Cinética Enzimática corresponde a análise quantitativa do efeito de cada um dos fatores que
influenciam na expressão da atividade enzimática , avaliando [E], [S], [P], inibidores e
ativadores, T , pH e imobilização (heterogênea)
V proporcional a [E] na zona linear relação P versus tempo
Cinética Enzimática é estudada para:
•
Determinar as constantes de afinidade do S e dos inibidores (Km e Ki);
•
Conhecer as condições ótimas da catálise (T, pH, [S] etc);
•
Ajudar a elucidar os mecanismos de reação (estudo ordem reação e tipo cinética);
•
Determinar a função de uma determinada enzima em uma rota metabólica (para um
dado S).
1
Centro ativo complementar em tamanho, forma e
natureza química à molécula do substrato, ou seja, uma
cavidade geometricamente rígida.
Emil Fischer (1894): alto grau de especificidade das enzimas originou
Chave- Fechadura , que considera que a enzima possui sitio ativo
complementar ao substrato.
2
Substrato induz mudanças conformacionais na
enzima - resultam em um alinhamento preciso dos
grupos catalíticos e suas ligações com o substrato
Substratos análogos podem se ligar a enzima não induzem apropriadamente o alinhamento dos
grupos catalíticos.
3
Conceitos para diminuição da energia
de ativação
orbital steering - alinhamento ótimo dos orbitais do
substrato e dos grupos catalíticos
stereopopulation control - restrição da liberdade
rotacional do substrato (“congelamento”)
rack - ligações formadas entre o substrato e a enzima
são tão fortes que levam a uma alteração na
molécula de substrato
4
Mecanismo rack (distorção do substrato)
A molécula de substrato sofre alteração para
se acomodar na molécula enzimática estática
5
Seqüência de ligação do substrato
em duas etapas
O substrato pode sofrer estas alterações por
mudanças conformacionais na enzima
6
Envolve a obtenção de uma expressão matemática :
• Em fase homogênea (enzimas em solução)
• Em fase heterogênea (enzimas imobilizadas)
Os aspectos gerais envolvidos:
- O substrato Sforma com E , o complexo intermediário ES.
- A velocidade reação esta representada pela tangente da curva P
ou Sversus tempo e é constante para concentrações dadas de S
e E, pois diminuí em função do tempo como consequência da
diminuição de S.
- Para dada [S] , a curva v=f[E] mostra trajetória hiperbólica.
7
Velocidade de reaç ão:
“diminuiç ão na concentraç ão de um dos
reagentes ou formaç ão de produto na unidade de
tempo”
Concentraç ões são
geralmente dadas em mol.L-1
e o tempo em minutos
velocidade = - d[a]/dt
Se a concentraç ão inicial do reagente for a e
se a concentraç ão de produto for x,
a
x,
então a equaç ão acima també m pode ser
escrita como:
velocidade = - d[a]/dt
diminuição da concentração dos reagentes
velocidade = d[x]/dt
aumento da concentração dos produtos.
