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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE NEUROCIÊNCIAS
PAULA ALVAREZ ABREU
Estudo de alvos terapêuticos e ligantes em doenças
neurodegenerativas e neuroinfecções por
modelagem molecular
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NITERÓI
2011
1
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE NEUROCIÊNCIAS
PAULA ALVAREZ ABREU
Estudo de alvos terapêuticos e ligantes em doenças
neurodegenerativas e neuroinfecções por
modelagem molecular
TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL
FLUMINENSE VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU
DE DOUTOR EM NEUROCIÊNCIAS
Orientadoras: HELENA CARLA CASTRO
IZABEL CHRISTINA DE PALMER PAIXÃO
NITERÓI
2011
2
PAULA ALVAREZ ABREU
Estudo de alvos terapêuticos e ligantes em doenças
neurodegenerativas e neuroinfecções por modelagem molecular
Banca Examinadora
_______________________________________________________________
Dra. Magaly Girão Albuquerque - IQ – UFRJ
_______________________________________________________________
Dra. Paula Campello Costa Lopes - IB – UFF
_______________________________________________________________
Dr. Ricardo Bicca de Alencastro - IQ - UFRJ
_______________________________________________________________
Revisor: Dr André Lopes Fuly - IB - UFF
________________________________________________________________
Orientadora: Dra. Helena Carla Castro – IB - UFF
________________________________________________________________
Co-orientadora: Dra. Izabel Christina de Palmer Paixão – IB - UFF
3
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais por todo incentivo em todos os momentos da minha vida.
À minha família principalmente minhas tias e irmão pelo carinho e apoio.
À minha orientadora Helena Carla Castro, por ter me introduzido na área da pesquisa e
pela orientação, confiança e apoio desde a iniciação científica e a professora Izabel por ter
aceito a co-orientação.
Aos amigos do laboratório por proporcionar um ótimo convívio durante todo este
tempo.
Aos alunos de iniciação científica que contribuíram com este e com outros projetos
desenvolvidos durante o doutorado.
Aos colaboradores da Faculdade de Farmácia e do Instituto de Química da UFRJ, do
Instituto de Biologia e do Instituto de Química da UFF e aos professores do programa de pósgraduação em Neurociências por todo o apoio e contribuição para a minha formação.
Fui bolsista da coordenação de aperfeiçoamento de pessoal de nível superior
(CAPES).
4
"Livros não mudam o mundo, quem muda o mundo são as pessoas.
Os livros só mudam as pessoas."
Mario Quintana
5
RESUMO
As doenças neurológicas afetam milhões de pessoas no mundo e são causas
importantes de morte, incapacidade, queda da qualidade de vida e têm alto custo econômico.
Entre as doenças neurológicas estão incluídas as doenças neurodegenerativas envolvendo o
receptor de NMDA, e as neuroinfecções causadas por fungos (Cryptococcus neoformans) e
vírus (Herpes simplex, HSV) para as quais ainda o tratamento é ineficiente ou apresenta
problemas como efeitos adversos ou resistência. Considerando que a modelagem molecular é
uma ferramenta capaz de otimizar o processo de descoberta de novos fármacos, o objetivo
deste trabalho é avaliar in silico a relação estrutura-atividade de alvos terapêuticos e novos
compostos para doenças neurodegenerativas envolvendo o receptor de NMDA e
neuroinfecções por HSV e C. neoformans. Os nossos resultados mostraram que quanto ao
receptor de NMDA, os antagonistas derivados de piperazina tiveram um modo de ligação
diferente, comparando as moléculas mais ativas com a menos ativa e que alguns resíduos de
aminoácidos foram importantes no sítio de ligação do glutamato para a interação com estes
antagonistas. A análise do domínio N-terminal da subunidade GluN2B do receptor de NMDA
revelou uma conformação diferente quando se compara o docking do ifemprodil, da fenilamidina (1a) e das triazolil-amidinas planejadas (2a, 2e e 2f) no receptor, sendo a menor
energia de ligação para a triazolil-amidina 2f. Quanto aos anti-herpéticos, a análise da série de
oxoquinolinas mostrou propriedades estereoeletrônicas relacionadas à atividade anti-herpes
no composto 3b. Esse derivado apresentou perfil de atividade semelhante ao aciclovir, porém,
com menor citotoxicidade, além de um melhor perfil em algumas propriedades
farmacocinéticas in silico. Por fim, quanto à análise de um alvo terapêutico de C. neoformans,
o estudo comparativo das enzimas da família CYP51 mostrou uma conservação da estrutura
secundária e terciária entre enzimas de diversos organismos e semelhança no modo de ligação
dos derivados azólicos (posaconazol, cetoconazol e fluconazol) com a enzima. A análise
teórica revelou ainda uma menor energia de ligação do complexo com o posaconazol que
parece estar relacionada às interações de van der Waals com a enzima. Nas três avaliações in
silico realizadas nesta tese, detectou-se resíduos de aminoácidos chaves no sítio de ligação
dos alvos terapêuticos ou características dos ligantes que foram úteis para explicar a atividade
biológica. Assim, esse estudo pode orientar o desenho de novos compostos para serem usados
em neuroinfecções por C. neoformans, HSV e doenças neurodegenerativas que atingem o
sistema nervoso central.
6
ABSTRACT
Neurological diseases affect millions of people in the word and are important cause of
death, incapacity, reduction of life quality and high economic costs. Neurological diseases
include neurodegenerative disorders involving NMDA receptor and neuroinfections caused by
fungus (Cryptococcus neoformans) and virus (Herpes simplex). Actually, treatment of these
diseases is ineffective or present problems as adverse effects or resistance. Considering that
molecular modeling is a tool capable of optimize the drug discovery process, the aim of this
work is to evaluate the in silico structure-activity relationship of therapeutic targets and new
compounds for neurodegenerative disorders involving NMDA receptor and neuroinfections
by HSV and C. neoformans. In relation to NMDA receptor, our results showed that the
piperazine derivatives, NMDA receptor antagonists, presented different binding mode
comparing the more active derivatives with the less active one and that some amino acids
residues in the glutamate binding site were important for the interaction with these
antagonists. The analysis of the N-terminal domain of the GluN2B subunit of NMDA receptor
revealed different conformation when comparing the docking of ifenprodil, phenyl-amidine
(1a) and the triazolyl-amidines (2a, 2e and 2f) in the receptor, and the lower energy was
observed for 2f.
The analysis of oxoquinoline derivatives showed estereoelectronic
properties correlated to the anti-HSV activity in the compound 3b. This derivative presented
the activity profile similar to acyclovir, but with less cytotoxicity, besides a better profile in
some in silico pharmacokinetic properties. At last, in relation to C. neoformans therapeutic
target, the comparative study of CYP51 family proteins from different organisms showed the
conservation of secondary and tertiary structure and the similarity in the azolic (posaconazol,
cetoconazol and fluconazole) binding mode with the enzyme. The theoretical analysis
revealed lower binding energy of the posaconazol complex which seems to be related to van
der Waals or hydrophobic interactions with the enzyme. In the three in silico evaluations
performed in this thesis, we detected key amino acid residues in the therapeutic targets
binding site and/or ligand features useful for explain the biological activity. Thus, this study
may orientate the design of new compounds for neuroinfections by C. neoformans, Herpes
simplex and neurodegenerative diseases that affect central nervous system.
7
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Regulação da entrada e saída de íons pela ativação dos receptores de 23
AMPA (azul), NMDA (roxo) e kainato (laranja) nos neurônios pelo agonista
glutamato.
Figura 2: Esquema do receptor de NMDA e os principais sítios de ligação 25
presentes nas subunidades.
Figura 3: Estrutura química de alguns antagonistas do receptor de NMDA 29
descritos na literatura.
Figura 4: Principais manifestações clínicas causadas pelo HSV-1 e HSV-2.
32
Figura 5: Principais antivirais usados no tratamento de infecções causadas pelo 35
vírus Herpes simplex (HSV).
Figura 6: Mecanismo de ação do antiviral aciclovir sobre a DNA polimerase 36
viral.
Figura 7: Fatores de virulência do Cryptococcus neoformans.
40
Figura 8: Biossíntese do ergosterol e possíveis alvos terapêuticos dos 44
antifúngicos.
Figura 9: Estrutura de derivados azólicos usados em infecções fúngicas.
46
Figura 10: Representação esquemática da interrrelação entre a absorção, 51
distribuição, ligação, metabolismo e excreção dos fármacos e a sua concentração
no sítio de ação.
Figura 11: Descrição geral dos métodos para o planejamento de novos compostos 52
bioativos.
Figura 12: Modelos para predição das propriedades farmacocinéticas.
57
Figura 13: Modelo para predição da penetração na barreira hematoencefálica 61
(Log BB).
Figura 14: Fluxograma das etapas de cálculos realizadas no programa Spartan`08 66
para obtenção dos descritores estereoeletrônicos e análise da relação estruturaatividade (SAR).
Figura 15: Fluxograma das etapas de análise de Holograma QSAR realizado no 68
servidor PK/DB.
Figura 16: Estruturas química dos 17 derivados do ácido piperazino-2,3- 76
dicarboxílico.
8
Figura 17: Análise teórica dos 17 derivados do ácido piperazino-2,3-dicarboxílico
(13, 16a-n, 17 e 23). (A) Estrutura tridimensional (cinza = carbono, branco =
hidrogênio, vermelho = oxigênio, amarelo = enxofre, vermelho escuro = bromo e
amarelo claro = fluor), e (B) Mapa de potencial eletrostático molecular,
evidenciando a distribuição de cargas em uma isosuperfície de -150 a 150 Kj/mol.
Regiões tendendo para o azul são mais positivas e para o vermelho, mais
negativas. As moléculas nos quadros A e B apresentam a mesma orientação.
80
Figura 18: Perfil de toxicidade in silico dos derivados de ácido piperazino-2,3dicarboxílico.
81
Figura 19: Redocking do glutamato na subunidade GluN2A do receptor de
NMDA. Em azul, a estrutura cristalográfica 2A5S e em verde o docking realizado.
82
Figura 20: Comparação entre o docking dos 17 derivados do ácido piperazino2,3-dicarboxílico nas formas não-ionizada (verde) e ionizada (vermelho) na
subunidade GluN2B do receptor de NMDA.
83
Figura 21: Docking do derivado 16g na subunidade GluN2B na forma aberta
(azul) e comparação com a estrutura na forma fechada (rosa). Em amarelo, está
destacada a alça que é impedida de fechar no caso de ligação com o antagonista.
87
Figura 22: Alinhamento estrutural da sequência primária da região N-terminal da
subunidade GluN2B de Rattus norvegicus (estrutura cristalográfica 3JPW),
GluN2B de humano e GluN2A de humano. Em rosa estão destacados os resíduos
conservados no grupo. * marca os resíduos substituídos entre a estrutura de rato e
humano.
89
Figura 23: Gráfico do Verify-3D mostrando a confiabilidade dos modelos do
domínio N-terminal do receptor de NMDA. O modelo de GluN2A de H. sapiens é
apresentado em vermelho, GluN2B, em verde e a estrutura cristalográfica de
GluN2B de Rattus norvegicus, em azul.
91
Figura 24: Análise do score-Z das estruturas do N-terminal do receptor de
NMDA. A estrutura de GluN2B de Rattus norvegicus (3JPW) é mostrada em
preto, GluN2B de humano em vermelho e GluN2A de humano em amarelo.
91
Figura 25: Na parte superior, gráfico de energia mostrando a energia
independente de cada resíduo (verde claro) e a média da energia dos resíduos em
função de um resíduo central (verde escuro). Na parte inferior, a estrutura das
proteínas mostrando as regiões de menor energia em azul e regiões de maior
energia em vermelho. A) Molde (3JPW). B) GluN2A e C) GluN2B.
92
Figura 26: Estrutura do N-terminal da subunidade GluN2B. Em rosa estão
destacados os resíduos que formam o bolso hidrofóbico (Ile150, Phe176, Phe182,
Tyr231 e Leu261).
93
Figura 27: Docking do ifemprodil no domínio N-terminal de GluN2A (rosa) e
GluN2B (verde).
94
9
Figura 28: Redocking do ifemprodil no receptor de NMDA. Em amarelo a
estrutura obtida por docking e em vermelho a estrutura cristalográfica de
GluN1/GluN2B em complexo com ifemprodil (3QEL).
96
Figura 29: Interação do ifemprodil com o domínio N-terminal. Em branco o
ifemprodil ligado a GluN2B (código PDB 3QEL) e em laranja docking com o
modelo de GluN2A.
97
Figura 30: Região de interação do ifenprodil no NMDAR mostrando os resíduos
de aminoácidos que estão localizados a cerca de 4Å do ifemprodil. Os traços
verdes mostram resíduos interagindo por ligação de hidrogênio. A) Estrutura
cristalográfica de GluN1/GluN2B. B) Modelo de GluN1/GluN2A. Os resíduos da
subunidade GluN1 estão identificados com a letra A no final do código e número
do resíduo de aminoácido e os da subunidade GluN2 com a letra B.
98
Figura 31: Principais resíduos de aminoácidos de GluN1/GluN2B interagindo
com A) fenil-amidina 1a, B) triazolil-amidina 2a, C) triazolil-amidina 2e, D)
triazolil-amidina 2f. Tracejado verde representa as ligações de hidrogênio.
101
Figura 32: Comparação do modo de ligação dos ligantes não competitivos ao
receptor de NMDA. Ifemprodil (vermelho), fenil-amidina 1a (laranja) e as
triazolil-amidinas 2a (verde), 2e (azul) e 2f (rosa).
102
Figura 33: Estruturas dos derivados oxoquinolínicos testado contra HSV-1.
103
Figura 34: Avaliação biológica da atividade anti-HSV-1 dos derivados
oxoquinolínicos (2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b, 5a, 5b) medida pela dose infectante em
cultura de tecido (TCID50) (ABREU et al., 2010).
104
Figura 35: Característica estrutural e eletrônica dos derivados oxoquinolínicos
(2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b, 5a, 5b). A) Representação em CPK da conformação mais
estável (cinza= carbono, branco = hidrogênio, vermelho = oxigênio, azul =
nitrogênio, verde = flúor, laranja = cloro). B) Mapa de potencial eletrostático
molecular (direita) e densidade de potencial (esquerda). As cores do mapa de
potencial estão na faixa de -150 a + 150 kJ/mol, regiões tendendo para o azul são
mais positivas e para o vermelho, mais negativas.
105
Figura 36: Avaliação do perfil citotóxico (CC50) dos derivados oxoquinolínicos.
107
Figura 37: Alinhamento da estrutura primária da CYP51 de diferentes espécies.
Em vermelho estão as regiões de α-hélice, em verde, as folhas β e em azul, as
alças
111
Figura 38: Gráfico de Ramachandran mostrando a confiabilidade do modelo
CYP51 de (A) C. neoformans e (B) H. sapiens.
115
Figura 39: Gráfico do Verify 3D mostrando a confiabilidade do modelo CYP51
de C. neoformans (vermelho) e H. sapiens (verde).
116
10
Figura 40: Análise do score-Z das estruturas de CYP51 de humano (preto) e de C.
neoformans (vermelho).
117
Figura 41: Gráfico de energia mostrando a energia independente de cada resíduo
(verde claro) e a média da energia dos resíduos em função de um resíduo central
(verde escuro).
117
Figura 42: Estrutura tridimensional das CYP51 de Mycobacterium tuberculosis
(1EA1), Trypanosoma cruzi (2WUZ), Trypanosoma brucei (2WV2), T. cruzi
(2WX2), Leishmania infantum (3L4D), Homo sapiens (3LD6) e o modelo de
Cryptococcus neoformans.
118
Figura 43: Estrutura da CYP51. A) modelo de C. neoformans e B) Estrutura
cristalográfica de H. sapiens. 1ª coluna - estrutura tridimensional 2ª coluna – mapa
de potencial eletrostático. 3ª coluna - mapa de potencial eletrostático mostrado em
uma mesma posição inicial e em um ângulo de 180º para o lado.
120
Figura 44: Alinhamento estrutural do fluconazol com o Heme de algumas CYP51
disponíveis como Mycobacterium tuberculosis (1EA1) em vermelho,
Trypanosoma cruzi (2WUZ) em verde, Trypanosoma brucei (2WV2) em azul, T.
cruzi (2WX2) em amarelo, T. cruzi (3KHM) em rosa, Leishmania infantum
(3L4D) em laranja e Homo sapiens (3LD6) em branco.
121
Figura 45: Alinhamento estrutural mostrando a ligação entre cetoconazol (A),
fluconazol (B) e posaconazol (C) com o heme da CYP51. Em azul C. neoformans
e em rosa H. sapiens.
122
Figura 46: Comparação dos resíduos a 6Å do posaconazol em C. neoformans
(azul) e H. sapiens (rosa). A numeração está de acordo com C. neoformans.
123
11
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Exemplo de antifúngicos usados atualmente, sua origem e
mecanismo de ação.
43
Quadro 3: Ligação de hidrogênio e interação eletrostática entre os ligantes
mais ativos (16e, 16g, 16h e 16n) e menos ativo (16a) na forma nãoionizada com a subunidade GluN2B.
84
Quadro 4: Ligação de hidrogênio e interação eletrostática entre os ligantes
mais ativos (16e, 16g, 16h e 16n) e menos ativo (16a) na forma de
zwitterion com a subunidade GluN2B.
86
Quadro 5: Resíduos de aminoácidos da subunidade GluN2B do receptor de
NMDA a 15 Å do átomo de nitrogênio do ifemprodil e os resíduos alinhados
na subunidade GluN2A. Em vermelho estão aqueles que divergem entre uma
subunidade e outra.
95
Quadro 6: Comparação dos resíduos envolvidos nas interações com os
ligantes (ifemprodil, fenil-amidina 1a e triazolil-amidina 2a, 2e e 2f) na
estrutura de GluN1/GluN2B obtida por cristalografia. Os resíduos em
vermelho fazem interação com o ligante por ligação de hidrogênio.
101
Quadro 7: Comparação dos resíduos de aminoácidos a 10 Å do átomo de
ferro do heme da CYP51 de humanos e M. tuberculosis em relação a de C.
neoformans.
114
Quadro 8: Aminoácidos interagindo com os ligantes (fluconazol,
cetoconazol e posaconazol) nas enzimas de Homo sapiens e de C.
neoformans.
125
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Valores de atividade de antagonista (Ki, µM) do receptor de NMDA 77
recombinante de rato expresso em ovócitos de Xenopus.
Tabela 2. Comparação da atividade biológica Ki (μM) e pKi (M) de 17 derivados do 78
ácido piperazino- 2,3-dicarboxíllico (13, 16a-n, 17 e 23) testados em receptor de NMDA
recombinante contendo subunidade GluN1/GluN2B e parâmetros teóricos calculados
incluindo energia de HOMO/LUMO (EHOMO e ELUMO, Ev), momento de dipolo
molecular (μ, Debye), massa molecular (MM, g/mol), área superficial molecular (ASM,
Å2), volume molecular (VM, Å3), área de superfície polar (ASP, Å2), coeficiente de
partição octanol/água (cLogP) e solubilidade em água calculada (cLogS), número de
grupos aceptores de ligação de hidrogênio (nALH) e doadores (nDLH) = 3.
Tabela 3: Matriz de correlação cruzada entre a atividade biológica experimental Ki (μM) 79
e pKi (M) testados em receptor de NMDA recombinante contendo subunidade
GluN1/GluN2B e energia de HOMO/LUMO (EHOMO e ELUMO, Ev), momento de dipolo
molecular (μ, Debye), massa molecular (MM, g/mol), área superficial molecular (ASM,
Å2), volume molecular (VM, Å3), área de superfície polar (ASP, Å2), coeficiente de
partição octanol/água (cLogP) e solubilidade em água calculada (cLogS), número de
grupos aceptores de ligação de hidrogênio (nALH) e doadores (nDLH) = 3.
dos 17 derivados do ácido piperazino-2,3-dicarboxíllico.
Tabela 4: Análise dos gráficos de Ramachandran da estrutura cristalográfica do N- 90
terminal de GluN2B do receptor de NMDA de rato e do modelo de GluN2B de humano.
Tabela 5: Estrutura e atividade biológica experimental (pIC50Exp) e predita (pIC50pred) 100
da fenil-amidinas 1a e das triazolil-amidinas 2a, 2e e 2f e energia de ligação (EL)
estimada.
Tabela 6: Propriedades estereoeletrônicas das oxoquinolinas, incluindo parâmetros 106
estéricos - volume molecular (VM, Å3), massa molecular (MM, g/mol), área superfícial
molecular (ASM, Å2), área de superfície polar (ASP = Å2) e número de ligações
rotacionáveis (nLR), parâmetros eletrônicos - energia de HOMO/LUMO (EHOMO e
ELUMO = eV) e parâmetros farmacocinéticos - número de aceptores/doadores de ligação
de hidrogênio (nALH e nDLH) e coeficiente de partição octanol/água calculado (cLogP).
Tabela 7: Valores das propriedades farmacocinéticas obtidas in silico para os derivados 108
de oxoquinolinas e o aciclovir. Absorção intestinal humana (Human intestinal absorption
- HIA), biodisponibilidade oral (F), ligação a proteínas plasmáticas (plasmatic protein
binding - PPB), coeficiente de partição cérebro-sangue que avalia a penetração na
barreira hematoencefálica (Log BB), solubilidade em água (Log S). Os valores de HIA,
F e PPB são fornecidos em percentagem da dose administrada de um composto. S é a
solubilidade em água à temperatura de 20-25ºC em mol/l.
Tabela 8: Percentual de identidade entre as CYP51 de diferentes espécies.
113
Tabela 9: Energia de ligação (Kcal/mol) do cetoconazol, do fluconazol e do posaconazol com a 125
CYP51 de H. sapiens e C. neoformans.
13
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ADME/Tox Absorção, distribuição, metabolismo, excreção e toxicidade
AMPA
Ácido alfa-amino-3-hidróxi-5-metil-4-isoxazol-propanóico
AMPc
Adenosina monofosfato cíclico
ASM
Área superfícial molecular
ASP
Àrea de superfície polar
BHE
Barreira hematoencefálica
clog P
Coeficiente de partição octanol/água calculado (lipofilicidade)
DNA
Ácido desoxirribonucleico
E
Energia
HIV
Vírus da imunodeficiência humana
HF
Hartree-Fock
HOMO
Orbital molecular ocupado de maior energia
HQSAR
Hologram quantitative structure-activity relationship, (relação estrutura-atividade
quantitativa por holograma)
HSV
Vírus Herpes simplex
IC50
Concentração que inibe 50% da atividade
Ki
Constante de inibição
Log BB
Coeficiente de partição sangue-cérebro
Log S
Solubilidade em água calculada
LTD
Long term depression, (depressão de longa duração)
LTP
Long term potentiation, (potenciação de longa duração)
LUMO
Orbital molecular desocupado de menor energia
MM
Massa molecular
MMFF
Molecular Mechanics Force Field, (Campo de Força de Mecânica Molecular)
14
NMDA
Ácido N-metil-D-aspártico
NMDAR
Receptor de Ácido N-metil-D-aspártico
nALH
Número de aceptores de ligação de hidrogênio
nDLH
Número de doadores de ligação de hidrogênio
QSAR
Quantitative structure-activity relationship, (relação quantitativa estrutura
atividade)
RM1
Recife Model 1
RMN
Ressonância magnética nuclear
RMSD
Root mean square deviation, (desvio médio da raiz quadrada)
RNA
Ácido ribonucleico
RTECS
Registry of Toxic Effects of Chemical Substances, (Registro de Efeitos Tóxicos de
Substâncias Químicas)
SAR
Structure-activity relationship, (relação estrutura-atividade)
SNC
Sistema nervoso central
TCID50
Dose infectante para 50% de cultura de tecido
VM
Volume molecular
μm
Micrômetro
μM
Micromolar
15
Tabela de aminoácidos
Nome
Abreviatura (3 letras)
Abreviatura (1 letra)
Alanina
Ala
A
Ácido aspártico
Asp
D
Arginina
Arg
R
Asparagina
Asn
N
Ácido glutâmico
Glu
E
Cisteína
Cys
C
Fenilanina
Phe
F
Glicina
Gly
G
Glutamina
Gln
Q
Histidina
His
H
Isoleucina
Ile
I
Leucina
Leu
L
Lisina
Lys
K
Metionina
Met
M
Prolina
Pro
P
Serina
Ser
S
Tirosina
Tyr
Y
Treonina
Thr
T
Triptofano
Trp
W
Valina
Val
V
16
SUMÁRIO
1.1.6
1.2.1
1.2.2
1 INTRODUÇÃO
................................................................................................................
1.1 Doenças neurológicas e tratamento..............................................................................
1.1.1 Doenças neurodegenerativas envolvendo o receptor de NMDA .................................
1.1.1.1 Antagonistas do receptor de NMDA..........................................................................
1.1.2 Neuroinfecção pelo vírus Herpes simplex.....................................................................
1.1.2.1 Antivirais usados atualmente e resistência................................................................
1.1.3 Neuroinfecção por Cryptococcus neoformans..............................................................
1.1.3.1 Antifúngicos usados atualmente e resistência............................................................
18
1.2 Química medicinal e Modelagem molecular no planejamento de fármacos...........
1.2.1 Modelagem Molecular nos estudos Farmacodinâmicos..............................................
1.2.2 Modelagem Molecular nos estudos Farmacocinéticos................................................
1.2.3 Modelagem Molecular na análise da toxicidade.........................................................
1.2.4 Modelagem Molecular no planejamento de fármacos para o sistema nervoso central
48
51
55
58
59
2 OBJETIVOS ....................................................................................................................
2.1 Objetivo Geral ..............................................................................................................
2.2 Objetivos específicos quanto ao receptor de NMDA.................................................
2.3 Objetivos específicos quanto aos antivirais................................................................
2.4 Objetivos específicos quanto aos antifúngicos............................................................
63
63
64
64
64
3. MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................................................
3.1 Análise da relação estrutura-atividade (SAR).............................................................
3.1.1 SAR de antagonistas competitivos do receptor de NMDA............................................
3.1.2 SAR de antivirais contra HSV1 ....................................................................................
65
65
66
66
3.2 Estudo teórico de propriedades farmacocinéticas e de toxicidade............................
3.2.1 Propriedades farmacocinéticas e toxicidade in silico de antagonistas do receptor de
NMDA ...................................................................................................................................
3.2.2 Propriedades farmacocinéticas “in silico” dos derivados de oxoquinolina................
67
3.3 Modelagem comparativa para predição da estrutura tridimensional de proteínas
3.3.1 Modelo tridimensional da CYP51 de Cryptococcus neoformans.................................
3.3.2 Modelo tridimensional do N-terminal de GluN2B e GluN2A do receptor de NMDA..
69
70
71
3.4 Docking ligante-receptor e análise das interações.......................................................
3.4.1 Docking dos azóis na CYP51 de C. neoformans e de Homo sapiens..........................
3.4.2 Docking dos antagonistas do receptor de NMDA no sítio de ligação ao glutamato
3.4.3 Docking dos antagonistas do receptor de NMDA e potenciais ligantes no N-terminal
do receptor de NMDA
71
72
73
74
18
21
28
30
34
37
41
68
69
17
4 RESULTADOS .................................................................................................................
4.1 Modelagem molecular para desenvolvimento de antagonistas do receptor de
NMDA......................................................................................................................................
4.1.1 Análise de antagonistas competitivos e do seu sítio de ação........................................
4.1.2 Análise de antagonistas não-competitivos e do seu sítio de ação ...............................
75
75
4.2 Modelagem molecular para desenvolvimento de Antivirais .......................................
4.2.1 Estudo da relação estrutura-atividade.........................................................................
4.2.2 Estudo da relação estrutura-toxicidade........................................................................
4.2.3 Análise in silico das propriedades farmacocinéticas...................................................
103
103
106
107
4.3 Modelagem Molecular para desenvolvimento de antifúngicos..................................
4.3.1 Predição da estrutura tridimensional da CYP51..........................................................
4.3.2 Análise das interações dos azóis com CYP51
109
109
120
5 DISCUSSÃO.......................................................................................................................
5.1 Estudo do receptor de NMDA e de seus antagonistas.......................................................
5.2 Estudo dos derivados de oxoquinolina com atividade anti-herpes................................
5.3 Estudo estrutural da CYP51 de C. neoformans e de seus inibidores
126
126
135
138
6 CONCLUSÃO ....................................................................................................................
6.1 Estudo do receptor de NMDA e de seus antagonistas......................................................
6.2 Estudo dos derivados de oxoquinolina com atividade anti-herpes...............................
6.3 Estudo estrutural da CYP51 de C. neoformans e de seus inibidores.................................
142
142
143
143
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................
145
74
88
8 ANEXO................................................................................................................................. 164
18
1 INTRODUÇÃO
1.1 Sistema nervoso central e doenças neurológicas
O sistema nervoso central (SNC) é reconhecido pela sua importância desde os tempos
remotos (BEAR et al., 2002). É provável que o homem pré-histórico já soubesse que traumas
cranianos eram capazes de produzir sérios danos e inclusive a morte (FINGER, 1994).
Entretanto, com não existem registros escritos, não é possível determinar com exatidão que
tipo de conhecimento essas culturas já tinham, apenas os achados arqueológicos podem
fornecer evidências (WALKER, 2001). Traumatismos cranianos capazes de causar lesões no
cérebro foram encontrados ao longo da evolução da espécie humana. Um exemplo é o crânio
da espécie Australopithecus africanus, com estimados três milhões de anos, que apresentava
diversas fraturas, umas próximas às outras, e provavelmente associadas a agressões por outro
membro da mesma espécie (FINGER, 1994; CASTRO e LANDEIRA-FERNANDEZ, 2010).
Crânios com orifícios realizados de forma cirúrgica foram encontrados em culturas
humanas pré-históricas datadas de 10.000 a.C, o que sugere que estes cirurgiões primitivos
deveriam estar tentando curar dor de cabeça ou transtornos mentais (CASTRO e
LANDEIRA-FERNANDEZ, 2010). Escritos egípcios de 5000 anos indicam que eles já
conheciam muitos sintomas dos danos cerebrais (BEAR et al., 2002). Essas descobertas são a
principal evidência de que essas culturas possivelmente atribuíam ao cérebro um papel
importante na regulação das funções (FINGER, 1994).
O SNC de vertebrados é um órgão complexo com centenas de bilhões de neurônios e
trilhões de conexões entre eles (WEIL et al., 2008). Este sistema apresenta uma grande
capacidade e habilidade de remodelar a si mesmo em resposta as experiências e ao ambiente.
Apesar da imensa habilidade do SNC em perceber, armazenar e analisar informações
19
complexas, ele não apresenta a capacidade de reparar danos de forma tão eficiente
(BRAMLETT e DIETRICH, 2004).
Muitos danos permanentes que ocorrem em resposta a traumas, infecções e isquemia
são mediados por processos endógenos secundários que podem contribuir para a morte celular
e danos aos tecidos (WEIL et al., 2008; BRAMLETT e DIETRICH, 2004). A habilidade
limitada de reparo do SNC sugere que a seleção natural na evolução não agiu neste processo
de recuperação de lesões, mas no processo que o isola dos danos em potencial (NESSE e
WILLIAMS, 2006). O cérebro e a medula espinhal são protegidos de trauma físico pela
estrutura óssea que os envolve, e das infecções e de influências químicas, pela barreira
hematoencefálica (BHE). Além disso, habilidades cognitivas incluindo medo, avaliação do
perigo e controle dos impulsos podem levar a redução de comportamentos de risco que
possam causar danos ao SNC (NESSE e WILLIAMS, 2006).
A existência de uma barreira que limita as trocas entre o sangue e o encéfalo foi
observada, em 1885, por Ehrlich. O termo BHE foi usado pela primeira vez por
Lewandowsky (1900) enquanto estudava a permeação limitada do ferrocianato de potássio
para o cérebro (CARDOSO et al., 2010). Por se tratar de uma interface dinâmica e complexa
entre o sangue e o SNC que controla as trocas entre estes compartimentos, a BHE tem um
papel importante na manutenção da homeostase do SNC, no suprimento constante de
nutrientes por sistemas de transportes específicos e na proteção contra substâncias tóxicas e
patógenos (LEE et al., 2006; PERSIDSKY et al., 2006; DE VRIES, et al., 1997;
NARAYANAN e GUNTURI, 2005).
Nas células endoteliais dos capilares do SNC não existem fendas intracelulares,
vesículas de pinocitose e fenestras, que permitam a troca transcapilar que ocorre na maioria
dos capilares sistêmicos. Além disso, os capilares cerebrais são circundados pelos "pés
astrocitários" que são processos dos astrócitos tipo 1. Estas células gliais especializadas
20
induzem as células endoteliais a formar as junções de oclusão ("tight junctions") que possuem
a complexa função de excluir a transferência de macromoléculas da circulação, embora
permanecendo permeável a água e lipídios. A taxa de transferência pela BHE está relacionada
à massa molecular, ao raio da molécula, assim como à sua carga elétrica (BRADBURY, 1979;
ALMEIDA et al., 1997).
As doenças neurológicas atingem o sistema nervoso central e periférico e apresentam-se
atualmente como um importante problema de saúde. Essas doenças incluem epilepsia,
Alzheimer e outras demências, doenças cerebrovasculares (derrame cerebral e enxaqueca),
esclerose múltipla, Parkinson, neuroinfecções, tumores cerebrais, doenças traumáticas e
doenças neurológicas resultantes da desnutrição.
Milhões de pessoas no mundo são afetadas por doenças neurológicas, o que inclui
aproximadamente 50 milhões que sofrem de epilepsia, 62 milhões afetados por doenças
cérebro-vasculares, 326 milhões com enxaqueca e 24 milhões com Alzheimer e outras
demências (WHO, 2007a; ALMEIDA, 2005). Uma análise da população acima de 65 anos
mostra que a doença de Alzheimer afeta cerca de 10% da população e cresce para 49% na
população acima de 80 anos. Parkinson afeta 1% da população acima de 60 anos e estudos
sugerem que em 2030 haverá cerca de 63 milhões de pessoas com demência no mundo
(ALAVIJEH et al., 2005).
As doenças neurodegenerativas e neuroinfecções além de serem uma importante causa
de morte, são também responsáveis pela incapacidade, queda da qualidade de vida e gastos
econômicos em todo mundo. Com o envelhecimento da população, estima-se que a
prevalência de muitas doenças crônicas e progressivas aumente, incluindo as doenças
neurológicas, e que o tratamento destes pacientes produza um aumento nos gastos com
cuidados com a saúde e manutenção de qualidade de vida nas próximas décadas (WHO,
2007a; WHO, 2007b; ALAVIJEH et al., 2005).
21
As infecções no SNC também estão associadas a uma alta morbidade e mortalidade, e
podem ser causadas por diversos agentes incluindo vírus, fungos, bactérias e protozoários. As
manifestações clínicas podem ser meningites, encefalites, abcessos cerebrais e epidurais e
infecções no líquor. O quadro pode ser agudo, subagudo ou crônico, dependendo do agente
infeccioso e do local atingido. De acordo com a literatura recente, apesar do progresso no
tratamento das doenças do SNC, a mortalidade ainda é geralmente alta (CODINA et al.;
2011).
1.1.1 Receptor de NMDA: um alvo terapêutico em doenças neurodegenerativas
As doenças neurodegenerativas são caracterizadas por perda irreversível e progressiva
de neurônios de regiões específicas do cérebro. De forma preocupante, atualmente, a terapia
destas doenças é limitada ao tratamento sintomático, o que não impede ou altera a progressão
da doença (HARDMAN, et al., 2001).
O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório no SNC de mamíferos. A família
de receptores de glutamato ionotrópicos incluem os receptores do ácido N-metil-D-aspártico
(NMDA) (GluN1, GluN2A-D, GluN3A-B), do ácido alfa-amino-3-hidróxi-5-metil-4isoxazol-propanóico (AMPA) (GluA1-GluA4) e do kainato (GluK1-GluK5) (DINGLEDINE
et al., 1999; HANSEN et al., 2010).
A ativação sustentada do receptor de NMDA promove sinalização para o núcleo, que
culmina na fosforilação da proteína de ligação ao elemento de resposta ao AMPc (CREB),
ativação de múltiplos genes e plasticidade sináptica de longo prazo (mecanismo envolvido em
aprendizado e memória) (KEMP e MCKERNAN, 2002; HANSEN et al., 2010). Essa
ativação está relacionada à potenciação de longa duração (LTP) e depressão de longa duração
(LTD), assim como ao desenvolvimento neuronal (DINGLEDINE et al., 1999). A
22
potenciação de longa duração é o aumento de longo prazo na duração da efetividade ou força
da transmissão sináptica que se segue a certos tipos de estímulos condicionados, enquanto a
depressão de longa duração refere-se ao decréscimo de longo prazo na efetividade ou força da
transmissão sináptica que se segue a certos tipos de estímulos (BEAR et al., 2002).
Receptores de AMPA e NMDA estão co-localizados em várias sinapses. Quando uma
sinapse glutamatérgica é formada, somente os receptores do tipo NMDA aparecem na
membrana pós-sináptica. Como consequência, a liberação de glutamato em uma única sinapse
evoca pouca resposta quando a membrana pós-sináptica está em repouso. Esta sinapse
silenciosa só é de fato observada quando um número suficiente de sinapses forem ativadas ao
mesmo tempo. Isso deverá promover despolarização suficiente para liberar o Mg+2, que em
potencial de repouso bloqueia o canal, permitindo a entrada de Na+ e Ca+2 e saída de K+.
Esses eventos diferem do receptor de AMPA, que é permeável apenas ao Na+ e K+. Como
consequência da forte ativação do receptor de NMDA e aumento da concentração de cálcio,
ocorre reforço da transmissão sináptica, chamado de potenciação de longa duração (BEAR, et
al., 2002; ISAAK et al., 1995).
Durante o desenvolvimento do sistema nervoso central, os receptores de NMDA
(NMDAR) participam mais das sinapses imaturas do que os receptores de AMPA. Conforme
ocorre a maturação sináptica, sinapses eletricamente ativas ganham receptores AMPA, o que
pode não ocorrer se os receptores de NMDA forem bloqueados por um antagonista (BEAR
2002; ISAAK et al., 1995; CAO et al., 2000). Por outro lado, níveis baixos de ativação do
NMDAR e menor influxo de cálcio desencadeiam a depressão de longa duração, uma forma
oposta de plasticidade sináptica, em que sinapses ativas têm a sua eficiência diminuída
(BEAR et al., 2002).
Apesar de ter grande importância participando de funções fisiológicas essenciais, o
receptor de NMDA quando hiperativado, pode causar neurotoxicidade e está envolvido em
23
inúmeras condições patológicas que vão desde doenças degenerativas aguda, (e.g. derrame e
trauma) até doenças crônicas que causam morte neuronal (e.g. Huntington, Parkinson e
Alzheimer) (TICKHONOVA et al., 2002; MARINELLI et al., 2007; LEVEILLE, 2008).
O papel do receptor de NMDA na morte celular foi inicialmente determinado em
estudos de neurônios em cultura primária que foram sensíveis aos efeitos tóxicos da ativação
do receptor de NMDA. Nestes estudos, foi observado ainda que os antagonistas deste receptor
protejam os neurônios em cultura da toxicidade do glutamato (CHOI et al., 1988;
ROSENBERG e AIZENMAN, 1989; MENNITI et al., 2000).
