SELEÇÃO DE PRIMERS PARA LOCI SSR POLIMÓRFICOS PARA AS
LINHAGENS L7 E L9 DE MILHO PIPOCA E PARA O MILHO 53F, H17 E
H31.
Camila Schelles Gonçalves (PIBIC/CNPQ-UEM), Juliana Franzoni dos
Santos (Doutoranda/CNPq-UEM), Liriana Belizario Cantagalli (Pós-doutorado/
CNPq-UEM), Maria de Fátima Pires da Silva Machado (Orientação/UEM), e-mail:
mfpsmachado@uem, Claudete Aparecida Mangolin (Co-orientação/UEM)
Universidade Estadual de Maringá/Centro de Ciências Biológicas –
Maringá – PR
Área e sub-área do conhecimento: Genética
Palavra chave: milho pipoca, microssatelites, loci SSR.
Resumo:
A proposta no presente estudo foi testar os primers para loci formados
por seqüencias de bases de DNA repetidas (loci SSR), desenvolvidos para
milho comum, em linhagens de milho pipoca e de milho comum. O objetivo é
selecionar os primers com potencial para amplificar os loci SSR em
linhagens que podem ser utilizados para construção do mapa de ligação.
Dentre os 18 primers testados, 88,8% podem ser usados para amplificar loci
SSR em 2 linhagens de milho pipoca e 3 de milho. Os 11,1% de primers que
não evidenciaram nenhum fragmento de DNA amplificado indicam uma falta
de complementação de bases entre os segmentos do primer e as bases dos
segmentos de DNA que flanqueiam os loci SSR. Este é um resultado de
ordem prática importante, porque os primers que não são adequados para
amplificar loci SSR serão excluídos em futuros experimentos com as 2
linhagens de milho pipoca. Isto significa economia de tempo e material de
consumo. O aspecto importante da presente investigação é a relação dos
primers que amplificaram os loci SSR em linhagens, e a informação de que
33,3% destes loci apresentam dois ou mais alelos. A análise das freqüências
dos alelos nos seus respectivos loci poderão indicar os primers promissores
para serem utilizados em mapeamentos de QTLs.
Introdução
A análise de loci formados por seqüências simples repetidas de DNA (loci
SSRs: Simples Sequence Repeated), também conhecidas por loci
microssatélites, pode indicar maior ou menor variabilidade genética entre os
exemplares de uma população ou espécie. As regiões loci SSRs são
compostas de 1 a 6 nucleotídeos, que são amplamente difundidos em
genomas de eucariotos (Field e Wills, 1998; Tóth et al., 2000). Essas regiões
SSR podem ser amplificadas individualmente através de PCR (Polymerase
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Chain Reaction) utilizando-se um par de primers (de 20 a 30 bases)
específicos, que são complementares as seqüências únicas que flanqueiam
o microssatélite. Os microssatelites polimórficos podem ser utilizadas na
construção do mapa de ligação; uma vez construído o mapa de ligação,
poderão ser mapeados os Locos de caracteres quantitativos (QTLs) para
Capacidade de expansão (CE) e os efeitos genéticos de cada um deles será
estimado. Dessa forma, essas regiões denominadas de QTLs podem ser
monitoradas e pesquisadas, obtendo-se como conseqüência maior
conhecimento do controle genético do caráter e de sua manipulação no
melhoramento (Souza Jr., 1992). Os marcadores moleculares são utilizados
para a construção de mapas genéticos. A detecção e o mapeamento de
QTLs é realizada associando-se a variação dos dados fenotipicos de um
determinado caráter com as regiões cromossômicas em que se encontram
os marcadores moleculares (Falconer e Mackay, 1996; Lynch e Walsh,
1997). Em seguida a construção do mapa de ligação, serão mapeados os
QTLs para CE e será estimado os efeitos genéticos de cada um deles.
Materiais e Métodos
O DNA genômico foi extraído de folhas de 11 plantas das linhagens
de milho pipoca e foram usados 6 plantas (5 pertencentes a linhagem L9 e 1
a linhagem L7), e 4 plantas de milho comum onde 3 pertencem a Linhagem
H31, 1 a linhagem H17 e 1 a linhagem 53F. Para o isolamento do DNA foi
utilizado o procedimento descrito por Hoisington et al. (1994). Em um tubo
para microcentrífuga foi adicionado 300 mg de tecido vegetal previamente
macerado em nitrogênio líquido e 800 µL de tampão de extração CTAB e
incubado em banho-maria a 65 ºC por 1 hora. Em seguida, foi adicionado
800 µL de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1) e centrifugado por 5 minutos.
A fase aquosa foi recuperada e o procedimento anterior foi repetido por mais
duas vezes. O sobrenadante foi transferido para um tubo limpo e o DNA foi
precipitado com isopropanol. O precipitado foi ressuspenso em 400 µL de
TE e incubado com RNAse; em seguida foi purificado com 200 µL de fenol e
200 µL de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1) e centrifugado por 5 minutos.
A fase aquosa foi transferida para um tubo limpo e adicionado 400 µL de
clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) e centrifugado por 5 minutos. A fase
aquosa foi transferida para um tubo limpo, e adicionado 250 µL de
isopropanol e 25 µL de NaCl 5 M. O precipitado foi analisado em gel de
agarose 0,8% com tampão TAE 1X com DNA padrão de fago λ.
