Degustação de trechos de livros sugeridos
Determinação de estrutura de proteínas
Fonte: Wilson & Walker. Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular
Biology, 7ed. Página 328Massa molecular relativa
Existem três métodos disponíveis para a determinação da massa molecular relativa, Mr,
frequentemente denominado de “peso molecular”. Os dois primeiros descritos abaixo
são rápidos e simples e resultam em valores com precisão de 5-10 %. Dependendo do
objetivo do experimento, necessita-se saber um valor estimado de tamanho da proteína e
esses métodos em geral são suficientes para tal finalidade. O terceiro método baseado na
determinação da massa por espectrometria de massa requer pessoas especializadas na
utilização do instrumento e dão valores de massa com precisão de 0.001 %. Este tipo
de precisão é essencialmente importante quando se quer determinar modificações póstraducionais.
- Eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel
electrophoresis)
Neste tipo de eletroforese as proteínas são separadas com base no tamanho, o qual por
sua vez está diretamente relacionado com a massa molecular. Para a determinação da
massa da proteína, aplica-se uma amostra contendo uma mistura de proteínas com
massas conhecidas (marcadores de peso molecular) no mesmo gel. Após a eletroforese,
cora-se o gel e mede-se a distância percorrida por cada proteína marcadora e calcula-se
a razão entre a distância percorrida pela proteína sobre a distância total da corrida de
eletroforese. Com esses dados constrói-se uma curva de Log Mr (massa da proteína
marcadora) vs migração relativa (da proteína marcadora). Determina-se a distância
percorrida pela proteína e calcula-se a sua migração relativa. Com esse dado, determinase a massa molecular utilizando-se a equação da reta obtida na curva padrão.
- Cromatografia de exclusão (filtração em gel)
O volume de eluição da proteína na cromatografia de exclusão é determinado pelo
tamanho da proteína. Esse volume de eluição tem relação direta com o logarítimo da
massa molecular da proteína (Log Mr). Com a finalidade de determinar a massa de uma
proteína, primeiro é necessário construir uma curva de calibração (curva padrão)
utilizando várias proteínas de massa conhecida. Em geral faz-se a cromatografia de
exclusão utilizando-se o equipamento de HPLC com colunas cujas dimensões variam de
1 a 30 cm e fluxos de 1 mL/min. Curvas de calibração lineares são obtidas plotando-se o
Log Mr vs Kd (eluição relativa). O Kd é calculado seguindo a equação:
Kd = (Ve-Vo)
(Vt-Vo)
Onde, Vo é o volume morto (volume necessário para que as moléculas totalmente
excluídas da coluna saia, em geral é um volume muito pequeno), Vt é o volume
necessário para que moléculas muito pequenas que entram em todos os poros saiam
1
(volume total da coluna) e Ve é o volume necessário para que a proteína de interesse
saia. Esse método dá valores de massa com precisão de 10%.
- Espetrometria de massas
Usando métodos de ionizações brandas, como o electrospray (ESI) ou o MALDI
(dessorção/ionização a laser assistida por matriz), pode-se produzir íons moleculares
intactos para proteínas e, portanto pode-se determinar a sua massa molecular de forma
precisa por espectrometria de massas. Em geral, o ESI produz íons de moléculas com
massas de até 100 kDa, enquanto o MALDI produz íons de moléculas com massas de
até 200 kDa. Em ambos, necessita-se de quantidades muito pequenas de amostra
(pmols). A espectrometria de massa possibilita a determinação de massa com alta
precisão para proteínas e peptídeos, e este tipo de dado pode ser utilizado para deduzir
pequenas alterações na estrutura básica da proteína.
Análise de aminoácidos
A determinação da composição de aminoácidos e sua proporção relativa em uma
proteína pode ser alcançada realizando-se uma hidrólise total da proteína e analisandose os aminoácidos livres por técnicas cromatográficas. A hidrólise pode ser feita
aquecendo-se a proteína em HCl 6 M por 14 h a 110 C, no vácuo. Infelizmente a
hidrólise ácida destrói ou modifica quimicamente aminoácidos como asparagina,
glutamina e triptofano. Asparagina e glutamina são convertidas aos seus respectivos
ácidos aspartato e glutamato e são analisados e quantificados como tal. Triptofano é
completamente destruído e é melhor determinado espectrofotometricamente na proteína
intacta.
Os aminoácidos livres são separados por cromatografia. Atualmente, isto é feito
derivatizando-se (reação em que o aminoácido é acoplado a um composto que absorve
luz ou que fluoresce). Reagentes utilizados para tal finalidade incluem o-ftalaldeído e 6aminoquilil-N-hidroxisuccinimidyl carbamato (AQC), fenilisotiocianato, etc.
