Universidade Federal da Bahia
Instituto de Química
Programa de Pós Graduação em Química
ESTUDO QUÍMICO DO EXTRATO HEXÂNICO E AVALIAÇÃO DA
ATIVIDADE BIOLÓLIGICA DOS EXTRATOS ORGÂNICOS DA
PRÓPOLIS MARROM CLARA E ESCURA DA BAHIA
DARLAN COUTINHO DOS SANTOS
Salvador
2010
DARLAN COUTINHO DOS SANTOS
ESTUDO QUÍMICO DO EXTRATO HEXÂNICO E AVALIAÇÃO DA
ATIVIDADE BIOLÓLIGICA DOS EXTRATOS ORGÂNICOS DA
PRÓPOLIS MARROM CLARA E ESCURA DA BAHIA
Dissertação submetida ao colegiado do
programa de pós graduação em Química da
UFBA para obtenção do título de mestre
em química orgânica
ORIENTADOR: Prof. Dr. Jorge Maurício David
Salvador
2010
Aos meus pais, Carlos e Margarida.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por tudo.
Aos meus pais, Carlos e Margarida, e minha irmã Michele por todo apoio.
Ao Dr. Jorge David, pela orientação na elaboração desse trabalho.
A Profa. Dra. Juceni Pereira David pelo apoio e concessão do seu laboratório para
realização de diversos trabalhos experimentais.
Ao Prof Dr. Edinildo Torres pela coleta do material.
Aos professores do programa de pós graduação pelos valiosos ensinamentos.
Aos funcionários do Instituto de química.
Aos colegas de laboratório Charleston, Bruno,Clayton, Luciano, Jéferson, Érika,
José Candido, Raul, Eliezer, Marcelo, Marcos Paraíba, Marcos Vinicius, Paty,
Roberta, Manuela, Larissa, Bel e Marquinhos pela ótima convivência.
Aos amigos Cristiano, Leôncio, Tico, Nai, Jr, Daniel, Rocha, Manu, Nana, Karem,
Naty que sempre estiveram comigo.
A minha madrinha Rose.
A Cínara por todo apoio.
A CNPq e Capes pelo apoio financeiro.
SUMÁRIO
Lista de Figuras .............................................................................................. vii
Lista de Tabelas.............................................................................................. x
Lista de Quadros ............................................................................................ xi
Lista de Abreviaturas, Siglas e Símbolos ....................................................... xii
Resumo........................................................................................................... xiii
Abstract...................................................................................................xiv
1.Introdução.........................................................................................................1
1.1Própolis.......................................................................................................1
1.2 Composição química da própolis...............................................................4
1.3Propriedades farmacológicas.....................................................................8
1.4 Própolis do Brasil........................................................................................10
2. Objetivos........................................................................................................17
3. Parte Experimental..............................................................................................18
3.1 Local..............................................................................................................18
3.2 Coleta do material.........................................................................................18
3.3 Preparo dos extratos.....................................................................................19
3.4 Separação e isolamento dos constituintes do extrato hexânico da própolis
marrom clara (PHC)................................................................................................20
3.4.1 Purificação da fração PHC 4................................................................21
3.4.2 Purificação da fração PHC 6................................................................23
3.4.3 Purificação da fração PHC 7................................................................24
3.5 Análise dos extratos por cromatografia líquida de alta eficiência em fase
reversa....................................................................................................................26
3.6 Avaliação da atividade antioxidante pelo método sequestrante de radical
DPPH......................................................................................................................26
3.7 Bioensaio de letalidade dos extratos sobre Artemia salina...........................28
4. Resultados e discussão......................................................................................29
4.1Perfil cromatográfico e espectro na região do ultravioleta dos extratos
orgânicos da própolis marrom clara e escura da Bahia submetidas à CLAE-DAD.29
4.2 Elucidação estrutural de PHC 4.4.12c............................................................35
4.3 Elucidação estrutural de PHC 6.4.3.1............................................................44
4.4 Elucidação estrutural de PHC 6.4.4...............................................................50
4.5 Elucidação estrutural de PHC 7.10 D.............................................................61
4.6 Avaliação da atividade antioxidante dos extratos da própolis marrom clara e
escura da Bahia......................................................................................................65
4.7 Avaliação da atividade citotóxica dos extratos da própolis marrom clara e
escura da Bahia.......................................................................................................67
5. Considerações finais...........................................................................................68
6. Referências bibliográficas...................................................................................69
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Flavonóides identificados na própolis..................................................7
Figura 2. Compostos fenólicos identificados em amostras de própolis..............7
Figura 3. Própolis verde do Brasil.....................................................................11
Figura 4.Estrutura da Aterpilina C....................................................................12
Figura 5. Própolis vermelha do Brasil...............................................................13
Figura 6. Estrutura da homopterocarpina e medicarpina..................................13
Figura 7. Substâncias de isoladas de amostras de própolis de Alto SantoCeará................................................................................................................ 15
Figura 8. Benzofenona prenilada identificada na própolis marrom da
Bahia..................................................................................................................16
Figura 9. Representação esquemática do radical 1,1-difenil-2picrilhidrazila(púrpura) e do 1,1-difenil-2- picrilhidrazina...................................27
Figura 10. Perfil cromatográfico de PHC por CLAE escala analítica no
comprimento de onda de 260 nm......................................................................30
Figura 11. Espectro de UV do composto com tempo de retenção 24.9
minutos..............................................................................................................30
Figura 12. Perfil cromatográfico de PHE por CLAE escala analítica no
comprimento de onda de 260 nm......................................................................31
Figura 13. Espectro de UV do composto com tempo de retenção 25.1
minutos..............................................................................................................31
Figura 14. Perfil cromatográfico de PMC por CLAE escala analítica no
comprimento de onda de 260 nm......................................................................32
Figura 15. Espectro de UV de alguns compostos presentes em PMC.............32
Figura 16. Perfil cromatográfico de PME por CLAE escala analítica no
comprimento de onda de 260 nm......................................................................33
Figura 17. Espectro de UV de alguns compostos presentes em PME.............33
Figura 18. Espectro de RMN de 1H da substância PHC 4.4.12C (CDCl3 , 500
MHz)..................................................................................................................37
Figura 19. Ampliação(1) do espectro de RMN de 1H da substância PHC
4.4.12C (CDCl3 , 500 MHz)...............................................................................38
Figura 20. Ampliação (2) do espectro de RMN de 1H de PHC 4.4.12C (CDCl3 ,
500 MHz)...........................................................................................................38
Figura 21. Espectro de RMN de 13C da substância PHC 4.4.12C (CDCl3 , 125
MHz)..................................................................................................................39
Figura 22. Ampliação(1) do espectro de RMN de 13 C da substância PHC
4.4.12C (CDCl3 , 125 MHz................................................................................39
Figura 23. Ampliação(2) do espectro de RMN de 13 C da substância PHC
4.4.12C (CDCl3 , 125 MHz)...............................................................................40
Figura 24. Espectro de RMN DEPT 135º da substância PHC 4.4.12C (CDCl3,
125 MHz)...........................................................................................................41
Figura 25. Ampliação do espectro de RMN DEPT 135º da substância PHC
4.4.12C (CDCl3 , 125 MHz)................................................................................41
Figura 26. Espectro de gHSQC da substância PHC 4.4.12C (CDCl3 , 500
MHz)..................................................................................................................42
Figura 27. Espectro de gHMBC da substância PHC 4.4.12C (CDCl3 , 500
MHz)..................................................................................................................43
Figura 28. Ampliação (1) do espectro de gHMBC da substância PHC 4.4.12C
(CDCl3 ,500 MHz)..............................................................................................43
Figura 29. Ampliação (2) do espectro de gHMBC da substância PHC
4.4.12C(CDCl3 , 500 MHz).................................................................................44
Figura 30. Principais correlações observadas no espectro de gHMBC da
substância PHC 4.4.12 (tautômero A)...............................................................44
Figura 31. Espectro de massas- APCI modo positivo de PHC 4.4.12C..........45
Figura 32. Estrutura da 7-epi-clusianona..........................................................48
Figura 33. Espectro de RMN de 1H da substância PHC 6.4.3.1 (CDCl3 , 300
MHz)..................................................................................................................50
Figura 34. Ampliação do espectro de RMN de 1H da substância PHC 6.4.3.1
(CDCl3 , 300 MHz).............................................................................................51
Figura 35. Espectro de RMN de 13C da substância PHC 6.4.3.1 (CDCl3 , 75
MHz)..................................................................................................................52
Figura 36. Ampliação (1) do espectro de RMN de 13C da substância PHC
6.4.3.1 (CDCl3, 75 MHz)....................................................................................52
Figura 37. Ampliação (2) do espectro de RMN de 13C da substância PHC
6.4.3.1 (CDCl3, 75 MHz)....................................................................................53
Figura 38. Perfil cromatográfico da fração PHC 6.4.4 no cromatográfo Dionex
equipado com detector de arranjo de diodo (DAD), com coluna analítica.........56
Figura 39. Espectro de massas da fração PHC 6.4.4 [M + H+].......................57
Figura 40. Espectro de RMN de 1H da substância PHC 6.4.4 (CDCl3 , 300
MHz)..................................................................................................................57
Figura 41. Espectro de RMN de 13C da substância PHC 6.4.4 (CDCl3 , 75
MHz)..................................................................................................................58
Figura 42. Ampliação (1) do espectro de RMN de 13C da substância PHC 6.4.4
(CDCl3 , 75 MHz)...............................................................................................58
Figura 43. Ampliação (2) do espectro de RMN de 13C da substância PHC 6.4.4
(CDCl3 , 75 MHz)...............................................................................................59
Figura 44. Ampliação(3) do espectro de RMN de 13C da substância PHC 6.4.4
(CDCl3 , 75 MHz)...............................................................................................59
Figura 45. Espectro de RMN de 1H de PHC 7.10D (CDCl3 , 300
MHz)..................................................................................................................62
Figura 46. Ampliação do espectro de RMN de 1H de PHC 7.10D (CDCl3 , 300
MHz)..................................................................................................................63
Figura 47. Espectro de RMN de 13C da substância PHC 7.10 D (CDCl3 , 75
MHz)..................................................................................................................63
Figura 48. Espectro no Infravermelho de PHC 7.10D (filme)...........................64
Figura 49. Porcentagem de atividade antioxidante dos extratos hexânicos e
metanólicos da própolis e do padrão ácido gálico.............................................66
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Atividade antioxidante por seqüestro de radical DPPH do extrato
etanólico de própolis e das substâncias 1,5-7...................................................15
Tabela 2. Massas dos extratos orgânicos das própolis clara e escura do Estado
da Bahia.............................................................................................................20
Tabela 3. Frações obtidas da primeira coluna da fase hexânica.....................20
Tabela 4. Frações obtidas do fracionamento da amostra PHC 4......................21
Tabela 5. Frações obtidas do fracionamento da amostra PHC 4.4...................22
Tabela 6. Subfrações obtidas do fracionamento da amostra PHC 6................23
Tabela 7. Subfrações obtidas do fracionamento da amostra PHC 6.4.............24
Tabela 8. Subfrações obtidas do fracionamento da amostra PHC 7................25
Tabela 9. Dados espectroscópicos de gHSQC de PHC 4.4.12C tautômero A)
(CDCl3 , 500 MHz) comparados com os valores da literatura...........................46
Tabela 10. . Dados espectroscópicos de RMN de 13C de PHC 4.4.12C
(tautômero B) (CDCl3 , 125 MHz) comparados com os valores da
literatura.............................................................................................................47
Tabela 11. Dados do espectro de RMN de 13C (CDCl3 , 75 MHz) de PHC
6.4.3.1 e valores da literatura............................................................................54
Tabela 12. Dados do espectro de RMN de 13C (CDCl3, 75 MHz) de
PHC 6.4.4 e valores da literatura.......................................................................60
Tabela 13. Dados do espectro de RMN de 1H e 13C (CDCl3 , 75 MHz)de PHC
7.10D e valores da literatura............................................................................64
Tabela 14. valores de IC50 para os extratos hexânicos e metanólicos da
própolis clara e escura da Bahia........................................................................66
Tabela 15. Resultado dos testes de toxicidade sobre Artemia Salina, relativo
aos extratos da própolis marrom clara e escura da Bahia.................................67
LISTA DE QUADROS
Quadro 01. Relação de algumas propriedades biológicas da própolis em
ordem cronológica...............................................................................................3
Quadro 02. Classificação das própolis Brasileiras............................................10
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
AcOEt- Acetato de etila
CC- Cromatografia em coluna
CCDC- Cromatografia em camada delgada comparativa
CCDP- Cromatografia em camada delgada preparativa
DEPT- Distortionless enhancement polarization transference
HMQC- Heteronuclear multiple quantum coherence
HMBC- Heteronuclear multi bond correlaction
IV- Infravermelho
J- constante de acoplamento
MeOH- metanol
MHz- megahertz
PHC- Própolis hexânico claro
PHE-Própolis hexânico escuro
PCC- Própolis clorofórmico claro
PCE- Própolis clorofórmico escuro
PMC- Própolis metanólico claro
PME- Própolis metanólico escuro
RMN- Ressonância magnética nuclear
RMN- 1H Ressonância magnética nuclear de hidrogênio
RMN- 13C Ressonância magnética nuclear de carbono
UV- Ultravioleta
CLAE- Fr Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa
EM- Espectrometria de massas
Hex- hexano
RESUMO
Própolis é uma mistura complexa, formada basicamente por secreções
salivares das abelhas e por um material resinoso e balsâmico coletado por elas
dos ramos, flores, pólen, brotos e exsudados de árvores, à qual têm sido
atribuídas propriedades antimicrobiana, antioxidante, antiinflamatória, antiviral
entre outras. Sua composição varia com a flora da região e época da colheita.
