Pós Graduação Lato Sensu
Curso: Biol Mol Aplicada às Áreas Humana, Animal e Vegetal
Módulo: Biotecnologia Vegetal
Responsável: Prof. Dr. José Armando-Jr.
Aula 6: Cultura de células e protoplastos: técnicas e aplicações
Introdução
Introdução
Cultura de tecidos Æ fragmentos de tecidos vivos isolados:
1. cultivados assepticamente;
2. período de tempo (in)definido
3. meio nutritivo
Descoberta das funções das Auxinas e Citocininas
Totipotencialidade Æ célula é autônoma - contém o potencial genético
necessário para originar um organismo completo.
Maioria das divisões celulares Æ áreas concentradas: Meristemas.
1892 Æ isolamento de primeiros protoplastos por meio mecânico, o
que era uma técnica de baixa eficiência,
Cultura de Protoplastos
Protoplastos
Protoplastos Æ células vegetais desprovidas de parede celular.
-
Estado transitório obtido em laboratório Æ podem ser manipuladas
semelhante as células animais e de microorganismos conservando as
potencialidades de células vegetais completas.
Obtenção de protoplastos Æ podem ser isolados de uma vasta variedade
de tecido vegetal, onde devemos observar:
a)
b)
c)
d)
espécie doadora;
tipo e idade do explante;
condições fisiológicas da planta doadora;
condições de isolamento dos protoplasto.
a) Espécie doadora
Cultivo de protoplastos Æ segmentos de plantas jovens
Ð
ramos, raízes, folhas
Ð
Atividade meristemática intensa
+
tecidos não lignificados
Ð
paredes celulares
apenas osídicas
1
b) Tipo e idade do explante
Diferenças morfológicas: célula animal x célula vegetal
b) Explante Æ tecidos e órgãos variáveis: folhas, frutos, pecíolos, cotilédones, caules, grãos de pólen, coleóptilos, pedicelos florais e embriões somáticos
.
Técnica + difícil com célula vegetal do que animal,
por suas diferenças morfológicas
È
1. Presença de uma parede celular constituída de celulose;
2. Organelas específicas Æ cloroplastos e vacúolo
Ó
Ô
produto da
volumoso (≈ 70%
fotossíntese
volume celular)
A célula vegetal
Parede celular: características
Após expansão célula parar sua expansão, pode
secretar camadas que formam a parede secundária
Parede secundária
Parede primária
Lamela média
Parede celular Æ Celulose, hemicelulose e pectina, são os constituintes
básicos da parede celular dos vegetais sendo que as fibras de celulose e
hemicelulose tem a função de dar rigidez a parede, enquanto a pectina
mantém juntas as células adjacentes.
È
Componentes da parede celular são degradados pela utilização de
enzimas pectocelulolíticas que possuem atividades celulolíticas,
hemicelulolíticas ou pectocelulolítica
È
Obtidas de microrganismos simbióticos, parasitas, saprofíticos que
degradam naturalmente as paredes celulares
Degradação da parede Æ efetuada em meio líquido - facilita a ação
enzimática e permite a sobrevivência dos protoplastos.
2
Ligações osídicas da parede celular
Fotomicrografia de parede celular vegetal
.
Perfil tridimensional da parede celular
Parede celular x membrana celular
.
.
3
Isolando os protoplastos – fase I
Fase I
Lise da parede celular
Excisão do material
Enzimas utilizadas para degradação de parede celular
Início do processo: isolando os protoplastos
O processo da lise
.
Enzimas
Microorganismo
Atividade
Celulase Onozuka R10 Trichoderma viride
Descristalização e despolimerização da celulose
Celulase driselase
Irpex lacteus
Pectinolítica e celulolítica
Pectinase
macerozyme R10
Rhizopus sp
Endo-poligalacturonase
(desdobra a pectina)
4
Fase II: purificação e testes de viabilidade
Após tratamento enzimático Æ material
precisa ser purificado para remoção
de resíduos de enzimas, restos celulares e células não digeridas.
Fase II
Digestão
Etapas:
1. Filtrado para separar os protoplastos
do tecido não digerido.
2. centrifugado em baixa rotação Æ sedimentação e conseqüente
separação.
3. lavado com meio de digestão ou em
solução salina de KCI e CaCI2 e
coletados com o uso de uma pipeta.
Fase II: testes de viabilidade
Colônia de protoplastos em meio líquido
4. avaliada
Viabilidade
Æ
sua viabilidade
Æ feita
através do uso de corantes ou de
corantes vitais fluorescentes.
5. Após esses processos Æ o n° de
protoplastos intactos é contado
usando-se hemacitômetros.
