PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA
E CIÊNCIAS DA SAÚDE
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: CLÍNICA MÉDICA
DETERMINAÇÃO DA FREQÜÊNCIA DE EXPRESSÃO DE
MARCADORES BIOLÓGICOS
EM AMOSTRAS DE CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE
ESÔFAGO
PELO MÉTODO DE IMUNOHISTOQUÍMICA
JOSÉ EDUARDO QUEIROZ DE CARVALHO
Porto Alegre, novembro de 2003
PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DO RIO GRANDE DO SUL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA E CIÊNCIAS DA SAÙDE
DETERMINAÇÃO DA FREQÜÊNCIA DE EXPRESSÃO DE
MARCADORES BIOLÓGICOS
EM AMOSTRAS DE CARCINOMA EPIDERMÓIDE DE
ESÔFAGO
PELO MÉTODO DE IMUNOHISTOQUÍMICA
Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Medicina e Ciências da
Saúde da Faculdade de Medicina da
Pontifícia Universidade Católica do Rio
Grande do Sul como pré-requisito para
obtenção do grau de DOUTOR.
JOSÉ EDUARDO QUEIROZ DE CARVALHO
Orientadora: Denise Cantarelli Machado, PhD
Porto Alegre, novembro de 2003
C331d
Carvalho, José Eduardo Queiroz de
Determinação da freqüência de expressão de marcadores biológicos
em amostras de carcinoma epidermóide de esôfago pelo método de
imunohistoquímica / José Eduardo Queiroz de Carvalho; orient. Denise
Cantarelli Machado. Porto Alegre: PUCRS, 2003.
86f.: il. graf. tab.
Tese(Doutorado)–Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande
do Sul. Faculdade de Medicina. (Área de concentração: Clínica Médica)
1. CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS. 2. NEOPLASIAS
ESOFÁGICAS. 3. IMUNOHISTOQUÍMICA. 4. P53. 5. PROTEÍNA DO
RETINOBLASTOMA. 6. CICLINA B1. 7. CICLINA D1. 8. ANTÍGENO
NUCLEAR DE PROLIFERAÇÃO CELULAR. 9. KI67. 10.C-ERBB-3. 11.
BCL-2 12. BCL-X. 13. C-MYC. 14. RECEPTOR DO FATOR DE
CRESCIMENTO EPIDÉRMICO. 15. ESA. 16. EMA. 17.MDM2. 18. CK20.
19.CK 5, 6, 18. 20 CEA. 21. CA-19-9. 22. I. Machado, Denise Cantarelli.
II. Título.
C.D.D. 616.99432
C.D.U. 616-000.6:616.329(043.3)
Elisete Sales de Souza/Bibliotecária
CRB10/1441
Rosária Maria Lúcia Prenna Geremia
Dedico este trabalho:
À minha esposa, Ana Martha, e ao meu filho Eduardo
“Não és sequer a razão do meu viver, posto que és já toda a minha vida”
Florbella Espanca
(poeta portuguesa)
Ao meu pai, Dr. José Mário de Carvalho, mestre da cirurgia e profundo
estudioso das ciências médicas e humanas, pelo seu caráter como pessoa e pela
sua grandeza como homem.
À minha mãe, Annajara Queiroz de Carvalho, mulher corajosa e determinada,
que me passou a alegria de viver.
Aos meus irmãos, Danusa, José Mário, Dardânia e João Antônio, pelo
exemplo de profissionalismo e pela maneira honesta com que conduzem suas
vidas.
Faço deste trabalho uma homenagem aos que pereceram na luta contra o
câncer.
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Dra. Denise Cantarelli Machado, o meu agradecimento
especial pela sua dedicação e empenho em todos os passos da realização deste
estudo. De uma maneira simples e objetiva, mas sempre competente, contribuiu
em questões fundamentais deste trabalho. A seriedade e a honestidade com que
busca a verdade científica impressionaram-me positivamente.
Ao amigo e colega Dr. Manoel Constant Neto, que me apresentou o projeto e
incentivou-me a desenvolvê-lo.
Ao incansável Dr. Salvador Gullo Neto, parceiro no trabalho e amigo de todas
as horas. O seu incentivo diário foi sempre muito importante.
À Direção do Curso de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina da
PUCRS, que me permitiu desenvolver este trabalho.
A todos os professores dos cursos de Graduação e de Pós-Graduação da
Faculdade de Medicina da PUCRS, que, de uma maneira ou de outra,
contribuíram para a minha formação médica.
Aos acadêmicos Vinícius Schenk Michaelsen, Giancarlo Maruri Munaretto,
Manlio Falavigna, Ana Carolina Silva de Castro, Bibiana Butkus de Aguiar e a
técnica Raquel Mattos de Oliveira pela sua inestimável ajuda no preparo das
lâminas. Sem sua contribuição este projeto não teria findado em tempo hábil.
Ao Prof. Dr. Emilio Jeckel Neto por disponibilizar seu laboratório e
equipamentos para a confecção das lâminas.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul –
FAPERGS, pelo apoio financeiro.
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS ......................................................................................................VIII
LISTA DE TABELAS ...................................................................................................................IX
LISTA DE FIGURAS .....................................................................................................................X
RESUMO ....................................................................................................................................XII
ABSTRACT ...............................................................................................................................XIII
I. INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 1
1.1 CÂNCER DE ESÔFAGO ..................................................................................................... 1
1.2 ONCOLOGIA MOLECULAR ............................................................................................... 5
1.3 O CICLO CELULAR E CÂNCER ........................................................................................ 7
1.3.1 Proto-oncogenes e Genes Supressores de Tumor....................................................... 9
1.3.2 Mutações que afetam a proliferação celular ............................................................... 11
1.3.3 Mutações que causam a perda do controle do ciclo celular........................................ 12
1.3.4 Biologia Molecular no estudo dos cânceres do esôfago ............................................. 14
1.4 PROTEÍNAS ENVOLVIDAS NO CONTROLE DO CICLO CELULAR ................................. 15
1.4.1 Gene supressor de tumor p53 ................................................................................... 15
1.4.2 Proteína do gene retinoblastoma (Rb) ........................................................................ 18
1.4.3 A proteína Murine Double Minute 2 (MDM-2) .............................................................. 19
1.4.4 Ciclina B1.................................................................................................................. 20
1.4.5 Ciclina D1.................................................................................................................. 21
1.5 PROTEÍNAS CONTROLADORAS DA PROLIFERAÇÃO CELULAR .................................. 23
1.5.1 Antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA) ....................................................... 23
1.5.2 Ki67........................................................................................................................... 24
1.5.3 Receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) ............................................... 25
1.6. PROTEÍNAS ENVOLVIDAS NA APOPTOSE ................................................................... 26
1.6.1 bcl-2 .......................................................................................................................... 26
1.6.2 bcl-x .......................................................................................................................... 27
1.7 PROTEÍNAS ONCOGÊNICAS ......................................................................................... 28
1.7.1 c-erbB-3 .................................................................................................................... 28
1.7.2 c-myc ........................................................................................................................ 28
1.8 PROTEÍNAS DE ORIGEM EPITELIAL.............................................................................. 29
1.8.1 Citoqueratina 20 (CK20) ............................................................................................ 29
1.8.2 Citoqueratinas 5, 6 e 18............................................................................................. 30
1.8.3
Antígeno específico epitelial (ESA) ........................................................................ 31
1.8.4 Antígeno de membrana epitelial (EMA)...................................................................... 31
1.9 PROTEÍNAS ENVOLVIDAS EM OUTROS PROCESSOS CELULARES............................ 32
1.9.1 Antígeno carcinoembriônico (CEA) ............................................................................ 32
1.9.2
CA19-9 ................................................................................................................... 33
1.10 PANORAMA ATUAL DAS ALTERAÇÕES MOLECULARES NO CÂNCER ...................... 34
II. OBJETIVOS............................................................................................................................ 36
III. MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................................... 37
3.1 ASPECTOS BIOÉTICOS................................................................................................... 37
3.2 DELINEAMENTO DO ESTUDO......................................................................................... 38
3.3 AMOSTRAS INVESTIGADAS ........................................................................................... 38
3.4 TÉCNICA DE IMUNOHISTOQUÍMICA .............................................................................. 39
3.5 CONSIDERAÇÕES SOBRE A FORMA DE APRESENTAÇÃO ......................................... 42
IV. RESULTADOS ...................................................................................................................... 43
4.1. FREQÜÊNCIA DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS QUE CONTROLAM O CICLO CELULAR
............................................................................................................................................... 46
4.2. FREQÜÊNCIA DE EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS QUE ATUAM NA PROLIFERAÇÃO
CELULAR ............................................................................................................................... 50
4.3. FREQÜÊNCIA DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS ENVOLVIDAS NA APOPTOSE.......... 52
4.4. FREQÜÊNCIA DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS ONCOGÊNICAS................................ 54
4.5. FREQÜÊNCIA DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS EPITELIAIS ....................................... 56
4.6. FREQÜÊNCIA DE EXPRESSÃO DE OUTRAS PROTEÍNAS INVESTIGADAS................. 58
V. DISCUSSÃO........................................................................................................................... 61
VI. CONCLUSÕES...................................................................................................................... 74
VII. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................................... 75
VIII. ANEXO ................................................................................................................................ 86
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
AICC – Associação Internacional contra o Câncer
AJCC – American Joint Committee on Cancer
Cdk –quinase dependente de ciclina
CEA – antígeno carcinoembriônico
CEE – Carcinoma epidermóide de esôfago
CK – Citoqueratina
CNS – Conselho Nacional de Saúde
DAB –diaminobenzidina
EDTA – Ácido etilenodiaminotretracético
EGFR – receptor do fator de crescimento epidérmico
EMA – antígeno de membrana epitelial
ESA – antígeno específico epitelial
INCA – Instituto Nacional do Câncer
MDM2 - Murine Doble Minute 2
PBS – Tampão fosfato tamponado com salina
PCNA – Antígeno nuclear de proliferação celular
Rb – Proteína do gene do Retinoblastoma
TGF – Fator de crescimento e transformação
ix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Estágio do câncer e sobrevida de acordo com o American
Joint Committee on Câncer (AJCC) ................................. 4
Tabela 2
Publicações relacionadas às alterações da ciclina D1 no
carcinoma epidermóide de esôfago detectadas pelo método
de imunohistoquímica ....................................................... 22
Tabela 3
Proteínas investigadas e técnica de imunohistoquímica
específica para exposição do antígeno ............................. 38
Tabela 4
Freqüência de expressão das proteínas investigadas e
número de carcinomas de esôfago analisados ................. 42
Tabela 5
Freqüência de expressão das proteínas controladoras do ciclo
celular nos espécimes de carcinomas epidermóides de
esôfago ............................................................................. 44
Tabela 6
Freqüência de expressão das proteínas envolvidas na
proliferação celular nos espécimes de carcinomas
epidermóides de esôfago .................................................. 47
Tabela 7
Freqüência de expressão das proteínas bcl-2 e bcl-x,
envolvidas na apoptose, investigadas nos carcinomas
epidermóides de esôfago .................................................. 49
Tabela 8
Freqüência de expressão das proteínas oncogênicas c-myc e
c-erbB-3 nos espécimes de carcinomas epidermóides de
esôfago ............................................................................. 51
Tabela 9
Freqüência de expressão das proteínas epiteliais nos
espécimes de carcinomas epidermóides de esôfago........ 54
Tabela 10 Freqüência de expressão do antígeno carcinoembriônico e
CA19-9 nos espécimes de carcinoma epidermóide de esôfago
.......................................................................................... 56
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
O ciclo celular e suas fases.................................................. 9
Figura 2
Regulação do ciclo celular e apoptose pelos genes p53 e Rb 17
Figura 3
Freqüência de expressão das proteínas investigadas nos
carcinomas epidermóides de esôfago.................................. 43
Figura 4
Freqüência de expressão das proteínas controladoras do ciclo
celular nos carcinomas epidermóides de esôfago ............... 45
Figura 5
Fotomicrografia de uma amostra de CEE mostrando a
marcação nuclear do anticorpo para o antígeno p53. Aumento
400x ..................................................................................... 45
Figura 6
Fotomicrografia de uma amostra de CEE mostrando a
marcação citoplasmática do anticorpo para o antígeno ciclina
B1. Aumento 400x................................................................ 46
Figura 7
Fotomicrografia de uma amostra de CEE mostrando a
marcação citoplasmática do anticorpo para o antígeno ciclina
D1. Aumento 400x................................................................ 46
Figura 8
Freqüência de expressão das proteínas envolvidas na
proliferação celular nos carcinomas epidermóides de esôfago
............................................................................................. 48
Figura 9
Fotomicrografia de uma amostra de CEE mostrando a
marcação da membrana pelo anticorpo para o antígeno EGFR.