Diferente de outros receptores glutamatérgicos como os receptores de AMPA e kainato
permeáveis aos íons sódio e potássio, o receptor de NMDA é permeável ao cálcio, além de
sódio e potássio (Figura 1). A hiperestimulação do receptor de NMDA leva a um aumento
excessivo do cálcio intracelular e morte celular (SEN et al.; 2008).
Figura 1: Regulação da entrada e saída de íons pela ativação dos receptores de AMPA (azul), NMDA
(roxo) e kainato (laranja) nos neurônios pelo agonista glutamato. A) Efeito fisiológico do cálcio. (1)
regulação da expressão gênica, (2) liberação pré-sináptica de neurotransmissores; (3) ativação de
enzimas; (4) controle da abertura de canais. B) Efeito patológico do cálcio. (5) ativação de proteases e
(6) lipases intracelulares; (7) despolarização da membrana da mitocôndria; (8) e aumento da geração
de radicais livres (Adaptado de Abreu, 2008).
24
O cálcio está envolvido em diversos processos celulares como liberação pré-sináptica
de neurotransmissores, ativação de enzimas, controle da abertura de canais e regulação da
expressão gênica. Entretanto, em concentrações muito elevadas, o cálcio pode promover
morte celular por apoptose (BEAR et al., 2002; SEN et al., 2008).
O aumento da concentração de cálcio citoplasmático, sustentada por uma abertura
duradoura do canal do receptor de NMDA, deflagra o processo excitotóxico por diferentes
vias intracelulares que podem envolver a ativação de lipases e proteases intracelulares,
despolarização da membrana da mitocôndria ou ainda aumento da geração de radicais livres
(Figura 1) (PREHN et al., 1996; BEAR et al., 2002; SEN et al., 2008).
Estruturalmente, o receptor de NMDA é um heteroligômero formado por diferentes
combinações das subunidades GluN1, GluN2 e, em alguns casos, GluN3. A subunidade
GluN2 apresenta quatro subtipos (GluN2A, GluN2B, GluN2C e GluN2D), enquanto que a
subunidade GluN3 apresenta dois subtipos (GluN3A e GluN3B) (CURTIS et al., 2003;
PAOLETTI e NEYTON, 2007; NIKAN e MELTZER, 2002; FURUKAWA et al., 2005).
As subunidades do receptor de NMDA compartilham uma topologia comum na
membrana, sendo compostas por: a) um domínio N-terminal extracelular formado por 350
aminoácidos, b) uma região na membrana compreendendo três segmentos transmembranares
(M1, M3 e M4) e uma alça de reentrada no poro (M2), c) uma alça extracelular entre M3 e
M4 e d) um domínio C-terminal citoplasmático que varia de acordo com a subunidade e que
fornece sítios de interação com proteínas intracelulares (Figura 2) (PAOLETTI e NEYTON,
2007).
25
Figura 2: Esquema do receptor de NMDA e os principais sítios de ligação presentes nas subunidades
(Adaptado de Abreu, 2008).
Na região N-terminal do NMDAR está presente o sítio de ligação para moduladores
não-competitivos como zinco, na subunidade GluN2A, e ifemprodil, na GluN2B. Outro
domínio importante compreende a região pré-M1 e a alça entre M3 e M4 com
aproximadamente 150 aminoácidos cada, que forma o sítio de ligação ao agonista glutamato
no caso de GluN2 e co-agonista glicina no caso de GluN1 e GluN3 (PAOLETTI e NEYTON,
2007) (Figura 2).
A ativação do NMDAR requer a ligação simultânea da glicina e do glutamato às
subunidades GluN1 e GluN2, respectivamente, e a liberação do íon Mg2+ que, no potencial de
repouso, bloqueia o canal prevenindo o fluxo de íons. A despolarização ocorre após a ativação
do receptor de AMPA na mesma sinapse ou em uma sinapse vizinha, liberando o íon
magnésio e permitindo o fluxo iônico (ARMSTRONG e GOUAUX, 2000; SCHEPMANN,
2010; STOLL et al., 2007).
26
NMDAR tem ampla distribuição no SNC, sendo as subunidades deste receptor
expressas em diferentes regiões, na qual GluN2A é expressa em todo o cérebro, GluN2B é
encontrada no córtex cerebral, hipocampo e bulbo olfatório, GluN2C no cerebelo e GluN2D
no mesencéfalo. A medula espinhal expressa ainda níveis elevados de GluN2C e D (TOLLE
et al., 1993).
A expressão de GluN2 é regulada durante o desenvolvimento e NMDARs formados
exclusivamente por GluN1 e GluN2B dominam durante a embriogênese e início do
desenvolvimento pós-natal (HALL e GHOSH, 2008). As mudanças relacionadas à
composição do receptor no desenvolvimento contribuem para as mudanças na plasticidade.
NMDARs do cortex são formados principalmente por subunidades GluN1, GluN2A e
GluN2B. As subunidades GluN2C e GluN2D são escassas no córtex em qualquer fase e a
expressão de GluN3 é confinada ao período perinatal (CAO et al., 2000).
Na literatura são apresentados resultados divergentes quanto à participação de
diferentes subunidades GluN2 na LTP e LTD. Alguns estudos mostraram que a contribuição
para a plasticidade aumenta com um número maior de subunidades GluN2B e menor de
GluN2A, e que a maior expressão de GluN2B também facilita o aprendizado comportamental
(MONYER et al., 1994; TANG et al., 1999).
Estudos com camundongos mutantes sugerem que LTP envolve GluN2A
(SAKIMURA et al., 1995; SPRENGEL, et al., 1998) e que LTD é dependente de GluN2B
(KUTSUWADA et al., 1996). Outros estudos que manipularam a expressão de GluN2B
sugeriram que GluN2B é importante para LTP (TANG et al., 1999; CLAYTON et al., 2002).
Outros autores afirmam que, dependendo do estágio de desenvolvimento, os receptores
contendo as subunidades GluN2A e GluN2B podem estar envolvidos na indução de LTP,
enquanto que GluN2B não parece estar envolvido com a indução de LTD (BARTLETT et al.,
2007). Marchena e colaboradores mostraram que a participação dos receptores com a
27
subunidade GluN2B não foi crítica para a indução de LTD ou LTP (MARCHENA et al.,
2008).
Apesar do papel de GluN2B na aprendizagem (TAKEHARA et al., 2004;
VALENZUELA-HARRINGTON et al., 2007), as consequências da inativação de receptores
contendo GluN2B ainda não foram bem esclarecidas (TAKEHARA et al, 2004;
VALENZUELA-HARRINGTON et al., 2007). Mathur e colaboradores (2009) forneceram
evidências de que o bloqueio de receptores contendo GluN2B prejudica a aquisição de
comportamento de medo de forma modesta. Contudo, com o envelhecimento, observa-se a
perda deste efeito (MATHUR et al., 2009). Ressalta-se, desta forma, que mais estudos são
necessários para mostrar o papel das subunidades do receptor de NMDA em condições
patológicas e o efeito da inibição do receptor de NMDA em fenômenos fisiológicos como
LTP e LTD.
De acordo com a literatura, derivados descritos como tendo seletividade maior pela
subunidade GluN2B, que não está presente no cerebelo, apresentaram um melhor perfil de
toxicidade, evitando os efeitos adversos sobre a função locomotora. Entretanto, alguns destes
antagonistas novos relatados na literatura, apesar de mais seletivos para GluN2B, ainda
afetam outros receptores como adrenérgico, sigma, canais iônicos de potássio hERG
envolvidos na atividade elétrica do coração e canais de Ca2+, apresentando efeitos adversos
significativos (CLAIBORNE et al., 2003; BORZA et al., 2005; CURTIS et al., 2003;
NGUYEN et al., 2007; KEISER, 2009; HANSEN et al., 2010).
O envolvimento do glutamato e do receptor de NMDA na mediação de múltiplas
doenças neurodegenerativas tem levado a busca pelo desenvolvimento de compostos mais
efetivos e seguros que tenham este sistema como alvo e possam auxiliar no tratamento mais
eficaz das doenças neurológicas.
28
1.1.1.1 Antagonistas do receptor de NMDA
Atualmente, apenas os compostos que se ligam ao domínio N-terminal do receptor de
NMDA, como o ifemprodil, são seletivos para a subunidade GluN2B. No caso do ifemprodil,
a potência é 100 vezes maior em receptores que contenham a subunidade GluN2B do que em
receptores contendo as outras subunidades (WILLIAMS, 1993; KARAKAS et al., 2009)
Entretanto, é possível observar diferente especificidade em outras classes de compostos
(PAOLETTI e NEYTON, 2007).
A maioria dos antagonistas competitivos do sítio de ligação ao glutamato no receptor
de NMDA (e.g. AP-5, AP-7 e CPP) (Figura 3), apresenta, em geral, afinidade em ordem
decrescente por GluN2A > GluN2B > GluN2C > GluN2D. No entanto, como a região do sítio
de ligação é altamente conservada entre estas subunidades, as variações na afinidade pelos
antagonistas são geralmente discretas (PAOLETTI e NEYTON, 2007).
A análise das interações de alguns antagonistas com o receptor de NMDA mostra que
derivados pouco volumosos apresentam menor seletividade por interagirem apenas com os
resíduos de aminoácidos imediatamente vizinhos ao sítio, enquanto que derivados mais
volumosos podem ser mais seletivos (FENG et al., 2005).
29
Figura 3: Estrutura química de alguns antagonistas do receptor de NMDA descritos na literatura.
Em geral, os antagonistas apresentam uma afinidade maior por GluN2A do que por
GluN2B, entretanto, existem alguns antagonistas como PBPD, LY233536 e EAB515 que
apresentam um padrão diferente, com maior seletividade para GluN2B do que para GluN2A
(MORLEY et al., 2005) (Figura 3).
Novos agentes terapêuticos que atuam em sítios moduladores, como o antagonista
não-competitivo ifemprodil, controlam a excitotoxicidade do influxo de cálcio mediado pela
hiperestimulação do receptor de NMDA sem os efeitos adversos psicóticos exibidos por
alguns agentes bloqueadores de canais (GALLAGHER et al., 1996; LIPTON, 1993).
O bloqueio completo do receptor de NMDA, aparentemente, prejudica a plasticidade
neuronal. Já foi descrito que tanto a hiper quanto a hipoatividade do sistema glutamatérgico
podem levar a disfunção no sistema nervoso central. Entretanto, a memantina, por exemplo,
usada no tratamento de Alzheimer, apresenta um bloqueio do canal do receptor de NMDA
rápido, com moderada afinidade e dependente de voltagem, tendo efeito terapêutico na
30
ativação patológica do receptor de NMDA. A memantina preserva a plasticidade sináptica
mediada pelo receptor de NMDA, indicando que tanto a neuroproteção, como a melhoria dos
sintomas ocorrem devido ao bloqueio com afinidade moderada pelo canal do receptor
(PARSON et al., 2007).
O desenvolvimento de novos antagonistas mais seletivos tem sido, atualmente, um
desafio e o sucesso nesta tarefa pode apontar um novo caminho para a terapia de diversas
doenças que envolvem o receptor de NMDA.
1.1.2 Neuroinfecção pelo vírus herpes simplex
As infecções causadas pelo vírus herpes simplex (HSV) estão entre as infecções mais
frequentes em humanos. Aproximadamente um terço da população do mundo sofre com
infecções por HSV recorrentes sendo capazes de transmitir o vírus (WHITLEY, 2002,
GRECO et al., 2007).
O HSV é um vírus com envelope que contém genoma de DNA de dupla hélice e
pertence à família Herpesviridae. Para iniciar a infecção, o vírus adere a pelo menos 3
principais classes de receptores da superfície celular e funde seu envelope a membrana
plasmática. O capsídeo sem envelope é transportado para o poro nuclear, sendo o DNA viral
liberado. A síntese das proteínas virais ocorre em três etapas incluindo, inicialmente, a síntese
das proteínas imediatas que regulam a replicação; depois das proteínas que sintetizam e
empacotam o DNA; e, em seguida, das proteínas tardias que formam o virion (MURRAY, et
al., 2006).
O HSV codifica cerca de 84 polipeptídeos diferentes, com funções diversas. Cerca de
metade destes estão envolvidos com a replicação viral. Os outros apesar de não estarem
31
envolvidos com a replicação, não são dispensáveis, uma vez que estão envolvidos com
reconhecimento celular, alteração do metabolismo celular para aumentar rendimento viral,
entre outros (WHITLEY e ROIZMAN, 2001; WARD e ROIZMAN, 1994).
Diversas partes do ciclo de replicação viral e proteínas resultantes são relevantes para
o estudo da doença em humanos e da terapia antiviral (WHITLEY e ROIZMAN, 2001). Por
exemplo, glicoproteínas da superfície são mediadores de adesão e penetração do vírus e
provocam resposta imune no hospedeiro. Algumas destas glicoproteínas (gB e gD) têm sido
usadas no desenvolvimento de vacinas de subunidades (FORRESTER et al., 1992;
FRICKER, 1996)
Os herpesvírus codificam diversas glicoproteínas para adesão e fusão viral e para
evadir o controle imune. O HSV pode infectar a maioria dos tipos celulares causando
infecções líticas em fibroblastos e em células epiteliais e infecções latentes em neurônios
(MURRAY et al., 2006).
Existem dois tipos de vírus HSV (GRECO et al., 2007, LUCERO et al., 2006) que
inclui o HSV-1 que causa erupções nos lábios, gengivomastite, queratoconjuntivite e
encefalite e o HSV-2 que está mais associado a infecções genitais e em recém-nascidos
(BARINGER, 2008) (Figura 4).
32
Figura 4: Principais manifestações clínicas causadas pelo HSV-1 e HSV-2 (Adaptado de MURRAY,
2006).
O HSV é transmitido de uma pessoa para outra pelo contato com secreções
contaminadas como líquido das vesículas, saliva, secreções genitais e pelo contato íntimo. O
vírus pode ser disseminado também por compartilhamento de objetos contaminados com
saliva mesmo sendo lábil e rapidamente inativado pelo ressecamento e pelo trato
gastrointestinal (MURRAY et al., 2006; BRADY e BERNSTEIN, 2004).
A infecção pelo vírus inicia-se, geralmente, na pele ou epitélio da mucosa e,
subsequentemente, pode ser assintomática ou irreconhecível ou produzir infecção aguda,
crônica ou latente que pode reativar ao longo da vida do hospedeiro (WHITLEY e
ROIZMAN, 2001; LUCERO et al., 2006).
Após penetrar no hospedeiro pela mucosa da membrana ou pela pele, o vírus é
transportado de forma retrógrada ao longo dos neurônios sensoriais para o gânglio onde
permanece em estado latente sem replicar. Periodicamente, o vírus pode reativar e ser
transportado de forma anterógrada pelos nervos sensoriais para a pele ou mucosa (BRADY e
BERNSTEIN, 2004).
33
A recorrência pode ser desencadeada por estímulos como estresse, trauma, febre e
ultravioleta que ativam a replicação viral permitindo que o vírus seja transportado através do
nervo formando lesões sempre no mesmo dermátomo e localização (MURRAY et al., 2006).
No caso de herpes genital, o HSV causa episódios recorrentes várias vezes ao ano, em
alguns casos por toda a vida (TYRING, 1998). Estudos mostram que quase 100% das
mulheres com HSV-2 apresentam infecção recorrente ao longo da vida, principalmente nos
primeiros 8 a 10 anos após a infecção primária (COREY e HANDSFIELD, 2000). Cinco a
10% das mulheres grávidas tem sintomas de herpes genital recorrente durante a gravidez
(BROWN, 2000; SHEFFIELD et al., 2003)
Os sintomas primários da infecção por HSV incluem uma síndrome semelhante à gripe
com febre, dor de cabeça, mialgia, seguido pelos sintomas locais como lesões, pápulas
dolorosas e ulcerações (HARDIN, 1996). As manifestações clínicas da doença exibem
diferentes severidades em pacientes normais e imunocompetentes. No caso de pacientes
imunocomprometidos e neonatos a infecção pode causar doença sistêmica grave (KHAN et
al., 2005). As infecções por HSV podem, inclusive, aumentar o risco de contrair o vírus da
imunodeficiência humana (HIV), por causar doença ulcerativa no trato genital (WHITLEY,
2002; SEVERSON e TYRING, 1999).
De acordo com os dados epidemiológicos, o HSV-1 é a principal causa de encefalite
esporádica (não sazonal), enquanto o HSV-2 causa um tipo de meningite asséptica benigna
(SCHELD et al., 2004). Cerca de um terço de todos os casos de encefalite herpética ocorre em
crianças e adolescentes e, apesar de rara, a mortalidade é de 70% na ausência de tratamento e
de 20-30% na presença da terapia antiviral disponível. Mesmo com a introdução precoce da
terapia, cerca de dois terços dos sobreviventes apresentam déficit neurológico residual
significativo e podem ter recidivas após o tratamento (WHITLEY e ROIZMAN, 2001;
ORVEDAHL e LEVINE, 2008; TYLER, 2004).
34
Ao penetrar no SNC, além da encefalite, o HSV pode ser responsável pela ocorrência
de outras doenças neurológicas, incluindo meningite, radiculite, mielite ou uma combinação
destas (SCHELD et al., 2004). A encefalite por HSV é considerada uma das infecções do
SNC mais devastadoras, mesmo com as terapias antivirais disponíveis (WHITLEY E
ROIZMAN, 2001; GRECO et al., 2007).
1.1.2.1 Antivirais atuais e resistência
O tratamento da herpes representa um desafio importante, principalmente, porque esta
infecção não é controlada por vacinação (DE CLERCQ, 2010). Assim, nos últimos anos,
vários esforços têm sido feitos para identificar potenciais fármacos antivirais (SUPERTI et
al., 2008).
O tratamento contra infecções causadas por HSV-1 e HSV-2 é representado pelo
aciclovir (que ainda é o tratamento de referência da herpes) e seus análogos (valaciclovir,
valganciclovir, fanciclovir, ganciclovir e penciclovir), além de outros análogos de
nucleosídeos que não pertencem a família do aciclovir (vidarabina, cidofovir, trifluridina,
idoxuridina), do análogo do pirofosfato (foscarnet) e ácido fosfonoacético (DE CLERCQ,
2005; DE CLERCQ, 2010) (Figura 5).
35
Figura 5: Principais antivirais usados no tratamento de infecções causadas pelo vírus Herpes simplex
(HSV).
Apesar de qualquer proteína essencial para a replicação viral ser um alvo terapêutico
em potencial, quase todos os fármacos usados atualmente são inibidores da polimerase e,
portanto, afetam a síntese do DNA viral (EIZURU, 2003; BILLAUD et al., 2009).
Aciclovir, valaciclovir, penciclovir, famciclovir, idoxuridina e trifluridina agem como
pró-fármacos (DE CLERCQ, 2005; DE CLERCQ, 2010), sendo inicialmente fosforilados
pela timidina quinase viral e subsequentemente convertidos para a forma trifosfatada por
quinases celulares. A forma trifosfatada inibe da DNA polimerase impedindo, assim, a
replicação viral (FIELD E BIRON, 1994) (Figura 6).
O aciclovir é um análogo nucleosídico acíclico da purina e tem sido a primeira escolha
para o tratamento contra o vírus, auxiliando no controle dos sintomas. Entretanto, outros
fármacos licenciados apresentam melhor biodisponibilidade oral, como o valaciclovir, que é
convertido a aciclovir no organismo e o fanciclovir convertido a penciclovir (BALFOUR,
1999).
36
Figura 6: Mecanismo de ação do antiviral aciclovir sobre a DNA polimerase viral (adaptado de DE
CLERCQ, 2010).
Outra categoria de antivirais, como foscarnet e ácido fosfonoacético, age como
inibidor direto da DNA polimerase (FIELD E BIRON, 1994).
Atualmente, o uso extensivo e indiscriminado dos antivirais disponíveis no mercado
pela população tem levado a resistência do vírus (ABREU et al., 2011). Além da gravidade e
da cronicidade da doença, o relato de isolamento de amostras resistentes ao aciclovir é um
problema grave (VARELLA et al., 2005; DIAZ-MITOMA et al., 1996).
Este evento tem sido mais significativo em pacientes imunodeprimidos (prevalência
em torno de 5%) e em transplantados de medula óssea (prevalência de 30%) (DANVESZATANEK et al., 2004; MORFIN et al., 2003).
O HSV pode desenvolver resistência devido a mutações em genes que codificam a
timidina quinase pela geração de mutantes deficientes nesta enzima ou por seleção de
mutantes com timidina quinase incapaz de fosforilar o aciclovir (WHITLEY E ROIZMAN,
2001; ERLICH et al., 1989). A resistência ao aciclovir pode estar relacionada a mudanças
qualitativas ou quantitativas não só na timidina quinase, mas também na DNA polimerase, e
37
deve ser considerada em pacientes que não apresentam resposta ao tratamento (REUSSER,
1996; PROTA et al., 2000). Em 95% dos casos, a resistência ao aciclovir está associada à
timidina quinase, sendo que as cepas resistentes a este fármaco apresentam resistência cruzada
a outros derivados que agem também na timidina quinase (MORFIN et al., 2003).
A terapia com aciclovir, valaciclovir e famciclovir tem poucos efeitos adversos, mas,
em alguns casos, pode causar disfunção renal e neurotoxicidade, principalmente, quando altas
doses são administradas (ERLICH, et al., 1989; LYON e MANSOOR, 2002; ERNST E
FRANEY 1998).
Foscarnet e cidofovir agem diretamente na DNA polimerase viral, sem ativação pela
timidina quinase, sendo efetivos contra cepas resistentes ao aciclovir devido à mutação no
gene da timidina quinase. Entretanto, estes fármacos podem causar significativa toxicidade
(BLOT et al., 2000; COLLINS e OLIVER, 1986; MORFIN e THOUVENOT, 2003).
O frequente desenvolvimento de cepas resistentes devido ao uso extensivo de
fármacos anti-herpéticos, principalmente em pacientes imunocomprometidos, destaca a
necessidade do desenvolvimento de novos compostos com amplo espectro, capazes de inibir a
infecção pelos vírus selvagens e resistentes (GRECO, 2007; LUCERO et al., 2006).
1.1.3 Neuroinfecção por Cryptococcus neoformans
As infecções oportunistas são aquelas causadas por fungos de baixa virulência que, ao
encontrar condições favoráveis, como em indivíduos imunodeprimidos, desenvolvem seu
poder patogênico, invadindo os tecidos (TRABULSI e ALTHERTUM, 2004).
38
Durante as duas últimas décadas, a incidência de infecções por fungos, em particular
àquelas associadas a pacientes imunodebilitados, cresceu dramaticamente (GALAL et al.,
2005).
Os avanços na tecnologia médica propiciaram novas possibilidades terapêuticas para
pacientes considerados terminais até recentemente. A introdução de métodos de diagnósticos
mais eficientes; as novas técnicas de transplantes de órgãos e cirurgias; antibióticos e
quimioterápicos mais potentes; novos materiais biológicos para próteses, sondas e catéteres e
técnicas avançadas de suporte e tratamento permitiram uma melhoria na qualidade de vida dos
pacientes críticos (ELLIS, 2001). Em contrapartida, as infecções fúngicas oportunistas
surgiram como complicações iatrogênicas nesses pacientes (WINGARD, 1999).
A criptococose é uma infecção oportunista causada por uma levedura, Cryptococcus
spp, que assumiu um papel relevante na atualidade por ser considerada uma das micoses mais
comuns em pacientes imunodeprimidos, principalmente nos portadores da síndrome da
imunodeficiência adquirida (AIDS).
A imunidade celular é considerada o principal fator predisponente para infecção por
Cryptococcus spp (MOREIRA et al., 2006). Apesar da incidência de criptococose em
pacientes HIV+ ter decrescido há poucos anos, com a introdução da terapia tripla para o HIV,
ela ainda é alta principalmente nos países em desenvolvimento (GALAL et al., 2005). Pelo
menos 5-10% dos pacientes com AIDS são infectados por Cryptococcus neoformans e a
epidemiologia da infecção é diferente em muitos aspectos daquela observada em outros
grupos de pacientes (LEVITZ, 1991).
Pacientes imunodeprimidos, como aqueles portadores de HIV, leucêmicos, portadores
de tumores, e de outras condições médicas sérias também apresentam maior risco de
desenvolver criptococose. Pacientes que utilizam antibióticos e corticóides por tempo
39
prolongado, como os transplantados, também têm aumentado o número de casos de
criptococose (PERFECT e COX, 1999).
Diversas manifestações clínicas são descritas na criptococose, como infecções
cutâneas, ventriculites, meningites, fungemia, pneumonia e abcesso pulmonar (PEDROSO et
al., 2006), mas, em geral, ela acomete principalmente o SNC, causando meningite (GALAL et
al., 2005).
A principal fonte de contaminação por este fungo nos seres humanos é proveniente das
excretas de pombos, onde o Cryptococcus permanece viável para contágio por um período de
até dois anos. C. neoformans tem a capacidade de colonizar a mucosa do papo dos pombos
sem causar doença, sendo um parasita natural dessas aves. A infecção é adquirida pela
inalação dos propágulos do ambiente, na forma de leveduras, menores do que 2 µm de
diâmetro (WICLES et al., 1996)
Após inalação, o fungo pode causar: a) uma forma pulmonar regressiva da doença, em
que os esporos são fagocitados, e não ocorrem os sintomas; b) a forma pulmonar progressiva
com lesão pulmonar, tosse, febre e expectoração; ou c) a forma disseminada, mais grave em
que o fungo, pela via hematogênica, atinge o sistema nervoso causando meningite
criptocócica ou meningoencefalite (OLIVEIRA, 1999).
Atualmente, duas espécies de Cryptococcus foram descritas como patogênicas,
incluindo C. gatti, um patógeno primário que acomete hospedeiros imunocompetentes, e C.
neoformans, relacionado a hospedeiros imunodebilitados (MORETTI et al., 2008). A
distribuição do C. neoformans é mundial, sendo encontrado, principalmente, associado à
excretas de pássaros, enquanto C. gatti é prevalente em regiões tropicais e subtropicais, sendo
isolado na natureza de troncos de árvores (MOREIRA e SCHMUTZ, 2006, LEVITZ, 1991).
Três outras espécies são consideradas patógenos dos seres humanos: C. albidus, C.
laurentii e C. uniguttulatus (PEDROSO et al., 2006). Contudo, as infecções por outras
40
espécies de Cryptococcus diferentes de C. neoformans ou C. gatti são raramente descritas na
literatura e ocorrem em pacientes imunocomprometidos com doença oncológica,
hematológica ou infectados por HIV.
Apesar da exposição ao Cryptococcus ser relativamente comum, os casos clínicos em
pacientes sadios são raros, o que sugere que a maioria das pessoas seja capaz de desenvolver
uma resposta imunológica adequada (LEVITZ, 1991). Os fatores que induzem a
patogenicidade no C. neoformans podem estar relacionados à presença de condições no
hospedeiro necessárias ao estabelecimento de infecções, capacidade de sobrevivência do
parasita no mesmo e os fatores de virulência propriamente ditos (Figura 7).
Figura 7: Fatores de virulência do Cryptococcus neoformans.
Dentre os fatores de virulência, o tamanho dos basidiósporos da forma sexuada do
Cryptococcus (Filobasidiela neoformans) entre 1,8 e 3 µm é descrito como importante para
este fungo transpor as barreiras existentes no trato respiratório e depositar-se nos alvéolos. A
41
presença da cápsula polissacarídica, que envolve a parede celular constitui um fator de
virulência que protege contra a fagocitose.
A urease é uma metaloenzima capaz de hidrolisar a uréia produzindo amônia que
inativa o sistema complemento e favorece a proliferação do fungo. Outras enzimas que atuam
como fator de virulência são as proteases, que auxiliam no início da invasão dos tecidos do
hospedeiro e na destruição das proteínas do sistema imunológico e a enzima fosfolipase que
atua degradando os fosfolipídeos das membranas celulares com consequente penetração
tecidual (AOKI et al., 1994).
A produção de manitol pelas células do C. neoformans no local da infecção é
responsável pelo aumento da resistência ao estresse provocado por choque térmico, diferenças
osmóticas, dano por formas reativas de oxigênio e ataque mediado por polimorfonucleares,
com consequente aumento da patogenicidade (REOLON et al., 2004, PERFECT E COX,
1999).
O C. neoformans apresenta também como fator de virulência a capacidade de
sintetizar melanina, o que confere à célula fúngica um efeito protetor contra reações
oxidativas e atua na defesa do fungo contra a radiação ultravioleta e o ataque das células de
defesa (HAMILTON e HOLDON, 1999).
1.1.3.1 Antifúngicos atuais e a resistência
O tratamento da infecção por C. neorformans tem se desenvolvido nas últimas décadas.
Antes de 1950, a criptococose disseminada era fatal, mas com o advento de agentes
antifúngicos poliênicos, particularmente a anfotericina B, o sucesso terapêutico foi atingido
em cerca de 60-70% de pacientes com meningite criptocócica (SAAG et al., 2000).
42
Atualmente, a mortalidade na criptococose disseminada é de 70-80% em pacientes
sem tratamento, comparada com 17% naqueles que recebem agentes antifúngicos sistêmicos
(HUSSAIN et al., 2001).
Em geral, o tratamento de infecções por fungos é um processo complexo, visto que os
fungos são organismos eucarióticos com estrutura e metabolismo semelhante ao hospedeiro
eucariótico, o que resulta na toxicidade mostrada por estes derivados (SATHIAMOORTHY et
al., 2007).
Os antifúngicos usados no mercado para tratamento das micoses em geral podem ter
ação fungistática ou fungicida e agem por quatro mecanismos diferentes, tendo com alvo a
membrana celular, a parede celular, o DNA ou RNA e proteínas como a tubulina (Quadro 1).
A parede celular dos fungos é composta por diversos polissacarídeos como β(1,3)glicana, β(1,6)-glicana, α(1,3)-glicana e quitina. Alguns antifúngicos agem nas enzimas que
sintetizam estes carboidratos. Equinocandinas são lipopeptídeos semi-sintéticos com estrutura
química de hexapeptídeos cíclicos ligados a uma cadeia lateral de ácido graxo. Três fármacos
pertencentes a esta classe, a caspofungina, a micafungina e a anidulafungina, chegaram à fase
de investigação clínica, das quais a primeira está licenciada para uso clínico (WHITE et al.,
1998). As equinocandinas inibem a β(1,3)-glicana-sintase, enzima ligada à síntese de β(1,3)glicana. O bloqueio de sua síntese resulta em desequilíbrio osmótico, prejudicando a
viabilidade do microorganismo (WHITE, et al., 1998).
A griseofulvina impede a interação entre α e β tubulinas, afetando com isto a
montagem e funcionamento dos microtúbulos (OLIVEIRA, 1999). A flucitosina ou 5fluorocitosina é convertida a 5-fluorouracil na célula fúngica. Este produto é um
antimetabólito e inibe a timidilato sintetase e, portanto, a síntese de DNA (SIDRIM e
ROCHA, 2004).
43
Quadro 1: Exemplo de antifúngicos usados atualmente, sua origem e mecanismo de ação.
Antifúngico
Estrutura
Origem
Local de
ação
Enzima
lanosterol
14αdesmetilase
Função
Fluconazol
Sintética
Inibe
a
biossíntese
do ergosterol
da
membrana
celular
Inibe
a
síntese de
β(1,3)glicana,
componente da parede
celular
Caspofungina
Produzido
pelo
fungo
aquático,
Glarea
lozoyensis
Enzima
β(1,3)glicanasintase
Griseofulvina
Produzida
pelo
Penicillium
griseofulvum
Tubulina
5Fluorocitosina
Sintética
Enzima
Timidilato
sintetase
Anfotericina B
Produzida
pelo
Streptomyces
nodosus
Ergosterol
Forma um
presente na poro
por
membrana
onde fluem
os componentes
celulares
Afeta
a
montagem
e
funcionamento
dos microtúbulos
Inibe
a
síntese de
DNA
A anfotericina B é um antifúngico poliênico que se liga ao ergosterol, esteróide presente
na membrana de fungos, formando um poro através do qual componentes celulares,
principalmente potássio, fluem, alterando o equilíbrio osmótico da célula. Adicionalmente,
leva a uma lesão oxidativa que resulta em alterações metabólicas prejudiciais à sobrevida
celular (GALLIS et al., 1990; MARTINEZ, 2006).
44
Outros antifúngicos que agem na membrana têm um mecanismo de ação diferente,
inibem enzimas envolvidas na síntese do ergosterol a partir do esqualeno (WHITE et al.,
1998) (Figura 8).
Figura 8: Biossíntese do ergosterol e possíveis alvos terapêuticos dos antifúngicos.
A inibição destas enzimas impede a formação adequada do ergosterol, além de levar
muitas vezes ao acúmulo de esqualeno ou outros intermediários na célula, alterando a
permeabilidade da membrana e a viabilidade fúngica. Alguns exemplos são as alilaminas que
agem na esqualeno epoxidase, as morfolinas com ação na 14Δ-redutase e Δ7,Δ8-isomerase e
os derivados azólicos que inibem a 14α-lanosterol desmetilase (HITCHCOCK, 1991,
RYDER, 1992; WHITE et al., 1998).
Os quimioterápicos antifúngicos da classe dos azóis são caracterizados por conter
anéis imidazóis ou triazóis. Considerando os fármacos de uso sistêmico, existem os azóis de
primeira geração que incluem o miconazol e o cetoconazol e os de segunda geração,
fluconazol, itraconazol, voriconazol, posaconazol e ravuconazol. Os derivados azólicos,
principalmente os imidazólicos, exercem ação apenas fungistática (MARTINEZ, 2006).
45
Estes fármacos atuam sobre a enzima 14α-desmetilase (CYP51), uma enzima do grupo
citocromo P450 dos fungos, responsável por catalisar a remoção oxidativa do grupo 14αmetila do lanosterol via três reações de oxidação levando a um intermediário na biossíntese do
ergosterol. As duas primeiras reações de oxidações produzem os derivados do lanosterol 14hidroximetila e 14-carboxialdeído. Na etapa final, o grupo 14-aldeído é eliminado como ácido
fórmico com concomitante formação de uma dupla ligação (CHAI, et al., 2009).
A inibição desta enzima causa alterações na fluidez e permeabilidade da membrana
citoplasmática do fungo e prejuízos na captação dos nutrientes, o que se traduz por inibição
do crescimento fúngico e alterações morfológicas que resultam em necrose celular
(MARTINEZ, 2006). Os derivados azólicos como imidazóis (e.g. cetoconazol e miconazol) e
triazóis (e.g. fluconazol, itraconazol, voriconazol, ravuconazol e posaconazol) (Figura 9) são
inibidores da CYP51. Estes inibidores coordenam-se ao átomo de ferro heme no sítio de
ligação da enzima via átomo de nitrogênio (N3 do imidazol e N4 do triazol) do anel
heterociclo. Esta inibição é realizada pelo impedimento da ligação do substrato e constitui um
importante alvo terapêutico em infecções fúngicas (MORETTI, 2008).
Em geral, os antifúngicos azólicos apresentam toxicidade por também coordenarem-se
ao ferro do grupamento heme do citocromo de mamíferos, como CYP3A4, podendo reduzir a
atividade do esterol por inibir a CYP51 de mamíferos (RUPPA et al., 2005).
46
Miconazol
Cetoconazol
Itraconazol
Ravuconazol
Posaconazol
Fluconazol
Voriconazol
Figura 9: Estrutura de derivados azólicos usados em infecções fúngicas.
A seleção dos antifúngicos leva em consideração, especialmente, a susceptibilidade do
agente causal provável ou definido, a existência de apresentações para uso endovenoso e oral,
as interações medicamentosas e o custo do tratamento (RAPP, 2004). No caso de medicações
dispendiosas, como o voriconazol, o uso é reservado para o tratamento de infecções graves ou
não responsivas a outros antifúngicos (MARTINEZ, 2006).
O tratamento inicial da criptococose é, em geral, baseado na anfotericina B ou em sua
combinação com 5-fluorocitosina, com base no sinergismo (MARTINEZ, 2006). Os
derivados azólicos como fluconazol ou itraconazol são usados na terapia de manutenção por
longos períodos (BARCHIESI et al., 2007). Entretanto, o uso indiscriminado ou prolongado
destes fármacos pode estar associado ao desenvolvimento de cepas menos suceptíveis a estes
antifúngicos em infecções por Cryptococcus sp. (PERFECT E COX, 1999, BARCHIESI et
al., 2007).
Fatores envolvidos na falha da terapia para criptococose incluem o local de infecção, a
resposta imune do hospedeiro, a virulência da cepa, a farmacocinética do medicamento e a
concentração inibitória mínima (CIM) do fármaco prescrito (WHITE et al., 1998).
47
Os mecanismos de resistência ao antifúngico podem estar associados à entrada da
molécula na célula, ao seu efluxo, inativação ou degradação do fármaco e redução da
atividade no alvo (WHITE et al., 1998). Enquanto a resistência primária ocorre quando a cepa
não teve contato com o antifúngico previamente no hospedeiro (e.g. 5-fluorocitosina). A
resistência intrínseca ocorre quando todos os membros de uma espécie são resistentes a um
fármaco ou a uma classe de fármacos (e.g. equinocandinas) e a resistência secundária ou
adquirida ocorre apenas após a exposição do fungo ao fármaco(e.g.
5-fluorocitosina)
(PERFECT e COX, 1999).
Séries de triazóis análogos de fluconazol e voriconazol foram descritas com atividade
antifúngica, algumas com potência contra uma ampla faixa de patógenos. Essa classe de
derivados tem sido a de maior expansão atualmente, entretanto, seu valor clínico tem sido
limitado pelo risco de toxicidade relativo e a emergência de resistência, deficiências
farmacocinéticas ou atividade insuficiente (KALE e JOHNSON, 2005).
Os mecanismos de resistência aos azóis incluem: a) alteração na afinidade pela
lanosterol 14-alfa desmetilase, devido à mutação na enzima; b) alteração na expresssão das
proteínas ou; c) redução do acúmulo do fármaco, devido ao efluxo mediado por transporte
ativo (RODERO et al., 2003).
Uma mutação pontual (G1855T) no gene ERG11 foi detectada em isolados de
Cryptococcus neoformans resistentes ao fluconazol. Esta mutação é responsável pela
substituição do aminoácido glicina 484 por serina (G484S) na sequência da proteína CYP51.
Este resíduo forma parte do domínio de ligação ao heme e é conservado em todas as CYP51
de fungos filamentosos e leveduriformes.
Alguns estudos têm demonstrado que, em Candida albicans, a substituição da glicina
pela serina confere uma mudança na orientação do domínio de ligação do heme levando a
redução da ligação ao derivado azólico e da atividade catalítica da enzima. Rodero e
48
colaboradores demonstraram que em C. neoformans a substituição de G484S estava associada
ao aumento da concentração inibitória mínima (CIM) de 2 para 16 μg/ml (RODERO et al.,
2003).
Com base no aumento de novos casos de criptococose e a gravidade das manifestações
clínicas, associado ao desenvolvimento de resistência deste fungo a antifúngicos usados
atualmente, a busca por novos compostos se faz indispensável para a terapia desta doença.
Apesar dos recentes avanços, ainda há a necessidade de agentes antifúngicos com amplo
espectro e baixo risco (KALE e JOHNSON, 2005; PERFECT e COX, 1999; WHITE et al.,
1998).
1.2 Química medicinal e modelagem molecular no planejamento de fármacos
Muitos fármacos no passado foram desenvolvidos ao acaso, sendo a piperazina um
exemplo, posto que originalmente estava sendo testada para gota, quando foi descoberta a sua
atividade anti-helmíntica (KOROLKOVAS e BURCKHALTER, 1988).