Este trabalho descreve o perfil cromatográfico dos extratos hexânicos e
metanólicos da própolis da Bahia obtidos por maceração, bem como o
isolamento e a elucidação estrutural de algumas substâncias presentes na fase
hexânica da própolis marrom clara, e avaliação da atividade antioxidante e
citotóxica dos extratos. Utilizando-se métodos cromatográficos usuais (CC,
CCDC e CCDP) foram isolados do extrato hexânico o trans cinamato de
metila, o cinamato de sitosterila que tem seu primeiro relato na própolis, além
de duas benzofenonas a hyperibona A e a clusianona, esta última também
identificada pela primeira vez na própolis. As estruturas das substâncias
isoladas foram elucidadas através da análise dos dados obtidos pelos
espectros no IV, de RMN de 1H, 13 C, DEPT, além de técnicas bidimensionais
(COSY, HMBC e HMQC). Os testes de atividade antioxidante in vitro utilizando
a metodologia do seqüestro do radical estável DPPH, demostraram que os
extratos apresentaram moderada atividade antioxidante quando comparados
com o padrão ácido gálico. Nos ensaios de atividade citotóxica frente Artemia
salina os extratos apresentaram CL50 < 145 ug/mL podendo ser um indicativo
de atividade antitumoral.
Palavras- chave: Própolis da Bahia, benzofenonas, atividade antioxidante,
atividade citotóxica.
ABSTRACT
Propolis is a complex mixture, constituted by salivary secretions of bees
and a balsamic and resinous material collected by them of the branches,
flowers, pollen, buds and exudates of trees. It is known for its antimicrobial,
antioxidant, anti-inflammatory and antiviral properties, among others. Its
composition varies with flora of the region and the harvest time. This study
describes the chromatographic profile of hexane and methanol extracts of
Bahia´s propolis which are obtained by maceration. The hexane extract was
also submitted to different chromatographic procedures and the isolates were
submitted to an evaluation of the antioxidant and cytotoxic activities. From these
procedures were isolated trans methyl cinnamate, sitosteril cinnamate which is
the first report of occurrence in própolis. Besides it was also isolated two
benzophenones hyperibone A and clusianone. This is also the first report for
this compound in própolis. The structures of the isolated compounds were
elucidated by IR, 1H and 13C NMR, DEPTand bidimensional techniques
(COSY, HMBC and HMQC) data analysis. Tests for antioxidant activity in vitro
using the methodology of the DPPH demonstrated that extracts showed
moderate activity compared with the standard gallic acid. In the testing cytotoxic
activity against artemia salina extracts showed LC50 < 145 ug/mL may be
indicative of antitumor activity.
Keywords: Bahia propolis, benzophenones, antioxidant
activity, cytotoxic activity.
1. Introdução
1.1 Própolis
A palavra própolis deriva do grego e significa pro “em defesa de”, polis
“cidade”, ou seja, em defesa da cidade ou, no caso da colméia. A própolis é
utilizada pelas abelhas para proteger a colméia contra agentes invasores,
embalsamar pequenos animais mortos que não puderam ser retirados da
colméia e contra os ventos frios, a fim de manter uma temperatura adequada
no interior da colméia (MARCCUCI, 1996). É um material resinoso e balsâmico
produzido pelas abelhas a partir da mistura de secreções salivares, enzimas e
diversas substâncias coletadas de diferentes partes das plantas como brotos,
botões florais e exsudados resinosos (GHISALBERT, 1979).
A composição química da própolis depende de diversos fatores tais
como: ecologia da flora, período de coleta da resina, clima, variabilidade
genética das abelhas rainhas, sendo assim algumas substâncias estão
presentes em todos os tipos de própolis, porém outras substâncias são
características de própolis derivadas de espécies particulares de plantas. A
composição química da própolis inclui flavonóides (como a galangina,
quercetina, pinocembrina e kaempferol), ácidos aromáticos e ésteres, aldeídos
e cetonas, terpenóides e fenilpropanóides (como os ácidos caféico e
clorogênico),
esteróides,
aminoácidos,
polissacarídeos,
hidrocarbonetos,
ácidos graxos além de vários outros compostos ocorrendo em pequenas
quantidades. Há também na sua constituição presença de elementos
inorgânicos tais como o cobre, manganês, ferro, cálcio, alumínio, vanádio e
silício. Dentre as substâncias da própolis, os flavonóides, por apresentarem
atividades antioxidante, antiviral e antibacteriana, vêm recebendo uma atenção
especial dos pesquisadores (LUSTOSA et al., 2008). A própolis brasileira é a
única que apresenta composição química bastante diversificada devido à
grande biodiversidade das regiões.
Existem relatos na literatura afirmando que a própolis apresenta
diferentes atividades biológicas tais como: antioxidante, antitumoral, antiúlcera,
antiinflamatória e portanto vem sendo utilizada há milhares de anos pelo
homem. Além destas atividades, é utilizada também, contra infecções do trato
respiratório e para tratamentos de infecções bacterianas e fúngicas (SOUZA et
al., 2007). Na África do Sul, na guerra dos Bôeres ao final do século XIX, foi
bastante utilizada devido às suas propriedades cicatrizantes. Na antiguidade,
por apresentar propriedades anti-putrefativas a própolis era utilizada pelos
egípcios para embalsamar cadáveres, além disso, suas propriedades
medicinais foram reconhecidas por médicos gregos e romanos como
Aristóteles, Dioscorides, Plínio e Galeno (Capasso & Castaldo, 2002). Por
apresentar características de panacéia (quadro 1) e devido ao seu valor
agregado fora do Brasil, principalmente no Japão onde um frasco de extrato
alcoólico da própolis pode chegar a custar 150 dólares, o interesse global pela
própolis vem aumentando, porém de certa maneira essas características
também atrapalham sua aceitação, pois alguns médicos e profissionais da área
tendem a desconfiar de sua eficácia devido a lhe serem atribuídas dezenas de
atividades biológicas simultaneamente (PEREIRA et al.,2001).
Durante a segunda guerra mundial foi empregada em diversas clínicas
russas, também foi bastante utilizada na antiga URSS na medicina humana e
veterinária no tratamento da tuberculose, observando-se uma regressão dos
problemas pulmonares e recuperação do apetite (PEREIRA et al., 2001).
A coloração da própolis varia de acordo com a região de colheita, seu
odor é característico e variável, porém algumas amostras não possuem
nenhum odor, seu ponto de fusão é variável estando na faixa de 60-70°C
sendo que em alguns casos seu ponto de fusão pode chegar até 100°C. É uma
substância dura em 15°C, tornando-se maleável em torno de 30°C
(MARCUCCI, 1996).
A própolis apresenta grande importância medicinal e econômica, sendo
comercializada em várias preparações farmacêuticas e cosméticas, tais como:
comprimidos, pastilhas, dentifrícios, loções, cremes faciais, tinturas, pomadas,
etc. (BANKOVA et al., 2000).
Quadro1. Relação de algumas propriedades “biológicas” da própolis em
ordem cronológica.
Data
País
Propriedade farmacológica
1957
URSS
Uso como anestésico
1967
Romênia
Uso no tratamento dermatológico,
ação antifúngica.
1968 e
URSS
Uso no tratamento de úlceras (em ratos).
Polônia
Estudo das propriedades bactericidas
1981
1968
(gênerocândida)
1976
Alemanha
Antifúngicas (ex.: Scopulariopsis
brevicaulis)
Polônia
Antiprotozoários.
1981
URSS
Antibióticos(Staphylococus aureus)
1983
Ioguslávia
Atividade citotóxica in vitro de EEP (de
1976 e
1977
células HeLa, carcinoma cervical humano)
1984
Brasil
Antimicrobiano
1985
Iugoslávia
Inibidor de Bacilus subtilis
1986
Tchecoslováquia
Inibidor de RNA polimerase de Escherichia.
1989
Polônia
Antitumoral (carcinoma de Ehrlich)
1990
Itália
Inibição de vários vírus (Herpes)
1992
Bulgária
Inibição do vírus Influenza A
1993
EUA
Antitumoral (testado em ratos e bovinos)
1993,
Japão
Citotoxicidade da própolis brasileira
Brasil
Atividade contra Trypanosoma Cruzy
Eslováquia
Antimutagênico
1995 e
1998
1994 e
1995
1998
PEREIRA et al.,2001
1.2 Composição química da própolis
Apesar de possuir estudos escassos sobre a composição química de
própolis brasileiras, existem vários estudos realizados em outros países sobre
o tema. As características fitogeográficas existentes ao redor da colméia é um
dos principais fatores que determina a composição química da própolis
(KUMAZAWA et al., 2004).
Entretanto a composição química da própolis
também pode variar sazonalmente em uma mesma localidade (SFORCIN et al.
