÍSTICA:
ESTUDO DAS
VARIAÇÕES DE
SEQUÊNCIA DO
GENE CFTR NA
POPULAÇÃO
PEDIÁTRICA
PORTUGUESA
Liliana Cristina Santos Gonçalves
Mestrado em Biologia Celular e Molecular
Departamento de Biologia – Faculdade de Ciências
Universidade do Porto
2013
Orientador
Ana Grangeia, PhD
Faculdade de Medicina – Universidade do Porto
Coorientador
Filipa Carvalho, PhD
Faculdade de Medicina – Universidade do Porto
FCUP
II
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
Todas as correções determinadas
pelo júri, e só essas, foram efetuadas.
O Presidente do Júri,
Porto, ______/______/_________
FCUP
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FACULDADE DE CIÊNCIAS – UNIVERSIDADE DO PORTO
MESTRADO EM BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO
GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
Liliana Cristina Santos Gonçalves
Dissertação submetida à Faculdade de
Ciências da Universidade do Porto como
requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Biologia Celular e Molecular
Orientador – Doutora Ana Grangeia
Docente Voluntária
Departamento de Genética
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Coorientador – Prof. Doutora Filipa Carvalho
Professora Auxiliar com Agregação
Departamento de Genética
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
PORTO
2013
III
FCUP
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"Sejam quais forem os resultados com êxito ou não,
o importante é que no final cada um possa dizer: 'fiz o que pude'."
Louis Pasteur
IV
FCUP
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AGRADECIMENTOS
Ao terminar mais esta etapa do meu percurso académico, não posso deixar de
agradecer a todos aqueles que contribuíram para a realização desta dissertação de
mestrado, em especial:
Ao Professor José Pissarra, Diretor do Mestrado em Biologia Celular e
Molecular, pelo trabalho efetuado nestes 2 anos de vida inicial do mestrado, sem
dúvida complicados. Obrigado também ao corpo docente do mestrado por todos os
ensinamentos transmitidos.
Ao Professor Doutor Alberto Barros, Diretor do Departamento de Genética da
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto, pela disponibilização de todos os
equipamentos e materiais necessários para a realização deste trabalho.
À Doutora Ana Grangeia, orientadora desta dissertação, pela orientação
científica, apoio e disponibilidade. Por me incentivar a apresentar o meu trabalho em
inglês e não me deixar desistir. Obrigado pela amizade, pela confiança e carinho
durante esta minha estadia. És um grande exemplo para mim.
À Professora Doutora Filipa Carvalho, co-orientadora desta dissertação, pela
oportunidade que me deu, por acreditar na minha capacidade e por toda a orientação
científica, apoio disponibilizado e exemplo de trabalho transmitido durante esta
passagem pelo departamento.
A todos os elementos do Departamento de Genética, em especial à equipa da
genética molecular, pela ajuda e esclarecimento de muitas dúvidas que foram surgindo
durante este tempo.
Aos meus colegas de mestrado, por todos os momentos de alegria,
companheirismo, estudo e trabalho que passamos. Iremos ser sempre os primeiros
mestres em BCM no Porto.
À Marta, Ana Paula, Tânia, Pedro e Francisco. Obrigado pelas pessoas que são
e por todos os momentos que vivemos e iremos com certeza continuar a viver. Cada
um à sua maneira, contribuíram muito para a minha vida durante este ciclo. Sois uns
queridos!
V
FCUP
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À Raquel, companheira inseparável desta jornada pelo Departamento de
Genética, por toda a ajuda laboral. Obrigado pela amizade, pela paciência e por todos
os momentos vividos e outros tantos por viver. Sem dúvida que as tuas palavras foram
muito importantes para mim durante os tempos bons e menos bons e serão sempre
recordadas. És uma sweet!
A todos os meus amigos, em especial ao Pedro e a todos os outros que
achavam que os PCRs nunca mais tinham fim, pela amizade, carinho e apoio
demonstrado ao longo deste tempo.
À Inês, longe mas sempre presente nos momentos cruciais. Obrigado por toda a
tua amizade ao longo destes anos e por todas as sábias palavras de carinho e apoio
nos momentos mais complicados.
À Sara, a minha irmã de coração, por estar sempre ao meu lado em todos os
momentos da vida, dando-me aquela forcinha para chegar mais além. Obrigado por
todas as palavras, carinhos e puxões de orelhas. Obrigado por seres a pessoa que és!
Aos meus pais e ao meu irmão, por todo o apoio e carinho que sempre tiveram
para comigo, nos bons momentos e principalmente nos maus, por toda a formação
que me proporcionaram e pelo seu apoio em todas as decisões que fui tomando ao
longo desta vida.
A TODOS um sincero OBRIGADO!
VI
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
ÍNDICE
Agradecimentos………………………………………………………………………………..V
Índice…………………………………………………………………………………………..VII
Lista de Figuras………………………………………………………………………………..IX
Lista de Tabelas……………………………………………………………………………….XI
Lista de Abreviaturas…………………………………………………………………………XII
Resumo………………………………………………………………………………………….1
Abstract………………………………………………………………………………………….3
1.
Introdução............................................................................................................ 6
1.1.
Fibrose Cística ......................................................................................... 6
1.1.1. Perspetiva Histórica ......................................................................... 6
1.1.2. Incidência ......................................................................................... 7
1.1.3. Manifestações Clínicas..................................................................... 9
1.1.4. FC Clássica .................................................................................... 11
1.1.5. CFTR-Related Disorders (CFTR-RD) ............................................. 11
1.2.
Gene CFTR ............................................................................................ 12
1.2.1. Identificação ................................................................................... 12
1.2.2. Estrutura e Organização................................................................. 13
1.2.3. Espetro de Mutações ..................................................................... 14
1.2.4. Classes das Mutações CFTR ......................................................... 15
1.2.5. Polimorfismos CFTR ...................................................................... 18
1.2.6. Alelos Complexos........................................................................... 19
1.2.7. Correlação Genótipo-Fenótipo ....................................................... 20
1.3.
Proteína CFTR ....................................................................................... 23
1.3.1. Classe, Estrutura e Função ............................................................ 23
1.4.
Diagnóstico e Rastreio de FC ................................................................. 24
1.4.1. Teste do Suor ................................................................................. 25
1.4.2. Diferença de Potencial Nasal ......................................................... 25
VII
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
1.4.3. Análise do Gene CFTR .................................................................. 25
1.4.4. Rastreio Neonatal........................................................................... 26
1.5.
Tratamento e Novas Terapias ................................................................ 27
2.
Objetivos ........................................................................................................... 30
3.
Materiais e Métodos .......................................................................................... 32
3.1.
Amostras ................................................................................................ 32
3.2.
Extração de ADN.................................................................................... 32
3.3.
Quantificação de ADN ............................................................................ 32
3.4.
Análise Completa da Sequência do Gene CFTR .................................... 32
3.4.1. Polymerase Chain Reaction (PCR) ................................................ 33
3.4.2. Eletroforese Capilar ........................................................................ 36
3.4.3. Purificação ..................................................................................... 37
3.4.4. Reação de Sequenciação .............................................................. 37
3.4.5. Precipitação ................................................................................... 38
3.4.6. Sequenciação ................................................................................ 39
3.5.
4.
Análise Bioinformática das Sequências .................................................. 39
Resultados......................................................................................................... 41
4.1.
Variações de Sequência CFTR .............................................................. 42
4.2.
Genótipos CFTR .................................................................................... 46
5.
Discussão e Conclusão ..................................................................................... 49
6.
Bibliografia ......................................................................................................... 55
Anexos…………………………………………………………………………………………61
VIII
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Número de pessoas com FC. O número de adultos com FC é
crescente, em relação ao número de crianças. Os dados mostram que atualmente
existem mais pessoas com FC em idade adulta. Em 2001, a pessoa mais velha com
FC tinha 74 anos de idade, enquanto em 2011, a pessoa mais velha tinha 81 anos.
Adaptado de (Cystic Fibrosis Fundation, 2012)............................................................. 6
Figura 2 – Incidência mundial da FC. Adaptado de (WHO, 2004). ...................... 8
Figura 3 - Idade média de sobrevida de doentes com FC. Adaptado de (Cystic
Fibrosis Fundation, 2012). .......................................................................................... 11
Figura 4 – Representação esquemática do gene e da proteína CFTR. O gene
CFTR é transcrito num ARN mensageiro de 6.5 kb que por sua vez é traduzido numa
proteína com 1480 aminoácidos que se localiza na membrana apical das células
epiteliais. Adaptado de (Tsui & Durie, 1997). .............................................................. 13
Figura 5 – Mecanismos mutacionais que alteram o normal funcionamento da
proteína CFTR. Adaptado de (Lubamba et al., 2012).................................................. 18
Figura 6 – Representação esquemática da proteína CFTR. Adaptado de (Prasad
et al., 2010)................................................................................................................. 24
Figura 7 – Processo de separação das amostras e resultados. Adaptado de
http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Automated-Solutions/Detection-andAnalysis/QIAxcel-Advanced-System#orderinginformation (Qiagen, 2013). ................. 36
Figura 8 – Esquema do processo de purificação: 1. Reação de PCR; 2. Ligação
das partículas magnéticas aos amplicões; 3. Separação dos amplicões ligados às
partículas magnéticas dos restantes contaminantes; 4. Lavagem dos amplicões com
etanol; 5. Eluição dos amplicões; 6. Transferência dos amplicões purificados para um
novo tubo. Adaptado de https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/research-anddiscovery/products-and-services/nucleic-acid-sample-preparation/agencourt-ampurexp-pcr-purification/index.htm (Beckman Coulter, 2013a). ............................................ 37
Figura 9 – Esquema do processo de precipitação: 1. Adição do reagente
Agencourt CleanSEQ e etanol aos produtos de sequenciação; 2. Ligação das
partículas magnéticas aos produtos de sequenciação; 3. Separação dos produtos de
sequenciação dos contaminantes; 4. Lavagem com etanol; 5. Eluição dos produtos de
sequenciação; 6. Transferência dos produtos precipitados para um novo tubo.
Adaptado
de
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/research-and-
IX
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
discovery/products-and-services/nucleic-acid-sample-preparation/agencourt-cleanseqdye-terminator-removal/index.htm (Beckman Coulter, 2013b). ................................... 38
Figura 10 – Imagem virtual de um gel correspondente à amplificação dos 27
exões do gene CFTR de uma amostra em estudo. As duas bandas observadas para o
exão 6b e para o exão 10 correspondem à variação de sequência c.744-31TTGA[3_7]
e à mutação F508del, respetivamente. ....................................................................... 41
Figura 11 – Sequência forward do exão 1 e respetivas regiões intrónicas. O
exão 1 começa no codão ATG (codão de iniciação – Metionina) e termina em CAG. . 42
X
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
LISTA DE TABELAS
Tabela I – Incidência Mundial da FC. .................................................................. 8
Tabela II – Manifestações clínicas da FC. ......................................................... 10
Tabela III – Diferentes classes de mutações do gene CFTR. ............................ 16
Tabela IV – Correlações genótipo-fenótipo CFTR. ............................................ 21
Tabela V – Critérios de diagnóstico da FC. ....................................................... 24
Tabela VI – Componentes da PCR.................................................................... 33
Tabela VII – Condições da PCR. ....................................................................... 33
Tabela VIII – Componentes da PCR com Type-it. ............................................. 34
Tabela IX – Condições da PCR com Type-it. .................................................... 34
Tabela X – Primers utilizados na amplificação dos exões do gene CFTR. ........ 35
Tabela XI – Componentes da reação de sequenciação..................................... 37
Tabela XII – Condições da reação de sequenciação. ........................................ 38
Tabela XIII – Frequências genotípicas e alélicas das variações de sequência
detetadas nas 194 amostras em estudo. .................................................................... 44
Tabela XIV – Genótipos dos quarenta e três indivíduos heterozigóticos para uma
ou duas variações de sequência no gene CFTR......................................................... 46
XI
FCUP
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LISTA DE ABREVIATURAS
ABC
ATP-Binding Cassete
ACMG
American College of Medical Genetics
ACOG
American College of Obstetricians and Gynecologists
ADN
Ácido desoxirribonucleico
ATP
Adenosine Triphosphate
BLAST
Basic Local Alignment Search Tool
CBAVD
Congenital Bilateral Absence of Vas Deferens
CFTR
Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator
CFTR1
Cystic Fibrosis Mutation Database
CFTR2
Clinical and Functional Translation of CFTR
CFTR-RD
CFTR-Related Disorders
Cl
-
Anião cloreto
DP
Diferença de Potencial
DPN
Diferença de Potencial Nasal
FC
Fibrose Cística
IP
Insuficiência Pancreática
IRT
Teste do tripsinogénio imunorreativo
mARN
Ácido ribonucleico mensageiro
MLPA
Multiplex Ligation dependent Probe Amplification
MSD
Membrane Spanning Domains
+
Na
Catião sódio
NBD
Nucleotide Binding Domains
NCBI
National Center for Biotechnology Information
PCR
Polymerase Chain Reaction
PKA
Protein Kinase A
PKC
Protein Kinase C
QF-PCR
Quantitative Fluorescence - PCR
R
Regulatory Domain
RE
Retículo Endoplasmático
SP
Suficiência Pancreática
XII
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
RESUMO
A Fibrose Cística (FC) é a doença genética autossómica recessiva mais comum
na população Caucasiana, afetando aproximadamente 1 em cada 2500 nascimentos,
com significativas variações de acordo com o grupo étnico e localização geográfica. A
FC é causada por mutações no gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane
conductance Regulator), que resultam na perda ou diminuição do transporte de iões,
nomeadamente Cl-, mediado por este canal, através da membrana apical das células
epiteliais. Após a identificação do gene CFTR, em 1989, esperava-se que apenas um
número limitado de mutações causadoras de doença pudessem causar FC, contudo,
estão atualmente descritas cerca de 2000 variações de sequência no gene CFTR. No
entanto, é importante realçar que as consequências moleculares e funcionais de
muitas destas variações estão ainda por definir e que a maioria das mutações
identificadas são raras. De facto, menos de 10 mutações ocorrem com uma frequência
maior que 1%, sendo a mutação mais comum, F508del, responsável por
aproximadamente 66% dos pacientes com FC. Em Portugal, a prevalência da FC é
ainda desconhecida. Assim, o objetivo deste trabalho é avaliar o tipo e a frequência
das variações identificadas no gene CFTR detetadas durante o rastreio da população
portuguesa, bem como a prevalência de FC. Este estudo foi realizado a partir de
amostras de ADN, extraídas de células da mucosa bucal de 194 crianças
Portuguesas, seguido de amplificação por PCR e sequenciação direta dos 27 exões e
regiões intrónicas flanqueantes do gene CFTR. Foram identificadas 39 diferentes
variações de sequência, das quais 17 correspondem a variações de sequência
associadas a FC ou CFTR-RD e as restantes 22 a polimorfismos. A variação de
sequência mais comum foi a variante IVS8T5, com uma frequência alélica de 3,1%,
seguida do alelo complexo G576A-R668C com uma frequência alélica de 1,5% e das
variações de sequência V754M e L997F com uma frequência alélica de 1,3%. A
mutação causadora de FC, F508del, foi encontrada em duas amostras, apresentando
uma frequência alélica de 0,5%. Foram ainda observadas cinco amostras com duas
variações de sequência: uma criança do sexo masculino com o genótipo
F508del/F1052V, que em heterozigotia composta pode resultar num fenótipo de FC
clássica e quatro crianças, três do sexo masculino e uma do sexo feminino com os
genótipos
G576A-R668C/L997F,
R297Q/E725K,
IVS8T5(TG)12/S1235R
e
IVS8T5(TG)12/L967S, respetivamente, que em heterozigotia composta pode resultar
num fenótipo de CFTR-RD. De acordo com os resultados obtidos, a frequência de
portadores de uma mutação é de 18,6% (36/194) e a prevalência de FC, nesta
1
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
população em estudo, é de 0,5% (1/194). Com o presente trabalho esperamos
determinar a prevalência de FC, bem como contribuir para um melhor conhecimento
do espetro de variações de sequência na população Portuguesa, com vista a melhorar
o diagnóstico de FC.
