FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA
RASTREAMENTO DE ALELOS DO GENE CFTR EM RONDÔNIA,
AMAZÔNIA OCIDENTAL BRASILEIRA
MARLENE GUIMARÃES SANTOS
Porto Velho – Rondônia
2013
FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA
MARLENE GUIMARÃES SANTOS
RASTREAMENTO DE ALELOS DO GENE CFTR EM RONDÔNIA,
AMAZÔNIA OCIDENTAL BRASILEIRA
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia
Experimental da Universidade Federal de Rondônia – UNIR como
requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Biologia
Experimental.
Área de Concentração: Genética Humana
Orientadora: Profª Dra. Vera Engracia Gama de Oliveira
Porto Velho – Rondônia
2013
FICHA CATALOGRÁFICA
BIBLIOTECA CENTRAL PROF. ROBERTO DUARTE PIRES
Santos, Marlene Guimarães.
S237r
Rastreamento de alelos do gene CFTR em Rondônia, Amazônia
Ocidental Brasileira. / Marlene Guimarães Santos. Porto Velho,
Rondônia, 2013.
76f.: il.
Tese (Doutorado em Biologia Experimental) – Núcleo de Saúde
(NUSAU), Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental,
Fundação Universidade Federal de Rondônia, Porto Velho, 2013.
Orientadora: Profa. Dra. Vera Engracia Gama de Oliveira.
1. CFTR. 2. Fibrose Cística. 3. ∆F508. 4. R334W. 5. N1303K. I.
Título.
CDU: 575(811)
Bibliotecária Responsável: Eliane Gemaque / CRB 11-549
UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA
Programa de Pós Graduação em Biologia Experimental (PGBioExp)
Candidata: MARLENE GUIMARÃES SANTOS
Titulo da Tese: Rastreamento de Alelos do Gene CFTR em Porto Velho, Amazônia
Ocidental Brasileira.
Orientadora: Profa. Dra. Vera Engracia Gama de Oliveira
A Comissão julgadora dos trabalhos de Defesa de tese de Doutorado, em sessão
publica, realizada a 25/ 04/ 2013, considerou-o:
( X ) Aprovado
(
) Reprovado
Profa. Dra. Vera Engracia Gama de Oliveira – Orientadora (Presidente da Banca)
Instituição: UNIR/PGBIOEXP
Assinatura:______________________________
Dr. Ricardo de Godoi Mattos Ferreira
Instituição: FIOCRUZ/RO/PGBIOEXP
Assinatura:______________________________
Dra. Maria Manuela da Fonseca Moura
Instituição: UNIR/PGBIOEXP
Assinatura:_______________________________
Dr. Horácio Tamada
Instituição: UNIR/RO
Assinatura:________________________________
Dr. Gilson Medeiros e Silva
Instituição: UNIR/RO
Assinatura:_______________________________
AGRADECIMENTOS
A Dra. Vera Engracia Gama de Oliveira, Docente/ Pesquisadora da Universidade Federal
de Rondônia, minha Orientadora, pela confiança que sempre depositou em mim, por todas as
oportunidades que me ofereceu e por sempre me incentivar em todos os aspectos. Suas
contribuições como Geneticista sempre foram muito valiosas e imprescindíveis para a realização
deste trabalho e para minha formação profissional.
Ao Dr. Aguinaldo Luís Simões, do Laboratório de Genética da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto-USP, que me recebeu em seu laboratório e esteve presente em várias fases de
minha trajetória Acadêmica, no Mestrado e Doutorado, obrigada.
À Dra. Giselda Kalil de Cabello, da FIOCRUZ-RJ, Dr. Ricardo Godoi, da FIOCRUZRO, Dr. Gilson Medeiros-UNIR por todas contribuições que resultaram no trabalho de Tese.
Ao Dr. Mauro Shugiro Tada, Diretor Geral do Centro de Pesquisa em Medicina
Tropical/CEPEM/RO, que além de facilitar nosso acesso a Hospitais e lugares de colega,
discutiu conosco nossos primeiros resultados, na qualificação da Tese.
Aos Drs. Ricardo Godoi, Maria Manuela, Gilson Medeiros e Horácio Tamada, membros
da Banca do Doutorado, por terem aceito participar da Defesa da Tese, pela contribuição e
atenção. Aos membros suplentes Dra. Ana Escobar, Dra.Rosely Rodrigues e Dr. Aguinaldo Luis
obrigada pela contribuição.
Aos colegas do laboratório de Genética Humana/UNIR, pela convivência, pelo respeito e
atenção, Dr. Almeida Casseb, MSc Andonai Krauze , Dra. Josileide Farias, Daniel Delani,
Leslee André meus agradecimentos. Aos estudantes Paulo Henrique Alves, Lilian Catanhede e
Milena Jano, pela ajuda em coletas e bancada.
Aos funcionários do IPEPATRO, hoje FIOCRUZ, Giovani, Rosineide e Marlene Donato,
pelo apoio.
A direção do Hospital Infantil Cosme e Damião e do Hospital de Base com suas equipes
de enfermagem, técnicos e aos demais funcionários do onde foram coletadas as amostras.
As crianças, pais ou responsáveis e a todos os sujeitos que participaram sem os quais este
trabalho não se realizaria.
As Instituições UNIR/IPEPATRO, pela concessão de parte do suporte financeiro para a
realização deste trabalho e pela oportunidade, incentivo e apoio institucional.
Ao Programa de Pós Graduação em Biologia Experimental da Universidade Federal de
Rondônia pela oportunidade que este curso propiciou à minha formação Acadêmica e Cientifica.
As agencias de fomento, especialmente CAPES e CNPq, o agradecimento pelo fomento
direto e indireto que contribuiu para minha formação Acadêmica e Científica.
A minha família especialmente por suportar minha ausência durante esses anos.
E a todos os que, de certa forma, contribuíram para realização deste trabalho,
principalmente aos participantes, obrigada.
A meu querido pai in memoriam
Francisco Beleza Guimarães
Pelo homem de caráter, exemplo de honestidade e simplicidade.
E por me ensinar “O que é certo e o que é errado”.
“A diferença entre o vencedor e o perdedor não é a força
nem o conhecimento, mas sim, a vontade de vencer.”
Vincent T. Lombardi
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................................. i
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................................... ......ii.
LITA DE SIGLAS E ABEVIATURA.........................................................................................................iv
RESUMO..............................................................................................................................vi
ABSTRACT............................................................................................................................................viii
INTRODUÇÃO E ESTADO DA ARTE .............................................................................................19
1.1 O GENE CFTR .............................................................................................................................20
1.2.ESTRUTURA DA PROTEÍNA CFTR .........................................................................................22
1.3 MUTAÇÕES NO GENE CFTR. ................................................................................................23
1.4.CORRELAÇÃO ENTRE GENÓTIPO E FENÓTIPO ............................................................25
1.5.DIAGNÓSTICO ...........................................................................................................................26
2.JUSTIFICATIVA ..............................................................................................................................29
3.OBJETIVOS ......................................................................................................................................33
3.1 OBJETIVO GERAL...........................................................................................................33
3.2.OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................................33
4.MATERIAL E MÉTODOS ...............................................................................................................34
4.1.POPULAÇÃO E ÁREA DE ESTUDO .....................................................................................34
4.1.1. MICRO REGIÃO DE PORTO VELHO (“63°54’14” W; 08°45’43” S) ..........................34
4.1.2. MICRO REGIÃO DE CACOAL (CAO; 11° 26′ 19″ S, 61° 26′ 50″ W) .........................36
4.1.3. MICRO REGIÃO DO VALE DO GUAPORÉ (62°54’ O; 12°51’ S) ..............................37
4.2.COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO .................................................................................38
4.3.MÉTODOS LABORATORIAIS ................................................................................................38
4.3.1. EXTRAÇÃO DE DNA DE LEUCÓCITOS DO SANGUE PERIFÉRICO .....................39
4.3.2. REAÇÃO DA POLIMERASE EM CADEIA (PCR) ..........................................................39
4.3.3. IDENTIFICAÇÃO DOS ALELOS DO GENE CFTR ..................................................................40
4.3.3.1. O ALELO ΔF508..........................................................................................................40
4.3.3.2. OS ALELOS R334W, G85E, G551D, R553X, W1282X, N1303K, R1162X DIGESTÃO
ENZIMÁTICA (RFLPS)...............................................................................................................42
4.4.ANÁLISES ESTATÍSTICAS .....................................................................................................47
5.RESULTADOS ..................................................................................................................................48
5.1.CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS SEGUNDO DADOS ANTROPOGENÉTICOS .........49
5.2 CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS SEGUNDO AS FREQUÊNCIAS ALELICAS .....48
5.3 INCIDÊNCIA DA FIBROSE CISTICA.............................................................................................50
6.DISCUSSÃO.........................................................................................................................51
7.CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ..............................................................................................59
8.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................................61
Anexo I – ...............................................................................................................................................73
Anexo II –..............................................................................................................................................74
Anexo III – ............................................................................................................................................75
|i
LISTA DE TABELAS
Tabela01.
Distribuição da mutação ∆F508 em pacientes fibrocísticos de alguns países
europeus, e américa Latina, segundo a Organização Mundial de Saúde
(OMS,2004) e Bobadilla e cols., (2002)...........................................................
28
Tabela 02.
Amostras (total de indivíduos/localidade) analisadas..................................
37
Tabela 03.
Concentração dos reagentes utilizados na reação de PCR e temperaturas de
39
pareamento (Tp) usadas para a amplificação por PCR.....................................
Descrição da sequência dos iniciadores utilizados na PCR dos exons 3, 7,11,
Tabela 04.
19 , 20 e 21, tamanho dos fragmentos resultantes desta reação e enzimas de
restrição específicas..........................................................................................
40
Tabela 05.
Descrição da sequência dos iniciadores utilizados na PCR do exon 10 e
tamanho do fragmento resultante desta reação................................................ 40
Tabela 06
Distribuição dos indivíduos das amostras do Hospital Infantil (HICD), das
Mães da maternidade do Hospital de Base (Mães-HB), seus respectivos
filhos (RN-HB), Engenho Velho, Cacoal e Vale do Guaporé de acordo com
a etnia, determinada pela cor da pele e por traços físicos...........................
48
Tabela 07.
Frequências do alelo ∆F508 nas amostras estudadas........................................ 49
Tabela 08.
Frequências dos alelos DF508, R334W e N1303K na Amostra do hospital
49
Infantil Cosme e Damião, Porto Velho-RO.............................................
Tabela 09.
Mostra as frequências de dois alelos em duas amostras do Hospital de Base
de Porto Velho..........................................................................................
50
Tabela 10.
Frequência da mutação ∆F508 em diferentes populações do Brasil................
54
Tabela 11.
Frequências de alelos do gene CFTR em alguns estados brasileiros................ 57
|ii
LISTA DE FIGURAS
Figura 01.
Representação esquemática do segmento de 27 exons do gene CFTR...............
21
Figura 02.
Estrutura da proteína CFTR ................................................................................
22
Figura 03.
Representação das classes de mutações do gene CFTR ....................................
25
Figura 04.
Mapa do Brasil e de Rondônia mostrando a localização da área de estudo........
34
Figura 05.
Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10%: Marcador de peso molecular de
100 pb.Produto de PCR, nas colunas 1 a 22 indivíduos homozigotos normais 41
para a mutação e na ultima coluna o controle negativo..............................
Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10%: Marcador de peso molecular de
Figura 06.
50 pb. Produto de PCR, detecção do alelo ∆F508. Nas colunas 1 a 5 indivíduos 41
heterozigoto para mutação ∆F508...............................................................
Figura 07.
Figura 08.
Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para a detecção da mutação
R334W. Marcador de peso molecular de 50 pb. Produto de PCR, Nas colunas 42
1 a 21 digestão do produto da PCR. Presença do alelo R334W nas colunas 16
e 21 indivíduos heterozigotos para mutação R334W........................................
Eletroforese em gel de agarose a 1.5% para detecção da mutação G85E.
Marcador de peso molecular de 100 pb. Nas colunas 1 a 9 produtos de PCR 42
resulta em fragmento de 309 e ultima coluna controle negativo........................
Figura 09.
Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para detecção da mutação G85E
Marcador de peso molecular de 100 pb. Produto de PCR, Nas colunas 1 a 19 43
digestão do produto da PCR – indivíduos normais.............................................
Figura 10.
Eletroforese em gel de agarose a 1.5% para a detecção da mutação G551D.
Marcador de peso molecular de 100 pb. Nas colunas 1 a 7 produtos de PCR 43
resulta em fragmento de 425 e ultima coluna controle negativo........................
Figura 11.
Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para a detecção da mutação
G551D. Marcador de peso molecular de 50 pb. Produto de PCR, Nas colunas
1 a 13 digestão do produto da PCR. Todos os indivíduos normais para a
mutação.................................................................................................................
43
|iii
Figura 12.
Figura 13.
Figura 14.
Eletroforese em gel de agarose a 1.5% para a detecção da mutação R553X.
Marcador de peso molecular de 100 pb. Nas colunas 1 a 9 produtos de PCR 44
resulta em fragmento de 425 e ultima coluna controle negativo...............
Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para a detecção da mutação
R553X. Marcador de peso molecular de 100 pb. Nas colunas 1 a 7 digestão 44
do produto da PCR. Todos os indivíduos normais para a mutação.............
Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para detecção da mutação
W1282X. Marcador de peso molecular de 50 pb. Produto de PCR. – 473
pb. Nas colunas 1 a 19 digestão do produto da PCR – indivíduos normais –
45
178,172 e 123 pb. E na ultima coluna controle negativo.........................
Figura 15. Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para detecção da mutação
N1303K. Marcador de peso molecular de 50 pb. Controle negativo. Nas 45
colunas 1 a 18 digestão do produto da PCR..........................................
Figura 16. Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para detecção da mutação
R1162X. Marcador de peso molecular de 100 pb. Produto de PCR. 454 pb.
Nas colunas 1 a 19 digestão do produto da PCR – indivíduos normais - 275 e
179 pb para mutação.........................................................................................
46
|iv
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
Sigla ou
Significado
Abreviatura
A
Adenina
AM
Amazonas
ARMS-PCR
Sistema de mutação refratário à amplificação
ASO
Hibridização de oligonucleotídeos alelo – específicos.
ATP
Adenina Tri-fosfato
CBAVD
Aplasia congênita bilateral dos vasos deferentes
CEPEM
Centro de Pesquisa em Medicina Tropical
CFTR
Gene Regulador da Condutância Transmembrânica
CFGAC
Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium
Cols
Colaboradores
CONEP
Comissão Nacional de Ética e Pesquisa
Cl
Cloro
C
Citosina
CEPEM
Centro de Pesquisas em Medicina Tropical
CONEP
Comissão de Ética e Pesquisa
Da
Daltons
DNA
Ácido nucléico
Dntp
Desoxinucleotídeo
DGGE
Eletroforese em gel com gradiente de desnaturação
dHPLC
Cromatografia líquida desnaturante de alta performace
EDTA
Ácido etileno diaminotetraacético
FC
Fibrose Cística
FIOCRUZ
Fundação Instituto Oswaldo Cruz
G
Guanina
HB
Hospital de Base
HBM
Parturientes
HBRN
Recém -nascidos
|v
HICD
Hospital Infantil Cosme e Damião
IBGE
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IRT
Teste da tripsina imunoreativa
IPEPATRO Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais
kb
Kilobase
mRNA
RNA mensageiro
MSD
Transmembrane domain of CFTR protein
NBD
Domain Nucleotide- Binding
Na
Sódio
Gel de Poliacrilamida
PCR
Reação da Polimerase em Cadeia
pb
Pares de bases
PN
Pedras Negras
R -domain
regulatory domain of CFTR protein
SSCP
Polimorfismo conformacional de fita simples
SESAU
Secretaria de Estado da Saúde de Rondônia
SPSS
Software Statistical Package for Social Sciences
T
Timina
TBE
Tris-Ácido Bórico-EDTA
TEMED
N, N, N’, N’ – tetrametilenodiamina
2
Teste do Qui-quadrado
|vi
RESUMO
Guimarães, M. Rastreamento de alelos do Gene CFTR em Rondônia, Amazônia Ocidental
Brasileira
2013. Tese. Programa de Pós Graduação em Biologia Experimental, Fundação Universidade
Federal de Rondônia, Porto Velho-Rondônia, Brasil.
Fibrose Cística é uma doença genética de herança autossômica recessiva, crônica, com
manifestações sistêmicas, altos níveis de eletrólitos no suor, comprometendo os sistemas
respiratório, digestivo e reprodutor. O gene de Fibrose Cística está localizado no braço longo do
cromossomo 7, na posição 7q. 31. Estão atualmente descritas 1932 mutações no gene CFTR,
classificadas de acordo com o tipo de alterações que acarretam na proteína CFTR. Apesar da
heterogeneidade que se verifica nas manifestações e evolução da doença, o diagnóstico de
Fibrose Cística é clínico e na maioria das vezes apresenta-se com fenótipo clínico diverso, com
intensidade diferente, em diferentes indivíduos. Propusemo-nos a rastrear oito alelos do gene
CFTR (∆F508, N1303K, W1282X, G551D, R553X, R1162X, G85E e R334W) no intuito de
começarmos uma competência local em Genética no estudo de Fibrose Cística, partindo da
hipótese de que o processo de colonização desta região Amazônica propiciou a fixação de genes
europeus, o que determina a presença de indivíduos fibrocisticos na região. Foram analisadas
seis amostras de três regiões do estado de Rondônia: quatro na cidade de Porto Velho, uma na
Região Central de Rondônia e uma no Vale do Guaporé, situado na região Leste de Rondônia.