2000). Variações na composição química foram observadas entre amostras de
própolis coletadas em uma mesma região, por diferentes raças de A. mellifera
(SILICI & KUTLUCA, 2005). Como conseqüência desta composição química
diferenciada da própolis, ocorre também uma variação nas suas atividades
farmacológicas (MENEZES, 2005). Os principais compostos químicos isolados
da própolis até o momento podem ser organizados em alguns grupos principais
como (ALDEMANN, 2005):
a) hidrocarbonetos superiores;
b) álcoois (cinâmicos, fenetílico, prenílico, isobutenol, benzílico);
c)
ácidos
alifáticos
(acético,
angélico,
butírico,
fumárico,
isobutírico,
metilbutírico) e ésteres derivados (acetatos de isobutila, isopentilia e
isopentenila)
d) ácidos aromáticos (benzóico, caféico, cinâmico, cumáricos (orto, meta e
para) ferúlico, gálico, salicílico, 3,4 dimetoxicinâmico, gentísico, hidroxinâmico,
isoferúlico, vanílico) e ésteres aromáticos derivados (acetato de benzila,
benzoato de benzila, cafeato de benzila, cumarato de benzila, cafeato de fenil
etila, ferulato de prenila, salicilato de benzila, cafeato de butenila, cafeato de
butila, cafeato de cinamila, cafeato de butila, benzoato de etila, benzoato de
metila, salicilato de metila; ésteres do ácido caféico com álcoois graxos de
cadeia longa- dodecanol, tetradecanol, hexadecanol);
e) ácidos graxos superiores típicos de cera (araquídico, behênico, cerótico,
lignocérico) e usuais (palmítico, oléico, láurico, mirístico) e seus ésteres
(hexacosilhexadecanoato);
f)
aldeídos
(benzaldeído,
aldeído
caprótico,
vanilina,
isovanilina,
p-
hidroxibenzaldeído);
g) cetonas (acetofenonas e seus derivados);
h) flavonas e flavonóis (acacetina, apigenina, apigenina-7- metil éster, crisina,
galanina, galanina-3- metil éster, quercetina, canferol, tectocrisina, canferid;
3,7,4’,5’ tetrametil éter da quercetina);
i) flavononas (narigenina, pinobanksina, pinobanksina-3- acetato, pinobanksina3- butirato, pinobanksina-3- metil éter, pinocembrina, pinostrobina);
j) chalconas e dihidrochalconas (de alpinetina, narigenina, pinobanksina,
pinobanksina-3- acetato, pinocembrina, pinostrobina);
l) terpenóides (farnesol, geraniol, cimeno, limoneno, estireno, naftaleno, βbisabolol, 1,8-cineol, derivados de clerodane, derivados do labdane, β-amirina,
sequisterpenóides, ledol spatulenol, germacreno);
m) esteróides (acetatos de estigmasterol e calinasterol);
n) aminoácidos (alanina, β- alanina, ácido α-aminobutírico, ácido –δaminobutírico, arginina, asparaginina, ácido aspártico, cistina, cisteína, ácido
glutâmico, glicina, histidina, hidroxiprolina, isoleucina, leucina, lisina, metionina,
ornitina, fenilalanina, prolina, ácido piroglutâmico, sarcosina, triptofano, valina,
serina, treonina, tirosina);
o) açúcares (d-ribofuranose, d-frutose, d-glucitol, d-glucose, talose, sacarose,
xilitol, xilose, galactose, manose, ácido galacturônico, lactose, maltose,
melibiose, eritritol, inositol);
p) lignanas (sesamina, aschantina, sesartenina, dihidrobenzofurano);
q) vitaminas (A, B1, B2, B6, C e E);
r) minerais ( sódio, potássio, magnésio, bário, estrôncio, Cádmio, chumbo,
cobre, manganês, ferro, cálcio, vanádio, silício, alumínio, níquel, zinco, cromo,
titânio, prata, molibdênio, cobalto).
Os flavonóides são compostos fenólicos que compreendem um amplo
grupo de substâncias naturais e que não são biosintetizados pelos animais
(BEECHER 2003; MANACH et al., 2004). Cerca de 4000 flavonóides já foram
descritos, entre eles, apigenina, quercetina, hesperetina, rutina, luteolina,
genisteina, daidzeina, autocianidina, kanferol, que são os mais comuns. A
presença e a concentração desses compostos são utilizadas como índice de
qualificação de amostras de própolis (LU et al., 2004). A importância para o
homem destes compostos se deve ao fato de que, uma dieta a base de
flavonóides interfere em diversos processos fisiológicos, auxiliando na
absorção e na ação de vitaminas, atuando nos processos de cicatrização como
oxidantes, além de apresentarem atividade moduladora do sistema imune
(WILLIAMS et al., 2004).
Como exemplo da composição flavonoídica da própolis, foi desenvolvido
um método, utilizando a técnica cromatográfica HPLC-ESI/MS para analisar os
extratos etanólicos de amostras de própolis da Argentina, Itália e Espanha.
Este procedimento permitiu identificar a presença de diversos flavonóides
(figura 1) (VOLPI & BERGONZINI, 2006).
Figura 1. Acacetina (1), Apigenina (2), Crisina (3), Galangina (4),
Genisteína (5), Kaempferol (6), Narinenina (7), Pinocembrina (8).
Outras classes comumente encontradas na composição química da
própolis obtidos em outros países são os ácidos fenólicos e seus ésteres, na
maioria derivados de ácido benzóico. A figura 2 mostra alguns compostos
fenólicos derivados de produtos apícolas (MARCUCCI,1998).
Figura 2. Compostos fenólicos identificados em amostras de própolis.
1.3 Propriedades farmacológicas
As causas dos processos inflamatórios são variadas e estão associadas
a diversas doenças. Em trabalhos realizados com camundongos e coelhos tem
sido constatada uma atividade antiinflamatória de soluções hidroalcoólicas da
própolis, tanto em aplicações tópicas, bem como através de injeção ou mesmo
via oral. Detalhes desses estudos podem ser encontrados em IVANOVSKA et
al., (1995), PARK et al., (1996), LEDON et al., (1997), MENEZES et al., (1999),
OZTURK et al (2000).
A atividade antiinflamatória da própolis foi atribuída a alguns compostos
como ácido cafeico, quercetina, narigenina e o éster fenetílico do ácido cafeico.
Essa atividade seria resultante da supressão da síntese de prostaglandinas e
de leucotrienos pelos macrófagos ( BORRELLI et al., 2002). Outros compostos
também apresentam atividade antiinflamatória e já foram encontrados na
própolis como ácido salicílico, apigenina, ácido felúrico e galanina (KROL et al.,
1996).
A atividade farmacológica mais popularmente conhecida e comprovada
cientificamente é a capacidade da própolis em inibir o crescimento de
microorganismos (MENEZES, 2005). As amostras de própolis oriundas da
Europa
no
que
diz
respeito
à
atividade
antimicrobiana
apresentam
características similares a amostras de própolis brasileiras (POPOVA et al.,
2004).
Ensaios de antibiose com a própolis, frente a 10 bactérias Grampositivas e 20 Gram-negativas, constataram que a atividades antibacteriana da
própolis é mais efetiva sobre a Gram-positivas (ANTUNES et al., 1996).
Poucos estudos constataram a inibição da levedura Candida Albicans
em cultura pela própolis (SOSA et al., 1997 & HEGAZI et al., 2000). Alguns
autores como OHSUGI et al., (1997), HASHIMOTO et al ., (1998), BANSKOTA
et al., (2000) e BOYANOVA et al., (2005), observaram a inibição do
crescimento de Helicobacter pylori. Desta forma, a inibição de úlceras gástricas
através da ingestão de própolis, possivelmente está relacionada com a
atividade anti-helicobacter, pois a ação desta bactéria está relacionada com
estas úlceras.
Atividade antiprotista também foi observada
em camundongos
infectados com Trypanosoma Cruzi (CASTRO & HIGASHI, 1995). A inibição de
vírus da gripe em aves utilizando a própolis em testes in vitro foi relatada por
KUJUMGIEV et al., (1999).
HARISCH et al., (1997) também descreveram
atividade inibitória da própolis sobre replicação do vírus HIV-1 em culturas
celulares de linfócitos CD4.
A constante busca de novos fármacos para o controle e o combate a
diversos tipos de neoplasias tem levado pesquisadores a isolar compostos
contidos em diversas amostras de própolis de diversas regiões (BURDOCK,
1998). Diversos compostos isolados em amostras de própolis oriunda de
diferentes regiões apresentaram atividade inibitória no crescimento de diversos
tumores. Um diterpeno (PMS-1) isolado da própolis brasileira apresentou
atividade inibitória frente ao hepatocarcinoma humano (MATSUNO, 1995).
Segundo MITAMURA et al., (1996) o efeito dessa atividade do PMS-1 sobre o
tumor de pele está relacionado com a inibição da síntese de DNA destas
células.
A crisina, per tencente a classe das flavonas, também isolada de
amostras de própolis oriunda da Europa mostrou-se efetiva em inibir o
crescimento de cultura da linhagem de glioma C6 de rato; as células
mantiveram-se estacionárias na fase G1 do ciclo celular (WENG et al., 2005).
Diversos
compostos
hidrossolúveis
da
própolis
que,
atuando
sinergisticamente, aumentaram a atividade de drogas tumoricidas, inibindo
assim o desenvolvimento de tumores acíticos de Ehrlich (SUZUKI et al., 1996).
Doenças cardiovasculares, doenças reumáticas, doenças neurológicas,
doenças psiquiátricas, envelhecimento precoce, neoplasias, osteoporose,
diabetes e inflamação estão relacionadas com aumentos nos níveis de radicais
livres em nosso organismo (DEVASAGAYAN et al., 2004). A própolis apresenta
uma gama de compostos, incluindo os polifenóis, com capacidade de remover
os radicais livres em excesso que são responsáveis por essas patologias
citadas anteriormente (MARQUELE et al., 2005).
1.4 Própolis do Brasil
De acordo com sua composição química e suas características físico
químicas existe uma classificação da própolis brasileira em 12 tipos sendo
cinco encontrada na região sul, seis na região nordeste e uma na região
sudeste e centro-oeste do país (PARK et al.,2000) (quadro 2), apresentando
uma composição química bastante diferente. Recentemente, um novo tipo de
própolis brasileira foi classificada como o 13° tipo, a própolis vermelha oriunda
da região do estado de Alagoas, que apresenta diversas atividades biológicas e
apresenta uma coloração vermelha intensa ( CABRAL et al., 2009).
Quadro 2. Classificação das própolis brasileiras.
Extrato etanólico de
própolis
Grupos
Cor
Origem da própolis
1 Rio Grande do Sul
Amarelo
Sul
2 Rio Grande do Sul
Castanho claro
Sul
3 Paraná
Castanho escuro
Sul
4 Paraná
Castanho claro
Sul
5 Paraná
Marrom esverdeado
Sul
6 Bahia
Marrom avermelhado
Nordeste
7 Bahia
Marrom esverdeado
Nordeste
8 Pernambuco
Castanho escuro
Nordeste
9 Pernambuco
Amarelo
Nordeste
10 Ceará
Amarelo escuro
Nordeste
11 Piauí
Amarelo
Nordeste
12 São Paulo
Verde ou Marrom
Sudeste
esver esverdeado
A própolis verde (figura 3) oriunda da região central do Brasil é
produzida pelas abelhas do tipo Apis mellifera, sua cor característica é devida à
espécie tipicamente brasileira Baccharis dracunculifolia, conhecida na medicina
popular como alecrim do campo que é a principal fonte de coleta das abelhas
para produção da própolis verde (Park et al., 2004).
Figura 3. Própolis verde do Brasil. Fonte :
http://2.bp.blogspot.com/_TFaflqw9q0/SUe9MBhwXbI/AAAAAAAAMo8/VdGNZItNIec/s400/clip_raw_propolis.JP
G(acessado em 10/11/2009)
Diante de todos os tipos de própolis encontrados no Brasil, a própolis
verde ganhou a preferência do mercado mundial, é amplamente consumida no
Japão como suplemento alimentar na profilaxia de doenças devido as suas
ótimas características organolépticas e também em razão do menor teor de
poluentes ambientais (SOUZA et al., 2007). Sua coloração varia do amarelo
esverdeado ao verde intenso, por ser dura, é facilmente transformada em pó
por moagem mecânica. A composição química da própolis verde é bastante
diversificada onde predominam os derivados do ácido cinâmico. Outras classes
de substâncias que são encontradas na própolis verde são os monos e
sequisterpenos que são responsáveis pelo odor característico e pela atividade
antimicrobiana reportada à própolis. Apesar de não ser maioria, alguns
flavonóides foram detectados que devem ser os principais responsáveis pela
atividade antioxidante da própolis, ésteres de cadeia longa e alguns triterpenos
também foram encontrados em algumas amostras da própolis verde
(SALATINO et al., 2005). Segundo Paulino e cols 2008 o 4- hidroxi-3,5 diprenil
ácido cinâmico (artepilina C) (figura 4) é a substância mais abundante na
própolis verde, sua coleta é feita pelas abelhas a partir dos exsudatos da
espécie Baccharis dracunculifolia.