Palavras-chave: Fibrose Cística, CFTR, CFTR-Related Disorders, Variações de
Sequência.
2
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
ABSTRACT
Cystic Fibrosis (CF) is the most common autossomal recessive genetic disease
in the Caucasian population, affecting approximately 1 in every 2500 births, with
significant variations according to ethnic group and geographical location. CF is caused
by mutations in the CFTR gene (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance
Regulator), that result in loss or reduction in ion transport, in particular Cl-, mediated by
the CFTR channel across the apical membrane of epithelial cells. After the CFTR gene
identification in 1989, it was expected that only a limited number of mutations could
cause CF, however, almost 2000 different sequence variants have already been
reported in the CFTR gene. Nonetheless, the molecular and functional consequences
of many of these sequence variations are still unknown and the majority of mutations
identified are rare. In fact, less than 10 mutations occur with a frequency greater than
1%, being the most common mutation, F508del, responsible for approximately 66% of
patients with CF. In Portugal, the prevalence of CF is still unknown. So, the aim of this
work is to investigate the type and frequency of sequence variations in the CFTR gene,
by screening a random sample of the pediatric Portuguese population and to determine
the prevalence of CF. This study was performed in DNA samples, extracted from
buccal mucosa cells of 194 children of the Portuguese population, followed by PCR
amplification and direct sequencing of 27 exons and flanking intronic regions of the
CFTR gene. We identified 39 different sequence variations, of which 17 correspond to
sequence variations associated with CF or CFTR-RD and the remaining 22
corresponds to polymorphisms. The most frequent sequence variation was IVS8T5,
with an allelic frequency of 3,1%, followed by the G576A-R668C complex allele with an
allelic frequency of 1.5% and V754M and L997F sequence variations with an allelic
frequency of 1.3%. The F508del mutation was found in two samples, with an allelic
frequency of 0.5%. It was also detected five samples with two sequence variations: a
boy with the genotype F508del/F1052V, that in compound heterozygosity can lead to a
classic CF and four children, three boys and one girl, with the genotypes G576AR668C/L997F, R297Q/E725K, IVS8T5(TG)12/S1235R and IVS8T5(TG)12/L967S,
respectively, that in compound heterozygosity can lead to a CFTR-RD. According to
the results obtained, the carrier’s frequency is 18,6% (36/194) and the prevalence of
CF, in the studied population, is 0,5% (1/194). With the present results we expect to
determine the CF prevalence, as well as to contribute for a better knowledge of the
spectrum of the CFTR gene sequence variations in Portuguese population, which will
improve the CF diagnosis in these patients.
3
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
Key-words: Cystic Fibrosis, CFTR, CFTR-Related disorders, Sequence
variations.
4
INTRODUÇÃO
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
1. INTRODUÇÃO
1.1. FIBROSE CÍSTICA
A Fibrose Cística (FC, MIM 219700) é a doença genética autossómica recessiva
mais frequente e grave na população Caucasiana. Esta doença conduz a uma
significativa morbidade e mortalidade, em que a idade média de sobrevida é cerca de
37 anos (Collaco & Cutting, 2008, Cystic Fibrosis Fundation, 2012). De acordo com
diversos estudos efetuados, a FC afeta 1 em cada 2500 recém-nascidos e 1 em cada
25 indivíduos é portador assintomático de uma mutação no gene da FC (Thompson et
al., 2002, Walters & Mehta, 2007) (Figura 1).
Figura 1 - Número de pessoas com FC. O número de adultos com FC é crescente, em relação ao número de
crianças. Os dados mostram que atualmente existem mais pessoas com FC em idade adulta. Em 2001, a
pessoa mais velha com FC tinha 74 anos de idade, enquanto em 2011, a pessoa mais velha tinha 81 anos.
Adaptado de Cystic Fibrosis Fundation, 2012.
1.1.1. PERSPETIVA HISTÓRICA
No século XIX, Carl von Rokitansky descreveu um caso de morte fetal com
peritonite meconial, uma complicação do íleo meconial associado com FC. O íleo
meconial foi descrito pela primeira vez em 1905 por Karl Landsteiner (Busch, 1991).
Em 1936, Guido Fanconi descreveu uma ligação entre a doença celíaca, a FC do
pâncreas e bronquiectasias (Fanconi et al., 1936).
Em 1938, Dorothy Hansine Andersen publicou o artigo "A Fibrose Cística do
Pâncreas e a sua Relação com a Doença Celíaca: um Estudo Clínico e Patológico", no
American Journal of Diseases of Children. Andersen foi a primeira médica a
caracterizar a FC do pâncreas e a relacioná-la com a doença pulmonar e intestinal
6
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
característica da FC. Foi também a primeira pessoa a propor a FC como uma doença
recessiva e a utilizar a reposição enzimática pancreática no tratamento de crianças
afetadas (Andersen, 1938, Welsh et al., 2001). Farber, em 1945, reconheceu a
implicação do muco viscoso na manifestação dos sintomas, denominando-o como
mucoviscidose. A perda aguda de sal causada por uma excessiva sudorese em bebés
com FC, durante as ondas de calor em 1953, foi demonstrada por Di Sant’Agnese
permitindo o posterior desenvolvimento do teste de suor, ainda hoje utilizado no
rastreio de FC (Di Sant'Agnese et al., 1953, Welsh et al., 2001).
Em 1985, foi descrita a localização do gene responsável pela FC no braço longo
do cromossoma 7 (Knowlton et al., 1985, Tsui et al., 1985). Francis Collins, Lap-Chee
Tsui e John R. Riordan, em 1988, identificaram a primeira mutação no gene da FC F508del. Em 1989, Lap-Chee Tsui e colaboradores descobriram o gene responsável
pela FC e aperceberam-se que a proteína resultante constituía um canal de Cl- ou um
regulador deste eletrólito, sendo denominado de Cystic Fibrosis Transmembrane
conductance Regulator (CFTR).
1.1.2. INCIDÊNCIA
A FC é a patologia genética autossómica recessiva mais comum em populações
descendentes do Norte da Europa, ocorrendo em aproximadamente 1 em cada 2500
nascimentos e 1 em cada 20-30 são portadores assintomáticos de uma mutação no
gene CFTR. No entanto, a prevalência de FC varia de acordo com a localização
geográfica e antecedentes étnicos (Tabela I; Figura 2). Por exemplo, a doença
manifesta-se em cerca de 1 em 3000-3500 na população branca americana, 1 em
4000-10000 em latino-americanos e 1 em 15000-20000 nos afro-americanos (Walters
& Mehta, 2007, O'Sullivan & Freedman, 2009, Salvatore et al., 2011).
Não existem dados concretos relativamente à prevalência da doença no norte de
África, contudo alguns estudos reportam a presença de mutações frequentes na
Europa, o que sugere uma elevada influência geográfica. No sul de África, estima-se
uma frequência de portadores de 1 em 42 indivíduos e que 1 em 7056 apresentem FC.
A incidência da FC no Médio Oriente varia de acordo com os antecedentes étnicos e
grau de consanguinidade da população, contudo, estima-se que 1 em 2500-15800
sejam diagnosticados com a doença. A FC é normalmente rara na Ásia, com uma
prevalência de 1 em 4000-100000 nascimentos na Índia e 1 em 100000-350000 no
Japão. Na Oceânia, a elevada prevalência desta patologia está relacionada com a
emigração de europeus para esta região (WHO, 2004, Walters & Mehta, 2007).
7
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
Figura 2 – Incidência mundial da FC. Adaptado de WHO, 2004.
Tabela I – Incidência Mundial da FC.
Continente
País
Incidência
Europa
Finlândia
Polónia
Holanda
Dinamarca
França
Suécia
Itália
Espanha
Portugal
Reino Unido
Irlanda
1:25000
1:6000
1:4750
1:4700
1:4600
1:2200-4500
1:4200
1:3500
1:3000
1:2500
1:1800
Canadá
1:3000-3500 (Caucasianos)
1:4000-10000 (Latino-americanos)
1:15000-20000 (Afro-americanos)
1:3600
América do Sul
Equador
México
Brasil
Cuba
1:11252
1:8500
1:6900
1:3900
África
África do Sul
1: 2000 (Brancos)
1:12000 (Cor)
Ásia
Japão
Índia
(Judeus Asknazi e árabes)
1:100000-355000
1:40000-100000
1:1800-4000
Oceânia
Austrália
Nova Zelândia
1:2900
1:3200
América do Norte
Estados Unidos
Adaptado de WHO, 2004, Walters & Mehta, 2007, Farrell, 2008, Salvatore et al., 2011.
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Em Portugal, estima-se que 1 em cada 3000 recém-nascidos apresente FC e
que 1 em 25 seja portador assintomático de uma mutação. No entanto, Lemos et al.
(2010) descreveram uma prevalência de 1 em 14000 indivíduos com a doença na
região centro do país, de acordo com os registos de pacientes obtidos entre 1970 e
2008 nos dois centros de diagnóstico dessa região (Lemos et al., 2010). Entre 1992 e
1995, foi realizado um rastreio pré-natal experimental pelo teste do tripsinogénio
imunorreativo (IRT), verificando-se uma incidência da doença de 1 em 10000 recémnascidos nos distritos do Porto e Coimbra (Vilarinho et al., 2006).
1.1.3. MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
A FC conduz a alterações patológicas de órgãos que expressam a proteína
CFTR nas células epiteliais, nomeadamente as vias respiratórias (incluindo os seios
nasais e os pulmões), o trato gastrointestinal (incluindo o pâncreas e o sistema biliar),
as glândulas sudoríparas e o sistema geniturinário (Huffmyer et al., 2009).
A elevada morbilidade e mortalidade resultam do comprometimento do sistema
de defesa pulmonar, conduzindo a infeções crónicas e inflamações das vias aéreas.
Infeções
persistentes,
nomeadamente
com
Pseudomonas
aeruginosa
e
Staphylococcus aureus, causam uma produção crónica de expetoração, obstrução das
vias aéreas e eventualmente, bronquiectasias e destruição pulmonar. A insuficiência
pancreática exócrina, que ocorre em aproximadamente 85% dos pacientes, conduz a
uma má absorção de gordura, esteatorreia e défice ponderal. Ao nível gastrointestinal,
o íleo meconial, presente em aproximadamente 10 a 20% dos recém-nascidos, é
muitas vezes marcador de diagnóstico da doença. No que diz respeito à fertilidade,
quase todos os homens com FC são inférteis devido a malformações congénitas no
sistema reprodutor. Outras características da doença incluem cirrose biliar, reduzida
fertilidade nas mulheres, formação de pólipos nasais e diabetes (Welsh et al., 2001,
Huffmyer et al., 2009, O'Sullivan & Freedman, 2009). Estas manifestações clinicas da
FC encontram-se sumarizadas na Tabela II.
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Tabela II – Manifestações clínicas da FC.
Hipertrofia das células calciformes, secreções mucosas viscosas com
transporte mucociliar
Pulmões
Atelectasia, inflamação das vias aéreas, e hipoxia crónica
Colonização com Pseudomonas, Staphylococcus aureus, Haemophilus
influenza e outros
Doença obstrutiva das vias aéreas
Vias aéreas superiores
Pâncreas
Pólipos nasais
Hipertrofia e hiperplasia da mucosa nasal
Deficiência pancreática exócrina: redução do volume e pH das secreções,
retenção de enzimas digestivas, autodigestão pancreática conduz a má
absorção de gordura e de proteínas
Doença pancreática endócrina: CF-related diabetes mellitus (CFRD)
Testes de função hepática anormais
Infiltração de gorduras no fígado
Fígado/Bílis
Cirrose
Associação com carcinoma hepatocelular
Colelitíase e colecistite
Alteração do metabolismo hepático
Trato Gastrointestinal
Doença Óssea
Síndrome de obstrução intestinal distal (DIOS): episódios recorrentes de
obstrução intestinal, dor abdominal, distensão, náuseas, vómitos e
obstipação
Baixa densidade mineral óssea
Aumento da incidência de fraturas
Início tardio da puberdade em homens e mulheres
Sistema Geniturinário
Infertilidade masculina, devido à ausência congénita bilateral dos canais
deferentes e azoospermia obstrutiva
Anatomia feminina normal, mas o muco cervical persistente pode resultar
em diminuição da fertilidade
Ciclos menstruais normais ou quase normais
Adaptado de Huffmyer et al., 2009.