As amostras coletadas em Porto Velho foram três hospitalares (uma de Recém-nascidos e outra,
suas respectivas Mães do Hospital estatal Ari Pinheiro, e a terceira constituída por crianças, de 0
a 10 anos, do Hospital estatal infantil Cosme e Damião) e uma populacional, peri- urbana, de
características ribeirinhas, Engenho Velho. A amostra da região Central de Rondônia era
hospitalar e foi coletada na cidade de Cacoal. A sexta amostra foi coletada no vilarejo de Pedras
Negras, localizado na região centro-leste de Rondônia e era constituída de indivíduos
remanescentes de Quilombolas. O DNA foi extraído seguindo a metodologia que emprega
digestão com Proteinase K. Após amplificação por PCR, das regiões alvo para cada alelo, as
amostras foram fenotipadas segundo protocolos já descritos na literatura. A visualização ocorreu
em gel de PAGE a 10% corado com nitrato de prata. As análises estatísticas foram realizadas
com os programas GENEPOP (versão 3.4) e o nível de significância adotado foi de 5%. O alelo
|vii
ΔF508 foi observado apenas em heterozigose com o alelo Normal do gene CFTR, na frequência
de 0,0065 ± 0,006; p= 0,1639 na amostra de crianças do Hospital Infantil Cosme e Damião. Na
amostra de Recém-nascidos a frequencia alélica foi quase polimórfica (0,0098 ± 0,008; p=
0,1377) e não satisfez as condições de equilíbrio de Hardy-Weinberg. Na amostra de Cacoal,
apenas um indivíduo foi heterozigoto para ΔF508, sendo a frequência de 0.0060 ± 0.000; p=
0.0435. Apenas outros dois alelos, em todas os 1.840 indivíduos analisados nesta Tese, os genes
R334W e N1303K, foram detectados, em heterozigose com o alelo normal, em duas crianças
cada um, na amostra do Hospital Infantil, ambos com frequências de 0.001. Não foram
observadas diferenças significantes na distribuição das frequências dos alelos analisados quando
comparados com outras populações brasileiras, com exceção de uma amostra, descrita na
literatura, a do povoado Santa Flora/MA, de origem portuguesa, e reflexo de efeito do fundador.
As várias ondas migratórias, responsáveis pelo povoamento de Rondônia, introduziram alelos
fibrocísticos, de origem européia, observados na população atual do estado. A ausência de
indivíduos homozigotos, mesmo sob suspeita clínica de apresentarem Fibrose Cística (caso de
crianças do Hospital Infantil) indica a necessidade de se ampliar o rastreamento ora iniciado,
introduzindo-se alelos já descritos em populações Ameríndias e Negróides, além de se colocar
em atividade o rastreamento neonatal de genes fibrocísticos nos hospitais públicos de Rondônia.
Palavras- chave: CFTR, Fibrose Cística, ∆F508, R334W, N1303K
|viii
ABSTRACT
Guimarães, M. Tracking alleles of the gene CFTR in Rondonia, Western Brazilian Amazon
2013. Thesis. Postgraduate Program in Experimental Biology, Federal University of Rondonia,
Porto Velho, Rondonia, Brazil.
Cystic Fibrosis is a genetic disease of inheritance autosomal recessive, chronic, with systemic
manifestations, high levels of electrolytes in sweat, affecting the respiratory, digestive and
reproductive systems. The gene of the cystic fibrosis is located on the long arm of the
chromosome 7, in the position 7q. 31. Currently are described 1932 mutations in the CFTR gene,
classified according to the type of changes that result in the CFTR protein. Despite the
heterogeneity that exists in the manifestations and evolution of the disease, the diagnostic of the
cystic fibrosis is clinical and in the most of time presents with a diverse clinical phenotype, with
different intensity in different individuals. We proposed to track down eight alleles of the CFTR
gene (∆F508, N1303K, W1282X, G551D, R553X, R1162X, G85E and R334W) in order to
begin a local competence in Genetics on the study of Cystic Fibrosis, based on the hypothesis
that the process of colonization of this amazonic region propitiated the fixation of european
genes, which determines the presence of fibrocystic individuals in the area. We analyzed six
samples from three regions of the state of Rondonia: four in the city of Porto Velho, one in the
Central Region of Rondonia and one in the Vale do Guapore, located in the eastern region of
Rondonia. Samples collected in Porto Velho were from three hospitals (one of newborns and
their respective mothers from the Ari Pinheiro Hospital, and the third made up of children from 0
to 10 years, from the State Children's Hospital Cosme and Damiao) And a population, peri-urban
with riverside characteristics, Engenho Velho. The sample from the Central Region of Rondonia
was hospital and was collected in the city of Cacoal. The sixth sample was collected in the
Pedras Negras, located in the central-east of Rondônia and consisted by individuals remaining of
Quilombola. The DNA was extracted following the method it employs digestion with Proteinase
K. Following PCR amplification, target regions for each allele, samples were phenotyped second
protocols described in the literature. A visualization occurred on PAGE gel stained with 10%
silver nitrate. The statistical analysis was performed with the programs GENEPOP (version 3.4)
|ix
and the significance level adopted was 5%. The ΔF508 allele was observed only in
heterozygous with the normal allele to the gene CFTR, at frequency of 0,0065 ± 0,006; p=
0,1639 sample of children in the State Children's Hospital Cosme and Damiao. In the sample
of newborns the allelic frequency was almost polymorphic (0,0098 ± 0,008; p= 0,1377) and
does not satisfy the conditions of Hardy-Weinberg equilibrium. In Cacoal sample, only one
individual was heterozygous for ΔF508, with a frequency of 0.0060 ± 0.000; p= 0.0435. Only
two other alleles, in all 1840 individuals analyzed in this thesis, R334W and N1303K genes
were detected in heterozygous with the normal allele, in two children each of them, on the
sample Children's Hospital, both with frequencies 0.001. There were no significant
differences in the distribution of frequencies of the alleles analyzed when compared with
other Brazilian populations, except for one sample, described in the literature, the town of
Santa Flora-MA, of Portuguese origin, and reflects the founder's effect. The various migratory
waves, responsible for the populating Rondonia, introduced fibrocystic alleles, of european
origin, observed in the current population of the state. The absence of homozygous
individuals, even under clinical suspicion of submitting Cystic Fibrosis (cases of children at
Children's Hospital) indicates the need to expand the tracking started now, introducing alleles
already described in amerindian and negroid populations, in addition to putting in activity the
neonatal screening of genes fibrocystic in public hospitals of Rondonia.
Keywords: CFTR, Cystic Fibrosis, ∆F508, R334W, N1303K
| 19
INTRODUÇÃO E ESTADO DA ARTE
Fibrose Cística, também conhecida como Mucoviscidose, é uma doença genética de
herança autossômica recessiva, crônica, com manifestações sistêmicas, altos níveis de
eletrólitos no suor, comprometendo os sistemas respiratório, digestivo e reprodutor. Apresenta
uma das principais causas de doença pulmonar crônica na faixa etária pediátrica afetando
cerca de 1/2.000 nascidos vivos na população caucasiana de pacientes com fibrose cística
(Lemos e cols., 2004; Cimmino e cols., 2003). É uma condição que resulta em secreções
mucosas muito espessas e viscosas, havendo obstrução nos ductos e canalículos glandulares.
A doença tem uma tríade clínica característica: (a) doença pulmonar obstrutiva supurativa
crônica, com evolução progressiva para cor pulmonale; (b) insuficiência pancreática com má
digestão e má absorção e desnutrição secundária e (c) níveis anormalmente elevados de Cl- no
suor (Rosov e cols., 1999). Em 1953 Di Sant 'Agnese e colaboradores evidenciaram o teor
extremamente elevado do íon cloreto no suor de pacientes fibrocisticos. A comprovação de
que a doença resultava de defeito na permeabilidade do cloro surgiram de estudos em células
epiteliais das vias aéreas de pacientes. Esta característica foi observada, posteriormente, em
todos os indivíduos com Fibrose Cística, tornando um fator decisivo para o diagnóstico da
doença (Welsh e Liedtke, 1986).
Das doenças genéticas que, na maioria dos casos, levam a óbito ainda na infância,
Fibrose Cística é a mais comum entre os indivíduos caucasianos (Rosenstein e cols., 1998;
Zielenski e cols., 1995), sendo rara em populações Africanas (1: 30.000) e asiáticos (1:90.
000) (htt//www.cfww.org, 2009; Ratjen e cols., 2003; Ribeiro e cols., 2002).
A prevalência da doença varia de acordo com o local geográfico (Welsh e cols., 2001).
Estima-se que ao redor de 70.000 a 100.000 pessoas são acometidas por Fibrose Cística no
mundo (htt//www.cfww.org, 2009), sendo mais frequente no norte da Europa, região em que a
ocorrência é de 1 para cada 3.500 nascimentos vivos. Entre os latino-americanos e afroamericanos a incidência varia de 1/15.000 a 1/20.000 nascimentos vivos, respectivamente
(O´Sullivan e cols., 2009). O quadro epidemiológico da doença tem variado nas últimas três
décadas, quando se avaliam os dados dos países desenvolvidos. Nos Estados Unidos havia,
em 1969, cerca de 8.000 indivíduos oficialmente registrados com Fibrose Cística. Em 1991
eram 18.926, sendo que em 2004 esse número já alcançava 22.714 pacientes (Davies, 2006).
A incidência de fibrose cística no Brasil varia entre as diferentes regiões, sendo de
1:10.000 nascimentos vivos em Minas Gerais, 1:9.500 no Paraná, 1:8.700 em Santa Catarina e
1:1.600 no Rio Grande do Sul (Raskin e cols., 2008; Honório e cols., 2006; Reis e cols., 2006;
Santos e cols., 2005).
I n t r o d u ç ã o | 2120
Diversas áreas do território brasileiro (Suarez-Kurtz, 2005). Outro fator da disparidade na
observação de Fibrose Cística é a ausência de diagnóstico clínico e/ou molecular. A
dificuldade no diagnóstico decorre muitas vezes devido à superposição de sintomas da
Fibrose Cística com os de outras doenças mais comuns, como diarreia crônica, desnutrição e
as infecções respiratórias (Reis e Cerqueira, 1991). A necessidade de realização de exames
laboratoriais específicos também dificulta o diagnóstico, que muitas vezes é feito tardiamente,
acarretando um prejuízo irreparável ao prognóstico e à determinação correta da incidência
(Raskin e cols., 2008). As investigações envolvendo a incidência da doença no Brasil são
realizadas principalmente nas regiões Sul e Sudeste e podem não refletir a realidade de todo o
País (Raskim e cols., 2008).
GENE CFTR
As primeiras hipóteses sobre o caráter genético da fibrose cística foram formuladas por
Lowe, May e Reed (1949), que postularam ser a doença a consequência de defeito em um
único gene, que gerava uma proteína anormal, sendo a herança autossômica recessiva. Em
1985, Tsui e colaboradores forneceram as primeiras evidências de um gene candidato para
Fibrose Cística no cromossomo 7. A detecção do loco responsável foi feita por Estivill e cols.,
(1987). Identificado pela técnica de clonagem posicional (mapeamento gênico; Riordan e
cols., 1989; Collins e Weissman, 1984), o gene de Fibrose Cística foi localizado no braço
longo do cromossomo 7, na posição 7q. 31. Este gene possui 250 Kb, 27 éxons, com
tamanhos que variam de 38 a 724 pares de bases (Zielenski e cols., 1991). O gene codifica um
mRNA de 6.5 Kb e massa molecular de 168.138 Da, dando origem a uma glicoproteína com
1.480 aminoácidos (Welsh e cols., 2001). Os exons estão numerados de 1 a 24, sendo
incluídos os éxons 6a, 6b, 14a, 14b, 17a e 17b. Este gene, localizado na membrana
citoplasmática das células epiteliais, foi denominado “Cystic Fibrosis Transmembrane
Conductance Regulator – CFTR”, desde que o produto proteico atua como canal de íons de
cloreto (Tsui e Durie, 1997; Zielenski e cols., 1991; figura 1).
I n t r o d u ç ã o | 22211
7q31.3
Figura 1. Representação esquemática do segmento de 27 exons do
gene CFTR (Zielenski e cols., 1991).
I n t r o d u ç ã o | 22
ESTRUTURA DA PROTEÍNA CFTR
Estruturalmente, a proteína CFTR possui 5 domínios (figura 2) e dois grandes
domínios transmembranários (Membrane Spanning Domain ou MSD), que são duas unidades
repetidas que atravessam a membrana de lado a lado 6 vezes. As subunidades dos domínios
MSD contribuem para a formação do poro do canal de Cl-, uma vez que mutações em sítios
específicos dentro dos MSD alteram sua seletividade a ânions (Wesh e cols., 1993).
Adicionalmente, existem dois domínios de ligação a nucleotídeos, ou NBDs (Nucleotídeo
Binding Domain; Lyzac e cols., 2002). Os domínios NBD são responsáveis pela ligação e
pela hidrólise de ATP e fornecem a energia necessária para a atividade do canal. A proteína
possui ainda um domínio de regulação (R), em posição intracitoplasmática (Kerem e cols.,
1989; Riordan e cols., 1989; Rommens e cols., 1989). O domínio R tem o papel de bloquear
ou não o canal de cloro, dependendo do seu estado de fosforilação e do AMP cíclico ( Smith e
Welsh, 1995; Welsh, 1993; Riordan e cols., 1989). O domínio regulatório modula também a
atividade de CFTR e pode ter efeito inibitório ou estimulatório (Welsh e cols., 2001).
Figura 2. Estrutura da proteína CFTR (adaptado por Smith &Welsh, 1995).
A proteína CFTR faz parte da membrana citoplasmática das células epiteliais de
diversos órgãos, como nos ductos pancreáticos, epitélios intestinais, no trato respiratório,
ductos das glândulas sudoríparas e sistema reprodutor, onde atua como regulador de fluxo de
cloretos (Welsh e cols., 1993).
I n t r o d u ç ã o | 243
23
MUTAÇÕES NO GENE CFTR
Estão atualmente descritas 1932 mutações no gene CFTR, classificadas de acordo com
o tipo de alterações que acarretam na proteína CFTR (The Cystic fibrosis mutation database,
CFMDB, 2013). Em geral as mutações ocorrem na primeira metade do gene CFTR, a maioria
na primeira região NBD, nos exons 10 e 11. A segunda região NBD, notadamente nos éxons
19 e 20, apresenta também numerosas mutações. A primeira região MSD (exons 4 e 7)
apresenta um conjunto de mutações, sendo estas quase inexistentes na segunda região MSD.
Estas mutações em exons são devidas, na maioria das vezes, a transições G → A (24.1%) e C
→ T (14.7%), e a transversões G → T (11.9%); ao contrário do que ocorre em outros genes
humanos, observam-se poucas mutações em sítios CG (Morral e cols., 1994; Cooper e
Krawczak, 1990).
Estas mutações, de modo geral, estão agrupadas em seis diferentes classes
(Vankeerberghen e cols., 2002; Welsh e cols., 2001):
Classe I: caracteriza-se por mutações que conduzem a um sinal de término de
transcrição, originando proteínas truncadas ou instáveis, alterando assim a quantidade de
proteína produzida. Como exemplos temos a mutação G542X, em que ocorre a substituição
de uma glicina por um códon STOP na posição 542 (Mishra e cols., 2005; Rowntree and
Harris, 2003; Welsh e cols., 2001); a mutação R1162X, que consiste na troca de C → T no
nucleotídeo 3616 do exon 19, levando à substituição de arginina por código de parada no
códon 1162 (Gasparini e cols., 1991), sendo a décima quinta mutação mais frequente em
CFTR na população mundial. A mutação W1282X, que consiste na transcrição de G → A no
nucleotídeo 3978 do exon 20, leva à substituição de triptofano por um código de parada, no
códon 1282 (CFGAC, 1990); é a quinta mutação mais frequente no mundo (Estivill e cols.,
1997). A mutação R553X consiste na transcrição de C → T no nucleotídeo 1789 do exon 11,
havendo substituição de arginina por um código de parada no códon 553.
Classe II: corresponde a mutações em sítios responsáveis pelo processamento e
transporte anômalo da proteína até a membrana. Incluem-se nesta classe as mutações ∆F508,
N1303K e G85E (Mishra e cols., 2005; Welsh e cols., 2001). A mutação ∆F508, ou deleção
Phe508, consiste em uma deleção de 3pb, adenina-timina-timina (ATT) entre os nucleotídeos
1652 e 1655 do éxon 10, tendo como consequência perda do aminoácido fenilalanina no
códon 508 da proteína resultante (Zielenski e cols., 1997). É a mutação mais frequente nas
I n t r o d u ç ã o | 2254
24
populações caucasoides (Welsh e cols., 1993). Outra mutação, o alelo N1303K, consiste na
transversão de C→ G no nucleotídeo 4041 do exon 21, levando à substituição de Asparagina
por Lisina no códon 1303 (Osborne e cols., 1992). A mutação G85E, resulta da transcrição de
G → A na posição do nucleotídeo 386 do éxon 3, havendo substituição de glicina por ácido
Glutâmico no códon 85, no primeiro domínio da membrana (Zielenski e cols., 1991).