Os métodos tradicionais de descoberta de novos fármacos tem se baseado na
identificação de um protótipo, que pode ser constituinte de produtos naturais já usados desde a
antiguidade, ou descoberto randomicamente por uma varredura, em que centenas de derivados
sintéticos ou produtos naturais são testados para uma possível atividade biológica
(KOROLKOVAS e BURCKHALTER, 1988; THOMAS, 2003).
Outra abordagem envolve a descoberta do farmacóforo, síntese desta estrutura
simplificada e desenvolvimento de análogos e bioisósteros para acelerar as propriedades
químicas. Na década de 1990, a estratégia mudou de uma abordagem tradicional para uma
abordagem baseada no alvo, no qual mecanismos bioquímicos envolvidos na doença são
conhecidos, bem como o receptor, enzima ou outro alvo terapêutico. Esta abordagem requer
49
conhecimento
sobre
a
estrutura
do
alvo
e
suas
interações
com
os
ligantes
(SATYANARAYANAJOIS, 2010; BROWN, 2007).
A química medicinal, entre suas inúmeras atribuições, engloba o planejamento
racional de novas substâncias bioativas, envolvendo a síntese ou a modificação molecular de
substâncias; o isolamento de princípios ativos naturais (plantas, animais e minerais); a
identificação ou elucidação da estrutura; estudo da relação entre a estrutura e a atividade e
suas interações com os diferentes sistemas biológicos; a compreensão em nível molecular de
processos bioquímicos, farmacológicos, toxicológicos e farmacocinéticos (AMARAL e
MONTANARI, 2002).
Diversas estratégias são usadas em química medicinal para modificação estrutural e
planejamento racional de novos ligantes como: simplificação molecular, hibridação, alteração
na flexibilidade, bioisosterismo, entre outras. Assim, é possível usar, por exemplo, a
informação de fármacos já existentes e otimizar um protótipo ao invés de tentar descobrir um.
O antimalárico mefloquina, por exemplo, foi desenvolvido a partir do produto natural,
cloroquina, baseada em uma simplificação molecular e apresenta melhores propriedades
farmacocinéticas (KOROLKOVAS e BURCKHALTER, 1988). A identificação do protótipo
é a etapa inicial, em seguida vem a otimização do protótipo (envolvendo química medicinal e
combinatória), desenvolvimento do protótipo (incluindo avaliação das características
farmacodinâmicas, farmacocinéticas e toxicológicas) e ensaios clínicos (BALUNAS e
KINGHORN, 2005).
As técnicas computacionais têm revolucionado a química medicinal. Baseado em um
farmacóforo, é possível planejar um composto com uma atividade biológica desejada e
realizar cálculos para avaliar a sua adequação antes de sintetizá-lo.
O processo de descoberta de um novo fármaco envolve em média cerca de 10 anos
(REICHERT, 2003) e um custo de 800 milhões de dólares (DICKSON e GAGNON, 2004).
50
Muito tempo e dinheiro são gastos em numerosos compostos que são descartados durante esse
processo. De fato, tem sido estimado que apenas um em cada 5000 compostos atingirá a etapa
de ensaios clínicos e será aprovado para o uso. Por isso, se faz necessária a busca por novas
metodologias capazes de auxiliar na descoberta de novos fármacos. Neste aspecto, a
modelagem molecular é uma ferramenta capaz de otimizar este processo, permitindo a
detecção precoce das moléculas com problemas e orientando os pesquisadores na direção das
moléculas com maior potencial (OOMS, 2000; TROULIER et al., 2002).
Os experimentos virtuais são rápidos, de baixo custo e seguros e podem auxiliar na
determinação da molécula mais promissora e eliminar compostos problemas em etapas
anteriores (OOMS, 2000; TROULIER, 2002; ENRIZ, 2005). O sucesso das inovações
farmacêuticas nesta área, principalmente, pelo uso da modelagem molecular pode ser
responsável por diminuir o sofrimento humano, os gastos com saúde pública, além de
proporcionar maior proteção e segurança para os pacientes e redução do uso de animais de
experimentação (ENRIZ, 2005).
Um fármaco para ser usado em humanos deve ter um balanço entre farmacocinética e
segurança, assim como potência e seletividade (MODA et al., 2007). Para produzir o seu
efeito farmacológico, o fármaco deve estar presente em concentração apropriada no sítio de
ação (HARDMAN et al., 2001).
A concentração do fármaco livre no sítio ativo é uma função da concentração
administrada, absorção, distribuição (o que está relacionado à ligação a proteínas plasmáticas
e teciduais), metabolismo (biotransformação) e excreção. A passagem do fármaco através das
membranas depende das características físico-químicas da membrana e da molécula (forma,
grau de ionização, lipofilicidade e ligação a proteínas). De forma importante, a modelagem
molecular pode auxiliar tanto nos estudos farmacodinâmicos quanto farmacocinéticos, e de
toxicidade na busca por novos fármacos (HARDMAN et al., 2001) (Figura 10).
51
Figura 10: Representação esquemática da interrelação entre a absorção, distribuição, ligação,
metabolismo e excreção dos fármacos e a sua concentração no sítio de ação. (adaptado de
HARDMAN et al., 2001).
1.2.1 Modelagem molecular nos estudos farmacodinâmicos
As técnicas de modelagem molecular utilizadas na descoberta de fármacos variam
dependendo das informações estruturais disponíveis sobre o alvo (enzima/receptor) e os
ligantes. Os desenhos direto e indireto são duas estratégias que podem ser utilizadas no
processo de desenvolvimento de novos fármacos (COHEN et al.,1990; OOHMS, 2000;
CHAVATTE e FARCE, 2006).
No método indireto, a estrutura tridimensional (3D) do alvo é desconhecida e as
informações sobre a estrutura dos compostos ativos e inativos podem ser utilizadas para
determinar características importantes, como grupos hidrofóbicos, ligação de hidrogênio e
momento de dipolo. A partir destas informações, gera-se um modelo que pode ser utilizado
para a seleção de compostos dentro de bancos de dados ou orientar no processo de
planejamento e síntese de novas entidades químicas (Figura 11) (JORGENSEN, 2004;
VESELOVSKY e IVANOV, 2003).
52
Figura 11: Descrição geral dos métodos para o planejamento de novos compostos bioativos (Adaptado
de Veselovsky e Ivanov, 2003).
No método direto, a estrutura tridimensional do alvo é conhecida e analisa-se o
complexo ligante-receptor (Figura 11). A determinação experimental da estrutura 3D de
proteínas por técnicas de cristalografia e difração de raios-X e Ressonância Magnética
Nuclear (RMN) tem um custo elevado e depende, muitas vezes, de uma alta concentração
proteica, o que na maioria das vezes é complicado, por dificuldades no isolamento ou na
clonagem ou porque algumas não possibilitam a formação do cristal para a análise. A
pesquisa na área de bioinformática tem buscado ferramentas que sejam capazes de simular a
estrutura tridimensional de proteínas. Neste contexto, a modelagem comparativa é a
ferramenta mais bem sucedida para a predição da estrutura tridimensional (KOPP e
SCHWEED, 2006; HILLISCH et al., 2004).
Na modelagem comparativa, os modelos são construídos a partir de dados de
coordenadas de raios X de proteínas semelhantes, usando técnicas de alinhamento de
sequência e análise de homologia (SANT’ANNA, 2002). Para definir o molde (template) a ser
53
utilizado na construção de um modelo tridimensional de uma proteína é necessário ter a
sequência de aminoácidos da proteína e realizar uma busca no banco de dados de sequência
por estruturas existentes no banco de dados de proteína (Protein Data Bank – PDB),
comparando com a sequência da proteína em questão (BERNSTEIN et al., 1977).
Em geral, proteínas com um alto grau de identidade na estrutura primária e
semelhanças funcionais apresentam estruturas tridimensionais semelhantes e podem ser
usadas como molde na modelagem comparativa da proteína alvo (ABREU, 2008; ROST e
SANDER, 1996).
A última etapa do processo de modelagem comparativa de uma proteína é a análise da
confiabilidade da estrutura gerada. Um importante indicador da qualidade estereoquímica de
uma proteína é o gráfico de Ramachandran (Ramachandran et al., 1963) que mostra a
distribuição das combinações entre todos os ângulos phi (Φ) e psi (Ψ) de uma proteína. No
caso da proteína apresentar resíduos de aminoácidos com problemas estereoquímicos, estes
estarão em regiões desfavoráveis do gráfico (SANTOS, 2002; BRANDEN e TOOZE, 1991).
Outra forma de analisar a qualidade de um modelo é baseada na verificação do
ambiente em torno de cada resíduo na proteína e análise da compatibilidade entre estrutura 3D
da proteína modelada e a sua própria sequência de aminoácidos usando o programa Verify 3D
(LUTHY et al.,1992; BOWIE et al., 1991).
O perfil obtido para cada resíduo de aminoácido é comparado estatisticamente com a
preferência de cada um dos 20 aminoácidos por um determinado ambiente. O ambiente dos
resíduos é definido por três parâmetros que incluem a área do resíduo que está voltada para o
interior da proteína, a área coberta por átomos polares e a estrutura secundária. O método
baseia-se no fato de que modelos de proteínas com estrutura 3D adequada têm pontuações
(scores) maiores do que os modelos com estrutura 3D inadequada. Além disso, o método
54
avalia o score 3D-1D para cada aminoácido que deve apresentar, preferencialmente, valores
maiores do que zero (LUTHY et al.,1992).
A análise do score-Z realizado no programa PROSA indica a qualidade geral da
estrutura e mede o desvio da energia total da proteína com respeito à distribuição de energia
derivada de conformações randômicas. O valor do score-Z de uma proteína é mostrado em um
gráfico que contém o score de todas as cadeias de proteínas presentes no PDB (SIPPL, 1993).
Estruturas de proteínas globulares cujos scores-Z desviam muito da média da base de
dados não são usuais e, frequentemente, tendem a estar erradas. O gráfico de energia mostra a
qualidade local dos modelos com base na energia em função da posição da sequência de
aminoácidos. Em geral, valores positivos correspondem a regiões problemáticas ou erradas da
estrutura. Como o gráfico de um único resíduo de aminoácido contém ampla flutuação, este
apresenta, por si só, limitado valor para a avaliação do modelo. O gráfico é então suavizado
pelo cálculo da média de energia de cada fragmento de 40 resíduos, sendo este valor
estabelecido para o resíduo na posição i +19 (WIEDERSTEIN e SIPPL, 2007; SIPPL, 1993).
Quando a estrutura do alvo terapêutico é conhecida, seja por cristalografia e difração
de raios-X, RMN ou modelagem comparativa, é possível realizar o docking com ligantes. O
docking é um método de ajuste ou encaixe molecular que permite explorar o modo de
interação dos compostos nos sítios de ligação, por ajuste manual (docking manual), onde o
composto é posicionado no sítio de interação de acordo com modelos comparativos de outros
compostos análogos, ou docking automático onde o composto é posicionado por programas
que utilizam algoritmos de busca para encontrar as conformações e orientações mais estáveis
(i.e., de menor energia) (SMITH, 1996).
Nesta metodologia, são exploradas translações, orientações e conformações do ligante
na proteína até que um sítio ideal seja encontrado. A flexibilidade do ligante é permitida e se
55
utiliza a mecânica molecular para calcular a energia do ligante no contexto do suposto sítio
ativo (LENGAUER e RAREY, 1996).
O docking de compostos orgânicos em proteínas alvo é relevante para entender os
processos biológicos e desenhar novos fármacos. Nos últimos 30 anos, diversos métodos têm
sido desenvolvidos para triagem de bases de dados de ligantes e análise de interações
moleculares (LENGAUER e RAREY, 1996).
Novos agentes terapêuticos podem ser desenvolvidos também pela análise da relação
estrutura-atividade, onde os dados estereoeletrônicos como energia dos orbitais de fronteira
(HOMO e LUMO), volume molecular, área de superfície polar, momento de dipolo, entre
outros podem ser calculados por técnicas de modelagem molecular resultando em parâmetros
potencialmente indicadores do perfil de atividade biológica (PATRICK, 2001; CARVALHO
et al., 2003).
Outro método é o estudo da relação estrutura-atividade quantitativa (QSAR) que usa
descritores moleculares para construir modelos matemáticos (equações) capazes de predizer,
quantitativamente, a afinidade de ligação de moléculas existentes ou hipotéticas relacionadas
a um conjunto de moléculas de treinamento (LILL, 2007).
O modelo de QSAR é uma equação matemática estatisticamente validada que
correlaciona a estrutura química com o perfil de atividade. Esta técnica pode contribuir muito
no processo de descoberta de novos fármacos e foi originalmente baseada na idéia de que
compostos similares apresentam propriedades físico-químicas e efeitos biológicos
semelhantes, estabelecendo comparação entre propriedades estereoeletrônicas de candidatos a
fármacos e afinidade de ligação a um alvo molecular comum (LILL, 2007; KHAN et al.,
2007).
56
1.2.2 Modelagem molecular nos estudos farmacocinéticos
Novas entidades químicas prováveis de avançar nos ensaios clínicos devem ter um
balanço ideal entre propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas. Problemas com
absorção, distribuição, metabolismo e excreção têm sido identificados como uma das
principais causas de candidatos a fármacos serem retirados do processo de pesquisa e
desenvolvimento farmacêutico em estágios avançados (MODA et al., 2008).
A estratégia clássica de varrer milhares de compostos apenas baseado na potência
biológica traz problemas para a indústria farmacêutica, visto que muitos compostos atrativos
não apresentam propriedades farmacocinéticas requeridas para um fármaco (MODA et al.,
2008; MODA et al., 2007). Atualmente, estudos in silico dos parâmetros de absorção,
metabolismo, excreção e toxicidade (ADME/Tox) são realizados em etapas preliminares do
processo de desenvolvimento de fármacos, a fim de economizar tempo e delinear melhor o
estudo de novos compostos.
A otimização das propriedades ADME/Tox por modificações moleculares de
compostos promissores é essencial na seleção de candidatos a fármacos com maior
probabilidade de não serem descartados na fase clínica (HANSCH et al., 2004).
As
propriedades
farmacocinéticas
como:
absorção
intestinal
humana,
biodisponibilidade oral, ligação a proteínas plasmáticas e solubilidade em água (Log S)
podem ser preditas por modelos de QSAR como no servidor PK/DB – database for
pharmacokinetic properties (http://miro.ifsc.usp.br/pkdb/) (Moda et al., 2008) (Figura 12).
57
Figura 12: Modelos para predição
http://miro.ifsc.usp.br/pkdb/models.php).
das
propriedades
farmacocinéticas
(Extraído
de
Os modelos preditivos são baseados em fragmentos moleculares especializados,
usando o método de estudo de Holograma QSAR (Hologram quantitative structure-activity
relationship - HQSAR) (HQSAR, 2003).
A técnica de HQSAR se baseia na transformação da representação química da
molécula em seu holograma molecular (TONG et al., 1998). Os modelos gerados são robustos
estatisticamente e foram validados por grupos de compostos testes que não haviam sido
considerados para gerar o modelo.
58
A biodisponibilidade oral é definida pela fração da dose do fármaco administrada que
chega à circulação sistêmica e apresenta-se como uma propriedade crítica a ser considerada
nos estágios iniciais do planejamento de um fármaco (MODA, et al., 2007). A sua predição
também é um desafio, visto que envolve múltiplos fatores biológicos e físico-químicos como
dissolução no trato gastrointestinal, permeação pelas membranas intestinais e metabolismo de
primeira passagem intestinal e hepático. Atualmente, muito esforço tem sido feito para
predizer a absorção intestinal, que é a primeira etapa para uma boa biodisponibilidade oral
(HOU et al., 2007; KHAN E SYLTE, 2007).
Neste contexto, a predição desta propriedade foi proposta pela primeira vez por
Lipinski e colaboradores (LIPINSKI et al., 2001) sendo conhecida como “regra dos cinco” de
Lipinski, que define um conjunto de parâmetros capazes de identificar compostos com
problemas de absorção e permeabilidade.
A “regra dos cinco” é um filtro amplamente aceito para análise de druglikeness
(semelhança estrutural com fármacos disponíveis). Deriva da análise de cerca de 2500
fármacos comerciais ativos por via oral (WERMUTH, 2003) e sugere que compostos
violando duas das seguintes regras são pouco absorvidos por via oral (1) massa molecular ≤
500 Da; (2) número de átomos aceptores de ligação de hidrogênio ≤ 10; (3) número de grupos
doadores de ligação de hidrogênio (grupos OH ou NH) ≤ 5; (4) Log do coeficiente de partição
óleo/água (cLog P) ≤ 5 (LIPINSKI et al., 2001; PAJOUHESH e LENZ, 2005).
A habilidade de formar ligação de hidrogênio está relacionada ao número de átomos
de oxigênio e nitrogênio presentes na molécula, sendo o somatório utilizado na regra de
Lipinski para estabelecer o número de grupos aceptores de ligação hidrogênio, ainda que os
pares de elétrons livres destes átomos não estejam disponíveis para este tipo de interação. Um
número excessivo de grupos doadores e aceptores de ligação hidrogênio, assim como uma alta
59
massa molecular dificultam a permeabilidade através da bicamada da membrana, enquanto
que uma lipofilicidade elevada reduz a absorção (PAJOUHESH e LENZ, 2005).
A flexibilidade da molécula é outra característica a ser analisada e está relacionada ao
número de ligações rotacionáveis, sendo uma certa flexibilidade importante para a passagem
através das membranas, entretanto, uma grande flexibilidade é desvantajosa (LIPINSKI et al.,
2001; PAN et al., 2004; PAJOUHESH e LENZ, 2005).
1.2.3 Modelagem Molecular na análise da toxicidade
A toxicidade de fármacos é um fator de extrema importância, uma vez que um número
significativo de fármacos são reprovados em ensaios clínicos devido a esta questão. (VAN DE
WATERBEEMD e GIFFORD, 2003, MITEVA et al., 2006;)
As estruturas são desenhadas no programa Osiris onde são preditos os riscos tóxicos
potenciais. O processo de predição conta com uma base pré-calculada de fragmentos
estruturais que se estiverem presentes na estrutura originam alertas toxicológicos. Essas listas
de fragmentos foram criadas pela fragmentação rigorosa de todos os compostos do banco de
dados do Registro de Efeitos Tóxicos de Substâncias Químicas (Registry of Toxic Effects of
Chemical Substances - RTECS) conhecidos por apresentarem algum tipo de toxicidade
(NIOSH, 2001).
Durante a fragmentação, as moléculas são quebradas nas ligações simples, originando
também um conjunto de fragmentos nucleares. Estes, por sua vez, são utilizados para
reconstruir todos os fragmentos maiores possíveis, sendo uma sub-estrutura da molécula
original. Em seguida, um processo de busca por sub-estruturas determina a frequência de
60
ocorrência dos fragmentos (núcleo e fragmentos construídos) dentre todos os compostos
daquela classe de toxicidade (SANDER, 2001).
As frequências de fragmentos são confrontadas com os fragmentos de mais de 3000
fármacos comerciais. Considerando que fármacos comerciais são tidos como isentos ou com
efeitos tóxicos mínimos, qualquer fragmento encontrado com alta frequência no banco de
fármacos comerciais é considerado como não-tóxico, entretanto, o fato de ser encontrado
frequentemente no banco de compostos químicos, pode ser considerado como um fator de
risco (SANDER, 2001).
Os alertas de riscos toxicológicos indicam que os compostos em avaliação possuem
determinados fragmentos que podem ter efeitos irritante, tumorigênico, mutagênico ou efeito
reprodutivo, por exemplo, quando varia da coloração verde, laranja e vermelha representando
baixo, médio e alto grau (SANDER, 2001).
1.2.4 Modelagem molecular no planejamento de fármacos para o SNC
Candidatos a fármacos bem sucedidos têm que preencher os critérios essenciais de
seletividade, potência, biodisponibilidade (para fármacos administrados oralmente), eficácia
terapêutica, além de perfil aceitável de efeitos adversos. Este sucesso está relacionado ao alvo
terapêutico, sendo que aqueles que agem no SNC têm uma probabilidade menor de serem
bem sucedidos. Este fato é atribuído a uma variedade de fatores incluindo a complexidade do
cérebro, a probabilidade que estes fármacos têm de causar efeitos adversos no SNC e a
necessidade de atravessar a BHE (ALAVIJEH et al., 2005).
Os fármacos que têm como alvo macromoléculas no SNC devem ser capazes de
atravessar a BHE de forma efetiva para exercerem a sua atividade. Por outro lado, fármacos
61
que agem perifericamente devem ter uma habilidade limitada de atravessar a BHE para evitar
efeitos adversos no SNC. Em experimentos, a afinidade relativa de um fármaco pelo sangue
ou cérebro é expressa em termos de coeficiente de partição sangue-cérebro (Log BB) = Log
(Ccérebro/Csangue) onde Ccérebro e Csangue são as concentrações de equilíbrio no cérebro e sangue
respectivamente (DE VRIES et al., 1997; NARAYANAN e GUNTURI, 2005) (Figura 13).
Figura 13: Modelo para predição da penetração na barreira hematoencefálica (Log BB) (Extraído de
http://miro.ifsc.usp.br/pkdb/models.php).
Fármacos moderadamente lipofílicos podem atravessar a BHE por difusão passiva,
enquanto moléculas polares geralmente penetram menos no SNC, a menos que utilizem o
transporte ativo. A maioria dos fármacos atravessam a BHE por difusão passiva e, desta
forma, tamanho, potencial de ionização e flexibilidade molecular influenciam no transporte de
uma molécula orgânica (PAJOUESH e LENZ, 2005; VAN DE WATERBEEMD, 1992).
Em geral, os fármacos para o SNC são mais lipofílicos, menos polares, menos
flexíveis e apresentam menor massa molecular e menor volume molecular do que fármacos
com outras indicações terapêuticas (MOURITSEN e JORGENSEN, 1998; PAJOUESH e
LENZ, 2005). Desta forma, baseado em 1500 fármacos comerciais que atuam no SNC e que
agem por via oral, Lipinski, em 2001 elaborou um conjunto de regras aplicáveis para
fármacos que devem ter uma penetração eficiente no SNC. Este estudo indicou que as
62
propriedades físico-químicas, em geral, têm um limite menor do que no caso de outras classes
de fármacos. De acordo com este estudo, os fármacos que conseguem atravessar a BHE e
desempenhar atividade no SNC apresentam massa molecular ≤ 400 Da, cLogP ≤ 5, aceptores
de ligação hidrogênio ≤ 7, e doadores de ligação hidrogênio ≤ 3 (PAJOUESH e LENZ, 2005;
LIPINSKI et al., 2001).
A penetração na BHE também pode ser predita por modelos de QSAR como no
servidor PK/DB – database for pharmacokinetic properties usando o método de Holograma
QSAR
(Hologram
quantitative
structure-activity
relationship
-
HQSAR)
(http://miro.ifsc.usp.br/pkdb/) (MODA et al., 2008) (Figura 15).
O estudo de atributos e propriedades necessários para uma molécula ter sucesso como
fármaco para o SNC é importante e pode orientar o desenvolvimento de fármacos mais
efetivos (PAJOUESH e LENZ, 2005). O tempo demandado para o desenvolvimento de um
fármaco com ação no SNC é maior (12-16 anos) do que para outras classes terapêuticas (1012 anos), além de envolver um alto custo ($0,8-1,7 bilhões). Centenas de compostos iniciam
os primeiros estágios neste processo, mas apenas poucos chegam a se tornar um novo fármaco
(PHILIPS e MAKINTOSH, 2002).
A demanda por novos fármacos é uma realidade no caso das neuroinfecções, que são
uma importante causa de morte e incapacitação, principalmente meningites e encefalites
criptocócica e herpética, sendo que muitos medicamentos existentes para estas condições
apresentam efeitos adversos ou favorecem o desenvolvimento de resistência. Além disso, as
doenças neurodegenerativas constituem um grave problema de saúde pública atualmente,
devido ao envelhecimento da população e aumento da expectativa de vida, ainda carecem de
medicamentos mais eficazes, seletivos e seguros.
63
2
OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar in silico a relação estrutura-atividade de alvos terapêuticos e novos potenciais
ligantes para o tratamento de indivíduos com doenças neurodegenerativas, relacionadas ao
receptor de NMDA e infecções no sistema nervoso central causadas por Cryptococcus
neoformans e pelo HSV.
2.2 Objetivos específicos quanto ao receptor de NMDA
Identificar os descritores estereoeletrônicos relacionados com o perfil de antagonistas
competitivos do receptor de NMDA em uma série de 17 derivados do ácido piperazino-2,3dicarboxílico descrita na literatura.
Avaliar o risco tóxico in silico desses derivados e a biodisponibilidade oral de acordo
com a “regra dos cinco” de Lipinski, bem como a penetração através da BHE usando a “regra
dos cinco” modificada para penetração no SNC.
Analisar as interações e a energia de ligação do complexo formado pelos antagonistas
competitivos e a estrutura do domínio de ligação ao glutamato na subunidade GluN2B obtida
por modelagem comparativa.
Estudar a estrutura do N-terminal das subunidades GluN2B e GluN2A do receptor de
NMDA por modelagem comparativa e identificar características importantes para a afinidade
do antagonista não-competitivo, ifemprodil, pela subunidade GluN2B em comparação com
GluN2A.
64
Comparar o modo de interação dos antagonistas não competitivos fenil-amidina 1a e
triazolil-amidina 2a, 2e e 2f.
2.3 Objetivos específicos quanto aos derivados candidatos a antivirais
Identificar as características estereoeletrônicas relacionadas com a atividade biológica
de uma nova série de derivados de oxoquinolinas sintetizadas e testadas por grupos
colaboradores com atividade anti-HSV1.
Determinar as características farmacocinéticas desta série de derivados comparando
com o antiviral aciclovir de uso clínico.
2.4 Objetivos específicos quanto a CYP51 e os antifúngicos
Estudar a estrutura da lanosterol 14α-desmetilase de C. neoformans usando um modelo
tridimensional construído com base na enzima humana.
Identificar as interações entre três antifúngicos azólicos de uso clínico (fluconazol,
cetoconazol e posaconazol) com a CYP51 de C. neoformans e de humanos, estabelecendo
uma análise comparativa.
65
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Análise da relação estrutura-atividade (SAR)
No estudo da relação estrutura-atividade (SAR), as estruturas químicas dos compostos
em estudo foram submetidas à análise conformacional sistemática, usando as opções padrões
e o campo de força MMFF94, disponível no programa Spartan`08 (Wavefunction, Inc., Irvine,
CA, 2000).
Subsequentemente, foi realizada a otimização da geometria dos confôrmeros de menor
energia, utilizando o método semi-empírico RM1 e, posteriormente, as estruturas foram
submetidas ao cálculo de ponto único (Single-Point), em que os cálculos são elevados se para
um arranjo estático dos átomos, utilizando o método Hartree-Fock (ab initio) na base 6311G* a fim de se obter parâmetros estereoeletrônicos que possam estar correlacionados com
a atividade biológica experimental tais como: volume molecular, área superficial molecular,
área de superfície polar, momento de dipolo, energias de HOMO (Highest occupied
molecular orbital) e de LUMO (Lowest unoccupied molecular orbital). Além dos mapas de
distribuição dos orbitais e de densidade de HOMO e LUMO e do mapa de potencial
eletrostático de cada composto.
As superfícies tridimensionais dos mapas de potencial eletrostático foram geradas na
faixa de energia entre -150 e + 150 KJ/mol e sobrepostos em uma superfície molecular de
densidade de elétrons constante (0,002 e/ua³). Cada ponto do mapa expressa o valor de
energia de interação eletrostática, avaliado com base em um átomo de prova de carga unitária
positiva fornecendo uma indicação do tamanho total e da forma das moléculas e da
localização dos potenciais eletrostáticos atrativos (negativos) e repulsivos (positivos) (SILVA
et al., 2008) (Figura 14).
66
Figura 14: Fluxograma das etapas de cálculos realizadas no programa Spartan`08 para obtenção dos
descritores estereoeletrônicos e análise da relação estrutura-atividade (SAR).
3.1.1 SAR de antagonistas competitivos do receptor de NMDA
Os 17 derivados do ácido piperazino-2,3-dicarboxílico descritos na literatura (ver
figura 16, página 76) (MORLEY et al., 2005) com atividade antagonista do receptor de
NMDA foram submetidos aos cálculos de análise conformacional, de otimização de
geometria e de energia de ponto único para obtenção das propriedades estereoeletrônicas,
conforme descrito no item 3.1.
3.1.2 SAR de antivirais contra HSV1
A análise de SAR foi realizada para 8 derivados de oxoquinolinas sintetizados pelo
grupo colaborador da Dra Maria Cecília B. V. de Souza (IQ-UFF) e testados pela professora
Dra. Izabel Paixão (IB-UFF), quanto a atividade contra HSV1.
67
3.2 Estudo teórico de propriedades farmacocinéticas e de toxicidade
O programa Osiris Property Explorer (Sander T., Actelion Pharmaceuticals Ltd,
Switzerland) (http://www.organic-chemistry.org/prog/peo/) foi utilizado para cálculo teórico
da solubilidade em água (LogS) e coeficiente de partição octanol-água calculado, descritor de
lipofilicidade (cLogP) que estão relacionados a absorção dos compostos e permeabilidade
através das membranas biológicas. Além disso, foi realizado um cálculo in silico da
toxicidade destas moléculas em relação aos efeitos mutagênico, tumorigênico, irritante e sobre
a reprodução e estes resultados foram comparados a fármacos disponíveis comercialmente.
Os compostos administrados por via oral devem ser capazes de serem absorvidos no
trato gastrintestinal. Desta forma, eles foram avaliados de acordo com a “regra dos cinco” de
Lipinski que avalia o potencial de um composto apresentar uma boa biodisponibilidade oral.
Para isto, os compostos devem apresentar massa molecular ≤ 500 Daltons (Da), coeficiente de
partição octanol/água calculado (cLogP) ≤ 5, número de aceptores de ligação de hidrogênio
(nALH) ≤ 10 e número de doadores de ligação de hidrogênio (nDLH) ≤ 5 (Lipinski, 2001).
Além disso, foi calculado o número de ligações rotacionáveis, parâmetro também relacionado
à capacidade do fármaco de permear as membranas biológicas que deve ser menor do que 10
(PAJOUHESH e LEN, 2005).
Como os compostos avaliados neste estudo devem ter ação no SNC, é necessário que
sejam capazes de atravessar a BHE e, por isso, foram avaliados de acordo com a “regra dos
cinco” de Lipinski modificada para a penetração no SNC que é mais restritiva e estabelece:
massa molecular ≤ 400 daltons (Da), coeficiente de partição octanol/água calculado (cLogP) ≤
5, número de aceptores de ligação de Hidrogênio (nALH) ≤ 7 e número de doadores de
ligação de hidrogênio (nDLH) ≤ 3 (PAJOUHESH e LEN, 2005). Estes cálculos foram
68
realizados
usando
o
programa
Molinspiration
(http://www.molinspiration.com/cgi-
bin/properties) e comparados com compostos da literatura.
As
propriedades
biodisponibilidade
oral,
farmacocinéticas
ligação
a
como:
proteínas
absorção
plasmáticas,
intestinal
penetração
na
humana,
barreira
hematoencefálica e solubilidade em água (Log S) foram preditas por modelos de Holograma
QSAR (Hologram quantitative structure-activity relationship - HQSAR) usando o servidor
PK/DB – database for pharmacokinetic properties (http://miro.ifsc.usp.br/pkdb/) (MODA et
al, 2008) (Figura 15).
Figura 15: Fluxograma das etapas de análise de Holograma QSAR realizado no servidor PK/DB
(Adaptado de http://miro.ifsc.usp.br/pkdb/PKDB_Manual.pdf).
3.2.1 Propriedades farmacocinéticas e toxicidade in silico de antagonistas do receptor de
NMDA
Para os 17 derivados do ácido piperazino-2,3-dicarboxílico foram feitas as análises de
lipofilicidade (cLog P), solubilidade em água (Log S) e toxicidade in silico. Além da
69
avaliação da “regra dos cinco” de Lipinski para biodisponibilidade oral e “regra dos cinco”
modificada para penetração no SNC.
3.2.2 Propriedades farmacocinéticas “in silico” dos derivados de oxoquinolina
Para análise das oxoquinolinas com atividade anti-HSV1 foram feitas análises da
absorção intestinal, biodisponibilidade oral, ligação a proteínas plasmáticas, penetração na
BHE e solubilidade em água (Log S) por modelos de QSAR. Além da avaliação da “regra dos
cinco” de Lipinski para biodisponibilidade oral e “regra dos cinco” modificada para
penetração no SNC.
3.3 Modelagem comparativa para predição da estrutura tridimensional de proteínas
Nos casos em que se conhecia a estrutura 3D do alvo terapêutico dos ligantes
estudados foi feita uma busca pela estrutura cristalográfica no banco de dados de proteína Research
Collaboratory
for
Structural
Bioinformatics
Protein
Data
Bank
(http://www.rcsb.org/pdb). Nos casos em que a estrutura 3D não havia sido elucidadas por
métodos experimentais, foi realizada a modelagem comparativa.
Os modelos tridimensionais das proteínas a serem avaliadas foram construídos usando
o servidor Swiss Model (http://swissmodel.expasy.org/) (GUEX e PEITSCH, 1997; ARNOLD
et al, 2006; PEITSCH, 1995; KIEFER, et al., 2009). Inicialmente, foi realizada a identificação
de proteínas moldes (templates), baseado na similaridade com a sequência de aminoácidos e
na semelhança funcional. Para isto, foi feita uma busca no banco de dados de estruturas de
proteínas PDB (http://www.rcsb.org/pdb/) (BERNSTEIN et al., 1977).
70
Subsequentemente, os modelos foram submetidos a etapas sucessivas de otimização
da geometria, no vácuo, usando o programa GROMOS96 (VAN GUNSTEREN, 1996)
disponível no programa Swiss-Pdb Viewer 4.0.3, usando o algorítmo Steepest descent com
cutoff de 10 Ǻ. A validação da estrutura do modelo foi realizada pela análise do gráfico de
Ramachandran e do score 3D-1D, usando os programas Procheck e Verify-3D
respectivamente disponíveis no servidor SAVES - Stuctural Analysis and Verification Server
(http://nihserver.mbi.ucla.edu/SAVES/) (BOWIE et al., 1991; LUTHY, et al., 1992), além da
análise do score-Z e da energia dos resíduos usando o servidor ProSA – protein structure
analysis (http://prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa.php) (WIEDERSTEIN e SIPPL, 2007;
SIPPL, 1993).
3.3.1 Modelo tridimensional da CYP51 de Cryptococcus neoformans
A construção do modelo da CYP51 de C. neoformans foi realizada pelo modo de
alinhamento disponível no programa Swiss-Model, utilizando a informação do alinhamento
múltiplo da sequência primária do modelo (C. neoformans) e do molde (Homo sapiens) com
outras proteínas da família (Mycobacterium tuberculosis, Aspergillus fumigatus, Coccidioides
immitis, Candida albicans, Candida tropicalis, Saccharomyces cerevisae, Mus musculus,
Rattus norvegicus, Leishmania major, Trypanosoma cruzi, Pneumocistis jiroveci), realizado
no programa ClustalW. A predição da estrutura secundária foi realizada usando o programa
JPred (http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/).
71
3.3.2 Modelo tridimensional do N-terminal de GluN2B e GluN2A do receptor de NMDA
Os modelos de GluN2B e GluN2A do receptor de NMDA foram construídos pelo
modo automático disponível no programa Swiss-Model, usando como molde a estrutura da
subunidade GluN2B do receptor de NMDA de Rattus norvegicus (código PDB = 3JPW). O
alinhamento entre a estrutura primária destas subunidades foi realizado no programa ClustalW
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/).
3.4 Docking ligante-receptor e análise das interações
Nos casos em que os ligantes estudados estavam disponíveis no banco de dados de
proteínas (PDB) ligados a proteínas com similaridade estrutural àquelas estudadas, o docking
ligante-receptor foi construído baseado em alinhamento estrutural usando o programa Swiss
PDB Viewer (SPDBV) utilizando a orientação do complexo disponível. Em seguida os
complexos foram otimizados até um gradiente inferior a 0,1 kcal/molÅ, usando o campo de
força MM+, disponível no HyperChem Release 7 (Hypercube Inc, 2002). A visualização das
interações ligante-receptor foi realizada nos programas Deep View / Swiss-PDB Viewer 4.0.3
(GUEX e PEITSCH, 1997).
Para aquelas proteínas que não apresentavam informação sobre o modo de interação
dos ligantes, foram construídos complexos pela metodologia de docking cego, usando o
programa Autodock 4.2. A estrutura 3D do ligante foi construída no programa Spartan’08
(Wavefunction Inc. Irvine, CA, 2000) e submetida à análise conformacional sistemática,
usando campo de força MMFF94. Em seguida, foi realizada a otimização da geometria e
cálculo da energia de ponto único usando o método Hartre-Fock na base 6-311G*. As
72
estruturas do ligante e da proteína foram transferidas para o programa Autodock 4.2 onde
foram adicionadas Cargas Gasteiger. O centro do grid para o cálculo do docking foi
posicionado no centro da proteína ou em resíduos de aminoácidos específicos, com dimensões
variadas, de acordo com a informação sobre o sítio de ligação e com espaçamento de 0,375 Å
e foram calculados os mapas para os tipos de átomos presentes usando o Autogrid. O
algoritmo genético Lamarkiano foi usado e solicitado um número de 50 conformações. Os
parâmetros usados para o docking foram os padrões do programa, e mantendo o ligante
flexível e a proteína rígida. Após o docking, os ligantes foram ordenados de acordo o número
de conformações nos clusteres e a energia de ligação calculada pelo programa.
Para análise das interações proteína-ligante foi usado o programa Autodock 4.2 e Deep
View/Swiss-PDB Viewer 4.0.3. Foram analisadas a energia de ligação e a forma como as
moléculas interagem com os alvos terapêuticos de modo a gerar informações importantes para
o desenvolvimento de ligantes com maior afinidade e mais potentes, além de tentar explicar as
diferenças entre os compostos mais ativos e com menor atividade.
3.4.1 Docking dos azóis na CYP51 de C. neoformans e de Homo sapiens
O docking dos derivados azólicos (fluconazol, cetoconazol e posaconazol) na enzima
CYP51 de humano e de C. neoformans foi realizado pela metodologia do docking manual. O
docking manual foi escolhido porque a inibição da enzima ocorre pela coordenação do átomo
de nitrogênio do anel azol com o ferro do grupo heme da enzima. Como estavam disponíveis
no PDB enzimas CYP51 de outros organismos ligadas a estes azóis, foi feito um alinhamento
estrutural com as proteínas usando o SPDBV e, em seguida, a minimização usando o
programa HyperChem Release 7, de modo a fornecer certa flexibilização ao complexo
73
formado. As estruturas usadas foram CYP51 de Leishmania infantum ligada ao fluconazol
(código PDB = 3L4D), Homo sapiens ligada ao cetoconazol (código PDB = 3LD6) e T.
brucei ligada ao posaconazol (código PDB = 2X2N).
3.4.2 Docking dos antagonistas do receptor de NMDA no sítio de ligação ao glutamato
Inicialmente foi realizado o redocking do glutamato no seu sítio de ligação na
subunidade GluN2A do receptor de NMDA de Rattus norvegicus, disponível no PDB (código
2A5S), usando o Autodock 4.2. Para isto, o ligante foi retirado do sítio de ligação e usou-se o
grid no tamanho de 65x65x65 cujo centro foi posicionado no centro da proteína, que é onde
se localiza o sítio de ligação ao glutamato.