De acordo com os dados do relatório anual da Fundação Fibrose Cística, a idade
média de sobrevida dos pacientes aumentou de 25 anos em 1985 para 37 anos em
2011 (Figura 3) (Cystic Fibrosis Fundation, 2012). Este aumento observado prende-se
com uma melhor visão do curso natural da doença, conduzindo a tratamentos que
visam as infeções respiratórias, inflamações e estado nutricional (Cohen-Cymberknoh
et al., 2011).
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Figura 3 - Idade média de sobrevida de doentes com FC. Adaptado de Cystic Fibrosis Fundation, 2012.
1.1.4. FC CLÁSSICA
A maioria das crianças com FC apresenta infeções pulmonares crónicas e
recorrentes, esteatorreia e défice de crescimento. A insuficiência pancreática encontrase presente em aproximadamente 85% dos indivíduos afetados. O diagnóstico é
confirmado tipicamente por um teste de suor elevado (> 60 mmol/L) bem como pela
identificação de duas mutações CFTR. Aproximadamente 70% dos indivíduos
afetados apresentam uma cópia da mutação F508del, sendo que cerca de 25% são
homozigóticos para esta mutação (Paranjape & Zeitlin, 2008).
1.1.5. CFTR-RELATED DISORDERS (CFTR-RD)
Os indivíduos que apresentam um fenótipo de FC monossistémica e um teste de
suor normal (< 40 mmol/L) ou no limite (40-60 mmol/L), são descritos como tendo uma
forma não clássica da doença. Esta condição é agora descrita como uma doença
associada a alterações da proteína CFTR (CFTR-RD). Geralmente, estes pacientes
têm suficiência pancreática (SP) e alterações pulmonares variáveis (comparativamente
com a forma clássica de FC) e são portadores de duas mutações CFTR, sendo que
pelo menos uma delas resulta numa expressão e função parcial da proteína. Os
sintomas de CFTR-RD normalmente apresentam-se com menor gravidade durante a
infância, tornando-se clinicamente mais significativos após a primeira década de vida e
durante a idade adulta. Os pacientes podem apresentar, alternativamente, apenas
sintomas monossistémicos, tais como cirrose biliar, pancreatites recorrentes, sinusites
crónicas, pólipos nasais ou infertilidade secundária devido à ausência congénita
bilateral de canais deferentes (CBAVD) (WHO, 2004, Paranjape & Zeitlin, 2008).
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A CBAVD ocorre com uma frequência aproximada de 1-2% nos homens inférteis
e é responsável por cerca de 6% dos casos de azoospermia obstrutiva. A variante
IVS8T5 pode ser considerada uma mutação causadora de CBAVD apresentando no
entanto uma penetrância variável (Grangeia et al., 2005). Esta variante apresenta uma
frequência de 5% na população caucasiana, aumentando para 25% em pacientes com
CBAVD. Quando detetada em combinação com outra ou outras variantes que
reduzam a quantidade de proteína funcional pode causar um fenótipo de CFTR-RD
(WHO, 2004).
Doença pulmonar moderada e bronquiectasias idiopáticas em pacientes mais
velhos podem sugerir um fenótipo de CFTR-RD sendo assim necessária a realização
de um teste de suor, avaliação da função da proteína CFTR e análise genética,
particularmente para mutações moderadas no gene CFTR (Paranjape & Zeitlin, 2008).
1.2. GENE CFTR
1.2.1. IDENTIFICAÇÃO
Como não foram encontradas anomalias cromossómicas estruturais envolvidas
na FC, foi efetuada clonagem posicional usando o mapeamento genético posicional
para localizar e clonar o gene envolvido nesta doença. Assim, procedeu-se ao estudo
de amostras de ADN de quase 50 famílias com FC para análise da ligação entre a FC
e centenas de marcadores espalhados pelo genoma, até que finalmente foi
identificada uma ligação entre a FC e os marcadores existentes no braço longo do
cromossoma 7 (Thompson et al., 2002). Estes marcadores foram os primeiros
utilizados no diagnóstico molecular da FC (Estivill et al., 1988).
Em 1989, foi efetuada a identificação do gene responsável pela FC, o gene
CFTR, bem como da principal mutação responsável pela doença, F508del, através da
combinação das técnicas de chromossome jumping, mapeamento físico, isolamento
das sequências exónicas e análise genética ( Kerem et al., 1989, Riordan et al., 1989,
Rommens et al., 1989, Cutting, 1997). A sequência de ADN complementar do gene
CFTR foi posteriormente determinada, em 1991, juntamente com a localização dos
limites intrão/exão (Zielenski et al., 1991).
A FC representa a primeira doença genética estritamente explicada pelo
processo de clonagem posicional, anteriormente denominado de genética reversa,
(Buchwald et al. 1989, Kerem et al., 1989, Riordan et al., 1989, Rommens et al.,
1989).
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1.2.2. ESTRUTURA E ORGANIZAÇÃO
O gene CFTR está localizado na região q31.2 do cromossoma 7 e engloba
250kb de ADN genómico. É constituído por 27 exões (sequências que codificam para
uma proteína) intercalados por longas sequências intrónicas (sequências não
codificantes). Os exões eram numerados do 1 ao 24, com as subdivisões “a” e “b” para
os exões 6, 14 e 17, visto terem sido reconhecidos só depois da publicação original do
gene (Zielenski et al., 1991), contudo, atualmente, esta numeração é feita do 1 ao 27
(Cystic Fibrosis Mutation Database, 2011). O gene CFTR é transcrito num ARN
mensageiro com 6.5 kb que por sua vez é traduzido numa proteína com 1480
aminoácidos e com um peso molecular de aproximadamente 170 kDa (Figura 4)
(Riordan et al., 1989) .
Figura 4 – Representação esquemática do gene e da proteína CFTR. O gene CFTR é transcrito num ARN
mensageiro de 6.5 kb que por sua vez é traduzido numa proteína com 1480 aminoácidos que se localiza na
membrana apical das células epiteliais. Adaptado de Tsui & Durie, 1997.
A proteína CFTR funciona como um canal de transporte de Cl- localizado na
membrana apical das células epiteliais, regulando o movimento transepitelial de água
e solutos devido à translocação mediada de Cl- através da membrana plasmática
(Riordan et al., 1989).
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1.2.3. ESPETRO DE MUTAÇÕES
A FC é uma doença autossómica recessiva, resultando de mutações num único
gene. Desde a descoberta do gene CFTR e da mutação F508del, em 1989, foram
encontradas cerca de 2000 outras variações de sequência neste gene (Cystic Fibrosis
Mutation Database, 2011). Investigações anteriores evidenciam que as mutações
causadoras de FC existem desde o período Paleolítico (50000 anos), e muitas estão
fortemente associadas com populações derivadas da Europa (Morral et al., 1994).
Estas mutações encontram-se localizadas ao longo de toda a região codificante do
gene e também na região do promotor. No entanto, existem regiões onde as mutações
são mais comuns, tais como os domínios de ligação de nucleótidos (NBD) e o domínio
regulador (R) e que correspondem a domínios ou aminoácidos importantes ao nível
funcional e estrutural da proteína (Rowntree & Harris, 2003).
A maior parte das variações de sequência estão associadas a doença, enquanto
as restantes são classificadas como polimorfismos. A grande maioria destas variações
associadas a doença correspondem a variações pontuais que afetam apenas um ou
poucos nucleótidos. E apenas 1% corresponde a rearranjos genómicos, como
deleções e inserções que afetam centenas ou milhares de pares de bases (Welsh et
al., 2001). Do total de mutações, 40,26% são missense (conduzem à substituição de
um aminoácido), 15,88% são frameshift (pequenas deleções ou inserções que alteram
a grelha de leitura), 11,65% são mutações que afetam o local de splicing e 8,3% são
nonsense (originam codões de terminação prematuros). Das restantes alterações no
gene CFTR, 13,87% correspondem a variações de sequência (polimorfismos), 1,96%
corresponde a inserções/deleções in frame, 0,77% são ao nível da região promotora e
4,79% correspondem a alterações ainda desconhecidas (Cystic Fibrosis Mutation
Database, 2011). Embora extremamente raros, têm existido alguns casos reportados
de FC associados a uma dissomia uniparental do cromossoma 7 (Hehr et al., 2000, Le
Caignec et al., 2007).
Em todo mundo, menos de 20 mutações CFTR apresentam uma frequência
superior a 0,1%, sendo que estas frequências variam entre diferentes regiões
geográficas e grupos étnicos (Bobadilla et al., 2002). A mutação F508del é a mutação
CFTR
mais
comum
na
população
caucasiana,
sendo
encontrada
em
aproximadamente dois terços dos indivíduos diagnosticados com FC. Esta mutação
está virtualmente ausente nas populações nativas de África e Ásia, embora exista com
uma frequência considerável em populações mistas, tais como os afro-americanos. Na
Europa, esta mutação apresenta um evidente gradiente na sua frequência, sendo mais
elevada a noroeste (88% na Dinamarca) e mais reduzida a sudeste (25% na Turquia)
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tal como se verifica na prevalência da FC e demonstrado em estudos anteriores
(Estivill et al., 1997, Welsh et al., 2001, Bobadilla et al., 2002). A mutação F508del
consiste na deleção de 3 nucleótidos CTT na posição 1521 do gene CFTR e envolve
os aminoácidos Isoleucina (Ile) e Fenilalanina (Phe) nas posições 507 e 508,
respetivamente. Esta alteração conduz à deleção do aminoácido Phe e à substituição
sinónima da Ile, alterando a função do domínio NBD1 e por conseguinte o misfolding
da proteína, levando à sua degradação (Bartoszewski et al., 2010).
A maioria das outras mutações CFTR é muito rara ou restrita a uma área
geográfica especifica. Apenas 4 mutações, G542X, G551D, N1303K e W1282X,
apresentam uma frequência superior a 1%. Muitas das outras mutações são
exclusivas de um indivíduo ou família em particular ou então encontradas em apenas
alguns casos em todo o mundo (Rowntree & Harris, 2003). Mutações de novo no gene
CFTR são extremamente raras (Cremonesi et al., 1996).
Segundo Lemos et al. (2010), em Portugal, a frequência da mutação F508del é
de 69%, aproximando-se da frequência encontrada em países da Europa do Norte e
Central, enquanto a mutação R334W, a segunda mais comum no nosso país,
apresenta uma frequência de 12,8% (Lemos et al., 2010).
1.2.4. CLASSES DAS MUTAÇÕES CFTR
Os efeitos das mutações CFTR são expressos sob vários mecanismos
moleculares que incluem a ausência de produção da proteína CFTR, a produção de
uma proteína mutante com uma atividade reduzida ou não funcional na membrana
apical das células epiteliais (Welsh et al., 2001). Assim, foi possível classificar as
diferentes mutações de acordo com o impacto quantitativo e/ou qualitativo que
apresentam ao nível celular. Inicialmente, Zielenski e Tsui, (1995) propuseram 5
classes de mutações CFTR, contudo, atualmente são consideradas 6 classes
(Zielenski & Tsui, 1995, Kreindler, 2010) (Tabela III; Figura 5).
Classe I: pertencem a esta classe todas as mutações que afetam a biossíntese
da proteína CFTR e inclui as mutações que causam os fenótipos de FC mais graves.
Estas mutações são normalmente nonsense, frameshift, mutações que alteram o local
de splicing ou mutações que alteram o codão de iniciação da tradução. Resultam na
produção de uma proteína pouco estável ou truncada devido à presença de um codão
de terminação prematuro. As proteínas truncadas são, normalmente, instáveis e
reconhecidas por proteínas chaperones no retículo endoplasmático (RE) que as
degradam rapidamente. Desta forma, não se observa proteínas CFTR na membrana
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celular (Zielenski, 2000, Rowntree & Harris, 2003, Culling & Ogle, 2010, Kreindler,
2010, Rogan et al., 2011).
Tabela III – Diferentes classes de mutações do gene CFTR.
Classe
Efeito
Efeito na
proteína CFTR
I
Ausência de proteína CFTR na
membrana apical
Síntese anormal
de proteína
II
Ausência de proteína CFTR na
membrana apical
Processamento e
tráfego anormal
III
IV
V
VI
Quantidades normais de
proteína CFTR não funcional na
membrana apical
Quantidade normal de proteína
CFTR com função residual na
membrana apical
Quantidade reduzida de
proteína CFTR funcional na
membrana apical
Proteína CFTR funcional mas
instável na membrana apical
Regulação
defetiva
Redução da
condutância
Redução de
síntese/tráfego
Diminuição da
estabilidade
Exemplos de
mutações
Mecanismo
mutacional
c.1624G>T (G542X)
c.3846G>A (W1282X)
c.1585-1G>A
F508del
c.3909C>G (N1303K)
c.3773_3774insT
c.1652G>A (G551D)
c.1679G>C (R560T)
c.1475C>T (S492F)
c.350G>A (R117H)
c.1040G>C (R347P)
c.1000C>T (R334W)
IVS8T5
c.1364C>A (A455E)
c.3717+12191C>T
c.4234C>T (Q1412X)
c.4196_4197delTC
c.4147_4148insA
Nonsense
Frameshift
Splice
Missense
Deleção de
aminoácidos
Missense
Missense
Missense
Splice
Nonsense
Frameshift
Adaptado de O'Sullivan & Freedman, 2009, Culling & Ogle, 2010, Rogan et al., 2011.
Classe II: as mutações que pertencem a esta classe estão associadas com um
processamento anormal da proteína devido a um misfolding incorreto. As proteínas
imaturas traduzidas ficam retidas no RE e como tal não passam para o aparelho de
Golgi para serem glicosiladas, havendo uma falha de proteínas funcionais na
membrana. Estas proteínas anormais saem diretamente do RE para o citosol para
serem degradadas no proteossoma. Devido à ausência de proteínas na membrana, as
mutações desta classe estão associadas a fenótipos de FC graves ( Zielenski, 2000,
Rowntree & Harris, 2003, Culling & Ogle, 2010, Kreindler, 2010).