Aumento 400x ...................................................................... 48
Figura 10
Freqüência de expressão das proteínas envolvidas na apoptose
nas amostras de carcinoma epidermóide de esôfago .......... 50
Figura 11
Fotomicrografia de uma amostra de CEE mostrando a
marcação citoplasmática do anticorpo para o antígeno bcl-x.
Aumento 400x ...................................................................... 50
Figura 12
Freqüência de expressão das proteínas oncogênicas c-myc e cerbB-3 nos espécimes de carcinoma epidermóide de esôfago
............................................................................................. 52
Figura 13
Fotomicrografia de uma amostra de CEE mostrando a
marcação da membrana citoplasmática pelo anticorpo para o
antígeno c-erbB-3. Aumento 400x........................................ 52
xi
Figura 14
Freqüência de expressão das proteínas epiteliais nos
espécimes de carcinoma epidermóide de esôfago .............. 54
Figura 15
Fotomicrografia de uma amostra de CEE mostrando a
marcação da membrana pelo anticorpo para o ESA. Aumento
400x ..................................................................................... 55
Figura 16
Freqüência de expressão do antígeno carcinoembriônico e
CA19-9 nos espécimes de carcinoma epidermóide de esôfago
............................................................................................. 56
Figura 17
Fotomicrografia de uma amostra de CEE mostrando a
marcação citoplasmática do anticorpo para o CEA. Aumento
400x ..................................................................................... 57
xii
RESUMO
A relevância do tema em questão, câncer de esôfago, deve-se a uma
combinação de fatores tais como alta incidência, alta mortalidade, alto custo dos
tratamentos com baixa eficiência, e impacto na força de trabalho. Os
conhecimentos básicos de Biologia Molecular limitavam-se, na prática clínica
diária, ao diagnóstico diferencial de lesões de histologia dúbia e ao seguimento de
lesões neoplásicas diagnosticadas por outros métodos. O melhor entendimento
da função de diversas proteínas envolvidas no metabolismo celular, associado
aos crescentes avanços das técnicas de Biologia Molecular, permitiu um
conhecimento mais amplo das alterações na expressão e estrutura das proteínas
com o desenvolvimento, comprometimento e desfecho de inúmeros tipos de
câncer, entre eles o carcinoma epidermóide de esôfago.
O presente estudo teve como objetivo determinar a freqüência de expressão
de proteínas envolvidas no ciclo celular, proteínas controladoras de proliferação
celular, proteínas envolvidas na apoptose, proteínas oncogênicas, proteínas de
origem epitelial e proteínas envolvidas em outros processos celulares.
Através do emprego da técnica de imunohistoquímica, foram analisadas trinta
e oito amostras de carcinoma epidermóide de esôfago incluídas em blocos de
parafina obtidas de pacientes submetidos à esofagectomia no Hospital São Lucas
da PUCRS. A freqüência de expressão das proteínas estudadas foi considerada
positiva quando mais de 10% das células tumorais apresentavam determinada
proteína. As proteínas investigadas foram p53, RB1, ciclina b1, ciclina D1, MDM2
(ciclo celular), PCNA, Ki67, EGFR (proliferação celular), bcl-2, bcl-x (apoptose), cerbB-3, c-myc (oncogênicas), ESA, EMA, CK20, CK 5, 6 e 18 (epiteliais) e CEA e
CA 19-9.
A proteína codificada pelo oncogene c-erbB-3 e a proteína bcl-x foram as
que tiveram uma maior freqüência de expressão, ambas com 92,1%, seguidas
das proteínas de origem epitelial EMA e ESA, 81,5% e 71%, respectivamente. A
proteína bcl-2 e a citoqueratina 20 apresentaram freqüência de expressão de
8,1% e 3,1%, respectivamente, nas amostras de CEE. A proteína Ki67 não foi
detectada nas amostras investigadas, e as proteínas envolvidas no ciclo celular
tiveram uma freqüência de expressão abaixo de 50%.
Palavras chave: carcinoma epidermóide de esôfago; imunohistoquímica; p53;
Rb1; MDM-2; ciclina B1; ciclina D1; PCNA; Ki67; EGFR; bcl-2; bcl-x; c-erbB-3; cmyc; CK20; CK 5, 6, 18; ESA; EMA; CA19-9; CEA.
xiii
ABSTRACT
Esophageal cancer studies are important due to a combination of factors such
as high incidence and mortality, treatments with low efficiency but high costs and
the great impact on labor. The basic molecular biology was limited, in clinical
practice, to the differential diagnosis of dubious histological lesions and the follow
up of neoplasias diagnosed by other methods. The function understanding of a
number of proteins involved in cell metabolism associated to the development of
new molecular biology techniques allow to better understand the protein structure
and changes in expression related to the development and the outcome of several
types of cancer including esophageal squamous cell carcinoma.
The aim of the present study was to determine the expression of proteins
involved in cell cycle, cell proliferation, apoptosis, oncogenes, proteins of epithelial
origin and proteins involved with other cell functions.
Thirty-eight samples of advanced esophageal squamous cell carcinoma,
formalin-fixed and paraffin-embedded, obtained from patients subjected to surgery
at Hospital São Lucas da PUCRS were analyzed regarding the expression of the
following proteins: p53, RB1, cyclin b1, cyclin D1, MDM2 (cell cycle), PCNA, Ki67,
EGFR (cell proliferation), bcl-2, bcl-x (apoptosis), c-erbb-3, c-myc (oncogenes),
ESA, EMA, CK20, CK 5, 6 e 18 (epithelial proteins), and CEA and CA 19-9.
Immunostaining was graded as positive if more than 10% of tumor cells were
stained.
The protein encoded by the oncogenes c-erbB-3 and the protein bcl-x,
involved with apoptosis, was detected in a higher frequency of expression 92,1%
of SCC samples, followed by EMA and ESA with 81,5 and 70%, respectively. Bcl2 and cytokeratin 20 were found only in 8,1% and 3,1%, respectively. The protein
Ki67 was not detected and the proteins involved with cell cycle were present in
less than 50% of investigated samples.
Key words: esophageal squamous cell carcinoma; immunohistochemistry; p53;
Rb1; MDM-2; cyclin B1; cyclin D1; PCNA; Ki67; EGFR; bcl-2; bcl-x; c-erbB-3; cmyc; CK20; CK 5, 6, 18; ESA; EMA; CA19-9; CEA.
I. INTRODUÇÃO
1.1 CÂNCER DE ESÔFAGO
As neoplasias são a terceira causa de morte no Brasil, superada somente
pelas doenças cardiovasculares e pelas causas externas. O Instituto Nacional do
Câncer (INCA) estimou para o ano de 2002 a ocorrência de 337.535 novos casos
de câncer e de 122.600 óbitos provocados por esta afecção. Utilizando-se a série
histórica disponível de taxas de mortalidade por câncer consolidadas em âmbito
nacional, por localização primária, estimou-se, para 2002, o câncer de pulmão
como a primeira causa de morte por câncer no sexo masculino, sendo a neoplasia
de esôfago a quarta causa de morte nos homens (4,94/100.000 casos). No
Estado do Rio Grande do Sul a estimativa para 2002 era de 930 casos novos de
câncer de esôfago em homens e 360 em mulheres. Além disto, se forem
comparadas às taxas de mortalidade por neoplasia de esôfago, bruta e ajustadas
por idade pelas populações mundial e brasileira, por 100.000 casos, o Rio Grande
do Sul ocupa o primeiro lugar entre os estados brasileiros (1).
Apesar do avanço da Medicina na área da oncologia, pouco foi obtido com
relação à terapêutica das neoplasias malignas do esôfago. Anualmente 13.100
americanos são diagnosticados como portadores de
câncer de esôfago
e,
desses, 12.600 morrerão da doença (2).
Há dois tipos histológicos que predominam nas neoplasias malignas do
esôfago: o adenocarcinoma e o carcinoma
epidermóide. Nas últimas duas
2
décadas ocorreu uma marcante modificação epidemiológica, com prevalência do
adenocarcinoma; hoje ele é mais prevalente que o carcinoma epidermóide nos
Estados Unidos e na Europa Ocidental, sendo que a maioria dos tumores localizase no terço distal do esôfago (3).
Há algumas evidências em relação a fatores de risco para o carcinoma
epidermóide de esôfago, como o fumo, o álcool e a má nutrição. Na China, o
câncer de esôfago está associado a deficiências de nutrientes como retinol,
riboflavina, alfa e beta-caroteno e zinco, assim como (4,5). Em contrapartida, o uso
regular de aspirina pode ser um fator de proteção para a neoplasia de esôfago,
conforme mostraram alguns autores (6,7).
O câncer de esôfago tem uma importância especial no Estado do Rio
Grande do Sul, pois apresenta uma alta prevalência, atingindo a marca de nove
casos por 100.000 habitantes (8), sendo o carcinoma epidermóide o tipo
histológico predominante (9). O chimarrão, hábito arraigado à cultura gaúcha, foi
apontado como responsável por esta alta prevalência. Entretanto, estudos
apontaram que esta alta prevalência é decorrente não da erva, mas, sim, da alta
temperatura da água, a qual poderia estar envolvida no processo de
carcinogênese (10, 11).
A faixa etária da população acometida também se constitui em um dado
importante, principalmente no que diz respeito à repercussão social desta
neoplasia. O câncer de esôfago tende a acometer, mais freqüentemente, a faixa
etária compreendida entre 45 e 65 anos. O impacto desta distribuição etária em
termos de força de trabalho é considerável devido à ausência de cura para a
maioria dos casos diagnosticados. Mesmo as terapêuticas paliativas pouco
3
modificam este cenário. Em um estudo sobre a influência do tratamento cirúrgico
na qualidade de vida de pacientes com câncer do esôfago avançado, foi
observado que menos de 3% dos indivíduos retornaram às suas atividades
laborativas (12).
A localização deste órgão em uma cavidade expansível e a elasticidade de
sua parede são condições determinantes no atraso diagnóstico que, infelizmente,
se constitui em regra nos dias de hoje, proporcionando um quadro com
predomínio de lesões avançadas, sem perspectiva significativa de cura. As
metástases linfonodais, que contribuem em muito para a piora do prognóstico,
ocorrem em um estágio inicial devido à trama linfática submucosa do esôfago
bem desenvolvida, ocorrendo em 28 a 54% dos casos,
quando a neoplasia
invade a muscular da mucosa e a submucosa, respectivamente (13, 14). Contudo,
não só a presença ou a ausência de metástases linfonodais é importante para o
prognóstico. O percentual de linfonodos comprometidos pela neoplasia, dentre
todos os tumores ressecados, bem como a sua localização em relação ao local da
neoplasia, têm sido enfatizados (15, 16), dado que evidencia possíveis benefícios
de uma linfadenectomia ampla em relação à sobrevida.