O docking dos 17 derivados do ácido piperazino-2,3-dicarboxílico com atividade de
antagonistas competitivos da subunidade GluN2B do receptor de NMDA foi realizado pela
metodologia do docking cego. O grid com o tamanho de 65x65x65 também foi centralizado
no centro da proteína. A estrutura do domínio S1S2 de ligação ao glutamato na subunidade
GluN2B do receptor de NMDA foi obtida de um estudo recente de nosso grupo, usando como
molde a estrutura da subunidade GluN2A ligada ao glutamato e a orientação de abertura da
subunidade GluR2 do receptor de AMPA (código do PDB = 1FTL) (ABREU, 2008).
Além disso, foi realizado o docking dos derivados do ácido piperazino-2,3dicarboxílico na forma zwiteriônica com um dos nitrogênios da piperazina protonado e o
oxigênio da carboxila desprotonado para estabelecer uma análise comparativa. Neste caso foi
escolhido o nitrogênio não ligado ao substituinte e a a carboxila imediatamente vizinha.
74
3.4.3 Docking dos antagonistas do receptor de NMDA e potenciais ligantes no N-terminal do
receptor de NMDA
O docking do antagonista não competitivo descrito na literatura, ifemprodil, na região
N-terminal do receptor de NMDA foi realizado usando a metodologia do docking cego. As
estruturas tridimensionais do N-terminal da subunidade GluN2A e GluN2B do receptor de
NMDA de humano foram construídas por modelagem comparativa usando a estrutura do Nterminal presente no banco de dados de proteína (código PDB = 3JPW) e foram usadas para
gerar os complexos ligante-receptor.
Como recentemente foi elucidada a estrutura do dímero formado entre as subunidades
GluN1/GluN2B complexada com o ifemprodil (KARAKAS et al., 2011), esta estrutura
(código PDB = 3QEL) foi usada para construir o dímero GluN1/GluN2A e realizar o docking
com ifemprodil.
Inicialmente, foi realizado o redocking do ifemprodil no sítio de ligação entre o e Nterminal de GluN2B e da subunidade GluN1 para validar o método. O tamanho da caixa foi
de 80x80x80 e foi centralizado no resíduo de aminoácido Gln110 da subunidade GluN2B.
Este resíduo está bem posicionado na região do sítio de ligação ao ifemprodil e interage por
ligação de hidrogênio. Deste mesmo modo foi realizado o docking da fenil-amidina 1a
(CLAIBORNE et al., 2003) e das triazolil-amidina 2a, 2e e 2f, planejadas por nosso grupo em
um estudo anterior (ABREU, 2008) com GluN1/GluN2B.
75
4 RESULTADOS
4.1 Modelagem molecular para desenvolvimento de antagonistas do receptor de NMDA
4.1.1 Análise de antagonistas competitivos e interação com o domínio de ligação ao
glutamato
A análise SAR de 17 derivados do ácido piperazino-2,3-dicarboxílico descritos na
literatura (MORLEY et al, 2005) com atividade de antagonista do receptor de NMDA foi
realizada utilizando o programa SPARTAN como descrito na seção de Materiais e Métodos.
Esta série foi escolhida por conter moléculas que apresentaram valores promissores de
atividade antagonista medida pela constante de inibição, Ki (µM) do receptor de NMDA,
além de uma afinidade diferente para as subunidades GluN2A-D (Figura 16 e Tabela 1).
Estudos anteriores já haviam demonstrado a atividade de antagonista do receptor de NMDA
de derivados de piperazina e, neste caso, grupos volumosos como o fenantreno foram testados
para avaliar o efeito no perfil de atividade.
Alguns derivados da série apresentaram potência comparável a moléculas como AP5,
AP7 e CPP, descritas na literatura como antagonistas competitivos do receptor de NMDA. Os
derivados mais ativos 16e, 16g, 16h e 16n tiveram maior afinidade por GluN2B do que por
GluN2A, sendo que o derivado 16n apresentou uma afinidade maior por GluN2B do que por
todas as outras subunidades GluN2A, GluN2C e GluN2D (Tabela 1).
76
Figura 16. Estruturas química dos 17 derivados do ácido piperazino-2,3-dicarboxílico (Adaptado de
MORLEY et al, 2005).
77
Tabela 1: Valores de atividade de antagonista (Ki, µM) do receptor de NMDA recombinante de rato
expresso em ovócitos de Xenopus. O receptor é formado por um heterômero contendo as subunidades
GluN1/GluN2A, GluN1/GluN2B, GluN1/GluN2C ou GluN1/GluN2D (Extraído de MORLEY et al.,
2005).
#
Estrutura
GluN1/
GluN2A
GluN1/
GluN2B
GluN1/
GluN2C
GluN1/
GluN2D
0,28
0,46
1,64
3,71
0,49
4,14
6,42
17,10
0,041
0,27
0,63
1,99
0,55
0,31
0,096
0,125
0,32
0,25
0,099
0,15
1,54
0,76
0,29
0,57
0,84
0,30
0,85
1,94
COOH
AP5
PO3H2
H2N
COOH
AP7
PO3H2
H2N
HN
CPP
N
PO3H2
HOOC
16e
O
N
COOH
N
H
COOH
Br
16g
O
16h
N
COOH
N
H
COOH
O
N
COOH
N
H
COOH
16n
O
N
COOH
N
H
COOH
78
A partir das características estruturais e eletrônicas calculadas pelo método ab initio,
observou-se que alguns descritores apresentaram certo grau de correlação (R ~ 5) com os
valores de pKi como volume molecular (0,57), área superficial molecular (0,54), lipofilicidade
(0,54) e energia de HOMO (0,55), o que significa que maiores valores destes descritores estão
relacionados com uma melhor atividade biológica enquanto a solubilidade em água
apresentou correlação inversa (-0,51) (Tabela 2 e 3).
Tabela 2. Comparação da atividade biológica Ki (μM) e pKi (M) de 17 derivados do ácido piperazino2,3-dicarboxíllico (13, 16a-n, 17 e 23) testados em receptor de NMDA recombinante contendo
subunidade GluN1/GluN2B e parâmetros teóricos calculados incluindo energia de HOMO/LUMO
(EHOMO e ELUMO, Ev), momento de dipolo molecular (μ, Debye), massa molecular (MM, g/mol), área
superficial molecular (ASM, Å2), volume molecular (VM, Å3), área de superfície polar (ASP, Å2),
coeficiente de partição octanol/água (cLogP) e solubilidade em água calculada (cLogS), número de
grupos aceptores de ligação de hidrogênio (nALH) e doadores (nDLH) = 3.
#
13
16a
16b
16c
16d
16e
16f
16g
16h
16i
16j
16k
16l
16m
16n
17
23
Ki
(μM)
pKi
(M)
MM
μ
9,08 5,04 378,38 5,67
>100 >4,00 278,26 10,85
5,01 5,30 354,36 11,45
22,1 4,66 433,26 11,66
13,4 4,87 372,35 9,71
0,31 6,51 378,38 11,67
19,29 4,71 378,38 11,13
0,25 6,60 457,28 9,27
0,76 6,12 380,40 11,42
2,15 5,67 459,30 8,92
3,25 5,49 366,37 11,57
9,36 5,03 380,36 12,04
18,00 4,74 306,32 10,13
18,20 4,74 328,32 11,49
0,30 6,52 354,36 11,52
16,20 4,79 390,42 9,38
10,25 4,99 364,40 8,22
ASM
VM
ASP
375,64
274,01
353,78
371,09
359,51
364,44
364,29
384,88
370,31
390,77
357,73
360,61
314,73
321,38
356,7
375,51
365,96
364,08
260,18
343,19
360,87
347,86
361,57
361,53
379,88
366,08
384,4
350,03
352,66
297,01
311,28
343,81
356,4
360,61
95,36
85,74
85,73
85,75
85,75
85,74
85,72
85,77
85,71
85,74
86,14
101,02
85,67
86,18
85,65
109,53
77,70
cLogP LogS
1,69
-0,68
1,00
1,70
1,06
1,69
1,69
2,38
1,50
2,20
1,46
1,03
-0,55
0,50
0,63
0,04
1,43
-4,11
-0,90
-2,98
-3,82
-3,30
-4,11
-4,11
-4,94
-3,53
-4,37
-3,61
-4,00
-1,27
-2,50
-2,87
-2,48
-4,50
EHOMO
ELUMO
nALH
-8,09
-10,03
-8,96
-9,26
-8,99
-8,38
-8,38
-8,68
-8,49
-8,65
-8,49
-9,03
-9,3
-8,69
-8,35
-9,09
-8,03
2,05
1,95
1,72
1,68
1,66
1,41
1,47
1,19
1,51
1,29
1,46
0,41
3,02
1,38
1,34
1,51
1,94
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
7
8
7
7
7
8
6
A análise dos derivados mais potentes da série (16e, 16g, 16h e 16n) demonstrou a
importância do anel fenantreno para a atividade, sendo essencial também a posição da ligação,
que o grupo carbonila da cadeia lateral está ligado ao anel aromático, uma vez que 16e com a
carbonila ligada na posição 2 foi mais potente do que 16f com carbonila na posição 3.
79
Tabela 3. Matriz de correlação cruzada entre a atividade biológica experimental Ki (μM) e pKi (M)
testados em receptor de NMDA recombinante contendo subunidade GluN1/GluN2B e energia de
HOMO/LUMO (EHOMO e ELUMO, ev), momento de dipolo molecular (μ, Debye), massa molecular
(MM, g/mol), área superficial molecular (ASM, Å2), volume molecular (VM, Å3), área de superfície
polar (ASP, Å2), coeficiente de partição octanol/água (cLogP) e solubilidade em água calculada
(LogS), número de grupos aceptores de ligação de hidrogênio (nALH) e doadores (nDLH) = 3.
Ki
(μM)
pKi
(M)
MM
μ
ASM
VM
ASP
cLogP LogS
EHOMO
ELUMO
Ki (μM)
1,00
pki (M)
-0,67
1,00
MM
-0,57
0,47
1,00
µ
0,07
0,10
-0,21
1,00
ASM
-0,79
0,54
0,89
-0,29
1,00
VM
-0,79
0,57
0,89
-0,25
0,99
1,00
ASP
-0,02 -0,18
0,11
-0,13
0,18
0,10
1,00
cLogP
-0,62
0,54
0,83
-0,19
0,82
0,88
-0,23
1,00
LogS
0,65
-0,51 -0,81
0,24
-0,85
-0,91
0,11
-0,95
1,00
EHOMO
-0,73
0,55
0,35
-0,32
0,63
0,67
-0,19
0,64
-0,70
1,00
ELUMO
0,28
-0,36 -0,47
-0,36
-0,42
-0,46
-0,30
-0,45
0,51
-0,18
1,00
nALH
0,01
-0,09
0,25
0,07
0,01
0,89
-0,24
0,18
-0,39
-0,45
0,10
nALH
1,00
Dentre os derivados mais ativos, apenas 16n não apresenta anel fenantrila, mas um
anel naftila separado por um alceno como espaçador, que apesar de tornar a molécula mais
flexível, possibilitou a manutenção de uma conformação biologicamente ativa semelhante a
16e. Os anéis 9H-fluorenil (16j) e 9-Oxo-9H-fluorenil (16k) reduziram a potência, assim
como os grupamentos bifenila e naftila (Figura 17 e Tabela 2).
A análise do mapa de potencial eletrostático e da superfície de van der Waals mostrou
um perfil semelhante para os derivados mais ativos. O derivado 17 apresentou uma
conformação diferente, o que provavelmente resultou em impedimento estérico e redução da
atividade, enquanto 16a e 16m apresentam um volume menor, o que possivelmente reduz as
interações com resíduos hidrofóbicos do receptor e resultou em menor atividade (Figura 17 e
Tabela 2).
80
Figura 17: Análise teórica dos 17 derivados do ácido piperazino-2,3-dicarboxílico (13, 16a-n, 17 e
23). (A) Estrutura tridimensional (cinza= carbono, branco = hidrogênio, vermelho = oxigênio, amarelo
= enxofre, vermelho escuro = bromo e amarelo claro = cloro), e (B) Mapa de potencial eletrostático
molecular, evidenciando a distribuição de cargas em uma isosuperfície de -150 a 150 KJ/mol. Regiões
tendendo para o azul são mais positivas e para o vermelho, mais negativas. As moléculas nos quadros
A e B apresentam a mesma orientação.
81
Os derivados 16a, 16b, 16c, 16d, 16h, 16i, 16l e 17 não apresentaram nenhum alerta
de risco quanto aos possíveis efeitos mutagênico, tumorigênico, reprodutivo e irritante in
silico. Os alertas parecem estar relacionados ao anel fenantreno, naftaleno e 9H-fluorenil.
Dentre os derivados mais ativos (16g, 16h, 16e e 16n), o derivado 16h foi o que apresentou
menor risco de toxicidade (Figura 18).
Figura 18: Perfil de toxicidade in silico dos derivados de ácido piperazino-2,3-dicarboxílico, onde 1
representa baixo risco, 2 = médio e 3 = alto risco.
Além
disso,
todos
os
derivados
desenvolvidos
apresentaram
uma
boa
biodisponibilidade oral de acordo com a análise da “regra dos cinco” de Lipinski e também
obedeceram a regra modificada para penetração no SNC (Tabela 3).
4.1.2 Docking dos derivados de ácido piperazino-2,3-dicarboxílico no receptor de NMDA
Inicialmente foi realizado o redocking do glutamato na estrutura cristalográfica do
domínio de ligação ao glutamato da subunidade GluN2A do receptor de NMDA de rato
(código PDB = 2A5S) para validação do método.
82
O ensaio teórico se mostrou satisfatório, uma vez que resultou na estrutura do
glutamato posicionada no mesmo local e orientação que a estrutura cristal disponível no PDB
e com conformação bastante similar (Figura 19).
Figura 19: Redocking do glutamato na subunidade GluN2A do receptor de NMDA. Em azul, a
estrutura cristalográfica 2A5S e em verde o docking realizado.
A partir deste resultado, o docking dos 17 derivados do ácido piperazino-2,3dicarboxílico foi realizado para avaliar o modo de ligação e as interações com a subunidade
GluN2B. A estrutura de GluN2B foi escolhida para ser estudada porque os antagonistas
seletivos para esta subunidade demonstraram ter menos efeitos adversos do que aqueles não
seletivos (BOYCE et al., 1999).
A estrutura tridimensional da subunidade GluN2B foi obtida por modelagem
comparativa em estudo anterior (ABREU, 2008). O docking foi realizado usando um grid de
dimensão de 65x65x65 cujo centro foi posicionado no centro da proteína e, de acordo com os
resultados do docking todas as moléculas se locarizaram no sítio competitivo do receptor onde
se liga também o glutamato. Os dockings foram analisados e os complexos escolhidos de
acordo com a energia de ligação, o número de conformações presentes nos clusteres e com
base no conhecimento prévio sobre o modo de ligação de outros antagonistas. Em geral,
83
foram selecionados aqueles complexos de menor energia presentes nos clusteres de menor
energia e contendo maior número de conformações.
Os ligantes estudados neste trabalho apresentam semelhança estrutural com
aminoácidos e contém sítios ionizáveis. Por isto, foi realizada uma avaliação também da
forma zwitteriônica dos derivados de piperazina. O termo zwitterion significa íon híbrido, em
alemão, e é usado para representar moléculas que contém igual número de grupos de cargas
opostas e, consequentemente, possuem carga líquida igual a zero (NELSON e COX, 2004).
Foram observados modos diferentes de interação com o receptor nas formas
zwitteriônicas ou não-ionizadas de todos os derivados, exceto do 17 que teve uma
conformação ligada semelhante nas duas formas e, 16a que teve o anel piperazina alinhado,
mas a fenila em direção oposta (Figura 20).
Figura 20: Comparação entre o docking dos 17 derivados do ácido piperazino-2,3-dicarboxílico nas
formas não-ionizadas (verde) e ionizada (vermelho) na subunidade GluN2B do receptor de NMDA.
84
Na forma não-ionizada, foi possível observar um modo de ligação semelhante na
maioria dos derivados que tiveram os anéis em posição semelhante, exceto 16a, 17 e 23 que
também não apresentaram atividade significativa (Figura 20).
A comparação da energia de ligação mostrou que os quatro derivados mais potentes da
série apresentaram energia de ligação menor (16e = -7,85, 16g = -8,76, 16h = -7,15 e 16n = 7,43) do que o derivado menos ativo 16a (-6,35). O derivado 16g com maior valor de pKi
também foi o que apresentou menor valor de energia de ligação (Quadro 3).
Quadro 3: Ligação de hidrogênio e interação eletrostática entre os ligantes mais ativos (16e, 16g, 16h
e 16n) e menos ativo (16a) na forma não-ionizada com a subunidade GluN2B.
Ligantes
16a
Energia de
ligação
estimada
Kcal/mol
-6,35
16e
-7,85
16g
-8,76
16h
-7,15
16n
-7,43
Ligações de hidrogênio
ou interação iônica
Interação de van der
Waals (contato a 4Å)
His486, Ser512, Thr514, His486, Ser512, Leu513,
Asn516, Arg519, Ser690 Thr514, Asn516, Arg519,
Gly689, Ser690, Thr691,
Tyr731, Asp732
Glu413, Lys485, His486, Glu413, Lys485, His486,
Tyr731
Thr514, Gly533, Ile534,
Ser690, Thr691, Val714,
Tyr731, Asp732, Thr760
Tyr762
Glu413, Lys485, His86, Glu413, Lys485, His486,
Tyr731
Gly533, Ile534, Ser690,
Thr691, Val714, Tyr731,
Asp732, Ala758, Thr760,
Tyr762
Glu413, Lys485, His486, Glu413, Lys485, His486,
Tyr731
Thr514, Gly533, Ile534,
Val686, Ser690, Thr691,
Tyr731, Asp732, Thr760,
Tyr762
Glu413, Lys485, His486 Leu411, Glu412, Glu413,
Lys485, His486, Ser690,
Thr691, Val714, Tyr731,
Asp732, Thr760, Tyr762
85
Os complexos com as moléculas mais potentes na forma não-ionizada apresentaram os
resíduos Glu413, Lys485, His486 e Tyr731 interagindo por ligação de hidrogênio, apenas no
complexo com 16n, Tyr731 estava um pouco mais distante para interagir com o ligante. Os
resíduos hidrofóbicos Gly533 e Ile534 parecem interagir com os anéis hidrofóbicos,
entretanto, em 16n estes resíduos se encontravam também mais distantes para interação.
Quando se analisa a forma de zwitterion o modo de ligação foi semelhante para os
complexos com 16g, 16h, 16i, 16l e 16n, que são os mais ativos, exceto 16l. Além disso, os
complexos com 17 e 23, também apresentaram o anel piperazina alinhado, apesar dos anéis
bifenila em 17 e fenantrenila, em 23, estarem voltados para direção diferente dos demais.
Os derivados 16c 16d, 16f, 16j, 16k e 16m apresentaram uma conformação
semelhante entre si, mas um pouco diferente das moléculas mais ativas (16g, 16h e 16n). O
derivado 16e, um dos mais ativos, apresentou o anel piperazina em posição próxima a
localização deste em 16g, 16h e 16n, enquanto que o anel fenantrila se localizou em diferente
região, provavelmente devido às interações π-π stacking com Tyr731. Os anéis fenantrila de
16g, 9,10-di-hidrofenantrila de 16h e naftila de 16n interagiram com os resíduos apolares
Val714 e Gly713. A maior parte das conformações tem os grupos hidrofóbicos voltados na
mesma direção, o que pode indicar que a região da proteína em contato com estes grupos pode
ser importante e favorecer este encaixe. O derivado 16a interagiu de modo semelhante ao
glutamato e diferente das moléculas mais ativas.
Na forma zwitteriônica, assim como na forma não-ionizada, a energia de ligação dos
derivados mais ativos (16e = -6,93, 16g = -7,58, 16h = -7,11 e 16n = -6,93) também foi
menor do que do derivado menos ativo 16a (-6,32). A menor atividade de 16a pode estar
relacionada ao seu menor volume e modo de ligação diferente dos demais (Quadro 4).
86
Quadro 4: Ligação de hidrogênio e interação eletrostática entre os ligantes mais ativos (16e, 16g, 16h
e 16n) e menos ativo (16a) na forma de zwitterion com a subunidade GluN2B.
Ligantes na
forma
zwitteriônica
Energia de
ligação
estimada
16a
-6,32
16e
-6,93
16g
-7,58
16h
-7,11
16n
-6,98
Ligações de
hidrogênio ou
interação iônica
Interação de van der
Waals
Thr514,
Arg519, His486, Ser512, Leu513,
Ser690, His486
Thr514, Asn516, Arg519,
Asn688, Gly689, Ser690
Gly487,
Arg519, Lys485, His486, Gly487,
Asn688
Lys488, Arg519, Asn688,
Pro687, Gly689, Ser690,
Thr691, Asp732, Tyr731
Lys485,
His486, Glu413, Gly484, Lys485,
Gly487
His486, Gly487, Lys488,
Asn495, Pro687, Asn688,
Gly689, Val714
Gly487, Arg519
Glu413, Lys485, His486,
Gly487, Lys488, Ser512,
Thr514, Arg519, Asn688,
Gly689, Ser690, Val735,
Tyr762
Lys485,
His486, Glu413, Lys 485, Lys488,
Gly487, Asn495
Asn495, Lys485, His486,
Gly487, Pro687, Asn688,
Tyr731
Apesar de alguns resíduos de aminoácidos estarem interagindo com os ligantes, tanto
na forma ionizada quanto não-ionizada, em muitos casos, a interação ocorreu com grupos
diferentes do ligante.
Nas formas ionizadas, os derivados mais potentes interagiram por ligação de
hidrogênio com Gly487. Entretanto, 16g e 16n conservaram outros resíduos de aminoácidos
interagindo por ligação de hidrogênio, como His486 e Lys485.
O derivado 16a, o menos ativo, apresentou uma conformação diferente dos demais,
interagindo mais próximo ao local de ligação do glutamato do que ao local onde interagiram
os demais antagonistas. Foram observados os mesmos resíduos interagindo por ligação de
hidrogênio que no caso do glutamato (Thr514, Arg519 e Ser690), sendo que o glutamato
87
também interagiu com Thr691 e Ser512, enquanto 16a interagiu com His486 (dados não
mostrados).
A energia de ligação dos complexos foi menor nas moléculas na forma não-ionizada
do que ionizada. Entretanto, na forma ionizada, foi observada a possibilidade de interação por
ligação de hidrogênio com Gly487 e de van der Waals com Asn688, o que pode resultar em
impedimento do fechamento do domínio S1S2 de ligação ao glutamato, e deste modo,
impedir a abertura do poro e passagem de íons. Este fato pode ser observado quando se
compara a estrutura da subunidade GluN2B do receptor de NMDA na forma aberta (na qual
foi realizado o docking) e a forma fechada, obtida recentemente por modelagem comparativa
(ABREU, 2008). Na forma fechada uma alça estaria colidindo com o grupamento carbonila
que liga ao anel aromático e ao grupo piperazina nos derivados. Deste modo, a forma
zwitteriônica destes derivados impediria o fechamento deste domínio, justificando o
antagonismo observado para estes compostos (Figura 21).
Figura 21: Docking do derivado 16g na subunidade GluN2B na forma aberta (branca) e comparação
com a estrutura na forma fechada (rosa). Em amarelo, está destacada a alça que é impedida de fechar
no caso de ligação com o antagonista.
Apesar dos valores de energia de ligação serem próximos entre a molécula menos
ativa 16a e os antagonistas que tiveram uma atividade alta, como 16e e 16n, é possível que
88
isto se deva ao fato de que o método de docking apenas analisa o modo de ligação que, dentro
do grid escolhido, apresenta a menor energia, mas não avalia se este confôrmero, nesta
posição, seria capaz de impedir o fechamento do domínio, promovendo o efeito de
antagonista.
4.1.2 Análise de antagonistas não-competitivos e do seu sítio de ação
Na busca por antagonistas mais seletivos para a subunidade GluN2B foi estudado
também um sítio para moduladores alostéricos na região N-terminal onde se liga o ifemprodil.
Em 2009, a estrutura tridimensional desta região da subunidade GluN2B de Rattus norvegicus
(código PDB = 3JPW) foi determinada por cristalografia e difração de raios-x (código PDB =
3JPW) (KARAKAS, et al, 2009).
A análise comparativa da estrutura primária do N-terminal de GluN2B de Rattus
norvegicus comparado com o N-terminal de GluN2B de Homo sapiens mostrou uma
identidade de 99%. Ao comparar GluN2B de humano com GluN2A de humano, o percentual
de identidade foi de 55%. Alguns resíduos estavam conservados nas três sequências, como
Cys86 e Cys321 formando ligação dissulfeto, além de Cys232 (Figura 22). Esta região do
receptor de NMDA apresenta homologia com a proteína de ligação a leucina/isoleucina/valina
com uma arquitetura semelhante a uma concha de marisco, apesar de terem um percentual de
identidade total de apenas 4% (SACK et al., 1989).
A estrutura do N-terminal de GluN2B de Rattus norvegicus (3JPW) foi usada para a
construção do modelo tridimensional da subunidade de GluN2B de humanos, que apresenta
mutação em dois resíduos, e do modelo de GluN2A de humanos com 55% de identidade
(Figura 22).
89
GluN2B_rato
GluN2B_humano
GluN2A_humano
PPSIGIAVILVGTSD--EVAIKDAHEKDDFHHLSVVPRVELVAMNETDPKSIITRICDLM 89
PPSIGIAVILVGTSD--EVAIKDAHEKDDFHHLSVVPRVELVAMNETDPKSIITRICDLM 89
PPALNIAVMLGHSHDVTERELRTLWGPEQAAGLPLDVNVVALLMNRTDPKSLITHVCDLM 90
GluN2B_rato
GluN2B_humano
GluN2A_humano
SDRKIQGVVFADDTDQEAIAQILDFISAQTLTPILGIHGGSSMIMADKDESSMFFQFGPS 149
SDRKIQGVVFADDTDQEAIAQILDFISAQTLTPILGIHGGSSMIMADKDESSMFFQFGPS 149
SGARIHGLVFGDDTDQEAVAQMLDFISSHTFVPILGIHGGASMIMADKDPTSTFFQFGAS 150
GluN2B_rato
GluN2B_humano
GluN2A_humano
IEQQASVMLNIMEEYDWYIFSIVTTYFPGYQDFVNKIRSTIENSFVGWELEEVLLLDMSL 209
IEQQASVMLNIMEEYDWYIFSIVTTYFPGYQDFVNKIRSTIENSFVGWELEEVLLLDMSL 209
IQQQATVMLKIMQDYDWHVFSLVTTIFPGYREFISFVKTTVDNSFVGWDMQNVITLDTSF 210
GluN2B_rato
GluN2B_humano
GluN2A_humano
DDGDSKIQNQLKKLQSPIILLYCTKEEATYIFEVANSVGLTGYGYTWIVPSLVAGDTDTV 269
DDGDSKIQNQLKKLQSPIILLYCTKEEATYIFEVANSVGLTGYGYTWIVPSLVAGDTDTV 269
ED--AKTQVQLKKIHSSVILLYCSKDEAVLILSEARSLGLTGYDFFWIVPSLVSGNTELI 268
GluN2B_rato
GluN2B_humano
GluN2A_humano
PSEFPTGLISVSYDEWDYGLPARVRDGIAIITTAASDMLSEHSFIPEPKSSCYNTHEKRI 329
PAEFPTGLISVSYDEWDYGLPARVRDGIAIITTAASDMLSEHSFIPEPKSSCYNTHEKRI 329
PKEFPSGLISVSYDDWDYSLEARVRDGIGILTTAASSMLEKFSYIPEAKASCYGQMERPE 328
GluN2B_rato
GluN2B_humano
GluN2A_humano
YQSNMLNRYLINVTFEGRDLSFSEDGYQMHPKLVIILLNKERKWERVGKWKDKSLQMKYY 389
YQSNMLNRYLINVTFEGRNLSFSEDGYQMHPKLVIILLNKERKWERVGKWKDKSLQMKYY 389
VPMHTLHPFMVNVTWDGKDLSFTEEGYQVHPRLVVIVLNKDREWEKVGKWENHTLSLRHA 388
GluN2B_rato
GluN2B_humano
GluN2A_humano
VWPRM 394
VWPRM 394
VWPRY 393
*
*
Figura 22: Alinhamento estrutural da sequência primária da região N-terminal da subunidade GluN2B
de Rattus norvegicus (estrutura cristalográfica 3JPW), GluN2B de humano e GluN2A de humano. Em
rosa estão destacados os resíduos conservados no grupo. * marca os resíduos substituídos entre a
estrutura de rato e humano.
A validação dos modelos foi realizada com base na análise do gráfico de
Ramachandran, Verify 3D e ProSA. O gráfico de Ramachandran dos modelos mostrou a
maior parte dos resíduos nas regiões mais favoráveis (GluN2A = 84,2% e GluN2B = 84%),
semelhante ao molde usado (código PDB = 3JPW), com 83,2% em regiões mais favoráveis,
enquanto que nenhum resíduo ficou em região desfavorável (Tabela 4).
90
Tabela 4: Análise dos gráficos de Ramachandran da estrutura cristalográfica do N-terminal
de GluN2B do receptor de NMDA de rato e do modelo de GluN2B de humano.
3JPW
GluN2A
GluN2B
Regiões
Regiões
Regiões
Estruturas
favoráveis
permitidas
desfavoráveis
3JPW (molde)
83,2%
16,8%
0%
GluN2A (modelo)
84,2%
15,8%
0%
GluN2B (modelo)
84,0%
16,0%
0%
Na análise do perfil no Verify-3D, foi observado um score 3D-1D acima de -0,1 para o
molde e para os modelos, sendo que, no caso do molde (3JPW) 93,89% dos resíduos estavam
acima de 0,2. O modelo de GluN2A de humano apresentou 92,86% > 0,2 e de GluN2B de
humano, 94,51% > 0,2, o que mostra que os modelos apresentaram valores favoráveis e no
caso de GluN2B, até maior do que o molde (Figura 23).
91
Figura 23: Gráfico do Verify-3D mostrando a confiabilidade dos modelos do domínio N-terminal do
receptor de NMDA. O modelo de GluN2A de H. sapiens é apresentado em vermelho, GluN2B, em
verde e a estrutura cristalográfica de GluN2B de Rattus norvegicus, em azul.
Foi feita a análise do score-Z no ProSA que mostrou os modelos de GluN2A (-9,34) e
de GluN2B (-8,89) com valores semelhantes ao molde (-8,31) e às estruturas experimentais
(raios-x e RMN) disponíveis no PDB (Figura 24).
Figura 24: Análise do score-Z das estruturas do N-terminal do receptor de NMDA. A estrutura de
GluN2B de Rattus norvegicus (3JPW) é mostrada em preto, GluN2B de humano em vermelho e
GluN2A de humano em amarelo.
92
O gráfico de energia que indica a qualidade local dos modelos (Figura 25) mostrou
todos os resíduos dos modelos de GluN2A e GluN2B com energia menor do que zero quando
observado o gráfico suavizado (em verde) pelo cálculo da média de energia de cada
fragmento de 40 resíduos, sendo este valor estabelecido para o resíduo na posição i +19
(WIEDERSTEIN e SIPPL, 2007). Estes dados são consistentes com os parâmetros de uma
proteína típica e semelhantes ao molde que ainda apresentou alguns resíduos com energia
acima de zero e alta energia (vermelho) na representação dos resíduos de acordo com a
energia. Estes resíduos se encontravam em uma alça próxima às posições 210 até 213,
ausentes na estrutura do cristal (Figura 25).
Figura 25: Na parte superior, gráfico de energia mostrando a energia independente de cada resíduo
(verde claro) e a média da energia dos resíduos em função de um resíduo central (verde escuro). Na
parte inferior, a estrutura das proteínas mostrando as regiões de menor energia em azul e regiões de
maior energia em vermelho. A) Molde (3JPW). B) GluN2A e C) GluN2B.
Desta forma, foi realizado o docking do ifemprodil usando o programa Autodock 4.2
para avaliar as interações e determinar características estruturais importantes para a atividade
93
biológica. Recentemente foi demonstrado que o ifemprodil, um derivado de feniletanolamina,
pode se ligar a um sítio de alta afinidade (Ki ≈ 0,2-1 μM), localizado no N-terminal
(GALLAGHER, 1996; WILLIAMS, 1993; MONY et al, 2009).
Estudos recentes de mutação sítio dirigida mostraram resíduos em uma cavidade
hidrofóbica (Ile150, Phe176, Phe182, Tyr231 e Leu261) que parecem ser importantes para a
atividade do ifemprodil (Figura 26). EA mutação detes resíduos por alanina foi capaz de
reduzir significativamente a sensibilidade do ifemprodil quando mutados por alanina, por
exemplo (KARAKAS, et al., 2009; PERIN-DUREAU et al., 2002; ALARCON et al., 2008;
MONY et al, 2009).
Essa região parece ser importante para a interação com ifemprodil, e, possivelmente,
para outros antagonistas não-competitivos. Desta forma, foi realizado o docking do ifemprodil
com cada uma das subunidades GluN2A e GluN2B do receptor de NMDA humano, de modo
a estabelecer uma comparação. O grid foi posicionado no centro da proteína, e incluía a
região do bolso hidrofóbico, onde seria o potencial sítio de ação, próxima aos resíduos
descritos como importantes para a interação com o ifemprodil (Figura 26).
Figura 26: Estrutura do N-terminal da subunidade GluN2B. Em rosa estão destacados os resíduos que
formam o bolso hidrofóbico (Ile 150, Phe 176, Phe 182, Tyr 231 e Leu 261).
94
A conformação de menor energia do maior cluster obtida do docking do ifemprodil
com cada subunidade (GluN2A e GluN2B) encontrou-se próxima a este sítio hidrofóbico
presente no domínio N-terminal, apesar do modo de ligação ter sido invertido (Figura 27).
Figura 27: Docking do ifemprodil no domínio N-terminal de GluN2A (rosa) e GluN2B (verde).
No complexo com GluN2A foram observados os seguintes resíduos a 4 Å do
ifemprodil Asp103, Thr104, Asp105, His128, Gly129, Gly130, Ser132, Met133, Ile134,
Gln146, Phe147, Phe147, Gly148, Ala149, Gln154, Ser259, Leu260, Gly263, Asn264,
Tyr281, Asp282, Tyr355, dos quais Thr104 e Ser259 interagem por ligação de hidrogênio.
No complexo com GluN2B, Asp101, Asp102, Thr103, Ile126, His127, Gly128,
Ser131, Met132, Ile133, Phe146, Gly147, Pro148, Gln153, Ser260, Leu261, Gly264, Asp265,
Tyr282, Asp283 e Arg292 estavam a cerca de 4 Å dos quais Gln153, Ile133 e Phe146
interagem por ligação de hidrogênio.
Apesar de ter sido relatado na literatura uma diferença de afinidade do ifemprodil de
até 100 vezes maior para o GluN2B do que para o GluN2A, neste estudo a energia de ligação
estimada no programa Autodock 4.2 foi muito semelhante (GluN2B = -6,64 e GluN2A = 6,41), não sendo vista nenhuma particularidade que justificasse esta diferença de afinidade.
95
Recentemente, Karakas e colaboradores (2011) conseguiram obter a estrutura
cristalográfica do domínio N-terminal de GluN2B do receptor de NMDA de Rattus
norvegicus ligada ao ifemprodil, e a outro antagonista, Ro25-6981. Ambos se ligaram de de
forma similar e a partir deste estudo foi demonstrado que o ifemprodil se ligava em uma
região entre GluN2B e GluN1, interagindo com ambas subunidades. Sendo assim, foi
analisado o sítio de ligação ao ifemprodil comparando a subunidade GluN2B com GluN2A
(KARAKAS et al., 2011).
A estrutura do ifemprodil ligada ao receptor na estrutura cristalográfica (3QEL)
apresenta uma conformação estendida medindo cerca de 15 Å. Desta forma, foi feita uma
análise dos resíduos localizados até 15 Ǻ do centro do ligante (átomo de nitrogênio) de
GluN2B e GluN2A e foram observadas as substituições nos seguintes resíduos Ile81, Ile108,
Ile111, Ala117, Gln118, ser130, Gln180, Asp181, Leu204, Leu209, Thr233 e Glu235 de
GluN2B (Quadro 5).
Quadro 5: Resíduos de aminoácidos da subunidade GluN2B do receptor de NMDA a 15 Å do átomo
de nitrogênio do ifemprodil e os resíduos alinhados na subunidade GluN2A. Em vermelho estão
aqueles que divergem entre uma subunidade e outra.
Estrutura
GluN2B
Resíduos a Thr76, Asp77, Pro78, Lys79,
15 Å do Ile81, Ile82, Asp101, Thr103,
ifemprodil
Asp104, Gln105, Glu106, Ala107,
Ile108, Ala109, Gln110, Ile111,
Leu112, Asp113, Phe114, Ile115,
Ser116, Ala117, Gln118, Gly128,
Gly129, Ser130, Ser131, Met132,
Ile133, Met134, Ala135, Asp136,
Lys137, Asp138, Phe143, Gln145,
Ile150, Thr173, Thr174, Tyr175,
Phe176, Pro177, Gly178, Tyr179,
Gln180, Asp181, Leu204, Leu205,
Asp206, Met207, Ser208, Leu209,
Tyr231, Cys232, Thr233, Lys234,
Glu235, Glu236, Ala237, Leu261
Resíduo alinhado em GluN2A
Thr77, Asp78, Pro79, Lys80,
Leu82, Ile83, Asp102, Thr104,
Asp105, Gln106, Glu107, Ala108,
Val109, Ala110, Gln111, Met112,
Leu113, Asp114, Phe115, Ile116,
Ser117, Ser118, His119, Gly129,
Gly130, Ala131, Ser132, Met133,
Ile134, Met135, Ala136, Asp137,
Lys138, Asp139, Phe144, Gln146,
Ile151, Thr174, Thr175, Ile176,
Phe177, Pro178, Gly179, Tyr180,
Arg181, Glu182, Thr205, Leu206,
Asp207, Thr208, Ser209, Phe210,
Tyr232, Cys233, Ser234, Lys235,
Asp136, Glu237, Ala238, Leu261
96
Alguns destes aminoácidos se encontram mais próximos do ligante podendo interagir
diretamente com o ifemprodil e outros, mais distantes, interagem, provavelmente, de forma
indireta, influenciando na posição de resíduos que interagem diretamente com o ligante.
Assim, esses resíduos podem ser responsáveis pela diferença de afinidade das
feniletanolaminas pelas subunidades GluN2A e GluN2B do receptor de NMDA.
Antes de realizar o docking com outros antagonistas não-competitivos, foi feito o
redocking do ifemprodil no sítio de ligação localizado entre a região N-terminal de GluN2B e
da subunidade GluN1, para validar o método. Assim, foi observada uma similaridade na
conformação e no modo de ligação do ifemprodil com o receptor que interagiu na mesma
posição (Figura 28).
Figura 28: Redocking do ifemprodil no receptor de NMDA. Em amarelo a estrutura obtida por docking
e em vermelho a estrutura cristalográfica de GluN1/GluN2B em complexo com ifemprodil (3QEL).