Classe III: mutações que causam uma regulação anormal do canal de Cl-. As
mutações no gene CFTR pertencentes a esta classe estão localizadas nos domínios
NBD1 e NBD2 da proteína, impedindo a ligação de ATP a estes domínios e a sua
hidrólise, necessária para a ativação do canal. Estas mutações podem ainda afetar a
regulação de outros canais (como o canal de potássio ROMK2). Este é um exemplo de
um mecanismo mutacional que afeta algumas funções reguladoras do gene CFTR
para além da sua função de transporte de cloro. Estas mutações têm sido associadas
a fenótipos graves de FC (Zielenski, 2000, Rowntree & Harris, 2003, Culling & Ogle,
2010, Kreindler, 2010, Rogan et al., 2011).
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Classe IV: as mutações associadas a esta classe incluem os casos em que o
gene codifica uma proteína CFTR que é corretamente traduzida, processada,
transportada e inserida na membrana apical e que responde a estímulos, contudo, a
condutância de Cl- é reduzida. Estas mutações (geralmente missense) estão
localizadas nos domínios transmembranares (Membrane-spanning domains – MSD)
que participam na formação do canal iónico. Assim, quando existe uma mutação desta
classe, há uma diminuição do fluxo iónico. O fenótipo de FC associado a esta classe é
moderado com suficiência pancreática (Zielenski & Tsui, 1995, Zielenski, 2000,
Rowntree & Harris, 2003, Culling & Ogle, 2010, Kreindler, 2010).
Classe V: as mutações pertencentes a esta classe conduzem a uma produção
de proteínas normais mas em níveis reduzidos devido a uma desregulação da
transcrição e estão associadas a um fenótipo de FC moderado. Incluem-se aqui as
mutações no promotor que reduzem a transcrição, splicing alternativo e uma
maturação ineficiente da proteína. Um splicing anormal pode resultar em ausência de
ARN mensageiro normal ou em níveis muito baixos, variando entre pacientes e
mesmo entre órgãos de um mesmo paciente (Zielenski & Tsui, 1995, Zielenski, 2000,
Culling & Ogle, 2010, Rogan et al., 2011).
Classe VI: esta classe inclui as mutações que diminuem a estabilidade da
proteína CFTR, tais como mutações nonsense ou frameshift que causam a deleção
dos últimos 70-98 bp da zona C-terminal da proteína, e mutações que afetam a
regulação de outros canais. As mutações desta classe estão associadas a um fenótipo
grave de FC (Haardt et al., 1999, Zielenski, 2000, Kreindler, 2010).
As classes I, II, III e VI estão associadas a um fenótipo de insuficiência
pancreática (IP), enquanto os pacientes com mutações das classes IV e V apresentam
SP (Ratjen & Doring, 2003). Até agora, o conhecimento da mutação genética era de
utilidade clínica limitada, contudo, esta perspetiva foi alterada devido ao recente
desenvolvimento de novas terapias focadas em aspetos específicos da disfunção da
proteína CFTR. A compreensão detalhada das anomalias genéticas subjacentes é,
portanto, essencial para definir os melhores alvos para terapias (Ratjen, 2007, Ratjen,
2009).
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Figura 5 – Mecanismos mutacionais que alteram o normal funcionamento da proteína CFTR. Adaptado
de Lubamba et al., 2012.
1.2.5. POLIMORFISMOS CFTR
Polimorfismos são definidos como variações de sequência que não conduzem a
uma patologia e que ocorrem com uma frequência superior a 1% na população geral.
Até à data, encontram-se descritos mais de 250 polimorfismos no gene CFTR
(Castellani et al., 2008, Cystic Fibrosis Mutation Database, 2011). Cerca de 55%
destes polimorfismos ocorrem em regiões codificantes do gene CFTR, metade dos
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quais resultam em substituições de aminoácidos. Contudo, alguns polimorfismos no
locus CFTR poderão potenciar alterações na expressão/função do gene CFTR (Welsh
et al., 2001, Rowntree & Harris, 2002). Por exemplo, alguns polimorfismos podem
estar localizados em regiões que regulam a expressão do gene CFTR, podendo
modificar a ligação de fatores de transcrição a estes locais, alterando a gravidade do
fenótipo da FC. Os indivíduos saudáveis podem tolerar estes polimorfismos pois
apresentam um alelo normal que produz proteína CFTR funcional. Contudo, um
individuo que seja portador de uma mutação causadora de FC num alelo, produzindo
proteína CFTR não funcional, e um polimorfismo relevante no outro alelo, encontra-se
sujeito a uma redução da atividade transcricional do alelo não mutado, podendo
apresentar um fenótipo moderado ou atípico de FC (Rowntree & Harris, 2002,
Rowntree & Harris, 2003).
Os polimorfismos IVS8(TG) e M470V, localizados no intrão 8 e exão 10,
respetivamente, influenciam a penetrância da variante IVS8T5 no splicing do exão 9.
Um maior número de repetições TG no intrão 8 ou/e a variante V470 estão associados
a um aumento da proporção de transcritos sem o exão 9 (Cuppens et al., 1998, de
Meeus et al., 1998, Grangeia et al., 2004, Groman et al., 2004).
1.2.6. ALELOS COMPLEXOS
Os alelos complexos são constituídos por duas ou mais variações de sequência
do gene CFTR presentes no mesmo alelo, ou seja em cis (CFTR2@Johns Hopkins,
2013). Embora a maioria dos alelos complexos representem a associação, no mesmo
cromossoma, de uma variação de sequência polimórfica e uma mutação causadora de
doença, existem alguns casos em que o polimorfismo pode modular o efeito da
mutação principal e consequentemente a gravidade clínica do fenótipo. Um exemplo é
o polimorfismo S912L que altera o efeito da mutação G1244V quando combinados em
cis (Clain et al., 2005). Noutros casos, pode ocorrer a associação em cis de duas ou
três mutações moderadas, como R347H-D979A, em que ocorre a combinação do
efeito das duas mutações, conduzindo a uma drástica diminuição no transporte de Cl(Clain et al., 2001) e D443Y-G576A-R668C, característica de pacientes com CFTRRD, nomeadamente CBAVD (El-Seedy et al., 2012). Os alelos complexos contribuem
para a dificuldade na determinação das mutações causadoras de FC, visto que os
investigadores não podem ter a certeza de qual das variações de sequência causa a
doença (CFTR2@Johns Hopkins, 2013).
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1.2.7. CORRELAÇÃO GENÓTIPO-FENÓTIPO
A FC é uma doença altamente heterogénea, com uma considerável variabilidade
na gravidade e velocidade de progressão nos diferentes órgãos (Castellani et al.,
2008). A maior variabilidade verifica-se ao nível do sistema respiratório, seguido da
função pancreática, envolvimento das glândulas sudoríparas e infertilidade masculina
(Culling & Ogle, 2010).
As classes de mutações apresentadas na Tabela III fornecem uma útil
informação sobre a gravidade da mutação, contudo não funcionam como uma
ferramenta para previsão de prognósticos individuais. Normalmente, os pacientes
homozigóticos ou heterozigóticos compostos para mutações pertencentes às classes I,
II, III e VI (também denominadas de mutações graves) tendem a apresentar IP,
elevada frequência de íleo meconial, mortalidade prematura, deterioração precoce e
grave da função respiratória, maior incidência de desnutrição e doença hepática grave.
Os indivíduos portadores de pelo menos uma mutação pertencente às classes IV e V
(denominadas de mutações moderadas) apresentam, normalmente, doença pulmonar
moderada, SP, vivendo até uma idade mais avançada (McKone et al., 2003, McKone
et al., 2006). Normalmente, as mutações das classes IV e V são fenotipicamente
dominantes quando ocorrem em combinação com as mutações das classes I a III e VI
(Castellani et al., 2008).
Por
exemplo,
doentes
heterozigóticos
compostos
para
as
mutações
F508del/A455E apresentam uma melhor função pulmonar que os indivíduos
homozigóticos F508del/F508del. Em indivíduos com uma ou duas mutações R117H, a
gravidade da doença pulmonar é afetada pela presença de variações na sequência
poly-T do intrão 8. Assim, indivíduos com a variante 5T, presente em cis com a
mutação R117H num dos alelos, e com outra mutação causadora de FC, no outro
alelo, desenvolvem doença pulmonar; enquanto que os indivíduos com a variante 7T,
em cis com a mutação R117H num dos alelos, e com outra mutação causadora de FC,
no outro alelo, apresentam um fenótipo muito variável, desde a ausência de sintomas,
a doença pulmonar moderada (Tabela IV). Como as mutações A455E e R117H estão
associadas a SP, a presença de doença pulmonar menos grave, em indivíduos com
estas mutações, pode ser consequência de um melhor estado nutricional (Moskowitz
et al., 2008).
20
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Tabela IV – Correlações genótipo-fenótipo CFTR.
Alelo 1
Grave
a
Moderado
a
Alelo 2
Variedade de Fenótipos
Grave
Clássico >> Não clássico
Grave ou moderado
Não clássico > Clássico
R117H/5T
Grave ou moderado
Não clássico > Clássico
R117H/7T
Grave ou moderado
Mulheres assintomáticas ou CBAVD > Não clássico
5T/TG13 ou TG12
Grave ou moderado
CBAVD ou Não clássico >> Portador assintomático
5T/TG11
Grave ou moderado
Assintomático > CBAVD
7T ou 9T
Grave ou moderado
Assintomático
7T ou 9T
7T ou 9T
Assintomático
a
Grave refere-se às classes de mutações I-III e VI; moderado refere-se às classes de mutações IV e V, excluindo a
mutação R117H e a variante 5T. Adaptado de Moskowitz et al., 2008.
O impacto dos genótipos CFTR tem sido também analisado para outros órgãos,
como as glândulas sudoríparas, através da medição da concentração de Cl- no suor,
em pacientes com diferentes mutações CFTR. Os pacientes foram analisados de
acordo com as classes de mutações ou genótipos específicos, o que revelou que
determinados alelos com mutações moderadas (R117H, A455E, 3849+10kb C>T)
pertencentes às classes IV e V, tendem a ser associados a níveis significativamente
mais baixos de Cl- no suor do que os alelos com mutações mais graves (F508del,
621+1 G>T, G542X, R553X). No entanto, observa-se que estas concentrações, apesar
de elevadas, variam conforme a mutação em causa (Wilschanski et al., 1995,
Zielenski, 2000). Relativamente à CBAVD, esta resulta, geralmente, da combinação de
uma mutação CFTR grave com uma mutação moderada ou com a variante 5T no
outro alelo. Contudo, pode existir uma sobreposição entre o fenótipo de CBAVD e um
fenótipo moderado de FC, com uma pequena fração de indivíduos com CBAVD a
apresentarem problemas respiratórios. A variante 5T pode também estar associada a
doença pulmonar em mulheres adultas com sintomas semelhantes a FC (Moskowitz et
al., 2008).
A heterogeneidade fenotípica da FC, observada em indivíduos com genótipos
semelhantes, sugere que existem mais fatores envolvidos na determinação do fenótipo
para além do fator genótipo CFTR, como por exemplo fatores ambientais (estado
socioeconómico, tabaco e outros poluentes, exposições infeciosas, autogestão da
doença e timing de diagnóstico) e outros modificadores genéticos (Rowntree & Harris,
2003, Wolfenden & Schechter, 2009).
21
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Estudos anteriores têm demonstrado a ligação entre genes modificadores e a
suscetibilidade para o desenvolvimento de íleo meconial, tanto em modelos de ratinho
como em humanos, contudo, não foi reportada a influência na obstrução intestinal
verificada numa fase mais adulta do paciente (Blackman et al., 2006). Outros estudos
envolvendo gémeos e irmãos com FC, evidenciam um impacto genético significativo
na gravidade da doença pulmonar, independentemente do genótipo CFTR (Wolfenden
& Schechter, 2009).
Diversos grupos têm investigado os genes envolvidos na defesa imunológica
(inata e adquirida) e no processo de inflamação, como modificadores da doença
pulmonar em pacientes com FC (Rowntree & Harris, 2003). Um polimorfismo na região
promotora do gene tumour necrosis factor α (TNF-α) está associado a um aumento no
nível de transcrição deste gene, tendo sido demonstrada a sua associação com a
doença pulmonar grave em pacientes com FC (Hull & Thomson, 1998). Um outro
estudo, com o gene transforming growth factor β1 (TGF-β1) mostrou que uma
mutação no exão 10 deste gene está associada a um rápido declínio da função
pulmonar (Arkwright et al., 2000). Enquanto um polimorfismo localizado na região
enhancer do gene α1-antitrypsin (AAT) está associado a uma doença pulmonar
moderada (Henry et al., 2001). Variantes alélicas do gene mannose-binding lectin 2
(MBL2) estão também relacionadas com a gravidade da doença pulmonar em
pacientes com FC (Garred et al., 1999, Rowntree & Harris, 2003).
Ainda se desconhece a relevância clinica e as implicações terapêuticas dos
genes modificadores, portanto não é aconselhável a realização de testes de rotina
para os mesmos (Castellani et al., 2008).
22
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FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
1.3. PROTEÍNA CFTR
1.3.1. CLASSE, ESTRUTURA E FUNÇÃO
A proteína CFTR funciona, principalmente, como um canal de Cl- regulado por
cAMP (3’,5’-adenosina monofosfato cíclico) e a sua sequência aminoacídica, revela
uma homologia significativa com a família de transportadores ABC (ATP-Binding
Cassette) (Lubamba et al., 2012).