A classificação TNM do American Joint Committee on Cancer (AJCC) e da
International Union Against Cancer (AICC) para o câncer de esôfago é
empregada
universalmente.
As
três
importantes
características
deste
estadiamento correspondem à invasão tumoral (T) e à presença de metástases
em linfonodos regionais (N) ou em órgãos sólidos (M). Atualmente, a importância
prognóstica do status linfonodal tem sido insistentemente valorizada na
classificação TNM, na qual o parâmetro N é considerado mais importante que o T
4
no estadiamento da neoplasia (15, 17). A importância do estadiamento reflete-se
no prognóstico, conforme mostra a tabela a seguir:
Tabela 1. Estágio do câncer e sobrevida de acordo com o American Joint
Committee on Cancer (AJCC).
Estágio
T
N
M
Sobrevida (%)
0
Tis
No
Mo
64
I
T1
No
Mo
61
IIa
T2
No
Mo
42
T3
No
Mo
39
T1
N1
Mo
31
T2
N1
Mo
23
T3
N1
Mo
17
T4
N1
Mo
9
Tn
Nn
M1
2
IIb
III
IV
Tis=carcinoma in situ; T1=invasão da lâmina própria ou submucosa;T2=invasão da muscular própria;
T3=invasão da adventícia; T4=invasão de estrututras mediastinais adjacentes; N0=ausência de
metástases em linfonodos regionais; N1=presença de metástases em linfonodos regionais;
M0=ausência de metástases à distância; M1 – presença de metástases à distância.
O prognóstico dos pacientes com câncer de esôfago avançado é ainda muito
pobre. A sobrevida em cinco anos fica em torno de 20% (16, 18).
A cirurgia continua sendo a melhor alternativa terapêutica para o câncer de
esôfago (19, 13, 20), devendo ser considerada como tratamento padrão para
todos os casos de neoplasias ressecáveis (13).
Em um estudo multicêntrico, prospectivo e randomizado, publicado em 1997,
os autores compararam a sobrevida de pacientes submetidos à quimioterapia e à
radioterapia seguido de cirurgia, com a sobrevida de indivíduos submetidos
5
somente à cirurgia, tendo sido observado que não houve diferença na sobrevida
entre estes dois grupos de pacientes com carcinoma epidermóide de esôfago,
mas sim, aumento da mortalidade no grupo submetido à quimioterapia e
radioterapia (21). Estudos realizados na década de 80 mostravam uma alta
mortalidade cirúrgica (29%) (22). Hoje, centros dedicados à cirurgia do esôfago
mostram índices de mortalidade de 4% (23, 24). Apesar do avanço das técnicas
operatórias e da diminuição das taxas de mortalidade, uma questão parece clara:
a maioria das cirurgias tem um caráter paliativo (18).
As colocações feitas até agora mostram que uma terapêutica eficiente para
o câncer de esôfago, apesar do avanço científico e tecnológico, ainda está por
acontecer.
As pesquisas no campo da Biologia e da Genética Moleculares estão
trazendo novos entendimentos das neoplasias, podendo, em futuro já não tão
distante, contribuir para o melhor manejo terapêutico desta afecção.
1.2 ONCOLOGIA MOLECULAR
Há um axioma na Medicina que diz que o câncer não é uma doença, mas
sim várias doenças. Esta sempre foi a visão dos patologistas, epidemiologistas e
oncologistas. Entretanto, esta não é a imagem de profissionais da área de
Biologia Molecular, segundo os quais, todos os tipos de câncer compartilham de
um mesmo distúrbio, existindo bons motivos para se acreditar que deva existir
uma explicação única para o câncer. Seja de que forma se desenvolva o câncer,
todos terão, direta ou indiretamente, um dano genético. Os pesquisadores nessa
6
área apóiam-se em dois conceitos: primeiro que o câncer fundamentalmente é
uma doença celular individual, e para que se possa entender as propriedades de
funcionamento de um tumor maligno, tem-se que entender as propriedades
celulares individuais desses componentes; segundo, que a atenção maior deste
entendimento deve ser dirigido ao funcionamento dos genes em tais células. Em
outras palavras, a complexidade do câncer só será entendida quando for dada
toda a atenção aos genes. O câncer é uma perversão do fenótipo celular, sendo
os genes determinantes deste fenótipo (25).
A
maioria
dos
pesquisadores
concorda
que
o
foco
principal
da
carcinogênese está no DNA, o qual atingiria a expressão dos genes, causando
indução ou supressão, ou os carcinógenos seriam mutagênicos, danificando
diretamente os genes, levando-os a uma atividade anômala ou à perda de sua
função. Esta teoria foi a que mais ganhou impulso e ainda persiste; a habilidade
de um carcinógeno de induzir câncer está na sua capacidade de induzir mutação.
Seja por intermédio da ação de carcinógenos externos ou por erros intrínsecos do
processo genético celular, deve haver a presença de um gene mutante dentro de
uma célula de qualquer tumor.
O câncer tem várias fases. Trata-se de um fenômeno progressivo no qual
uma célula vai acumulando uma série de modificações que a levam a um
crescimento cada vez mais anormal. Essas modificações são provocadas não por
uma única mutação, mas por algumas mutações nos genes que regulam a
multiplicação celular. Três diferentes
tipos de abordagem experimental
convergiram para essa importante conclusão: a epidemiologia dos cânceres
humanos, análise do DNA nas células nos vários estágios de desenvolvimento
7
dos cânceres em seres humanos e em camundongos e superexpressão de
oncogenes em células em cultura e em animais transgênicos (26).
O paradigma genético do câncer oferece uma esperança maior para o
manejo terapêutico desta afecção. O inimigo molecular já foi avistado. Uma vez
entendidas
as
estratégias
de
crescimento
desenvolvidas
pelas
células
cancerosas, poderá se obter capacidade suficiente para o desenvolvimento de
drogas muito mais específicas, com resultados bem mais animadores que os
atuais.
1.3 O CICLO CELULAR E CÂNCER
A maioria das células eucarióticas passa por uma série ordenada de eventos
que constituem o ciclo celular, durante o qual os cromossomos são duplicados, e
uma cópia de cada cromossomo duplicado vai para cada uma das células-filhas.
A regulação do ciclo celular é crítica para o desenvolvimento normal
dos
organismos multicelulares. A perda deste controle provoca, em última análise, o
surgimento do câncer. Os processos moleculares que regulam os principais
eventos do ciclo celular, a duplicação cromossômica e a divisão celular, são
fundamentalmente semelhantes em todas as células eucarióticas.
O ciclo celular é uma série ordenada de eventos que culminam na
duplicação da célula, com duração em média, nas células de mamíferos, de 18 a
24 horas. Esta duplicação é basicamente controlada pela regulação do tempo de
dois eventos críticos no ciclo celular: a duplicação do DNA e a mitose. Ele se
divide em quatro fases principais: a fase G1, S , G2 e M (Figura 1). A fase G1 é o
8
período compreendido entre a divisão celular e o início da síntese de DNA (fase
S), período em que a célula cresce e toma forma. Durante a fase S (síntese)
ocorre a duplicação dos cromossomos (replicação do DNA ). Depois de passarem
pela fase G2, onde é feita uma checagem do DNA para verificar se mesma se
encontra pronta para a divisão celular, tem início o complicado processo da
mitose, também chamado de fase M. A mitose é a fase em que os cromossomos
são separados e a célula divide-se em duas células filhas com um conjunto
cromossômico idêntico. É na prófase, primeiro estágio da fase M, que as
cromátides se condensam. Cada cromossomo replicado contém duas cromátides
com a mesma informação genética. As cromátides–irmãs, produzidas pela
duplicação do DNA durante a fase S, permanecem ligadas pelo centrômero e se
alinham no centro da célula durante a metáfase. Na anáfase as cromátides-irmãs
separam-se e migram para pólos opostos puxadas pelo aparelho mitótico. Na
maioria das células dos eucariotos superiores o envelope nuclear rompe-se em
muitas vesículas no início da mitose e se recompõe em torno dos cromossomos
segregados quando eles se descondensam durante a telófase, o último estágio da
mitose (25).
A seqüência de eventos do ciclo celular é governada por um sistema de
controle, o qual ciclicamente desencadeia os processos essenciais da replicação
celular. No coração deste sistema, está uma série de complexos de proteínas
formada por dois tipos básicos de componentes: subunidades de proteínas
quinases, chamadas de proteínas Cdk e de proteínas ativantes, denominadas
ciclinas. No mínimo dois destes complexos protéicos regulam o ciclo celular
normal, um no ponto de controle G1, que se situa antes do início da fase S, e o
outro em G2, antes do início da fase M. Tais complexos de proteínas exercem seu
9
controle por intermédio de sua atividade quinase e pela ativação e desativação
das quinases em pontos estratégicos do ciclo.
Ciclo Celular
G1
Divisão celular
Síntese de DNA
CDK
Mitose
M
ciclina
S
Duplicação cromossômica
Separação cromossômica
G2
Figura 1. O ciclo celular e suas fases.
1.3.1 Proto-oncogenes e Genes Supressores de Tumor
A análise das alterações genéticas em células cancerosas revelou um
grande número de genes que codificam proteínas envolvidas no controle da
proliferação celular. O gene de proliferação normal é chamado de protooncogene. Por outro lado, uma célula pode ser liberada de seus controles normais
de supressão da proliferação e se dividir conforme uma célula cancerosa, se um
10
gene de antiproliferação sofrer uma mutação que o torne inativo. Assim, os genes
de antiproliferação encontrados em células normais são freqüentemente referidos
como genes supressores de tumor.
Os proto-oncogenes e os genes supressores de tumor constituem duas
classes de genes que desempenham uma função-chave na indução do câncer.
Esses genes codificam muitas espécies de proteínas que auxiliam a controlar o
crescimento e a proliferação celular. Mutações nesses genes podem contribuir
para o desenvolvimento do câncer. Os proto-oncogenes podem se converter em
oncogenes, que é qualquer gene capaz de codificar uma proteína que induza o
câncer.
Os tipos de acidentes genéticos que podem converter um proto-oncogene
em um oncogene são basicamente três: o gene pode ser alterado por uma
mutação de ponto, por deleção, por uma translocação cromossômica, ou pela
inserção de um elemento genético móvel de retrovírus. A mudança pode ocorrer
na região codificadora da proteína de forma a gerar um produto hiperativo, ou
pode ocorrer em regiões de controles adjacentes de forma que o gene é
simplesmente superexpresso. Alternativamente, o gene pode ser superexpresso
devido à amplificação em um grande número de cópias decorrentes de erros no
processo de replicação cromossômica. Um exemplo são os membros da família
do gene c-myc, que freqüentemente estão superexpressos ou amplificados. A
proteína c-myc normalmente atua no núcleo como um sinal para a proliferação
celular, quantidades excessivas de c-myc induzem as células a continuarem no
ciclo celular em circunstâncias nas quais uma célula normal pararia (27).
