EFEITO DE VÁRIOS COMPOSTOS NA ACTIVIDADE IN
VITRO DA FOSFÁTASE ALCALINA DA SALIVA
HUMANA
NASCIMENTO, João ; OLIVEIRA, José ; SILVA, João
Orientador: LEMOS, Clara Dra
Faculdade de Medicina da Universidade do Porto
Objectivos
Resultados
Conclusões
 Dosear a actividade enzimática da fosfátase alcalina (FA) da saliva
humana;
Análise Geral de Resultados (gráfico 1)
 Foi confirmado o efeito inibidor do levamisole já descrito, assim como
se verificou que a solução de glicose actuou como activador da
fosfátase alcalina salivar.
 Verificar o efeito in vitro de levamisole, sumo de maçã, chá preto, chá
preto com glicose e solução aquosa de glicose na actividade
enzimática da FA salivar humana;
 Verificou-se uma tendência activadora do chá.
 Verificar a influência do grupo sanguíneo do sistema ABO, sexo e uso
de contraceptivos orais na actividade da fosfátase alcalina salivar.
 Na amostra estudada, o chá com glicose e o sumo apresentaram um
efeito activador; no entanto, os resultados obtidos não são
estatisticamente significativos.
Introdução
Grupos sanguíneos – sistema ABO (gráfico 2 e 3)
A fosfátase alcalina (FA) é uma ecto-enzima (EC 3.1.31.1) que
efectua a hidrólise de mono-ésteres fosfóricos com actuação óptima em
pH alcalino. [2,4]
 Os elementos dos grupos sanguíneos AB e B não foram
considerados na análise uma vez que não existiam elementos
suficientes (n=0 e n=3 respectivamente).
Esta existe sob a forma de 4 isoenzimas (intestinal, placentária,
específica das células germinativas e não específica) e 3 isoformas (renal,
óssea e hepática) encontrando-se a sua presença nos fluídos orgânicos
intimamente relacionada com os estados fisiológicos e patológicos dos
respectivos tecidos. [5] A existência FA em grandes quantidades nas
membranas de células envolvidas em transportes transmembranares,
sugere uma possível relação desta com o transporte de substâncias. [2]
 Verificou-se uma forte tendência para uma maior actividade basal da
enzima nos indivíduos de grupo sanguíneo O em relação aos de
grupo A confirmando-se os estudos anteriores [1].
É já conhecido o papel inibidor do levamisole na actividade da
isoenzima não específica. [5]
Gráfico 1 – Resultados Gerais
 O efeito do chá com glicose foi superior no grupo sanguíneo O (com
significado estatístico), verificando-se ainda uma forte tendência no
efeito do chá, da solução aquosa de glicose e do sumo.
Na amostra, levamisole inibiu, sumo de maçã, chá preto, chá preto com
glicose e solução aquosa de glicose estimularam
(nmol p-NP.mL saliva-1.min-1)
Pretende-se avaliar a actividade enzimática da FA presente na
saliva humana pelo seu papel de catalizador na desfosforilação do pnitrofenilfosfato (p-NPP) em p-nitrofenol (p-NP):
Sexo (gráfico 4 e 5)
Efeito
(% do controlo)
140
 Verificou-se uma forte tendência para uma maior actividade basal da
enzima nos indivíduos de sexo feminino em relação aos de sexo
masculino contrariando as conclusões de estudos anteriores nos
quaisquer não se verificavam diferenças [5].
120
100
80
p-NPP → p-NP + Pi
 O efeito de todos os compostos testados foi superior no sexo
masculino. No entanto, esta diferença apenas é significativa para o
sumo e para o chá, verificando-se contudo uma nítida tendência para
tal no chá mais glicose e solução aquosa de glicose.
60
40
Realizaram-se curvas de calibração e de cinética desta enzima e
procedeu-se à determinação da actividade da FA da saliva humana in
vitro, sob a presença de levamisole, sumo de maçã, chá preto, chá preto
com glicose e solução aquosa de glicose.
20
0
Efeito do
levamisole
Efeito do chá
Efeito do
chá+glicose
Efeito da
glicose
Efeito do
sumo
Uso de contraceptivos orais (gráfico 6 e 7)
O
Material e Métodos
Durante todo o trabalho experimental foi utilizada uma solução A (47 mg pNPP/25 mL Tris) contendo substrato para a FA assim como uma solução
de NaHO 0,02M, a 4ºC.
Gráfico 2 – Actividade basal por grupo
sanguíneo
Na amostra, os indivíduos de grupo O (n=19)
apresentaram uma actividade basal superior
aos indivíduos de grupo A (n=19)
(nmol p-NP.mL saliva-1.min-1)
Gráfico 3 – Efeito por grupo sanguíneo
A
Na amostra, o efeito dos compostos testados foi na
generalidade superior nos indivíduos de grupo
sanguíneo O em relação aos indivíduos de grupo A
 Verificou-se com significado estatístico que para o chá com glicose
os indivíduos que afirmaram tomar contraceptivos apresentaram um
efeito superior. Há ainda uma forte tendência para tal diferença em
relação ao chá e solução aquosa de glicose. É ainda de referir que
no sumo há uma nítida tendência para um maior efeito no grupo que
afirmou não tomar quaisquer contraceptivos orais.
Efeito
(% do controlo)
160
Incubação: A incubação foi efectuada a 37ºC durante 30min. seguindo-se
a adição de 2mL da solução de NaHO a todos os tubos preparados sendo
estes mantidos a 4ºC durante 10 min.