5
Protoplastos isolados
Fase III: Cultivo propriamente dito
1. Meio de cultura Æ sais orgânicos e inorgânicos + fitorreguladores +
polissacarídeos
2. Estímulo Æ após obtenção de colônia de protoplastos:
- Físico
- Químico
3. Regeneração da parede celular e a divisão das células .
Ð
Cinética de regeneração da parede celular Æ varia de acordo com a
fonte de protoplastos e as condições de cultura.
Regeneração da parede celular Æ divisão Æ colônias Æ variação da
densidade celular baseado em subculturas Æ indivíduos adultos por
organogêse ou embriogêse.
Principais Técnicas de Cultura de Protoplastos
Aplicações: 1. Obtenção de plantas transgênicas
1. Cultura em meio líquido Æ placa de Petri com fina camada de meio que
facilita as trocas gasosas e tem como vantagem, a facilidade de
modificação do meio por troca ou diluição.
2. Cultura em meio sólido Æ inicialmente é preparada uma suspensão de
protoplastos em meio líquido duas vezes maior que a de interesse e a
agarose é preparada no dobro da concentração desejada e mantida
líquida numa temperatura de 37 a 45°C. Mistura-se volumes iguais das
duas preparações e colocados numa placa de Petri.
3. Combinação de meio líquido e sólido Æ protoplastos ou colônias
incluidas em meio de agarose é cortado em fatias e colocadas em um
volume de meío líquid: combinando as vantagens das culturas líquida e
sólida devido ao intercâmbio entre o líquido e a agarose.
Plantas transgênicas - híbridos somáticos - Seleção de mutantes
•
Obtenção de plantas transgênicas
-
plantas transgênicas Æ definidas como aquelas que apresentam
genes que originalmente não fazem parte do seu genoma.
-
resultados da obtenção da planta transgênica desejada irão depender
ainda de diversos fatores Æ integração no genoma do hospedeiro,
expressão, herança e estabilidade genética.
-
Vantagem: obtenção de uma planta inteira a par1ir de uma única
célula, evitando a formação de quimeras e reduzindo a probabilidade
e falsos transformantes.
6
Transferência de gene em alfafa (Medicago sativa L.)
2. Obtenção de híbridos somáticos
- Técnica de fusão Æ protoplastos de duas plantas são fundidos utilizando PEG, Ca++ ou corrente elétrica.
Ð
hibridização do citoplasma e
do genoma cromossômico.
Produto de fusão Æ poderá regenerar Æ divisão Æ calo Æ novo ∆
a parede celular
3. Fusão com PEG (Polietilenoglicol)
Fusão de protoplastos
Para utilizar esta técnica é preciso considerar:
.
a)
b)
c)
d)
a qualidade dos protoplastos no início do tratamento,
a pré-incubação com soluções salinas,
a densidade de protoplastos na solução fusogênica e a
concentração do PEG.
Eletrofusão Æ Com este tratamento podem-se gerar poros temporários
na membrana, onde se iniciam as fusões.
Protoplastos Æ submetidos a uma corrente alternada de alta freqüência
que faz com que estes fiquem alinhados conforme o campo elétrico Æ
após fusão, protoplastos são cultivados em meio de cultura Æ
regeneração
7
Fusão de protoplastos
Fusão de protoplastos de tubérculos de batata
.
.
3. Obtenção de mutantes
Clonagem de cenoura via cultivo de protoplastos
- Necessário uma população homogênea Æ facilmente conseguidas com
protoplastos.
-
Uma mudança no material genético pode ser conseguida:
a) Radiações Æ células são irradiadas com luz ultravioleta, são
colocadas em meio de cultura e depois selecionadas.
b) Agentes mutagênicos químicos Æ expõe-se a célula ao agente
mutagênico e em seguida as células são transferidas para um meio
onde não será permitido o crescimento de células originais.
-
Seleção de células mutantes Æ como nos protoplastos as variações
somaclonais aparecem com alta frequência, à seleção dos mutantes
pode ser feita sem utilização de um mutagênico físico ou químico.
8
Calo de explantes de ápices radiculares de Cymbidium ensifolium
Cultura de célula em suspensão de Musa spp.
.
Calos embriogênicos de banana
Manutenção da cultura
Culturas em frascos
Células embriogênicas
forma redonda e citoplasma denso
Germinação e obtenção de novos indivíduos
Células em suspensão estabelecidas
Embriões somáticos
em germinação
Plântulas enraizadas
prontas para aclimatação
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Plantio – aclimatação – campo
Fusão de protoplastos – Milho (Zea mays L.)
.
Plântulas em aclimatação
em casa-de-vegetação
Transferência para o campo
Milho (Zea mays L.) – obtenção de novos indivíduos
Biomassa: parede celular
.
.
10
Importância da parede celular vegetal
Parede celular: primária e secundária
Modelo estrutural da parede celular
Síntese de celulose
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Estrutura da celulose
Fragmentando a molécula de celulose
FIM
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