Os genes supressores de tumor via de regra codificam proteínas que, de
uma maneira ou de outra, inibem a proliferação celular. A perda deste mecanismo
11
contribui para o desenvolvimento de muitos cânceres. Uma cópia do gene
supressor de tumor é suficiente para controlar a proliferação celular, devendo
ambos os alelos de um gene supressor de tumor serem perdidos ou inativados
para que o desenvolvimento desse tumor seja promovido. Assim, as mutações
oncogênicas que significam perda da função em genes supressores de tumor
atuam recessivamente. Os genes supressores de tumor em muitos cânceres
apresentam deleções ou mutações pontuais que previnem a produção de
qualquer proteína ou que levam à produção de uma proteína não-funcional. O
primeiro gene
supressor
de tumor
foi
identificado
em pacientes
com
retinoblastoma hereditário (Rb). Conforme será discutido mais adiante, a proteína
codificada pelo gene Rb ajuda a regular a progressão no ciclo celular (28).
1.3.2 Mutações que afetam a proliferação celular
Algumas proteínas codificadas por vírus podem-se ligar a receptores para
fatores de crescimento nas células hospedeiras e ativá-las, estimulando assim a
proliferação celular na ausência de sinais normais. Mutações ou translocações
cromossômicas que permitem que as proteínas quinases dimerizem os receptores
de fator de crescimento levando à ativação de receptor, induzindo mudanças na
expressão gênica que podem transformar as células. A superexpressão dos
receptores para fatores de crescimento pode ter o mesmo efeito e levar à
proliferação celular anormal.
Um grande número de oncogenes é derivado de proto-oncogenes cujas
proteínas codificadas atuam como transdutoras intracelulares, isto é, proteínas
12
que ajudam na transmissão de sinais de um receptor para uma célula-alvo. Nessa
classe situam-se os oncogenes ras, os quais foram os primeiros oncogenes nãovirais a serem reconhecidos. A expressão inapropriada de fatores nucleares de
transcrição pode induzir a transformação, como é o caso de c-fos e c-myc, que
estimulam a transcrição de genes que codificam proteínas que promovem a
progressão através da fase G1 do ciclo celular para S. Nos tumores, as formas
oncogênicas desses e de outros fatores de transcrição são com freqüência
expressas em altos níveis (26).
1.3.3 Mutações que causam a perda do controle do ciclo celular
Algumas proteínas têm a habilidade de verificar a progressão do ciclo celular
e manter as células no estado quiescente ou, mesmo, levá-las ao suicídio quando
as condições não forem apropriadas. Isto significa que elas podem evitar que as
células tornem-se cancerosas. A regulação da expressão alterada, de pelo menos
uma ciclina, bem como a mutação de várias proteínas que passem a regular
negativamente a passagem pelo ponto de restrição, pode ser oncogênica.
A amplificação de um gene ou a translocação de um cromossomo que
coloca a ciclina D1 sob o controle de um promotor impróprio leva a
superexpressão dessa ciclina em muitos tipos de cânceres humanos, indicando
que a ciclina pode atuar como uma oncoproteína (29).
A perda de função do Rb seja somática ou por mutação, conduz à indução
de muitos tipos de cânceres, mais notavelmente ao retinoblastoma da infância.
Tumores com mutações inativadoras do Rb em geral expressam níveis normais
13
de ciclina D1 e produzem proteína p16 funcional. Em contraste, células tumorais
que superexpressam a ciclina D1 ou que tenham perdido a função da p16
geralmente retêm o Rb tipo selvagem. Assim, a perda de apenas um componente
desse sistema controlador da passagem pelo ponto de restrição é suficiente para
subverter o controle do crescimento normal (30).
Os fatores de crescimento estimulam, principalmente, a proliferação de
diferentes tipos de células. O fator de crescimento tumoral-β (TGF-β) é secretado
pela maioria das células corporais e apresenta uma gama de atividades
biológicas. O TGF-β tem a capacidade de inibir o crescimento de muitos tipos
celulares, incluindo a maioria das células epiteliais e células do sistema
imunológico. A perda da função de inibição do crescimento mediada pelo TGF-β
contribui para o desenvolvimento e a progressão de uma variedade de tumores
(31).
A proteína p53 é essencial para o controle do ponto de checagem, o qual
retém as células humanas com DNA danificado em G1. Embora a p53 tenha
várias funções, sua habilidade para ativar a transcrição de certos genes é a mais
relevante para a sua função de supressão de tumor. Praticamente todas as
mutações na p53 suprimem sua capacidade de ligar-se a seqüências específicas
de DNA e de ativar a expressão gênica. Na maioria das células, o acúmulo da p53
leva, também, à indução de proteínas que promovem a apoptose. Embora possa
ser tomado como uma resposta drástica ao dano no DNA, isso evita a proliferação
de células que têm a possibilidade de acumular múltiplas mutações. Quando o
controle da p53, no ponto de controle, não atua apropriadamente, o dano no DNA
pode ser perpetuado e produzir mutações, o que contribui para o desenvolvimento
de uma célula metastática altamente transformada (32). Proteínas que interagem
14
e regulam a p53 estão também alteradas em muitos tumores humanos. O gene
que codifica uma dessas proteínas, o MDM2, está amplificado em muitos
sarcomas e outros tumores humanos que mantêm a p53 funcional. Sob condições
normais, a proteína MDM2 liga-se a um sítio na porção N-terminal da p53,
reprimindo a capacidade da p53 de reativar a transcrição do p21 e de outros
genes, mediando a degradação da p53. Assim, a MDM2 normalmente inibe a
habilidade da p53 de interromper o ciclo celular levar a célula à apoptose (25).
1.3.4 Biologia Molecular no estudo dos cânceres do esôfago
A Biologia Molecular sofreu um grande avanço nos últimos tempos, mas
basicamente sua aplicação clínica nas neoplasias ainda se restringia, até pouco
tempo atrás, no diagnóstico diferencial de lesões de histologia dúbia e no
seguimento de lesões previamente diagnosticadas por outros métodos. O futuro
certamente fará com que as aplicações da Biologia Molecular nas neoplasias
atinjam
todos
os
campos,
identificando
pacientes
com
alto
risco
de
desenvolverem câncer, diagnosticando lesões com maior acurácia, determinando
o grau de malignidade das lesões cancerosas e o seu prognóstico, bem como
criando novas abordagens terapêuticas.
Apesar dos avanços cirúrgicos obtidos nas últimas décadas, associado a
outras estratégias terapêuticas, ainda não foi possível obter um aumento
significativo na sobrevida de pacientes acometidos pelo câncer do esôfago. O
melhor entendimento da função de diversas proteínas envolvidas no metabolismo
celular, associado aos crescentes avanços das técnicas de Biologia Molecular
15
permitiu que muitos pesquisadores dirigissem seus esforços para o estudo das
alterações na estrutura ou na expressão de proteínas com o desenvolvimento, o
comprometimento e o desfecho de inúmeros tipos de cânceres, entre eles o
carcinoma epidermóide do esôfago (26).
Até o momento muitas investigações já foram realizadas; no entanto, como
será visto a seguir, ainda não foi possível determinar, entre tantas alterações
detectadas, quais seriam determinantes dessas neoplasias, quais seriam
importantes para o diagnóstico e o prognóstico do carcinoma epidermóide de
esôfago.
1.4 PROTEÍNAS ENVOLVIDAS NO CONTROLE DO CICLO CELULAR
1.4.1 Gene supressor de tumor p53
O p53 é um gene supressor tumoral típico, cuja função é codificar uma
proteína que impede a proliferação indesejável de células mutantes, levando a
apoptose da célula alterada. A perda do gene p53 ou as mutações que interferem
com a sua função protetora são as mutações mais freqüentes observadas nos
cânceres humanos, embora seu papel específico no desenvolvimento do câncer e
o seu valor como marcador tumoral ainda não estejam claros. Mutações no p53
resultam na superexpressão de uma proteína que pode ser detectável pela
técnica de imunohistoquímica (33). O gene p53 está localizado no cromossomo
17p, um local freqüente de perda de alelo em muitos tumores, incluindo o câncer
de pulmão, cólon, mama e cérebro. O papel da p53 em doenças malignas tem
16
sido investigado em muitos centros. A superexpressão desta proteína tem sido
relacionada com um pior prognóstico em câncer de mama (34). Em tumores de
cólon a expressão da p53 tem sido detectada em 47% dos cânceres e em 9% dos
adenomas. Essa proteína não é expressa em mucosa normal (35).
O p53 e o gene do retinoblastoma (Rb) são dois dos mais importantes
supressores tumorais envolvidos na regulação do ciclo celular. A transição da
fase G1 do ciclo para a fase S (síntese de DNA) é mediada pela proteína p53
(36). Quando há um dano no DNA, ocorre um aumento dramático da p53, o qual
faz com que a proteína p53 normal induza a célula à fase G0 (descanso celular),
fenômeno que permite que a célula repare seu DNA antes de prosseguir para a
fase S (37) (Figura 2). Células deficientes de p53 não interrompem o ciclo celular
na fase G1 e prosseguem replicando o DNA, mesmo quando danificado. Tal
situação pode resultar no acúmulo de mutações e instabilidades genômicas,
aumentando a possibilidade de transformações neoplásicas. A p53 auxilia na
apoptose (morte celular programada) após exposição a agentes quimioterápicos
ou à irradiação. Além disso, parece haver uma relação direta entre a
superexpressão da p53 mutada e o aumento da atividade celular proliferativa no
carcinoma epidermóide de esôfago (32, 38).
Em uma revisão sobre mutações na p53 envolvendo o carcinoma
epidermóide de esôfago (CEE), a freqüência de expressão de positividade variou
entre 10-85% (39).
A proteína p53 mutada tem uma meia-vida mais longa quando comparada
com a proteína normal e, por isso, pode ser detectada pela técnica de
imunohistoquímica. A simples detecção da proteína p53 pode ser indicativo de
mutações no gene p53 (32, 40).
17
G0/descanso celular
M
G2
p53
Ciclo celular
DNA
danificado
G1
Apoptose
S
Rb desfosforilado
Figura 2. Regulação do ciclo celular e apoptose pelos genes p53 e Rb.
Investigações pertinentes a alterações na p53, correlacionando com o
prognóstico dos pacientes portadores de CEE, mostraram-se conflitantes. Isto
pode ser devido ao fato de que há poucos estudos para a detecção da p53 por
métodos moleculares, um pequeno número de pacientes avaliados e pela falha na
estratificação dos parâmetros clinicopatológicos, como tipo histológico e estágio
do tumor (41). Alguns estudos mostraram que os pacientes com tumores com
superexpressão da p53 mutada tinham uma sobrevida mais reduzida; enquanto
outros estudos não encontraram nenhuma relação entre os níveis de expressão
da p53 e o prognóstico nesses pacientes (41, 42). Parece não haver uma relação
entre a freqüência de expressão da p53 e os parâmetros clinicopatológicos, como
grau de invasão tumoral e comprometimento linfonodal. Tais resultados podem
inferir a atuação da p53 nos estágios iniciais da doença ou em lesões précancerosas, o que comprovaria o seu papel na carcinogênese (43).
A
maioria
dos
estudos
realizados
comparando
quimioterapia
e/ou
radioterapia pré-operatória e quimioterapia e/ou radioterapia neoadjuvante em
18
pacientes portadores de carcinoma epidermóide de esôfago, com a freqüência de
expressão da p53, não mostrou associação significativa (44, 45).
1.4.2 Proteína do gene retinoblastoma (Rb)
O gene do retinoblastoma (Rb) foi identificado originalmente em estudos
sobre a predisposição, herdada geneticamente, a um câncer raro que ocorre nos
olhos de crianças, associada com mutações no cromossomo 13. Foi o primeiro
gene supressor tumoral a ser identificado. A perda de ambas as cópias deste
gene leva a uma excessiva proliferação celular na retina imatura, sugerindo que o
produto do gene normal interrompe a proliferação. A clonagem do gene do
retinoblastoma permitiu investigar o efeito do produto do gene. A proteína Rb é
uma molécula abundante no núcleo de células de mamíferos e tem um papel
importante na regulação das células para a entrada na fase S do ciclo celular (46).