Classe III: mutações desta classe interferem na regulação do canal de cloreto, por
afetarem os domínios TDMs, levando ao bloqueio deste canal. São exemplos desta categoria o
alelo G551D (Mishra e cols., 2005; Mckone e cols., 2003; Salvatore e cols., 2002; Welsh e
cols., 2001), e ele resulta da transcrição de G → A no nucleotídeo 1784 do exon 11, com
substituição de Glicina por ácido Aspártico, no códon 551 (CFGAC, 1996). É a terceira
mutação mais frequente do gene CFTR na população mundial.
Classe IV: representada por mutações que alteram a condução de íons através dos
poros. O alelo R334W (Mishra e cols., 2005 ; Mckone e cols., 2003; Welsh e cols., 2001) está
nesta classe de mutações, que ocorre devido à troca do aminoácido Arginina pelo Triptofano
no códon 334 do éxon 7 do gene CFTR. É a décima sétima mutação mais frequente na
população mundial (Streit e cols., 2003; Kerem e cols., 1989).
Classe V: são mutações que alteram o nível de transcrito, e consequentemente de
proteína necessária para uma função adequada. O alelo A455E (Mishra e cols., 2005;
Rowntree e cols., 2003; Welsh e cols., 2001) situa-se nesta classe; resulta da troca de C → A
no nucleotídeo 1496 do exon 9, causando a substituição de alanina por glutamina no códon
455. Foi relatada pela primeira vez em 9 de fevereiro de 1990 por Karem e cols. (apud
CFGAC, 1994). Na Europa é a 16ª mutação mais frequente, presente em média em 0.20% dos
cromossomos (Estivill e cols., 1997).
Classe VI promove alterações que afetam as propriedades de regulação da proteína
CFTR. Exemplo desta mutação é o alelo Q1412X (Vankeerberghen e col., 2002), resultante
da substituição de uma glutamina por um codão Stop na posição 1412, havendo perda de 70
aminoácidos na proteína (Rowntree e Harris., 2003).
I n t r o d u ç ã o | 25
R1162X, G542X, R553X, W1282X
∆F508, N1303K e G85E
G551D, R553G, R560T
R334W, R117H, R117C
A455E
Q1412X
Figura 3. Representação das classes de mutações do gene CFTR (O´Sullivan BP e cols., 2009).
CORRELAÇÃO ENTRE GENÓTIPO E FENÓTIPO
A heterogeneidade alélica é uma das causas da variabilidade de expressão clínica da
Fibrose Cística. Dependendo de como a proteína funcional é afetada, o transporte de cloreto
não ocorre, ou fica diminuído. Geralmente, mutações severas resultam na falha da síntese
proteica ou no bloqueio do processo e mutações brandas causam alteração na condutância ou
na síntese (reduzida) da proteína. As manifestações clínicas da doença estão também
relacionadas ao estado nutricional do paciente, à frequência e gravidade das infecções das vias
respiratórias e aos fatores ambientais (Faucs e cols., 2010).
As manifestações clínicas envolvendo insuficiência pancreática, alta incidência de íleo
meconial e altos níveis de cloro no suor e comprometimento pulmonar, são encontradas nos
indivíduos que apresentam o gene ∆F508 (Keller e cols., 2003). O fenótipo clínico dos
indivíduos portadores desta mutação varia muito, mas está sempre associado ao fenótipo
grave da doença (Morales e cols., 1999).
A correlação de diversas mutações com o comprometimento pulmonar não está
totalmente estabelecida. As mutações ∆F508, N1303K, G542X estão relacionadas a doenças
pancreáticas e pulmonares severas enquanto a mutação R1162X caracteriza-se por expressar
fenótipos suaves de Fibrose Cística, causando insuficiências pancreática e pulmonar
moderadas (Gasparini e cols., 1991).
I n t r o d u ç ã o | 2276
26
Mutações no gene CFTR podem resultar em fenótipo parcial da doença. Os pacientes
apresentam ausência congênita bilateral do canal deferente (CBAVD), azoospermia
obstrutiva, bronquiectasia, aspergilose broncopulmonar alérgica, hipertripsinémia e
pancreatite crônica. Estas doenças foram designadas como “doenças relacionadas com CFTR”
e muitas vezes são associadas a mutações consideradas mais suaves como: R117H, R347P,
A455E, 3849 + 10kb C→ T, R334W (Vankeerberghen e cols., 2002).
DIAGNÓSTICO
Apesar da heterogeneidade que se verifica nas manifestações e evolução da doença, o
diagnóstico de Fibrose Cística é clínico, na maioria das vezes se apresentam de maneira e
intensidade diferentes em cada individuo. Essa variedade clinica entre os indivíduos
provavelmente está relacionada com o polimorfismo em outros genes (O’Sullivan e cols.,
2009; Ribeiro e cols., 2002).
Embora o diagnóstico de fibrose cística seja usualmente realizado na infância (70%
dos casos no primeiro ano de vida), a frequência do diagnóstico na vida adulta vem
aumentando. A doença tornou-se também uma doença de adulto, exigindo o envolvimento de
pneumologista e de outros especialistas de adultos para o seu tratamento (Yankaskas e cols.,
2004). Em geral, os pacientes diagnosticados na vida adulta possuem formas não- clássicas de
fibrose cística. Eles se apresentam com doença respiratória crônica, sendo de menor,
gravidade, com menor frequência de infecção por Pseudomonas aeruginosa com menor
frequência de insuficiência pancreática do que os pacientes
com fibrose cística
diagnosticados na infância. Além disso, um outro fator que contribui para a dificuldade
diagnóstica é que uma considerável parcela desses pacientes apresenta teste do suor normal ou
no limittrofe (Gilljan e cols., 2004; Widerman e cols., 2000). O teste diagnóstico para a
fibrose cística é o Teste do Suor mais sensível considerado o padrão-ouro. A tríade
diagnóstica, doença sinopulmonar crônica, insuficiência pancreática e teores elevados de
cloreto no suor, constitui a sintomatologia (Sotto-Mayor e cols., 2003). O teste que mede
teores de Cloro no suor, denominado Teste do Suor, foi padronizado em 1959 por Gibson e
Cooke sendo utilizado até os dias atuais. A dosagem de eletrólitos é realizada através de
estímulos no suor pela Iontoforese com policarpina (Alvarez e cols., 2004; Lemos e cols.,
2004). Com os respectivos valores: < 40mml/L = negativo; entre 40 e 60 mml/L = no
limítrofe e > 60 mml/L = compatível com a Fibrose Cística (Mishra e cols., 2005). É um
exame de baixo custo, com elevada sensibilidade e especificidade e não invasivo (Ribeiro e
col., 2002).
I n t r o d u ç ã o | 27
27
As mutações descritas no gene CFTR através da análise molecular podem ser
rastreadas por várias técnicas, como a análise de polimorfismo conformacional de fita simples
(SSCP), a análise de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLPs),
sistema refratário a amplificação (ARMS – PCR), eletroforese em gel de gradiente de
desnaturação (DGGE). Hibridização de alelo-específicos (ASO), cromatografia liquida
desnaturante de alta performance (dHPLC), e, com mais eficácia, em alguns casos, por
sequenciamento, sistemas de PCR em tempo real (Dempsey e cols., 2004). Também a análise
através de associações entre haplótipos marcadores e mutações que causam Fibrose Cística
pode facilitar a detecção da causa da doença ou de portadores potenciais (Morral e cols.,
1996). Um crescente desenvolvimento nas técnicas moleculares nos últimos anos tem
contribuído para diagnóstico mais preciso das mutações relacionadas à Fibrose Cística nos
pacientes e na investigação de portadores.
A triagem neonatal para Fibrose Cística é realizada através da avaliação da tripsina
imunorreativa (IRT), com o objetivo de auxiliar no diagnóstico precoce (Welsh e cols., 2001).
A IRT é avaliada no sangue para identificação precoce de manifestações bioquímicas da
disfunção pancreática. A medição é feita em amostras de sangue seco (teste do pezinho)
usando radioimunoensaio (Audrezet e cols., 2008).
Existe uma grande variabilidade na frequência da doença e das principais mutações
causadoras da Fibrose Cística, de acordo com a ancestralidade dos indivíduos.
A distribuição das mutações CFTR em várias regiões do mundo foi realizada com o
intuito de entender a evolução da doença em cada região (Bobadilla e cols., 2002). A mutação
mais caracterizada atualmente é a ΔF508, cuja frequência mundial, entre os pacientes, é, em
média, de 66%, variando de acordo com a população estudada, sendo a Dinamarca o país que
apresenta a maior frequência (87%) e a Tunísia, apenas 18% (Bobadilla e cols., 2002). Está
presente em cerca de 70% dos países da região norte da Europa, e 55% nos situados no sul
europeu (Tabela 1).
I n t r o d u ç ã o | 2828
Tabela 1. Distribuição da mutação ∆F508
em pacientes fibrocísticos de alguns países
europeus, e américa Latina, segundo a
Organização Mundial de Saúde (OMS,2004)
e Bobadilla e cols., (2002).
Europa
América Latina
País
Dinamarca
Bélgica
Inglaterra
Holanda
Alemanha
Irlanda
França
Suíça
Áustria
Noruega
Suécia
Rússia
Grécia
Espanha
Itália
Polônia
Escócia
Rússia
México
Brasil
Chile
Incidência
1:4700
1:3700
1:2400
1:3650
1:3300
1:1800
1:2900
1:1700
1:2500
1:4.500
1:8000
1:2500
1:3500
1:3500
1:2500
1:6000
1:9840
1:4900
1:8500
1:6902
1:4000
%
87
71
70
74
72
70
68
67
77
60
57
54
53
53
51
57
71
54
41
48
29
| 2929
JUSTIFICATIVA
A contribuição dos diferentes grupos humanos varia de uma região para outra no
Brasil, levando a um perfil indefinido de distribuição de determinados polimorfismos, alguns
deles envolvidos na resposta genética de resistência/suscetibilidade a doenças. A avaliação da
história genética destas regiões é, portanto relevante para otimizar desígnios de estudos
centrados na identificação de determinantes genéticos de doenças. Existem poucos estudos
sobre a distribuição de polimorfismos de DNA na Amazônia Brasileira, o que, por si só,
justifica o estudo da estrutura desta população, principalmente porque se trata de uma região
em que o processo de miscigenação é recente, e estudos familiares ou populacionais podem
ser usados para identificar genes que refletem as diferenças entre as populações.
Apesar de que a maioria (ao redor de 98%) dos indivíduos com mutações em
homozigose no gene CFTR pode ser diagnosticada como indivíduos fibrocísticos através do
teste de suor, devido às altas concentrações de cloro e/ou sódio no suor (Legrys, 1996),
existem mutações que não alteram o teor de cloro e/ou sódio no suor e o teste apresenta níveis
normais destes íons. Para estes indivíduos a identificação da mutação no gene CFTR é um dos
testes de diagnóstico necessário (Wallis, 1997).
Em Rondônia, estado brasileiro situado na região da Amazônia Ocidental, a Secretaria
do Estado de Saúde (SESAU, 2010) identificou, 30 casos de Fibrose Cística, havendo entre
eles o óbito de uma criança, sem que a mutação responsável tenha sido identificada. A falta de
um Centro de Referência, ou mesmo um setor especializado da doença, em Rondônia, ou
regiões próximas, impede um acompanhamento mais cuidadoso dos casos diagnosticados, ou
a serem diagnosticados. Propusemo-nos a rastrear oito alelos do gene CFTR no intuito de
começarmos uma competência local em Genética no estudo de Fibrose Cística. Estes alelos
(∆F508, N1303K, W1282X, G551D, R553X, R1162X, G85E e R334W) apresentam as
características que se seguem:
ΔF508 - Localiza-se no exon 10 do gene CFTR, trata-se de uma deleção das bases CTT
(Karem e cols., 1989) que leva a perda do aminoácido fenilalanina na posição 508 da proteína
CFTR, impedindo o seu empacotamento correto e conformação normal e Mickle e Cutting
(2000) definem os pacientes homozigotos para a mutação ΔF508, como os que possuem
fenótipo clássico da doença, o que inclui elevadas concentrações de eletrólitos no suor,
insuficiência pancreática e doença pulmonar obstrutiva. Tal alteração está presente em 70 a
J u s t i f i c a t i v a | 31
30
95% dos alelos responsáveis pela Fibrose Cística em países do leste europeu. No Brasil essa
alteração contribui com cerca de 50% dos alelos responsáveis pela doença nas regiões sul e
sudeste (Correia e cols. 2005). Trabalhos realizados por Raskin e cols. (2001) em cinco
estados brasileiro como Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná, Minas Gerais e São Paulo
detectaram as respectivas frequências (49,1%), (55,2%), (39%), (32,6%) e (52,7%). Sendo
que Streit e cols. (2003) detectou no Rio Grande do Sul uma frequência de 48,7% similar à
encontrada por Raskin e cols. (2001). Trabalhos realizados por Araujo e cols. (2005) no
estado do Pará detectaram a frequência da mutação de 22.7%. Em outros estudos realizados
no Rio de Janeiro, Cabello e cols. (2005), efetuaram a triagem das mutações ao longo do exon
23 e das regiões flanqueadoras nos introns do gene CFTR utilizando a técnica SSCP e por
sequenciamento automático em 95 pacientes com fibrose cística. Foi concluída em apenas
34.7% dos pacientes.
G551D - A terceira mutação mundialmente mais frequente, apresentando 2.1% de indivíduos
fibrocisticos (CFGAC, 2004). As regiões com alta frequência correspondem às áreas com
grandes populações da descendência Celta. Localizada no exon 11 sendo associado ao
fenótipo grave da fibrose cística causando insuficiência pancreática severa. De acordo com
trabalhos realizados por Bobadilla e cols. (2002), a mutação G551D. Trabalhos realizados no
Brasil no estado de São Paulo por Raskin e cols. (2001) encontraram uma frequência da
mutação G551D de 0.9%.
N1303K: A quarta mutação mundialmente mais frequente com frequência de 1.3% (Dawson
& Frossard, 2000). Localizada no exon 21 está relacionada ao comprometimento pancreático.
R553X: A sexta mutação mundialmente mais frequente na população mundial com
frequência de 0.59% (CFGAC, 2004). Localizada no exon 11, associado com a doença
pancreática grave e doença pulmonar leve. No Brasil, trabalhos realizados por Cabello e
cols., 1999 na cidade do Rio de Janeiro a frequencia foi nula. Em São Paulo Bernardino e
cols. (2000) detectaram uma frequencia de 0.6%. Em outras populações do Brasil, Raskin e
cols. (2001) detectaram a frequencia de 2.7% em São Paulo, Paraná 2% e no Rio Grande do
Sul foi 0.7%.
W1282X: Localizado no exon 20, está associado com severa insuficiência pancreática. É
comum na maioria dos países mediterrânicos, atingindo maior frequência em Israel (36.2%),
31
J u s t i f i c a t i v a | 321
sendo comum em judeus Ashkenazi. Essas variações são provavelmente devido ao efeito
fundador durante a migração e estabelecimento de alguns grupos em diferentes áreas
(Rowntree e Harris., 2003; Bobadilla e cols., 2002). É a mutação mais comum em população
judaica (Ashkenazi em Israel). Na população mundial a mutação W1282X tem uma
frequência de 1.2% (Bombadilha e cols., 2002). Pesquisas com grupos populacionais
brasileiros relatam que não foi encontrada no estado do Rio de Janeiro, segundo Fernandes e
cols. (1994), que estudaram esta mutação em 26 cromossomos de afetados com fibrose
cística. Trabalhos realizados por Cabello e cols. (1999), em seu estudo com 88 cromossomos
de afetados não detectaram presença da mutação. Em São Paulo, Bernardino e cols. (2000)
encontraram 1 cromossomo com a mutação (1.3%) em uma amostra de 160 indivíduos.
R1162X: Localizada no exon 19. É a décima quinta mutação mais frequente no gene CFTR
na população mundial, apontando uma frequência de 0.03 (CFGAC, 2004). No Nordeste da
Itália a frequência da mutação R1162X é de 0.01, sendo mais rara em outras regiões do
mundo (Bobadilla e cols., 2002). A mutação R1162X caracteriza-se por expressar fenótipos
suaves da fibrose cística, causando insuficiência pancreática e insuficiência pulmonar
moderada (CFGAC, 2004). Trabalhos realizados por Bernardino e cols. (2000) em São Paulo
apontou uma frequência de 2.5% com valores inferior as pesquisas de Raskin e cols. (2001)
em afetados nascidos em Santa Catarina, Paraná e Minas Gerais detectando frequência de
4.8% para a mutação.