A partir disto, foi realizado o docking do ifemprodil com o dímero GluN1/GluN2A
obtido por modelagem comparativa para comparar com a estrutura cristalográfica do dímero
GluN1/GluN2B ligada ao ifemprodil
Os resultados obtidos revelaram um modo de interação diferente do ifemprodil com
GluN2A em comparação com GluN2B, em que os anéis aromáticos do ligante estão em
97
posição invertida e a conformação do ligante está mais dobrada. A distância entre os anéis
aromáticos foi de cerca de 12 Ǻ em GluN2B, enquanto em GluN2A foi de cerca de 9 Ǻ
(Figura 29).
Figura 29: Interação do ifemprodil com o domínio N-terminal. Em branco o ifemprodil ligado a
GluN2B (código PDB 3QEL) e em laranja docking com o modelo de GluN2A.
A energia de ligação quando se comparou o complexo formado entre o ifemprodil e a
subunidade GluN2A obtida por docking e o complexo obtido pelo redocking com a
subunidade GluN2B foi semelhante (-5,11 e -5,82 respectivamente), sendo um pouco menor
no caso da subunidade GluN2B.
A análise das interações de GluN1/GluN2B com o ifemprodil mostra que os resíduos
Tyr109, Thr110, Arg115, Ser132, Ile133, Leu135 estão a cerca de 4Ǻ do ligante na
subunidade GluN1, sendo que Ser132 fazia ligação de hidrogênio com esta subunidade
enquanto Ala107, Gln110, Ile111, Phe114, Thr174, Tyr175, Phe176, Pro177 e Glu236 estão a
cerca de 4Ǻ com GluN2B, sendo que Gln110 e Glu236 faziam ligação de hidrogênio. No caso
de GluN1/GluN2A foram observados os resíduos Tyr109A, Thr110A, Ala75A, Tyr114A,
98
Lys80A, Cys329A, Cys79A, Gly112, Phe113 e Ile133A, a 4Å de GluN1 e Pro79, Phe115,
Met112, Ala108 e Gln111 a 4 Å de GluN2B enquanto Thr110 e Tyr114 interagem por ligação
de hidrogênio com GluN1 e Lys80 com GluN2B (Figura 30).
Figura 30: Região de interação do ifenprodil no NMDAR mostrando os resíduos de aminoácidos que
estão localizados a cerca de 4Å do ifemprodil. Os traços verdes mostram resíduos interagindo por
ligação de hidrogênio. A) Estrutura cristalográfica de GluN1/GluN2B. B) Modelo de GluN1/GluN2A.
Os resíduos da subunidade GluN1 estão identificados com a letra A no final do código e número do
resíduo de aminoácido e os da subunidade GluN2 com a letra B.
99
Como é possível observar, os resíduos que estão envolvidos em ligação de hidrogênio
foram diferentes. Alguns resíduos que interagiram por van der Waals foram os mesmos
Tyr109, Thr110, Ile133, Ala107, Gln110 e Phe114 (numeração de GluN2B), enquanto
Tyr109 foi substituída por isoleucina em GluN2A, o que corresponde à troca de um
aminoácido polar por um apolar, e Ile111 foi substituída por metionina, esta troca de um
aminoácido apolar por um contendo enxofre pode trazer características diferentes ao sítio
ativo.
Neste trabalho, foi realizado o docking da fenil-amidina 1a, o composto mais ativo
descrito no estudo de Claiborne e colaboradores (2003), e das triazolil-amidinas 2a, 2e e 2f
planejadas anteriormente por nosso grupo (Abreu, 2008), com o receptor. Este estudo
pretendeu avaliar as possíveis interações possíveis e estabelecer uma comparação entre as
energias de ligação, e correlacionar estes dados com a atividade biológica, o que pode auxiliar
no desenho de novas moléculas.
A molécula 2a foi escolhida por ter sido sintetizada e testada quanto ao efeito
neuroprotetor em neurônios frente à morte celular provocada pelo glutamato e as moléculas
2e e 2f porque, dentre os derivados planejados, estes foram preditos com maior potência
(ABREU, 2008) (Tabela 5).
100
Tabela 5: Estrutura e atividade biológica experimental (pIC50Exp) e predita (pIC50pred) da fenilamidinas 1a e das triazolil-amidinas 2a, 2e e 2f e energia de ligação (EL) estimada.
#
Estrutura
NH
pIC50 Predb
ELc
8,39
8,12
-4,02
ND
7,71
-6,23
ND
8,46
-5,74
ND
9,41
-6,74
OCH3
N
H
1a
pIC50 Expa
F3CO
NH
N
N
N
2a
N
H
NH
2e
N
H
H3CO
N
N
N
NH
2f
a
N
N
N
N
H
N
N
N
descrito na literatura (Claiborne et al, 2003). .bavaliado por nosso grupo usando QSAR em estudo anterior (Abreu, 2008).
c
energia de ligação estimada pelo docking no programa Autodock.
ND = não determinado
Em todas as triazolil-amidinas, os resíduos Tyr109, Thr110, Phe113, Ser132 e Ile133
se encontravam a 4 Å de GluN1, enquanto Pro78, Ala107, Gln110, Ile111 e Phe114 de
GluN2B. Todas as amidinas, exceto 2f, fazem ligação de hidrogênio com Phe113. 2a e 2f
apresentaram ligação de hidrogênio com o resíduo Gln110, assim como o ifemprodil,
enquanto 2a e 2e com Tyr109 (Quadro 6 e Figura 31).
101
Quadro 6: Comparação dos resíduos envolvidos nas interações com os ligantes (ifemprodil, fenilamidina 1a e triazolil-amidina 2a, 2e e 2f) na estrutura de GluN1/GluN2B obtida por cristalografia. Os
resíduos em vermelho fazem interação com o ligante por ligação de hidrogênio.
Ligante
Resíduos a 4 Å do ligante em
Resíduos a 4 Å do ligante em GluN2B
GluN1
ifemprodil Thr110, Tyr109, Ile133, Leu135, Ala107, Gln110, Ile111, Phe114,
Arg115, Ser132
Thr174, Tyr175, Phe176, Pro177,
Glu236
Ser108, Tyr109,
Glu106, Ala107, Gln110, Glu235
1a
Gly112, Phe113, Arg115, Ile133,
Thr333, Asn334, Ile335
Tyr109, Thr110, Gly112, Phe113, Pro78, Ile82, Ala107, Gln110, Ile111,
2a
Ser132, Ile133
Phe114, Met134, Pro177
Ser108, Tyr109, Thr110, Gly112, Pro78, Ala107, Gln110, Ile111, Phe114,
2e
Phe113, Ser132, Ile133, Leu135
Pro177
Tyr109, Thr110, Phe113, Ser132, Pro78, Ile82, Ala107, Gln110, Phe114,
2f
Ile133
Met134 Ala135, Asp136, Ile111
Figura 31: Principais resíduos de aminoácidos de GluN1/GluN2B interagindo com A) fenil-amidina
1a, B) triazolil-amidina 2a, C) triazolil-amidina 2e, D) triazolil-amidina 2f. Tracejado verde representa
as ligações de hidrogênio.
102
Todas as fenil-amidinas planejadas apresentaram energia de ligação menor do que a
fenil-amidina mais ativa do outro estudo (Tabela 5). A menor energia de ligação foi obsevada
no complexo com 2f que também havia sido predita com melhor atividade no estudo anterior.
O derivado 2f foi o que apresentou menos ligações de hidrogênio, o que sugere a importância
das interações mais fracas para o encaixe no receptor (Figura 31 e Quadro 6).
Os ligantes interagiram em regiões equivalentes no receptor e ao menos um dos anéis
fenila dos antagonistas estava alinhado em todos casos, exceto o do ligante 1a. A
conformação biologicamente ativa do ifemprodil é mais estendida, enquanto a fenil-amidina,
torcida em uma direção, em contraste com as triazolil-amidinas que aparecem em direção
oposta (Figura 32). Desta forma, os ligantes parecem interagir com alguns resíduos de
aminoácidos diferentes do sítio ativo.
Figura 32: Comparação do modo de ligação dos ligantes não competitivos ao receptor de NMDA.
Ifemprodil (vermelho), fenil-amidina 1a (laranja) e as triazolil-amidinas 2a (verde), 2e (azul) e 2f
(rosa).
Foi observado que as triazolil-amidinas 2a e 2f, ambas com anéis fenila não
substituídos, apresentaram energia de ligação de -6,23 e -6,74, respectivamente, o que foi
menor do que a energia de ligação do ifemprodil (-5,82).
103
4.2 Modelagem molecular para desenvolvimento de antivirais
4.2.1 Estudo da relação estrutura-atividade
A atividade anti-herpes foi medida pela dose infectante em cultura de tecido (TCID50),
na qual a diluição viral promove efeito citopático em 50% das células, sendo avaliada pelo
decréscimo do título viral na presença dos derivados (ABREU et al., 2011). De acordo com a
análise do potencial antiviral contra HSV1 da nova série de oxoquinolinas (2a, 2b, 3a, 3b, 4a,
4b, 5a, 5b), o derivado mais promissor foi 3b (Figura 33 e 34).
Figura 33: Estruturas dos derivados oxoquinolínicos testado contra HSV-1.
TCID50/ml x 105
104
Figura 34: Avaliação biológica da atividade anti-HSV-1 dos derivados oxoquinolínicos (2a, 2b, 3a,
3b, 4a, 4b, 5a, 5b e do aciclovir) medida pela dose infectante em cultura de tecido (TCID50) (ABREU
et al., 2010).
O
estudo
da
relação
estrutura-atividade
revelou
algumas
propriedades
estereoeletrônicas relacionadas com a atividade anti-herpes como área de superfície molecular
e volume molecular, onde os derivados com maior potência (3b e 4a) apresentaram menores
valores (Figura 35 e Tabela 11).
A maior atividade de 3b comparando com os outros derivados pode estar relacionada à
menor energia de LUMO (maior caráter eletrofílico), menor lipofilicidade e maior área de
superfície polar e número de grupos aceptores e doadores de ligação de hidrogênio, visto que
estes parâmetros têm sido descritos como importantes para o reconhecimento pelo alvo
(Figura 35 e Tabela 11).
105
Figura 35: Característica estrutural e eletrônica dos derivados oxoquinolínicos (2a, 2b, 3a, 3b, 4a, 4b,
5a, 5b). A) Representação em CPK da conformação mais estável (cinza= carbono, branco =
hidrogênio, vermelho = oxigênio, azul = nitrogênio, verde = flúor, laranja = cloro). B) Mapa de
potencial eletrostático molecular (direita) e densidade de potencial (esquerda). As cores do mapa de
potencial estão na faixa de -150 a + 150 kJ/mol, regiões tendendo para o azul são mais positivas e para
o vermelho, mais negativas.
Interessantemente, o derivado mais bioativo 3b apresentou um perfil diferente dos
demais. As diferenças entre 3a (R1 = Cl) e 3b (R1 = F) envolvendo seus perfis de atividade e
mapas de potencial eletrostático apontam para a importância do átomo de flúor (menor
volume e maior eletronegatividade) como substituinte para a atividade biológica. A
comparação de 3b com 2b e 5b, com diferentes substituintes na posição 3 do grupo
oxoquinolina, sugere um provável impedimento estérico em 2b e 5b devido ao volume e
distribuição de cargas específica dos substituintes (Figura 35 e Tabela 6).
106
Tabela 6: Propriedades estereoeletrônicas das oxoquinolinas, incluindo parâmetros estéricos - volume
molecular (VM, Å3), massa molecular (MM, g/mol), área superfícial molecular (ASM, Å2), área de
superfície polar (ASP = Å2) e número de ligações rotacionáveis (nLR), parâmetros eletrônicos energia de HOMO/LUMO (EHOMO e ELUMO = eV) e parâmetros farmacocinéticos - número de
aceptores/doadores de ligação de hidrogênio (nALH e nDLH) e coeficiente de partição octanol/água
calculado (cLogP).
# EHOMO ELUMO ASM
VM
MM
cLogP nALH nDLH ASP nRot
2a
-8,84
1,62
333,07 305,93 325,75
1,02
6
1
59,44
7
2b
-8,9
1,62
325,01 297,59 309,29
0,47
6
1
59,55
7
3a
-8,92
1,46
309,63 281,70 311,72
-1,07
7
4
93,72
5
3b
-8,98
1,46
300,57 273,31 295,27
-1,62
7
4
93,71
5
4a
-7,79
2,07
289,84 267,32 260,29
0,82
5
2
57,81
4
4b
-8,58
1,88
305,73 278,64 286,29
1,98
7
0
75,09
5
5a
-8,82
1,53
398,28 374,63 386,83
1,48
6
2
61,53
7
5b
-8,83
1,52
389,27 366,25 370,38
0,93
6
2
61,54
7
4.2.2 Estudo da relação da estrutura com a citotoxicidade
Um estudo da relação estrutura-toxicidade dos derivados foi realizado para avaliar as
características relacionadas a um perfil de menor citoxicidade.
A análise do efeito citopático em células Vero (CC50) mostrou que o derivado 2b foi o
menos citotóxico, seguido de 3b, 3a e 5b que não apresentaram citotoxidade significativa na
maior concentração usada (1000 μM). Todos os derivados de oxoquinolinas eram menos
tóxicos do que aciclovir (860 μM) (ABREU et al., 2011) (Figura 36).
107
Figura 36: Avaliação do perfil citotóxico (CC50) dos derivados oxoquinolínicos (ABREU et al.,
2011).
Foi observado que as cloro-oxoquinolinas foram mais tóxicas do que as flúoroxoquinolinas, o que pode ser observado pela comparação entre 2a (R1 = Cl), 2b (R1 = F), 3a
(R1 = Cl) e 3b (R1 = F), 5a (R1 = Cl) e 5b (R1 = F). Este fato pode estar relacionado à maior
lipofilicidade do cloro, o que poderia levar a maior penetração através das membranas. O
derivado de oxoquinolina mais ativo, 3b, apresentou o segundo menor perfil de toxicidade,
inclusive menor do que o aciclovir, um antiviral de uso clínico, nos ensaios in vitro (Figura
36).
4.2.3 Análise in silico das propriedades farmacocinéticas
Neste trabalho, a série de derivado de oxoquinolina foi avaliada segundo a “regra dos
cinco” de Lipinski, que envolve a análise de diferentes parâmetros e a probabilidade de que
um composto químico tenha boa biodisponibilidade quando administrado por via oral em
humanos (LIPINSKI et al., 2001). Os resultados mostraram que todos os derivados
preencheram esta regra (MM = 260,29 – 386,83 g/mol, cLogP = -1,62–1,98, nALH = 5–7 e
108
nDLH = 0–4). Além disso, foi calculada a área de superfície polar (57,81-93,72 Å2) que deve
ser menor do que 140Å2 e número de ligações rotacionáveis (4-7), que deve ser menor do que
10. Estes valores indicam, por conseguinte, que esta série deve apresentar uma boa
biodisponibilidade oral (Tabela 7).
Além disso, foi feita a avaliação da “regra dos cinco” de Lipinski modificada para
penetração no SNC, que mostrou que todos os derivados contemplam ao menos, três
requisitos desta regra. Apenas 3a e 3b tiveram número de doadores de ligação de hidrogênio
maior do que o preconizado pela regra. Foi feita uma análise na base de dados PK/DB para
predição de propriedades farmacocinéticas e comparou-se com o aciclovir, o principal
fármaco anti-herpes usado atualmente (Tabela 7).
Tabela 7: Valores das propriedades farmacocinéticas obtidas in silico para os derivados de
oxoquinolinas e o aciclovir. Absorção intestinal humana (Human intestinal absorption - HIA),
biodisponibilidade oral (F), ligação a proteínas plasmáticas (plasmatic protein binding - PPB),
coeficiente de partição cérebro-sangue que avalia a penetração na barreira hematoencefálica (Log BB),
solubilidade em água (Log S). Os valores de HIA, F e PPB são fornecidos em percentagem da dose
administrada de um composto. S é a solubilidade em água à temperatura de 20-25ºC em mol/l.
#
HIA (%)
F (%)
PPB (%)
Log BB
Log S
2a
89,64
53,44
43,12
-0,78
-2,91
2b
89,31
55,27
40,22
-0,71
-2,54
3a
81,86
50,75
43,91
-0,78
-2,64
3b
81,53
52,75
41,00
-0,71
-2,28
4a
77,14
51,39
38,99
-0,15
-3,57
4b
95,66
49,59
47,50
-0,08
-3,65
5a
91,66
60,71
67,00
-0,73
-4,08
5b
91,34
61,59
64,10
-0,60
-3,71
Aciclovir
29,30
21,35
24,96
-1,29
-1,72
109
Com relação à biodisponibilidade oral (F), é possível separar basicamente três grupos
de fármacos (aqueles com baixa biodisponibilidade apresentam valores ≤ 40%, média = 4180% e alta ˃ 80%) (MODA et al., 2007). Os derivados de oxoquinolinas apresentaram uma
biodisponibilidade média enquanto o aciclovir apresentou uma baixa biodisponibilidade.
A absorção intestinal (HIA) de um fármaco administrado por via oral está relacionada
a permeabilidade, ou seja, a capacidade da molécula de atravessar as membranas antes de ser
distribuída pelo organismo e chegar ao sítio ativo. Nesta série, o percentual de HIA variou
nesta série de 77,14% a 95,66%, sendo maior do que a do aciclovir (29,30%). Os valores de
Log BB sugerem uma maior penetração na barreira hematoencefálica no caso dos derivados
de oxoquinolinas do que do aciclovir. Log S foi menor do que do aciclovir indicando menor
solubilidade em água dos derivados (Tabela 7). Além disso, foi avaliada a ligação a proteínas
plasmáticas, o que é importante porque determina a fração da molécula biodisponível livre
distribuída por vários tecidos. Os valores variaram de 38,99 a 67,00, sendo maior do que o
aciclovir, o composto mais potente 3b teve um dos menores valores. A análise destes
parâmetros é importante, uma vez que está diretamente relacionada à absorção, metabolismo,
distribuição e excreção.
4.3 Modelagem Molecular para desenvolvimento de antifúngicos
4.3.1 Predição da estrutura tridimensional da CYP51
O alinhamento da sequência primária da CYP51 de Cryptococcus neoformans com
proteínas da mesma família de outros micro-organismos (Coccidioides immitis, Aspergillus
fumigatus, Candida albicans, C. tropicalis, Saccharomyces cerevisae, Pneumocistis jiroveci,
110
Mus musculus, Rattus norvegicus, Homo sapiens, Trypanosoma cruzi, Leishmania major e
Mycobacterium tuberculosis) revelou um percentual de identidade global variando de 25% a
46% (Tabela 8). Apesar de baixa identidade na estrutura primária, a estrutura secundária da
CYP51 é conservada entre as proteínas da família que também apresentaram um
enovelamento similar conforme observado para as proteínas que têm a estrutura elucidada por
cristalografia e difração de raios-X (Tabela 8 e Figura 37).
O modelo tridimensional foi construído a partir deste alinhamento, sendo usado como
molde a estrutura cristalográfica da CYP51 de humanos (código PDB = 3LD6) com
percentual de identidade de 36% (Tabela 8). Além disso, comparando o sítio ativo da CYP51
de H. sapiens e de M. tuberculosis, na região até 10 Ǻ de distância do átomo de ferro do
heme, observou-se que a enzima de C. neoformans apresentava maior identidade na sequência
de aminoácidos com a humana (75%) do que com a de M. tuberculosis (55%). Isso indica que
o molde H. sapiens seria a melhor escolha para predizer a estrutura do que M. tuberculosis,
visto que apresenta mais resíduos idênticos na proteína inteira (Tabela 8) e também no sítio
ativo (Quadro 7).
111
C.
C.
A.
C.
C.
S.
P.
M.
R.
H.
T.
L.
M.
neoformans
immitis
fumigatus
albicans
tropicalis
cerevisiae
jiroveci
musculus
norvegicus
sapiens
cruzi
major
tuberculosis
KDLPPVVFHYIPWFGSAAYYGEDPYKFLFECRDKYG-DLFTFILMGRRITVALGPKGNNLS
GAKPPVVFHWVPFIGSAISYGLDPYRFFTSCREKYG-DIFTFVLLGRKVTVYLGVKGNEFI
RTEPPMVFHWVPFLGSTISYGIDPYKFFFACREKYG-DIFTFILLGQKTTVYLGVQGNEFI
KDRAPLVFYWIPWFGSAASYGQQPYEFFESCRQKYG-DVFSFMLLGKIMTVYLGPKGHEFV
KDRVPMVFYWIPWFGSAASYGMQPYEFFEKCRLKYG-DVFSFMLLGKVMTVYLGPKGHEFI
KDRPPLVFYWIPWVGSAVVYGMKPYEFFEECQKKYG-DIFSFVLLGRVMTVYLGPKGHEFV
SSKPPVVFHWLPFIGSTIQYGMDPYKFFQKQKKKHG-NIFTFILLGKKMTVALGPKGNDIL
AKSPPHIYSPIPFLGHAIAFGKSPIEFLENAYEKYG-PVFSFTMVGKTFTYLLGSDAAALL
AKSPPYIYSPIPFLGHAIAFGKSPIEFLENAYEKYG-PVFSFTMVGKTFTYLLGSDAAALL
VKSPPYIFSPIPFLGHAIAFGKSPIEFLENAYEKYG-PVFSFTMVGKTFTYLLGSDAAALL
PTDPPVYPVTVPFLGHIVQFGKNPLEFMQRCKRELKSGVFTISIGGQRVTIVGDPHEHSRF
PTDPPVVHGAMPFVGHIIQFGKDPLDFMLNAKKKYG-GVFTMNICGNRVTVVGDVHQHNKF
AVALPRVSGGHDEHGHLEEFRTDPIGLMQRVRDECG-DVGTFQLAGKQVVLLSGSHANEFF
117
98
93
104
104
112
101
117
117
117
89
88
62
C.
C.
A.
C.
C.
S.
P.
M.
R.
H.
T.
L.
M.
neoformans
immitis
fumigatus
albicans
tropicalis
cerevisiae
carinii
musculus
norvegicus
sapiens
cruzi
major
tuberculosis
LGGKISQVSAEEAYTHLTTPVFGKGVVYDCPNEMLMQQKKFIKSGLTTESLQSYPPMITS
LNGKLQDVNAEEVYSPLTTPVFGSDVIYDCPNQKLMEQKKFIKFGLSSEALASYVPLIQH
LNGKLKDVNAEEVYSPLTTPVFGSDVVYDCPNSKLMEQKKFIKYGLTQSALESHVPLIEK
FNAKLSDVSAEDAYKHLTTPVFGKGVIYDCPNSRLMEQKKFAKFALTTDSFKRYVPKIRE
YNAKLSDVSAEEAYTHLTTPVFGKGVIYDCPNSRLMEQKKFAKFALTTDSFKTYVPKIRE
FNAKLADVSAEAAYAHLTTPVFGKGVIYDCPNSRLMEQKKFVKGALTKEAFKSYVPLIAE
FNGKLSSLSAEEAYTHLTTPVFGTDVVYDVPNHVLMEQKKFVKTGFTIETFRAYVPLIIE
FNSKNEDLNAEEVYGRLTTPVFGKGVAYDVPNAIFLEQKKIIKSGLNIAHFKQYVPIIEK
FNSKNEDLNAEEVYGRLTTPVFGKGVAYDVPNAVFLEQKKILKSGLNIAHFKQYVSIIEK
FNSKNEDLNAEDVYSRLTTPVFGKGVAYDVPNPVFLEQKKMLKSGLNIAHFKQHVSIIEK
FSPRNEILSPREVYT-IMTPVFGEGVAYSAPYPRMREQLNFLAEELTIAKFQNFVPAIQH
FTPRNEILSPREVYS-FMVPVFGEGVAYAAPYPRMREQLNFLAEELTVAKFQNFAPSIQH
FRAGDDDLDQAKAYP-FMTPIFGEGVVFDASPERRKE--MLHNAALRGEQMKGHAATIED
177
158
153
164
164
172
161
177
177
177
148
147
119
C.
C.
A.
C.
C.
S.
P.
M.
R.
H.
T.
L.
M.
neoformans
Immitis
fumigatus
albicans
troplicalis
cerevisiae
carinii
musculus
norvegicus
sapiens
cruzi
major
tuberculosis
ECEDFFTKEVGIS-PQKPSATLDLLKAMSELIILTASRTLQGKEVRESLNG-QFAKYYED
EVEQYIASSPHFK---GESGTMNVLQVMAEITILTAARTLQGEEVRSKLDS-SFANYYHD
EVLDYLRDSPNFQ---GSSGRMDISAAMAEITIFTAARALQGQEVRSKLTA-EFADLYHD
EILNYFVTDESFKLKEKTHGVANVMKTQPEITIFTASRSLFGDEMRRIFDR-SFAQLYSD
EVLNYFVNDVSFKTKERDHGVASVMKTQPEITIFTASRCLFGDEMRKSFDR-SFAQLYAD
EVYKYFRDSKNFRLNERTTGTIDVMVTQPEMTIFTASRSLLGKEMRAKLDT-DFAYLYSD
EVKTYLETSPIFG-KDKLSGVSSLMKALPEITIFTASRTLQGKEVRSNFDA-SFAKLYHD
EAKEYFQS-------WGESGERNVFEALSELIILTASHCLHGKEIRSQLNE-KVAQLYAD
EAKEYFKS-------WGESGERNVFEALSELIILTASHCLHGKEIRSQLNE-KVAQLYAD
ETKEYFES-------WGESGEKNVFEALSELIILTASHCLHGKEIRSQLNE-KVAQLYAD
EVRKFMAEN-----WKKDEGVINLLEDCGAMIINTACQCLFGEDLRKRLNARHFAQLLSK
EVRKFMKAN-----WNKDEGEINILDDCSAMIINTACQCLFGEDLRKRLDARQFAQLLAK
QVRRMIAD-------WGEAGEIDLLDFFAELTIYTSSACLIGKKFRDQLDG-RFAKLYHE
235
214
209
223
223
231
219
229
229
229
203
202
171
C.neoformans
C. immitis
A. fumigatus
C. albicans
C. troplicalis
S. cerevisiae
P. carinii
M. musculus
R. norvegicus
H. sapiens
T. cruzi
L. major
M. tuberculosis
LDGGFTPLNFMFP---NLPLPSYKRRDEAQKAMSDFYLKIMENRRK--GESDHEHDMIEN
LDSGFTPINFLLP---WAPLPHNRKRDAAHKKMRDVYMDIIKKRRISGQE--RGHDMLWN
LDKGFTPINFMLP---WAPLPHNKKRDAAHARMRSIYVDIIKQRRLDGDKDSQKSDMIWN
LDKGFTPINFVFP---NLPLPHYWRRDAAQKKISATYMKEIKSRRD-RGDIDPNRDLIDS
LDKGFTPINFVFP---NLPLPHYWRRDAAQRKISAHYMKEIKRRRE-SGDIDPKRDLIDS
LDKGFTPINFVFP---NLPLEHYRKRDHAQKAISGTYMSLIKERRK-NNDIQ-DRDLIDS
LDGGFTPINFLAP---WLPLPKNRLRDAAQKKMAQIYMNIIKQRRK-TCQHE-EKDMIWN
LDGGFTHAAWLLPA--WLPLPSFRRRDRAHREIKNIFYKAIQKRRL---SKEPAEDILQT
LDGGFSHAAWLLPG--WLPLPSFRRRDRAHREIKNIFYKAIQKRRL---SKEPAEDILQT
LDGGFSHAAWLLPG--WLPLPSFRRRDRAHREIKDIFYKAIQKRTQ---SQEKIDDILQT
MESSLIPAAVFMPWLLRLPLPQSARCREARAELQKILGEIIVAREKEEASKDNNTSDLLG
MESCLIPAAVFLPWILKLPLPQSYRCRDARAELQDILSEIIIAREKEEAQKDSNTSDLLA
LERGTDPLAYVDP---YLPIESFRRRDEARNGLVALVADIMNGRIANPPTDKSDRDMLDV
290
269
266
279
279
286
274
284
284
284
263
262
228
Figura 37: Alinhamento da estrutura primária da CYP51 de diferentes espécies. Em vermelho estão as
regiões de α-hélice, em verde, as folhas β e em azul, as alças (Parte 1).
112
C.
C.
A.
C.
C.
S.
P.
M.
R.
H.
T.
L.
M.
neoformans
immitis
fumigatus
albicans
troplicalis
cerevisiae
carinii
musculus
norvegicus
sapiens
cruzi
major
tuberculosis
LQS-CKYRNGVPLSDRDIAHIMIALLMAGQHTSSATSSWTLLHLA--DRPDVVEALYQEQ
LMDNCVYKDGTALPDKEIAHLMITLLMAGQHTSSAISAWAILQLA--AHPEVMEGLYQEQ
LMN-CTYKNGQQVPDKEIAHMMITLLMAGQHSSSSISAWIMLRLA--SQPKVLEELYQEQ
LLIHSTYKDGVKMTDQEIANLLIGILMGGQHTSASTSAWFLLHLG--EKPHLQDVIYQEV
LLVNSTYKDGVKMTDQEIANLLIGVLMGGQHTSASTSAWFLLHLA--EQPQLQDDLYEEL
LMKNSTYKDGVKMTDQEIANLLIGVLMGGQHTSAATSAWILLHLA--ERPDVQQELYEEQ
LMN-QHYKDGRKLTDKEIAHLMIAILMAGQHTSAATGCWALLHLA--EKPEYIKLLLEEQ
LLD-STYKDGRPLTDEEISGMLIGLLLAGQHTSSTTSAWMGFFLA--KDKPLQEKCYLEQ
LLD-STYKDGRPLTDDEIAGMLIGLLLAGQHTSSTTSAWMGFFLA--RDKPLQDKCYLEQ
LLD-ATYKDGRPLTDDEVAGMLIGLLLAGQHTSSTTSAWMGFFLA--RDKTLQKKCYLEQ
GLLKAVYRDGTRMSLHEVCGMIVAAMFAGQHTSTITTSWSMLHLMHPKNKKWLDKLHKEI
SLLGAVYRDGTRMSQHEVCGMIVAAMFAGQHTSTITTTWSLLHLMDPRNKRHLAKLHQEI
LIAVKAETGTPRFSADEITGMFISMMFAGHHTSSGTASWTLIELMR--HRDAYAAVIDEL
347
327
323
337
337
344
331
341
341
341
323
322
286
C.
C.
A.
C.
C.
S.
P.
M.
R.
H.
T.
L.
M.
neoformans
immitis
fumigatus
albicans
troplicalis
cerevisiae
carinii
musculus
norvegicus
sapiens
cruzi
major
tuberculosis
KQKLGNPD--GTFRDYRYEDLKELPIMDSIIRETLRMHAPIHSIYRKVLSDIPVPPSLSA
VQVFGPS------KSITLGDIDRLSFSQMVIKETLRLHAPIHSIMRKAKNTMAVP----LANLGPAGPDGSLPPLQYKDLDKLPFHQHVIRETLRIHSSIHSIMRKVKSPLPVP----VELLKEKG--GDLNDLTYEDLQKLPSVNNTIKETLRMHMPLHSIFRKVTNPLRIP----TNLLKEKG--GDLNDLTYEDLQKLPLVNNTIKETLRMHMPLHSIFRKVMNPLRVP----MRVLD-----GGKKELTYDLLQEMPLLNQTIKETLRMHHPLHSLFRKVMKDMHVP----KRVFG-----DNLDDLTYDNLKDMELLSYVIKETLRLHPPLHSIIRKVKSPILIE----KAVCG-----EDLPPLTYDQLKDLNLLDRCIKETLRLRPPIMTMMRMAKTPQTVAG---KTVCG-----EDLPPLTYEQLKDLNLLDRCIKETLRLRPPIMTMMRMAKTPQTVAG---KTVCG-----ENLPPLTYDQLKDLNLLDRCIRETLRLRPPIMIMMRMARTPQTVAG---DEFPAQLN--------YDNVMDEMPFAERCVRESIRRDPPLLMVMRMVKAEVKVG----DEFPAQLN--------YDNVMEEMPFAEQCARESIRRDPPLIMLMRKVLKPVQVG----DELYGDGR------SVSFHALRQIPQLENVLKETLRLHPPLIILMRVAKGEFEVQG----
405
376
378
390
390
394
381
392
392
392
370
369
336
C.
C.
A.
C.
C.
S.
P.
M.
R.
H.
T.
L.
M.
neoformans
immitis
fumigatus
albicans
troplicalis
cerevisiae
carinii
musculus
norvegicus
sapiens
cruzi
major
tuberculosis
PSENGQYIIPKGHYIMAAPGVSQMDPRIWQDAKVWNPARWHDEKGFAAAAMVQYTKAEQV
---GTNLVIPESHILLSAPGFTARSEDHFKDAAKWNPHRWLSVI--ER-----SEADEKI
---GTPYMIPPGRVLLASPGVTALSDEHFPNAGCWDPHRWENQA--TKE----QENDEVV
---ETNYIVPKGHYVLVSPGYAHTSERYFDNPEDFDPTRWDTAA--AKANSVSFNSSDEV
---NTKYVIPKGHYVLVSAGYAHTSDRWFEHPEHFNPRRWESDD--TKASAVSFNSEDTV
---NTSYVIPAGYHVLVSPGYTHLRDEYFPNAHQFNIHRWNND------SASSYSVGEEV
---NSPYIVPKNHYLLAAPGVSSVDEEYFENALEFIPERWKCEK--------NTEDSDKI
------YTIPPGHQVCVSPTVNQRLKDSWAERLDFNPDRYLQDN---------------------YTIPPGHQVCVSPTVNQRLKDSWVERLDFNPDRYLQDN---------------------YTIPPGHQVCVSPTVNQRLKDSWVERLDFNPDRYLQDN--------------------SYVVPKGDIIACSPLLSHHDEEAFPNPRLWDPER-------------------------KCVVPEGDIIACSPLLSHQDEEAFPNPREWNPER--------------------------HRIHEGDLVAASPAISNRIPEDFPDPHDFVPARYEQPR----------------
465
426
429
445
445
445
430
430
430
430
404
403
374
C.
C.
A.
C.
C.
S.
P.
M.
R.
H.
T.
L.
M.
neoformans
immitis
fumigatus
albicans
troplicalis
cerevisiae
carinii
musculus
norvegicus
sapiens
cruzi
major
tuberculosis
DYGFGSVSKGTESPYQPFGAGRHRCVGEQFAYTQLSTIFTYVVRNFTLKLA--VPKFPET
DYGYGVTIKGTKSPYLPFGAGRHRCIGEKFAYVNLGVILAVMVRHFKLRNPDNRVGVPAT
DYGYGAVSKGTSSPYLPFGAGRHRCIGEKFAYVNLGVILATIVRHLRLFNVDGKKGVPET
DYGFGKVSKGVSSPYLPFGGGRHRCIGEQFAYVQLGTILTTFVYNLRWTID--GYKVPDP
DYGFGKISKGVSSPYLPFGGGRHRCIGEQFAYVQLGTILTTYIYNFKWRLN--GDKVPDV
DYGFGAISKGVSSPYLPFGGGRHRCIGEHFAYCQLGVLMSIFIRTLKWHYPE-GKTVPPP
DYGYGLVTKGAFSPYLPFGAGRHRCIGEQFAYMQLGTIITIFVHELEWTLPKNQITIPKP
------PASGEKFAYVPFGAGRHRCVGENFAYVQIKTIWSTMLRLYEFDLIN--GYFPTV
------PASGEKFAYVPFGAGRHRCIGENFAYVQIKTIWSTMLRLYEFDLIN--GYFPSV
------PASGEKFAYVPFGAGRHRCIGENFAYVQIKTIWSTMLRLYEFDLID--GYFPTV
------DEK-VDGAFIGFGAGVHKCIGQKFALLQVKTILATAFREYDFQLLRD--EVPDP
------NMKLVDGAFCGFGAGVHKCIGEKFGLLQVKTVLATVLRDYDFELLG---PLPEP
-----QEDLLNRWTWIPFGAGRHRCVGAAFAIMQIKAIFSVLLREYEFEMAQ-PPESYRN
523
486
489
503
503
504
490
482
482
482
455
454
428
C.
C.
A.
C.
C.
S.
P.
M.
R.
H.
T.
L.
M.
neoformans
immitis
fumigatus
albicans
troplicalis
cerevisiae
carinii
musculus
norvegicus
sapiens
cruzi
major
tuberculosis
NYRTMIVQPNNP-LVTFTLRNAEVKQEV
DYRSLLSRPMEPSSVHWEKRNFVSE--DYSSLFSGPMKPSIIGWEKRSKNTSK-DYSSMVVLPTEPAEIIWEKRETCMF--DYQSMVTLPLEPAEIVWEKRDTCMV--DFTSMVTLPTGPAKIIWEKRNPEQKI-DYTSMVVLPERPSNIEWRRRQKR----NYTTMIHTPENP-VIRYKRRSK-----NYTTMIHTPENP-VIRYKRRSK-----NYTTMIHTPENP-VIRYKRRSK-----DYHTMVVGPTLNQCLVKYTRKKKLPS-NYHTMVVGPTASQCRVKYIRKKAAA--DHSKMVVQLAQPACVRYRRRTGV-----
550
511
515
528
528
530
513
503
503
503
481
479
451
Figura 37: Alinhamento da estrutura primária da CYP51 de diferentes espécies. Em vermelho estão as
regiões de α-hélice, em verde, as folhas β e em azul, as alças (Parte 2).
113
Tabela 8: Percentual de identidade entre as CYP51 de diferentes espécies (Coccidioides immitis, Aspergillus fumigatus, Candida albicans, C. tropicalis,
Saccharomyces cerevisae, Pneumocistis jiroveci, Mus musculus, rattus norvegicus, Homo sapiens, Trypanosoma cruzi, Leishmania major e M. tuberculosis).
114
Quadro 7: Comparação dos resíduos de aminoácidos a 10 Å do átomo de ferro do heme da CYP51 de
humanos e M. tuberculosis em relação a de C. neoformans.
Aminoácidos a até 10 Å de dsitância do átomo de ferro do heme da
CYP51
M. tuberculosis
Resíduos
H. sapiens
Resíduos
alinhados em
alinhados em
C. neoformans
C. neoformans
Gln 72
Ala127
Tyr 145
Tyr 145
Arg 96
Leu152
Phe 152
Leu152
Leu 100
Phe158
Lys 156
Lys156
Leu 105
Leu163
Leu 159
Ile159
Met 253
Leu314
Leu 163
Leu163
Met 254
Leu315
Gly 307
Ala313
Phe 255
Met316
Leu 308
Leu314
Ala 256
Ala317
Leu 310
Met316
Gly 257
Gly318
Ala 311
Ala317
His 258
Gln319
Gly 312
Gly318
His 259
His320
Gln 313
Gln319
Thr 260
Thr321
His 314
His320
Ser 261
Ser322
Thr 315
Thr321
Thr 264
Thr325
Ser 316
Ser 322
Leu 315
Leu380
Leu 371
Leu380
Pro 320
Pro385
Pro 376
Pro385
Leu 321
Ile386
Ile 377
Ile386
Leu 324
Ile389
Met 380
Ile389
Ile 385
Gln481
Val 440
Gln481
Pro 386
Pro482
Pro 441
Pro482
Phe 387
Phe483
Phe 442
Phe483
Gly 388
Gly484
Gly 443
Gly484
Ala 389
Ala485
Ala 444
Ala485
His 392
His488
His 447
His488
Arg 393
Arg489
Arg 448
Arg489
Cys 394
Cys490
Cys 449
Cys490
Val 395
Val491
Ile 450
Val491
Gly 396
Gly492
Gly 451
Gly492
Ala 397
Glu493
Glu 452
Glu493
Ala 398
Gln494
Asn 453
Gln494
Phe 399
Phe495
Phe 454
Phe 495
Ala 400
Ala496
Ala 455
Ala 496
Ile 401
Tyr497
115
O modelo construído mostrou-se adequado pela análise do gráfico de Ramachandran,
do perfil no Verify 3D e análise da energia no ProSA, com resultados semelhantes ao molde.