A Rb liga-se a muitas outras proteínas, incluindo importantes proteínas
reguladoras de genes, mas sua capacidade depende do seu estado de
fosforilação. A Rb desfosforilada liga-se, permanecendo inativa, a proteínas
reguladoras que estimulam a transcrição de certos genes, como é o caso do cmyc, necessárias à proliferação celular. A Rb fosforilada faz o inverso, libera as
proteínas estimuladoras que ativam a proliferação celular (47).
Mutações no gene Rb podem ter um efeito potencial no desenvolvimento de
inúmeros tumores, entre eles o câncer de pulmão (pequenas células), mama,
bexiga e sarcoma. Além disso, mutações nesta proteína têm indicado um pior
prognóstico em tumores de bexiga e de pulmão.
19
A expressão da Rb em carcinoma epidermóide parece ser extremamente
variável, conforme demonstrado em muitos estudos nos quais foi descrita uma
variação, desde ausência até a presença absoluta desta proteína (48). No
entanto, a maioria destes estudos considera tumores positivos quando mais de
50% das células expressam a Rb. Muitos estudos encontraram uma maior curva
de sobrevida nos CEE nos quais a freqüência de expressão da Rb era menor.
Tais resultados mostram uma forte relação da proteína Rb com a progressão da
doença (49), embora outros demonstrem que a freqüência de expressão da Rb
não está relacionada com a sobrevida dos portadores de CEE (29).
1.4.3 A proteína Murine Double Minute 2 (MDM-2)
O produto do gene MDM-2 é um potente inibidor da proteína p53 normal (46).
Em alguns tumores como os sarcomas, a amplificação da MDM-2 desempenha
um papel importante na tumorigênese causando a perda da função da p53. Zhu e
colaboradores não detectaram a amplificação deste gene em carcinoma
epidermóide de esôfago (50). Por outro lado, Shibakagi e colaboradores
detectaram um aumento da MDM-2 em 18% dos CEE, sendo que tais pacientes
tiveram um pior prognóstico, no entanto, sem apresentar relação com a p53
mutada.
Em um outro estudo, comparando alguns genes importantes para a
tumorogênese do CEE, como p53, Rb, MDM-2, p21, p16 e a ciclina D1, a
superexpressão da MDM-2 apareceu como o fator de risco mais significativo nos
20
pacientes que tinham metástases à distância, corroborando sua relação com um
pior prognóstico (49).
Alterações no MDM-2 podem ter uma relação com a progressão do CEE por
um mecanismo desconhecido em adição ao processo de tumorigênese pela
inativação da p53 (51).
1.4.4 Ciclina B1
A ciclina B1 desempenha um papel importante no ciclo celular, com uma
função reguladora na transição da fase G2 para M, sendo essencial para o início
da mitose. A superexpressão desta proteína é um achado precoce e freqüente na
seqüência metaplasia-displasia-carcinoma no esôfago de Barrettt (52).
No CEE, a prevalência da expressão da ciclina B1 foi significativamente alta
nos tumores que tinham invasão da muscular, o que sugere a sua relação com
um pior prognóstico neste tipo de carcinoma (53). Em um outro estudo
empregando a técnica de imunohistoquímica e, após, realizando uma análise
multivariada, os autores mostraram que a ciclina B1 era um fator prognóstico
independente no CEE (54).
Alguns parâmetros clinicopatológicos como grau de invasão tumoral,
comprometimento linfonodal e metástases à distância estão correlacionados com
a superexpressão da ciclina B1 (55).
21
1.4.5 Ciclina D1
A proteína ciclina D1 é freqüentemente expressa na fase G1 do ciclo celular,
e parece desempenhar um papel importante no controle do ciclo celular e na
progressão do câncer (56). A sua superexpressão tem sido sugerida como
contribuinte da oncogênese pela desregulação do ciclo celular, e estudos
apontam esta proteína como sendo este um fator oncogênico importante no
carcinoma esofagiano (57).
A amplificação do gene da ciclina D1, em geral, está relacionada com um
aumento do mRNA para a ciclina D1 ou da expressão da proteína, mas um
número significante de carcinomas apresenta uma superexpressão desta proteína
sem amplificação do gene da ciclina D1, sugerindo que outros fatores, além da
amplificação, podem estar envolvidos na superexpressão desta proteína (58).
Muitos estudos já foram descritos na literatura como sendo a ciclina D1 um
fator de péssimo prognóstico no carcinoma epidermóide de esôfago (Tabela 2)
(46).
22
Tabela 2. Publicações relacionadas às alterações da ciclina D1 no carcinoma
epidermóide de esôfago detectadas pelo método de imunohistoquímica.
Autor/Ano original
%
Associação
Naiton/1995/Japão
62
baixa sobrevida
Chetty/1997/África do Sul
29
metástases linfonodais
Takeuchi/1997/ Japão
25
metástases à distância
Anayama/1998/ Japão
27
baixa sobrevida
Ishikawa/1998/ Japão
31
baixa sobrevida
Sarbia/1999/Alemanha
73
Sem correlação com diferenciação,
associado à atividade mitótica, metástases
linfonodais e baixa sobrevida
Recentemente, um trabalho retrospectivo e multiinstitucional, realizado pelo
Comitê de Pesquisa em Câncer de Esôfago da Sociedade Japonesa para
Doenças do Esôfago, do qual participaram 10 dos maiores centros de esôfago
daquele país, confirmou e estabeleceu um valor preditivo para ciclina D1 no
prognóstico dos pacientes com câncer epidermóide de esôfago. Nesse estudo, a
relação entre a freqüência de expressão da ciclina D1 e a disseminação
hematogênica nos pacientes N1, bem como a associação da proteína com a
progressão tumoral, ficou bem demonstrada (59). Tal observação já havia sido
relatada por Shinozaki, em 1996 (60). Por outro lado, em outra análise
multiinstitucional realizada por Sarbia e colaboradores (61), a freqüência de
expressão da ciclina D1 não mostrou associação com a diferenciação tumoral, e,
sim, com a atividade mitótica e o status linfonodal. A positividade da ciclina D1
detectada nos tumores nesta investigação foi de 72 a 75%, o que é extremamente
alto se comparado com outros dados da literatura, cuja média é em torno de 45%.
23
Isto pode ser explicado pelo fato de que os autores consideraram positivos os
tumores com apenas 1% das células com presença da proteína investigada
enquanto a maioria dos estudos considera a positividade somente quando mais
de 10% das células tumorais estão marcadas pelo anticorpo.
1.5 PROTEÍNAS CONTROLADORAS DA PROLIFERAÇÃO CELULAR
1.5.1 Antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA)
O PCNA, antígeno nuclear de proliferação celular, auxilia nos mecanismos
de reparo do DNA danificado durante a fase de síntese do ciclo celular. A
detecção da proteína PCNA pela técnica de imunohistoquímica é de grande valia
na análise de células em fase proliferativa (62).
Há diferenças significantes quanto aos índices de marcação para o PCNA
em adenocarcinomas derivados do epitélio de Barrettt, indicando que este é um
marcador prognóstico importante em tumores do cárdia (63). A marcação positiva
para o PCNA em tumores primários de pequenas células de esôfago mostrou-se
desfavorável quanto ao prognóstico, ao passo que, em relação ao grau das
displasias esofágicas, o PCNA mostra uma relação direta com o grau de
severidade da displasia (64).
No CEE, o PCNA parece ser um fator prognóstico independente para o
controle local
em pacientes
submetidos
à
radioterapia
(65).
Wang
e
colaboradores(66) citam o PCNA como marcador prognóstico de uso limitado,
enquanto Yasunaga e colaboradores (67) não observaram significância no
prognóstico de pacientes operados de CEE que foram submetidos à quimioterapia
24
neoadjuvante. Nesse mesmo estudo sobre a significância prognóstica do PCNA
no CEE, os autores observaram que havia uma relação direta somente entre o
tamanho do tumor e a profundidade da invasão, não acontecendo o mesmo com
a diferenciação celular. A marcação do PCNA variou entre 4,4% a 96,2% e na
análise multivariada esta proteína não foi considerada um fator prognóstico
independente.
1.5.2 Ki67
O Ki67 é um antígeno específico para estimar a proliferação celular, sendo
expresso somente durante os períodos de proliferação celular do ciclo celular. Ele
mostra uma acurácia maior de indicação de células proliferativas do que o PCNA.
Os índices de marcação do Ki67 aumentam com a progressão tumoral em
carcinoma epidermóide de esôfago, embora outros estudos mostrem que ele não
teria um valor prognóstico em CEE (68, 69).
Existe uma diferença significativa na marcação do Ki67 para mucosa normal
e displasia no câncer de esôfago, sendo importante a expressão desta proteína
na identificação precoce de neoplasia de esôfago em populações de alto risco
(70).
A superexpressão do Ki67 aparece também na fase G1 em metaplasia de
Barrett, podendo tal atividade proliferativa precoce contribuir para a progressão
deste epitélio em neoplasia (71).
25
1.5.3 Receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR)
Os fatores de crescimento são importantes para a regulação da
diferenciação e da proliferação celular. A expressão anormal dos receptores de
fatores de crescimento, tal como o receptor do fator de crescimento epidérmico
(EGFR), está relacionado com a carcinogênese (72). O EGFR é membro da
família dos fatores de crescimento tipo 1. Trata-se de uma proteína de membrana
em tumores epidermóides, mas em tumores de mama a proteína pode ter
localização citoplasmática. A sua expressão como fator prognóstico na neoplasia
de mama permanece controversa, tendo a maioria dos estudos mostrado uma
associação com um mau prognóstico neste órgão, assim como no câncer de
pulmão e nos tumores ginecológicos (73).
Níveis elevados de EGFR já foram detectados no câncer esofagiano tais
como nas lesões displásicas e no adenocarcinoma de Barrett (74). Em um estudo
realizado por Yano e colaboradores (1991) não foi detectada uma relação entre a
expressão do EGFR com a amplificação gênica, mas sim, que níveis elevados de
EGFR estão correlacionados com o desenvolvimento de metástases e sobrevida
após a cirurgia do CEE, tornando este marcador um importante indicador
prognóstico para o carcinoma epidermóide de esôfago (75). Outros trabalhos
mostraram que o valor prognóstico e o papel do EGFR no desenvolvimento do
CEE são limitados (66).
26
1.6. PROTEÍNAS ENVOLVIDAS NA APOPTOSE
1.6.1 bcl-2
Recentes estudos sugerem que a proteína bcl-2 pode regularmente controlar
alguns mecanismos específicos do ciclo celular, inibindo certos tipos celulares de
entrar em apoptose (76). Ela foi observada em células da linhagem linfóide e
também em células basais de alguns epitélios, mas não em células mais
diferenciadas, o que pode sugerir que ela tenha uma função protetora de células
tronco (77). Além disso, o gene bcl-2 está envolvido em uma translocação gênica
característica dos linfomas foliculares (78). Do ponto de vista histopatológico
muitas vezes é difícil diferenciar uma hiperplasia folicular de uma neoplasia
folicular, parecendo haver aí uma relevância clínica da aplicação do bcl-2, pois ela
está presente somente nas células neoplásicas (79).