R334W: É a décima sétima mutação mais frequente em CFTR na população mundial
apresenta uma frequência de 0.16% (CFGAC, 2004). Localizada no exon 7. A mutação
R334W expressa um fenótipo grave de insuficiência pancreática. Trabalhos realizados no Rio
de Janeiro por Cabello e cols. (2001) indentificaram a mutação R334W em 2.6% de
indivíduos com fibrose cística. Outros trabalhos realizados no Brasil por Bernardino e cols.
(2000) em São Paulo encontraram uma frequência similar (2.5%) aos trabalhos realizados no
Rio de Janeiro. Streit e cols. (2003) detectaram no Rio Grande do Sul a frequência de (1.3%).
Pesquisadores sugerem que a mutação R334W foi introduzida no Brasil pelos espanhóis.
G85E: É a décima quarta mutação mais frequente em CFTR na população mundial (CFGAC,
2004), apresentando uma frequência de 0.38%. Localizada no exon 3, apresenta fenótipo
clinico moderado para insuficiência pancreática. Trabalhos realizados por Bernardino e cols.
J u s t i f i c a t i v a | 32
(2000), na cidade de São Paulo encontraram uma frequência de 1,2%. Pesquisas em outras
populações brasileiras feitas por Raskin e cols. (2001) apontam frequência para a mutação
G85E de (3,5%) no estado de Minas Gerais. Vários estudos utilizando diferentes métodos de
biologia molecular têm sido publicados no Brasil mostrando o perfil de mutação no gene
CFTR em alguns estados ou regiões com algumas características especiais deste país são a sua
dimensão geográfica e a variabilidade étnica de diferentes regiões.
A frequência baixa dessas mutações encontradas em populações brasileiras quando
comparada aos países europeus que colonizaram o Brasil e que contribuíram de forma
importante na composição genética dessas regiões brasileiras, reflete o alto índice de
miscigenação, característico de nosso país (Suarez-Kurtz, 2005).
A pergunta que fizemos foi: qual seria o mecanismo que propiciou a fixação de
indivíduos portadores de alelos fibrocísticos nesta região, através dos diversos ciclos de
povoamento? Numa primeira abordagem, partimos da hipótese de que o processo de
colonização desta região Amazônica propiciou a fixação de genes europeus, que justificam a
incidência, ainda que baixa, de indivíduos fibrocísticos na região e analisamos o problema
através de objetivos direcionados para a implantação de uma competência local em estudos de
Doenças Genéticas como um primeiro passo para a resolução de problemas de Saúde
Humana.
| 33
OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL
Caracterizar mutações no gene CFTR através da determinação de suas frequências
gênicas e genotípicas em amostras da população de Rondônia.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Montando métodos de diagnóstico molecular para identificação de mutações
fibrocísticas
b) Determinando a frequência das mutações ∆F508, R1162X, G551D, R553X, N1303K,
G85E, W1282X e R334W em algumas amostras de Rondônia, Amazônia Ocidental
Brasileira.
c) Comparando nossos resultados aos da literatura.
d) Implantando uma competência local em Genética Humana no estudo de Fibrose
Cística.
| 34
MATERIAL E MÉTODOS
POPULAÇÃO E ÁREA DE ESTUDO
Foram coletadas amostras de três regiões de Rondônia, compreendendo a cidade de
Porto Velho, capital do estado, a região Centro - Leste do estado (cidade de Cacoal) e vilarejo
de Pedras Negras, situado no vale do rio Guaporé, também a Leste do estado de Rondônia. No
total analisamos seis amostras. A figura 4 mostras estas áreas geográficas da coleta:
Cacoal
Pedras Negras
Figura 4. Mapa do Brasil e de Rondônia mostrando a localização da área de estudo
a. PORTO VELHO (“63°54’14” W; 08°45’43” S)
A vila de Porto Velho foi criada em 1913 e em 2 de outubro de 1914 transformou-se
em município. De 1971 a 1989 o garimpo foi a maior fonte econômica de Porto Velho e desde
4 de janeiro de 1982 é a capital do Estado de Rondônia. No começo do século XX Porto
Velho era um povoado com cerca de 300 habitantes, quase todos homens, brancos, e algumas
mulheres negras, havendo apenas uma mulher branca (Ferreira, 1987). Situava-se a cerca de
sete quilômetros de Santo Antônio, vilarejo pertencente, na época, ao estado de Mato Grosso
e cujo ponto foi escolhido para ser o início da ferrovia Madeira-Mamoré. Era uma região
povoada por índios Torá, Mura, Caripuras, Pamas e outras nações indígenas que foram sendo
M a t e r i a l e M é t o d o | 35
35
exterminadas tanto por missões jesuítas como pelos portugueses, que partiram para a
conquista da região do rio Madeira, no final da primeira metade do século XVIII (Silva,1991).
Em 1873, devido ao fluxo de migrantes para coleta de Latex, foi elevada à categoria de
coletoria, passando a município em 1912. Hoje, Santo Antônio é um bairro de Porto Velho, e
segundo alguns historiadores constitui uma relíquia histórica. Em 1907, por ocasião da
construção da estrada de ferro Madeira-Mamoré, a companhia ferroviária levantou, entre
Porto Velho e Santo Antônio, um hospital ao qual foi dado o nome de Candelária, e cuja
região constitui atualmente o bairro mais antigo de Porto Velho, no que se refere a sua
população, constituída em grande parte por descendentes de antigos operários da estrada
Madeira - Mamoré. Em seis anos (de 1907 a 1912) a companhia construtora contratou 21 783
homens, de diversas nacionalidades, sendo a maioria brasileiros vindo das regiões Norte e
Nordeste do Brasil. Entre os estrangeiros destacam-se antilhanos e barbadianos, espanhóis e
portugueses, encontrando - se também, em números significantes, italianos, colombianos,
alemães, franceses, russos, venezuelanos, bolivianos, norte-americanos (Ferreira, 1987).
Localiza-se à margem direita do rio Madeira, o maior afluente do rio Amazonas, possuindo
uma área de 58.310 km². Limita-se ao Norte com Humaitá (AM), ao Sul com Candeias do
Jamari (RO), a Oeste com Guajará Mirim (RO) e a Leste com o estado do Acre. Possui uma
estimativa populacional de 426.558 habitantes (IBGE, 2010). A população do município de
Porto Velho é miscigenada, oriunda de várias ondas migratórias, principalmente a partir da
segunda metade do século XX. A população urbana atual descende de imigrantes que vieram
principalmente do Nordeste e Sul do Brasil. A partir dos anos 1970, através de programas
patrocinados pelo Governo brasileiro, a zona urbana recebeu grande contingente humano
proveniente do Sul e Sudeste brasileiros, assim como de indivíduos provenientes de outros
estados da região Norte. Muitos dos atuais habitantes nasceram em Rondônia.
Nesta região foram coletadas quatro amostras:
1) a. em Engenho Velho, localidade de características ribeirinha, situada na margem direita do
rio Madeira, a 5 Km do centro da cidade, cuja atividade econômica baseava-se principalmente
na pesca e na agricultura. Este bairro foi desocupado em 2010 para obedecer a normas de
segurança, desde que estava na área das Usinas Hidroelétricas no rio Madeira, ainda em
construção. A amostra populacional foi coletada em 2006 por pesquisadores do Laboratório
M a t e r i a l e M é t o d o s | 376
36
de Genética Humana do Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais (IPEPATRO,
FIOCRUZ-RO), em colaboração com um grupo de médicos e paramédicos do Centro de
Pesquisas em Medicina Tropical (CEPEM), ligado à Secretaria de Saúde (SESAU) do
Governo do Estado de Rondônia, sob Coordenação do Dr. Mauro S. Tada. É constituída de
111 indivíduos adultos, sendo 55 não aparentados, de ambos os sexos.
2 e 3) Hospital de Base Dr Ari Pinheiro, situado na região central de Porto Velho, hospital
estadual, local em que foram coletadas duas amostras: b. HBM, constituída de 305 mulheres
que tiveram seus filhos no período de março a abril de 2005 e c. HBRN, constituída de 305
recém-nascidos, sendo 148 do sexo masculino e 157 do sexo feminino. As mães eram
provenientes de várias localidades de Porto Velho, sendo que algumas moravam em cidades
vizinhas. A coleta foi realizada com a cooperação de profissionais do Centro Obstétrico e do
laboratório de Análises Clínicas do Hospital, em acordo firmado com o Dr. Amado Ahamad
Rahhal, na época Diretor do Hospital.
4) d. HICD, amostra coletada no período de setembro de 2007 a dezembro de 2008 no
ambulatório do Hospital Estadual Infantil Cosme e Damião, situado em bairro periférico de
Porto Velho. É constituída de 1.000 crianças de ambos os sexos, com idades de 0 a 10 anos,
sendo 496 do sexo masculino e 504 do sexo feminino. Algumas com sinais clínicos
compatíveis com Fibrose Cística (diarréia e / ou infecções respiratórias) e recebiam prévia
recomendação médica de rastreamento de mutações. Nesta amostragem, além de sangue
também foi coletado 1 ml de swab bucal, sendo que o material foi mantido em recipiente
refrigerado e as amostras foram conduzidas em recipientes apropriados até o laboratório de
Genética Humana do IPEPATRO.
b. CACOAL (CAO; 11° 26′ 19″ S, 61° 26′ 50″ W)
De acordo com o censo de 2010, a população de Cacoal era de 77.982 habitantes.
Possui uma área de 3792.64 Km2. A amostra, coletada no ano de 2008, é composta por 84
indivíduos, sendo 39 do sexo masculino e 45 do sexo feminino, que procuraram atendimentos
clínicos para várias condições patológicas, dentre elas pneumonia e diarréia, na Unidade
Mista do Hospital Estadual da cidade.
M a t e r i a l e M é t o d o s | 37
c. VALE DO GUAPORÉ (62°54’ O; 12°51’ S)
Representada por Pedras Negras (PN), vilarejo situado no vale do rio Guaporé.
Pertence ao município de São Francisco do Guaporé, em uma zona de transição entre o
Pantanal Matogrossense e a Amazônia. Esta localidade é composta em grande parte por
remanescentes de Quilombolas do Vale do Guaporé, descendentes de escravos que
trabalharam nas minas de ouro, entre 1734 e 1835, da antiga capital do Mato Grosso, Vila
Bela da Santíssima Trindade. Foram analisados 35 indivíduos adultos, não aparentados, sendo
18 homens e 17 mulheres. A primeira coleta foi realizada em 2002, por um grupo de
pesquisadores do Laboratório de Genética Humana do IPEPATRO e médicos da cidade de
Costa Marques, cidade localizada próximo a Pedras Negras. Nova visita foi feita em 2007,
para coleta de novas informações antropogenéticas e de material biológico. No total, foram
coletas amostras de 1840 indivíduos, sendo 146 de amostra populacional e 1.694 de amostra
hospitalar (tabela 2).
Tabela 2. Amostras (total de indivíduos/localidade) analisadas
Total
Sexo
Porto Velho
Masculino
Feminino
1.HICD
496
504
1000
2.HB (Mães)
-
305
305
3.HB (RNs)
148
157
305
4.Engenho Velho
72
39
111
39
45
84
6. Pedras Negras
18
17
35
Total
773
1067
1840
Região Central de Rondônia
5.Cacoal
Região Vale do Guaporé
M a t e r i a l e M é t o d o s | 38
COLETA DE MATERIAL BIOLÓGICO
Em todas as amostras o procedimento de coleta de material biológico e de dados
antropogenéticos foi o mesmo. Na coleta de dados antropogenéticos (anexo I) foram obtidas
informações sobre etnia, baseada na cor da pele e características morfológicas dos sujeitos das
amostras, que foram classificados em Branco, Negro, Mulato e Amarelo.
Foram coletados 5 ml de sangue periférico em tubos contendo EDTA, após
consentimento escrito (anexo II). Nos recém-nascidos da amostra do Hospital de Base o
sangue foi coletado no cordão umbilical e nas amostras das crianças do Hospital Infantil
Cosme e Damião. Além de sangue foram também coletadas células da mucosa bucal (swab),
armazenadas em 1 ml de cloreto de sódio a 0.9%. O sangue coletado foi transportado em
recipientes refrigerados até o laboratório de Genética Humana do IPEPATRO, processado até
10h após a coleta para separação de hemácias e de leucócitos, armazenado a -20°C, até o
momento de uso, em alíquotas, para melhor conservação das amostras.
PROCEDIMENTOS DE ÉTICA EM PESQUISA ENVOLVENDO SERES HUMANOS:
Tanto a coleta das amostras, como o processamento, armazenamento e formação de
banco de dados, seguiram as normas do Conselho Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP,
resolução 196/96; Projeto aprovado sob número CONEP 3349/ 2001 e renovado sob o
número 13. 356/ 2007.
MÉTODOS LABORATORIAIS
1. Extração de DNA de leucócitos do sangue periférico
O DNA foi extraído segundo protocolo descrito por Higuchi (1989), a partir de 500 μl
de sangue total, logo após a coleta, sendo em seguida armazenado a – 20°C até o momento da
análise (anexo III). O sangue remanescente foi centrifugado e armazenado, sendo a fase
leucocitária (Buffer Coat) tratada com glicerol tamponado (Citrato de potássio tribásico 0.1
M; fosfato de sódio monobásico dihidratado 0.345 M; fosfato de sódio bibásico anidro 0.0344
M; glicerol 60 % e água destilada 40 %) e armazenada a – 20°C para futuras análises.
M a t e r i a l e M é t o d o s | 39
2. Reação da Polimerase em Cadeia (PCR)
Os alelos analisados (ΔF508, N1303K, G551D, R553X, R1162X , W1282X, R334W e
G85E) foram detectados através da técnica do PCR (Saiki e cols., 1988), em gel de
poliacrilamida a 10%, por aparelho termociclador Eppendorf modelo Mastercicler, utilizandose primers descritos na tabela 4 e 5 seguindo-se protocolos descritos na tabela 3. Os reagentes
utilizados na PCR compreenderam dNTPs 100mM, Taq DNA Polimerase 5U/μl, tampão 10X
da Enzima Taq, MgC2 50mM, primers específicos (Tabela 03) e 4µL de DNA genômico
para um volume final de reação de 25µL.
A análise dos resultados deu-se em gel de agarose 1.5% com corrida eletroforética a 100
V em tampão TBE 10X (Tris-HCl 0.89 M; Ácido Bórico 0,89 M e EDTA 10 mM) corado
com brometo de etídio e visualização em luz UV. Também foi utilizado gel de Poliacrilamida
a 10% (PAGE) com corrida eletroforética a 100 V corado com nitrato de prata 10% (AgNO 3).
O tempo de corrida variou entre 1 hora a 3 h, conforme o sistema a ser analisado.
Tabela 3. Concentração dos reagentes utilizados na reação de PCR e temperaturas de
pareamento (Tp)
usadas para a amplificação por PCR.
Éxon 11
Éxon 3
Éxon 7
Éxon 10
Éxon 19
Éxon 20
Éxon 21
Reagentes
G551D e
G85E
R334W
∆F508
R1162X
W1282X N1303K
R5532X
DNA (µL)
4,0 µL
4,0 µL
4,0 µL
4,0 µL
4,0 µL
4,0 µL
4,0 µL
Iniciadores
2,0 µL
2,0 µL
1,0 µL
2,0 µL
1,5 µL
1,5 µL
1,5 µL
Tris-HCl, pH 8,4 (10.0
Mm)
2,5 µL
2,5 µL
2,5 µL
2,0 µL
2,0 µL
2,5 µL
2,5 µL
dNTP
2,0 µL
0,3 µL
0,3 µL
0,2 µL
0,2 µL
0,3 µL
0,1 µL
MgCl2
1,2 µL
0,6 µL
0,3 µL
0,6 µL
0,6
0,6
0,3 µL
Taq polimerase (5 U)
0,1 µL
0,3 µL
0,3 µL
0,1 µL
0,1µL
0,3 µL
0,1 µL
Água qsp(µL)
11,2 µL
13,3 µL
15,6 µL
14,1 µL
15,1 µL
14,3 µL
15 µL
94°C/3’
94°C/5’
94°C/1’
94°C/5’
94°C/1’
94°C/5’
94°C/6’
94°C/1’
94°C/1’
94°C/30’
’
94°C/1’
94°C/1’
94°C/1’
94°C/1’
54°/1’
55°C/1’
55°C/1’
58°C/1’
62°C/1’
58°C/1’
58°C/1’
72°C/3’
72°C/3’
72°C/2’
72°C/1’
72°C/3 ‘
72°C/1’
72°C/2’
72°C/5’
72°C/5’
72°C/7’
72°C/1’
72°C/7’
72°C/5’
72°C/7’
30
30
30
35
35
35
30
Programa
Nº. de ciclos
M a t e r i a l e M é t o d o | 40
A concentração dos reagentes utilizados na reação de PCR, ciclos de desnaturação
térmicas do DNA, pareamento dos iniciadores em temperaturas adequadas, extensão dos
iniciadores promovida pela enzima Taq DNA polimerase. As sequencias dos iniciadores
(oligos) e as enzimas de restrição estão descritos nas tabelas 4.
Tabela 4. Descrição da sequência dos iniciadores utilizados na PCR dos exons 3, 7,11, 19 , 20 e 21,
tamanho dos fragmentos resultantes desta reação e enzimas de restrição específicas.