Apenas os resíduos (Pro464, Lys136 e Thr300) estão em regiões desfavoráveis no gráfico de
Ramachandran, mas estes se encontram longe do sítio ativo da proteína, e provavelmente não
devem interferir na ligação aos azóis (Figura 38).
Figura 38: Gráfico de Ramachandran mostrando a confiabilidade do modelo CYP51 de (A) C.
neoformans e (B) H. sapiens.
A análise do Verify 3D do molde mostrou 87,91% dos resíduos com uma pontuação
(score) 3D-1D médio > 0,2, comparado com o modelo (90,36%) (Figura 39).
116
Figura 39: Gráfico do Verify 3D mostrando a confiabilidade do modelo CYP51 de C. neoformans
(vermelho) e H. sapiens (verde).
Apenas Tyr459, Thr460, Lys461, Ala462, Glu463 e Gln464 apresentaram valor
negativo, sendo que estes também estavam distantes do sítio ativo da proteína e se localizando
em uma alça que não tem equivalente no molde.
A análise do score-Z feita no PROSA mostrou que o modelo apresentou valor de
-8,93, semelhante ao molde (-9,51) e às estruturas 3D de proteínas disponíveis no PDB,
obtidas por métodos experimentais (Figura 40).
117
Figura 40: Análise do score-Z das estruturas de CYP51 de humano (preto) e de C. neoformans
(vermelho).
O modelo de C. neoformans mostrou a maioria dos resíduos com energia menor do
que zero semelhante ao molde e consistente com os parâmetros de uma proteína típica (Figura
41).
Figura 41: Gráfico de energia mostrando a energia independente de cada resíduo (verde claro) e a
média da energia dos resíduos em função de um resíduo central (verde escuro).
118
As estruturas cristalográficas da CYP51 de alguns organismos estão descritas na
literatura como a de Homo sapiens ligada ao cetoconazol (3LD6) (STRUSHKEVICH et al.,
2010), Trypanosoma cruzi ligado ao posaconazol (3K1O) (LEPESHEVA et al., 2010b) e ao
fluconazol (2WUZ) (CHEN et al., 2010) e (3KHM) (LEPESHEVA et al., 2010a), além de
T. brucei (2WV2) (CHEN et al., 2010), Leishmania infantum (3L4D) (HARGROVE, 2011)
e M. tuberculosis (1EA1) todas ligados ao fluconazol (PODUST et al., 2001).
Comparando as estruturas tridimensionais das CYP51 de M. tuberculosis, T. cruzi, T.
brucei, Leishmania infantum, Homo sapiens e o modelo de C. neoformans, foi observada uma
conservação das estruturas secundária e terciária, com apenas algumas regiões de alças com
diferentes conformações, principalmente na enzima de Mycobacterium tuberculosis (Figura
42).
Figura 42: Estrutura tridimensional das CYP51 de Mycobacterium tuberculosis (1EA1), Trypanosoma
cruzi (2WUZ), Trypanosoma brucei (2WV2), T. cruzi (2WX2), Leishmania infantum (3L4D), Homo
sapiens (3LD6) e o modelo de Cryptococcus neoformans.
119
A comparação do mapa de potencial eletrostático destas proteínas mostrou que, apesar
da estrutura tridimensional ser bem semelhante, o perfil de distribuição de cargas é diferente
(Figura 42). A estrutura de M. tuberculosis apresenta regiões mais negativas, enquanto a de
Homo sapiens, mais positivas, estas foram as duas que apresentaram um perfil de mapa de
potencial eletrostático mais diferente das outras no. Determinadas regiões de carga negativa e
positiva foram conservadas, principalmente quando se comparam espécies do mesmo gênero,
como T. cruzi e T. brucei, com 83% de identidade na estrutura primária e também L.
infantum, outro protozoário com 77% e 78% de identidade. Parece que a semelhança
estrutural está relacionada à proximidade evolutiva.
Comparando as estruturas da CYP51 de C. neoformans e de H. sapiens observou-se
uma estrutura tridimensional semelhante também (RMSD = 0,55 envolvendo 1752 átomos da
cadeia principal), enquanto o mapa de potencial eletrostático revelou um perfil diferente onde
a enzima de C. neoformans apresentou regiões mais positivas e a de humano, mais neutras e
negativas (Figura 43).
120
A
Figura 43: Mapa de potencial eletrostático das CYP51 de diferentes organismos (modelo de C.
neoformans e estrutura cristalográfica de H. sapiens, M. tuberculosis, T. cruzi, T. brucei e L. infantum)
Cada estrutura é mostrada em uma mesma posição inicial e em um ângulo de 180º para o lado.
4.3.2 Análise das interações dos azóis com CYP51
A análise do modo de ligação do fluconazol com diferentes CYP51 disponíveis no
PDB (Mycobacterium tuberculosis, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei, Leishmania
infantum e Homo sapiens) mostra que o inibidor se liga de um mesmo modo ao grupo Heme
da proteína, com os anéis fenila e triazóis alinhados (Figura 44). Desta forma, foi possível
realizar um docking manual baseado em um alinhamento estrutural com proteínas disponíveis
no PDB complexadas ao posaconazol, fluconazol e cetoconazol e propor um modo de ligação
destes com as enzimas de C. neoformans e de humano.
121
Figura 44: Alinhamento estrutural do fluconazol com o Heme de algumas CYP51 disponíveis como
Mycobacterium tuberculosis (1EA1) em vermelho, Trypanosoma cruzi (2WUZ) em verde,
Trypanosoma brucei (2WV2) em azul, T. cruzi (2WX2) em amarelo, T. cruzi (3KHM) em rosa,
Leishmania infantum (3L4D) em laranja e Homo sapiens (3LD6) em branco.
O encaixe (docking) do cetoconazol, fluconazol e posaconazol com a CYP51 de C.
neoformans e de humano mostrou que, após a minimização, estes apresentaram o mesmo
modo de ligação com o ferro no grupo heme (Figura 45).
122
Figura 45: Alinhamento estrutural mostrando a ligação entre cetoconazol (A), fluconazol (B) e
posaconazol (C) com o heme da CYP51. Em azul C. neoformans e em rosa H. sapiens.
Foi feita uma comparação do sítio ativo das enzimas de C. neoformans e Homo
sapiens a 6Å dos inibidores, distância esta em que os resíduos podem tanto interagir
diretamente por ligação de hidrogênio, interação iônica, hidrofóbica ou Van der Walls como
123
também indiretamente influenciando na conformação de outros resíduos. Foram observadas
substituições em resíduos, tais como A75I, Y77F, E79K, L100M, M101V, R103K, I105F,
A130V, V144A, I159L, P242H, F245W, M246L, A313G, M316L, S388I, I389M, Y390M e
R526T. Algumas destas substituições foram por aminoácidos com diferentes características
(i.e. P242H, S388I e Y390M). Estes resíduos podem ser avaliados para o desenvolvimento de
inibidores mais seletivos (Figura 46 e Quadro 8).
Figura 46: Comparação dos resíduos a 6Å do posaconazol em C. neoformans (azul) e H. sapiens
(rosa). A numeração está de acordo com C. neoformans.
Os resíduos Y131, F139, Y145, A317, T321 e I386 da CYP51 de Cryptococcus
neoformans interagem por contatos de van der Waals com todos os três derivados azólicos,
considerando uma distância de até 4 Å, o que mostra que são resíduos com importância maior
para encaixe dos inibidores no sítio ativo. No caso da enzima de humano, os resíduos F139,
Y145, F234, A311 e T315 interagiram com os ligantes. Comparando, foi observada a
diferença da I386 que interagiu apenas com C. neoformans, e F234 apenas com H. sapiens,
124
apesar de ambos estarem conservados nas duas enzimas. Quando se comparam com outras
CYPs foi observado que os resíduos F139 e T321 foram conservados em todas, Y145 em
todas exceto em M. tuberculosis e A317 exceto nas leveduras Candida albicans, C. tropicalis
e Saccharomyces cerevisae (Quadro 8).
Quadro 8: Aminoácidos interagindo com os ligantes (fluconazol, cetoconazol e posaconazol) nas
enzimas de Homo sapiens e de C. neoformans.
a
Proteína
Ligante
C. neoformans
Fluconazol
C. neoformans
Cetoconazol
C. neoformans
Posaconazol
H. sapiens
Fluconazol
H. sapiens
Cetoconazol
H. sapiens
Posaconazol
Resíduos localizados até 4 Å de distância do
ligante na CYP51a
Y131, F139,V144, Y145, F240, A313,
A317, T321, I386
Y77, Y131, L134, F139, Y145, F245, A313,
A317, T321, I386, S388, Y390, M528
Y131, L134, F139, V144, Y145, P242, M246,
A317, T321, I386, S388, Y390, Y525, R526,
M528
F139, Y145, F234, A311, T315, I377
F77, Y131, L134, F139, Y145, F234 , W239,
G307, A311, T315, I377, I379, M381, M487
A74, G78, Y131, F139, Y145, F234, H236,
A311, T315, I379, M381, Y484, T485, M487
O resíduo sublinhado interage por ligação de hidrogênio.
Foi analisada a energia de ligação do fluconazol, cetoconazol e posaconazol com a
enzima CYP51 de C. neoformans, sendo que a menor energia foi observada no posaconazol,
seguido do cetoconazol e fluconazol. Este fato parece estar relacionado à área superficial que
é maior no posaconazol, depois cetoconazol e fluconazol, desta forma, favorece a interação
com um número maior de resíduos, aumenta a superfície de contato com a proteína e favorece
o encaixe (Tabela 9).
125
Tabela 9: Energia de ligação (Kcal/mol) do cetoconazol, do fluconazol com a CYP51 de H. sapiens e
C. neoformans.
Fluconazol
Energia do
Complexo
-3179,83
Energia do
Ligante
38,17
Energia da
proteína
-3193,66
Energia de
ligação
-24,34
Cetoconazol
-3182,34
55,49
-3188,47
-49,36
Posaconazol
-3181,46
103,65
-3224,53
-60,58
O único resíduo que interage por ligação de hidrogênio com o ligante cetoconazol é a
Tyr390 no caso de C. neoformans, o que mostra a importância dos contatos de van der Waals,
além da ligação ao ferro do Heme para inibição da enzima.
126
5 DISCUSSÃO
5.1 Estudo do receptor de NMDA e de seus antagonistas
Muitos anos se passaram desde a descoberta do primeiro antagonista do receptor de
NMDA, e, até hoje, as ferramentas farmacológicas disponíveis para discriminar entre as
subunidades do receptor ainda são limitadas. Para ser efetivo na terapia antiexcitotóxica o
composto deve bloquear a ativação excessiva do receptor de NMDA, mas deve manter a
função normal relativamente intacta para evitar efeitos adversos (CHEN e LIPTON, 2006).
Alguns antagonistas do receptor de NMDA foram planejados a partir da estrutura do
glutamato, substituindo um grupo carboxilato por grupo fosfonato. Esta substituição
acompanhada do aumento da cadeia resultou na alteração do efeito agonista para antagonista
no sítio de reconhecimento do receptor, sendo AP5 e AP7 (figura 3) os protótipos deste
grupo. A atividade agonista ou antagonista no receptor está relacionada à distância entre os
dois grupos ácidos. Uma distância menor é necessária para a atividade agonista enquanto os
antagonistas são caracterizados por distância maior entre os grupos ácidos (URWYLER et al.,
1996).
Foi proposto que a carboxila distal do agonista glutamato se encontra próxima ao
pequeno bolso formado entre os resíduos Val714, Tyr731, Phe729 e Val686 e que isto limita
o tamanho do agonista. Como os antagonistas não se encaixam ao tamanho do bolso, eles
podem se ligar a Lys485 e Lys488, impedir o fechamento do domínio de ligação ao glutamato
e resultar na atividade de antagonista (TICKHONOVA et al., 2002).
No estudo dos 17 derivados do ácido piperazino-2,3-dicarboxílico, antagonistas
competitivos do receptor de NMDA, foi usada a estrutura da subunidade GluN2B deste
receptor. A estrutura 3D desta região na subunidade GluN2A de rato, na forma fechada (i.e.
127
ligada ao glutamato) foi determinada em 2005 e foi expressa substituindo os três domínios
transmembrânicos e a alça de reentrada por dois aminoácidos: (ácido glutâmico e treonina)
que unem o domínio S1 e S2 (FURUKAWA et al., 2005; STOLL et al., 2007). Baseada nesta
estrutura, foi construído o modelo de GluN2B de humano (ABREU, 2008), que foi usado
neste estudo para avaliar o modo de interação com os antagonistas competitivos derivados de
piperazina e determinar os resíduos de aminoácidos envolvidos na interação.
O nosso estudo com esses 17 derivados revelou a interação dos ligantes mais ativos
com Lys485 e Lys488, similar ao descrito por Tickhonova e colaboradores em 2002.
A literatura descreve outros antagonistas competitivos mais potentes, desenvolvidos
com base na restrição conformacional obtida pela inserção de ligações duplas ou do anel
piperazina (e.g. CPP e CPPene). Esses antagonistas apresentam um padrão típico de
seletividade na subunidade NR2 recombinante, com a seguinte ordem de afinidade
GluN2A>GluN2B>GluN2C>GluN2D (WATKINS et al., 1990; MÜLLER et al., 1992).
Neste trabalho, o mesmo padrão foi observado nos antagonistas competitivos do receptor de
NMDA analisados por modelagem molecular, visto que também apresentaram o anel
piperazina que confere restrição conformacional (CHEUNG et al., 1996).
Muitos autores identificaram o biciclo LY233536 e o composto contendo bifenila
EAB-515 com afinidade maior por GluN2B e menor por GluN2A. A inserção do grupo
bifenila no meio da cadeia de AP7 levou ao análogo EAB-515 que mostra uma maior
afinidade por GluN2B do que por GluN2A, além de aumentar a afinidade por GluN2C e
GluN2D (JANE et al., 1994; JANE 2002; BULLER e MONAGHAN, 1997; MORLEY et al.,
2005).
O derivado do ácido piperazino-2,3-dicarboxílico (PBPD) contendo o anel bifenila
também manteve afinidade maior por GluN2B, enquanto aumentou a afinidade relativa por
GluN2C e GluN2D. Segundo a literatura, o substituinte volumoso bifenila parece ocupar um
128
suposto bolso hidrofóbico (BULLER e MONAGHAN, 1997; CHEUNG, et al., 1996). Em
nosso estudo dos derivados do ácido piperazino-2,3-dicarboxílico também foi observada a
importância dos substituintes volumosos, uma vez que os ligantes que apresentam o anel
fenantrila (16e e 16g), foram mais potentes do que outros substituídos por fenila, bifenila ou
naftaleno. A presença de anéis aromáticos coplanares não foi essencial para a atividade, o que
pode ser observado quando se compara 16g com 16h, visto que ambos apresentaram
atividade, apesar da perda da aromaticidade e planaridade em 16h. Por outro lado, a presença
do anel bifenila, capaz de girar no plano, reduziu a atividade.
Alguns estudos demonstraram que um anel bifenila contendo um substituinte flúor ou
bromo reduz a afinidade relativa por GluN2B em relação a GluN2A ou reduz a atividade em
ambas subunidades (AUBERSON et al., 2002, FENG et al., 2004). Entretanto, no caso de
16g e 16e o grupo fenantrila com um substituinte bromo aumenta a atividade e também
mantém uma afinidade maior por GluN2B em relação a GluN2A, o que pode sugerir a
participação de outros aminoácidos importantes para a formação do complexo alvo-ligante.
Devido à semelhança dos derivados de piperazina com aminoácidos, apresentando
grupos que podem ser protonados ou desprotonados, como carboxila e piperazina, neste
trabalho foi realizado o docking dos derivados também na forma de zwitterion. Em solução
aquosa e em pH neutro, um aminoácido existe predominantemente como zwitterion, que são
moléculas que podem agir como um ácido (doador de próton) ou base (aceptor de próton)
(NELSON e COX, 2004). Em pH neutro, como no sangue, estruturas como D-cicloserina
existem essencialmente como zwitterion (LEE et al., 1997; MCBRAIN et al., 1989). Outros
estudos também simularam ligantes do receptor de NMDA e aminoácidos na forma ionizada
(FROLUND et al., 2005; MORETTI et al., 2004).
Tem sido proposto que antagonistas competitivos do receptor de NMDA, assim como
o glutamato, interagem com a região S1 e S2 por ligação de hidrogênio, interação iônica e que
129
os antagonistas impedem o fechamento desta região, e, consequentemente, a abertura do poro
e passagem de íons (BLAISE, et al., 2005; NIKAM et al., 2002). Foi observado que na forma
ionizada, os derivados interagem com Gly487 e Asn688 o que poderia impedir o fechamento
do poro.
Além da Gly487 que interagiu por ligação de hidrogênio com todos os derivados de
piperazina mais ativos, outros resíduos foram importantes para a interação como Lys485,
His486 e Arg519 para alguns derivados, diferente de 2a que não fez ligação de hidrogênio
com Gly487, mas com His486, Thr514, Arg519, Ser690 e não apresentou atividade
significativa. Em estudos anteriores os resíduos Ser511, Thr513, Arg518, Ser689 e Thr690
(que correspondem a Ser512, Thr514, Arg519, Ser690 e Thr691 de GluN2B aqui descritos)
interagem com o glutamato (Abreu, 2008). No caso da molécula 16a, o modo de ligação tanto
da forma ionizada quanto não ionizada foi semelhante ao do glutamato, conservando alguns
grupos em posição próxima. É possível citar a carboxila dos dois ligantes, o nitrogênio da
piperazina que estava próximo à amina do glutamato e à carbonila do derivado, que também
indicava para uma direção semelhante à carboxila do glutamato, mantendo um perfil
eletrônico semelhante.
Antagonistas como AP5 tem demonstrado interagir com o sítio de ligação de modo
similar aos grupos amino e carboxila do gutamato. Laube e colaboradores (2004) mostraram a
interação do antagonista AP5 com o modelo por homologia do sítio ativo do glutamato na
subunidade GluN2B. O modelo proposto baseado na estrutura de GluR2 e D-AP5 interage
com resíduos do lobo I e II como Lys459 e Lys462 (correspondente aos resíduos Lys485 e
Lys 488 no nosso estudo) e impediu o fechamento do domínio, sendo demonstrado ainda que
a mutação nestes resíduos reduziu a atividade (LAUBE et al., 2004). No nosso estudo,
Lys485 e Lys488 também interagiram com os antagonistas mais potentes da série (16e, 16g,
16h e 16n) na forma ionizada.
130
Estudos de mutação sítio dirigida mostraram que os resíduos Glu413, Lys485, Ser512,
Arg519, Ser690 e Thr691 foram importantes para o funcionamento do receptor, podendo
interagir diretamente com o agonista ou para manter o mecanismo de abertura do poro ou para
o enovelamento apropriado (TIKHONOVA et al., 2002). Alguns destes resíduos foram
importantes para a interação com os antagonistas derivados de piperazina aqui estudados.
Urwyler e colaboradores (1996) demonstraram que a introdução de hidroxila ao anel
bifenila de EAB-515 aumentou a atividade biológica. Desta forma, a substituição do bromo
em 16g por uma hidroxila ou por NH2 poderia ser testada. Estes substituintes possivelmente
aumentariam as interações com grupos polares desta região. Apesar de descrições da literatura
sobre um bolso hidrofóbico importante para interação com os anéis, apenas os resíduos
Val714 e Gly713 estavam relativamente próximos para interagir com as moléculas mais
ativas na forma ionizada. Entretanto existem outros resíduos polares que poderiam ser
importantes para a interação. Além disso, a substituição da carbonila (ligada a piperazina e
aos anéis) por uma hidroxila poderia ser testada, apesar de que a ausência da carbonila não foi
favorável para a atividade, o que pode ser observado quando se compara o derivado 23 (Ki =
10,25 μM) com 16h (Ki = 0,76 μM). A substituição pela hidroxila, entretanto, poderia manter
um perfil eletrônico similar, e talvez possibilitasse a realização de ligação de hidrogênio com
Gly487, estabilizando ainda mais a conformação aberta do domínio de ligação ao glutamato.
Avanços no conhecimento sobre a estrutura do receptor de NMDA tem levado
pesquisadores a investigar a possibilidade de desenvolver antagonistas seletivos para subpopulações do receptor ao invés de bloqueadores de canal, buscando reduzir os efeitos
adversos
associados
ao
bloqueio
deste
receptor
como:
efeitos
psicomiméticos,
comprometimento da aprendizagem, memória e função motora devido à abundância de
receptores de NMDA por toda parte do SNC (BARON et al., 2005; CHAFFEY e CHAZOT
2008; WILLIAMS 2001).
131
Foi demonstrado que a atividade do receptor de NMDA pode ser modulada por uma
variedade de ligantes endógenos como zinco, poliaminas e prótons, sendo os sítios de ligação
no domínio N-terminal (HUGGINS e GRANT, 2005). Nesta região podem se ligar
antagonistas não-competitivos. Este sítio tem homologia com a proteína de ligação a
leucina/isoleucina/valina (LIVBP) composta por dois domínios R1 e R2 e apresenta a
conformação aberta e fechada. Esta movimentação entre os domínios produz a conformação
ligada ao agonista e não ligada facilitando a ligação aos ligantes modulatórios no domínio Nterminal (HUGGINS e GRANT, 2005).
O ifemprodil é um antagonista não-competitivo que afeta apenas aqueles receptores
que contenham a subunidade GluN2B. Dados de mutagênese mostraram que o sítio de ligação
do ifemprodil, um antagonista não-competitivo, se localiza no domínio N-terminal sendo que
resíduos do domínio R1 quanto R2 são importantes para a ligação (PERIN-DUREAU et al.,
2002).
Gallagher et al. (1996) demonstraram que os aminoácidos entre 198 e 356 estavam
envolvidos na interação de alta afinidade com o ifemprodil. O nosso estudo, revelou uma
importância similar para outros resíduos localizados fora deste intervalo. Posteriormente,
Perin-Dureau e colaboradores (2002) demonstraram a existência de dois sítios de ligação ao
ifemprodil, um de baixa afinidade e dependente de voltagem, localizado no poro do canal
iônico e outro de alta afinidade, independente de voltagem e localizado extracelularmente, no
domínio N-terminal (WILLIAMS, 1993; PERIN-DUREAU et al, 2002, KARAKAS et al.,
2009). Masuko e colaboradores (1999), usando técnicas de mutagênese concluiram a favor de
um sítio de ligação para o ifemprodil no N-terminal de GluN1, o que está de acordo com a
idéia de que a região N-terminal de GluN2B e GluN1 interagem proximamente
(SOBOLEVSKY et al., 2009; HANSEN, 2010; KARAKAS et al., 2009; MASUKO et al.,
1999).
132
Outros estudos concluíram que o sítio de ligação do ifemprodil se localizava no Nterminal de GluN2B entre os domínios R1 e R2 (PERIN-DUREAU et al, 2002;
GALLAGHER et al. 1996). Devido a essa variação de dados, neste estudo, foi realizado
inicialmente o docking do ifemprodil na região central do N-terminal de GluN2B entre os
domínios R1 e R2 para evidenciar os resíduos que poderiam interagir tanto em GluN2B
quanto em GluN2A. Para estudo destas interações foi construído o modelo por homologia do
N-terminal de GluN2B e GluN2A de humano, com base na estrutura recentemente obtida por
cristalografia e difração de raios-X da região do N-terminal de GluN2B de rato (KARAKAS,
et al., 2009). Com base nesta estrutura, foi possível estudar com mais precisão esta região,
realizar dockings e propor modos de interação com antagonistas não-competitivos que se
ligam neste domínio.
Modelos tridimensionais da estrutura da região N-terminal já haviam sido descritos na
literatura. Huggins (2005) propôs um modelo do dímero do domínio N-terminal baseado na
estrutura do receptor de glutamato metabotrópico (mGluR1) que apresenta baixo percentual
de identidade na cadeia, com apenas cerca de 8% de resíduos de aminoácidos idênticos
(código PDB 1EWK). Esse estudo sugeriu que o sítio de ligação para o zinco seria na fenda
na subunidade GluN2A, a ligação deste estabilizaria a forma aberta do domínio N-terminal.
Além disso, propôs que o efeito do ifemprodil seria semelhante na subunidade GluN2B
(HUGGINS e GRANT, 2005).
Em outro estudo, foi proposto um modelo por homologia da região do N-terminal
baseado na estrutura da proteína de ligação a leucina/isoleucina/valina (LIVBP), entretanto,
apesar de apresentar uma certa similaridade estrutural, esta proteína apresenta apenas 4% de
identidade com GluN2B de humano (PERIN-DUREAU et al., 2002).
Recentemente Karakas e colaboradores (2011) conseguiram elucidar por cristalografia
e difração de raios-X, a estrutura 3-D da região do N-terminal de GluN2B de rato interagindo
133
com ifemprodil, além de outro antagonista Ro25-6981, o que mostrou que estes interagem de
maneira similar a uma determinada região entre a subunidade GluN2B e GluN1. Com base
nesta informação, foram realizados neste trabalho o redocking do ifemprodil com a
subunidade GluN2B e o docking do ifemprodil com GluN2A, além da fenil-amidina descrita
na literatura (CLAIBORNE et al., 2003) e das triazolil-amidinas planejadas por nosso gupo
em outro estudo (ABREU, 2008) que foram complexados com GluN2B.
Foi proposto que o sítio de ligação para antagonistas semelhantes ao ifemprodil é
baseado em pelo menos três sub-sítios: um hidrofóbico acomodando o anel fenila, um
eletrostático interagindo com a hidroxila central e um hidrofóbico e com grupo aceptor de
ligação de hidrogênio (CHENARD e MENNITI, 1999; KARAKAS, 2009).
Seguindo este conceito, foi possível observar Gln110 interagindo com a amina e
Phe114 e Tyr109 interagindo com o anel fenila, enquanto Glu236 interagiu com o fenol por
ligação de hidrogênio e Phe176 interagiu com o anel aromático. Apesar destes resíduos serem
conservados em GluN2A, nesta subunidade o ifemprodil interagiu de modo diferente na qual
Tyr114 e Lys80 interagiram por ligação de hidrogênio com o fenol enquanto Tyr109 interagiu
com o anel fenila, sendo que não houve resíduos interagindo eletrostaticamente com a amina
central.
A distância entre os anéis aromáticos que é descrita na literatura como sendo entre 1012 Ǻ (MONY et al., 2009) foi de aproximadamente 12 Ǻ em GluN2B, enquanto em GluN2A
foi de aproximadamente 9 Ǻ. A ligação do ifemprodil e de outros antagonistas não
competitivos ocorre por um mecanismo de encaixe induzido que requer a abertura de
GluN2B, enquanto a sua inibição envolve fechamento deste domínio e estabilização por meio
da interação de GluN1 e GluN2B (KARAKAS, 2011). Desta forma, parece que a interação do
ifemprodil com GluN2B, de algum modo estabilizou melhor a conformação fechada do que
134
com GluN2A, provavelmente por interagir de modo diferente e com resíduos também
diferentes.
As amidinas estudadas apresentaram o anel fenila alinhado com o do ifemprodil,
interagindo com os mesmos resíduos (e.g. Phe176 e Tyr109) do receptor. Com exceção da
fenil-amidina 1a, essas amidinas também apresentavam o nitrogênio das amidinas e dos
triazóis, (no caso das triazolil-amidinas) capazes de interagir eletrostaticamente com o
receptor, além do anel aromático fenila capaz de interagir com resíduos hidrofóbicos. Apesar
da semelhança estrutural com o ifemprodil, mantendo um anel aromático em cada
extremidade ligado por um espaçador contendo nitrogênio, a distância entre os anéis era
diferente nas amidinas. Além disso, as triazolil-amidinas que tiveram menor energia de
ligação estimada por docking (2a e 2f), diferente do ifemprodil, não apresentaram grupos
doadores ou aceptores de ligação de hidrogênio ligados a fenila.
Estudos demonstraram que mutação nos resíduos Val42, Thr103A, Asp104, Glu106,
Thr233, Lys234, Glu236, Leu261 e Gly264A aumentou em 4 a 25 vezes o valor de IC50 para
o ifemprodil enquanto a mutação em Asp101, Ile150, Phe176 e Phe182 teve um efeito mais
pronunciado (aumento de 60 vezes o valor de IC50 com relação ao tipo selvagem) (PERINDUREAU et al., 2002; ALARCON et al, 2008; MONY et al, 2009). A mutação sítio dirigida
da Arg337 também reduziu a inibição causada pelo ifemprodil (GALLAGHER et al., 1996).
No nosso estudo, foi observado que apenas Glu236 e Phe176 estavam realmente próximos e
interagindo com GluN2B, enquanto os outros se encontravam próximos a fenda entre R1 e
R2. Este fato fez com que inicialmente esta região fosse considerada como o sítio de ligação
ao ifemprodil, mas possivelmente estes resíduos tem importância por estabilizar a
conformação do N-terminal do receptor ou posicionar corretamente outros resíduos.
O maior desafio neste campo é que as doenças neurodegenerativas são caracterizadas
por uma perda progressiva e irreversível de neurônios em áreas específicas do cérebro, e a
135
terapia atual ainda apresenta eficácia limitada e baixa relação custo-efetividade (BODNER et
al., 2006), mostrando que mais pesquisas ainda são necessárias nesta área.
5.2 Estudo dos derivados de oxoquinolina com atividade anti-herpes
Oxoquinolinas são uma importante classe de heterocíclicos devido à diversidade de
aplicações farmacêuticas. Dentre as atividades descritas estão: antimicobacteriana
(SENTHILKUMAR, et al., 2008), antiviral para HIV (LUO et al., 2009; SANTOS et al.,
2009), antimicrobiano (INAGAKI et al., 2004), contraceptivo (SINGH et al., 1987), entre
outros. Entretanto, poucos estudos foram relatados na literatura descrevendo derivados de
quinolonas para herpes (LUCERO et al., 2006).
Neste trabalho foi avaliada uma série de oxoquinolinas com atividade anti-HSV1.
Como não era conhecido o mecanismo pelo qual estes derivados inibiam a atividade viral, foi
realizado um estudo de modelagem molecular por meio de uma abordagem indireta, na qual a
estrutura tridimensional do alvo terapêutico é desconhecida e, desta forma, as informações
sobre a estrutura dos derivados ativos e inativos são utilizadas para determinar características
importantes e correlacionar com a atividade biológica ou planejar novos derivados.
Dados da literatura mostraram a importância do substituinte cloro para a atividade
anti-herpética (SAVARINO et al., 2003; SOUZA et al., 2008) o que divergiu do nosso estudo
onde derivados com o substituinte flúor apresentaram melhor perfil de atividade inibitória,
conforme pode ser observado comparando 3a (R1 = Cl) e 3b (R1 = F)
Derivados de oxoquinolinas semelhantes a 2a e 2b, porém com mais o cloro na
posição 7 e ácido carboxílico no lugar do éster, foram testados contra HSV1 e HSV2 não
sendo observada atividade (MASOUDI et al., 2000). Esse dado é similar aos que obtivemos
136
nesta tese, nos quais 2a e 2b também não apresentaram atividade significativa, mas a
substituição da carboxila por hidrazida levou ao derivado ativo 3b.
O mapa de potencial eletrostático é uma abordagem útil para o entendimento da
contribuição eletrostática para o processo de ligação ligante-receptor. O mapa mostra
tamanho, forma e distribuição de carga das moléculas analisadas e permite realizar a
correlação com a atividade antiviral. Neste estudo, foi observada a importância do flúor como
substituinte na posição 6 e da hidrazida na posição 3 do anel oxoquinolina, o que resulta em
um mapa de potencial eletrostático com carga mais negativa nestas regiões. O menor volume
destes substituintes quando comparado aos outros também foi uma característica importante.
A análise de propriedades físico-químicas relacionadas à farmacocinética dos
derivados de oxoquinolina mostrou que a série deve apresentar uma boa biodisponibilidade
oral de acordo com a “regra dos cinco” de Lipinski e, além disso, foi feita a avaliação da
“regra dos cinco” de Lipinski modificada para penetração no SNC, que mostrou que pelo
menos três requisitos da regra foram preenchidos. Apenas 3a e 3b tiveram número de
doadores de ligação de hidrogênio maior do que o preconizado pela regra. Desta forma, seria
interessante propor modificações estruturais para que os derivados preenchessem a todos os
requisitos, desde que a atividade fosse mantida.
Foi
observado
que
os
derivados
de
oxoquinolinas
apresentaram
uma
biodisponibilidade oral maior do que do aciclovir pelas análises na base de dados PK/DB. Os
valores de Log BB sugeriram uma maior penetração na barreira hematoencefálica. Além
disso, visando garantir a penetração através da BHE para que estes derivados sejam eficazes
em neuroinfecções, poderia ser pensado em algumas modificações como, por exemplo,
reduzir a flexibilidade e a área de superfície polar ou aumentar a lipofilicidade. Sendo
importante ressaltar que estas propriedades estão correlacionadas entre si e a alteração de uma
pode resultar em modificação de outras.
137
Infecções por HSV estão entre as infecções mais comumente tratadas por antivirais,
sendo os análogos nucleosídicos, os principais destes. Alguns fármacos deste grupo foram
introduzidos no mercado por volta de 1960 e incluem aciclovir, penciclovir, vidarabina, e
ganciclovir (YONEDA et al., 2006; REARDON et al., 1989; WEBER e CINATL, 1996).
Análogos nucleosídicos atuam geralmente inibindo a polimerase viral de modo competitivo.
Estudos
demonstraram
a
atividade
dos
derivados
6-cloro-1,4-di-hidro-4oxo-1-(d-
ribofuranosil)3-ácido carboxílico quinolina contra HSV1, além da sua forma aglicona que
também apresentou uma boa atividade quando comparado com o aciclovir. Estes análogos,
diferente do aciclovir, inibem a atividade da DNA polimerase viral sem necessitar da
fosforilação.
A inibição da enzima de HSV1 e HSV2 ocorre por mecanismo não-competitivo
(SOUZA, et al., 2008). Devido à semelhança estrutural entre estes derivados, sugere-se que os
derivados de oxoquinolinas estudados aqui tenham a DNA polimerase como alvo, ou
diretamente, como aqueles do estudo de Souza e colaboradores (2008), ou indiretamente após
ser convertida a forma trifosfatada pela timidina quinase e quinases celulares como o
aciclovir.
O estudo das interações dos derivados de oxoquinolinas (principalmente 3b que
apresentou o melhor perfil) com o seu possível alvo terapêutico, pode fornecer mais
informações sobre estes derivados e seu mecanismo de ação e auxiliar na descoberta e
planejamento de novos antivirais.
138
5.3 Estudo estrutural da CYP51 de C. neoformans e de seus inibidores
Neste estudo, foi construída a estrutura tridimensional da CYP51 de C. neoformans
por modelagem por homologia usando como molde a estrutura de Homo sapiens. Em um
estudo anterior envolvendo a construção do modelo da enzima CYP51 de C. neoformans
utilizou-se como molde a estrutura de M. tuberculosis (código PDB 2VKU).
Comparando as enzimas de M. tuberculosis com a enzima de humano foi observado
que a CYP51 de C. neoformans apresentou maior identidade com a proteína de humano tanto
na estrutura global quanto no sítio ativo (SHENG et al., 2009). A acurácia do modelo por
homologia é relacionada ao grau de identidade da estrutura primária e similaridade entre o
molde e o alvo, sendo essencial para o sucesso do modelo que o molde tenha um percentual
de identidade alto. Desta forma, acredita-se que o modelo aqui proposto tenha uma boa
capacidade preditiva e que possa ser usado não só para avaliar o modo de interação com
alguns azóis já usados comercialmente (fluconazol, cetoconazol e posaconazol) como também
para análise e planejamento de novos derivados que tenham esta enzima como alvo.
Outros modelos por homologia já foram propostos para a CYP51 de diversas espécies
como Ustilago maydis, que foi construída com base na enzima de humano (código PDB,
3LD6) no intuito de buscar fungicidas contra infecções nas plantações de milho (HAN et al.,
2010); modelos de Candida albicans e Aspergillus fumigattus foram construídos e usados
para investigar o mecanismo de ação dos azóis (WANG, et al., 2010). Além de Penicillium
digitatum usando a enzima de M. tuberculosis (código PDB 1E9X) como molde (ZHAO, et
al., 2007). Em geral, as enzimas da família das CYPs conservam alguns resíduos, além de
manterem uma semelhança na estrutura tridimensional, o que foi observado comparando as
CYP51 de Mycobacterium tuberculosis (1EA1), Trypanosoma cruzi (2WUZ), T. brucei
(2WV2), T. cruzi (2WX2), Leishmania infantum (3L4D), Homo sapiens (3LD6) e o modelo
139
de Cryptococcus neoformans. A enzima com o perfil mais diferente na análise da estrutura
terciária e do mapa de potencial eletrostático foi a de M. tuberculosis provavelmente por ser
uma enzima de bactéria. A avaliação do sítio ativo quando se comparou a enzima de fungo e
de humano (a 6Å dos inibidores) mostrou substituições em resíduos, tais como: A75I, Y77F,
E79K, L100M, M101V, R103K, I105F, A130V, V144A, I159L, P242H, F245W, M246L,
A313G, M316L, S388I, I389M, Y390M, R526T, o que sugere que estes resíduos são
importantes para a especificidade pelo substrato das CYP51 de diferentes espécies.
O sítio ativo da enzima CYP51 contém um heme central que é ligado a proteína pela
ligação Fe-S com a cisteína. No outro lado do heme, a sexta coordenação é feita com os azóis
que ocupam o sítio do substrato (BALDING et al., 2008). Além da ligação com o ferro,
estudos de dockings moleculares de derivados triazólicos revelaram que os compostos
interagem com CYP51 principalmente por interações de van der Waals e hidrofóbicas
(SHENG et al., 2009).
A energia de ligação foi menor no complexo do posaconazol seguido de cetoconazol e
fluconazol com a enzima CYP51 de C. neoformans, o que está relacionado principalmente às
interações hidrofóbicas e contatos de van der Waals formados com um número maior de
resíduos. Pesquisas mostraram que o anel triazol, difluorfenil e a hidroxila são os grupos
farmacofóricos dos agentes antifúngicos (CHAI et al., 2009).
Tanto itraconazol quanto posaconazol tem uma longa cadeia, isto faz com que a
energia de ligação destes seja menor por interagir com resíduos hidrofóbicos adicionais. O
anel fenila de ambos interagiu com Tyr131, Ile386, Ile389 e Ile529. O grupo piperazina
formou uma interação hidrofóbica com Tyr390 e Met421. Os resíduos Leu100, Met528 e
Phe245 interagiram com o segundo grupo fenil e com a triazolona. O grupo alquila interagiu
com os resíduos hidrofóbicos Ala74, Phe71 e Phe84 (SHENG et al. 2009). No nosso estudo
também foi observado Tyr131 e I386, interagindo com fluconazol, cetoconazol e
140
posaconazol, enquanto Tyr390 e Met528 interagiu apenas com posaconazol, devido ao seu
tamanho. Por outro lado, não foi observada interação do posaconazol com os resíduos
Met421, Leu100, Ile389, Ala74, Phe71 e Phe84, pelo menos não tão próxima quanto a 4 Å.