Figura 4. Artepilina C
Um
trabalho
publicado
recentemente
no
periódico
Journal
of
Ethnopharmacology reporta que os compostos fenólicos encontrados na
própolis verde são responsáveis pela atividade antiúlcera. Os resultados
obtidos revelaram que os ácidos caféico, cinâmico, p- cumárico e ferúlico
apresentaram uma diminuição de cerca de 50% na área lesionada em modelo
experimental de ulcera em ratos (BARROS et al., 2008).
A morte de células ganglionares da retina é uma característica comum de
muitas doenças oftalmológicas como glaucoma, neuropatias ópticas e varias
doenças retinovascular. Apesar de já existirem tratamentos a busca de novos
medicamentos é constante. Em estudos preliminares, a própolis verde
apresentou resultados promissores no tratamento contra danos à retina, uma
vez que o extrato de própolis verde teve efeito neuroprotetor contra danos em
células in vitro. Os componentes comuns tais como; 3,4 di-O-ácido
cafeoilquínicos, 3,5-di-O-ácido cafeoilquínicos e ácido p-cumárico são os
responsáveis pela atividade apresentada (INOKUCHI et al., 2006).
Recentemente um novo tipo de própolis proveniente da região de mangue
do Estado de Alagoas teve sua origem botânica identificada como Dalbergia
ecastophyllum, uma espécie de leguminosa. Esta própolis é denominada
“própolis vermelha” (figura 5) devido a sua coloração vermelha intensa, e já
foram reportadas para esse tipo de própolis diversas atividades biológicas em
testes in vitro (CABRAL et al.,2009).
Figura 5. Própolis vermelha do Brasil. Fonte: www.agricultura.al.gov.br
(acessado em 15/12/2009).
Da própolis vermelha já foram isolados e identificados diversos
compostos tais como: ácido butanodióico, m- guaiacol, metileugenol, metil oorselinato de metila, metoxieugenol, ácido hexadecanóico, 7,4 dihidroxiisoflavona, 2,4,6 trimetilfenol, entre outros, sendo que substâncias como
medicarpina e homopterocarpina (figura 6) jamais tinham sido identificadas em
amostras de própolis (ALENCAR et al.,2007).
A
B
Figura 6. Homopterocarpina(a) e medicarpina(b).
Células humanas de câncer de pâncreas são conhecidas por
apresentarem tolerância acentuada a falta de nutrientes, por esta razão, estas
células sobrevivem por um longo período de tempo sob condições carentes de
nutrientes. Atualmente a cirurgia é a única modalidade que oferece qualquer
perspectiva de cura. Portanto, há uma necessidade urgente de buscar
fármacos capazes de combater essas células cancerígenas. O extrato
metanólico da própolis vermelha coletada no Estado da Paraíba apresentou
100% de citotoxicidade contra células humanas de câncer de pâncreas, essa
ótima
atividade
pode
está
associada
à
substância
3,8
hidroxi-9-
metoxiprotecarpana que foi identificada na própolis (AWALE et al., 2008).
Segundo (Torres et al.,2008) pesquisas mostraram que as própolis do
Brasil mais estudadas são a própolis vermelha e a própolis verde, embora
existem alguns relatos na literatura de estudos de outros tipos de própolis. O
estado do Piauí é um dos maiores produtores de mel do Brasil, sua localização
geográfica o torna ímpar no que refere à ocorrência de formações vegetais
específicas (cerrado, caatinga e matas de cocais) e áreas de ecotonos.
Utilizando a microidrodestilação como técnica de extração e a cromatografia
gasosa acoplada à espectrometria de massas como técnica de identificação foi
possível investigar a fração volátil do óleo essencial de amostras de própolis
piauiense. Diante dos resultados obtidos, onde cinco amostras de própolis de
diferentes regiões foram analisadas, todas elas apresentaram diferenças no
que se refere à composição química de suas frações voláteis. Dependendo da
região de coleta houve predominância de mono ou de sesquiterpenos. Quando
comparou-se os constituintes das amostras com predominância de uma
determinada classe de terpenos, observou-se que em geral, ocorrem variações
qualitativas na sua composição. Assim, estes dados indicam que inviabiliade no
estabelecimento de um perfil químico característico para as amostras de
própolis piauiense. Deve-se destacar que,a presença desses compostos
voláteis, mesmos em baixas concentrações, são indicativo de atividade
antimicrobiana.
Recentemente a composição química da própolis do Ceará foi
investigada, a amostra de própolis utilizada para investigação foi coletada no
município de Alto Santo-Ceará, onde a vegetação predominante é a “caatinga”.
Foram isoladas e identificadas sete substâncias do extrato etanólico (figura 7),
com predominância dos triterpenos e flavonóides: ácido canárico (1), lupeol (2),
lupenona (3), germanicona (4), quercetina (5), canferol (6) e acacetina (7). O
extrato etanólico de própolis e as setes substâncias isoladas foram submetidas
a testes de atividade antioxidante utilizando-se o método de seqüestro de
radicais DPPH (tabela 1), através dessa metodologia observou-se atividade
antioxidante significativa para os flavonóides quercetina 5, canferol 6 e
acacetina 7. Como esperado os flavonóides com maior número de hidroxila
como a quercetina e o canferol apresentaram maior percentagem de inibição
(ALBUQUERQUE et al., 2007).
Tabela 1. Atividade antioxidante por seqüestro de radical DPPH do extrato
etanólico de própolis e das substâncias 1,5-7.
Substâncias
Concentração (mg/ml)
1,00
0,05
0,025
%
Extrato
66
50
45
1
26
25
22
5
70
70
70
6
68
60
59
7
53
29
19
BHT
100
98
97
Trolox
100
95
90
(ALBUQUERQUE et al., 2007)
Figura 7. Substâncias de 1-7 isoladas de amostras de própolis de Alto Santo-Ceará.
Assim, a composição química da própolis comparada com a provável
fonte vegetal pode ser considerada como o melhor indicador de sua origem
botânica. Com o objetivo de caracterizar quimicamente a própolis da região Sul
do Brasil os pesquisadores (PARK et al., 2002) investigaram a origem botânica
da própolis. As amostras de própolis foram coletas nos estados do Rio Grande
do Sul, Paraná e Santa Catarina. Realizaram-se análises utilizando as técnicas
cromatográficas CG-EM e CCDAE-FR e foi possível identificar cinco tipos
diferentes de própolis na região Sul.
Existem poucos estudos sobre a atividade biológica da própolis marrom
da Bahia e apenas um relato sobre estudo químico, as atividades biológicas
decritas para a própolis do estado foram as atividades antioxidante (PARK, et
al.,2000) e antimicrobiana (CASTRO et al. 2009). A atividade antimicrobiana
possivelmente está relacionada com a presença de ácidos graxos e seus
derivados. Um estudo recente da fase hexânica da própolis oriunda do Estado
da Bahia relatou identificação de uma substância com ótima atividade
bacteriana pertencente à classe das benzofenonas preniladas, conhecida como
a hyperibona A (figura 8) (CASTRO et al.,2009). Assim, torna-se pertinente a
investigação minuciosa da composição química e avaliação da atividade
biológica da própolis da Bahia, visto que o consumo da
própolis é bem
estabelecido e estimulado.
Figura 8. Benzofenona prenilada identificada da própolis marrom da Bahia.
2. Objetivos
Isolar os constituintes químicos presentes no extrato hexânico da
própolis marrom clara da Bahia;
Identificar as substâncias isoladas através das técnicas analíticas como:
CLAE/ MS, Espectroscopia no Infravermelho e RMN;
Traçar o perfil cromatográfico dos extratos orgânicos da própolis marrom
clara e escura da Bahia;
Avaliar a atividade antioxidante in vitro dos extratos pelo método de
seqüestro do radical livre estável DPPH;
Avaliar atividade citotóxica dos extratos através do bioensaio de
letalidade sobre Artemia salina.
3. Parte experimental
3.1 Local
O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Produtos
Naturais (GPPN) situado no Departamento de Química Orgânica do Instituto de
Química da Universidade Federal da Bahia com apoio do Laboratório de
produtos Naturais(LPPN) localizado na faculdade de Farmácia.
3.2 Coleta do material
As amostras de própolis marrom clara e escura (tipo 6) foram obtidas no
município de Entre Rios, na apícola localizada na fazenda experimental
Naturapi pelo professor Dr. Ednildo Andrade Torres da Universidade Federal da
Bahia.
Na preparação dos extratos, na solubilização das amostras e nas
eluições em CCDC, CCDP e CC foram utilizados solventes como: hexano,
acetato de etila, clorofórmio, metanol diclorometano todos de grau analítico da
Quimex e Quemis.
Nos procedimentos cromatográficos em coluna foram utilizados como
fase estacionária os adsorventes gel de sílica 60 da Akros com diâmetro de
partícula entre 0,063-0,200 nm e sílica Flash com diâmetro de partícula entre
0,040-0,063 mm da Acros Co.
Nas cromatografias em camada delgada preparativa foram preparadas
placas utilizando-se suspensão de gel de sílica (Sílica gel 60 PF254 MERCK) em
água destilada e espalhadores (Espalhador Quickfit e Desaga Heidelberg),
ajustados para 1,0 mm de espessura, posteriormente essas placas ficaram
expostas 24 horas para secagem a temperatura ambiente e foram ativadas
durante 1 hora a temperatura de 100 °c.
Nos procedimentos de cromatografia em camada delgada comparativa
foram utilizadas placas pré-preparadas de gel de sílica 60 F254 de procedência
Merck.
Para a revelação das cromatoplacas foram utilizados reagente spray
Libermann - Buchard, luz UV (254/366 nm) e/ou vapores de iodo.Para o
preparo do reagente utilizou-se um béquer arrefecido e mediu-se 60 ml de
anidrido acético, em seguida adicionou-se gota a gota com agitação constante,
10 ml de ácido sulfúrico concentrado. Posteriormente adicionou-se 30 ml de
ácido acético glacial, seguido de 0,6 g de sulfato de sódio anidro.
Para evaporação dos solventes orgânicos utilizou-se o rotaevaporador
da marca BUCHI 461.
Os espectros no infravermelho foram obtidos em espectrofotômetro ABB
BOMEM SÉRIE MB e os espectros de
RMN 1H,
13
C, DEPT, HMBC e HMQC
foram registrados em espectrômetro de RMN Varian. GEMINI 2000 (7,00
Tesla), operando a 300 MHz (1H) e 75 MHz (13C), utilizando-se CDCl3, como
solvente. Para obtenção dos cromatogramas utilizou-se um cromatógrafo a
líquidos da VARIAN POLARIS modelo 320. Os espectros de massas de baixa
resolução foram registrados em um equipamento SHIMADZU LCMS -2010.
3.3 Preparo dos extratos
Amostras de própolis marrom clara (141,18 g) e de própolis marrom
escura (142,30 g) foram submetidas à extração através de maceração onde o
hexano foi utilizado como líquido extrator. O procedimento foi realizado por três
vezes consecutivas, cada uma em torno de 48h cada, e o filtrado obtido em
cada etapa foi reunido e concentrado sob pressão reduzida, obtendo-se assim
os extratos hexânicos da própolis marrom clara e escura (Tabela 2).