Após a identificação da sequência de aminoácidos da proteína CFTR, Riordan et
al, (1989) propuseram uma estrutura composta por duas unidades repetidas, cada
uma consistindo num domínio transmembranar (MSD) composto por seis hélices
transmembranares hidrofóbicas, seguido de um domínio de ligação de nucleótidos
(NBD) que interage com o ATP (Figura 6). Dez das doze hélices transmembranares
contêm um ou mais aminoácidos carregados, e nas hélices 7 e 8 encontram-se dois
potenciais locais de glicosilação. As duas unidades são ligadas por um domínio
regulador (R) que contém nove dos dez motivos consenso para a fosforilação pela
PKA (proteína cinase A) e sete locais de fosforilação da PKC (proteína cinase C). O
domínio R é exclusivo da proteína CFTR, não estando presente nos outros membros
da superfamília ABC (Riordan et al., 1989, Prasad et al., 2010, Lubamba et al., 2012).
O terminal carboxilo (composto por Treonina, Arginina e Leucina (TRL)) está
ancorado, através de interações do tipo PDZ, com o citoesqueleto e é mantido em
estreita aproximação com várias proteínas importantes (Short et al., 1998).
Os MSD são responsáveis pela formação do poro do canal através do qual o
fluxo de Cl- atravessa a membrana plasmática. Acredita-se que o fluxo de aniões é
controlado pela fosforilação do domínio R pela PKA e pela interação do ATP com os
locais NBDs, induzindo alterações de conformação da proteína, resultando na abertura
e fecho do canal (Lubamba et al., 2012). A proteína CFTR pode ter também outras
funções, como por exemplo, no transporte de bicarbonato e na interação com outras
moléculas, incluindo o canal epitelial de sódio ENaC, o que sugere um papel regulador
da proteína CFTR neste canal (Rowntree & Harris, 2003).
A proteína CFTR encontra-se, principalmente, localizada na membrana apical
das células epiteliais polarizadas, embora seja também encontrada em tecidos não
epiteliais, como os miócitos cardíacos, músculo liso e macrófagos (Lubamba et al.,
2012).
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Figura 6 – Representação esquemática da proteína CFTR. Adaptado de Prasad et al., 2010.
1.4. DIAGNÓSTICO E RASTREIO DE FC
O diagnóstico de FC deve ser estabelecido rapidamente de forma a providenciar
aconselhamento e tratamento apropriado aos doentes. A FC é diagnosticada pela
presença de pelo menos uma manifestação fenotípica (como doença pulmonar
crónica, manifestações gastrointestinais e nutricionais ou CBAVD), história familiar de
FC ou rastreio neonatal positivo, acompanhado de provas laboratoriais de disfunção
da proteína CFTR – teste de suor positivo ou diferença de potencial nasal (DPN)
positivo – ou pela identificação de duas mutações causadoras de FC em heterozigotia
composta ou homozigotia (Tabela V) (Rosenstein, 1998, Rosenstein & Cutting, 1998,
Dalcin & Abreu, 2008).
Tabela V – Critérios de diagnóstico da FC.
Manifestações de FC
Prova bioquímica de disfunção CFTR
≥ 1 Manifestação fenotípica
Teste de suor positivo
ou
ou
Rastreio neonatal positivo
mais
DPN positiva
ou
ou
História familiar de FC
2 mutações causadoras de FC
Adaptado de Rosenstein & Cutting, 1998.
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1.4.1. TESTE DO SUOR
A maioria dos casos de FC pode ser diagnosticada com base nas características
fenotípicas da doença e num teste de suor aumentado. A medida de concentração de
eletrólitos no suor tornou-se o esteio do diagnóstico de FC desde o momento que o
procedimento padrão foi estabelecido por Gibson e Cooke, em 1959. A perda de
função da proteína CFTR em pacientes com FC conduz a níveis elevados de Na+ e Clno suor devido à má reabsorção destes eletrólitos nos ductos sudoríparos (Dalcin &
Abreu, 2008, Farrell et al., 2008, Voter & Ren, 2008).
Este método consiste na estimulação da produção de suor, por iontoforese com
pilocarpina, sendo de seguida recolhido e analisada a sua concentração em Cl-. Os
indivíduos normais apresentam uma concentração de Cl- < 40 mmol/L. Valores entre
40 e 59 mmol/L são considerados valores intermédios, sendo necessária a sua
confirmação. Uma concentração de Cl- > 60 mmol/L é considerada elevada, sendo
diagnóstico de FC. Em crianças, este pode ser considerado positivo quando superior a
40 mmol/L, devendo ser realizado só após as primeiras 48h de vida (Voter & Ren,
2008).
1.4.2. DIFERENÇA DE POTENCIAL NASAL
O conhecimento adquirido através do estudo da função CFTR pode ser aplicado
a testes de diagnóstico como a medição do fluxo de iões transepiteliais na mucosa
nasal. O transporte de iões através da mucosa nasal gera uma diferença de potencial
(DP), que pode ser medida in vivo, apresentando os pacientes com FC um padrão
distintamente diferente dos indivíduos normais. A linha de base da DP nasal
representa um equilíbrio entre o fluxo de Na+ e Cl- através da membrana. Em
pacientes com FC, esta DP basal é muito mais elevada do que o normal, o que reflete
a impermeabilidade relativa da membrana celular ao fluxo de iões característico da
FC. A medição da DP nasal pode ser útil quando o teste de suor não é conclusivo e a
análise genética não revelou mutações (Knowles et al., 1995, Voter & Ren, 2008).
1.4.3. ANÁLISE DO GENE CFTR
A análise molecular assenta principalmente em métodos de análise direta do
gene CFTR, isto é, a deteção de mutações causadoras de doença. São utilizadas uma
grande variedade de técnicas para a identificação de variações na sequência do gene
CFTR, não havendo um padrão estabelecido. Assim, todos os métodos exigem um
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grande conhecimento e experiência na sua execução e interpretação por parte de
cada laboratório (Dequeker et al., 2009).
Os kits comerciais disponíveis permitem detetar as mutações causadoras de FC
mais frequentes na população caucasiana. O estudo da maioria destas mutações é
recomendado pelo American College of Medical Genetics (ACMG) e pelo American
College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) (Anexo I). No caso de nenhuma
ou apenas uma mutação ser detetada através do kit comercial, pode recorrer-se a um
estudo molecular completo do gene CFTR. Normalmente, a sequenciação completa do
gene permite a análise da zona promotora e de todos os exões e regiões intrónicas
flanqueantes. Adicionalmente, pode ser também efetuada a pesquisa de rearranjos do
gene CFTR, como grandes deleções, inserções ou duplicações, pela técnica de MLPA
(Multiplex
Ligation-dependent
Probe
Amplification)
e
QF-PCR
(Quantitative
Fluorescent multiplex PCR) (De Boeck et al., 2005, Dequeker et al., 2009, Culling &
Ogle, 2010).
No entanto, o uso combinado de todas estas técnicas não garante a deteção das
duas mutações causadoras de doença (em trans) de todos os pacientes; 1-5% das
mutações permanecem indeterminadas em pacientes com FC clássica e ainda mais
em pacientes com CFTR-RD. As mutações não detetadas podem estar em regiões
que não são normalmente analisadas, como os intrões ou regiões reguladoras, ou
então dever-se a mutações em genes modificadores (Dequeker et al., 2009, Culling &
Ogle, 2010).
1.4.4. RASTREIO NEONATAL
O rastreio neonatal é realizado através da medição do tripsinogénio
imunorreativo (IRT) em amostras de sangue de recém-nascidos. Uma concentração
muito elevada de IRT é sugestiva de lesões pancreáticas consistentes (mas não
especificas) de FC. Este marcador está aumentado mesmo em crianças com
mutações pertencentes às classes IV ou V e associadas a suficiência pancreática
(O'Sullivan & Freedman, 2009). Este protocolo apresenta duas fases: na primeira,
realiza-se o IRT numa amostra de sangue seco; na segunda, repete-se o IRT numa
amostra de sangue fresca recolhida após 1-2 semanas de idade (IRT/IRT), ou realizase um teste de ADN para a mutação F508del (IRT/ADN). Os recém-nascidos com um
rastreio positivo são referenciados para realização de outros testes de diagnóstico
(teste de suor e/ou teste molecular do gene CFTR) (Moskowitz et al., 2008, Culling &
Ogle, 2010).
26
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Vários estudos têm demonstrado que o rastreio neonatal de FC conduz a
melhores resultados nutricionais (Farrell et al., 1997, Farrell et al., 2001). Existem
ainda dados que suportam a hipótese de que o aumento do crescimento na infância,
como resultado do rastreio neonatal, conduz a uma melhoria da função pulmonar ao
longo da vida (McKay et al., 2005, O'Sullivan & Freedman, 2009). Num futuro próximo,
a junção do rastreio neonatal com as terapias génicas permitirá uma qualidade de
vida, para os doentes com FC, muito próxima da população geral.
1.5. TRATAMENTO E NOVAS TERAPIAS
Sendo a FC uma doença complexa, exige uma abordagem holística para o seu
tratamento. Contudo, apesar do grande avanço no conhecimento da doença, o
tratamento da FC continua a basear-se num tratamento sintomático e na correção das
disfunções orgânicas (Dalcin & Abreu, 2008).
Reposição enzimática pancreática: aproximadamente 90% dos pacientes com
FC apresentam graves defeitos proteicos e má absorção de gordura devido à
insuficiência pancreática que apresentam. Com a utilização de enzimas pancreáticas
exógenas, há uma melhor nutrição logo desde o início da doença. As dosagens e
formulações das enzimas pancreáticas têm sido alteradas ao longo dos anos, contudo
o princípio permanece o mesmo: a substituição da amilase, lipase e protease que um
doente com FC é incapaz de produzir adequadamente. A administração de
bloqueadores de acidez do estômago e ingestão de vitaminas lipossolúveis, proteínas
e calorias são também fundamentais para uma boa nutrição essencial a longo prazo
(Davis, 2006, Moskowitz et al., 2008, Kreindler, 2010).
Doença pulmonar: a doença pulmonar na FC é descrita como um ciclo vicioso de
retenção de muco, infeção, inflamação e lesões nos tecidos, existindo diversas
terapias para cada fase deste processo. O muco produzido nos doentes com FC é
mais viscoso, bloqueando os pulmões e criando um ambiente propício a infeções.
Para tratar a acumulação de muco, existem diversos métodos mecânicos (como o
método de Ketchup-bottle ou dos coletes mecânicos) bem como terapias
farmacológicas, que passam pela administração de broncodilatadores que ajudam na
desobstrução das vias aéreas; ou DNase humana recombinante que funciona como
um agente mucolítico, degradando o ADN libertado pelos neutrófilos nas vias aéreas.
Para os doentes com FC em condições mais saudáveis é recomendada a prática de
exercício aeróbico. Relativamente às infeções bacterianas, existe uma administração
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constante de antibióticos orais e/ou intravenosos (nomeadamente azitromicina em
pacientes infetados com Pseudomonas), anti-inflamatórios e corticosteroides com o
objetivo de aumentar a função pulmonar dos doentes com FC. Está descrito que uma
intensa terapia supressiva na infância, antes de estar estabelecida uma infeção
crónica, permite uma qualidade de vida muito superior. Quando a lesão é irreversível e
os pulmões colapsam, a única hipótese é o transplante pulmonar (Davis, 2006, Dalcin
& Abreu, 2008, Moskowitz et al., 2008, Kreindler, 2010).
Novas terapias: existem em desenvolvimento duas abordagens principais para o
tratamento da FC. A primeira, a terapia génica que assenta na inserção de uma cópia
funcional do gene CFTR nas células epiteliais dos tecidos mais afetados pela FC.
Diversos estudos efetuados descrevem esta transferência através de vetores virais,
nanopartículas de ADN ou lípidos catiónicos complexados com ADN plasmídico. No
entanto, esta abordagem ainda não alcançou os resultados espectáveis (Kreindler,
2010). Assim, surgiu o desenvolvimento da segunda abordagem terapêutica, a
administração de compostos farmacológicos para corrigir ou potenciar a proteína
CFTR anormal. Estes fármacos são desenvolvidos para atuar de acordo com as
consequências funcionais causadas por cada classe mutacional presente no doente
com FC (Lubamba et al., 2012).
28
OBJETIVOS
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2. OBJETIVOS
Em Portugal, a prevalência da FC é ainda desconhecida, bem como a frequência
e o tipo de variações de sequência do gene CFTR característicos da população
portuguesa. Como tal, os objetivos deste trabalho foram:
- Avaliar o tipo e a frequência das variações identificadas no gene CFTR
detetadas durante o rastreio da população portuguesa;
- Avaliar a prevalência da FC na população Portuguesa.
Posteriormente,
será
necessário
uma
avaliação
clínica
dos
pacientes
identificados com diferentes genótipos CFTR, incluindo os pacientes com FC, bem
como os pacientes com CFTR-related disorders, para se estabelecer associações
entre fenótipo e genótipo identificados.
Assim, para cada paciente, será necessário identificar a evolução clínica das
diferentes conjugações de mutações do gene CFTR ao longo do tempo,
nomeadamente:
sintomatologia,
idade
do
aparecimento
e
correlação
genótipo/fenótipo; e estabelecer as manifestações fenotípicas associadas a estados
de heterozigotia do gene CFTR de forma a poder definir protocolos de avaliação e
seguimento clínico.
30
MATERIAIS E MÉTODOS
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3. MATERIAIS E MÉTODOS
O material necessário à realização deste trabalho prático encontra-se descrito
em anexo (Anexo II).
3.1. AMOSTRAS
O ADN genómico foi recolhido a partir de células da mucosa bucal de 912
crianças representativas da população Portuguesa. Estas crianças estão integradas no
projeto Geração XXI (implementado pelo Departamento de Epidemiologia da
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto). Este projeto consiste no
acompanhamento, desde 2005, de um conjunto de quase 8700 crianças e as suas
respetivas famílias, constituindo um trabalho ímpar em Portugal que busca o
acompanhamento da saúde deste grupo de crianças desde o seu nascimento até à
idade adulta, gerando conhecimento fundamental para retratar a realidade da saúde
no nosso país e para projetar o seu futuro (Geração 21, 2013).
Todas as análises genéticas foram efetuadas após consentimento informado dos
pais e confirmação da origem parental portuguesa (Anexo III).
Neste trabalho foram analisadas 194 amostras de ADN, de 98 crianças do sexo
masculino e 96 crianças do sexo feminino.