Mutação
Sequência 5’  3’
Tamanho do
fragmento
Enzima de
Restrição
Referencia
Éxon
3
G85E
5’-CTTgggTTAATCTCCTTggA-3’
5’-ATTCACCAgATTTCGTAgTC-3’
309 pb
Hinf I
1
7
R334W
5’-gATCTTCCATTCCAAgATCCC-3’
5’-ATCATAgTATATATAATgCAgC-3’
358 pb
Msp I
2
11
G551D
5’-CAACTgTggTTAAAgCAATAgTgT-3’
5’-gCACAgATTCTgAgTAACCATAAT-3’
425 pb
Mbo I
3
11
R553X
5’-CAACTgTggTTAAAgCAATAgTgT-3’
5’-gCACAgATTCTgAgTAACCATAAT-3’
425 pb
Hinc II
4
19
R1162X
5’ gCCCgACAAATAACCAAgTg 3’
5’ gCTAACACATTGCTTCAggCT 3’
454 pb
Dde I
5
20
W1282X
5’-ggTCAggATTgAAAgTgTgCA-3’
5’-CTATgAgAAAACTgCACTggA-3’
473 pb
Mnl I
6
21
N1303K
5’-CAATACAATAAgggAAAAAT-3’
5’-AATgATGTCAgCTATACAg-3’
59 pb
Bstn I
7
1. Zielenski e cols, 1991; 2. Streit e cols, 1999; 3. Cutting e cols,1990a; 4. Cutting e cols, 1990a; 5.
Gasparini e cols, 1991; 6. Vidaud e cols 1990; 7. Osborne e cols, 1991
Tabela 5. Descrição da sequência dos iniciadores utilizados na PCR do exon 10 e tamanho do fragmento
resultante desta reação.
Éxon
Mutação
10
∆F508
Sequência 5’  3’
5’ – gTTTTCCTggATTATgCCTggCAC -3’
5’- gTT GGCAgCTTTgATgA CgC TTC- 3’
Tamanho do
fragmento
Tamanho do
Fragmento
Mutante
98 pb
95pb
Referencia
1
1.Kerem e cols, 1989
3. Identificação dos Alelos do gene CFTR
3.1. O Alelo ΔF508
A identificação da mutação ΔF508 foi realizada em gel de agarose e poliacrilamida,
com primer descrito na Tabela 6. O indivíduo normal gera um fragmento de 98pb e o portador
de ΔF508, um de 95pb. Os indivíduos heterozigotos, portanto, apresentam fragmentos de 98 e
95pb (Kerem e cols 1989; figuras 5 e 6).
M a t e r i a l e M é t o d o | 41
F
i
g
u
ra 5. Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10%: Marcador de peso molecular de 100 pb.
Produto de PCR, nas colunas 1 a 22 indivíduos homozigotos normais para a mutação e na ultima
coluna o controle negativo.
M PCR 1
nnN
2
3
4
5
N
Figura 6. Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10%: Marcador de peso
molecular de 50 pb. Produto de PCR, detecção do alelo ∆F508. Nas
colunas 1 a 5 indivíduos heterozigoto para mutação ∆F508.
Os alelos R334W, G85E, G551D, R553X, W1282X, N1303K, R1162X: Digestão enzimática
(RFLPs).
A identificação de sete alelos analisados nesta Tese foi realizada através de PCR
seguida de digestão enzimática com enzimas especificas (Tabelas 4).
O produto da PCR dos marcadores RFLPs foi digerido após a confirmação da
amplificação do produto da PCR, sendo posteriormente visualizados em gel de Poliacrilamida
e corados com Nitrato de Prata a 10%. Cada mix de reação teve um volume final de 25 µl. As
condições de digestão foram desenvolvidas de acordo com o seguinte protocolo:
M a t e r i a l e M é t o d o s |42
O alelo R334W
Análise do alelo R334W utilizou-se a enzima Msp I, sendo que a ausência da mutação
cria um sítio de reconhecimento da enzima que cliva o produto da PCR em dois fragmentos
de 206, 152 pb . A presença da mutação reconhece um fragmento do tamanho de 358 pb
(figura 7).
M PCR N 1
2
358 pb
3
4 5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21
206pb
50 pb
152 pb
Figura 7. Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para a detecção da mutação R334W.
Marcador de peso molecular de 50 pb. Produto de PCR, Nas colunas 1 a 21 digestão do produto da
PCR. Presença do alelo R334W nas colunas 16 e 21 indivíduos heterozigotos para mutação R334W.
O alelo G85E
Para análise do alelo G85E localizado no éxon 3 utilizou-se a enzima HinfI. A
ausência da mutação cria um sitio de reconhecimento da enzima que cliva o produto da PCR
em três fragmentos de 172,105 e 32 pb . Já a presença da mutação reconhece apenas um
fragmento de 277 pb (figuras 8 e 9).
M 1
2
3
4
5
6
7
8
9
N
309 pb
100 pb
Figura 8. Eletroforese em gel de agarose a 1.5% para
detecção da mutação G85E. Marcador de peso molecular de
100 pb. Nas colunas 1 a 9 produtos de PCR resulta em
fragmento de 309 e ultima coluna controle negativo.
M a t e r i a l e M é t o d o s |43
M PCR 1 2
309 pb
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 N
172 pb
100 pb
105 pb
Figura 9. Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para detecção da mutação G85E. Marcador de peso
molecular de 100 pb. Produto de PCR, Nas colunas 1 a 19 digestão do produto da PCR – indivíduos normais.
O alelo G551D
Para análise da mutação G551D utilizou-se a enzima Mbo I quando a mutação está
presente são gerado dois fragmentos de 242 pb e de 183 pb . E quando a mutação está ausente
gera apenas um fragmento de 425 pb ( figura 10 e 11).
M
1
2
3
4
5
6
7
N
425 pb
100 pb
Figura 10. Eletroforese em gel de agarose a 1.5% para a detecção da mutação G551D.
Marcador de peso molecular de 100 pb. Nas colunas 1 a 7 produtos de PCR resulta em
fragmento de 425 e ultima coluna controle negativo.
M
N
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 13
425 pb
50 pb
Figura 11. Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para a detecção da mutaçãoG551D.
Marcador de peso molecular de 50 pb. Produto de PCR, Nas colunas 1 a 13 digestão do produto da
PCR. Todos os indivíduos normais para a mutação.
M a t e r i a l e M é t o d o s |44
O alelo R553X
Enquanto para análise da mutação R553X utilizou-se a enzima Hinc II. E quando não
possui sítio de reconhecimento que corta o produto de PCR permanece com o tamanho do
produto de PCR 425 pb. É gerando dois fragmentos normais de 239 e 186 (figuras 12 e13).
M
M
1
2
1
3
2
4
425
100
5
3
6
4
7
5
N
6
7
8
9
pb
pb
Figura 12. Eletroforese em gel de agarose a 1.5% para a detecção da mutação
R553X. Marcador de peso molecular de 100 pb. Nas colunas 1 a 9 produtos de
PCR resulta em fragmento de 425 e ultima coluna controle negativo
M
PCR
425 pb
1
2
3
4
5
6
239
7
100 pb
186
Figura 13. Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para a detecção da mutação
R553X. Marcador de peso molecular de 100 pb. Nas colunas 1 a 7 digestão do produto
da PCR. Todos os indivíduos normais para a mutação.
N
M a t e r i a l e M é t o d o s |45
O alelo W1282X
Para detecção da mutação W1282X localizada no éxon 20, utilizou-se a enzima Mnl I,
que identifica três fragmentos de 178, 172 e 123 pb para indivíduos normais e para indivíduos
com a mutação revela dois fragmentos de 301 e 172 pb (figura14).
M PCR 1 2 3 4 5 6 7 8
M N PCR 1 2 3 4
5
N
473 pb
18 N18
178 pb
172 pb
50 pb
96 107 11 12
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 N
8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17 18
123
pb
Figura 14. Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para detecção da mutação
W1282X. Marcador de peso molecular de 50 pb. Produto de PCR. – 473 pb. Nas
colunas 1 a 19 digestão do produto da PCR indivíduos normais – 178,172 e 123 pb. E
na ultima coluna controle negativo.
O alelo N1303K
Para análise da mutação N1303K, localizada no éxon 21, utilizou-se a enzima Bstn I.
Reconhece um fragmento de 59 pb nos indivíduos que possuem a mutação e nos indivíduos
normais cliva o fragmento em 30 e 19 pb. No caso de indivíduos heterozigotos aparece um
pequeno fragmento de 10 pb (figura 15).
M N PCR 1
18 N18
59 pb
2
3
4
5
6
7
8 9
10
11 12
13 14
15 16 17
18
30 pb
50 pb
19 pb
10 pb
Figura 15. Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para detecção da mutação N1303K.
Marcador de peso molecular de 50 pb. Controle negativo. Nas colunas 1 a 18 digestão do produto
da PCR.
M a t e r i a l e M é t o d o s |46
O alelo R1162X
Para a análise da mutação R1162X, no éxon 19, utilizou-se a enzima Dde I . A
ausência da mutação cria um sítio de reconhecimento da enzima que corta o produto da PCR
em dois fragmentos de 275 e 179pb. A mutação reconhece mais um sítio de restrição, que
cliva o fragmento de 179 pb em dois fragmentos, um de 143 e outro de 132pb. Assim, os
indivíduos que possuem a mutação apresentam os fragmentos de 179, 143 e 132pb (figura
16).
M PCR 1 2
100p
454 pb
b
3
4 5 6
7 8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 N
275 pb
179 pb
100pb
Figura 16. Eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% para detecção da mutação R1162X.
Marcador de peso molecular de 100 pb. Produto de PCR. 454 pb. Nas colunas 1 a 19 digestão do
produto da PCR – indivíduos normais - 275 e 179 pb para mutação.
M a t e r i a l e M é t o d o s |47
ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Todos os dados obtidos nesta Tese foram armazenados em planilha eletrônica
(Microsoft Excel, versão 2007).
As estimativas de frequência gênica e genotípica e respectivos desvios foram obtidos
por verossimilhança máxima, através do programa BioEstat , versão 5.3. Foram utilizados
testes não- paramétricos, que são apropriados em análises em que o tamanho amostral é
reduzido e os valores não apresentam distribuição normal, como o caso dos dados utilizados
nessa pesquisa. O nível de significância adotado foi de 5%, nesta e em todas as análises
estatísticas efetuadas.
A aderência das frequências genotípicas, observadas às proporções de HardyWeinberg, foi calculada pelo teste do qui-quadrado, com intervalo de confiança de 95% (p=
0.05), através do programa GENEPOP, versão 3.4 (Raymond e Rousset, 1995).
A precisão das estimativas pontuais foi determinada pelo Intervalo de Confiança de
95% (IC95%). Este parâmetro estatístico foi utilizado para podermos comparar, com controle
sobre as divergências observadas, as diferentes populações analisadas . Foi calculado segundo
método descrito por Wilson, 2008.
|48
RESULTADOS
CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS SEGUNDO DADOS ANTROPOGENÉTICOS
Os parâmetros utilizados na caracterização das amostras de Rondônia foram: etnia,
gênero masculino/feminino, cor da pele. As tabelas 6,7, 8 e 9 resumem os dados obtidos.
Tabela 6. Distribuição dos indivíduos das amostras do Hospital Infantil
(HICD), das Mães da maternidade do Hospital de Base (Mães-HB), seus
respectivos filhos (RN-HB), Engenho Velho, Cacoal e Vale do Guaporé de
acordo com a etnia, determinada pela cor da pele e por traços físicos.
População
Branco
%
Mulato
%
Negro
%
Ameríndio
%
HICD
17
77,5
4,9
0,6
Mães (HB)
19,4
75,1
5,2
0,3
RNs (HB)
17,6
82,2
0,1
0,1
Engenho Velho
15,3
75,7
9
-
Cacoal
84,5
13,5
2,4
-
Pedras Negras
16
62
22
-
CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS SEGUNDO AS FREQUÊNCIAS ALELICAS
Dos 2000 alelos analisados no HICD, foram encontrados 13 alelos mutantes ∆F508
Prevalência aproximada de 1/154. (p = 0,0065). Na amotras RN, dos 610 alelos analisados, 6
são alelos mutantes para ∆F508 Prev ≅ 1/102 (p = 0,0098) (tabela 7).
M a t e r i a l e M é t o d o |49
Tabela 7. Frequências do alelo ∆F508 nas amostras estudadas.
Alelos (ΔF508)
Frequência
ΔF508
Χ2
p
1. Crianças (HICD)
1974 (13)
0,0065 ± 0,006
0,0428
0,1639
2. Mães (HB)
3. Recem Nascidos (HB)
4. Engenho Velho
610 (0)
598 (6)
222 (0)
Nulo
0,0098 ± 0,008
Nulo
0,0301
-
0,1377
0,0060 ± 0.000
0,0030
0,0435
Nulo
-
Amostras
Micro-região: Porto Velho
Micro-região: Central de Rondônia
5. Cacoal
166 (1)
Micro-região: Vale do Guaporé
6. Pedras Negras
70 (0)
Total: Normal 3640 Normal + 20 ΔF508 = 3660 Alelos
Tabela 8. Frequências dos alelos DF508, R334W e N1303K na
Amostra do hospital Infantil Cosme e Damião, Porto Velho-RO.
Genótipo
Frequência genotípica
N/N
N/A
Total
∆F508
987
13
1000
R334W
998
2
1000
Frequência alélica
N1303K
998
2
1000
N
0,9935
0,999
0,999
A
0,0065
0,001
0,001
N= normal
A= variante
M a t e r i a l e M é t o d o |50
A tabela 9 mostra as frequências de dois alelos em duas amostras do Hospital de Base de
Porto Velho:
Frequência
Alelos
HB (Mães)
305 (0)
Nulo
3050,00 E+09
0,0000
305 (0)
Nulo
HB (RNs)
299 (6)
0,019
0,0300
0,1376
305 (0)
Nulo
Χ2
3050,00 E+09
0,0300
P
0,0000
0,0000
∆F508
Χ2
P
R1162X
Tabela 9. Mostra as frequências de dois alelos em duas
amostras do Hospital de Base de Porto Velho.
Incidência da fibrose cística
Para estimar o número real de heterozigotos em uma população, é necessário saber qual
a proporção de alelos mutantes está sendo detectada. O índice de detecção deverá ser derivado
do conhecimento das proporções alélicas das mutações entre pacientes com FC.
Também não podemos descartar o fato de que para se efetuar cálculo de incidência de
doença pela triagem de heterozigotos, é necessário que a população esteja em equilíbrio de
Hardy-Weinberg, ou seja, ausência de migração ou seleção preferencial.
Já é consenso que eventos mutacionais novos são raros, entretanto a seleção preferencial
de heterozigotos ainda não está totalmente estabelecida.
Uma outra estimativa a incidência da FC seria utilizar valores bem estabelecidos de
outras amostras com os dados populacionais de cada cidade estudada. Para tanto, no caso dos
caucasóides utilizaremos a incidência da FC em Portugal 1:3.500, para os negros e pardos
utilizaremos a incidência de 1:17.000 e no caso de indígenas ou orientais, esta incidência
poderá ser negligenciada devido a sua raridade. Desta forma, o cálculo da incidência da FC
foi estimado de acordo com a distribuição étnica dessas cidades.
(
)
(
)
(
)
(
)
( )
(
)≅
|51
DISCUSSÃO
Nesta tese iniciamos um procedimento de rastreamento de mutações do gene CFTR,
que é o loco gênico responsável pela doença Fibrose Cística. As mutações são responsáveis
por alterações estruturais da cadeia proteica, ocasionando a doença, cuja gravidade é variável,
dependente da natureza das mutações. Foram analisadas seis amostras coletadas em três
regiões de Rondônia, que se localiza na região Noroeste do Brasil, a Amazônia Ocidental: as
cidades de Cacoal (uma amostra), Porto Velho (Recém-nascidos e respectivas Mães do
Hospital de Base; Hospital Infantil e o vilarejo ribeirinho, Engenho Velho, num total de
quatro amostras), e uma amostra de quilombolas da região centro-sul de Rondônia, o vilarejo
de Pedras Negras.
Em Rondônia, a colonização européia começou aproximadamente em 1650 em uma
região pouco habitada por povos indígenas, que se instalaram no Vale do rio Guaporé (Pinto,
1993). Os colonizadores portugueses e posteriormente as populações africanas, provenientes
do sistema escravista, povoaram o território, no que foram seguidos pela imigração de
italianos, alemães, espanhóis, japoneses, até o final do período de Império no século XIX
(Martins e cols, 1993). Segundo historiadores, no início do povoamento, houve uma tendência
de casamento entre o homem europeu, que para o Brasil se deslocava, e a mulher indígena, na
formação da população da região norte do Brasil (Hugo, 1959). Na história de povoamento
de Rondônia, as décadas de 70 e 80 foram um período auge da colonização, sendo o processo
de ocupação linear, ao longo da BR 364 (Martine, 1978), tendo os imigrantes vindos, em sua
maioria, das regiões Sul, Sudeste e Centro Oeste, principalmente dos estados do Paraná,
Minas Gerais , Espírito Santo e Rio Grande do Sul (Oliveira, 2000). Houve concentração
principalmente nas áreas de Ji-Paraná, Cacoal, Pimenta Bueno, Ariquemes, cidades situadas
na região centro-Leste de Rondônia.