A sua expressão já foi estudada em câncer de esôfago, estômago,
pâncreas, pulmão, mama e nas diversas fases da tumorigênese do carcinoma
epidermóide de esôfago, desde a mucosa normal até a displasia, passando,
desde a invasão precoce até os estágios mais avançados da doença, sugerindo
uma diminuição da freqüência de expressão da bcl-2 com a progressão da
doença (80).
Estudos relacionando à sobrevida e a freqüência de expressão da bcl-2 no
carcinoma epidermóide de esôfago têm sido relatados, mas ainda há muitas
controvérsias. Alguns autores encontraram significância na relação da bcl-2 com o
prognóstico, enquanto outros estudos não detectaram associação (81).
27
Pesquisas cujo objetivo era investigar a associação da freqüência de
expressão da bcl-2, pelo método de imunohistoquímica, em portadores de CEE,
com a quimioterapia e a radioterapia pré-operatória, e que poderiam selecionar
pacientes favoráveis ou não a este tipo de tratamento, não se mostraram
significativos, o que levou à conclusão de que esta oncoproteína não modifica a
resposta a agentes anticâncer (44, 45).
1.6.2 bcl-x
A bcl-x é uma proteína da família do bcl-2 que induz apoptose, sendo
detectada no citoplasma da célula, em linfócitos ativados em áreas interfoliculares
e em um pequeno número de linfócitos nos centros germinativos. Também é
detectada nas células de Reed Stemberg em 86% dos linfomas de Hodgkin (82).
Nos tecidos normais, a bcl-x tem sido detectada na zona cortical dos timócitos,
megacariócitos, precursores de eritrócitos e em alguns tipos diferenciados de
células mielóides da medula óssea, bem como em espermatócitos. Esta proteína
aparece também em células epiteliais mamárias, células epiteliais basais e
secretoras, assim como em queratinócitos diferenciados das camadas superiores
da epiderme (83).
A análise da presença da bcl-x nos tumores de pacientes com CEE não
mostrou correlação com o prognóstico (84). Em contrapartida, Takayama (85) em
um estudo com 86 pacientes portadores de CEE, em uma análise multivariada,
mostrou que a proteína bcl-x constituía-se em um fator prognóstico independente.
Em um trabalho recente, houve uma relação direta entre a freqüência de
28
expressão da bcl-x e o grau de profundidade do tumor e o comprometimento
linfonodal em carcinoma epidermóide de esôfago (86).
Já a relação da freqüência de expressão da bcl-x com a sobrevida dos
portadores de CEE tratados com radioterapia e quimioterapia não mostrou
significância estatística (87).
1.7 PROTEÍNAS ONCOGÊNICAS
1.7.1 c-erbB-3
O c-erbB-3 é uma oncoproteína membro da família do receptor do fator de
crescimento tipo 1, que inclui também o EGFR (receptor do fator de crescimento
epidérmico) e o c-erbB-2. Tais receptores compartilham de uma mesma estrutura,
que consiste de um domínio extracelular, uma região transmembrana e um
domínio citoplasmático (88). A superexpressão do c-erbB-3 em linhagens
celulares humanas está associada com transformações neoplásicas e tem sido
detectada em adenocarcinomas, bem como em pancreatites crônicas (89).
Estudos já demostraram a superexpressão do c-erbB-3 em carcinoma de cabeça
de pâncreas (90). A superexpressão é encontrada predominantemente na
membrana, embora ocorra marcação citoplasmática em menor número.
Não há relato na literatura avaliando a freqüência de expressão de c-erbB-3
em carcinoma epidermóide de esôfago.
1.7.2 c-myc
29
O c-myc é um oncogene que codifica uma fosfoproteína, a p62, que é
necessária para a proliferação celular, diferenciação e, provavelmente, replicação
do DNA (46). O c-myc é o produto do gene de resposta inicial myc. Ele codifica
proteínas reguladoras de genes e, quando expresso em excesso por uma
mutação, pode causar proliferação celular não-controlada.
Existem evidências sugerindo que c-myc, em particular, desempenha um
papel crucial no controle da proliferação celular. Células, nas quais a expressão
do c-myc é especificamente impedida, não se dividirão, mesmo na presença de
fatores de crescimento. Por outro lado, células nas quais a expressão é
especificamente acionada, as mesmas começarão a se dividir mesmo na
ausência de fatores de crescimento. Nas neoplasias humanas, a ativação do
oncogene c-myc é resultado tanto da amplificação gênica quanto de translocação
cromossômica (91).
A sua amplificação tem sido detectada em linhagens celulares e amostras de
tumores de carcinoma epidermóide de esôfago em alguns estudos, embora a
ausência dessa amplificação também tenha sido descrita (92).
Miyazaki e colaboradores detectaram, pelo método de imunohistoquímica, a
proteína c-myc tanto no núcleo quanto no citoplasma de células de carcinoma
epidermóide avançado de esôfago. Eles também concluíram que não havia valor
prognóstico relacionado com a expressão de c- myc (93).
1.8 PROTEÍNAS DE ORIGEM EPITELIAL
1.8.1 Citoqueratina 20 (CK20)
30
A CK20 é uma citoqueratina que em tecidos normais é produzida no epitélio
intestinal, epitélio gástrico foveolar, em um número de células endócrinas na
porção superior das glândulas pilóricas, urotélio e células de Merkels na
epiderme. Em tumores, ela tem uma freqüência de expressão bem definida em
diferentes tipos de carcinoma, entre eles o adenocarcinoma colorretal, o
adenocarcinoma de vesícula biliar e colangiocarcinomas, adenocarcinoma de
células ductais de pâncreas, tumores mucinosos de ovário e carcinomas de
células transicionais. Não há evidência de marcação em adenocarcinomas de
mama, pulmão, endométrio e tumores de ovário não-mucinosos (94).
A CK20 pode ser bastante útil na classificação dos tumores da junção
esofagogástrica, auxiliando a definir a origem desses tumores, se são
provenientes do epitélio de Barrett ou primários do estômago. Ela aparece
bastante elevada em adenocarcinoma proveniente do esôfago de Barrett (73,3%),
quando comparada com outros tipos de carcinomas (95).
Não há relato na literatura avaliando a freqüência de expressão da CK20 em
carcinoma epidermóide de esôfago.
1.8.2 Citoqueratinas 5, 6 e 18
As citoqueratinas (CKs) 5, 6 e 18 são importantes marcadores de tecidos
epiteliais, desde epitélios glandulares simples até epitélio escamoso estratificado
(96), podendo ser úteis na identificação de tumores de origem epitelial e menos
comum nos tumores de origem mesotelial (97).
31
Alguns estudos mostraram a relação das citoqueratinas 5, 6 e 18 com
tumores do aparelho digestivo. Em um estudo recente, realizado no norte da
China, uma zona de alta incidência para CEE, 111 espécimes de CEE foram
avaliados para um grande número de citoqueratinas. Os resultados obtidos
apontaram uma diferença estatisticamente significativa para a marcação da CK18
nos pacientes que tinham linfonodos positivos, sugerindo que esta proteína pode
ser um marcador importante para progressão da doença (98).
Um outro estudo mostrou que não havia relação das citoqueratinas 5, 6 e 18
com tumores da transição esofagogástrica (99).
1.8.3 Antígeno específico epitelial (ESA)
O antígeno específico epitelial é uma glicoproteína de superfície, portanto é
um marcador de membrana. O ESA é útil como marcador celular de inúmeros
tecidos epiteliais humanos (100). A análise desta proteína também pode ser
usada em um painel de anticorpos para o diagnóstico de mesotelioma (101).
Atualmente, não há dados disponíveis na literatura que correlacionem a
presença do ESA com o CEE.
1.8.4 Antígeno de membrana epitelial (EMA)
O antígeno de membrana epitelial (EMA), também conhecido como
episialina, tem um peso molecular que varia de 256 a 400 kDa. Em tecidos
normais, o anticorpo anti-EMA reage com uma variedade de epitélios normais.
32
Uma forte marcação é observada na porção apical de células ductais do epitélio
mamário. Esta proteína é útil para a classificação de tumores de origem epitelial.
Poucos estudos mostraram algum grau de positividade do EMA em câncer de
esôfago (adenocarcinoma de Barrett e pequenas células primárias de esôfago),
não havendo correlação com achados clinicopatológicos (102, 103).
Ainda não existem trabalhos na literatura que correlacionem a freqüência de
expressão do EMA com o CEE.
1.9 PROTEÍNAS ENVOLVIDAS EM OUTROS PROCESSOS CELULARES
1.9.1 Antígeno carcinoembriônico (CEA)
Uma das primeiras moléculas de superfície celular designadas como
antígeno tumoral é uma glicoproteína de superfície de 180 kDa. Demonstrou-se,
inicialmente, que ela era expressa nas células do câncer do cólon humano e pelas
células intestinais do feto, mas não por células adultas saudáveis do cólon. Com
base nisso, a glicoproteína foi denominada antígeno carcinoembrionário.
Subseqüentemente, quando métodos mais sensíveis de detecção foram usados,
o CEA foi encontrado no fígado e no pâncreas fetal, e em baixos níveis, nas
células do cólon, do fígado, do pâncreas e do pulmão adultos, assim como na
mama em lactação. Além disto, a freqüência de expressão aumentada do CEA
em adultos não se restringia a células malignas, mas também era observada em
locais de inflamação crônica, conforme ocorre no cólon de pacientes com
pancreatite. De fato, a freqüência de expressão do CEA correlaciona-se mais
33
intimamente com a proliferação de células epiteliais do que com sua
transformação maligna (27).
Nas neoplasias de esôfago, alguns trabalhos mostraram que a detecção do
CEA pela técnica de imunohistoquímica pode ser útil na identificação da
histogênese de tumores epiteliais (104). Em um estudo que examinou a
freqüência de expressão do CEA com achados clinicopatológicos em CEE, os
autores mostraram que, nas amostras de pacientes com células cancerosas e
presença de CEA positivo, a invasão linfática era significativamente maior que nos
pacientes com ausência de CEA. Estas observações levaram a suposição de que
o CEA desempenha um papel importante no grau de invasão linfática no
carcinoma epidermóide de esôfago (105).
Parece não haver uma relação do CEA com o grau de profundidade tumoral
nem com o estágio da doença no CEE (106).
1.9.2 CA19-9
O CA19-9 é uma proteína de membrana celular útil no diagnóstico e no
seguimento de pacientes com câncer pancreático e gastrointestinal (107). No
carcinoma de pâncreas, a freqüência de expressão do CA19-9 correlaciona-se
com a diferenciação tumoral (108), podendo também aparecer em lesões
benignas, como na pancreatite crônica.
Não há dados descritos na literatura avaliando a correlação entre a presença
da proteína CA19-9 e o CEE.
34
1.10 PANORAMA ATUAL DAS ALTERAÇÕES MOLECULARES NO CÂNCER
O avanço nos estudos de linhagens tumorais permitiu a identificação de
antígenos tumorais. A partir destes, anticorpos monoclonais foram desenvolvidos,
possibilitando o diagnóstico de muitas lesões. No entanto, o mais importante foi a
descoberta de que pacientes que tinham a mesma classificação clínica e o
mesmo tipo histológico apresentavam padrões de alterações genéticas diferentes
(26). A forma de classificar o câncer pelo fenótipo, ou que seja, pelo arranjo
celular, passa a ser considerada muito simplista, pois cada caso de câncer é
caracterizado por um conjunto de alterações genéticas próprias.