140
120
100
Todas as absorvâncias foram medidas utilizando um comprimento de onda
de 410nm.
80
Comentário geral aos resultados
60
1ª Parte
40
20
Foi construída uma curva de calibração a partir da qual se desenhou um
gráfico da cinética enzimática da fosfátase alcalina salivar
2ª Parte
Foi analisado o efeito de vários compostos na actividade da enzima em
estudo com a preparação dos tubos:
C: controlo
C+LEV: levamisole (2,408 mg/mL)
C+CHA: chá preto (250 mL de água para beber fervida; infusão
durante 3 minutos)
C+CHA+GLI: chá preto com glicose (6 g glicose adicionados a 100
mL do chá já preparado)
C+GLI: solução aquosa de glicose (glicose a 3g/50mL)
C+SUMO: sumo de maçã
0
Efeito do
levamisole
Efeito do
chá+glicose
Efeito da
glicose
Efeito do
sumo
Masculino
Feminino
Gráfico 4 – Actividade basal por sexo
Na amostra, os indivíduos de sexo feminino
(n=41) apresentaram uma actividade basal
superior aos indivíduos de sexo masculino
(n=34)
(nmol p-NP.mL saliva-1.min-1)
Efeito do chá
Gráfico 5 – Efeito por sexo
Na amostra, o efeito dos compostos testados foi na
generalidade superior nos indivíduos de sexo
masculino em relação aos indivíduos de sexo
feminino (NOTA: é de notar que o cha, chagli e
sumo tiveram um efeito estimulador no sexo
masculino e inibidor no sexo feminino)
Para o estudo de cada um dos compostos acima, foram utilizados, em
cada tubo, 200μL de solução A, 150μL de amostra (saliva previamente
homogeneizada) assim como 50μL do composto a testar excepto no
controlo. Foi ainda adicionada água destilada até perfazer o volume de
500μL. Incubação. Foi efectuada a leitura da absorvância e calculada a
actividade de cada um dos tubos utilizando para tal efeito uma curva de
calibração de declive 15,130.
Foi utilizada uma amostra de 77 alunos das Faculdades de Medicina e
Medicina Dentária da Universidade do Porto sendo 41 do sexo feminino e
34 do sexo masculino (total de 75 alunos), tendo 2 alunos não respondido
ao questionário entregue.
Os dados foram analisados recorrendo a testes estatísticos para um nível
de significância de 5%.
É ainda de referir que, além dos factores acima descritos, a falta de dados
em relação a muitos dos indivíduos dos quais foi recolhida saliva (sexo,
grupo sanguíneo, uso de contraceptivos) dificultou o tratamento dos dados
e a inferência de resultados objectivos.
Bibliografia
2. CALHAU C (2002). Tese de Doutoramento:
transmembranar e fosfátase alcalina”.
100
“Transporte
80
3. HERBETH B, Bagrel A, Dalo B, Siest G, Leclerc J, Rauber G
(1981). Influence of oral contraceptives of differing dosages on
alpha-1-antitrypsin, gamma-glutamyltransferase and alkaline
phosphatase. Clin Chim Acta: 112(3):293-9.
60
40
20
0
Amostra e tratamento estatístico
A falta de significado estatísticos de algumas das análises efectuadas
prende-se com a disparidade de valores encontrados quer por diferenças
fisiológicas entre os indivíduos, quer por possíveis erros decorridos do
próprio processo de investigação/experimentação.
1. BAYER PM, Hotschek H, Knoth E (1980). Intestinal alkaline
phosphatase and the ABO blood group system--a new aspect.
Clin Chim Acta: 108(1):81-7.
Efeito
(% do controlo)
140
120
NOTA: para cada um dos compostos foi preparado 1 branco e 3 ensaios.
A solução A apenas foi adicionada aos brancos após todo o processo de
incubação.
 Verificou-se uma forte tendência para uma maior actividade basal da
enzima nos indivíduos de sexo feminino que afirmaram tomar
contraceptivos orais (n=10) ao contrário do que sugeriam estudos
anteriores. [3]
Efeito do
levamisole
Efeito do
chá
Efeito do
chá+glicose
Efeito da
glicose
Efeito do
sumo
toma
Gráfico 6 – Actividade basal segundo uso
de contraceptivos orais
Na amostra, os indivíduos de sexo feminino
(n=41) que referiram tomar contraceptivos
orais (n=10) apresentaram uma actividade
basal superior aos indivíduos que referiram
não tomar quaisquer contraceptivos (n=30)
Gráfico 7 – Efeitos segundo uso de
não toma
contraceptivos orais
Na amostra, o efeito do levamisole e do sumo foi
superior nos indivíduos do sexo feminino que
afirmaram não tomar quaisquer contraceptivos orais
(n=30). Nos outros compostos verificou-se que o
efeito foi superior nos indivíduos do sexo feminino
que afirmaram tomar contraceptivos orais (n=10)
4. MARTINS MJ (2002). Tese de Doutoramento: “Fosfátase
alcalina. Actividades em diversas situações fisiológicas e
patológicas.
Relação
com
sistemas
de
transporte
transmembranar”.
5. Protocolo Experimental “Fosfátase Alcalina: Projecto de
Investigação. Efeito in vitro de várias bebidas na actividade da
fosfátase alcalina da saliva.”. Bioquímica 1º Ano, Ano Lectivo
2003/2004
6. VAN HOOF VO, Hoylaerts MF, Geryl H, Van Mullem M, Lepoutre
LG et al (1990). Age and sex distribution of alkaline phosphatase
isoenzymes by agarose electrophoresis. Clin Chem 36: 875-8.