Neste trabalho de Tese, observamos uma concentração, ainda que de baixa frequência,
de mutações fibrocísticas, na região que acompanha a BR 364, por onde vieram os imigrantes
do S e SE, no Programa Governamental de Assentamento Agrário da segunda metade do
século XX. A tabela 8 mostra as frequências dos oito alelos investigados. Apenas três alelos
foram detectados: o ΔF508, o NI303K e R334W.
As amostras de Recém-nascidos do Hospital de Base e Crianças do Hospital Infantil
Cosme e Damião, ambos da cidade de Porto Velho, apresentaram a mutação ΔF508 em úmero
estatisticamente mensurável (0.98% e 0.65%, respectivamente, tabela 7). O valor de requência
da amostra de RN (0,0098 ± 0,008 com o valor de p = 0,1377) evidencia que este grupo não
D i s c u s s ã o |52
adere às condições de equilíbrio de Hardy- Weinberg. De acordo com Kitzis e cols. (1988), a
herança do alelo ∆F508 é preferencial sobre o alelo normal pelos filhos de pai portador da
mutação sugerindo a interação dos alelos do gene CFTR e do cromossomo Y (Pritchard
1991). Observamos que nos RN, o alelo mutante não veio de nenhuma mãe da amostra, em
que a frequência deste alelo foi nula. Portanto, os RN herdaram o gene através de seus
respectivos progenitores masculinos. Também, numa análise de mtDNA realizada nas duas
amostras do Hospital de Base (Cantanhede e cols., 2010) foi obtida uma frequência de 64% de
haplótipos Ameríndios (em ambas as amostras), havendo coerência entre estes resultados e a
história de povoamente sumariamente discutida acima. Apenas um indivíduo de Cacoal
apresentou o alelo ΔF508, mesmo se a amostra, pela cor da pele, era constituída por 84,5% de
indivíduos caucasóides. Esta determinação de mistura étnica foi obtida pela análise de cor da
pele, realizada por enfermeiros no momento da internação do indivíduo. Com exceção desta
amostra de Cacoal, as outras populações estudadas nesta Tese apresentaram o padrão de
mistura característico das populações brasileiras. Estes dados já foram descritos, nesta região,
em trabalhos anteriores envolvendo estes indivíduos (Farias e cols., 2012; Casseb e cols.,
2008; Heckmann e cols., 2005). A detecção de seis alelos ΔF508 em 305 recém nascidos do
hospital de Base mostra que esta mutação, que é a mais frequente em população cacausoides,
foi observada em 1: 101 cromossomos. Esta frequência observada está de acordo com a
historia de povoamento da região norte do Brasil, em que houve uma tendência de casamentos
entre mulheres Ameríndias com homens descendentes de imigrantes europeus (CarvalhoSilva e cols, 2001). Nenhuma mãe do HB apresentou a mutação no gene CFTR, sendo esta
uma evidencia de herança de que o alelo ΔF508 encontrado nos RNs veio de origem paterna.
A análise do DNA mitocondrial (mtDNA) nestas amostras de mães e recém nascidos mostrou
a presença de haplótipos Ameríndios com frequência de 64% em ambas as amostra.
No Hospital Infantil também foram observadas as mutações NI303K e R334W, duas
vezes cada. Não houve casos de homozigotos, mesmo se alguns indivíduos apresentassem
sinais clínicos de Fibrose Cística. Nas análises realizadas nas amostras do HICD, observamos
uma frequência de heterozigotos igual a 0,0065. Sabendo-se que a mutação ΔF508
corresponde a aproximadamente 50% dos alelos de indivíduos com FC no Brasil, obtêm-se a
frequência dos alelos causadores de FC utilizando a proporção: (0,0065/0,5)=0,013. Essas
informações nos leva a estimar qual seria a incidência de fibrocísticos nessa amostra como
aproximadamente de 1/5917 indivíduos.
D i s c u s s ã o |53
Esses resultados divergem de encontrados em outras populações, como a do Rio Grande
do Sul, cuja contribuição caucasóide à constituição étnica da população é maior que a
observada na região Norte, local da Pesquisa da Tese, levando a uma maior incidência de
fibrocísticos na população (1:1.587; Raskin e cols,2007).
Gontijo (2008), trabalhando com amostras do Vale do Guaporé, analisada por
marcadores informativos de ancestralidade (AIM), encontrou uma composição étnica igual a
42% de Ameríndios, seguido por Africanos (37%) e Europeus (21%). Esta região, povoada
primeiramente por Amerindios, posteriormente ocupada por escravos Africanos (quilombolas)
foi envolvida por ondas migratórias do século XX e embora o percentual de genes
caucasóides seja significativo (21%) não foi possível detectar nenhuma das mutações
analisadas. No Brasil a incidência de Fibrose Cística em afro-brasileiros é desconhecida, uma
vez que não há estudos epidemiológicos abrangentes que permitam avaliar integralmente as
variações étnicas regionais. Na população desse estudo, pelas características étnicas próprias,
além dos fatores descritos acima, a ausência de alelos mutantes pode reforçar a hipótese de
que esta população negra teria uma mutação própria, como já sugerida por Padoa e cols.
(1999).
A amostra ribeirinha de Porto Velho foi representada neste trabalho pelos indivíduos
de Engenho Velho, oriundos do Amazonas e de Rondônia. Não foi observado nenhum alelo
mutante nesta amostra.
Trabalho realizado por Leal-Mesquita, 2001 no estado do Maranhão (Tabela 10)
confirma o fator “povoamento” como causa da alta/baixa prevalência da mutação ∆F508 em
seus estudos, que chegou ao alto nível de 5,4% na amostra de Santa Flora, de origem
portuguesa. Esta frequência polimorfica é bem próxima à encontrada em países europeus, e
pode ser explicada como o resultado de um efeito do fundador, que deriva dos Portugueses
que povoaram a região. Na região Sul, a baixa frequência do alelo ΔF508, detectada nos
trabalhos de Marostica (1995) e Raskim e cols., (2008), refletiu a origem geográfica deste
alelo. Estes resultados são uma comprovação da influencia da miscigenação na frequência da
mutação
ΔF508 em populações povoadas por individuos oriundos de diversas regiãoes
geográficas e etnias diferentes. Estes resultados estão descritos na tabela 10, em que podemos
observar que os resultados não diferem significantemente dos observados em outras regiões
brasileiras.
D i s c u s s ã o |54
Tabela 10. Frequência da mutação ∆F508 em diferentes populações do Brasil.
Regiões
Estados/Cidade
N
Brasileiras
N
%
Alelo
Bahia***
1002(4)
1006
0,40
IC
IC
95%
95%
0,13
0,0109
Referência
Moura-Costa e cols.
(2007)
Maranhão
Nordeste
Pontal **
108 (0)
108
Zero
Zero
0,0428
Cajual**
78 (0)
78
Zero
Zero
0,0585
Santa Flora*
70 (4)
74
5,41
1,75
0,1399
Rio Grande do Sul*
1043 (13)
1056
1,23
0,69
0,0215
Raskin e cols. (2008)
RN Rio Grande do
334 (4)
338
1,18
0,38
0,0321
Maróstica e cols.
Sul*
Sul
(1995)
Santa Catarina*
995 (5)
1000
0,50
0,18
0,0123
Paraná*
1051 (5)
1056
0,47
0,17
0,0116
Guarani
160 (0)
160
Zero
Zero
0,0292
(Amerindia)
Kaingang
Leal Mesquita. (2001)
Raskin e cols. (2008)
Faucz e cols (2007)
166 (0)
166
Zero
Zero
0,0282
Minas Gerais*
1228 (4)
1232
0,32
0,10
0,0088
Raskin e cols. (2008)
Rio de Janeiro***
589 (3)
592
0,51
0,13
0,0161
Cabello e cols. (1999)
RN Rio de Janeiro
223 (1)
224
0,45
0,02
0,0285
Cabello e cols . (2003)
São Paulo*
1019 (3)
1022
0,29
0,07
0,0093
Raskin e cols. (2008)
HICD ***
1987(13)
2000
0,65
0,36
0,0114
Este trabalho
305 (6)
610
0,98
0,40
0,0224
Este trabalho
(Amerindia)
Sudeste
***
Norte
HB ***
*Caucasoide ); ** (Afro-Brasileiro); *** (Tri- hibrida); RN (Recém Nascido)
Comparando os resultados obtidos neste rastreamento da mutação ΔF508 em
Rondônia com os observados em outras regiões brasileiras observamos diferenças de
frequências que seguramente refletem a incidência maior ou menor de genes caucasoides na
composição étnica das populações. A distribuição heterogênea, ao longo do território
brasileiro, das três etnias que compõem sua população, explicam o alto grau de diversidade
genética observado em nas diferentes regiões do Brasil, resultado desta mistura em variadas
proporções das etnias caucasóide, negróide e ameríndia (Salzano e Freire-Maia, 1967).
D i s c u s s ã o |55
No caso de genes fibrocísticos não se descarta uma possível alta taxa de mortalidade infantil
(cujas causas primárias seriam doença pulmonar e gastrointestinal) levando a não
sobrevivência dos afetados e/ou o retardo no reconhecimento da doença. Outros fatores
seriam as dificuldades de acesso aos serviços de saúde e aos exames diagnósticos (Raskin e
cols., 2003).
A mutação ∆F508, na forma homozigótica, é responsável por um fenótipo grave da
Fibrose Cística, como insuficiência pancreática, doença pulmonar muito grave que a
observada em Fibrose Cística causada por outras mutações (Mickle e Cutting 2000). A
ausência do genótipo ∆F508/∆F508 neste trabalho pode ser explicada tanto pelo tamanho
amostral, pela grande diversidade na composição étnica entre as amostras e também pela
ausência de diagnósticos precoces, que levariam a atendimentos médicos mais eficazes, e pela
morte precoce dos indivíduos afetados. Segundo Rowntree e Harris (2003) fenótipos
fibrocísticos não Δ F508 em geralo não apresentam problemas graves no sistema digestivo e
respiratório e têm uma qualidade de vida que se aproxima da normalidade.
No Brasil, as primeiras investigações de rastreamento de mutações em indivíduos
fibrocísticos indicaram que o ΔF508 encontrava-se em 47% dos pacientes, contra 66% de
pacientes norte-americanos. A alta miscigenação da população brasileira foi evidente em
pacientes fibrocísticos de Minas Gerais, em que este alelo foi o responsável pela doença em
53% dos indivíduos caucasóides e em 24% dos negróides. As outras mutações encontradas
foram G542X (5,5%), G551D (0.2%), N1303K (2.6%) e R533X (0.8%) (Reis e Damasceno,
1998). A dificuldade na descrição da identidade molecular da Fibrose Cística persiste até hoje,
mesmo se a metodologia molecular para detecção da mutação responsável esteja atualmente
com uma sofisticação que facilita e acelera o processo. A dificuldade reside ainda na escolha
do alelo a ser investigado. Escolhemos os alelos ∆F508, N1303K, W1282X, G551D, R553X,
R1162X, G85E e R334W devido às características clínicas da doença resultante, compatíveis
com o fenótipo observado em alguns pacientes da Secretaria de Saúde de Rondônia, e pelas
informações obtidas das frequências delas em pacientes fibrocísticos brasileiros.
Além do ΔF508 encontramos os alelos R334W e N1303K na amostra de crianças do
Hospital Infantil, entre os indivíduos classificados como caucasoides, pela cor da pele. Foram
dois indivíduos, para cada alelo, e a frequência de cada um deles foi bem baixa (0,001), em
heterozigose com o alelo normal (tabela 8).
Numa investigação realizada em fibrocísticos na cidade do Rio de Janeiro, Cabello e
cols. (2001) identificaram a mutação R334W como a responsável pela doença em 2.6% dos
D i s c u s s ã o |56
indivíduos analisados, cujos resultados foram similares ao de Bernardino e cols. (2000) em
amostra de São Paulo. No Rio Grande do Sul, esta mutação foi detectada em 1.3% de
indivíduos analisados.
O alelo N1303K não foi encontrado em amostras do Rio de Janeiro (Fernandes e cols.,
1994; Cabello e cols., 1999) mas foi detectado em pacientes de São Paulo (2.5%; Bernardino
e cols., 2000).
Os alelos R1162X, G85E, W1282X, G551D, R553X não foram detectados nas
amostras de Rondônia, mas entre os fibrocísticos de São Paulo (Bernardino e cols., 2000),
R1162X foi a terceira mais frequente (2,5%) e valores mais altos foram observado entre
pacientes de Santa Catarina, Paraná e Minas Gerais (4,8%; Raskin e cols, 2001). Entre
Ameríndios de isolado americano e em Italianos do Sul do país, Mercier e cols. (1994)
observaram-na em baixa frequência (0,02%). Esta mutação é uma das poucas mutações
fibrocísticas descritas em populações Ameríndias.
Os outros alelos não encontrados neste trabalho já foram detectados em pacientes
fibrocísticos de outros estados brasileiro, em baixas frequências, com exceção de alguns
trabalhos referentes ao Rio de Janeiro e Minas Gerais (tabela 11).
Discute-se o problema de diagnóstico tardio de Fibrose Cístico e apesar de o problema
já ter sido levantado há algum tempo (discutido em Reis e Damasceno, 1998) não existe, até o
momento, a rotina de realização de teste neonatal em hospitais públicos e particulares de
várias regiões do Brasil. Os testes diagnósticos, quando realizados, muitas vezes já encontra o
paciente desnutrido e acometido de doenças graves, pulmonares, principalmente (Sih e cols.,
2012).
Apesar da especificidade proporcionada pelos testes genéticos, estes se tornam não
apropriados quando alguns parâmetros não são levados em consideração, como a estrutura
genética da população, origem étnica e geográfica dos indivíduos que a compõem, etc.
D i s c u s s ã o |57
Tabela 11: Frequências de alelos do gene CFTR em alguns estados brasileiros
Alelo
G551D
R553X
G85E
W1282X
Frequência (%)
Referência
1,1
Rio de Janeiro
Cabello e cols., 1999
0,9
São Paulo
Raskim e cols.,2001
1,04
São Paulo
Alvarez e cols., 2004
0
Sta Catarina
Raskin e cols., 2003
0
Paraná
Raskin e cols., 2003
0
São Paulo
Correia e cols.,2005
0,2
Rio Grande do Sul
Raskin e cols., 2001
0,76
Sta Catarina
Raskin e cols., 2001
1,6
Paraná
Raskin e cols., 2001
0,8
Rio Grande do Sul
Raskin e cols., 2001
1,6
Minas Gerais
Raskin e cols., 2001
0,6
São Paulo
Bernardino e cols., 2000
0,52
São Paulo
Alvarez e cols., 2004)
2,6
Santa Catarina
Raskin e cols., 2003
2,6
Paraná
Raskin e cols., 2003
3.5
Minas Gerais
Raskin e cols., 2003
1.8
São Paulo
Bernardino e cols., 2000
0
Rio de Janeiro
Fernandes e cols., 1994
0
Rio de Janeiro
Cabello e cols., 1999
1,3%
São Paulo
Bernardino e cols., 2000
4,73
Rio de Janeiro
Cabello e cols., 2001
São Paulo
Alvarez e cols., 2004)
4,8
Santa Catarina
Raskin e cols., 2003
2%
Paraná
Raskin e cols., 2003
São Paulo
Bernardino e cols., 2000
0,52%
R1162X
Estado
2,5%
Nesta amostra de Rondônia fomos incapazes de determinar se quatro crianças, de 2 a 4
anos apresentavam mutação fibrocística. Estas crianças, devido aos sintomas característicos
que apresentavam, estavam sob avaliação clínica para Fibrose Cística. Será necessário rever
principalmente estes casos, determinar a ancestralidade destas crianças e analisar com mais
acurácia as condições clínicas, a atividade pancreática, o desenvolvimento físico em busca das
condições genéticas e fisiológicas da alteração da proteína CFTR.
Muitas vezes alguns fibrocísticos apresentam níveis normais ou limítrofes de
concentração de eletrólitos no suor, o que cria uma situação atípica de diagnóstico. Além
disso, uma das dificuldades de diagnóstico,
D i s c u s s ã o |58
no Brasil e vários países, mesmo os que apresentam uma população étnica
predominantemente caucasóide, indígena ou negróide, é que muitas crianças afetadas, e
mesmo adultos, não são diagnosticadas em virtude da superposição de sintomas da fibrose
cística com os de outras doenças mais comuns, como a diarreia crônica, a desnutrição e as
infecções respiratórias, comuns em países em desenvolvimento (Mishra e cols., 2005; Silva
Filho e cols., 2003). O diagnóstico molecular muitas vezes tem de ser realizado com métodos
complexos (como os observados em Hadj Fredj e cols., 2013; Cabello e cols., 2005) e a
presença de médicos pneumologistas, pediatras, microbiologistas, na detecção da flora
bacteriana coletada por métodos endoscópicos (Franche e cols., 2007) auxiliará na obtenção
do diagnóstico.
|59
CONCLUSÃO e PERSPECTIVA
1.