Determinação da estrutura primária
Por vários anos o sequenciamento de aminoácidos foi realizado utilizando-se proteínas
isoladas (purificadas). Isso significa que a maioria dos dados de sequências disponíveis
de proteínas eram limitadas a aquelas proteínas que podiam ser purificadas em
quantidades suficientemente grandes para serem sequenciadas. O conhecimento da
sequência de aminoácidos de uma proteína era (ainda é) um pré-requisito para a
determinação da estrutura tridimensional da proteína e o conhecimento da função
proteica. No entanto, atualmente os bioquímicos que trabalham com proteínas ficam
normalmente satisfeitos com dados de algumas sequências curtas obtidas da região
amino-terminal ou de uma sequência de um peptídeo interno, produzido pela clivagem
parcial da proteína por proteases. Os dados do sequenciamento são em geral utilizados
para:
- Pesquisar sequências em banco de dados para verificar se a proteína de interesse já foi
isolada e, portanto pode ser identificada. Para este tipo de busca, sequências muito
curtas (3-5 resíduos), conhecidos como “sequence tags” são utilizadas.
- Pesquisar sequências homólogas usando bancos de dados para identificar função de
proteínas. Por exemplo, a busca pode mostrar sequências com identidade significante
2
com sequências de proteínas quinases conhecidas, sugerindo fortemente que a proteína
em estudo seja também uma proteína quinase.
- A sequência pode ser utilizada para desenhar probes de oligonucleotídeos a serem
utilizados para selecionar clones a partir de bibliotecas de DNA complementar. Desta
forma, o DNA codificante para a proteína pode ser isolado e a sequência do DNA, e
portanto a sequência da proteína podem ser determinadas. A obtenção da sequência da
proteína desta forma é mais trabalhosa e mais demorada do que realizar o
sequenciamento direto da proteína.
Um outro uso da sequência da proteína é para o controle de qualidade em indústrias
biofarmacêuticas. Várias companias farmacêuticas produzem produtos que são
proteínas, por exemplo, hormônios peptídicos, anticorpos, enzimas terapêuticas,
peptídeos sintéticos. A análise da sequência, especialmente para determinar sítios e
natureza das modificações pós-traducionais, como glicosilação, é necessário para
garantir a integridade estrutural destas proteínas.
- Degradação de Edman
Em 1950, Per Edman publicou um método químico para a remoção sucessiva de
resíduos de aminoácidos a partir da extremidade amino-terminal da proteína ou
peptídeo. Estas séries de reações foram denominadas de degradação de Edman e o
método continua sendo o meio químico mais efetivo de remover resíduos de
aminoácidos de maneira sucessiva a partir de uma cadeia polipeptídica e então
determinar a ordem em que os aminoácidos estão ligados à partir da extremidade
amino-terminal de uma proteína ou peptídeo.
No entanto, o método vem sendo cada vez menos utilizado atualmente e nãos será
descrito em detalhes aqui. O desenvolvimento da espectrometria de massas nos últimos
20 anos tornou esta técnica o método de escolha para a determinação da sequência de
proteínas.
- Clivagem da proteína e produção de peptídeos
Quando se estuda uma proteína existem várias ocasiões em que sua clivagem em
fragmentos peptídicos menores é necessária. Peptídeos podem ser produzidos por
clivagem química ou enzimática. Os métodos químicos tendem a produzir fragmentos
peptídicos muito grandes, pois em geral as reações clivam em aminoácidos menos
comuns, produzindo 2 ou 3 peptídeos grandes. Métodos enzimáticos tendem a clivar
ligações peptídicas adjacentes a aminoácidos que são comuns em proteínas (ex. a
tripsina cliva a cadeia onde tiver lisina ou arginina) produzindo 50 ou mais peptídeos.
- Espectrometria de massas (MS)
Devido ao absoluto requerimento da produção de íons em fase gasosa a técnica de
espectrometria de massas por muitos anos ficou restrita à análise de compostos
pequenos e apolares com massas menores que 500 Da. No entanto, no início da década
de 80 introduziram-se técnicas de ionização como o electrospray e o MALDI que
possibilitaram a análise de proteínas por espectrometria de massas. Embora a
degradação de Edman ainda seja utilizada ocasionalmente, a espectrometria de massas é
atualmente o método de escolha para a determinação da sequência de aminoácidos.
Quando peptídeos são fragmentados no espectrômetro de massas, estes são
fragmentados predominantemente na ligação peptídica (embora outras fragmentações
3
também ocorram, complicando a interpretação do espectro de massas). Isto significa
que os fragmentos peptídicos gerados diferem sequencialmente da massa de um resíduo
de aminoácido, podendo a sequência ser deduzida facilmente. Em particular, se há uma
modificação, ela pode ser observada pelo acréscimo de massa correspondente. O uso da
espectrometria de massas para a obtenção da sequência de aminoácidos e peptídeos está
descrito em mais detalhes na Seção 9.5 (Ver Degustação 7).
A espectrometria de massas em tandem (MS/MS ou MS2) é cada vez mais utilizado
para a obtenção de dados de sequência. A proteína digerida (em geral utilizando-se
tripsina) é introduzida no espectrômetro de massas (com ou sem separação prévia da
mistura de peptídeos). O íon correspondente a um peptídeo é selecionado no primeiro
analisador e fragmentado na câmara de colisão e os fragmentos gerados analisados em
um segundo analisador de massas. O espectro de massa desses fragmentos fornece as
informações necessárias para a obtenção da sequência daquele peptídeo (Detalhes na
Seção 9.5).
4
Download

Determinação de estrutura de proteínas