Como referido anteriormente o estudo da Biologia Molecular levou à
compreensão de muitos mecanismos envolvidos na gênese do câncer. A
descoberta dos oncogenes e proto-oncogenes começa a desvendar as
características bioquímicas desta doença, mas ainda estamos longe de
compreender completamente a fisiololgia dos cânceres humanos. É preciso um
esclarecimento maior a respeito de como as moléculas interagem e influenciam o
comportamento das células individuais, bem como das diferentes mutações
genéticas que contribuem para o aparecimento de células cancerosas.
Diversas técnicas de Biologia Molecular, entre as quais a técnica de
imunohistoquímica, permitiu diagnosticar inúmeros tipos de câncer, e possibilitou
outros tantos estudos prognósticos dessas lesões. Apesar disso, os dados
disponíveis na literatura científica referentes a estes achados são bastante
conflitantes, pois não há uma padronização da metodologia de quantificação entre
os diferentes laboratórios.
35
A inexistência de estudos que investiguem um grande número de proteínas
em uma mesma amostra no câncer de esôfago, e o fato de que algumas
proteínas como a c-erbB-3, ESA, EMA, CA19-9 e CK20, ainda não terem sido
investigadas no carcinoma epidermóide de esôfago, nos levou a definir os
objetivos a seguir.
II. OBJETIVOS
2.1.Objetivo Geral
Determinar a freqüência da expressão de proteínas envolvidas no
ciclo celular (p53, Rb1, MDM2, ciclina B1 e ciclina D1), proliferação celular
(PCNA, Ki67, EGFR), apoptose (bcl-2 e bcl-x), proteínas oncogênicas (cerbB-3 e c-myc), marcadores epiteliais (citoqueratina 20, ESA, EMA e
citoqueratinas 5, 6 e 18) e as proteínas que estão envolvidas em outros
processos celulares (CEA e CA19-9), em amostras de carcinoma
epidermóide de esôfago.
2.2.Objetivos Específicos
2.2.1 Determinar a freqüência da expressão de proteínas celulares
de acordo com o seu grupo funcional em amostras de carcinoma
epidermóide esôfago.
2.2.2 Determinar a freqüência da expressão de proteínas celulares
c-erbB-3, ESA, EMA, CA19-9 e CK20, ainda não investigadas em carcinoma
epidermóide de esôfago.
III. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 ASPECTOS BIOÉTICOS
O presente estudo está em conformidade com os itens III.3.i e III.3.t das
Diretrizes e Normas Regulamentadoras de Pesquisa Envolvendo Seres Humanos
(Resolução CNS 196/96), bem como com a diretriz número 12 das Diretrizes
Éticas Internacionais para Pesquisas Biomédicas Envolvendo Seres Humanos
(CIOMS, 1993).
Esta investigação faz parte de um estudo aprovado pela Comissão Científica
do Curso de Pós-Graduação em Medicina e Ciências da Saúde e pelo Comitê de
Ética em Pesquisa do Hospital São Lucas da PUCRS, após análise do seu projeto
de pesquisa.
Este estudo não implicou em modificações no tratamento da doença. Não
houve riscos nem transtornos aos pacientes, pois toda a pesquisa foi realizada
em material biológico que havia sido retirado para fins terapêuticos. Além disso,
foi mantido o sigilo sobre a identidade dos pacientes. Por estes motivos, a
assinatura de um termo de consentimento informado foi considerada não aplicável
a este projeto.
38
3.2 DELINEAMENTO DO ESTUDO
O presente estudo situa-se em um primeiro nível de investigação, que
apresenta fatos mas não está delineado para comprovar hipóteses. Poderá
fornecer base para outros estudos. Trata-se, portanto, de um estudo descritivo.
3.3 AMOSTRAS INVESTIGADAS
Os espécimes investigados neste estudo foram obtidos do Laboratório de
Anatomia Patológica do Hospital São Lucas da PUCRS. Essas amostras
constituem-se de peças cirúrgicas ressecadas de pacientes que foram
submetidos à esofagectomia total entre 1996 e 1999, neste mesmo Hospital, por
apresentarem carcinoma epidermóide de esôfago. Após a ressecção, as amostras
foram fixadas em formalina e embebidas em parafina, para posterior análise
histopatológica. O diagnóstico histopatológico, dado pelo patologista chefe do
laboratório supracitado, Dr. Carlos Reichel, foi de carcinoma epidermóide de
esôfago estágio III para todas as amostras, ou seja todos os espécimes
apresentavam a classificação T3 ou T4, e todos tinham comprometimento
linfonodal (N1). Dos 38 espécimes estudados, 23 apresentavam invasão da
adventícia, classificados como T3 na classificação do American Joint Committee
on Cancer, e 15 desses foram considerados T4, que significa invasão de
estruturas adjacentes ao esôfago, pela mesma classificação referida. Nenhuma
das amostras era de pacientes submetidos à quimioterapia e/ou radioterapia
prévia.
39
3.4 TÉCNICA DE IMUNOHISTOQUÍMICA
As peças incluídas em parafina, obtidas do Laboratório de Patologia Clínica,
foram processadas e analisadas pela técnica de imunohistoquímica no
Laboratório de Pneumologia do Instituto de Pesquisas Biomédicas da Pontifícia
Universidade Católica do Rio Grande do Sul.
Secções de 4µm de espessura foram obtidas com o auxílio de um
micrótomo (Leica, SM 2000R, Alemanha). Os cortes foram colocados em lâminas
pré-tratadas com 10% de poli-L-lisina (Sigma, USA) e levados a estufa a 60oC por
24 horas.
Os cortes foram desparafinizados por incubação em xileno por 10 minutos
por três vezes, seguido da re-hidratação dos cortes em seqüência de etanol em
concentrações decrescentes, começando com etanol absoluto, 90%, 80% e 70%
por 3 minutos em cada diluição. A seguir, os cortes foram lavados três vezes em
água destilada.
Diferentes técnicas de exposição do antígeno foram empregadas para a
realização da técnica de imunohistoquímica (Tabela 3).
A recuperação dos sítios antigênicos por digestão com tripsina foi realizada
após o aquecimento a 37oC de uma solução de tripsina 0,1% contendo 0,1% de
cloreto de cálcio em pH 7,8. As lâminas foram incubadas nesta solução por 30
minutos a 37oC, seguido de uma lavagem com água destilada.
A exposição do antígeno à alta temperatura foi realizada pela incubação das
lâminas em berço de vidro, com tampão PBS pH 7,2, citrato 0,01M pH 6,0 ou com
1mM de EDTA, dispostos em ângulo de 45o, em potência média por 5 minutos e
40
50 segundos, seguida de 8 minutos em potência baixa (Microondas Panasonic,
1.500 W).
Após a recuperação dos sítios antigênicos, procedeu-se o bloqueio da
peroxidase endógena com 3% de H2O2. Após 10 minutos de incubação, as
lâminas foram lavadas três vezes com água destilada e uma vez com PBS pH
7,2. Os cortes foram incubados por uma hora com os anticorpos primários
diluídos em solução diluente (Dako, USA) na concentração descrita na Tabela 3,
seguido de duas lavagens em PBS. Após a incubação com o anticorpo primário,
os cortes foram incubados com o sistema biotina-estreptavidina (Dako LSAB2
System, peroxidade, USA) que consiste na incubação com anticorpo antimouse/anti-rabbit biotinilado por 10 minutos, seguido de uma lavagem em PBS e
posterior incubação com estreptavidina conjugado à peroxidase. Após 10 minutos
de incubação as lâminas foram lavadas em PBS e incubadas em uma solução
com diaminobenzidina líquida (Dako Liquid DAB Substrate Chromogen system,
USA). Após lavagem em água destilada, as lâminas foram contra-coradas com
hematoxilina de Harris por 15 segundos. Após lavagem em três banhos de água,
as lâminas foram mergulhadas em uma solução de amônia 37 mM. Após a
contra-coloração, a lâminas foram lavadas em três banhos de água morna,
seguido de desidratação em concentrações crescentes de etanol (80%, 90% e
puro, respectivamente) por 3 minutos em cada diluição. Após dois tratamentos por
5 minutos em xileno, os cortes foram cobertos com lamínulas montadas em
Entellan (Merck, Alemanha).
41
Tabela 3. Proteínas investigadas e técnica de imunohistoquímica específica para
exposição do antígeno.
Proteína
Função
Anticorpo*
Diluição do
Exposição
Anticorpo
do antígeno
Localização
da Proteína
EGFR
Fator Crescimento
NCL-EGFR
1:20
Mic./C
M
Ki67
Ciclo celular
NCL-Ki67-MM1
1:100
Mic./PBS
N
PCNA
Ciclo cellular
NCL-PCNA
1:100
Conv.
N
Ciclina B1
Ciclo celular
NCL-Cyclin B1
1:50
Mic./C
Cit
Ciclina D1
Ciclo celular
NCL-Cyclin D1
1:20
Mic./EDTA
N/Cit
Bcl-x
Ciclo celular
NCL-bcl-x
1:80
Conv.
Cit
Bcl-2
Oncoproteína
NCL-bcl-2
1:80
Mic./PBS
M/Cit
c-myc
Oncoproteína
NCL-cMYC
1:150
Conv.
N/Cit
c-erbB-3
Oncoproteína
NCL-c-erbB-3
1:20
Mic./PBS
Cit
CA19-9
Marcador tumoral
NCL-CA19-9
1:200
Mic./C
M
MDM2
Oncoproteína
NCL-MDM2
1:100
Mic./C
N
p53
Oncossupressora
NCL-p53-BP
1:50
Mic./C.
N
RB1
Oncossupressora
NCL-RB1
1:50
Mic./C.
N
CEA
Marcador tumoral
NCL-CEA-2
1:100
Conv.
Cit
ESA
Marcador tumoral
NCL-ESA
1:250
Conv.
M
EMA
Marcador tumoral
NCL-EMA
1:200
Conv.
Cit/M
Citoqueratina 20
Citoqueratina
NCL-CK20
1:25
Mic./C
Cit
Citoqueratinas
Citoqueratina
NCL-LP34
1:100
T
Cit
5,6 e18
* Novocastra Laboratories Ltd (Newcastle upon Tyne, UK). Mic= microondas; C=citrato; Conv.=
convencional; PBS= tampão fosfato tamponado com salina; T=tripsina; EDTA= ácido
etilenodiaminotetratacético; M=membrana; N=nuclear; Cit= citoplasmática.
Os anticorpos usados neste estudo foram todos obtidos da Novocastra
Laboratories Ltd (Newcastle upon Tyne, UK).
42
As amostras foram analisadas por dois observadores independentes em
microscópio de luz direta (Axiolab, Zeiss, Alemanha). Um terceiro observador
analisava as lâminas em caso de desigualdade nos resultados. A contagem era
feita em quatro campos da lâmina. Contavam-se então todas as células
neoplásicas independentes de estarem marcadas ou não, e a seguir todas as
células coradas calculando-se o percentual. Os dados obtidos estão descritos na
tabela do Anexo Foi considerada expressão positiva quando mais de 10% das
células tumorais encontravam-se coradas para o marcador de interesse, pois este
é o parâmetro mais freqüentemente utilizado nos estudos disponíveis na
literatura.
3.5 CONSIDERAÇÕES SOBRE A FORMA DE APRESENTAÇÃO
Como não existe uma recomendação formal pelo Programa de PósGraduação em Medicina e Ciências da Saúde sobre a forma de apresentação,
este trabalho utilizou as recomendações de Spector e as referências bibliográficas
serão apresentadas no formato Vancouver (109).
IV. RESULTADOS
Foram analisadas 38 amostras de carcinoma epidermóide de esôfago (CEE)
obtidas de pacientes submetidos à esofagectomia no Hospital São Lucas da
PUCRS.