Fringuelli e colaboradores (2009) realizaram o docking de derivados análogos do
cetoconazol com o modelo da CYP51 de Candida albicans que apresentaram modo de ligação
similar, assim como no nosso estudo em que também foi observado um mesmo modo de
ligação dos azóis conservando grupos farmacofóricos em posição semelhante. Além disso, foi
observado por Fringuelhi e colaboradores, a ligação de hidrogênio com Tyr505 e Met508
(correspondente a Tyr525 e Tyr528 em C. neoformans). No nosso estudo estes resíduos
também estavam interagindo com o posaconazol, mas não eram capazes de fazer ligação de
hidrogênio.
Dentre os antifúngicos conhecidos atualmente, os triazóis são os mais usados
geralmente apresentam um amplo espectro e alta potência (SHEEHAN, 1999). Infelizmente, o
uso massivo destes fármacos tem levado a resistência, sendo necessária a busca por novos
azóis. Os azóis de segunda geração como voriconazol, posaconazol, ravuconazol e
albaconazol, entre outros, já estão disponíveis no mercado ou estão em ensaios clínicos
(WANG et al., 2010)
Na literatura já foi demonstrado que a mutação de Gly484 está envolvida com
resistência de C. neoformans aos azóis. Este resíduo parece não interagir diretamente com
fluconazol, mas é importante para conformação no ambiente do heme, reduzindo a
flexibilidade necessária para mudança da conformação interdomínio que ocorre na ligação do
inibidor (SHENG et al., 2009). Em nosso modelo, este resíduo também estava distante para
interagir com os derivados azólicos. Entretanto, a substituição da Gly484 por uma serina
possibilitou a formação de uma ligação de hidrogênio com o heme que não ocorria no caso da
glicina (dados não mostrados). Este fato parece ser importante, uma vez que esta mutação está
141
envolvida com a resistência de cepas de C. neoformans ao fluconazol em isolados clínicos
(RODERO et al., 2003).
Neste estudo foi construído um modelo da CYP51 de C. neoformans, analisada a
interação com derivados azólicos e traçou-se um perfil comparativo com outras CYPs, a partir
do modelo da enzima descrito aqui, é possível estudar novos derivados azólicos descritos na
literatura, como por exemplo, o isavuconazol, um triazol em fase três dos ensaios clínicos,
que é aquela anterior à comercialização. O isavuconazol demonstrou atividade in vitro contra
diversas leveduras e fungos filamentos, além de apresentar vantagens com relação às
características farmacocinéticas comparando com outros já existentes (WANG et al., 2010;
THOMPSON E WIEDERHOLD, 2010).
Os estudos de modelagem molecular possibilitam o planejamento de novos fármacos.
Neste aspecto, a técnica de dinâmica molecular é uma outra ferramenta que pode auxiliar nos
estudos futuros de séries de triazóis por avaliar o comportamento do complexo ligantereceptor ao longo do tempo, além de simular as moléculas de água no sítio ativo que podem
influir nas interações.
142
6 CONCLUSÕES
6.1 Estudo do receptor de NMDA e de seus antagonistas
No estudo dos derivados do ácido piperazina2,3-dicarboxílico, antagonistas do
receptor de NMDA, concluiu-se que, compostos com maior volume, área superficial,
lipofilicidade e energia de HOMO foram os que apresentam melhor atividade. A
conformação, a posição do substituinte e a presença de grupos hidrofóbicos como o
fenantreno também foram importantes. Todos os derivados apresentaram uma boa
biodisponibilidade oral e penetração no SNC de acordo com as análises in silico, sendo que,
dentre os mais potentes, 16h apresentou o melhor perfil de toxicidade teórico.
A análise das interações dos derivados com o modelo construído da subunidade
GluN2B do receptor de NMDA mostrou resíduos diferentes interagindo com as moléculas
mais ativas e com a menos ativa 16a. Além disso, a energia de ligação estimada do complexo
resultante da interação dessa subunidade com as moléculas mais ativas foi menor, justificando
seu melhor perfil de afinidade. Na forma de zwitterion, as moléculas mais ativas interagiram
de modo similar com interação com Gly487 e Asn688, impedindo o fechamento do domínio
S1S2 de ligação ao glutamato, resultando no antagonismo.
A análise da região do N-terminal da subunidade GluN2B e GluN2A do receptor de
NMDA construída por modelagem comparativa e sua interação diferente com ifemprodil
dependendo da subunidade foi justificada pela posição invertida do ligante e a conformação
variante, além da distância diferente entre os anéis aromáticos, o que resultou em interação
com outros resíduos. Provavelmente estas interações não estabilizaram o receptor de forma
eficiente para levar ao efeito de antagonista com a mesma afinidade em ambas subunidades.
143
A análise do modo de ligação da fenil-amidina 1a e das triazolil-amidinas planejadas
recentemente (2a, 2e e 2f) mostraram uma posição no sítio ativo semelhante entre o grupo das
triazolil-amidinas, mas diferente quando se compara com o ifemprodil e a fenil-amidina. O
composto 2f apresentou menor energia de ligação estimada do que as outras e do que o
ifemprodil, o que sugere um perfil promissor para essa molécula.
6.2 Estudo dos derivados de oxoquinolina com atividade anti-herpes
No estudo dos derivados de oxoquinolinas anti-herpéticos concluiu-se que a menor
energia de LUMO, menor lipofilicidade e maior área de superfície polar e número de
grupamentos aceptores e doadores de ligação de hidrogênio estavam relacionados com uma
melhor atividade, representado pelo derivado 3b que teve melhor perfil de atividade e de
citotoxicidade do que o aciclovir. O 3b apresentou ainda propriedades farmacocinéticas como
a absorção intestinal, biodisponibilidade oral e valores de Log BB (penetração na barreira
hematoencefálica) melhores do que do aciclovir.
6.3 Estudo estrutural da CYP51 de C. neoformans e de seus inibidores
O estudo comparativo entre enzimas da família CYP51, alvo terapêutico de
antifúngicos, mostrou conservação da estrutura secundária e terciária e semelhança no modo
de ligação dos derivados azólicos. Apesar da semelhança estrutural da enzima de humanos e
de C. neoformans foram observadas substituições em resíduos do sítio ativo, e diferenças no
mapa de potencial eletrostático que influenciam na especificidade dos ligantes.
144
A menor energia de ligação observada nos complexos construídos com antifúngicos
conhecidos foi com o posaconazol, estando teoricamente relacionada a sua maior área
superficial.
Nas três avaliações in silico realizadas nesta tese, detectou-se resíduos chaves no sítio
de ligação dos alvos terapêuticos e/ou características dos ligantes que foram úteis para
explicar a atividade biológica. Assim, este estudo pode orientar o desenho de novos
compostos para serem usados em neuroinfecções por C. neoformans, herpes e doenças
neurodegenerativas que atingem o SNC.
145
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABREU, P. A. Receptor de NMDA: modelagem molecular por homologia e análise SAR
de antagonistas de um potencial alvo terapêutico em doenças neurodegenerativas.
Dissertação de Mestrado, Universidade Federal Fluminense, Niterói, 2008.
ABREU, P. A.; DA SILVA, V. A.; SANTOS, F. C.; CASTRO, H. C.; RISCADO, C. S.; DE
SOUZA, M. T.; RIBEIRO, C. P.; BARBOSA, J. E.; DOS SANTOS, C. C.; RODRIGUES, C.
R.; LIONE, V.; CORREA, B. A.; CUNHA, A. C.; FERREIRA, V. F.; DE SOUZA, M. C.;
PAIXÃO, I. C. Oxoquinoline derivatives: identification and structure-activity relationship
(SAR) analysis of new anti-HSV-1 agents. Curr Microbiol, v. 62, n. 5, p. 1349-54, 2011.
ALAVIJEH, M. S.; CHISHTY, M.; QAISER, M. Z.; PALMER, A. M. Drug Metabolism and
Pharmacokinetics, the Blood-Brain Barrier, and Central Nervous System Drug Discovery.
NeuroRx, v. 2, n. 4, p. 554–571, 2005.
AL-MASOUDI, N. A.; AL-SOUD, Y. A.; EHERMAN, M.; CLERCQ, E. Synthesis of
acyclic 6,7-dihaloquinolone nucleoside analogues as potential antibacterial and antiviral
agents Bioorg Med Chem, v. 8, n. 6, p. 1407-1413, 2000.
ALMEIDA, O. P. Can we prevent Alzheimer's disease? Rev Bras Psiquiatr, v. 27, n. 4, p.
264-265, 2005.
ALMEIDA, S. M.; LIVRAMENTO, J. A.; PASQÜINI, R.; PALOU, V. B.; OUVEIRA, A.
M.; MISSAKO, D. E.; ONO, M.; ASO, M. C., EURÍPIDES F. Avaliação da barreira hematoencefálica no transplante de medula óssea. Arq Neuropsiquiatr, v. 55, n. 4, p. 812-818,
1997.
AMARAL, A. T.; MONTANARI, C. A. Química medicinal: 25 anos de planejamento
racional de fármacos. Quim Nova, v. 25, Supl. 1, p. 39-44, 2002.
AOKI, S.; ITO-KUWA, S.; NAKAMURA, K.; KATO, J.; NINOMIYA, K.; VIDOTTO, V.
Extracellular proteolytic of Cryptococcus neoformans. Mycopathologia, v. 128, n.3, p. 14350, 1994.
ARMSTRONG, N.; GOUAUX, E. Mechanisms for activation and antagonism of an AMPAsensitive glutamate receptor: crystal structures of the GluR2 ligand binding core. Neuron. v.
28, n. 1, p. 165-81, 2000.
ARNOLD, K.; BORDOLI, L.; KOPP, J.; SCHWEDE, T. The SWISS-MODEL Workspace:
A web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics, v. 22,
n. 2, p. 195-201, 2006.
AUBERSON, Y. P.; ALLGEIER, H.; BISCHOFF, S., LINGENHOEHL, K.,
MORETTI, R.; SCHMUTZ, M. 5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive
NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B
receptor composition. Bioorg Med Chem Lett, v. 12, n. 7, p. 1099–1102, 2002.
146
BALDING, P. R.; PORRO, C. S.; MCLEAN, K. J.; SUTCLIFFE, M. J.; MARECHAL, J.;
MUNRO, A. W.; VISSER, S. P. How do azoles inhibit cytochrome p450 enzymes? A density
functional study. J Phys Chem, v. 112, n. 50, p. 12911–12918, 2008.
BALFOUR, H. H. Antiviral drugs. N Engl J Med, v. 340, n. 16, p. 1255–68. 1999.
BALUNAS, M. J.; KINGHORN, A. D. Drug discovery from medicinal plants. Life Sci, v. 78,
n.5, p.431– 441, 2005.
BARCHIESI ,F.; GIACOMETTI, A.; CIRIONI, O.; ARZENI, D.; SILVESTRI, C.;
KAMYSZ, W.; ABBRUZZETTI, A.; RIVA, A.; KAMYSZ, E.; SCALISE, G. In vitro
activity of the synthetic lipopeptide PAL-Lys-Lys-NH(2) alone and in combination with
antifungal agents against clinical isolates of Cryptococcus neoformans. Peptides, v. 28, n. 8,
p. 1509-13, 2007.
BARINGER, J. R. Herpes Simplex Infections of the Nervous System. Neurol. Clin, v. 26, n.
3, p. 657-674, 2008.
BARON, B. M.; CREGGE, R. J.; FARR, R. A.; FRIEDRICH, D.; GROSS, R. S.;
HARRISON, B. L.; JANOWICK, D. A.; MATTHEWS, D.; MCCLOSKEY, T. C.;
MEIKRANTZ, S.; NYCE, P. L.; VAZ, R.; METZ, W. A. CoMFA, synthesis, and
pharmacological evaluation of (E)-3-(2-carboxy-2-arylvinyl)-4,6-dichloro-1H-indole-2carboxylic acids: 3-[2-(3-aminophenyl)-2-carboxyvinyl]-4,6-dichloro-1H-indole-2-carboxylic
acid, a potent selective glycine-site NMDA receptor antagonist. J Med Chem, v. 48, n. 4, p.
995-1018, 2005.
BARTLETT, T.; BANNISTER, N. J.; COLLETT, V. J.; DARGAN, S. L.; MASSEY, P. V.;
BORTOLOTTO, Z. A.; FITZJOHN, S. M.; BASHIR, Z. I.; COLLINGRIDGE, G. L.;
LODGE, D. Differential roles of NR2A and NR2B-containing NMDA receptors in LTP and
LTD in the CA1 region of two-week old rat hippocampus, Neuropharmacology, v. 52, n. 1,
p. 60-70, 2007.
BEAR, M. F.; CONNORS, B. W.; PARADISO, M. A. Neurociências: desvendando o
sistema nervoso. 2ed, Porto Alegre, Artmed, 2002.
BERNSTEIN, F. C.; KOETZLE, T. F.; WILLIAMS, G. J.; MEYER, E. F.; JR, BRICE, M.
D.; RODGERS, J. R.; KENNARD, O.; SHIMANOUCHI, T.; TASUMI, M. The Protein Data
Bank: a computer-based archival file for macromolecular structures. J Mol Biol, v. 112, n. 3,
p. 535-42, 1977.
BILLAUD, G. THOUVENOT D, MORFIN F. Drug targets in herpes simplex and Epstein
Barr Virus infections. Infect Disord Drug Targets, v. 9, p. 117–125, 2009.
BLAISE, M. C.; SOWDHAMINI, R.; PRADHAN, N. Comparative analysis of different
competitive antagonists interaction with NR2A and NR2B subunits of N-methyl-D-aspartate
(NMDA) ionotropic glutamate receptor. J Mol Model, v. 11, n. 6, p. 489-502, 2005.
BLOT, N.; SCHNEIDER, P.; YOUNG, P.; JANVRESSE, C.; DEHESDIN, D.; TRON,
P.; VANNIER, J. P. Treatment of acyclovir and foscarnetresistant herpes simplex virus
infection with cidofovir in a child after an unrelated bone marrow transplant. Bone
147
Marrow Transplant, v. 26, n. 8, p. 903-905, 2000.
BODNER, R. A.; HOUSMAN, D. E.; KAZANTSEV, A. G. New directions for
neurodegenerative disease therapy: Using chemical compounds to boost the formation of
mutant protein inclusions Cell Cycle, v. 5, n.14, p.1477-80, 2006.
BORZA, I.; KOLOK, S.; IGNÁCZ-SZENDREI, G.; GREINER, I; TÁRKÁNYI, G.;
GALGÓCZY, K.; HORVÁTH, C.; FARKAS, S.; DOMÁNY, G. Indole-2-carboxamidines as
novel NR2B selective NMDA receptor antagonists. Bioorg Med Chem Lett, v. 15, n. 24, p.
5439-5441, 2005.
BOWIE, J. U.; LÜTHY, R.; EISENBERG, D. A. Method to identify protein sequences that
fold into a known three-dimensional structure. Science, v. 253, n. 5016, p. 164-70, 1991.
BOYCE, S.; WYATT, A.; WEBB, J. K.; O'DONNELL, R.; MASON, G.; RIGBY, M.;
SIRINATHSINGHJI, D.; HILL, R. G.; RUPNIAK, N. M. Selective NMDA NR2B
antagonists induce antinociception without motor dysfunction: correlation with restricted
localisation of NR2B subunit in dorsal horn. Neuropharmacology, v. 38, n. 5, p. 611-23,
1999.
BRADBURY, M. W. The concept of a blood brain barrier. London: John Wiley & Sons,
1979.
BRADY, R. C.; BERNSTEIN, D. I. Treatment of herpes simplex virus infections Antiviral
Res. v. 61, n. 2, 73–81, 2004.
BRAMLETT, H.M., DIETRICH, W.D. Pathophysiology of cerebral ischemia and brain
trauma: similarities and differences. J. Cereb. Blood Flow Metab, v. 24, n. 2, p. 133–
150, 2004.
BRANDEN, C.; TOOZE, J. Introduction to protein structure, Garland Publishing, Inc.
New York and London, 1991.
BROWN, D. Unfinished business: target-based drug discovery. Drug Discov Today, v. 12, n.
23-24, p. 1007-1012, 2007.
BROWN, Z. A. Should we use acyclovir to suppress genital herpes late in pregnancy?
Contemp Ob/Gyn, v. 5, p. 67–70, 2000.
BULLER, A. L.; MONAGHAN, D. T. Pharmacological heterogeneity of NMDA receptors:
Characterization of NR1a/NR2D heteromers expressed in Xenopus oocytes. Eur. J.
Pharmacol, v. 320, n. 87-94, 1997.
CAO, Z.; LICKEY, M. E.; LIU, L.; KIRK, E.; GORDON, B. Postnatal development of NR1,
NR2A and NR2B immunoreactivity in the visual cortex of the rat. Brain Res, v. 859, n. 1, p.
26-37, 2000.
CARDOSO, F. L.; BRITES, D.; BRITO, M. A. Looking at the blood–brain barrier: Molecular
anatomy and possible investigation approaches. Brain Research reviews, v.64, n. 2, p. 328363, 2010.
148
CARVALHO, I.; PUPO, M. T.; BORGES, A. D. L.; BERNARDES, L. S. C. Introdução a
modelagem molecular de fármacos no curso experimental de química farmacêutica. Quim
Nova, v. 26, n. 3, p. 428-438, 2003.
CASTRO, F. C. LANDEIRA FERNANDEZ, J. Alma, Mente e Cérebro na Pré-história e nas
Primeiras Civilizações Humanas. Psicol. Reflex. Crít., v. 23, n. 1, p. 37-48.
CHAFFEY, H.; CHAZOT, P. L. NMDA receptor subtypes: Structure, function
and therapeutics. Current Anaesthesia & Critical Care, v. 19, n. 4, p. 183–201, 2008.
CHAI, X.; ZHANG, J.; HUA, H.; YU, S.; SUN, Q.; DAN, Z.; JIANG, Y.; WU, Q. Design,
synthesis, and biological evaluation of novel triazole derivatives as inhibitors of cytochrome
P450 14a-demethylase Eur J Med Chem, v. 44, n. 5, p. 1913–1920, 2009.
CHAVATTE, P.; FARCE, A. A computational view of COX-2 inhibition. Anti-Cancer Ag
Med Chem, v. 6, n. 3, p. 239-249, 2006.
CHENARD, B. L.; MENNITI, F. S. Antagonists selective for NMDA receptors containing
the NR2B subunit. Curr Pharm Des, v. 5, n. 5, p. 381-404, 1999.
CHEN, C. K.; LEUNG, S. S. F.; GUILBERT, C.; JACOBSON, M.; MCKERROW, J.H.;
PODUST, L. M. Structural characterization of CYP51 from Trypanosoma Cruzi and
Trypanosoma brucei bound to the antifungal drugs posaconazole and fluconazole. Plos Negl
Trop Dis, v. 4, n. 4, p. 651-666, 2010.
CHEN, H. V.; LIPTON, S. A. The chemical biology of clinically tolerated NMDA receptor
antagonists. J Neurochem, v. 97, n. 6, p. 1611–1626, 2006.
CHEUNG, N. S.; O’CALLAGHAN, D.; RYAN, M. C.; DUTTON, R.; WONG, M. G.;
BEART, P. M. Structure-activity relationships of competitive NMDA receptor antagonists.
Eur J Pharmacol, v. 313, n. 1-2, p. 159- 162, 1996.
CHOI, D. W.; KOH, J. Y.; PETERS, S. Pharmacology of glutamate neurotoxicity in cortical
cell culture: attenuation by NMDA antagonists. J Neurosci, v. 8, n. 1, p. 185-196, 1988.
CLAIBORNE, C. F.; MCCAULEY, J. A.; LIBBY, B. E.; CURTIS, N. R.; DIGGLE, H. J.;
KULAGOWSKI, J. J.; MICHELSON, S. R.; ANDERSON, K. D.; CLAREMON, D. A.;
FREIDINGER, R. M.; BEDNAR, R. A.; MOSSER, S. D.; GAUL, S. L.; CONNOLLY, T.
M.; CONDRA, C. L.; BEDNAR, B.; STUMP, G. L.; LYNCH, J. J.; MACAULAY, A.;
WAFFORD, K. A.; KOBLAN, K. S.; LIVERTON, N. J. Orally Efficacious NR2B-selective
NMDA Receptor Antagonists. Bioorg Med Chem Lett, v. 13, n. 4, p. 697-700, 2003.
CLAYTON, D. A., MESCHES, M. H., ALVAREZ, E., BICKFORD, P. C., BROWNING, M.
D. A hippocampal NR2B deficit can mimic age-related changes in long-term potentiation and
spatial learning in the Fischer 344 rat. J Neurosci, v. 22, n. 9, p. 3628-3637, 2002.
149
CODINA, M. G.; DE CUETO, M.; VICENTE, D.; ECHEVARRÍA, J. E.; PRATS, G.
Microbiological diagnosis of central nervous system infections. Enferm Infecc Microbiol
Clin, v. 29, n. 2, p. 127-134. 2011.
COHEN, N. C.; BLANEY, J. M.; HUMBLET, C.; GUND, P.; BARRY, D. C. Molecular
modeling software and methods for medicinal chemistry. J Med Chem, v. 33, n. 3, p. 883894, 1990.
COLLINS, P.; OLIVER, N. M. Sensitivity monitoring of herpes simplex
virus isolates from patients receiving acyclovir. J Antimicrob Chem, v. 18, (suppl. B), p.
103-112, 1986.
COREY, L.; HANDSFIELD, H. H. Genital herpes and public health: Addressing a global
problem. JAMA v. 283, n. 6, p. 791–4, 2000.
CURTIS, N. R.; DIGGLE, H. J.; KULAGOWSKI, J. J.; LONDON, C.; GRIMWOOD, S.;
HUTSON, P. H.; MURRAY, F.; RICHARDS, P.; MACAULAY, A.; WAFFORD, K. A.
Novel N1-(benzyl) Cinnamamidine Derived NR2B Subtype-Selective NMDA Receptor
Antagonists. Bioorg Med Chem Lett, v. 13, n. 4, p. 693-696, 2003.
DANVE-SZATANEK, C.; AYMARD, M.; THOUVENOT, D.; MORFIN, F.; AGIUS, G.;
BERTIN, I.; BILLAUDEL, S. CHANZY, B. COSTE-BUREL, M.; FINKIELSZTEJN, L.;
FLEURY, H.; HADOU, T.; HENQUELL, C.; LAFEUILLE, H.; LAFON, M. E.; LE FAOU,
A., LEGRAND, M. C.; MAILLE, L.; MENGELLE, C.; MORAND, P.; MORINET, F.;
NICAND, E.; OMAR, S.; PICARD, B.; POZZETTO, B.; PUEL, J.; RAOULT, D.; SCIEUX,
C.; SEGONDY, M.; SEIGNEURIN, J. M.; TEYSSOU, R.; ZANDOTTI, C. Surveillance
network for herpes simplex virus resistance to antiviral drugs: a three year follow-up. J Clin
Microbiol, v. 42, n. 1, p. 242–249, 2004.
DE CLERCQ, E.; HOLY, A. Acyclic nucleoside phosphonates: a key class of antiviral drugs.
Nat Rev Drug Discov, v. 4, n. 11, p. 928–940, 2005.
DE CLERCQ, E. In search of a selective therapy of viral infections. Antivir Res, v. 85, n. 1,
p. 19–24, 2010.
DE VRIES, H. E.; KUIPER, J.; DE BOER, A. G.; VAN BERKEL, T. J.; BREIMER, D. D.
The blood-brain barrier in neuroinflammatory diseases. Pharmacol Rev, 49, 143–155; 1997.
DIAZ-MITOMA, F.; RUBEN, M.; SACKS, S.; MACPHERSON, P.; CAISSIE, G. Detection
of viral DNA to evalute outcome of antiviral treatment of patients with recurrent genital
herpes. J Clin Microbiol, v. 34, n. 3, p. 657-63, 1996.
DICKSON, M.; GAGNON, J. P. Key factors in the rising cost of new drug discovery and
development. Nat Rev Drug Discov v.3, n.5, p.417–429; 2004.
DINGLEDINE, R.; BORGES, K.; BOWIE, D.; TRAYNELIS, S.F. The glutamate receptor
ion channels. Pharmacol Rev, v. 51, n. 1, p. 7-61, 1999.
150
EIZURU Y. Development of new antivirals for herpesviruses. Antivir Chem Chemother, v.
14, n. 6, p. 299-308, 2003.
ELLIS, M. Invasive Fungal Infection: Evolving Challenges for Diagnosis and Therapeutics.
Mol Immunol, v. 38, n. 12-13, p. 947-957, 2001.
ENRIZ R.D. The legacy of the past, the reality of the present and the hopes of the future.
Theochem v. 731, n. 1-3, p. 163–172, 2005.
ERLICH, K. S.; MILLS, J.; CHATIS, P.; MERTZ, G. J.; BUSCH, D. F.; FOLLANSBEE, S.
E.; GRANT, R. M.; CRUMPACKER, C. S. Aciclovir-resistant herpes simplex virus
infections in patients with the acquired immunodeficiency syndrome. N Engl J Med, v. 320,
n. p. 293–296. 1989.
ERNST, M. E., FRANEY, R. J. Acyclovir and ganciclovir-induced neurotoxicity. Ann
Pharmacother, v. 32, n. 1, p. 111–113, 1998.
FENG, B.; MORLEY, R.M.; JANE, D.E.; MONAGHAN, D.T. The effect of competitive
antagonist chain length on NMDA receptor subunit selectivity. Neuropharmacol, v. 48, n. 3,
p. 354-9, 2005.
FENG, B.; TSE, H. W.; SKIFTER, D. A.; MORLEY, R.; JANE, D. E.; MONAGHAN, D. T.
Structure–activity analysis of a novel NR2C/NR2D-preferring NMDA receptor antagonist: 1(phenanthrene-2-carbonyl)piperazine-2,3-dicarboxylic acid. Br J Pharmacol, v. 141, n. 3, p.
508–516, 2004.
FIELD, A. K., BIRON, K. K. The End of Innocence" Revisited: Resistance of Herpesviruses
to Antiviral Drugs. Clin Microbiol Rev, v.7, n. 1, p. 1-13, 1994.
FINGER, S.; FERNANDO, H. R. E. George Squier and the discovery of cranial trepanation:
A landmark in the history of surgery and ancient medicine. J. Hist. Med. allied Sc., v. 56, p.
353-381, 2001.
FORRESTER, A.; FARRELL, H.; WILKINSON, G.; KAYE, J.; DAVIS-POYNTER, N.;
MINSON, T. Construction and properties of a mutant herpes simplex virus type 1
with glycoprotein gH coding sequences deleted. J Virol. v. 66, n. 341–48, 1992.
FRICKER, J. Herpes vaccines: spinning a new DISC. Lancet, v. 348, n. 9041, p. 1576, 1996.
FRINGUELLI, R.; GIACCHÈ, N.; MILANESE, L.; CENCI, E.; MACCHIARULO, A.;
VECCHIARELLI, A.; COSTANTINO, G.; SCHIAFFELLA, F. Bulky 1,4-benzoxazine
derivatives with antifungal activity. Bioorg Med Chem, v. 17, n. 11, p. 3838-46, 2009.
FRØLUND, B.; GREENWOOD, J. R.; HOLM, M. M.; EGEBJERG, J.; MADSEN, U.;
NIELSEN, B.; BRÄUNER-OSBORNE, H.; STENSBØL, T. B.; KROGSGAARD-LARSEN,
P. Tetrazolyl isoxazole amino acids as ionotropic glutamate receptor antagonists: synthesis,
modelling and molecular pharmacology. Bioorg Med Chem, v. 13, n. 18; p. 5391-5398,
2005.
151
FURUKAWA, H.; SINGH, S. K.; MANCUSSO, R.; GOUAUX, E. Subunit arrangement
and function in NMDA receptors. Nature, v. 438, n. 7065, p. 185-192, 2005.
GALLAGHER, M. J. HUANG, H.; PRITCHETT, D. B.; LYNCH, D. R. Interactions between
Ifenprodil and the NR2B Subunit of the N-Methyl-D-aspartate Receptor. J Biol Chem, v.
271, n. 16, p. 9603–9611, 1996.
GALAL, A. M.; ROSS S. A. J. M.; ELSOHLY, M. A. Antifungal activity of artemisinin
derivatives. J Nat Prod, v. 68, n. 8, p. 1274-6, 2005.
GALLIS, H. A.; DREW, R. H.; PICKARD, W. W. Amphotericin B: 30 years of clinical
experience. Rev Infect Dis, v. 12, n. 2, p. 308-29, 1990.
GUEX, N.; PEITSCH, M. C. SWISS-MODEL and the Swiss-PdbViewer: An environment for
comparative protein modeling. Electrophoresis, v. 18, n. 15, p. 2714-2723, 1997.
GRECO, A.; DIAZ, J-J.; THOUVENOT, D.; MORFIN, F. Novel targets for the development
of anti-herpes compounds. Infect Disord Drug Targets, v. 7, n. 1, p. 11-8, 2007.
HAMILTON, J. D, HOLDOM, M. D. Antioxidant systems in the pathogenic fungi of man
and their role in virulence. Med Mycol, v. 37, n. 6, p. 175-89, 1999.
HAN, R.; ZHANG, J.; LI, S.; CAO, S.; GENG, H.; YUAN, Y.; XIAO, W.; LIU, S.; LIU, D.
Homology modeling and screening of new 14α-demethylase inhibitor (DMI) fungicides based
on optimized expression of CYP51 from Ustilago maydis in Escherichia coli. J Agric Food
Chem, v. 58, n. 24, p. 12810-6, 2010.
HANSCH, C. LEO, A.; MEKAPATI, S. B.; KURUP, A. QSAR and ADME. Bioorg Med
Chem, v. 12, n. 12, p. 3391–3400, 2004.
HARDMAN, J. G.; LIMBIRD, L. E.; GILMAN, A. G. GOODMAN E GILMAN’S.
Pharmacol Ther, 10th ed. Mc-Graw-Hill, United States, 2001.
HARGROVE, T.Y., WAWRZAK, Z., LIU, J., NES, W.D., WATERMAN, M.R.,
LEPESHEVA, G.I. Substrate preferences and catalytic parameters determined by structural
characteristics of sterol 14a-demethylase (CYP51) from Leishmania infantum. J Biol Chem,
v. 286, n. 30, p. 26838-26848, 2011.
HILLISCH, A.; PINEDA, L. F.; HILGENFELD, R. Utility of homology models in the drug
discovery process. Drug Discov Today, v. 9, n. 15, p. 659–669, 2004.
HITCHCOCK, C. A. Cytochrome P-450-dependent 14 alpha-sterol demethylase of Candida
albicans and its interaction with azole antifungals. Biochem Soc Trans, v. 19, n. 3, p. 782–
787, 1991.
HOU, T; WANG, J.; ZAHNG, W.; ZHANG, W.; XIAOJIE, X. ADME Evaluation in Drug
Discovery. 7. Prediction of Oral Absorption by Correlation and Classification. J Chem Inf
Model, v. 47, n. 1, p. 208 -218, 2007.
HQSAR. Manual, SYBYL 6.9.2, Tripos Inc., St. Louis, MO, 2003.
152
HUSSAIN, S.; WAGENER, M. W.; SINGH, N. Cryptococcus neoformans infection in organ
transplant recipients: variables influencig clinical characteristics and outcome. Emerg Infect
Dis, v. 7, n. 3, p. 375–81, 2001.
INAGAKI, H.; TAKAHASHI, H.; TAKEMURA, M. Synthesis and antibacterial activity of
novel 6-fluoro-1-[(1R,2S)-2-fluorocyclopropan-1-yl]-4-oxoquinoline-3-carboxylic acids
bearing cyclopropane-fused 2-amino-8-azabicyclo[4.3.0]nonan-8-yl substituents at the C-7
position Bioorg Med Chem Lett, v. 14, n. 20, p. 5193-5198, 2004.
ISAAC, J. T.; NICOLL, R. A.; MALENKA, R. C. Evidence for silent synapses: implications
for the expression of LTP. Neuron, v. 15, p. 427–434, 1995.
JANE, D. E. Antagonists acting at the NMDA receptor complex: Potential for therapeutic
applications. In Glutamate and GABA receptors and transporters. Krogsgaard-Larsen, P.,
Egebjerg, J., Schousboe, A., Eds.; Taylor and Francis: London, 2002, p 69-98.
JANE, D. E.; OLVERMAN, H. J.; WATKINS, J. C. Agonists and competitive antagonists:
Structure-activity and molecular modeling studies. In The NMDA receptor. Collingridge G.
L.; Watkins J. C., Eds.; Oxford University Press: Oxford, UK, 1994; p 31-104.
JORGENSEN, W. L. The Many Roles of Computation in Drug Discovery, Science, v. 303, n.
5665, p. 1813-1818, 2004.
KALE, P. E JOHNSON, L.B. Second-generation azole antifungal agents, Drugs Today, v.
41, n. 2, p. 91–105, 2005.
KARAKAS, E.; SIMOROWSKI N.; FURUKAWA, H. Structure of the zinc-bound aminoterminal domain of the NMDA receptor NR2B subunit. The EMBO Journal, v. 28, n. 24, p.
3910–3920, 2009.
HALL, B. J.; GHOSH, A. Regulation of AMPA receptor recruitment at developing synapses.
Trends Neurosci, v. 31, n. 2, p. 82-89, 2008.
HANSEN, K. B.; FURUKAWA, H.; TRAYNELIS, S. F. Control of assembly and function of
glutamate receptors by the amino-terminal domain. Mol Pharmacol, v. 78, n. 4, p. 535-49,
2010.
HARDIN, T. C. Sexually transmitted diseases. In: Herfindal, E. T., Gourley, D. R. (Eds.),
Textbook of Therapeutics-Drug and Disease Management. Williams and Wilkins,
Baltimore, 1996, p. 1389–1404.
HUGGINS, D. J.; GRANT, G. H. The function of the amino terminal domain in NMDA
receptor modulation. J. Mol Graph Model. v. 23, n. 4, p. 381–388, 2005.
KARAKAS, E.; SIMOROWSKI, N.; FURUKAWA, H. Subunit arrangement and
phenylethanolamine binding in GluN1/GluN2B NMDA receptors. Nature, v. 475, n. 7355, p.
249-53, 2011.
153
KHAN, M. T.; SYLTE, I. Predictive QSAR Modeling for the Successful Predictions of the
ADMET Properties of Candidate Drug Molecules. Curr Drug Discov Technol, v. 4, n. 3, p.
141-149, 2007.
KEISER, M. J.; SETOLA, V.; IRWIN, J. J.; LAGGNER, C.; ABBAS, A.I.; HUFEISEN, S.
J.; JENSEN, N. H.; KUIJER, M. B.; MATOS, R. C.; TRAN, T. B.; WHALEY, R.;
GLENNON, R. A.; HERT, J.; THOMAS, K. L.; EDWARDS, D. D.; SHOICHET, B. K.;
ROTH, B. L. Predicting New Molecular Targets for Known Drugs. Nature, v. 462, n. 7072,
p. 175-181, 2009.
KEMP, J. A.; MCKERNAN, R.M. NMDA receptor pathways as target. Nature neurosci, v.5,
Suppl 1039-42, p. 1039-1042, 2002.
KIEFER, F. The SWISS-MODEL Repository and associated resources. Nucleic Acids Res, v.
37, p. 387-392, 2009.
KOPP, J.; SCHWEDE, T. The SWISS-MODEL Repository: new features and functionalities.
Nucleic Acids Res, v. 34, n. database, p. 315-318, 2006.
KOROLKOVAS, A.; BURCKHALTER, J. H. Química Farmacêutica. Rio de Janeiro,
Guanabara Koogan, 1988, 783 p.
KUTSUWADA, T.; SAKIMURA, K.; MANABE, T., TAKAYAMA, C., KATAKURA, N.;
KUSHIYA, E.; NATSUME, R.; WATANABE, M.; INOUE, Y.; YAGI, T.; AIZAWA, S.;
ARAKAWA, M.; TAKAHASHI, T.; NAKAMURA, Y.; MORI, H.; MISHINA, M.
Impairment of suckling response, trigeminal neuronal pattern formation, and hippocampal
LTD in NMDA receptor epsilon 2 subunit mutant mice. Neuron, v. 16, n. 2; p. 333-344,
1996.
LAUBE, B.; SCHEMM, R.; BETZ, H. Molecular determinants of ligand discrimination in the
glutamate-binding pocket of the NMDA receptor. Neuropharmacol, v. 47, n. 7, p. 994-1007,
2004.
LEE, H. H., TAKEUCHI, N., SENDA, H., KUWAE, A., HANAI, K. IR study on aqueous
solution behavior of D-cycloserine. Spectrosc Lett, v. 30, n. 4, p. 685-700, 1997.
LEE, S.W.; KIM, W.J.; PARK, J.A.; CHOI, Y.K.; KWON, Y.W.; KIM, K.W. Blood–brain
barrier interfaces and brain tumors, Arch Pharm Res, v. 29 n. 4, p. 265–275, 2006.
LENGAUER, T.; RAREY, M. Computational methods for biomolecular docking. Curr
Opin Struct Biol, v. 6, n. 3, p. 402-406, 1996.
LEPESHEVA, G. I., HARGROVE, T. Y., ANDERSON, S., KLESHCHENKO, Y.,
FURTAK, V., WAWRZAK, Z., VILLALTA, F., WATERMAN, M. R. Structural insights
into inhibition of sterol 14alpha-demethylase in the human pathogen Trypanosoma cruzi J
Biol Chem v. 285, n. 33, p. 25582-25590, 2010a.
LEPESHEVA, G. I.; PARK, H. W.; HARGROVE, T. Y.; VANHOLLEBEKE, B.;
WAWRZAK, Z.; HARP, J. M., SUNDARAMOORTHY, M., NES, W. D., PAYS, E.,
CHAUDHURI, M., VILLALTA, F., WATERMAN, M. R. Crystal structures of
154
Trypanosoma brucei sterol 14alpha-demethylase and implications for selective treatment of
human infections. J Biol Chem, v. 285, n. 3, p. 1773-1780, 2010b
LÉVEILLÉ, F.; EL GAAMOUCH, F.; GOUIX, E.; LECOCQ, M.; LOBNER, D.; NICOLE,
O.; BUISSON, A. Neuronal viability is controlled by a functional relation between synaptic
and extrasynaptic NMDA receptors. FASEB J, v. 22, n. 12, p.4258-4271, 2008.
LEVITZ, S. M. The ecology of Cryptococcus neoformans and the epidemiology of
cryptococcosis. Rev Infect Dis, v. 13, n. 6, p. 1163-1169, 1991.
LILL, M. A. Multi-dimensional QSAR in drug discovery. Drug Discov Today, v. 12, n. 2324, p. 1013-1017, 2007.
LIPINSKI, C. A.; LOMBARDO, F.; DOMINY, B. W.; FEENEY, P. J. Experimental and
computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and
development settings. Adv Drug Deliv Rev, v. 46, n. 1-3, p. 3-26, 2001.
LIPTON, S. Prospects for clinically tolerated NMDA antagonists. Open-channel blockers and
alternative redox states of nitric oxide. Trends Neurosci, v. 16, n. 12, p. 527–532, 1993.
LUCERO, B.; GOMES, C. R.; FRUGULHETTI, I. C.; FARO, L. V.; ALVARENGA, L.; DE
SOUZA, M. C.; DE SOUZA, T. M.; FERREIRA, V. F. Synthesis and anti-HSV-1 activity of
quinolonic acyclovir analogues. Bioorg Med Chem Lett, v. 16, n. 4, p. 1010-1013, 2006.