Neste trabalho, realizou-se a análise molecular do gene CFTR em indivíduos com e
sem características sugestivas de Fibrose Cística, em diferentes amostras do estado de
Rondônia, com o objetivo de se determinarem as frequências das mutações ΔF508, R334W,
N1303K, G551D, G551D, W1282X, G85E e R1162X, consideradas as mais comuns na
população mundial e descritas em amostras de fibrocísticos brasileiros em estudos abrangendo
amostras de várias regiões geográficas.
2.
A presença da deleção ΔF508, dos alelos R334W e N1303K nas amostras de Recém
nascidos do Hospital de Base, em crianças do Hospital Infantil “Cosme e Damião” e em
apenas um indivíduo da cidade de Cacoal, região Centro-Leste de Rondônia, confirma a
influência da colonização desta região por descendentes de europeus e está de acordo com a
História de povoamento da região.
3.
A ausência de alelos no estado homozigoto reflete o alto grau de mistura, sobretudo da
etnia Ameríndia, neste região da Amazônia Ocidental Brasileira e à baixa frequência dos
alelos analisados em populações não caucasóides.
4.
Faz-se necessário melhor conhecimento sobre a estrutura genética da população desta
região da Amazônia Ocidental, para identificação da ancestralidade étnica e geográfica dos
indivíduos que povoaram a Amazônia. Os resultados obtidos nesta Tese contribuíram para a
caracterização genética da população do estado de Rondônia, cujo povoamento foi realizado,
desde o século XIX, por fluxos migratórios intensos, e continua atualmente pela construção
das usinas Hidrelétricas do rio Madeira.
5.
Esta Tese poderá contribuir para o conhecimento de metodologias usadas na detecção
da mutação fibrocística de indivíduos já diagnosticados clinicamente como Fibrocísticos, ou
sob suspeita.
6.
Sugere ainda a necessidade de obediência, pelas Secretarias de Saúde, à Portaria GM /
MS n. 822/GM de 2001/06/06 do Ministério da Saúde, que versa sobre a obrigação das
Instituições de Saúde realizar a triagem neonatal para FC, adotar métodos de uma rápida e
C o n c l u s ã o e P e r s p e c t i v a |60
confiável de confirmação que permitam o diagnóstico precoce e melhora o prognóstico, itens
essenciais para um desenvolvimento saudável em indivíduos homozigotos para mutações
fibrocísticos.
7.
Sugere que aspectos relevantes são fundamentais na compreensão das questões atuais
da Fibrose Cística, isto é, indivíduos com características sugestivas a doença estariam sendo
subdiagnosticados ou diagnosticados incorretamente.
8.
A ausência de indivíduos homozigotos, mesmo os que se encontravam sob suspeita
clínica de apresentarem Fibrose Cística (caso de crianças do Hospital Infantil) indica a
necessidade de continuidade da Pesquisa, introduzindo-se a análise de outros alelos já
descritos em populações Ameríndias e Negróides, tanto nestas amostras estudas nesta Tese
como também nos indivíduos já diagnosticados clinicamente como fibrocísticos e sob
tratamento.
|61
REFERENCIAS
Alvarez AE.; Ribeiro AF.; Henssel G.; Bertuzzo CS and Ribeiro JD. Fibrose Cística em um
centro de referencia no Brasil: caraterísticas clínicas e laboratoriais de 104 pacientes e sua
associação com o genótipo e a gravidade da doença. J Pediatr 80 (5): 371-379, 2004.
Andrade-Casseb A, Krauze A, Lafontaine RM, Tada MS, Silva WA, Simões AL, Engracia V.
Distribution of hemoglobina phenotypes in four diferente districts of Porto Velho, Rondônia,
Brazil. Hum Biol 80: 573-579, 2008.
Araújo, F. G.; Novaes, F. C.; dos Santos, N. P. C.; Martns, V. C.; Souza DE, S. M.; dos
Santos, S. E. B.; Ribeiro-dos-Santos, A. K. C. Prevalence of ΔF508, G551D, G542X and
R553X mutations among cystic fibrosis patients in north of Brazil. Braz. J. of Medical and
Biol. Reser., 38: 11-15, 2005.
Audrézet M-P.; Dabricot A.; Le Marechal C and Ferec C. Validation of high- resolution DNA
melting analysis for mutation scanning of the cystic fibrosis transmembrane conductance
regulator (CFTR) gene. J. Mol Diagn 10 (5): 424-434, 2008.
Bernardino AL.; Ferri A.; Passos-Bueno MR.; Kim CE.; Nakaie CM.; Gomes CE. Molecular
analysis in Brazilian cystic fibrosis patients reveals five novel mutations. Genet Test; 4: 6974, 2000.
Bobadilla JL.; Macek Jr M.; Fine JP.; Ferrell PM. Cystic fibrosis: a worldwide analysis of
CFTR mutations-correlation with incidence data and application to screening. Hum Mutat.;
19: 575-606, 2002.
Cabello, G.M.; Moreira, A.F.; Horovitz, D.; Correia, P.; Santa Rosa, A.; Llerena J.Jr.; Greg,
J.; Grody, W.W.; Degrave, W.M.; Fernandes, O.; Cabello, P.H. Cystic fibrosis: low frequency
of DF508 mutation in 2 population samples from Rio de Janeiro, Brazil. Human Biology, 71:
189-196,1999.
R e f e r ê n c i a s |62
Cabello, G. M. K.; Cabello, P. H.; Llerena JR., J.; Fernades, O.; Harri, A.The 3120+1G a
splicing mutation in CFTR is comun in Brazilian cystic fibrosis patients. Hum. Biol., 73: 40309, 2001.
Cabello GMK.; Cabello PH.; Roig SRS.; Fonseca AL. Cystic fibrosis in “screening” by twotrued newborn IRT assay and ∆F508 mutation molecular analysis. J Bras Patol Med Lab;
39(1): 15-20, 2003.
Cabello, MGK.; Cabello, PH.; Otsuki, K.; Gombarovits, ME.; Llerena, JC.; Fernandes, O.
Molecular analysis of 23 exons of the CFTR gene in Brazilian patients leads to the finding of
rare cystic fibrosis mutations. Human Biology 77:125-135, 2005.
Cantanhêde L.M. 2010. Determinação dos Haplogrupos A, B, C e D de DNA mitocondrial, na
Busca da Ancestralidade Genética da população Urbana de Porto Velho Estado de Rondônia.
Monografia. Faculdades Integradas Aparicio Carvalho, 2010.
Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium: Worldwide survey of the DF508 mutation –
report from the CFGAC. Am j Hum Genet. 47: 354-359,1990.
Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium. Population variation of common cystic fibrosis
mutations. Hum mutat. 4; 167-77,1994.
Cystic Fibrosis Foundation. Consensus Conferences. The diagnosis of Cystic fibrosis:
Consensus statement. 7(1), 1996.
Cimmino M.; Cavaliere M.; Nardone M.; Plantulli A.; Orefice A.; Esposito V. Clinical
characteristcs and genotupe analysis of patients with cystic fibrosis and nasal polyposis. Clin
Otolaryngol. 28: 125-32, 2003.
Collins, F. S.; Weissman, S.M. Directional cloning of DNA fragments at a large distance from
an initial probe: a circularization method. Proc Natl Acad Sci USA, v. 81, n. 21, p. 6812-6,
1984.
R e f e r ê n c i a s |63
Cooper D.; Krawczak M.The mutational spectrum of single base-pair substitutions causing
human genetic disease: patterns and predictions. Hum Genet 85:55-74, 1990.
Correia CAA. Prevalência de Seis Mutações no Gene CFTR Em Portadores de Fibrose Cística
da Região de Campinas. Dissertação. Campinas (SP): Universidade Estadual de Campinas;
2005.
Cutting, GR.; Kasch, L.M.; Rosenstein, BJ.; Zielenski, J.; Tsui, LC.; Antonarakis, S E.;
Kazazian, H.H.Jr. A cluster of cystic fibrosis mutations in the first nucleotide binding fold of
the cystic fibrosis conductance regulator protein. Nature, 346, 366369, 1990a.
Davies JC. New tests for cystic fibrosis. Pediatr Respir Rev 7 (1): 141-3. Pmid: 16798543,
2006.
Dawson, K.P.; Frossard, P.M. The geographic distribution of cystic fibrosis mutations gives
clues about population origins. Eur J Pediatr. 159:496-9, 2000.
Dempsey E.; Barton DE and Ryan F. Detection of five common CFTRmutation by RapidCycle Real - Time Amplification refractory Mutation System PCR. Clin Chem 50 (4): 773775 (2004).
Di Sant’Agnese, P.A.; Darling, R.; Perera, G.; Shea, E. Abnormal composition of sweat in
cystic fibrosis of the pâncreas. Clinical significance and relationship to the disease. Pediatrics,
12: 549 – 63, 1953.
Estivill, X; Farrall, M; Scambler, PJ; Bell GM; Hawley, KM.L; Ench , NJ. Bates, GP; Kruyer,
HC; Frederick, PA; Stainer, P; Watson, EK; Williamson, R e Wainwrigth, BJ A candidate for
the cystic fibrosis locus isolated by selection for methylation- free islands. Nature.326: 840845, 1987.
Estivill, X.; Bancells, C.; Ramos, D. Geographic distribution and regional origin of 272
fibrosis mutations in European populations. Human Mutation, 10: 135-154, 1997.
R e f e r ê n c i a s |64
Franche, G.L.S; Silva, F.A; Saleb, C.S. Bacretiologia do aspirado do meato médio em
pacientes com fibrose cística. Revista Brasileira de Otorrinolaringologia, vol.73,nº. 4,pp.494499, 2007.
Farias JD.; Santos MG.; Krauze A.; Delani D.; Tada MS.; Andrade-Casseb A.; Simões AL.;
Engracia V. Distribuition of the CCR5 delta 32 allele (gene variant CCR5) in Rondônia,
Western Amazonian Region, Brazil. Genetics Molecular Biology, 35(1): 27-31, 2012.
Faucz FR.;Gimenez J.; Ramos MD.; Pereira-Ferrari.; Estivel X.; Raskin S. Cystic fibrosis in
soutern Brazilian population: characteristics of 90% of the alleles. Clin Genet, 72 (3): 218 –
23, 2007.
Faucz FR.; Souza DAS.; Olandoski M.; Raskin S. CFTR allelic heterogeneity in Brazil:
historical and geographical perspectives and implications for screening and counseling for
cystic fibrosis in this country. J Hum Genet. 55:71-6, 2010.
Fernandes, O.; Gutierrez, B.; Degrawe, W.; Hyga, L.; Moraes, L.; Horovitz, D.; Almeida,
J.C.C.; Llerena, Jr J. Determinação do genótipo de fibrocísticos numa amostra hospitalar do
Rio de Janeiro. Rev Bras Pat clin, 30 (4): 159-163, 1994.
Ferreira MR. A Ferrovia do Diabo. Editoa Melhoramentos,1987.
Gasparini, P.; Nunes V.; Savola, A.; Dognini, M.; Morral, N.; Gaona, A.; Bonizzato, A.;
Chillón,M.; Sangiuolo, F.; Novelli, G.; Dallapiccola, B.; Pignatti, P.F.; Estivill, X. The search
for South European cystic fibrosis mutations: identification of two new mutations. Four
variants and introns sequences. Genomics. 10, 193-200, 1991.
Gibson LE, Cooke RE. A test for concentration of electrolytes in sweat in cystic fibrosis of
the pancreas utilizing pilocarpine by iontophoresis. Pediatrics. 23:545-9,1959.
Gilljam M, Ellis L, Corey M, Zielenski J, Durie P, Tullis DE. Clinical manifestations of cystic
fibrosis among patients with diagnosis in adulthood. Chest. 126(4): 1215 -24, 2004.
R e f e r ê n c i a s |65
Gontijo CC. Genetic composition of two Afro-Brazilian populations inferred from ancestry
informative markers (Composição Genética de Duas Populações Afro-derivadas Brasileiras
Inferida a partir de Marcadores Informativos de Ancestralidade). Master’s Degree Thesis,
University of Brasília, Distrito Federal, Brasília, Brazil. 78 pp (Portuguese), 2008.
Hadj Fredj, S; Boudaya, M; Oueslati, S; Sahnoun Safa; Sahl, C; Siala H; Boussetta, K; Bibi
Amina; Messaoud, T. New frameshift CF mutation 3729 delAins TCT in a Tunisian cystic
fibrosis patients. Journal Genet, 2013.
Heckmann MI, Mendes- Junior CT, Tada MS, Santos MG, Cabello GM, Salzano FM, Simões
AL e Engracia V. CFTR haplotype distribution in the Brazilian Western Amazonian region.
Human Biology 77: 499-508, 2005.
Higuchi, R. Simple and rapid preparation of samples for PCR. In: Erlich, H.A, (Ed) PCR
technology- principles and applications for DNA amplification, 36 New York: Stockton, Press,
1989.
Hugo V (1959) Pathfinder II. Missão Selestiana de Humaitá Publisher, Amazonas, Manaus.
830 pp.
Yankaskas JR.; Marshall BC.; Sufian B.; Simon RH.; Rodman D. Cystic fibrosis adult care:
consensus conference report. Chest. 125 (1 Suppl): 1 S-39 S, 2004.
Kerem, B.; Rommens, J.; M. Buchanan J.A.; Markiiewicz, D.; Cox, T. K.; Chakravarti, A;
Buchwald, M.; Tsui, L. Identification of the cystic fibrosis Genetic analysis. Science, 245,
1073-1080, 1989.
Keller BM.; Aebischer CC.; Kraemer R and Schöni MH. Growth in prepubertal chilfren With
cystic fibrosis, homozygous for the ΔF508mutation. Journal of Cystic Fibrosis 2: 76 -83, 2003.
Kitzis A.; Chomel JC.; Kaplan JC.; Giraud G.; Labbe A.; Dastugue B.; Dumur V.;Farriaux,
JP.; Roussel P.; Williamson R.; Feingold J. Unusual segregation of cystic fibrosis allele to
males. Nature 333: 215,1988.
R e f e r ê n c i a s |66
Leal-Mesquita ERRBP . The cystic fibrosis gene in different population groups (O gene da
fibrose cística em diferentes grupos populacionais). PhD Thesis, São Paulo University, São
Paulo, São Paulo. 79 pp. (Portuguese), 2001.
Legrys, V. Sweat testing for the diagnosis of cystic fibrosis: Practical considerations. J
Pediatr. 129(6):892-97, 1996.
Lemos, A.; C. M.; Matos E.; Franco R.;Santana P.; Santana M.A. Fibrose Cística em adultos:
aspectos clínicos e espirométricos. J Bras Pneumol. v. 1, n. 30, p. 9-13, 2004.
Lyczak JB.; Cannon CL.; Pier GB. Lung Infections associated with cystic fibrosis. Clinical
Microbiology Reviews. Ht ancestry informative SNPs! An J Hum Biol. 15(2): 194-222, 2002.
Lowe, C.U.; May, C.D.; Reed, S.C. Fibrosis of the pâncreas in indants and children: a
statistical study of clinical and hereditary deatures. Am J Dias Child. v.78, p.349-74, 1949.
Martins CS.; Ribeiro F.; Costa FF. Frequency of cystic fibrosis delta F508 mutation in a
population from São Paulo State, Brazil. Braz. J. Med Biol Res 26: 1037-1040, 1993.
Martine, G. Migrações Internas e Alternativas de Fixação Produtiva: Experiência recente de
Colonização no Brasil. Clacso, México. Trabalho apresentado no simpósio sobre migrações
Internas e Desenvolvimento 78:319, 1978.
Maróstica PJC. Avaliação pneumológica de pacientes portadores de fibrose cística: sua
relação com grupos genéticos [tese]. Porto Alegre, Universidade Federal do Rio Grande do
Sul; 1995.
Mickle, J.E.; Cutting, G.R. Genotype- phenotype relationships in cystic fibrosis. Med. Cl.
North. Am. 84 (3); 597 -07, 2000.
Mishra A.; Greaves R and Masie J. The releavance of sweat testing for the diagnosis of cystic
fibrosis in the genomic Era. Clin Biochem Rev: (26) 135 - 153 (2005).
R e f e r ê n c i a s |67
Mckone EF.; Emerson SS.; Edwards KL.; Aitken ML. Effect of genotype on phenotype and
mortality in cystic fibrosis: a retrospective cohort study. Lancet.361:1671–6, 2003.
Morales MM.; Caapella Mam and Lopes AG. Structure and function of the cystic fibrosis
transmembrane conductance regulator. Braz J Med Biol Res 32 (8): 1021- 1-28,1999.
Morral, N.; Bertranpetir, J.; Estivill. X.; Nunes, V.; Casals, T. The origin of the major cystic
fibrosis mutation (∆F508) in European populations. Nat. Genet., 7: 169- 75, 1994.
Moura-Costa F.M.; Santana M.A.; Lemos A.C.; Galvão- Castro B.; Acosta A.X. Low
frenquency of the ∆F508 mutation of the CFTR gene in a highly admixed population in
Bahia, Brazil. Hum Biol. 79 (3): 293-7, 2007.
Osborne L.; Knight R.; Santis G.; Hodson M. A mutation in the second nucleotide binding
fold of the cystic fibrosis gene. Am J Hum Genet 48:608-612 ,1991.