3.2. EXTRAÇÃO DE ADN
A extração de ADN das células do epitélio bucal foi efetuada com o kit comercial
JETQUICK Blood & Cell Culture (Genomed), de acordo com o protocolo fornecido pelo
kit. Depois de extraídas, as amostras foram conservadas a 4°C.
3.3. QUANTIFICAÇÃO DE ADN
As
amostras
de
ADN
foram
quantificadas
num
espetrofotómetro
NanoDrop2000C (ThermoScientific). A medição da absorvância no comprimento de
onda de 260 nm permitiu calcular a concentração de ADN em ng/µL.
3.4. ANÁLISE COMPLETA DA SEQUÊNCIA DO GENE CFTR
A pesquisa de variações de sequência nos 27 exões e nas regiões intrónicas
flanqueantes do gene CFTR foi efetuada através da amplificação do ADN genómico
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por Polymerase Chain Reaction (PCR), seguida de eletroforese capilar, purificação e
sequenciação do ADN amplificado.
3.4.1. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
A PCR foi efetuada num volume final de 20,0 µL, com as seguintes quantidades:
5,8 µL de H2O destilada (B/Braun), 2,0 µL de Buffer Taq com KCl (10x), 1,0 µL de
MgCl2 (25mM), 2,0 µL de mix de dNTPs (0,5 µL de cada dNTP) (10mM), 2,0 µL de
cada par de primers (10mM), 0,2 µL de enzima Taq DNA Polymerase (5U/µL)
(Fermentas) e 5,0 µL de amostra de ADN (Tabela VI).
Tabela VI – Componentes da PCR.
ADN
5,0 µL
H2O
5,8 µL
Buffer Taq
2,0 µL
MgCl2
1,0 µL
dNTPs
2,0 µL
Primer Forward
2,0 µL
Primer Reverse
2,0 µL
Enzima Taq DNA Polymerase
0,2 µL
Volume total
20,0 µL
As condições de PCR utilizadas foram as seguintes: 10 min a 94°C; 40 ciclos de
30 seg a 94°C, 30 seg à temperatura de annealing respetiva de cada par de primers e
30 seg a 72°C; seguidos de 10 min de extensão final a 72°C (Tabela VII).
Tabela VII – Condições da PCR.
Temperatura (°C)
Tempo
Desnaturação Inicial
94
3 min
Desnaturação
94
1 min
50/55/65
1 min
Extensão
72
1 min
Extensão Final
72
10 min
4
∞
Annealing
a
a
Ciclos
40
Temperatura variável de acordo com a sequência de cada par de primers.
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Para amplificação de alguns exões, de amostras com uma concentração muito
reduzida de ADN, foi utilizado Type-it® Microsatellite PCR Kit. Os componentes da
reação bem como as condições da PCR encontram-se descritas na Tabela VIII e
Tabela IX respetivamente.
Tabela VIII – Componentes da PCR com Type-it.
ADN
3,0 μL
H2O
6,0 μL
Reaction Mix (Type-it Multiplex PCR Master Mix)
10,0 μL
Primer Forward
0,5 μL
Primer Reverse
0,5 μL
20,0 μL
Volume Total
Tabela IX – Condições da PCR com Type-it.
Temperatura (°C)
Tempo
Desnaturação Inicial
95
5 min
Desnaturação
95
48 seg
50/55/65
48 seg
Extensão
72
1 min
Extensão Final
72
30 min
4
∞
Annealing
a
a
Ciclos
35
Temperatura variável de acordo com a sequência de cada par de primers.
Para cada exão e respetivas zonas intrónicas adjacentes foi utilizado um par
especifico de primers, cujas sequências se encontram descritas na Tabela X.
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Tabela X – Primers utilizados na amplificação dos exões do gene CFTR.
Exão
Tamanho do
Fragmento (bp)
1
243
2
240
3
323
4
438
5
215
6a
345
6b
417
7
390
8
225
9
561
10
341
11
229
12
306
13
906
14a
291
14b
174
15
401
16
338
17a
288
17b
452
18
277
19
449
20
260
21
477
22
322
23
227
24
329
Sequência dos Primers
F: TTG AGC GGC AGG CAC CCA G
R: ACA CGC CCT CCT CTT TCG TG
F: CCA AAT CAA GTG AAT ATC TG
R : TAA TAA TAT GAA TTT CTC TCT T
F: TTG GAT ATA CTT GTG TGA AT
R: TTC GTA GTC TTT TCA TAA TC
F: TCA CAT ATG GTA TGA CCC TC
R: TTG TAC CAG CTC ACT ACC TA
F: TAT TTG TAT TTT GTT TGT TG
R: TAA AAG ATT AAA TCA ATA GG
F: TGG AAG ATA CAA TGA CAC CTG
R: GCA TAG AGC AGT CCT GGT TT
F: TGG AAT GAG TCT GTA CAG CG
R: GAG GTG GAA GTC TAC CAT GA
F : CAT CCT GAA TTT TAT TGT TA
R : ATC ATA GTA TAT AAT GCA GC
F: ATT AAT GCT ATT CTG ATT CT
R: AGT TAG GTG TTT AGA GCA AA
F:TGA AAA TAT CTG ACA AAC TC
R: ACA GTG TTG AAT GTG GTG CA
F: TCC TGA GCG TGA TTT GAT AA
R: ATT TGG GTA GTG TGA AGG G
F: CAG ATT GAG CAT ACT AAA AGT G
R: ATT TAC AGC AAA TGC TTG CTA G
F: ATG ACC AGG AAA TAG AGA GG
R: GCT ACA TTC TGC CAT ACC AA
F: TGC TAA AAT ACG AGA CAT ATT GC
R: TAC ACC TTA TCC TAA TCC TAT
F: GGT GGC ATG AAA CTG TAC TG
R: TGT ATA CAT CCC CAA ACT ATC T
F: GGG AGG AAT TAG GTG AAG AT
R: TAC ATA CAA ACA TAG TGG ATT
F: TGT ATT GGA AAT TCA GTA AGT AAC TTT GG
R: AGC CAG CAC TGC CAT TAG AAA
F: TCT GAA TGC GTC TAC TGT GA
R: GCA ATA GAC AGG ACT TCA AC
F: TGC AAT GTG AAA ATG TTT AC
R: CTC TTA TAG CTT TTT TAC AA
F: TTC AAA GAA TGG CAC CAG TGT
R: TGC AGC ATT TTA TTC ATT GA
F: TAG GAG AAG TGT GAA TAA AG
R: ATA CTT TGT TAC TTG TCT GA
F: GTG AAA TTG TCT GCC ATT CT
R:ACT CCA TAT AAT AAA ACA TGT GTG
F: TAT GTC ACA GAA GTG ATC CC
R: AAA ACT GGC TAA GTC CTT TT
F: AAT GTT CAC AAG GGA CTC CA
R: CAA AAG TAC CTG TTG CTC CA
F: GCC CGC TGT GGT ATC TGA ACT ATC TT
R: TGT CAC CAT GAA GCA GGC AT
F: CTG TTC TGT GAT ATT ATG TG
R: ATG AGA TCT TAA GTA AAG TT
F: TCC CTG CTC TGG TCT GAC CTG C
R: CAT GAG GTG ACT GTC CCA CGA G
Temperatura de
Annealing (°C)
55
50
56
55
50
55
55
55
55
55
55
55
55
50
50
50
55
55
50
55
50
50
50
55
50
50
65
35
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
3.4.2. ELETROFORESE CAPILAR
A confirmação e a determinação dos tamanhos dos produtos amplificados foram
realizadas através de eletroforese capilar no aparelho QIAxcel, com o kit QIAxel DNA
Screening e com o software BioCalculatorTM (Quiagen).
Ao contrário da tradicional electroforese em gel de agarose, a separação das
moléculas de ácidos nucleicos é realizada num capilar preenchido com gel. As
amostras são automaticamente carregadas em capilares individuais e é aplicada uma
voltagem específica. Como as moléculas dos ácidos nucleicos são carregadas
negativamente migram através do capilar em direção ao terminal com carga positiva,
passando por um detetor que mede o sinal de fluorescência. Tal como acontece com a
eletroforese em gel de agarose, as moléculas de baixo peso molecular migram mais
rapidamente do que as moléculas de alto peso molecular. De seguida, um
fotomultiplicador converte o sinal de fluorescência em dados eletrónicos, os quais são,
então, transferidos para um computador para processamento adicional usando o
software BioCalculatorTM (Quiagen).Os resultados são apresentados sob a forma de
um eletroferograma e numa imagem virtual de um gel (Figura 7).
Figura
7
–
Processo
de
separação
das
amostras
e
resultados.
Adaptado
http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Automated-Solutions/Detection-and-Analysis/QIAxcel-AdvancedSystem#orderinginformation - Qiagen, 2013.
de
36
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
3.4.3. PURIFICAÇÃO
A purificação dos produtos amplificados foi efetuada numa placa magnética
utilizando o kit Agencourt®AMPure®XP PCR Purification de acordo com o protocolo
fornecido (Protocol 000387v001 - BeckmanCoulter) (Figura 8).
Figura 8 – Esquema do processo de purificação: 1. Reação de PCR; 2. Ligação das partículas magnéticas aos
amplicões; 3. Separação dos amplicões ligados às partículas magnéticas dos restantes contaminantes; 4.
Lavagem dos amplicões com etanol; 5. Eluição dos amplicões; 6. Transferência dos amplicões purificados
para
um
novo
tubo.
Adaptado
de
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/research-anddiscovery/products-and-services/nucleic-acid-sample-preparation/agencourt-ampure-xp-pcrpurification/index.htm - Beckman Coulter, 2013a.
3.4.4. REAÇÃO DE SEQUENCIAÇÃO
A reação de sequenciação foi realizada com o kit ABI PRISM BigDye Terminator
v3.1 Cycle Sequencing (AppliedBiosystems). Para um volume final de 10,0 µL,
adicionou-se: até um máximo de 6,5 µL de produto de PCR purificado (dependendo da
intensidade dos produtos de PCR), 2,0 µL de Terminator Ready Reaction Mix (2,5x),
1,0 µL de Sequencing Buffer (5x), 0,5 µL de primer forward ou reverse (10 mM) e
perfez-se o volume com H2O destilada (B/Braun) (Tabela XI).
Tabela XI – Componentes da reação de sequenciação.
Produto Purificado
H2 O
a
Sequencing Buffer
1,0 µL
Terminator Ready Reaction Mix
2,0 µL
Primer
0,5 µL
Volume Total
a
até 6,5 µL
10,0 µL
Ajustar o volume de H2O para um volume final de reação de 10,0 μL.
37
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
Os primers utilizados nesta reação foram os mesmos utilizados na PCR (Tabela
X), com exceção do primer forward do exão 9, em que se utilizou o primer 9i2F: 5’GGG GAA TTA TTT GAG AAA GC-3’. As condições da reação encontram-se descritas
na Tabela XII.
Tabela XII – Condições da reação de sequenciação.
Temperatura (°C)
Tempo
Desnaturação Inicial
96
3 min
Desnaturação
96
10 seg
Annealing
50
5 seg
Extensão
60
4 min
4
∞
Ciclos
24
3.4.5. PRECIPITAÇÃO
A precipitação dos produtos para sequenciação foi executada numa placa
magnética utilizando o kit Agencourt®CleanSEQ® Dye-Terminator Removal (Protocol
000600v032 - BeckmanCoulter®) (Figura 9).
Figura 9 – Esquema do processo de precipitação: 1. Adição do reagente Agencourt CleanSEQ e etanol aos
produtos de sequenciação; 2. Ligação das partículas magnéticas aos produtos de sequenciação; 3. Separação
dos produtos de sequenciação dos contaminantes; 4. Lavagem com etanol; 5. Eluição dos produtos de
sequenciação; 6. Transferência dos produtos precipitados para um novo tubo. Adaptado de
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/nucleic-acidsample-preparation/agencourt-cleanseq-dye-terminator-removal/index.htm - Beckman Coulter, 2013b.
38
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
3.4.6. SEQUENCIAÇÃO
Para a sequenciação, foi transferido 10 µL de cada produto precipitado para uma
placa de sequenciação e estes foram sequenciados num sequenciador automático ABI
Prism 3500, com o polímero POP-7.
3.5. ANÁLISE BIOINFORMÁTICA DAS SEQUÊNCIAS
A análise das sequências foi realizada com o programa bioinformático
Sequencing Analysis (AppliedBiosystems) e com o programa Basic Local Alignment
Search Tool (BLAST - NCBI) o que permitiu efetuar o alinhamento das sequências das
amostras em estudo com a sequência de referência do gene CFTR (Cystic Fibrosis
Mutation Database). As alterações detetadas foram identificadas recorrendo às bases
de dados Cystic Fibrosis Mutation Database (CFTR1) e Clinical and Functional
Translation of CFTR (CFTR2).
39
RESULTADOS
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
4. RESULTADOS
Neste trabalho foram analisados os 27 exões e respetivas regiões intrónicas
flanqueantes do gene CFTR, a partir do ADN extraído de 194 amostras da população
portuguesa. Para tal, foi efetuada a técnica de PCR seguida de sequenciação direta do
ADN amplificado. Após a extração do ADN, as amostras foram quantificadas, sendo
que o valor médio de concentração de ADN foi de 10,0 ng/μL. Seguidamente, foram
amplificados todos exões do gene CFTR das 194 amostras, utilizando-se um par
especifico de primers para cada exão. A amplificação dos produtos de PCR foi
confirmada por eletroforese capilar (Figura 10).
Figura 10 – Imagem virtual de um gel correspondente à amplificação dos 27 exões do gene CFTR de uma
amostra em estudo. As duas bandas observadas para o exão 6b e para o exão 10 correspondem à variação de
sequência c.744-31TTGA[3_7] e à mutação F508del, respetivamente.
41
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
Depois de confirmada a amplificação dos produtos de PCR, correspondentes
aos 27 exões e regiões intrónicas flanqueantes do gene CFTR das 194 amostras,
foram efetuadas as suas purificações e respetivas sequenciações. As sequências
resultantes (Figura 11) foram de seguida analisadas, com recurso ao programa
bioinformático Sequencing Analysis (AppliedBiosystems), ao programa BLAST e às
bases de dados CFTR e CFTR2.