8
Michaelis-Menten
equilíbrio rápido
1913
Leonor Michaelis - Enzimologista
Maud Menten - Pediatra
Hipóteses de Henri -(1903): E +
S
ES
1. velocidade inicial de uma reação enzimática é proporcional a
concentração da enzima
2. dependência da velocidade de reação com a concentração de
substrato é característica de um fenômeno de saturação (reação
química reversível)
K1
E+S
K-1
Etapa rápida
ES
Kp
E+P
Etapa lenta
9
E S
K1
K 1
ES
K2
K 2
EP
K3
E
P
K 3
Modelo da Reaç ão Enzimática
v = K2 [ES]
d[ES] = 0 (teoria estado estacionário – ES constante em tempo
curto)
dt
d[ES] = K1 [E] [S] - K-1 [ES] - K2 [ES]
dt
Como:
[ES]= [E] [S]
Km
Km = K-1 +
K1
K2
[E] = [ES] - [E]t
Etapa limitante da reação é o desdobramento de ES em E+P ,
(K2<<K1) – após atingir rapidamente o equilíbrio o [ES] começa a
ditar a velocidade
10
Curvas cinéticas para os componentes da
reação enzimática –
Briggs-Haldane
estado estacionário
1-Admite a formação de dois complexos de transição ES e EP
2- [ES] permanece constante ([ES] produzido é consumido)
3- Enzima em quantidades catalíticas [E]t << [S]t e [S] [S]t
E
S
K1
K
ES
1
v = K2 [E]t [S]t
Km + [S]t
K2
K
K3
EP
2
K
E
P
3
Equação de velocidade pela
Teoria do Estado Estacionário
11
Modelo da Reaç ão Enzimátic a (Mic hae liano)
dP/dt= v = K2 [ES]
v = K2 [ES]
[Et]
[Et]
divido por [Et]
como [ES] = [E] [S]
Km
v = = K2 [E] [S]
[Et]
__Km______
[E] [S] + [E]
Km
e [Et] = [ES] + [E]
divido por [E]
v = = K2 [S]
[Et]
__Km__ multiplico por Km
[S] + 1
Km
V= K2 [Et] [S]
Km + [S]
V= Vmax [S
Km + [S]
12
v = K2 [ E] t [ S] t
Km + [ S] t
Equação de velocidade
Onde:
Km - constante de Michaelis-Menten
Como:
Km= K2 + K-1
K1
Vm = K2 [ E] t
v = Vm [ S] t
Km + [ S] t
Equação de Michaelis-Menten
Cinética estudada em termos da velocidade inicial onde K-2
desprezado já que no início [ P] = 0
13
cinética de
ordem zero
hipérbole
v
vo
Vmax [S]
K M [ S]
cinética de primeira ordem
14
Enzimas – ordem da reação
v=
Vmax [S]
Km + [S]
v = V max [ S]
Km
1
v
Quando a formação de P
for proporcional à [S]
a velocidade da reação
é de 1a ORDEM
1- [S]
v = V max
2
V max
2
3
Km
Km>>[S]
Quando a velocidade da reação
independe da [S] a reação é de
ORDEM ZERO
2- [S]
[S]>>Km
v = Vmax
[ S]
15
Km depende:
-
aspectos específicos do mecanismo de reação;
-n° de passos da reação;
-velocidades relativas dos passos individuais.
ENZIMA
SUBSTRATO
Km (mM)
Catalase
H2O2
25
Hexoquinase
ATP
0,4
D - Glicose
0,05
D - Frutose
1,5
Quimotripsina Gliciltirosinilglicina
N - benzoiltirosinamida
108
2,5
Se em um experimento usarmos [S] = Ks o máximo que
poderemos alcançar para v é um valor de v= Vmáx/2, sendo
este independente da concentração da enzima.
16
Determinação Experimental dos
Parâmetros Cinéticos
Representação hiperbólica de assintotas:
S = -KM
v = VMAX
17
1/v
Método dos inversos de LineweaverBurke
KM / VMAX
1/VMAX
-1/KM
Método
1/[S]
Eixo y
Eixo x
Lineweaver-Burke
1/v
1/S
1/VMAX
-1/KM
KS/VMAX
Hanes
S/v
S
KM/VMAX
-KM
1/VMAX
v
v/S
VMAX
VMAX/KM
-KM
1/t ln(Si/S)
(Si-S)/t
VMAX/KM
VMAX
-1/KM
Eadie-Hofstee
Integrado
Intercessão Intercessão
eixo y
eixo x
Tangente
18
métodos integrados são importantes para determinar mecanismos de inibição
ENZIMAS – MÉTODOS GRÁFICOS
Pe rm ite m obte r os parâm e tros c iné ticos (Km e
Vmax)
Gráfico dos Recíprocos de Line we ave r-Burk
1
Km
1
v
Vm a x [ S]
Vm a x
1
v
Km
V max
Inclinação =
1
V max
-1
Km
1
[ S]
19
Gráfico da equação integrada de Michaelis-Menten
[ S] o
2 ,3
log
t
[ S]
Vmax
Km
1 ( [ S] o [ S] )
Km
t
V max
Km
2 ,3 log[ S] o
t
[ S]
Inclinação = - 1 /
Km
V max
( [ S] o - [ S] )
t
20
Gráfico de Hane s -Woolf
[S]
v
K
m
V
max
1
V
max
[S]
[ S]
v
Inclinação =
1
V max
Km
V max
- Km
[ S]
21
21
Gráfico de Eadie-Hofstee
v
v
K
m [ S]
V
m ax
V max
v
Inclinação =
-K m
V max
Km
v
[ S]
22
Inibição Enzimática
Qualquer substância que reduz a velocidade de uma reação enzimática.