As tortas obtida após extração com hexano foram posteriormente
submetidas à maceração em MeOH, três extrações, com cerca de 48 h cada, e
o filtrado obtido em cada etapa foi reunido e concentrado sob pressão reduzida,
originando os extratos metanólicos da própolis marrom clara e escura (Tabela
2).
Os extratos metanólicos da própolis marrom clara e da própolis escura
foram dissolvidos em MeOH/H2O (7/3) e particionados com clorofórmio, dando
origem a duas fases, clorofórmica (fase clorofórmica)
e a hidrometanólica.
Para obtenção da fase acetato de etilia tanto a fração da própolis marrom clara
e escura hidrometanólica foram concentradas a pressão reduzida para
eliminação do metanol, as fases aquosas da própolis marrom clara e escura
foram submetidas à partição com acetato de etila originando as fases AcOEt e
aquosa. Em seguida as fases obtidas foram concentradas, pesadas e
identificadas de acordo com a Tabela 2.
Tabela 2. Massas dos extratos orgânicos das própolis clara e escura do Estado da
Bahia
Extratos
Massa (g)
Própolis marrom clara-hexânico
Rendimento (%)
34,91
24,72
34,90
24,52
(PHC)
Própolis marrom escurahexânico (PHE)
Própolis marrom clara-
53,22
37,69
26,82
20,25
clorofórmico (PCC)
Própolis marrom escuraclorofórmico (PCE)
3.4 Separação e isolamento dos constituintes do extrato
hexânico da própolis marrom clara (PHC)
O extrato hexânico (PHC) foi submetido a fracionamento por CC de
sílica gel 600 (0,063-0,200 mm da Merck) utilizando-se inicialmente hexano
como fase móvel e em seguida misturas de hex/AcOEt em gradiente de
polaridade. Foram obtidas 38 frações de 50 mL cada que foram agrupadas
após análise em CCDC (tabela 3)
Tabela 3. Frações obtidas da primeira coluna da fase hexânica.
Código
Frações
Eluente
reunidas
Hex:AcEOt)
Massa (g)
PHC 1
1
1:0
2,2626
PHC 2
2-4
1:0
0,4345
PHC 3
5-7
95:05
0,9149
PHC 4
8
9:1
4,0052
PHC 5
9-11
9:1
7,9018
PHC 6
12-15
8:2
4,8703
PHC 7
16-19
7:3
3,0020
PHC 8
20-23
7:3
2,8001
PHC 9
24-29
1:1
3,4520
PHC 10
30-33
0:1
1,5236
PHC 11
34-36
MeOH
1,3546
PHC 12
37-38
MeOH
1,0045
3.4.1 Purificação da fração PHC 4
Após análise espectral de RMN de 1H as frações PHC 4 e PHC 5 foram
agrupadas em PHC 4 (11,907 g), pois
ambas apresentaram sinais
semelhantes na região referente aos compostos aromáticos e perfis
cromatográficos semelhantes. Com isso a fração PHC 4 foi submetida à CC
empregando-se como fase estacionária sílica flash e fase móvel misturas de
hex/AcOEt em gradiente de polaridade. Foram coletadas 16 subfrações de 30
mL cada que foram reunidas após análise em CCDC (tabela 4).
Tabela 4. Frações obtidas do fracionamento da amostra PHC 4.
Código
Frações
Eluente
Massa (g)
reunidas
(Hex:AcEOt)
PHC 4.1
1-2
1:0
0,9810
PHC 4.2
3-4
1:0
3,8396
PHC 4.3
5-6
95:05
0,0109
PHC 4.4
7
9:1
3,5201
PHC 4.5
8-9
9:1
1,7258
PHC 4.6
10
8:2
0,8664
PHC 4.7
11-12
7:3
0,1782
PHC 4.8
13-15
7:3
0,3377
PHC 4.9
16
1:1
0,0586
A fração PHC 4.4 (3,5201g) foi submetida a novo fracionamento em CC
empregando-se como fase estacionária sílica flash e fase móvel o sistema
hex/AcOEt em gradiente. Foram obtidas 12 subfrações que foram agrupadas
após análise em CCDC( tabela 5).
Tabela 5. Frações obtidas do fracionamento da amostra PHC 4.4
Código
Frações
Eluente
Massa (g)
reunidas
(Hex:AcEOt)
PHC 4.4.1
1-2
1:0
0,0207
PHC 4.4.2
3-6
1:0
1,0020
PHC 4.4.3
7-8
95:05
1,0037
PHC 4.4.4
9
9:1
0,1489
PHC 4.4.5
10-11
9:1
0,8952
PHC 4.4.6
12
8:2
0,3150
A fração PHC 4.4.2 foi submetida a fracionamento em CC empregandose como fase estacionária sílica flash e fase móvel a mistura hex/AcOEt em
gradiente. Foram obtidas 15 frações e após análise em CCDC, utilizando-se
como reveladores radiação por luz UV (245 e 365 nm) a fração PHC 4.4.2.12
(38 mg) foi submetida à cromatografia em camada delgada preparativa
utilizando-se como eluente (Hex:AcEOt 85:15)
originando a fração PHC
4.4.12.C (15 mg) que após análise em CCDC apresentou um aspecto
cromatográfico de substãncia pura. Após análise espectral ratificou-se que a
mesma pertencia à classe das benzonfenonas.
3.4.2 Purificação da fração PHC 6
A fração PHC 6 (3,8703 g) foi submetida a fracionamento em CC
empregando-se como fase estacionária sílica flash e fase móvel o sistema
hexano/acetato de etila em gradiente. Foram obtidas 10 frações de 60 mL cada
que foram agrupadas de acordo com análise em CCDC, utilizando-se como
reveladores radiação por luz UV (245 e 365 nm) (tabela 6).
Tabela 6. Subfrações obtidas do fracionamento da amostra PHC 6.
Código
Frações
reunidas
Eluente
Massa (g)
(Hex:AcEOt)
PHC 6.1
1
1:0
1,1066
PHC 6.2
2
1:0
0,3315
PHC 6.3
3
95:05
0,1251
PHC 6.4
4-5
9:1
1,0405
PHC 6.5
6
9:1
0,4552
PHC 6.6
7-8
8:2
0,3150
PHC 6.7
9
7:3
0,0802
PHC 6.8
10
7:3
0,0252
A subfração PHC 6.4 (1,0405) foi submetida a fracionamento em CC
empregando-se como fase estacionária sílica flash e fase móvel o sistema
hexano/acetato de etila em gradiente. Foram coletadas 10 frações de 20 mL
cada que foram agrupadas após análise em CCDC utilizando-se como
reveladores radiação por luz UV (245 e 365 nm) (tabela 7).
Tabela 7. Subfrações obtidas do fracionamento da amostra PHC 6.4.
Código
Frações
Eluente
reunidas
(Hex:AcEOt)
Massa (g)
PHC 6.4.1
1
1:0
0,1202
PHC 6.4.2
2
1:0
0,2004
PHC 6.4.3
3
95:05
0,2501
PHC 6.4.4
4-5
9:1
0,0640
PHC 6.4.5
6-8
8:2
0,2745
PHC 6.4.6
8-10
7:3
0,0514
Após análise em CCDC a subfração PHC 6.4.4( 64 mg) foi submetida à
análise de RMN de
1
H e
13
C sendo possível à identificação de uma
benzofenona prenilada em mistura com outra substãncia. Análise via HPLC
confirmou a presença de outras substâncias.
A subfração PHC 6.4.3 (250 mg) foi submetida a fracionamento em CC
empregando-se como fase estacionária sílica flash e fase móvel o sistema
hexano/acetato de etila em gradiente. Foram obtidas 16 subfrações que foram
agrupadas de acordo com seu perfil cromatográfico. Foi possível identificar
após análise de RMN de 1H e
13
C a subfração PHC 6.4.3.1 (15 mg) como
sendo um sitosterol esterificado com o trans cinamato de metila.
3.4.3 Purificação da fração PHC 7
A purificação da fração PHC 7 (3,0020 g) foi realizada através do
fracionamento em CC empregando-se como fase estacionária sílica flash e
fase móvel o sistema hex/AcOEt em gradiente. Foram obtidas 23 subfrações
de 30 ml cada que foram agrupadas de acordo com seu perfil cromatográfico
(Tabela 8).
Tabela 8. Subfrações obtidas do fracionamento da amostra PHC 7.
Código
PHC 7.1
Frações
Eluente
reunidas
(Hex:AcEOt)
1-2
1:0
Massa (g)
0,1741
PHC 7.2
3
1:0
0,1247
PHC 7.3
4-5
95:05
0,1362
PHC 7.4
6
95:05
1,4154
PHC 7.5
7
95:05
0,1765
PHC 7.6
8-10
9:1
0,0695
PHC 7.7
11-13
9:1
0,2358
PHC 7.8
14
8:2
0,1299
PHC 7.9
15
8:2
0,2657
PHC 7.10
16
8:2
0,0601
PHC 7.11
17
7:3
0,1606
PHC 7.12
18-19
7:3
0,0526
PHC 7.13
20
7:3
0,0232
PHC 7.14
21
0:1
0,0125
PHC 7.15
22-23
0:1
0,0058
A subfração PHC 7.10 (60,1 mg)
foi submetida à cromatografia em
camada delgada preparativa utilizando-se como eluente (Hex:AcEOt 95:05)
originando a fração PHC 7.10 D (13 mg) que após análise em CCDC utilizandose como reveladores radiação por luz UV (245 e 365 nm) apresentou um
aspecto cromatográfico de substãncia pura. Após análise espectral de RMN de
13
C e 1H foi possível identificar a subfração PHC 7.10 D como sendo o trans
cinamato de metila.
3.5 Análise dos extratos hexânicos e metanólicos da
própolis marro clara e escura da Bahia por Cromatografia
líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR)
Os extratos hexânicos da própolis clara e escura foram submetidos a
análises por CLAE em fase reversa. Vinte microlitros de cada extrato na
concentração de 1mg/ml foram injetados em um cromatógrafo líquido acoplado
a um detector de arranjo de foto diodo a 260 nm sendo utilizada a coluna de
fase reversa LiChroCART Purospher Star® C 18(50 mm x 4 mm) com tamanho
da partícula 3 µm combinado com pré-coluna LiChroCART 4-4 LiChrospher. A
fase móvel utilizada foi água e algumas gotas de ácido acético utilizado para
diminuir a força do eluente(solvente A) e metanol (solvente B), com vazão
constante de 1mL/min. Iniciou-se o gradiente com 40% A e 60 % de B até 3
minutos, 30% de A e 70% de B até 10 minutos, 25% de A e 75% de B até 20
minutos, 10% de A e 90% de B até 28 minutos, 40% de A e 60% de B até 45
minutos. Para obtenção dos cromatogramas a coluna foi mantida a temperatura
ambiente. O mesmo procedimento foi utilizado para os extratos orgânicos
apenas mudou-se o gradiente para 50% de A e 50%de B até 3 minutos, 45%
de A e 55% de B até 10 minutos, 40% de A e 60% de B até 20 minutos, 30%
de A e 70 % de B até 30 minutos, 20% de A e 80% de B até 40 minutos, 15%
de A até 85% de B até 50 minutos, 10% de A e 90% de B até 60 minutos, 50%
de A e 50% de B até 65 minutos.
3.6 Avaliação da atividade antioxidante pelo método
sequestrante de radical DPPH
Os extratos metanólicos e hexânicos da própolis clara e escura foram
submetidos a teste de atividade antioxidante in vitro, utilizando-se a
metodologia do seqüestro de radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil).
Por ter a capacidade de aceitar um elétron ou radical hidrogênio para
torna-se uma molécula estável (figura 9) o DPPH é bastante utilizado em
ensaios para determinar a capacidade antioxidante de extratos e substãncias.