Figura 11 – Sequência forward do exão 1 e respetivas regiões intrónicas. O exão 1 começa no codão ATG
(codão de iniciação – Metionina) e termina em CAG.
4.1. VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA CFTR
No total, foram detetadas 39 diferentes variações de sequência nas 194
amostras analisadas, tal como se descreve na Tabela XIII. Não foram observadas
quaisquer alterações nos exões 1, 2, 4, 6a, 6b, 14b, 16, 18, 22, e 23, bem como nas
regiões flanqueantes correspondentes dos intrões 1, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14a,
14b, 16, 18, 19, 21, 22, 23 e 3’UTR.
As variações de sequência c.1521-1523delCTT (p.F508del), no exão 10, e
c.3154T>G (p.F1052V), no exão 17b, foram observadas em duas amostras. A variante
IVS8T5, no intrão 8, foi detetada em doze amostras, correspondendo a uma
frequência alélica de 3%. Estas variações de sequência são classificadas como
mutações causadoras de FC pela base de dados CFTR2 (CFTR2@Johns Hopkins,
2013). A penetrância da variante IVS8T5 no splicing do exão 9, é dependente do
número de repetições IVS8(TG)m, estando as variantes IVS8(TG)11, 12 ou 13
associadas a um fenótipo de CBAVD. A variante IVS8T5 está associada à variante
IVS8(TG)11 em sete amostras e à variante IVS8(TG)12 em cinco amostras.
A variação de sequência c.224G>A (p.R75Q), no exão 3, foi detetada numa
amostra; a variação de sequência c.3705T>G (p.S1235R), no exão 19, foi observada
em duas amostras; as variações de sequência c.2260G>A (p.V745M), no exão 13, e
42
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
c.2991G>C (p.L997F), no exão 17a, foram observadas em cinco amostras; a variação
de sequência c.1727G>C (p.G576A), no exão 12, foi observada em sete amostras; e a
variação de sequência c.2002C>T (p.R668C), no exão 13, foi detetada em nove
amostras. Estas variações de sequência são classificadas como mutações que não
causam FC quando combinadas com uma mutação causadora de FC clássica, pela
base de dados CFTR2 (CFTR2@Johns Hopkins, 2013), no entanto estão associadas
a fenótipos de CFTR-RD.
As variações de sequência c.509G>A (p.R170H), no exão 5, c.890G>A
(p.R297Q), no exão 7, c.1327G>T (p.D443Y), no exão 9, c.2173G>A (p.E725K), no
exão 13, c.2900C>T (p.L967S), no exão 15, c.3041A>G (p.Y1014C), no exão 17a e
c.3322G>C (p.V1108L), no exão 17b, foram detetadas numa amostra e a variação de
sequência c.1052C>G (p.T351S), no exão 7, foi observada em duas amostras. Estas
variações de sequência não constam da base de dados CFTR2, não havendo assim
um consenso relativo à sua classificação como mutação, contudo são encontradas em
indivíduos com CFTR-RD.
Considerando as dezassete diferentes variações de sequência associadas a FC
ou a CFTR-RD, quinze (88,2%) são alterações missense conduzindo à alteração de
um aminoácido, uma (5,9%) altera o local de splicing e uma (5,9%) provoca a deleção
de um aminoácido.
As restantes vinte e duas diferentes variações de sequência, detetadas nas 194
amostras analisadas, são consideradas como polimorfismos, isto é, variações de
sequência não causadoras de FC ou de CFTR-RD.
Foram
identificadas
três
variações
de
sequência
pela
primeira
vez,
c.273+35C>T, no intrão 3, c.744-31TTGA(3), no intrão 6a e c.1614T>C (p.A538A), no
exão 11, que não conduz à alteração de aminoácido. Estas variações de sequência
foram analisadas através dos programas bioinformáticos MutationTaster, PMut e SIFT
tendo sido consideradas como polimorfismos.
As frequências genotípicas e alélicas de cada variação de sequência estão
apresentadas na Tabela XIII.
43
FCUP
44
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Tabela XIII – Frequências genotípicas e alélicas das variações de sequência detetadas nas 194 amostras em estudo.
Localização
Efeito
Promotor
Variação de sequência
Exão 3
Substituição de aa
Intrão 3
Variação de sequência
Exão 5
Substituição de aa
Nome
(Proteína)
Nucleótido
c.-8G>C
p.R75Q
c.224G>A
p.R170H
Intrão 6b
Exão 7
Exão 8
G/G = 178
G/C = 16
C/C = 0
G = 0,959
C = 0,041
G/G = 193
G/A = 1
A/A = 0
G = 0,997
A = 0,003
C/C = 193
C/T = 1
T/T = 0
C = 0,997
T = 0,003
c.509G>A
G/G = 193
G/A = 1
A/A = 0
G = 0,997
A = 0,003
c.743+40 A>G
A/A = 180
A/G = 14
G/G = 0
A = 0,964
G = 0,036
T/T = 0
C = 0,907
T = 0,093
Variação de sequência
c.744-31TTGA[3_7]
Variação de sequência
c.869+11C>T
C/C = 158
3/5 = 1
5/5 = 2
5/6 = 62
6/6 = 127
6/7 = 2
C/T = 36
Exão 10
3 = 0,003
5 = 0,173
6 = 0,819
7 = 0,005
Substituição de aa
p.R297Q
c.890 G>A
G/G = 193
G/A = 1
A/A = 0
G = 0,997
A = 0,003
Substituição de aa
p.T351S
c.1052C>G
C/C = 192
C/G = 2
G/G = 0
C = 0,995
G = 0,005
Substituição de aa
p.T388M
c.1163C>T
C/C = 193
T/T = 0
C = 0,997
T = 0,003
Variação de sequência
IVS8(TG)m
c. 1242-35_1242-12TG[9_13]
Splicing anormal
IVS8(T)n
c. 1210-12T[5_9]
C/T = 1
TG10TG10 = 23
TG10TG11 = 73
TG10TG12 = 6
TG11TG11 = 73
TG11TG12 = 17
TG12TG12 = 2
T5/T7 = 11
T5/T9 = 1
T7/T7 = 126
T7/T9 = 53
T9/T9 = 3
Substituição de aa
p.D443Y
c.1327G>T
G/G =193
G/T = 1
T/T = 0
G = 0,997
T = 0,003
Substituição de aa
p.M470V
c.1408A>G
A/A = 27
A/G = 124
G/G = 43
A = 0,459
G = 0,541
Deleção de aa
p.F508del
c.1521_1523delCTT
CTT/CTT = 192
CTT/- = 2
-/- = 0
CTT = 0,995
- = 0,005
b
Intrão 8
Exão 9
Frequência Alélica
c.273+35C>T
a
Variação de sequência
Intrão 6a
Frequência Genotípica
TG10 = 0,322
TG11 = 0,608
TG12 = 0,070
T5 = 0,031
T7 = 0,814
T9 = 0,155
FCUP
45
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
Substituição de aa
p.F508C
c.1523T>G
T/T = 191
T/G = 3
G/G =0
T = 0,992
G = 0,008
Variação de sequência
p.E528E
c.1584G>A
G/G = 180
G/A = 14
A/A = 0
G = 0,964
A = 0,036
a
Exão 11
Variação de sequência
p.A538A
c.1614T>C
T/T = 193
T/C = 1
C/C = 0
T = 0,997
C = 0,003
Exão 12
Substituição de aa
p.G576A
c. 1727G>C
G/G = 187
G/C = 7
C/C = 0
G = 0,982
C = 0,018
Substituição de aa
p.R668C
c.2002C>T
C/C = 185
C/T = 9
T/T = 0
C = 0,977
T = 0,023
Substituição de aa
p.E725K
c.2173G>A
G/G = 193
G/A = 1
A/A = 0
G = 0,997
A = 0,003
Substituição de aa
p.V754M
c.2260G>A
G/G = 189
G/A = 5
A/A = 0
G = 0,988
A = 0,012
Variação de sequência
p.T854T
c.2562T>G
T/T = 84
T/G = 95
G/G = 15
T = 0,678
G = 0,322
Variação de sequência
p.T966T
c.2898G>A
G/G = 192
G/A = 2
A/A = 0
G = 0,995
A = 0,005
Substituição de aa
p.L967S
c.2900T>C
T/T = 193
T/C = 1
C/C = 0
T = 0,997
C = 0,003
c.2909-71G>C
G/G = 192
G/C = 2
C/C = 0
G = 0,995
C = 0,005
Exão 13
Exão 14a
Exão 15
Intrão 15
Exão 17a
Intrão 17a
Exão 17b
Variação de sequência
Substituição de aa
p.L997F
c.2991G>C
G/G = 189
G/C = 5
C/C = 0
G = 0,988
C = 0,012
Substituição de aa
p.Y1014C
c.3041A>G
A/A = 193
A/G = 1
G/G = 0
A = 0,997
G = 0,003
c.3140-92T>C
T/T = 183
T/C = 11
C/C = 0
T = 0,972
C = 0,028
Variação de sequência
Substituição de aa
p.F1052V
c.3154T>G
T/T = 192
T/G = 2
G/G = 0
T = 0,995
G = 0,005
Variação de sequência
p.T1095T
c.3285A>T
A/A = 191
A/T = 3
T/T = 0
A = 0,992
T = 0,008
Substituição de aa
p.V1108L
c.3322G>C
G/G = 193
G/C = 1
C/C = 0
G = 0,997
C = 0,003
Intrão 17b
Variação de sequência
c.3367+37G>A
G/G = 192
G/A = 2
A/A = 0
G = 0,995
A = 0,005
Exão 19
Substituição de aa
p.S1235R
c.3705T>G
T/T 0 192
T/G = 2
G/G = 0
T = 0,995
G = 0,005
Exão 20
Variação de sequência
p.P1290P
c.3870A>G
A/A = 177
A/G = 17
G/G = 0
A = 0,956
G = 0,044
Intrão 20
Variação de sequência
c.3874-200G>A
G/G = 192
G/A = 2
A/A = 0
G = 0,995
A = 0,005
Exão 21
Variação de sequência
p.T1299T
c.3897A>G
A/A = 193
A/G = 1
G/G = 0
A = 0,997
G = 0,003
Variação de sequência
p.Y1424Y
c.4272C>T
C/C = 191
C/T = 3
T/T = 0
C = 0,992
T = 0,008
Variação de sequência
p.Q1463Q
c.4389G>A
G/G = 93
G/A = 93
A/A = 8
G = 0,719
A = 0,281
Exão 24
a
Variação de sequência descrita pela primeira vez; b A variação IVS8(TG)m condiciona a penetrância da variante IVS8T5.
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
4.2. GENÓTIPOS CFTR
Relativamente aos genótipos CFTR identificados nas amostras analisadas,
foram detetados quarenta e um indivíduos heterozigóticos para uma ou duas variações
de sequência no gene CFTR, associadas a FC clássica ou CFTR-RD (Tabela XIV).
Destes alelos mutados, sete correspondem a alelos complexos, um D443Y-G576AR668C e seis G576A-R668C. Foram ainda identificadas cinco crianças com duas
variações de sequência: uma criança do sexo masculino com as mutações p.F508del
e p.F1052V e quatro crianças, três do sexo masculino e uma do sexo feminino, com as
variações
de
sequência
p.R297Q/p.E725K,
G576A-R668C/p.L997F,
IVS8T5(TG)12/p.S1235R e IVS8T5(TG)12/p.L967S, respetivamente.
Assim, a taxa de portadores de uma variação de sequência CFTR é de 18,6%
(36/194) e a prevalência de FC clássica ou CFTR-RD é de 2,6% (5/194).
Tabela XIV – Genótipos dos quarenta e três indivíduos heterozigóticos para uma ou duas variações de
sequência no gene CFTR.
Genótipo
Genótipo IVS8Tn(TG)m
Nº amostras
p.R75Q / -
T7(TG)11
T7(TG)11
1
p.R170H / -
T7(TG)10
T7(TG)11
1
p.R297Q / p.E725K
T7(TG)11
T7(TG)11
1
p.T351S / -
T7(TG)10
T9(TG)11
2
D443Y-G576A-R668C / -
a
T7(TG)10
T7(TG)10
1
G576A-R668C / -
a
T7(TG)10
T7(TG)11
3
G576A-R668C / -
a
T7(TG)11
T7(TG)11
1
G576A-R668C / -
a
T7(TG)10
T7(TG)10
1
G576A-R668C / p.L997F
T7(TG)10
T9(TG)10
1
p.R668C / -
T7(TG)10
T7(TG)12
1
p.R668C / -
T7(TG)10
T7(TG)11
1
p.F508del / -
T7(TG)10
T9(TG)11
1
p.F508del / p.F1052V
T7(TG)10
T9(TG)10
1
p.F1052V / -
T7(TG)10
T7(TG)11
1
p.V754M / -
T7(TG)11
T9(TG)10
3
p.V754M / -
T9(TG)10
T9(TG)10
1
p.V754M / -
T7(TG)11
T9(TG)11
1
p.L967S / -
T5(TG)12
T7(TG)11
1
p.L997F / -
T7(TG)10
T9(TG)10
1
p.L997F / -
T7(TG)10
T9(TG)11
2
p.L997F / -
T7(TG)11
T9(TG)10
1
p.Y1014C / -
T7(TG)11
T9(TG)11
1
p.V1108L / -
T7(TG)11
T7(TG)11
1
46
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
a
p.S1235R / -
T7(TG)11
T7(TG)12
1
p.S1235R / -
T5(TG)12
T7(TG)12
1
-/-
T5(TG)11
T7(TG)11
6
-/-
T5(TG)12
T7(TG)11
1
-/-
T5(TG)12
T7(TG)12
1
-/-
T5(TG)11
T9(TG)11
1
-/-
T5(TG)12
T7(TG)10
1
Alelos complexos: mutações no mesmo alelo
47
DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
5. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO
A FC é a doença genética autossómica recessiva mais frequente na população
Caucasiana com uma incidência de 1:2500 nascimentos e uma frequência de
portadores de 1:25 (Walters & Mehta, 2007). Esta doença é causada por mutações no
gene CFTR, estando descritas até à data cerca de 2000 variações de sequência
diferentes (Cystic Fibrosis Mutation Database, 2011) com frequências e distribuições
que variam geograficamente (Salvatore et al., 2011). Este facto conduz à necessidade
de determinar a frequência e distribuição das variações de sequência do gene CFTR
nas diferentes populações e, consequentemente, a prevalência de FC, de modo a
melhorar o diagnóstico efetuado.