Osbone, L.; Santos, G.; Schwarz, M.; Klinger,K.; Dork T.;Mclnton, L.; Schwart, M.; Nunes,
V.; Macek, M.; Jr, Reiss, J and. Incidence and expression of the N1303K mutation of cystic
fibrosis (CFTR) gene.Hum Genet. 89. 653 -658,1992.
Oliveira, AO. Assim é Rondônia. Edição especial; IBGE, 2000.
O´Sullivan BP.; Freedman SD. Cystic fibrosis. The Lancet. 373-1891-1904, 2009.
Padoa C.; Goldman A.; Jenkins T.; Ramsay M. Cystic fibrosis carrier frequencies in
populations of African origin. J Med Genet. 36 (1): 41 – 4. PMID: 9950364, 1999.
Pinto PE. Rondônia, historic evolution: creation of the Federal Territory of Guaporé, factor of
national integration (Rondonia, evolucao historica: criacao do Territorio Federal de Guapore,
fator de integração nacional). Expressão e Cultura Publishing. Rio de Janeiro-RJ, Brazil, 216
pp, 1993.
Pritchard DJ. Cystic fibrosis allele frequency, sex ratio anomalies and fertility: a new theory
for the dissemination of mutant alleles. Hum Genet 87: 671-676, 1991.
R e f e r ê n c i a s |68
Raymond M. & Rousset F. Genepop (version 3.4): population genetics software for exact
tests and ecumenicism. J. Heredity. 86:248-249, 1995.
Raskin S.; Faucz FR. Aspectos genéticos da fibrose cística. In: Carakushansky G. Doenças
genéticas em pediatria. São Paulo: Guanabara. p. 227-238, 2001.
Raskin S.; Pereira L.; Reis F.; Rosario NA.; Ludwig N.; Valentim L, et al. High allelic
heterogeneity between Afro-Brazilians and Euro-Brazilians impacts cystic fibrosis genetic
testing. Genet Test, 7: 213-218, 2003.
Raskim S.; Pereira Ferrari L.; Caldeira RF.; Abreu F.; Maraostica P.; Rozov T, et al.
Incidaence of cystic fibrosis in five diffrent stares of Brazil as determined by screening of
p.F508 del, mutation at the CFTR gene in newborns and patients. J Cystic Fibrosis. 7(1). 1522, 2008.
Ratjen F and Döring G. Cystic fibrosis. The Lancet. vol. 361, no.9358, pp.681-689, 2003.
Reis, F.J.C.; Cerqueira, M.C.D. Tábua da vida de pacientes com fibrose cística em Minas
Gerais. Journal de Pneumologia, 17: 6, 1991.
Reis e Damasceno. Fibrose Cistica. J.Pediatria (Rio); 74: 876-894, 1998.
Reis, F.; Melo S.O.; Vergara AA.; Programa de Triagem Neonatal Para Fibrose Cística de
Minas Gerais (PETN-FC): Aspectos clínicos e laboratoriais; Anais do I Congresso Brasileiro
de Fibrose Cístia, SP: 2006.
Ribeiro JC.; Ribeiro MAGO.; Ribeiro AF. Controvérsia na fibrose cística - do pediatra ao
especialista. J Pediatr (Rio J). 78 (Supl): S171 - S186, 2002.
Riordan, JR.; Rommens, J.; Kerem, B-S.; Alon, N.; Rozmahel, R.; Grzelczak, Z.; Zielenski, J.;
Lok, SI.; Plavisc, N.; Chou, JIA-Ling.; Drumm, ML.; Iannussi, Michael.; Collins, FS.; Tsui,
L-C. Identification of the Cystic Fibrosis gene: Cloning and Characterization of
complementary DNA. Science. 245: 1066-1073, 1989.
R e f e r ê n c i a s |69
Rommens., J.M.; Iannuzzi, M.C.; Kerem, B.; Drumm, M.L.; Melmer, G.; Dean, M.;
Rozmahel, R.; Cole, J.L.; Kennedy, D.; Hidaka, N.; Zsiga, M.; Buchwald, M.; Riordan, J.R.;
Tsui,L.C.; Collins, F.S. Identification of the cystic fibrosis gene: chromosome walking and
jumping. Science, v245, n 4922, p.1059-65, 1989.
Rosentein BJ, Cutting GR. The diagnosis of cystic fibrosis: aconsensus statement. Cystic
Fibrosis Foundation Consensus Panel. J Pediatr. 132(4); 589 -95, 1998.
Rosov T. Doenças Pulmonares em pediatria: diagnóstico e tratamento. 1ª Ed. São Paulo. Ed.
Atheneu, 1999.
Rowntree RK.; Harris A. The phenotypic consequences of CFTR mutations. Ann Hum
Genet.67: 471-485, 2003.
Saiki, R.K., D.H. Gelfand, S.J.; Scharf, R.; Higuchi, G.T.; Horn, K.B.; Mullis and H.A.
Erlich. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA
polymerase. Science, 239: 487-491, 1988.
Salvatore, F.; Scudiero, O.; Castaldo. G. Genotype-phenotype correlation incystic fibrosis: the
role of modifier genes. Am. J. of Med. Genet. 111: 88-95, 2002.
Salzano FM & Freire-Maia N. Brazilian populations: demographic, genetic and
anthropological aspects (Populações brasileiras: aspectos demográficos, genéticos e
antropológicos). Companhia Editora Nacional Publishing, publisher of the University of Sao
Paulo, Sao Paulo.177 pp, 1967.
Santos GP., Domingos MT.,Witting EO., Riedi CA., Rosario NA. Programa de triagem
neonatal para fibrose cística no estado do Paraná: avaliação após 30 meses de sua implantação.
J Pediatr (Rio J). 81: 240 -4, 2005.
Smith, A.; Welsh, M. Cystic Fibrosis Scientifc American 273: 52-58, 1995.
Sih, T; Golginho, R; Franco, LP; Piltcher, O. Cystic Fibrosis: Brazilian ENT
Experience.International Journal of Otolaryngology, 2012
R e f e r ê n c i a s |70
Silva AG. Amazônia, Porto Velho. 138 páginas. Edição do autor, Porto Velho-RO, 1991.
Sotto- Mayor R. Tratado de Pneumonia. 68: 927-943, 2003.
Streit, C. Análise de mutações em pacientes com fibrose cística nascidos no sul do Brasil.
Dissertação (Mestrado em Bioquimica). Departamento de Ciências Biológicas- Bioquimica,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brasi, 1999.
Streit, C.; Bulamarque-Neto, A. C.; Abreu E Silva, F.; Giugliani, R.; Pereira, M. L. S. CFTR
gene: molecular analysis in patients from south brazil. Mol. Genet. And Met. 78: 259-64,
2003.
Suarez- Kurtz G. Pharmacogenomics in admixed populations. Trends Pharmacol Sci. 26 (4):
196-201, 2005.
Tsui, L.C.; Buchwald M, Barker D. Cystic fibrosis locus defined by a genetically linked
polymorphic DNA marker. Science. 230: 1054 -7, 1985.
Tsui, L.C and Durie, P. 1997. Genotype and phenotype in cystic fibrosis. Hosp. Pract. 32:115142, 1997.
Vankeerberghen A.; Cuppens H.; Cassiman JJ. The cystic fibrosis yransmembrane
conductance regulator: an intriguing potein with pleiotropic functions. J Cistic Fibrosis. 1: 1329, 2002.
Vidaud, M.; Fanen, P.; Martin, J.; Ghanem N.;Nicolas S.;Goossens M. Three point mutations
in the CFTR gene in French cystic fibrosis patients: identification by denaturing gradient gel
electrophoresis. Hum. Genet. 85: p 446 – 449, 1990.
Wallis C. Diagnosing cystic fibrosis: blod, sweat and tears. Arch Dis Child. 76: 85-91,1997.
Welsh M.J.; Liedtke, C.M. Chloride and potassium channels in cystic fibrosis airway
epithelia. Nature, v. 322, n.6078, p. 467-70, 1986.
R e f e r ê n c i a s |71
Welsh M.J.; Ramsey BW.; Accurso F.; Cutting, GR. Cystic Fibrosis. In: Scriver AB, Sly WS,
Valle D. editors. The molecular and metabolic basis of inherited disease. New York:
McGraw-Hill; p 5121-5188, 2001.
Welsh, M.; Denning, G.M.; Ostedgaard, L.S.; Anderson, M.P. Dysfunction of CFTR bearing
the ∆F508 mutation. Science. 17: 235-239, 1993.
Wiedemann, B.; Steinkamp, G.; Sens, B. & Stern, M. The German cystic fibrosis quality
assurance project; clinical features in children and adults. Eur. Respir. J. 17, 1187 -1194,2001.
Wilson B. E.The Law of Succession, and Statistical Interference. Journal of the American
Statistical Association. p.209-2012, 2008.
Zielenski, J.; Bozon, D.; Kerem, B.; Markiewiicz, D.; Durie, O.; Rommens, J.M.; Tsui,
L.C.Identification of mutations in éxons 1 through 8 of the cystic fibrosis transmembrane
conductance regulator (CFTR) gene. Genomics. 10: 229-235, 1991.
Zielenski, J.; Markiewicz D.; Rininsland F.; Rommens J.; Tsui L-C. A cluster of highly
polymorphic dinucleotide repeats in intron 17b of the cystic fibrosis transmembrane
conductance regulator (CFTR) gene. Am J Hum Genet 49: 1256-1262,1991b.
Zielenski J.; Rozmahel R.; Bozon D.; Kerem B.; Grzelczak Z.; Riordan JR.; Rommens JM .
Genomic DNA sequence of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)
gene. Genomics 10: 214-228, 1991c.
Zielenski J.; Tsui LC. Cystic fibrosis: genotypic and phenotypic variations. Annu Ver Genet.
29:777 – 807,1995.
Zielenski T.; Tsui LC. Cystic Fibrosis: genotypic and phenotypic variations. Annual Review
of Genetics. 29:777- 807, 1997.
REFERÊNCIAS ELETRÔNICAS
I-
Sites foram acessados entre fevereiro de 2007 a janeiro de 2013.
R e f e r ê n c i a s |72
Cystic Fibrosis Wordwide. Disponivel em: htt//www.cfww.org/. Acessado em: 08/2007.
Cystic Fibrosis Wordwide. Disponivel em: htt//www.cfww.org/. Acessado em: 09/2008.
Cystic Fibrosis Wordwide. Disponivel em: htt//www.cfww.org/. Acessado em: 08/2009.
Cystic Fibrosis Foundation. Disponível em: http://www.cff.org/. Acessado em: 09/2010.
Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium - CFGAC. The Cystic fibrosis mutation
database. Disponível em: http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr. Acesso em janeiro de 2011.
Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium - CFGAC. The Cystic fibrosis mutation
database. Disponível em: http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr. Acesso em janeiro de 2012.
Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium - CFGAC. The Cystic fibrosis mutation
database. Disponível em: http://www.genet.sickkid
|73
Anexo I - Questionário Antropogenético
Unidade Laboratorial de
Genética Molecular Humana
CEP: 78.900.970
Caixa Postal: 87
BR: 364/ KM 3.5
QUESTIONÁRIO ANTROPOGENÉTICO
Registro
Casa nº.
Data da coleta
Pai
Mãe
Rua:
Nº.
Telefone:
Bairro:
Estado Civil:
Escolaridade:
Etnia: B ( ) N ( )
Entrevistador
Idade:
Ocupação principal:
M( )
I (
Tabagismo: Sim ( )
Não ( )
)
Etilismo: Sim ( )
Não ( )
Endocruzamento: Sim ( )
Não ( )
Sistema ABO e Rh
Filhos: Sim ( )
Renda familiar:
Não ( )
Nº.
( ) 1 sal
Estatura:
Sexo: ( ) Masculino
Aborto:
( ) 2 sal
Sim ( )
( ) 3 sal
Não ( )
>4 sal ( )
Peso ao nascer:
( ) Feminino
Nome da criança:
Data de nascimento:
Nome da criança:
Local de nascimento:
Data de nascimento:
Idade:
Histórico de ascendência dos Pais
Pai:
Mãe
Avô paterno:
Avó materna:
Nº
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Anexo II – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE)
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Eu,
________________________________________________________morador
da
localidade___________________________________________declaro ter sido plenamente
esclarecido sobre o conteúdo do presente termo e que:
a) Concordo em participar da pesquisa “Caracterização de Populações Humanas em
Rondônia através de Análise de Polimorfismos de DNA” e da liberdade de recusar
a participar ou retirar meu consentimento em qualquer fase da pesquisa sem
penalização nem prejuízo ao meu cuidado.
b) Minha participação se resume em autorizar o uso de amostras coletadas sobresponsabilidade da Dra. Vera Engracia Gama. Não terei que realizar nenhum outro
exame além da coleta desta autorização, não terei qualquer tipo de gasto ou ganho e
poderei me retirar a qualquer momento desta pesquisa, sem que isto me cause
qualquer prejuízo, bastando para isso entrar em contato com o pesquisador(a) citado
abaixo.
c) O sangue ficará guardado no laboratório de Genética do Instituto de Pesquisas em
Patologias Tropicais – IPEPATRO.
Porto Velho, _______de______________ de 200______.
Assinatura: _______________________________________________
Pesquisador (nome e assinatura)_______________________________
Dra. Vera Engracia Gama de Oliveira
Laboratório
Instituto
de
de
Genética
Pesquisa
Tropical – IPEPATRO
BR. 364, KM 3,5 – PORTO VELHO, RO
CEP: 78.900.970 Telefone: (69) 2196008
em
Humana,
Patologia
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Anexo III – Protocolo de Extração de DNA – Método Proteinase K
I - Material e Equipamentos
 Microcentrífuga
 Micropipeta (c/ 1 ponteira/amostra)
 Microtubos de polipropileno tipo "Eppendorf" de 1,5 ml
II - Reagentes e Soluções
 TAMPÃO PARA LISE DE ERITRÓCITOS
Tris/HCl 0,5 M pH 7,6; Sacarose 0,32 M; MgCl2 1M; Triton X-100 1%
 TAMPÃO PARA LISE DE LEUCÓCITOS
Tris/HCl 0,5 M pH 8,5; KCl 2M; MgCl2 0,5 mM; NP-40 0,45%;Tween 20 (ou 80)
0,45%
 PROTEINASE K: 10 mg/ml
III – Procedimentos
1. As amostras de sangue devem ser colhidas em tubos Vacutainer com EDTA Volume de 3
a 5 ml (nunca menos do que 2 ml).
2. Proceder alternativamente de acordo com o tipo de amostra:
a) sangue total: colocar 500 l de sangue total em microtubo;
b) sangue total glicerolizado: transferir 50 l de hemácias p/ um microtubo de 1,5 ml;
c) Buffy Coat (BC): transferir 50l de buffy coat para um microtubo de 1,5 ml;
d) Sangue total hemolisado: transferir 300 l para microtubo e centrifugar.
Separar o
sobrenadante, se sobrar sedimento, proceder com ele a partir do item 3; caso contrário,
usar o sobrenadante a partir do item 7.
3. Acrescentar 1 ml do tampão de lise de eritrócitos (lise 1).
4. Centrifugar a 6000G por 1 minuto e descartar o sobrenadante.
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5. Os procedimentos 3 e 4 devem ser repetidos até que o precipitado fique límpido,
indicando ausência de contaminação com a hemoglobina. Normalmente 3 vezes são
suficientes.
6. Ressuspender o precipitado em 300 l de tampão de lise de leucócitos, adicionar 5 l de
Proteinase K(10 mg/ml) e deixar pelo menos 1 hora a 65ºC e mais 3 horas a 37ºC
(preferencialmente à noite).
7. Aquecer a 94ºC por 10 minutos para inativar a proteinase K, estocar a –20ºC. Este DNA
tem se demonstrado de ótima qualidade para PCR.
a) Acrescentar 75 l de NaCl 5,6 M autoclavado aos 300 l de tampão de leucócitos;
b) Inverter cuidosamente várias vezes;
c) Centrifugar durante 5 minutos a 6000 rpm;
d) Transferir o sobrenadante para outro eppendorf de 1,5 ml;
e) Adicionar a este sobrenadante transferido 900 l de etanol 95% gelado (de preferência a
–20ºC);
f) Agitar cuidadosamente o tubo e deixar por no mínimo 2 horas em freezer a –20ºC;
g) Centrifugar durante 5 minutos a 6000 rpm;
h) Descartar o sobrenadante, deixando aproximadamente 30 l no tubo e cuidando para não
ressuspender o pellet;
i) Adicionar 1ml de etanol 70% e inverter cuidadosamente;
j) Centrifugar durante 5 minutos a 6000 rpm;
k) Descartar o sobrenadante, deixando aproximadamente 30 l no tubo cuidando para não
ressuspender o pellet;
l) Secar a 37ºC na estufa a vácuo;
m) Ressuspender o pellet em 200 l de Tris-HCl pH 7,6 0,01 M;
n) Estocar a –20ºC até o momento do uso. Existe indicação, de que o DNA em tampão,
mantém-se por bastante tempo (1 ano ou mais) em geladeira; em freezer, mantém-se por
tempo indetermina