Para a seleção dos primers, foram testados 20 primers de
microssátelites previamente mapeados para milho comum. A PCR foi
preparada em microtubos de 0,2 mL, usando um termociclador Techne TC512. As amostras foram preparadas com 25 ng de DNA genômico, 2,0 µL de
tampão de reação 10X (10 mM Tris-HCl, pH 8.8), 2,0 mM de MgCl2 0,1 mM
de cada dNTP, 1 unidade de Taq-DNA polimerase (Invitrogen), 0,2 μM de
primer F e R específico e água destilada até completar 20 µL. Para a
amplificação foi utilizado o programa Touchdown PCR (Don et al., 1991). Os
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produtos das amplificações foram separados em gel de agarose 4%, e
tampão TBE 0,5X com 60 Volts por 5 horas.
Resultados e Discussão
Dentre os 20 primers testados, 88,8% (18 primers) podem ser usados para
amplificar loci SSR dos parentais de milho pipoca e milho comum (Tabela 1).
Na tabela 1 estão relacionados os loci SSR monomórficos, os polimorficos, e
também os primers que não evidenciaram nenhum fragmento de DNA
amplificado. A falta de amplificação pode ser devido ao fato de não haver
complementação de bases entre os segmentos do primer e as bases de
DNA que flanqueiam os loci SSR. Isto sugere que estes 11,1% de primers
desenvolvidos para os loci SSR de milho comum não conseguiram ser
complementados com os segmentos de DNA do genoma das duas
linhagens (L7 e L9) de milho pipoca e também de milho comum (H17, H31 e
53F) que flanqueiam loci SSR nas respectivas linhagens.
Tabela 1. Relação e seleção dos primers de loci SSR de milho utilizados
para amplificar o DNA genômico das linhagens de milho pipoca e milho
comum
Primer
Seleção
Numero de alelos
cromossomo
Umc 2352
Não Amplificou
-
8
Umc 1383
Monomórfico
1
1
Umc 1685
Monomórfico
1
1
Umc 2245
Polimórfico
3
2
Umc 1754
Polimórfico
2
1
Umc 2210
Não Amplificou
-
8
Umc 1472
Monomórfico
1
1
Umc 2233
Monomórfico
1
1
Umc 1277
Monomórfico
1
9
Umc 1111
Monomórfico
1
1
Mmc 0001
Monomórfico
1
3
Umc 2358
Polimórfico
3
8
Umc 2165
Polimórfico
2
6
Umc 1505
Polimórfico
2
9
Umc 2266
Monomórfico
1
3
Umc 1719
Monomórfico
1
4
Umc 1268
Monomórfico
1
8
Umc 1887
Polimórfico
2
6
Os estudos que utilizam primers de microssatélites para amplificar os loci
SSR focalizam somente os loci SSR amplificados e polimórficos. Estes
estudos não relacionam os primers usados que não amplificam. Entretanto,
este é um resultado de ordem prática importante, porque a informação de
que determinados primers não são adequados para amplificar loci SSR em
certos genomas contribui para a exclusão destes em futuros experimentos;
isto significa economia de tempo e material de consumo.
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.
Independentemente da utilidade desta informação para estudos que
focalizem a diversidade genética na espécie Z. mays, o aspecto importante
da presente investigação é a relação dos primers que amplificaram os loci
SSR nas linhagens de milho pipoca e milho comum mostrada na Tabela 1, e
a informação de que 33,3% destes loci apresentam dois ou mais alelos
(Figura 1). A análise das freqüências dos alelos nos seus respectivos locus,
e da heterozigosidade média observada e esperada dentro de cada um dos
parentais são resultados que poderão ser utilizados para a construção do
mapa de ligação para milho pipoca.
1
2
3
Figura 1.
4
5
6
7
8
9
10 11
12
13
14
15 16
17
18
19
20
21
22
23 24
Loci SSR amplificados com os primers Umc 1685 (amostras 2 a 12) e Umc 2245 (amostras 13 a 23).
O polimorfismo de fragmentos repetidos de DNA esta evidente no locus Umc 2245.
Conclusões
A etapa de seleção de primers polimórficos para loci SSR é fundamental
importância para o desenvolvimento de mapeamento de QTLs, porque
mostrou que somente 33,3% dos primers que amplificaram seqüências
simples repetidas nos genomas de milho comum e milho pipoca são
polimórficos, e poderão ser utilizadas para a construção de um mapa de
ligação para milho pipoca.
Agradecimentos
Agradecemos ao CNPq pelo suporte financeiro.
Referências
Falconer, D.S.; Mackay, T.F.C. Introduction to Quantitative Genetics.
Addison Wesley Longman, Harlow. 464 p, 1996.
Field, D.; Wills, C. Long polymorphic microsatellites in simple organisms.
Proceeding of the Royal Society of London, Series B: Biological Sciences 263:
209-215, 1998.
Hosington, D.; Khairallah, M.; Gonzalez De Lion, D. Laboratory protocols:
CIMMYT applied molecular genetics laboratory. 2nd edn. México DF: CIMMYT,
1994.
Lynch, M.; Walsh, B. Genetics and analysis of quantitative traits. Sinauer
Associates, Sunderland, MA. 980 p, 1997.
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.