Na genética da FC, existe uma grande heterogeneidade relativamente às
variações de sequência, o que dificulta a sua classificação. Zielenski e Tsui, em 1995,
propuseram uma classificação em 5 classes de acordo com os efeitos provocados
pelas mutações na proteína CFTR (Zielenski & Tsui, 1995). Castellani et al, em 2008,
dividiram as diferentes variações de sequência em 4 grupos: mutações causadoras de
FC, mutações que resultam em CFTR-RD, mutações sem consequências clínicas e
mutações com relevância desconhecida (Castellani et al., 2008). A base de dados
CFTR1 também fornece uma classificação, baseada nos termos polimorfismo e
mutação, para as variações de sequência descritas (Cystic Fibrosis Mutation
Database, 2011).
Contudo, devido à ausência de consenso quanto à classificação de grande parte
destas variações de sequência, foi criada a base de dados CFTR2 por forma a
uniformizar todos estes dados (CFTR2@Johns Hopkins, 2013). Esta nova base de
dados engloba informações sobre os pacientes com FC a nível mundial. Para
determinar se uma variação de sequência em particular causa FC, são utilizados três
critérios diferentes:
a) Características clínicas dos pacientes com a mutação em questão em
heterozigotia composta com uma mutação conhecida por causar FC. Nestes pacientes
são efetuados testes funcionais (teste de suor), é analisada a função pulmonar e a
função pancreática e efetuada a análise microbiológica ao muco para determinar se os
indivíduos com a mutação em estudo têm FC;
b) Testes funcionais in vitro, através da avaliação da disfunção celular
provocada pela mutação em causa;
c) Algoritmos de previsão da patogenicidade da mutação.
49
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
No entanto, até à data apenas estão incluídas na base de dados CFTR2 as 160
variações de sequência mais comuns, estando esta base de dados em constante
atualização.
O presente estudo consistiu na análise de todos os exões e respetivas regiões
intrónicas flanqueantes do gene CFTR em 194 amostras de ADN. No total, foram
identificadas trinta e nove diferentes variações de sequência, em que dezassete
correspondem a variações de sequência associadas a FC ou CFTR-RD e as restantes
vinte e duas a polimorfismos.
Das dezassete variações de sequência identificadas, a mais comum foi a
variante IVS8T5, com uma frequência alélica de 3,1% (12/388), estando de acordo
com a frequência já descrita previamente para a população Portuguesa (3,5%)
(Grangeia et al., 2004) e com a frequência de 5% na população Caucasiana,
aumentando para 25% em pacientes com CBAVD (Chillon et al., 1995, WHO, 2004).
Esta variante pode estar associada a diversos fenótipos, desde o assintomático a
CBAVD, ou mesmo FC moderada (Cuppens et al., 1998).
A penetrância da variante IVS8T5 no splicing normal do exão 9 pode ser
condicionada pelas variantes IVS8(TG)m e pelo polimorfismo p.M470V (Groman et al.,
2004). Neste estudo, a variante IVS8T5 está associada a IVS8(TG)11, em sete
amostras e a IVS8(TG)12, em cinco amostras. Relativamente ao polimorfismo
p.M470V, o alelo V (54,1%) apresentou uma frequência superior ao alelo M (45,9%), o
que já está descrito para a população caucasiana (Huang et al., 2008). Este
polimorfismo afeta a atividade intrínseca de Cl- (afetando a função da proteína CFTR)
e aumenta a penetrância da variante IVS8T5 (diminuindo o nível de mARN normal)
(Cuppens et al., 1998).
As variações de sequência p.L997F e p.V754M foram identificadas em cinco
amostras, apresentando uma frequência alélica de 1,2% (5/388). A variação de
sequência p.L997F encontra-se localizada no exão 17a e é considerada rara em
doentes com FC. Consiste na substituição do aminoácido Leucina pelo aminoácido
Fenilalanina e é normalmente associada a doença pulmonar, bronquiectasias
disseminadas, pancreatites recorrentes e CBAVD (Castellani et al., 2001, Conklin et
al., 2008, Lucarelli et al., 2010). A variação de sequência p.V754M está localizada no
exão 13 e consiste na substituição do aminoácido Valina pelo aminoácido Metionina.
Está associada a FC moderada quando combinada com as variações de sequência
1812-1G>A ou p.G542X (Loumi et al., 1999).
50
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
Foram identificados dois alelos complexos neste trabalho: G576A-R668C, em
seis amostras, e D443Y-G576A-R668C, numa amostra. Dados epidemiológicos
evidenciam que o alelo complexo G576A-R668C é uma variante frequente na
população geral (El-Seedy et al., 2012).
De acordo com publicações anteriores, estes alelos complexos, quando em trans
com uma mutação causadora de FC, estão associados a fenótipos moderados (CFTRRD), em particular CBAVD. A variação de sequência p.D443Y, localizada no exão 9,
apresenta efeitos ao nível da maturação da proteína CFTR, e as variações de
sequência p.G576A e p.R668C, localizadas nos exões 12 e 13 respetivamente, têm
efeitos na atividade do canal de Cl-. Apesar da observação de uma associação entre a
diminuição da função de CFTR com o alelo complexo D443Y-G576A-R668C
(provavelmente devido ao efeito combinado das três variações de sequência), a
proteína apresenta uma função residual, correspondente a fenótipos moderados e
CFTR-RD (El-Seedy et al., 2012).
Esta associação das variações de sequência p.D443Y, p.G576A e p.R668C em
alelos complexos foi feita com base em publicações anteriores (Pignatti et al., 1995,
Abramowicz et al., 2000), no entanto é necessário, nestas amostras, a avaliação dos
progenitores para confirmar se as variações de sequência estão de facto em cis, ou
seja, que são alelos complexos.
De acordo com os resultados obtidos, foram identificadas cinco amostras com
duas variações de sequência. Uma criança do sexo masculino com as mutações
p.F508del e p.F1052V e quatro crianças, três do sexo masculino e uma do sexo
feminino, com as variações de sequência p.R297Q/ p.E725K, G576A-R668C/ p.L997F,
IVS8T5(TG)12/ p.S1235R e IVS8T5(TG)12/ p.L967S, respetivamente. Estas variações
de sequência serão estudadas nos progenitores de forma a confirmar se se encontram
em cis ou em trans.
A associação, em heterozigotia composta, das variações de sequência p.R297Q/
p.E725K, G576A-R668C/ p.L997F, IVS8T5(TG)12/ p.L967S e IVS8T5(TG)12/
p.S1235R pode corresponder a um fenótipo de CFTR-RD, nomeadamente
bronquiectasias (Pignatti et al., 1995, Bombieri et al., 1998) e, no caso das crianças do
sexo masculino, CBAVD (WHO, 2004, Grangeia et al., 2007). Contudo, é necessária
uma avaliação clínica precisa pois não é possível prever qual o fenótipo que cada
individuo manifesta baseado exclusivamente no genótipo.
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FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
Relativamente à amostra com as variações de sequência p.F508del/ p.F1052V,
em heterozigotia composta, pode resultar num fenótipo de FC clássica. Esta
classificação é baseada na informação da base de dados CFTR2 (CFTR2@Johns
Hopkins, 2013). Porém, devido à heterogeneidade da doença, não é possível prever o
fenótipo deste individuo apenas com a informação genotípica de que dispomos
(apesar da mutação F508del causar FC clássica), sendo necessária a sua avaliação
clinica para realização de outros estudos, nomeadamente o teste de suor, para
confirmação do diagnóstico e corelação genótipo/fenótipo. É também necessária,
nestes cinco casos, a avaliação dos progenitores por forma a confirmar a segregação
destas alterações.
Assim, a prevalência de FC ou CFTR-RD, na população em estudo, é de 2,6%
(5/194), sendo que podemos considerar a prevalência de FC clássica em 0,5%
(1/194), um valor muito superior ao reportado para a população Portuguesa (1/14000)
(Lemos et al., 2010) e para a população Caucasiana (1/2500). Com os resultados
obtidos, podemos também estimar uma frequência de portadores de uma variação de
sequência de 18,6% (36/194), um valor cerca de cinco vezes superior ao reportado
para outras populações (1/25) (Welsh et al., 2001). Contudo, este é apenas uma
abordagem inicial de um estudo epidemiológico da população Portuguesa, que prevê
incluir a análise das 912 amostras.
Em conclusão, existe uma urgente necessidade de determinar a frequência e a
distribuição das mutações do gene CFTR para cada população, para que seja possível
oferecer um diagnóstico mais adaptado e uma melhor interpretação fenotípica de
acordo com a população em estudo (Salvatore et al., 2011, Farjadian et al., 2013).
Com este trabalho, ao estudar a população Portuguesa, foi obtida uma
frequência e uma distribuição de mutações CFTR muito diferente das já descritas para
outras populações. Sendo os kits comerciais a primeira linha de diagnóstico da FC, é
necessário perceber que estes necessitam de ser adaptados ao espetro de mutações
mais frequente em cada população para assim, otimizar este diagnóstico e
consequentemente melhorar a terapêutica da doença.
Foi ainda discutida a difícil correlação genótipo-fenótipo, devido à grande
heterogeneidade das diferentes variações do gene CFTR, o que dificulta a
determinação de um diagnóstico de FC ou CFTR-RD. Portando, é de todo o interesse
realizar um levantamento de todos os dados dos pacientes no sentido de determinar e
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FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
fundamentar os efeitos que cada variação exerce na proteína CFTR, diretamente ou
através da sua capacidade de modificar o efeito de outras variações.
O trabalho futuro consiste na otimização de um protocolo para prosseguir este
projeto através da técnica de Sequenciação de Nova Geração (NGS – Next
Generation Sequencing). Após a sequenciação das restantes amostras, é necessário
avaliar o espectro de mutações identificado, de modo a obter um painel de mutações
específico da população Portuguesa que permita validar o diagnóstico e,
eventualmente, o estabelecimento de uma correlação genótipo-fenótipo imediata.
53
BIBLIOGRAFIA
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
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57
FCUP
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58
FCUP
FIBROSE CÍSTICA: ESTUDO DAS VARIAÇÕES DE SEQUÊNCIA DO GENE CFTR NA POPULAÇÃO PEDIÁTRICA PORTUGUESA
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59
ANEXOS
FCUP
Fibrose Cística: Estudo das Variações de Sequência do gene CFTR na População Pediátrica Portuguesa
ANEXO I
Tabela 1 – Mutações do gene CFTR detetadas com o kit comercial Devyser CFTR
Mutação Core
Denominação
Localização
711+1G>T
c.579+1G>T
Intrão 5
3120+1G>A
c.2988+1G>A
Intrão 18
621+1G>T
c.489+1G>T
Intrão 4
1717-1G>A
c.1585-1G>A
Intrão 11
CFTRdele2,3(21kb)
c.54-5940_273+10250del21kb
Intrão 1 a Exão 3
3849+10kbC>T
c.3717+12191C>T
Intrão 22
2789+5G>A
c.2657+5G>A
Intrão 16
1898+1G>A
c.1766+1G>A
Intrão 13
G542X
c.1624G>T
Exão 12
G85E
c.254G>A
Exão 3
Y1092X(C>A)
c.3276C>A
Exão 20
G551D
c.1652G>A
Exão 12
R553X
c.1657C>T
Exão 12
3659delC
c.3528delC
Exão 22
N1303K
c.3909C>G
Exão 24
R560T
c.1679G>C
Exão 12
R117H(350G>A)
c.350G>A
Exão 4
R1162X
c.3484C>T
Exão 22
L1077P
c.3230T>C
Exão 20
R117C(349C>T)
c.349C>T
Exão 4
R1066C
c.3197G>A
Exão 20
L1065P
c.3194T>C
Exão 20
W1282X
c.3846G>A
Exão 23
R347H
c.1040G>A
Exão 8
I507del
c.1519_1521delATC
Exão 11
T338I
c.1013C>T
Exão 8
F508del
c.1521_1523delCTT
Exão 11
I336K
c.1007T>A
Exão 8
1677delTA
c.1545_1546delTA
Exão 11
R334W
c.1000C>T
Exão 8
3272-26A>G
c.3140-26A>G
Intrão 19
1078delT
c.948delT
Exão 8
2183AA>G
c.2051_2052delAAinsG
Exão 14
2184insA
c.2052_2053insA
Exão 14
2143delT
c.2012delT
Exão 14
5T(TGn)
c.1210-34TG[9_13]T[5]
Intrão 9
Adaptado de Devyser, Palex Medical SA, Barcelona, Espanha.
61
FCUP
Fibrose Cística: Estudo das Variações de Sequência do gene CFTR na População Pediátrica Portuguesa
ANEXO II
Tabela 2 – Lista de materiais
Reagentes
Marca
Água destilada estéril
B-Braun
dNTPs
Invitrogen
Etanol 70% e 85%
Merck Millipore
Kit ABI PRISM BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing
Applied Biosystems
Kit Agencourt®AMPure®XP PCR Purification
Beckman Coulter
Kit Agencourt®CleanSEQ® Dye-Terminator Removal
Beckman Coulter
Kit JETQUICK Blood & Cell Culture
Genomed
Kit QIAxel DNA Screening
Qiagen
Kit Taq Polymerase
Fermentas
Kit Type-it® Microsatellite PCR
Qiagen
Primers
Thermo Lab e Frilabo
Polímero POP-7
Applied Biosystems
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FCUP
Fibrose Cística: Estudo das Variações de Sequência do gene CFTR na População Pediátrica Portuguesa
ANEXO III
63