Visualmente quando o DPPH (coloração púrpura) entra em contato com
substâncias antioxidantes a coloração do meio reacional fica amarelada
(BRAND-WILLIAMS et al., 1995).
Preparou-se 50 ml de uma solução metanólica de DPPH (45µg/mL) em
seguida preparou-se soluções metanólicas dos extratos em 5 concentrações
(20, 50, 100,150, 200 µg/mL), onde o ácido gálico foi utilizado como padrão.
Para realização dos testes foram utilizados 3 mL de solução de DPPH com 1
mL da amostra, as absorvâncias foram
medidas a 517 nm em um
espectrofotômetro após 15 minutos de incubação. Para zerar o equipamento
preparou-se o branco com 3 mL de DPPH e 1 mL de metanol. Todas as
reações foram realizadas a temperatura ambiente e em local protegido da luz.
Todas as análises foram realizadas em triplicatas. Através do software
ED50v10 foi possível calcular o IC50.
Figura 9. Representação esquemática do radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazila(púrpura) e do
1,1-difenil-2- picrilhidrazina (amarelo claro) respectivamente.
A percentagem de atividade antioxidante foi calculada utilizando-se a
seguinte fórmula:
% A.A = (ABS controle15 – ABS amostra15) X 100
ABS controle15
Onde: A.A (atividade antioxidante), ABS controle15 (absorbância no
tempo 15 minutos do metanol + DPPH) e ABS amostra15 (absorbância da
amostra no tempo 15 minutos).
3.7 Bioensaio de letalidade dos extratos sobre Artemia salina
O ensaio de toxicidade sobre Artemia Salina LEACH foi realizado de
acordo com a metodologia proposta por MEYER et al., 1982.
Foram
preparadas 5 soluções de( 50, 75, 100, 150 e 200 µg/mL) dos extratos
hexânicos, metanólicos e clorofórmicos da própolis marrom clara e escura.
Os ovos de Artemia salina foram eclodidos em um aquário retangular,
utilizando-se solução salina 3,8 g/L obtida de acordo com as especificações do
fabricante. O sistema foi aerado com bomba específica. O aquário foi
construído com uma divisão interna de acrílico contendo vários orifícios,
produzindo dois compartimentos não equivalentes em tamanho. Os ovos foram
adicionados no compartimento menor, previamente escurecido utilizando-se
papel alumínio. O compartimento maior foi externamente iluminado com
lâmpada 60W, de modo a atrair os camarões para este compartimento, após a
eclosão.
Após 48 horas foram transferidos 10 camarões para cada frasco,
utilizando pipeta Pasteur esterilizada e, o volume dos frascos completados até
5 mL com água do mar artificial. As amostras bem como os controles foram
mantidos sob iluminação por 24 horas e o número de camarões sobreviventes
foram determinados com auxílio de uma lupa. Todos os experimentos, inclusive
os de controle foram realizados em triplicata. Os dados obtidos foram
processados e os valores de CL50 foram calculados usando o método de probit.
4. Resultados e discussão
4.1 Perfil cromatográfico e espectro na região do
ultravioleta dos extratos orgânicos da própolis marrom clara
e escura da Bahia submetidas à CLAE-DAD
Os extratos orgânicos da própolis marrom clara e escura foram
submetidos à análise por CLAE em escala analítica, de modo a traçar um
possível perfil cromatográfico dos extratos hexânicos e metanólicos.
A figura 10 (p. 30) apresenta o perfil cromatográfico do extrato hexânico
da própolis clara (PHC). Nesse perfil destaca-se a presença de uma substância
majoritária, com pico com tempo de retenção em 24.9 minutos. A figura 11 (p.
30) apresenta o espectro de UV referente ao composto com tempo de retenção
24.9 minutos.
A figura 12 (p. 31) apresenta o perfil cromatográfico do extrato hexânico
da própolis escura (PHE). Nesse perfil destaca-se o pico com tempo de
retenção 25.1 minutos. A figura 13 (p. 31)
apresenta o espectro de UV
referente ao composto com tempo de retenção 25.1 minutos.
A figura 14 (p. 32) apresenta o perfil cromatográfico do extrato
metanólico da própolis clara (PMC). Nesse perfil destacam-se vários picos com
diferentes tempos de retenção indicando assim a diversidade de substâncias
com cromóforos presentes neste extrato. A figura 15 (p. 32) apresenta os
espectros de UV referentes aos compostos com tempos de retenção 10.9,
20.6, 22.6, 25.3, 26.7 e 35.9 minutos.
A figura 16 (p. 33) apresenta o perfil cromatográfico do extrato
metanólico da própolis escura (PME). Nesse perfil destacam-se vários picos
com diferentes tempos de retenção indicando assim a diversidade de
substâncias com cromóforos presentes neste extrato. A figura 17 (p. 33)
apresenta os espectros de UV referentes aos compostos com tempos de
retenção 9.5, 10.6, 35.9 e 39.1 minutos.
24.9
PHC
26.9
Figura 10. Perfil cromatográfico do extrato hexânico da própolis clara por CLAE escala
analítica no comprimento de onda de 260 nm.
24.9 min
Figura 11. Espectro de UV do composto com tempo de retenção 24.9 minutos
25.1
PHE
26.9
Figura 12. Perfil cromatográfico do extrato hexânico da própolis escura por CLAE
escala analítica no comprimento de onda de 260 nm.
25.1 min
Figura 13. Espectro de UV do composto com tempo de retenção 25.1 minutos.
10.9
22.6
25.3
26.7
35.9
PMC
20.6
Figura 14. Perfil cromatográfico do extrato metanólico da própolis clara por
CLAE escala analítica no comprimento de onda de 260 nm
Figura 15. Espectro de UV de alguns compostos presentes em PMC
9.5
10.6
35.9
26.3
39.1
PME
Figura 16. Perfil cromatográfico do extrato metanólico da própolis escura por
CLAE escala analítica no comprimento de onda de 260 nm.
Figura 17. Espectro de UV de alguns compostos presentes em PME.
Nas análises em CLAE o extrato PHC apresentou um perfil
cromatográfico semelhante ao perfil do extrato PHE. Nota-se que ambos
apresentaram um pico de maior intensidade com tempos de retenção PHC 24.9
minutos e PHE 25.1 minutos. Utilizando como parâmetro a análise em CLAE
podemos inferir a similaridade da composição química dos extratos PHC e
PHE.
Os extratos polares da própolis PMC e PME em análises por CLAE
apresentaram um perfil cromatográfico bastante rico em relação aos extratos
hexânicos PHC e PHE. Observou-se que PMC e PME apresentaram perfis
cromatográficos parecidos, sendo mais um indicativo de semelhança entre a
composição química dos extratos da própolis clara e da própolis escura.
O espectro de UV do pico 24.9 minutos do extrato PHC apresentou dois
máximos de absorção, o primeiro em 245.60 nm e o segundo em 277.39 nm.
Basicamente todos os picos referentes ao extrato PMC apresentaram
absorção máxima em torno de 250.0 nm, com perfis de absorção semelhantes
entre 200 e 400 nm. Comparando-se os valores dos espectros de UV
referentes aos picos do extrato PMC com os valores presentes na literatura
(SILVERSTEIN et al., 1979) podemos inferir, utilizando como parâmetro o
espectro de UV, à presença de compostos carbonilados e fenólicos na própolis
da Bahia, pois eles absorvem em radiações em torno de 250 e 280 nm. O
espectro de UV referente ao pico 35.9 minutos apresentou perfil semelhante ao
das isoflavonas (FERNANDES et al., 2009). Os espectros de UV dos extratos
PHE e PME não apresentaram comprimento de onda máximo não sendo
possível uma análise mais detalhada.
4.2 Elucidação estrutural de PHC 4.4.12c
PHC 4.4.12.c
A benzofenona prenilada PHC 4.4.12.c (15 mg) foi identificada a partir da
análise dos dados de RMN (mono e bidimensionais) e EM. O EMESI registrado
no modo positivo apresentou íon pseudo molecular [M+H] em m/z 503 que,
juntamente com a intensidade do pico de M+1, em m/z 504 é indicativo de FM
C33H42O4 para a substância PHC 4.4.12.c.
Análise do espectro de RMN de 1H (figuras 18, p.37; 19 e 20 p. 38)
indicou diversos sinais na região entre δ 1,52 e 1,74 correspondente aos
grupos metílicos CH3-13, CH3-14, CH3-25, CH3-26, CH3-30 e CH3-31). O
multipleto observado em δ 2,42 foi atribuído aos hidrogênios metilênicos CH210 e CH2-22
uma vez que estão localizados em uma posição beta ao
grupamento carbonila (C-9) encontram-se mais desblindados em relação aos
hidrogênios metilênicos CH2-27. Pode-se também observar no espectro
multipletos referentes a hidrogênios olefínicos que não puderam ser atribuídos
devido a similaridade do ambiente químico e magnético que estes hidrogênios
encontram-se (Tabela 9). No entanto, a presença de um sinal largo em δ 17,53
é característico de hidroxila quelada de benzofenonas preniladas (SANTOS et
al., 1999) e, os sinais na região de δ 7,24 a 7,50 são referentes aos hidrogênios
do anel aromático.
Observou-se no espectro de RMN de
13
C (figuras 21 e 22 p. 39; 23, p.
40) o registro de 43 sinais de carbonos. Dentre eles pode ser observado a
presença de quatro sinais cujos deslocamentos químicos são característicos
de carbonilas (δ 207,27; δ 197,48; δ 194,68 e δ 193,88). A presença de um
anel aromático na substância foi corroborado pela presença de sinais
característicos em δ 137,26; δ 132,46; δ 127,80; δ 128,86; δ 128,76 indicando
um grupo fenila.
Foi possível através do espectro de RMN de DEPT 135° (figuras 24 e
25, p. 41) a identificação de dez carbonos metílicos, nove carbonos
metilênicos, nove carbonos metínicos e quinze carbonos não hidrogenados
totalizando 43 carbonos.
Análise do espectro de gHSQC (figura 26 p. 42) permitiu correlacionar
os sinais dos hidrogênios em δ 4,80; em δ 4,95 e em δ 5,15 com os carbonos
C-11 em δ 119,12; C-28 em δ 122,31 e C-23 em δ 119,90 respectivamente
referentes às unidades isoprênicas típicas das benzonfenonas isopreniladas.
As outras correlações observadas estão descritas na Tabela 9 (p.46) onde
pode-se verificar a comparação com os valores de RMN de C-13 descrito para
esta substância (PICCINELLI et al., 2005). No entanto, o espectro de gHMBC
(figuras 27 e 28, p. 43; 29, p. 44) permitiu ratificar que a substância em questão
pertencia a classe das benzofenonas isopreniladas sendo que as principais
correlações espectrais observadas estão representadas na Figura 30 (p. 40).
Dentre elas pode-se destacar as correlações dos hidrogênios ligado a C-6 e a
carbonila C-4 (δ 193.88), de H-10 com C-2 (δ 194.68), C-9 (δ 207.27) e C-12 (δ
134.46) e de H-21 com C-15 (δ 197.48).
Diante da intensidade e número dos sinais observados, dos dados
espectrais discutidos anteriormente, juntamente com o pico correspondente ao
íon molecular em m/z 503 ( [M]. +), registrado pelo espectro de massas (figura
31, p. 45) e comparando-se os dados espectrais com os dados descritos na
literatura (PICCINELLI et al., 2005) foi possível concluir que a substância, em
solução, encontra-se na forma de tautômeros. Os dados espectrais discutidos
anteriormente são do tautômero A e a (tabela 10, p. 47) mostra os dados
espectrais do tautômero B comparado com os valores descritos na literatura
(PICCINELLI et al., 2005).