LUO, C. G.; ZENG, C. C.; YANG, L. F.; HE, H. Q.; WANG, C. X.; HU, L. M. Synthesis of
6-sulfamoyl-4-oxoquinoline-3-carboxylic acid derivatives as integrase antagonists with antiHIV activity. Chines Chem Lett, v. 20, n. 7, p. 789-792, 2009.
LÜTHY, R.; BOWIE, J. U.; EISENBERG, D. Assessment of protein models with threedimensional profiles. Nature, v. 356, n. 6364, p. 83-5, 1992.
LYON, A. W.; MANSOOR, A.; TROTTER, M. J. Urinary gems: acyclovir crystalluria. Arch
Pathol Lab Med, v. 126, n. 6, p. 753–754, 2002.
MARCHENA, J.; ROBERTS, A. C.; MIDDLEBROOKS, P. G.; VALAKH, V.; YASHIRO,
K.; WILFLEY, L. R.; PHILPOT, B. D. NMDA Receptor Antagonists Reveal Age-Dependent
Differences in the Properties of Visual Cortical Plasticity. J Neurophysiol, v. 100, n. 4, p.
1936–1948, 2008.
MARINELLI, L.; COSCONATI, S.; STEINBRECHER, T.; LIMONGELLI, V.;
BERTAMINO, A.; NOVELLINO, E.; CASE, D. A. Homology Modeling of NR2B
Modulatory Domain of NMDA Receptor and Analysis of Ifenprodil Binding. Chem Med
Chem, v. 2, n. 10, p. 1498-1510, 2007.
MARTINEZ, R. Atualização no uso de agentes antifúngicos. J Bras Pneumol, v. 32, n. 5, p.
449-60, 2006.
MARTZ, A.; MONY, L.; NEYTON, J.; PAOLETTI , P.; GOELDNER, M.; FOUCAUD, B.
Reactive derivatives for affinity labeling in the ifenprodil site of NMDA receptors. Bioorg
Med Chem Lett, v. 18, n. 9, p. 2765–2770, 2008.
155
MASUKO, T.; KASHIWAGI, K.; KUNO, T.; NGUYEN, N. D.; PAHK, A. J.; FUKUCHI, J.;
IGARASHI, K.; WILLIAMS, K. A Regulatory Domain (R1-R2) in the Amino Terminus of
the N-Methyl-D-Aspartate Receptor: Effects of Spermine, Protons, and Ifenprodil, and
Structural Similarity to Bacterial Leucine/Isoleucine/Valine Binding Protein. Mol
Pharmacol, v. 55, n. 6, p. 957-969, 1999.
MATHUR, P.; GRAYBEAL, G.; FEYDER, M.; DAVIS, M. I.; HOLMES, A. Fear memory
impairing effects of systemic treatment with the NMDA NR2B subunit antagonist, Ro 256981, in mice: Attenuation with ageing. Pharmacol Biochem Behav. v. 91, n. 3, p. 453–460,
2009
MCBAIN, C. J.; KLECKNER, N. W.; WYRICK, S.; DINGLEDINE, R. Structural
requirements for activation of the glycine coagonist site of N-methyl-D-aspartate receptors
expressed in Xenopus oocytes. Mol Pharmacol, v. 36, n. 4, p. 556–565. 1989.
MENNITI, F. S.; PAGNOZZI, M. J.; BUTLER, P.; CHENARD, B. L.; JAW-TSAI, S. S.;
FROST WHITE, W. CP-101,606, an NR2B subunit selective NMDA receptor antagonist,
inhibits NMDA and injury induced c-fos expression and cortical spreading depression in
rodents. Neuropharmacol, v. 39, n. 7, 1147-55, 2000.
MITEVA, M. A.; VIOLAS, S.; MONTES, M.; GOMEZ, D.; TUFFERY, P.;
VILLOUTREIX, B. O. FAF-Drugs: free ADME/tox filtering of compound collections.
Nucleic Acids Res, v. 34, p. 738-744, 2006.
MODA, T. L.; MONTANARI, C. A.; ANDRICOPULO, A. D. Hologram QSAR model for
the prediction of human oral bioavailability. Bioorg Med Chem, v. 15, n. 24, p. 7738–7745,
2007.
MODA, T. L.; TORRES, L. G.; CARRARA, A. E.; ANDRICOPULO, A. D.PK/DB: a
database for pharmacokinetic properties and predictive in silico ADME models.
Bioinformatics, v. 24, n. 19, p. 2270, 2008.
MONYER, H.; BURNASHEV, N.; LAURIE, D. J.; SAKMANN B.; SEEBURG, P. H.
Developmental and regional expression in the rat brain and functional properties of four
NMDA receptors. Neuron, v. 12, n. 3, p. 529–540, 1994.
MONY, L.; KRZACZKOWSKI, L.; LEONETTI M, L. E.; GOFF, A.; ALARCON, K.;
NEYTON, J.; BERTRAND, H. O.; ACHER, F.; PAOLETTI, P. Structural basis of NR2Bselective antagonist recognition by N-methyl-D-aspartate receptors. Mol Pharmacol, v. 75, n.
1, p. 60–74, 2009.
MOREIRA, T. A.; FERREIRA, M. S.; RIBAS, R. M.; BORGES, A. S. Criptococose: estudo
clínico-epidemiológico, laboratorial e das variedades do fungo em 96 pacientes. Rev Soc
Bras Med Trop, v. 39, n. 3, p. 255-258, 2006.
MORETTI, L.; PENTIKÄINEN, O. T.; SETTIMO, L.; JOHNSON, M. S. Model structures of
the N-methyl- -aspartate receptor subunit NR1 explain the molecular recognition of agonist
and antagonist ligands. J Struct Biol, v. 145, n. 3, p. 205-215, 2004.
156
MORETTI, M. L. Consenso em criptococose. Rev Soc Bras Med Trop, v. 41, n. 5, p. 524544, 2008.
MORFIN, F.; THOUVENOT, D. Herpes simplex virus resistance to antiviral drugs. J Clin
Virol, v. 26, n. 1, p. 29–37, 2003.
MORLEY, R. M.; TSE, H. W.; FENG, B.; MILLER, J. C.; MONAGHAN, D. T.; JANE, D.
E. Synthesis and Pharmacology of N1-Substituted Piperazine-2,3-dicarboxylic Acid
Derivatives Acting as NMDA Receptor Antagonists. J Med Chem, 48, 2627-2637, 2005.
MOURITSEN, O. G.; JORGENSEN, K. A new look at lipid-membrane structure in relation
to drug research. Pharm Res, v. 15, n. 10, p. 1507-1519, 1998.
MÜLLER, W.; LOWE, D. A.; NEIJT, H.; URWYLER, S.; HERRLING, P.; BLASER, D.;
SEEBACH, D. Synthesis and N-methyl-aspartate (NMDA) antagonist properties of the
enantiomers of a-amino-5(phosphonomethyl)[I, I’-biphenyl].3.propanoic acid. Use of a new
chiral glycine derivative. Helv Chim Acta, v. 75, n. 3, p. 855-864, 1992.
MURRAY, P. R.; ROSENTHAL, K. S.; KOBAYASHI, G. S.; PFALEER, M. A.
Microbiologia Médica. Guanabara Koogan 5th ed, 2006.
NARAYANAN, R.; GUNTURI, S. B. In silico ADME modelling: prediction models for
blood–brain barrier permeation using a systematic variable selection method. Bioorg Med
Chem, v. 13, n. 8, p. 3017–3028, 2005.
NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger Principles of Biochemistry. 4ed. Nova Iorque: W.
H. Freeman, 2004.
NESSE, R. M., WILLIAMS, G. C. Why We Get Sick. Vintage Books, New York.
Niederkorn, J.Y. See no evil, hear no evil, do no evil: the lessons of immune privilege. Nat
Immunol, v.7, p. 354–359, 2006.
NGUYEN, K. T.; CLAIBORNE, C. F.; MCCAULEY, J. A., LIBBY, B. E.; CLAREMON, D.
A.; BEDNAR, R. A.; MOSSER, S. D.; GAUL, S. L.; CONNOLLY, T. M.; CONDRA, C. L.;
BEDNAR, B.; STUMP, G. L.; LYNCH, J. J.; KOBLAN, K. S.; LIVERTON, N. J. Cyclic
benzamidines as orally efficacious NR2B-selective NMDA receptor antagonists. Bioorg Med
Chem Lett, v. 17, n. 14, p. 3997-4000, 2007.
NIKAM, S. S.; MELTZER, L. T. NR2B Selective NMDA Receptor Antagonists Curr
Pharm Design, v. 8, n. 10, p. 845-855, 2002.
NIOSH - National Institute for Occupational Safety and Health Registry of Toxic Effects of
Chemical Substances (RTECS). Disponível em
<http://www.cdc.gov/niosh/rtecs/default.html>, acesso em julho, 2011.
OLIVEIRA, J. C. Micologia Médica. Rio de Janeiro, Control Lab, 1999.
OOMS, F. Molecular Modeling and Computer Aided Drug Design. Examples of their
applications in Medicinal Chemistry. Curr Med Chem, v. 7, n. 2, p. 141-158, 2000.
157
ORVEDAHL, A. E.; LEVINE, B. Autophagy and viral neurovirulence. Cell Microbiol, v.
10, n. 9, p. 1747-56, 2008.
PAJOUHESH, H.; LEN, G. R. Medicinal chemical properties of successful central nervous
System drugs. NeuroRx, v. 2, n. 4, p. 541-553, 2005.
PAN, D.; IYER, M,; LIU, J.; LI, Y.; HOPFINGER, A. J. Constructing optimum blood brain
barrier QSAR models using a combination of 4Dmolecular similarity measures and cluster
analysis. J Chem Inf Comput Sci, v. 44, n. 6, p. 2083–2098, 2004.
PAOLETTI, P.; NEYTON, J. NMDA receptor subunits: Function and pharmacology. Curr
Opnion Pharm, v. 7, n. 1, p. 39-47, 2007.
PATRICK, G. L. An Introduction to Medicinal Chemistry, 2nd ed., Oxford University
Press: Oxford, 2001.
PARSONS, C. G.; STOFFLER, A.; DANYSZ, W. Memantine: a NMDA receptor antagonist
that improves memory by restoration of homeostasis in the glutamatergic system - too little
activation is bad, too much is even worse. Neuropharmacol, v. 53, n. 6, p. 699-723, 2007.
PEDROSO, R. S.; FERREIRA, J. C.; CANDIDO, R. C. In vitro susceptibility to antifungal
agents of environmental Cryptococcus spp. isolated in the city of Ribeirão Preto, São Paulo,
Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 101, n. 3, p. 239-243, 2006.
PEITSCH, M. C. Protein modeling by E-mail. Nature Biotech, v. 13, p. 658-660, 1995.
PERFECT, J. R.; COX, G. M. Drug resistance in Cryptococcus neoformans. Drug Resist
Update, v. 2, n. 4, p. 259–69, 1999.
PERIN-DUREAU, F.; RACHLINE, J.; NEYTON, J.; PAOLETTI, P. Mapping the binding
site of the neuroprotectant ifenprodil on NMDA receptors. J Neurosci, v. 22, n. 14, p. 5955–
5965, 2002.
PERSIDSKY, Y.; RAMIREZ, S. H.; HAORAH, J.; KANMOGNE, G. D. Blood-brain barrier:
structural components and function under physiologic and pathologic conditions, J.
Neuroimmune Pharmacol. v. 1, n. 3, p. 223–236, 2006.
PHILIPS, S. P.; MACKINTOSH, A. Beyond 2005. The future of pharmaceutical marketing
and sale. Perspect sci, Special edition. Chichester, Sussex, UK: Ernst & Young, 2002.
PODUST, L. M.; POULOS, T. L.; WATERMAN, M. R. Crystal structure of cytochrome
P450 14a-sterol demethylase (CYP51) from Mycobacterium tuberculosis in complex with
azole inhibitors. PNAS, v. 98, n. 6, p. 3068–3073, 2001.
PREHN, J. H. Protective effect of transforming growth factor-beta 1 on beta-amyloid
neurotoxicity in rat hippocampal neurons. Mol Pharmacol, v. 49, n. 2, p. 319-28, 1996.
PROTA, A.; VOGT, J.; PILGER, B.; PEROZZO, R.; WURTH, C.; MARQUEZ, V. E.;
RUSS, P.; SCHULZ, G. E.; FOLKERS, G.; SCAPOZZA, L. Kinetics and crystal structure of
the wild-type and the engineered Y101F mutant of Herpes simplex virus type 1 thymidine
158
kinase interacting with (North)-methanocarba-thymidine. Biochemistry, v. 39, n. 31, p. 9597603, 2000.
RAMACHANDRAN, G.N.; RAMAKRISHNAN, C.; SASISEKHARAN, V. Stereochemistry
of polypeptide chain configurations. J Mol Biol v. 7, p. 95–9, 1963.
RAPP, R. P. Changing strategies for the management of invasive fungal infections.
Pharmacotherapy, v. 24, n. 2, p. 4-28, 2004.
REARDON, J. E.; SPECTOR, T. Herpes simplex virus type 1 DNA polymerase: Mechanism
of inhibition by acyclovir triphosphate. J Biol Chem, v. 264, n. 13, p. 7405–7411, 1989.
REICHERT, J. M. Trends in development and approval times for new therapeutics in the
United States. NatRev Drug Discov, v. 2, n.9, p. 695– 702, 2003.
REOLON, A.; PEREZ, L. R. R.; MEZZARI, A. Prevalência de Cryptococcus neoformans nos
pombos urbanos da cidade de Porto Alegre, Rio Grande do Sul. J Bras Patol Med Lab, v.
40, n. 5, p. 293-298, 2004.
REUSSER, P. Herpesvirus resistance to antiviral drugs: a review of the mechanisms, clinical
importance and therapeutic options. J Hosp Infect, v. 33, n. 4, p. 235-48, 1996.
RODERO, L.; MELLADO, E.; RODRIGUEZ, C.; SALVE, A.; GUELFAND, L.; CAHN, P.;
CUENCA-ESTRELLA, M.; DAVEL, G.; RODRIGUEZ-TUDELA, J. L. G484S amino acid
substitution in 14-α-lanosterol demethylase (ERG11) is related to fluconazol resistance in a
recurrent Cryptococcus neoformans clinical isolate. Antimic Agents Chemother, v. 47, n. 11
p. 3653-3656, 2003.
ROSENBERG, P. A; AIZENMAN, E. Hundred-fold increase in neuronal vulnerability to
glutamate toxicity in astrocyte-poor cultures of rat cerebral cortex. Neurosci Lett v. 103, n. 2,
p. 162–168, 1989.
ROST, B.; SANDER, C. Bridging the protein sequence-structure gap by structure predictions.
Annu Rev Biophys Biomol Struct, v. 25, n. 3, p. 113-136, 1996.
RUPPA, B.; RAUBB, S.; MARIANB, C.; HO, H. LTJE Molecular design of two sterol 14ademethylase homology models and their interactions with the azole antifungals ketoconazole
and bifonazole. J Comput Aided Mol Des v. 19, n. 3, p. 149–163, 2005.
RYDER, N. S. Terbinafine: mode of action and properties of the squalene epoxidase
inhibition. Br J Dermatol, v. 126, n. 39, p. 2–7, 1992.
SAAG, M. S.; GRAYBILL, R. J.; LARSEN, R. A.; PAPPAS, P. G.; PERFECT, J. R.;
POWDERLY, W. G.; SOBEL, J. D.; DISMUKES, W. E. Practice Guidelines for the
Management of Cryptococcal Disease. Clin Infect Dis, v. 30, n. 4, p. 710–8, 2000.
SACK, J. S., SAPER, M. A., QUIOCHO, F. A. Periplasmic binding protein structure and
function. Refined X-ray structures of the leucine/isoleucine/valine-binding protein and its
complex with leucine. J Mol Biol, v. 206, n. 1, p. 171-191, 1989.
159
SAKIMURA, K.; KUTSUWADA, T.; ITO, I.; MANABE, T.; TAKAYAMA, C.; KUSHIYA,
E.; YAGI, T., AIZAWA, S.; INOUE, Y.; SUGIYAMA, H.; MISHINA, M. Reduced
hippocampal LTP and spatial learning in mice lacking NMDA receptor
epsilon 1 subunit. Nature, v. 373, p. 151-155, 1995.
SANDER, T. Toxicity Risk Assessment. Actelion Pharmaceuticals Ltd., Gewerbestrasse 16,
4123 Allschwil, Switzerland, 2001. Disponível em <http://www.organicchemistry.org/prog/peo/tox.html>, acesso em julho de 2011.
SANT’ANNA, C. M. R. Glossário de Termos Usados no Planejamento de Fármacos. Quim
Nova, v. 25, n. 3, p. 505-512, 2002.
SANTOS, A. C. S. Estudo Semi-Empírico da Interação de 20-hidroxiecdisona e seus
Agonistas Sintéticos com Modelos de Homologia de Receptores de Ecdisteróide (EcR).
Tese de Doutorado, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 2002.
SANTOS, F. C.; ABREU, P. A.; CASTRO, H. C.; PAIXÃO, I. C. P.; CIRNE-SANTOS, C.
C.; GIONGO, V.; BARBOSA, J. E.; SIMONETTI, B. R.; GARRIDO, G.; BOU-HABIB, D.
C.; SILVA, D. O.; BATALHA, P. N.; TEMEROZO, J. R.; SOUZA, T. M.; NOGUEIRA, C.
M.; CUNHA, A. C.; RODRIGUES, C. R.; FERREIRA, V. F.; SOUZA, M. C. B. V.
Synthesis, antiviral activity and molecular modeling of oxoquinoline derivatives. Bioorg Med
Chem, v. 17, n. 15, p. 5476-5481, 2009.
SATYANARAYANAJOIS, S. D. Active-Learning Exercises to Teach Drug-Receptor
Interactions in a Medicinal Chemistry Course. Am J Pharm Ed, v. 74, n. 8, p. 147, 2010.
SATHIAMOORTHY, B. New antifungal flavonoid glycoside from Vitex negundo. Bioorg
Med Chem Lett, v. 17, n. 1, p. 239-242, 2006.
SAVARINO, A., BOELAERT, J.R., CASSONE, A., MAJORI, G., CAUDA, R. Effects of
chloroquine on viral infections: an old drug against today’s diseases? Lancet
Infect Dis, v. 3, n. 11, p. 722–727, 2003.
SCHELD, W. M.; WHYTLEY, R. J.; MARRA, C. M. Herpes simplex virus; neurologic
manifestation of varicella and herpes zoster; cytomegalovirus; Epstein-Barr virus, human
herpesvirus-6; B virus; arthropod-borne viral encephalitides. In: Infections of the Central
Nervous System. Lippincott Williams & Wilkins v. 3, p. 123-230, 2004.
SCHEPMANN, D.; FREHLAND, B.; LEHMKUHL, K.; TEWES, B.; WÜNSCH, B.
Development of a selective competitive receptor binding assay for the determination of the
affinity to NR2B containing NMDA receptors. J Pharmaceutic Biom Anal v. 53, n. 3, p.
603–608, 2010.
SEN, I.; JOSHI, D.C.; JOSHI, P.G.; JOSHI, N.B. NMDA and non-NMDA receptor-mediated
differential Ca2+ load and greater vulnerability of motor neurons in spinal cord cultures.
Neurochem Int, v. 52, n. 1-2, p. 247-55, 2008.
SENTHILKUMAR, P.; DINAKARAN, M.; BANERJEE, D.; DEVAKARAM, R. V. D.;
YOGEESWARI, P.; CHINA, A.; NAGARAJA, V.; SRIRAM, D. Synthesis and
antimycobacterial evaluation of newer 1-cyclopropyl-1,4-dihydro-6-fluoro-7-(substituted
160
secondary amino)-8-methoxy-5-(sub)-4-oxoquinoline-3-carboxylic acids. Bioorg Med Chem,
v. 16, n. 5, p. 2558-2569, 2008.
SEVERSON, J. L., TYRING, S. K. Relation between herpes simplex viruses and human
immunodeficiency virus infections. Arch Dermatol, v. 135, n. 11, p. 1393–1397, 1999.
SHEEHAN, D. J.; HITCHCOCK, C. A.; SIBLEY, C. M. Current and Emerging Azole
Antifungal Agents. Clin. Microbiol. Rev. v. 12, n. p. 40-79, 1999.
SHEFFIELD, J. S.; HOLLIER, L. M.; HILL, J. B.; STUART, G. S.; WENDEL, G. D. Jr.
Acyclovir Prophylaxis to Prevent Herpes Simplex Virus Recurrence at Delivery: A
Systematic Review. Obstet Gynecol. v. 102, n. 6, p. 1004-1005, 2003.
SHENG,C.; MIAO, Z.; JI, H.; YAO, J.; WANG, W.; CHE, X.; DONG, G.; LU, J.; GUO, W.;
ZHANG, W. Three-Dimensional Model of Lanosterol 14_-Demethylase from Cryptococcus
neoformans: Active-Site Characterization and Insights into Azole Binding. Antimicrob
agents chemother, v. 53, n. 8, p. 3487–3495, 2009.
SPRENGEL, R.; SUCHANEK, B.; AMICO, C.; BRUSA, R.; BURNASHEV, N.; ROZOV,
A.; HVALBY, O.; JENSEN, V.; PAULSEN, O.; ANDERSEN, P.; KIM, J. J.; THOMPSON,
R. F. Importance of the intracellular domain of NR2 subunits for NMDA receptor function in
vivo. Cell, v. 92, n. 2, p. 279-89, 1998.
SIDRIM, J. J. C.; ROCHA, M. F. G. Micologia médica. À luz de autores contemporáneos.
Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2004.
SILVA, F. C.; SOUZA, M. C. B. V.; FRUGULHETTI, I. C. P. P.; CASTRO, H. C.; SOUZA,
S. L. O.; SOUZA, T. M. L.; RODRIGUES, D. Q.; SOUZA, A. M. T.; ABREU, P. A.;
PASSAMANI, F.; RODRIGUES, C. R.; FERREIRA, V. F. Synthesis, HIV-RT inhibitory
activity and SAR of 1-benzyl-1H-1,2,3-triazole derivatives of carbohydrates. Eur J Med
Chem, v. 44, n. 1, p. 373-383, 2009.
SINGH, M. M.; MEHROTRA, P. K.; AGNIHOTRIA, A.; SRIVASTAVA, R. P.; SETH, M.;
BHADURI, A.P.; KAMBOJ, V.P. Contraceptive and hormonal properties of a new 1,4dihydro-2-oxoquinoline derivative (compound 84–182) in rodents and rhesus monkeys.
Contraception, v. 36, n. 2, p. 239-251, 1987.
SIPPL, M. J. Recognition of Errors in Three-Dimensional Structures of Proteins. Proteins, v.
17, n. 4, p. 355-362, 1993.
SMITH, W. B. Introduction to Theoretical Organic Chemistry and Molecular Modeling.
New York, Wiley-VCH Publishers, 1996.
SOBOLEVSKY, A. I.; ROSCONI, M. P.; GOUAUX, E. X-Ray Structure, Symmetry and
Mechanism of an AMPA-Subtype Glutamate Receptor. Nature v. 462, p. 745-756, 2009.
SOUZA TM, MARIA CECILIA BASTOS V. DE SOUZA B, VITOR F. FERREIRA B,
CARLA VERONICA B. SANTOS CANUTO B, ISAKELLY PEREIRA MARQUES B,
CARLOS FREDERICO L. FONTES C,1, IZABEL C.P.P. FRUGULHETTI. Inhibition of
161
HSV-1 replication and HSV DNA polymerase by the chloroxoquinolinic ribonucleoside 6chloro-1,4-dihydro-4-oxo-1-(b-d-ribofuranosyl)quinoline-3-carboxylic acid and its aglycone.
Antivir Res. v. 77, n. 1, p. 20–27, 2008.
STOLL, L.; HALL, J.; VAN BUREN, N.; HALL, A.; KNIGHT, L.; MORGAN, A.; ZUGER,
S.; VAN DEUSEN, H.; GENTILE, L. Differential regulation of ionotropic glutamate
receptors. Biophys J, v. 92, n. 4, p. 1343-1349, 2007.
STRUSHKEVICH, N.; USANOV, S. A.; PARK, H. W. Structural basis of human CYP51
inhibition by antifungal azoles. J Mol Biol, v. 397, n. 4, p. 1067-1078, 2010.
SUPERTI, F.; AMMENDOLIA, M. G.; MARCHETTI, M. New advances in anti-HSV
chemotherapy. Curr Med Chem, v. 15, n. 9, p. 900-911, 2008.
TANG, Y. P.; SHIMIZU, E.; DUBE, G. R.; RAMPON, C.; KERCHNER, G.; ZHUO, M.;
LIU, G.; TSIEN, J. Z. Genetic enhancement of learning and memory in mice. Nature, v. 401,
n. 6748, p. 63–69, 1999.
TAKEHARA, K.; KAWAHARA, S.; MUNEMOTO, Y.; KURIYAMA, H.; MORI, H.;
MISHINA, M..; KIRINO, Y. The N-methyl-D-aspartate (NMDA)-type glutamate receptor
GluRepsilon2 is important for delay and trace eyeblink conditioning in mice. Neurosci Lett,
v. 364, n. 1, p. 43–47, 2004.
TIKHONOVA, I. G.; BASKIN, I. I.; PALYULIN, V. A.; ZEFIROV, N. S.; BACHURIN, S.
O. Structural Basis for Understanding Structure-Activity Relationships for the Glutamate
Binding Site of the NMDA Receptor. J Med Chem, v. 45, n. 18, 3836-3843, 2002.
TYLER, K. L. Herpes simplex virus infections of the central nervous system: encephalitis and
meningitis, including Mollaret's. Herpes, v. 11, n. 2, p. 57-64, 2004.
TYRING, S. K. Advances in the treatment of herpesvirus infection: the role of famciclovir.
Clin. Ther. v. 20, n. 4, p. 661–670, 1998.
THOMAS, G. Fundamentals of Medicinal Chemistry. New York, John Wiley & Sons,
2003.
TÖLLE, T. R.; BERTHELE, A.; ZIEGLGÄNSBERGER, W.; SEEBURG, P.H.; WISDEN,
W. The differential expression of 16 NMDA and non-NMDA receptor subunits in the rat
spinal cord and in periaqueductal gray. J Neurosci, v. 13, n. 12, p. 5009-5028, 1993.
THOMPSON, G. R.; WIEDERHOLD, N. P. Isavuconazole: a comprehensive review of
spectrum of activity of a new triazole. Mycopathologia, v. 170, n. 5, p. 291-313. 2010.
TONG, W.; LOWIS, D. R.; PERKINS, R.; CHEN, Y.; WELSH, W. J.; GODDETTE, D. W.;
HERITAGE, T. W.; SHEEHAN, D. M. Evaluation of quantitative structure-activity
relationship methods for large-scale prediction of chemicals binding to the estrogen receptor.
J Chem Inf Comput Sci, v. 38, n. 4, p. 669-677, 1998.
TRABULSI, L. R.; ALTHERTUM, F. Microbiologia. 4a edição, São Paulo, Atheneu, 2004.
162
TROULLIER, P. Drug development for neglected diseases: a deficient market and a public
health policy failure. Lancet, v. 359, n. 9324, p. 2188-2194, 2002.
URWYLER, S.; LAURIE, D.; LOWE, D. A.; MEIER, C. L.; MijLLER, W. Biph(enylderivatives of 2-Amino-7-phosphonoheptanoic Acid, a Novel Class of Potent Competitive NMethyl-D-aspartate Receptor Antagonists-I. Pharmacological Characterization in Vitro
Neuropharmacology, v. 35, n. 6, p. 643-654, 1996.
VALENZUELA-HARRINGTON, M.; GRUART, A.; DELGADO-GARCIA, J. M.
Contribution of NMDA receptor NR2B subunit to synaptic plasticity during associative
learning in behaving rats. Eur J Neurosci, v. 25, n. 3, p. 830–6, 2007.
VARELLA, R. B.; PIRES, I. L.; SARAIVA, C. A.; GUIMARÃES, A. C. C.; GUIMARÃES,
M. A. A. M. Diagnóstico laboratorial da infecção pelo vírus herpes simples (HSV) em
pacientes transplantados e não-transplantados J Bras Patol Med Lab, v. 41, n. 4, p. 257-262,
2005.
VESELOVSKY, A. V.; IVANOV, A. S. Strategy of Computer-aided drug design. Curr Drug
Targets Infect Disord, v. 3, n. 1, p. 33-40, 2003.
WALKER, P. L. A bioarchaeological perspective on the history of violence. Annual Review
of Anthropology, v. 30, p. 573-596, 2001.
WANG, W.; SHENG, C.; CHE, X.; JI, H.; CAO, Y.; MIAO, Z.; YAO, J.; ZHANG, W.
Discovery of highly potent novel antifungal azoles by structure-based rational design. Bioorg
Med Chem Lett, v. 19, n.20, p. 5965–5969, 2009.
VAN DE WATERBEEMD, H.; KANSY, M. Hydrogen bonding capacity and brain
penetration. Chimia, v. 46, n. 7-8, p. 299 –303, 1992.
VAN DE WATERBEEMD, H.; GIFFORD, E. ADMET in silico modelling: Towards
prediction paradise? Nature, v.2, p. 192-204, 2003.
VAN GUNSTEREN, W. F.; BILLETER, S. R.; EISING, A. A.; HÜNENBERGER, P. H.;
KRÜGER, P.; MARK, A. E.; SCOTT, W. R. P.; TIRONI, I. G. Biomolecular Simulation:
The GROMOS96 Manual and User Guide. Verlag der Fachvereine Hochschulverlag AG
an der ETH Zurich, 1996
WANG, W.; WANG, S.; LIU, Y.; DONG, G.; CAO, Y.; MIAO, Z.; YAO, J.; ZHANG, W.;
SHENG, C. Novel conformationally restricted triazole derivatives with potent antifungal
activity. Eur J Med Chem, v. 45, n. 12, p. 6020-6026, 2010.
WARD, P.L.; ROIZMAN, B. Herpes simplex genes: the blueprint of a successful human
pathogen. Trends Genet, v.10, n. 8, p. 267–74. 1994.
WATKINS, J. C.; KROGSGAARD-LARSEN, P.; HONORE T. Structure-activity
relationships in the development of excitatory amino acid receptor agonists and competitive
antagonists. Trends Pharmacol. Sci, v. 11, n. 25-33, p. 1990.
163
WIEDERSTEIN, M.; SIPPL, M. J. ProSA-web: interactive web service for the recognition of
errors in three-dimensional structures of proteins. Nucleic Acids Research, v. 35, p. W407–
W410, 2010.
WEBER, B., CINATL, J. Antiviral therapy of herpes simplex virus infection: recent
developments. J Eur Acad Dermatol Venereol, v. 6, n.2., p. 112-126, 1996.
WEIL, Z. M., NORMAN, G. J.; DEVRIES, A. C.; NELSON, R.J. The injured nervous
system: A Darwinian perspective. Progress Neurobiol, v. 86, n.1, p. 48–59, 2008.
WERMUTH, C. G. The practice of medicinal chemistry, 2nd, San Diego, University of
Louis Pasteur, Academic Press, 2003.
WHITE, T. C.; MARR, K. A.; BOWDEN, R. A. Clinical, cellular, and molecular factors that
contribute to antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev, v. 11, n. 2, p. 382–402, 1998;
WHITLEY, R. J. Herpes simplex virus infection. Semin Pediatr Infect Dis, v. 13, n. 1, p. 611, 2002.
WHITLEY RJ, ROIZMAN B. Herpes simplex virus infections. Lancet, v. 357, n. 9267,
p.1513-1518, 2001.
WICLES, B. L. Dimorphism and haploid fruiting in Cryptococcus neoformans: association
with the a-mating type. Proceeding of the National Academy of Science, v. 93, n. 4, p.
7327-31, 1996.
WILLIAMS, K. Ifenprodil Discriminates Subtypes of the N-Methyl-D-aspartate
Receptor: Selectivity and Mechanisms at Recombinant Heteromeric Receptors. Mol
Pharmacol, v. 44, n. 4, p. 851-859, 1993.
WINGARD, J. R. Fungal infection after bone marrow transplant. Biology of Blood and
Marrow Transplantation, v. 5, n. 2, p. 55-68, 1999.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. What are neurological disorders? 2007a.
Disponível em <http://www.who.int/features/qa/55/en/> Acesso em Janeiro de 2010.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Neurological Disorders: Public Health Challenges.
WHO Press, Geneva, Switzerland, 2007b, 218 p.
YONEDA, J. D.; ALBUQUERQUE, M. G.; LEAL, K. Z.; SEIDL, P. R.; WHEELER, R. A.;
BOESCH, S. E.; ALENCASTRO, R. B., DE SOUZA, M. C. B. V.; FERREIRA, V. F.
Molecular dynamics simulations of a nucleoside analogue of 1,4-dihydro-4-oxoquinoline-3carboxylic acid synthesized as a potential antiviral agent: Conformational studies in vacuum
and in water. Theochem, v. 778, n. 1-3, p. 97–103, 2006.
ZHAO, L.; LIU, D.; ZHANG, Q.; ZHANG, S.; WAN, J.; XIAO, J. Expression and homology
modeling of sterol14a-demethylase from Penicillium digitatum. FEMS Microbiol Lett, v.
277, n. 1, p. 37–43, 2007.
164
ANEXO A – Artigos publicados durante o doutorado
1. Abreu PA, da Silva VA, Santos FC, Castro HC, Riscado CS, de Souza MT, Ribeiro
CP, Barbosa JE, dos Santos CC, Rodrigues CR, Lione V, Correa BA, Cunha AC,
Ferreira VF, de Souza MC, Paixão IC. Oxoquinoline derivatives: identification and
structure-activity relationship (SAR) analysis of new anti-HSV-1 agents. Curr
Microbiol. v. 62, n. 5, p. 1349-54, 2011.
2. Lourenço AL, Abreu PA, Leal B, da Silva Júnior EN, Pinto AV, Pinto Mdo C, Souza
AM, Novais JS, Paiva MB, Cabral LM, Rodrigues CR, Ferreira VF, Castro HC.
Identification of nor-β-lapachone derivatives as potential antibacterial compounds
against Enterococcus faecalis clinical strain. Curr Microbiol. v. 62, n. 2, p. 684-9,
2011.
3. Campos VR, Abreu PA, Castro HC, Rodrigues CR, Jordão AK, Ferreira VF, de
Souza MC, Santos Fda C, Moura LA, Domingos TS, Carvalho C, Sanchez EF, Fuly
AL, Cunha AC. Synthesis, biological, and theoretical evaluations of new 1,2,3triazoles against the hemolytic profile of the Lachesis muta snake venom. Bioorg Med
Chem. v. 17, n. 21, p. 7429-34, 2009.
4. Castro HC, Abreu PA, Geraldo RB, Martins RC, dos Santos R, Loureiro NI, Cabral
LM, Rodrigues CR. Looking at the proteases from a simple perspective. J Mol
Recognit. v. 24, n. 2, p. 165-181, 2010.
5. Geraldo RB, Bello ML, Dias LR, Vera MA, Nagashima T, Abreu PA, Santos MB,
Albuquerque MG, Cabral LM, Freitas AC, Kalil MV, Rodrigues CR, Castro HC.
Antiplatelet activity and structure-activity relationship study of Pyrazolopyridine
Derivatives as potential series for treating thrombotic diseases. J Atheroscler
Thromb. v. 17, n. 7, p. 730-9, 2010.
6. Leal B, Afonso IF, Rodrigues CR, Abreu PA, Garrett R, Pinheiro LC, Azevedo AR,
Borges JC, Vegi PF, Santos CC, da Silveira FC, Cabral LM, Frugulhetti IC,
Bernardino AM, Santos DO, Castro HC. Antibacterial profile against drug-resistant
Staphylococcus epidermidis clinical strain and structure-activity relationship studies of
1H-pyrazolo[3,4-b]pyridine and thieno[2,3-b]pyridine derivatives. Bioorg Med
Chem. v. 16, n. 17, p. 8196-204, 2008.
7. Do Nascimento VV, Castro HC, Abreu PA, Oliveira AE, Fernandez JH, Araújo Jda S,
Machado OL. In silico structural characteristics and α-amylase inhibitory properties of
Ric c 1 and Ric c 3, allergenic 2S albumins from Ricinus communis seeds. J Agric
Food Chem. v. 59, 9, p. 4814-21, 2011.
8. Pinheiro LC, Abreu PA, Afonso IF, Leal B, Corrêa LC, Borges JC, Marques IP,
Lourenço AL, Sathler P, dos Santos AL, Medeiros CA, Cabral LM, Júnior ML,
Romeiro GA, Ferreira VF, Rodrigues CR, Castro HC, Bernardino AM. Identification
of a potential lead structure for designing new antimicrobials to treat infections caused
by Staphylococcus epidermidis-resistant strains. Curr Microbiol. v. 57, n. 5, p. 463-8.
165
9. Santos F. da C, Abreu P, Castro HC, Paixão IC, Cirne-Santos CC, Giongo V, Barbosa
JE, Simonetti BR, Garrido V, Bou-Habib DC, Silva Dde O, Batalha PN, Temerozo JR,
Souza TM, Nogueira CM, Cunha AC, Rodrigues CR, Ferreira VF, de Souza MC.
Synthesis, antiviral activity and molecular modeling of oxoquinoline derivatives.
Bioorg Med Chem. v. 17, n. 15, p. 5476-81, 2009.
10. Pinheiro, L.C.S. Borges, J. C.; Oliveira, C.D.; Ferreira, V. F.; Romeiro, G. A.;
Marques, I. P.; Abreu, P. A.; Frugulheti, C.P.P; Rodrigues, C.R.; Albuquerque, M.
G.; Castro, H. C.; Bernardino, A.M.R. Synthesis of new 4-(phenylamino)thieno[2,3b]pyridines and derivatives of the novel benzo[b]thieno[3,2-h][1,6]naphthyridine
tetracyclic system ARKIVOC (xiv) 77-87, 2008.
11. Santos, M.S.; Gomes, A. O.; Bernardino, A. M. R.; Souza, M. C.; Khan, M.A.; Brito,
M. A.; Castro, H.C.; Abreu, P.A.; Rodrigues, C. R.; Léo R.M.M.; Leonf, L. L.; CantoCavalheiro, M. M. Synthesis and Antileishmanial Activity of New 1-Aryl-1HPyrazole-4- Carboximidamides Derivatives J. Braz. Chem. Soc., v. 22, N. 2, p. 352-358,
2011.
12. Ventura, A. L.M.; Abreu, PA.; Freitas, R. C. C.; Sathler, P. C.; Loureiro, N.; Castro,
H. C. Sistema colinergico: revisitando receptores, regulacao e a relacao com a doenca
de Alzheimer, esquizofrenia, epilepsia e tabagismo. Rev Psiq Clín. v. 37, n. 2, p. 6672, 2010.
13. Silva, F. C.; Souza, M. C. B. V.; Frugulhetti, I. C. P. P.; Castro, H. C.; Souza, S. L. O.;
Souza, T. M. L.; Rodrigues, D. Q.; Souza, A. M. T.; Abreu, P. A.; Passamani, F.;
Rodrigues, C. R.; Ferreira, V. F. Synthesis, HIV-RT inhibitory activity and SAR of 1benzyl-1H-1,2,3-triazole derivatives of carbohydrates. Eur J Med Chem, v. 44, n. 1,
p. 373-383, 2009.