Reguladores – ativadores – aceleram v
I nibidores – reduzem reversivelmente v
I nativadores – reduzem irreversivelmente v
INIBIDORES
REVERSÍVEIS
COM PETI TI VOS
IRREVERSÍVEIS
N ÃO COM PETI TI VOS
I N COM PETI TI VOS
23
Modelos de Inibição Competitiva
1. Modelo
clássico, S e
I competem
pelo mesmo
sítio de
ligação
2. I e S são
mutuamente
excludentes
por causa de
impedimento
estéreo
3. I e S possuem
um sítio comum
de ligação
4. Os sítios de
ligação para I e S
são distintos, mas
se sobrepõem
5. A ligação de I
em um sítio
inibidor distinto
causa uma
mudança
conformacional
na enzima que
não permite a
ligação do
substrato (viceversa)
24
kS
E + S
+
I
kP
ES
E + P
ki
EI
v
Vmax
[S ]
[I]
kS 1
ki
[S ]
Afeta a afinidade da
enzima pelo seu
substrato (KS), sem
afetar a reatividade do
complexo ativo enzimasubstrato (Vmax)
minimizada em
elevadas [S]
25
Plot de v versus [S] na presença e na ausência
de uma concentração fixa do inibidor competitivo
26
Modelos de Inibição Não-Competitiva
1. S e I não são mutuamente excludentes, mas ESI é
cataliticamente inativo (não competitiva)
27
2. I não pode se ligar ao complexo ES já formado, mas também forma
complexos terciários enzima-inibidor-substrato cataliticamente inativos
28
3. I e S são mutuamente excludentes por causa de impedimento estéreo
29
kS
E + S
+
I
kP
ES
+
I
ki
E + P
ki
kS
EI + S
v
Vmax
[I]
1
ki
ESI
[S ]
k S [S ]
Afeta a reatividade da
enzima pelo seu
substrato (Vmax), sem
afetar a afinidade do
complexo ativo enzimasubstrato (KS)
30
Plot de v versus [S] na presença e na ausência
de uma concentração fixa do inibidor não-competitivo
31
Modelos de Inibição Acompetitiva
Ocorre a altas [s] e ocorre bloqueio de ES. Na enzima pode haver 2 sítios de
ligação, um para S e outra para I, sendo que este último só se torna ativo
quando o complexo ES esta formado. O complexo ESI formado não gera
produtos.
32
kS
E + S
kP
ES
+
I
E + P
ki
ESI
v
Vmax
[ S]
kS
1
[I]
[ S]
ki
Inibição Mista:
afeta tanto a afinidade de
E por S (kS) como a
reatividade de ES (Vmax )
33
Plot de v versus [S] na presença e na ausência
de uma concentração fixa do inibidor acompetitivo
34
Modelos Geral de Inibição Mista
v
VAP [S]
[S] K AP
Inibição Competitiva:
KAP > K ; VAP = V
Inibição Não-competitiva: KAP = K ; VAP < V
Inibição Mista:
KAP < K ; VAP < V
Um ativador é uma substância que aumenta a
reatividade de ES (VAP > V)
V ou a afinidade de E
por S (KAP < K)
K
35
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