B
A
PHC 4.4.12C (tautômeros)
Figura 18. Espectro de RMN de 1H da substância PHC 4.4.12C (CDCl3 , 500 MHz)
Figura 19. Ampliação parcial (1) do espectro de RMN de 1H da substância PHC
4.4.12C (CDCl3 , 500 MHz)
Figura 20. Ampliação parcial (2) do espectro de RMN de 1H de PHC 4.4.12C (CDCl3 ,
500 MHz)
Figura 21. Espectro de RMN de 13C da substância PHC 4.4.12C (CDCl3 , 125 MHz)
Figura 22. Ampliação parcial (1) do espectro de RMN de 13 C da substância PHC
4.4.12C (CDCl3 , 125 MHz)
Figura 23. Ampliação parcial (2) do espectro de RMN de 13 C da substância PHC
4.4.12C (CDCl3 , 125 MHz)
Figura 24. Espectro de RMN DEPT 135º da substância PHC 4.4.12C (CDCl3, 125
MHz)
Figura 25. Ampliação parcial do espectro de RMN DEPT 135º da substância PHC
4.4.12C (CDCl3 , 125 MHz)
Figura 26. Espectro de gHSQC da substância PHC 4.4.12C (CDCl3 , 500 MHz)
Figura27. Espectro de gHMBC da substância PHC 4.4.12C (CDCl3 , 500 MHz)
Figura 28. Ampliação parcial (1) do espectro de gHMBC da substância PHC 4.4.12C
(CDCl3 ,
500 MHz)
Figura 29. Ampliação parcial (2) do espectro de gHMBC da substância PHC 4.4.12C
(CDCl3 , 500 MHz)
Figura 30. Principais correlações observadas no espectro de gHMBC da substância
PHC 4.4.12 (tautômero A).
Inten.
(x1,000,000)
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
503
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
435
2.0
1.5
1.0
311
0.0
300.0
525
519
379
0.5
343
327
325.0
391
363
350.0
375.0
400.0
419
425.0
541
557
485
447
574
473
450.0
475.0
500.0
525.0
550.0
Figura 31. Espectro de massas- APCI modo positivo de PHC 4.4.12C
575.0
592
m/z
Tabela 9. Dados espectroscópicos de gHSQC de PHC 4.4.12C (tautômero A) (CDCl3 ,
500 MHz) comparados com os valores da literatura.
Posição
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
δ 13 C PHC
4.4.12C
67.28
194.68
116.10
193.88
64.62
42.92
42.32
48.53
207.27
24.91
119.12
134.46
18.11
25.71
197.48
137.26
128.76
127.78
132.46
127.78
128.86
30.59
119.90
134.46
18.11
26.09
28.49
122.31
133.27
17.87
26.03
16.34
23.72
(*) (PICCINELLI et al., 2005).
δ13 C(*)
(67.3)
(194.6)
(116.1)
(193.9)
(64.7)
(42.9)
(43.0)
(48.6)
(207.3)
(24.9)
(119.1)
(134.5)
(18.0)
(25.7)
(197.5)
(137.2)
(128.9)
(127.8)
(132.5)
(127.8)
(128.9)
(30.6)
(119.9)
(134.5)
(18.1)
(26.1)
(28.6)
(122.3)
(133.3)
(17.9)
(26.0)
(16.4)
(23.7)
δ 1 H e PHC
4.4.12C
1.37 e 2.00
1,50
2.71
4.80
1.74
1.60
7.50
7.24
7.35
7.24
7.50
2.42
5.15
1.62
1.74
1.68
4.95
1.52
1.74
0.82
1.21
δ 1 H(*)
(1.38 e 2.00)
(1.51)
(2.74)
(4.82)
(1.70)
(1.61)
(7.53)
(7.40)
(7.52)
(7.40)
(7.53)
(2.43)
(5.16)
(1.65)
(1.76)
(1.67)
(4.96)
(1.53)
(1.70)
(0.84)
(1.23)
Tabela 10. Dados espectroscópicos de RMN de 13C de PHC 4.4.12C( tautômero B)
(CDCl3 , 500 MHz) comparados com os valores da literatura.
Posição
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
δ 13 C PHC 4.4.12c
71.04
(**)
116.88
(**)
59.60
41.49
42.32
47.60
207.27
25.55
119.12
134.46
17.87 ou 18.11
2.578
197.48
137.26
128.86
127.78
132.46
127.78
128.86
29.86
120.38
134.45
18.11
26.09
28.10
122.23
133.26
18.11
26.03
16.23
22.59
δ13 C(*)
71.0
192.6
116.8
195.5
59.6
41.5
42.3
47.7
207.3
25.5
119.1
134.5
18.0
25.7
197.7
137.2
128.9
127.8
132.5
127.8
128.9
29.9
120.4
134.5
18.1
26.1
28.2
122.2
133.3
18.1
26.0
16.2
22.6
(*) (PICCINELLI et al., 2005).
(**) Os valores das carbonilas não apareceram no espectro de RMN de 13C.
Assim, PHC 4.4.12.c foi identificada como sendo 3-benzoil-4-hidroxi-8,8
dimetil-1,5,7-tris(3 metil-2-but-1-enil) bicilo[3.3.1] non-3-eno-2,9-diona (1R, 5R e
7S) também conhecida como clusianona. As benzofenonas isopreniladas são
típicas das espécies Clusia e Garcinia ambas pertencentes à família Guttiferae.
No entando, está é a primeira vez que essa substância é encontrada na
própolis.
Em trabalho anterior (PICCINELLI et al., 2005)
foi observado que a
clusianona apresenta atividade anti-HIV moderada frente a células infectadas
e uma ótima atividade citotóxica. Esta substância foi isolada pela primeira vez
a partir das raízes de Clusia congestiflora (McCANDLISH et al., 1976). Em
1991, foi também encontrada nos frutos de C. sandinensis embora sem a
determinação da estereoquímica do C-7 (DELLE MONACHE, et al., 1991).
Finalmente, em 1996 a mesma foi isolada da resina floral da espécie C. apititusantensis
onde a estereoquímica do carbono 7 foi então determinada (DE
OLIVEIRA, et al., 1996). Santos et al., após isolar 7-epi-clusianona (figura 32)
sugeriu que o composto isolado em 1991 não seria a clusianona e sim o
epímero 7-epi-clusianona.
Figura 32. Estrutura da 7-epi-clusianona.
4.3 Elucidação estrutural de PHC 6.4.3.1
PHC 6.4.3.1 - Cinamato de sitosterila
Após eluição em CCDC e revelação com reagente de LiebermanBuchard a substância PHC 6.4.3.1 apresentou uma coloração rósea indicativo
de triterpeno ou esteróide.
Análise do espectro de RMN de 1H (figuras 33, p. 50; 34 p. 51) indicou
vários sinais na região entre δ 0.70 e 1.26 correspondente aos grupos metílicos
do sistema esteroidal (CH3-18, CH3-19, CH3-21, CH3-26, CH3-27, CH3-29). A
presença de um multipleto em δ 4.75 correspondente ao hidrogênio oximetínico
que, pelo deslocamento indica que a hidroxília encontra-se esterificada pois, o
valor de H-3 no sitosterol é em campo mais baixo (δ ~3.3). Já o dubleto em δ
5.41 (4,5 Hz) característico de hidrogênio olefínico H-6 do sistosterol. Os
dubletos em δ 6.40 e 7.65. apresentando J=15,9 Hz são indicativos de sistema
olefínico com configuração trans e os sinais na região entre δ 7.37 e 7.70,
integrando para 5H indicam um anel aromático monossubstituido.
De posse dos espectros de RMN de
13
C (figuras 35 e 36, p. 52; 37, p.
53) foi possível corroborar a existência de um carbono oximetínico em δ 74.10,
que também encontra-se mais desblindado quando comparado com o C-3 do β
–sitosterol devido esterificação com o grupo cinamoila. Os carbonos olefínicos
em δ 139.41 e 122.71 referentes à (C-5 e C-6), respectivamente, corroboram
com a estrutura esteroidal da substância. O registro de um sinal em δ
166.41referente a carbono acila, corrobora com a afirmação que a substância é
um derivado esterificado do ácido cinâmico com sitosterol. Além disso, estes
dados comparados a valores descritos na literatura (GOULART et al., 1993)
(tabela 11, p. 54) do β - sitosterol permitiram a identificação inequívoca da
substância PHC 6.4.3.1 como sendo o cinamato de sitosterila.
É descrito que o cinamato de sitosterila possui atividade alelopática.
Alelopatia, que pode ser definida como os efeitos diretos ou indiretos
promovidos por substâncias químicas produzidas por certos organismos, sobre
o crescimento e desenvolvimento de outros indivíduos do meio. Diante disso a
liberação de metabólicos secundários contidos nos tecidos vegetais pode afetar
a composição floristica de uma área. Alguns fenômenos como: a dominância
de uma única espécie ou grupos de espécie sobre outras, a mudança e
substituição de espécies no processo de sucessão podem ser explicados pela
alelopatia (ESPINDOLA el al., 2005).
O cinamato de sitosterila foi isolado anteriormente de
Lafoensia
glyptocarpa (Lytraceae) (ESPINDOLA el al., 2005), porém esse é o primeiro
relato dessa substância na própolis. Apesar de ser uma substância já
conhecida seus dados de RMN não estão disponíveis na literatura.
Figura 33. Espectro de RMN de 1H da substância PHC 6.4.3.1 (CDCl3 , 300 MHz)
Figura 34. Ampliação parcial do espectro de RMN de 1H da substância PHC
6.4.3.1 (CDCl3 , 300 MHz)
Figura 35. Espectro de RMN de 13C da substância PHC 6.4.3.1 (CDCl3 , 75 MHz)
Figura 36. Ampliação parcial (1) do espectro de RMN de 13C da substância PHC
6.4.3.1 (CDCl3, 75 MHz).
Figura 37. Ampliação parcial (2) do espectro de RMN de 13C da substância PHC
6.4.3.1 (CDCl3, 75 MHz).
Tabela 11. Dados do espectro de RMN de 13C (CDCl3 , 300 MHz) de PHC 6.4.3.1 e
valores da literatura.
Posição
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
1’
2’ e 6’
3’ e 5’
4’
7’
8’
9’
*(GOULART et al., 1993).
δ 13 C PHC 6.4.3.1
37.03
31.88
74.10
42.32
139.69
122.72
31.92
31.92
50.05
36.63
21.04
39.73
42.32
56.70
24.29
28.25
56.03
11.86
19.35
36.15
19.03
33.94
33.70
45.84
26.01
19.03
19.81
23.06
11.86
134.54
128.03
128.85
130.15
144.41
118.71
166.41
δ13 C(*)
37.25
31.64
71.81
42.29
140.73
121.71
31.89
31.89
50.12
36.40
21.08
39.68
42.29
56.87
24.30
28.24
56.05
11.87
19.38
36.16
19.03
33.94
33.12
45.83
26.03
18.76
19.81
23.06
11.99
-
4.4 Elucidação estrutural de PHC 6.4.4
PHC 6.4.4
A fração PHC 6.4.4 foi submetida à cromatografia líquida de alta
eficiência em escala analítica. A figura 38 (p. 56) apresenta o perfil
cromatográfico da fração e, pode ser verificado que existe mais de um sinal
predominante na fração. Portanto, trata-se de uma mistura. O EM-ESI,
registrado no modo positivo (figura 39 p. 57) não indica presença do pseudo
íon molecular.
O perfil do espectro de RMN de
1
H é indicativo da presença de
benzofenonas isopreniladas uma vez tem similaridades ao espectro da
clusionana (p. 37). O espectro de RMN de 1H (figura 40, p. 57) apresentou,
entre outros, diversos sinais na região entre δ 0.9 e
3.1 referentes à
hidrogênios ligados a carbonos metílicos e metilênicos. Além disso é possível
identificar a presença de hidrogênios olefínicos em δ 4.9 e 5.1 referentes as
unidades isoprênicas. Os sinais presentes na região entre δ 7.2 e 7.8 indicam a
presença do grupo benzoíla.
Nos espectros de RMN de 13C (figuras 41 e 42 p.58; 43 e 44 p.59) foram
observados 61 sinais de carbonos. Notou-se a presença de 5 carbonos na
região entre δ 190.30 e 206.81 região característica das carbonilas. O Caráter
aromático da substância foi confirmado devido à intensidade dos sinais em δ
127.83, 128.00. A presença de três sinas em δ 70.27, 70.64 e 71.04 indicaram
possivelmente a presença de carbonos oximetínicos.
Foi possível identificar um dos componentes da mistura como sendo a
Hyperibona A m/z 518 através da comparação direta dos dados de RMN de
13
C registrados com os descritos na literatura (CASTRO et al., 2009) (tabela
12).
Esse é o segundo relato de identificação dessa substância na própolis
da Bahia, segundo Castro et al., testes de atividades biológicas reportaram a
essa substância ótima atividade antimicrobiana. Até o momento, com os dados
disponíveis, não foi possível identificar a outra benzofenona presente da
mistura.
Figura 38. Perfil cromatográfico da fração PHC 6.4.4 no cromatográfo Dionex
equipado com detector de arranjo de diodo (DAD), com coluna analítica.
Figura 39. Espectro de massas da fração PHC 6.4.4 [M + H+]
Figura 40. Espectro de RMN de 1H da substância PHC 6.4.4 (CDCl3 , 300 MHz)
Figura 41. Espectro de RMN de 13C da substância PHC 6.4.4 (CDCl3 , 75 MHz)
Figura 42. Ampliação parcial (1) do espectro de RMN de 13C da substância PHC 6.4.4
(CDCl3 , 75 MHz)
Figura 43. Ampliação parcial (2) do espectro de RMN de 13C da substância PHC 6.4.4
(CDCl3 , 75 MHz)
Figura 44. Ampliação parcial (3)do espectro de RMN de 13C da substância PHC 6.4.4
(CDCl3 , 75 MHz)
Tabela 12. Dados do espectro de RMN de 13C (CDCl3, 300 MHz)de PHC 6.4.4 e
valores da literatura.
Posição
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 e 16
13 e 15
14
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
*(CASTRO et al., 2009)
δ 13 C PHC 6.4.4
78.55
193.21
115.77
172.27
60.39
39.13
42.62
47.99
204.93
193.48
137.06
128.00
127.83
131.99
22.03
90.12
71.04
25.71
23.92 ou 24.08
30.26
120.51
133.52
26.45
17.90
26.69
122.21
132.4
25.87
17.78
16.32
23.05
δ13 C(*)
78.7
193.3
115.9
172.3
60.2
39.3
42.7
48.1
204.9
193.6
137.0
128.1
127.9
131.9
22.1
90.2
71.1
25.7
24.0
30.4
120.7
133.6
26.5
17.9
26.8
122.3
132.5
25.9
17.8
16.4
23.1
4.5 Elucidação estrutural do cinamato de metila (PHC
7.10D)
O
3
9
4
8
1
2
7
OCH3
10
5
6
PHC 7.10D
A partir da análise dos dados de RMN de
13
C e 1H e do espectro no
infravermelho foi possível elucidar a estrutura da substância PHC 7.10D como
sendo o éster metílico do ácido 3-fenil prop-2-enóico mais conhecido como
trans cinamato de metila. De posse dos espectros de 1H (figuras 45 p. 62 e 46,
p. 63) foi possível identificar em δ 3,8 a presença da metoxila, dois dubletos em
δ 6.5 (J=15.7 Hz) e δ 7.8 (J=15.7 Hz) correspondentes a hidrogênios da ligação
dupla, cujas constantes de acoplamento indicam olefina com
configuração
trans. Além desses, foram observados sinais em δ 7.36 (5 e 9) δ 7.50 (6 e 8) e
δ 7.62 (7) referentes aos hidrogênios do anel aromático que foram identificados
de acordo com os dados descritos na literatura (ESPINDOLA et al., 2005).
A confirmação da identificação de PHC 7.10D foi realizada após análise
dos dados do espectro de RMN de
13
C (Figura 47, p. 63). O espectro
apresentou oito sinais, sendo que os sinais em δ 128.02 e δ 128.84 são
referentes a dois carbonos cada. O pico em δ 51.68 é característico de
metoxila ligada a carbono acila como também o sinal em δ 167.39 referente a
carbono acila típico de éster (Tabela 13).
Analise do espectro no infravermelho da substância (figura 48, p. 64)
confirmou a presença de um grupo éster, devido à presença de um sinal de
deformação axial em 1716 cm-1 típica de carbonila além de ausência de
deformação entre 3500 -3000 cm-1, característica de grupos OH, descartando
assim a possibilidade da substância ser um derivado de ácido carboxílico.
Também foi observada a presença de dois picos característicos em 773 e 668
cm-1 referentes a deformações angulares fora do plano de C-H aromático
monosubstituído. Esses dados comparados com valores descritos na literatura
para o grupo cinamoila (CHALONER, 2005) permitiram a identificação
inequívoca de PHC 7.10 D como sendo o trans cinamato de metila.
O trans cinamato de metila já foi identificado utilizando-se a técnica CGMS na própolis oriunda da região do sul do Brasil(PARK et al., 2002), porém
este é o primeiro relato de isolamento dessa substância na própolis da Bahia e
não foram encontrados dados de RMN na literatura para esta substância.
Figura 45. Espectro de RMN de 1H de PHC 7.10D (CDCl3 , 300 MHz)
Figura 46. Ampliação parcial do espectro de RMN de 1H de PHC 7.10D (CDCl3 , 300
MHz)
Figura 47. Espectro de RMN de 13C da substância PHC 7.10 D (CDCl3 , 75 MHz)
Figura 48. Espectro no Infravermelho de PHC 7.10D (filme)
Tabela 13. Dados do espectro de RMN de 1H e 13C (CDCl3 , 75 MHz)de PHC 7.10D e
valores da literatura.
Posição
1
2
3
4
5e9
6e8
7
10
PHC 7.10 D
1
13
H
C
167.39
6.52 (d) 117.75
7.77 (d) 144.84
134.32
7.36 (d) 128.02
7.50 (m) 128.84
7.62 (m) 130.25
3.80
51.68
Cinamoila
1
H**
6.42
7.67
7.30
7.46
7.46
-
13
C*
168.54
119.08
146.00
135.64
129.27
130.08
131.48
4.6 Avaliação da atividade antioxidante dos extratos da
própolis marrom clara e escura da Bahia
A produção de radicais livres é controlada nos seres vivos por diversos
compostos antioxidantes, os quais podem ter origem endógena (por ex.,
superóxido dismutase), ou serem provenientes da dieta alimentar e outras
fontes. Destas últimas destacam-se tocoferóis (vitamina E), ácido ascórbico
(vitamina C), polifenóis, selênio e carotenóides. Quando há limitação na
disponibilidade de antioxidantes podem ocorrer lesões oxidativas de caráter
cumulativo. Os antioxidantes são capazes de estabilizar ou desativar os
radicais livres antes que ataquem os alvos biológicos nas células. De forma
geral, denominam-se antioxidantes as substâncias que presentes em baixas
concentrações, comparadas ao substrato oxidável, retardam significativamente
ou inibem a oxidação do substrato (BARREIROS et al., 2006).
A figura 49 mostra os resultados expressos em percentual da atividade
antioxidante dos extratos da própolis utilizando-se como método o teste de
seqüestro do radical DPPH. Pela analise da figura 49 percebe-se que os
extratos hexânicos e metanólicos da própolis marrom clara e escura não
apresentaram atividade oxidante superior a 20%. Na medida de IC50, que
expressa a quantidade de antioxidante necessária para reduzir em 50% a
concentração inicial de DPPH os valores obtidos estão descritos na Tabela 14.
Sendo assim esse resultado pode ser um indicativo da ausência de compostos
fenólicos. Segundo Park et al., (2002) a própolis do estado da Bahia apresenta
composição química distinta dos demais tipos, devido à predominância de
compostos de natureza mais apolar e significativa ausência de flavonóides.
Figura 49. Porcentagem de atividade antioxidante dos extratos hexânicos e metanólicos
da própolis e do padrão ácido gálico.
Tabela 14. Valores de IC50 para os extratos hexânicos e metanólicos da própolis clara
e escura da Bahia.
Extrato
IC50 ug/mL
PHC
1,192 X 10-3
PHE
1,570 X 10-3
PMC
5,26 X 10-2
PME
6,50 X 10-2
4.7 Avaliação da atividade citotóxica dos extratos da
própolis marrom clara e escura da Bahia
O ensaio sobre Artemia Salina Leach é um método simples, barato e
eficiente de determinação de toxicidade aguda de substâncias. A tabela 15
apresenta os resultados de toxicidade para os extratos hexânicos (PHC E
PHE), metanólicos (PMC e PME) e para os clorofórmicos (PCC e PCE). De
acordo com a literatura (ANDERSON et al., 1991) a substância que apresentar
CL50 < 100 µg/mL é considerada muito ativa, aquela que apresentar CL50 ≥
100
µg/mL,
no intervalo
entre
100
e
900
µg/mL é
considerada
moderadamente ativa e a substância que apresentar CL50 > 1000 µg/mL é
considerada inativa. Todos os extratos, exceto os extratos hexãnicos
apresentaram CL50 < 145 µg/mL sendo assim esses extratos podem
apresentar atividade anti- tumoral (DOLABELA, et al., 1997). Como a
composição química desses extratos ativos ainda não foi estudada, torna-se
pertinente uma investigação na composição química buscando isolamento das
substâncias responsáveis por essa atividade.
Tabela 15. Resultado dos testes de toxicidade sobre Artemia Salina, relativo aos
extratos da própolis marrom clara e escura da Bahia.
Extratos
CL50 µg/mL
PHC
>1000
PHE
>1000
PCC
68.99
PCE
37.85
PMC
118.1
PME
83.83
5. Considerações finais
Este trabalho contribuiu para o conhecimento da composição química e
atividade biológica da própolis marrom da Bahia.
Pode-se verificar nos resultados obtidos no desenvolvimento deste
trabalho que foram isoladas substâncias de classes distintas. O fracionamento
do extrato hexânico da própolis levou a identificação do cinamato de metila e
do cinamato de sitosterila, que tem seu primeiro relato na própolis, de duas
benzonfenonas a hyperibona A e a clusianona que também foi isolada pela
primeira vez na própolis. Existem pouquíssimos relatos sobre estudo químico e
avaliação biológica realizados com esse tipo de própolis e a única substãncia
identificada foi a hiperibona A.
Foi possível utilizando a técnica CLAE traçar o perfil cromatográfico dos
extratos orgânicos da própolis e verificou-se a riqueza da composição química
dos extratos orgânicos polares.
A avaliação da atividade antioxidante, pelo método do seqüestro do
radical livre estável DPPH, dos extratos hexânicos e metanólicos da própolis
marrom clara e escura indicou que os extratos apresentaram de baixa a
moderada atividade antioxidante quando comparado com o ácido gálico que foi
utilizado como padrão. A excelente atividade citotóxica da própolis frente à
Artemia salina pode ser um indicativo de atividade antitumoral desses extratos,
pois todos os extratos apresentaram CL50 < 145 µg/mL exceto os extratos
hexânicos.
6. Referências bibliográficas
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