A técnica de imunohistoquímica foi empregada para detectar a presença de
proteínas que controlam o ciclo celular, proteínas envolvidas na proliferação
celular, proteínas reconhecidamente oncogênicas, proteínas controladoras de
apoptose, proteínas de origem epitelial e proteínas envolvidas em outros
processos celulares. Para algumas proteínas, o número de espécimes analisados
variou em decorrência de problemas inerentes à técnica de imunohistoquímica,
como perda do corte histológico durante as inúmeras etapas de lavagens
requeridas pelo método e/ou espécimes de tamanho insuficiente para obtenção
do número de cortes necessários, considerando que o número mínimo por
amostra era 18 cortes.
Conforme mencionado anteriormente (Seção 3.3), os espécimes de CEE
investigados foram considerados com marcação positiva quando pelo menos 10%
das células tumorais expressavam a proteína investigada, como determinado pelo
padrão de coloração amarronzada conferido pela reação do substrato com o
cromógeno diaminobenzidina (DAB). Assim, a freqüência de expressão das 18
proteínas, nos trinta e oito espécimes investigados, estão resumidas na Tabela 4
e Figura 3.
44
Trinta e cinco das 38 amostras investigadas (92,1%) expressavam as
proteínas c-erbB-3 e bcl-x, sendo estas as proteínas de maior freqüência dentre
todas as estudadas.
O antígeno de membrana epitelial (EMA) e o antígeno carcinoembriônico
(CEA) também estavam presentes na maioria dos espécimes de CEE com uma
freqüência de expressão de 81,5 e 78,9%, respectivamente.
Por outro lado, a proteína Ki67 não foi detectada nas amostras investigadas.
As proteínas citoqueratina 20 (CK20) e bcl-2 foram expressas em apenas 1
(3,1%) e 3 (8,14%) das amostras, respectivamente (Tabela 4 e Figura 3).
45
Tabela 4. Freqüência de expressão das proteínas investigadas e número de
carcinomas de esôfago analisados.
Expressão
Freqüência
−
Proteína
n
+
%
bcl-x
38
35
3
92,1
c-erbB-3
38
35
3
92,1
EMA
38
31
7
81,5
CEA
38
30
8
78,9
ESA
38
27
11
71,0
PCNA
38
26
12
68,4
c-myc
38
25
13
65,7
EGFR
38
24
14
63,1
CK 5,6,18
34
19
15
55,8
CA 19-9
37
20
17
54,0
Rb1
34
16
18
47,0
MDM-2
34
14
20
41,1
p53
38
11
27
28,9
Ciclina D1
33
6
27
18,1
Ciclina B1
37
5
32
13,5
bcl-2
37
3
34
8,1
CK20
32
1
31
3,1
Ki67
37
0
37
0
46
Freqüência de expressão (%)
0
20
40
60
80
bcl-x
92,1
c-erbB-3
92,1
81,5
EMA
78,9
CEA
71
ESA
68,4
PCNA
Proteínas investigadas
100
65,7
c-myc
63,1
EGRF
55,8
CK 5,6,18
54
CA19-9
47
Rb
41,1
MDM2
28,9
p53
18,1
CD1
13,5
CB1
8,1
bcl-2
3,1
CK20
Ki-67
0
Figura 3. Freqüência de expressão das proteínas investigadas nos carcinomas
epidermóides de esôfago.
4.1. FREQÜÊNCIA DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS QUE CONTROLAM O
CICLO CELULAR
As proteínas p53, Rb1, MDM2 e as ciclinas B1 e D1 estão diretamente
envolvidas no controle do ciclo celular, sendo que a p53, Rb1 e MDM2
desempenham suas funções em conjunto. Na Tabela 5 e Figura 4 estão descritos
os resultados relativos à freqüência de expressão das proteínas investigadas. As
Figuras 5, 6 e 7 mostram fotomicrografias de amostras de CEE com marcação
47
nuclear e citoplasmática, correspondendo as proteínas p53, ciclina B1 e ciclina
D1, respectivamente.
As proteínas Rb1 e MDM2 estavam presentes em mais de 40% das
amostras analisadas (16 e 14 espécimes, respectivamente).
Por outro lado, as ciclinas B1 e D1 estavam presentes em menos de 20%
das amostras (13,5 e 18,1%, respectivamente), ao passo que para a p53 foi
observada uma freqüência de expressão intermediária de 28,9%.
Tabela 5. Freqüência de expressão das proteínas controladoras do ciclo celular
nos espécimes carcinomas epidermóides de esôfago.
Expressão
Freqüência
Proteína
n
+
−
%
Ciclina B1
37
5
32
13,5
Ciclina D1
33
6
27
18,1
P53
38
11
27
28,9
Rb1
34
16
18
47,0
MDM2
34
14
20
41,1
Freqüência de expressão
48
50%
45%
40%
35%
30%
25%
20%
15%
10%
5%
0%
47,0%
41,1%
28,9%
18,1%
13,5%
P53
RB1
MDM2
CB1
CD1
Proteínas envolvidas no ciclo celular
Figura 4. Freqüência de expressão das proteínas controladoras do ciclo celular
nos carcinomas epidermóides de esôfago.
Figura 5. Fotomicrografia de uma amostra de CEE mostrando a marcação nuclear
do anticorpo para o antígeno p53. Aumento 400x.
49
Figura 6. Fotomicrografia de uma amostra de CEE mostrando a marcação
citoplasmática do anticorpo para o antígeno ciclina B1. Aumento 400x.
Figura 7. Fotomicrografia de uma amostra de CEE mostrando a marcação
citoplasmática do anticorpo para o antígeno ciclina D1. Aumento 400x.
50
4.2. FREQÜÊNCIA DE EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS QUE ATUAM NA
PROLIFERAÇÃO CELULAR
As proteínas envolvidas na proliferação celular, investigadas no presente
estudo, foram o antígeno de proliferação celular (PCNA), o receptor de fator de
crescimento epidérmico (EGFR) e o antígeno Ki67. A freqüência de expressão do
PCNA e EGFR foi semelhante nas 38 amostras analisadas, sendo detectadas 26
e 24 espécimes com uma freqüência de 68,4% e 63,1%, respectivamente. A
proteína Ki67 não foi detectada nas 37 amostras analisadas de carcinoma
epidermóide de esôfago.
Na Tabela 6 e Figura 8, estão descritos os resultados referentes à freqüência
de expressão das proteínas que atuam na proliferação celular obtidos nos
carcinomas epidermóides de esôfago. A Figura 9 mostra uma fotomicrografia de
uma amostra de CEE com marcação da membrana citoplasmática, pelo anticorpo
contra o antígeno EGFR.
Tabela 6. Freqüência de expressão das proteínas envolvidas na proliferação
celular nos carcinomas epidermóides de esôfago.
Expressão
Freqüência
Proteína
n
+
−
%
PCNA
38
26
12
68,4
EGFR
38
24
14
63,1
Ki67
37
0
37
0
51
Freqüência de expressão
70%
68,4%
63,1%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0,0%
0%
PCNA
EGFR
KI-67
Proteínas envolvidas na proliferação celular
Figura 8. Freqüência de expressão das proteínas envolvidas na proliferação
celular nos carcinomas epidermóides de esôfago.
Figura 9. Fotomicrografia de uma amostra de CEE mostrando a marcação da
membrana pelo anticorpo para o antígeno EGFR. Aumento 400x.
52
4.3. FREQÜÊNCIA DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS ENVOLVIDAS NA
APOPTOSE
As proteínas bcl-2 e bcl-x, que estão envolvidas na apoptose, foram
investigadas em 37 casos para a bcl-2, ao passo que a proteína bcl-x investigouse nas 38 amostras selecionadas.
A proteína bcl-2 foi detectada somente em três espécimes das 37 amostras
analisadas, enquanto a
bcl-x estava presente em 35 espécimes das 38
investigadas, correspondendo a uma freqüência de 8,1 e 92,1%, respectivamente
(Tabela 7 e Figura 10). A Figura 11 mostra uma fotomicrografia de um espécime
de CEE com a marcação citoplasmática do anticorpo para o antígeno bcl-x .
Tabela 7. Freqüência de expressão das proteínas bcl-2 e bcl-x, envolvidas na
apoptose, investigadas nos carcinomas epidermóides de esôfago.
Expressão
Freqüência
Proteína
n
+
−
%
bcl-2
37
3
34
8,1
bcl-x
38
35
3
92,1
Freqüência de expressão
53
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
92,1%
8,1%
bcl-2
bcl-x
Proteínas envolvidas na apoptose
Figura 10. Freqüência de expressão das proteínas envolvidas na apoptose, nas
amostras de carcinoma epidermóide de esôfago.
Figura 11. Fotomicrografia de uma amostra de CEE mostrando a marcação
citoplasmática do anticorpo para o antígeno bcl-x. Aumento 400x.
54
4.4. FREQÜÊNCIA DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS ONCOGÊNICAS
A freqüência de expressão das proteínas oncogênicas c-myc e c-erbB-3
foram investigadas nos espécimes de carcinoma epidermóide de esôfago. A
oncoproteína c-erbB-3 foi detectada em 92,1%, o que correspondeu a 35 dos 38
espécimes analisados.
A oncoproteína c-myc foi detectada em 25 espécimes de CEE das 38
amostras investigadas, o que representa uma freqüência de 65,7%, como descrito
na Tabela 8 e na Figura 12. A Figura 13 apresenta uma fotomicrografia com a
marcação citoplasmática do anticorpo para o antígeno c-erbB-3 em um espécime
de CEE.
Tabela 8. Freqüência de expressão das proteínas oncogênicas c-myc e c-erbB-3
nos espécimes de carcinoma epidermóide de esôfago.
Expressão
Freqüência
Proteína
N
+
−
%
c-myc
38
25
13
65,7
c-erbB-3
38
35
3
92,1
Freqüência de expressão
55
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
92,1%
65,7%
c-erbB-3
c-myc
Proteínas oncogênicas
Figura 12. Freqüência de expressão das proteínas oncogênicas c-myc e c-erbB-3
nos espécimes de carcinoma epidermóide de esôfago.
Figura 13. Fotomicrografia de uma amostra de CEE mostrando a marcação
citoplasmática do anticorpo para o antígeno c-erbB-3. Aumento 400x.
56
4.5. FREQÜÊNCIA DE EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS EPITELIAIS
As proteínas epiteliais investigadas neste estudo incluem o antígeno
específico epitelial (ESA), o antígeno de membrana epitelial (EMA), a
citoqueratina 20 (CK20) e as citoqueratinas 5, 6 e 18. Os resultados obtidos estão
descritos na Tabela 9 e Figura 14. Na Figura 15 mostra a marcação de membrana
do anticorpo para o antígeno ESA em um espécime de CEE.
As proteínas ESA e EMA tiveram uma freqüência de expressão de 71 e
81,5%, respectivamente, correspondendo a 27 e 31 espécimes das 38 amostras
de CEE examinadas. As citoqueratinas 5, 6 e 18 apresentaram uma freqüência de
expressão intermediária de 55,8%, o que corresponde a 19 das 34 amostras de
CEE analisadas. Em apenas uma amostra, entre 32 investigadas, foi detectada a
presença da citoqueratina 20 (CK20).
57
Tabela 9. Freqüência de expressão das proteínas epiteliais nos espécimes de
carcinomas epidermóides de esôfago.
Expressão
Freqüência
N
+
−
%
CK20
32
1
31
3,1
ESA
38
27
11
71,0
EMA
38
31
7
81,5
CK 5, 6, 18
34
19
15
55,8
Freqüência de expressão
Proteína
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
81,5%
71,0%
55,8%
3,1%
ESA
EMA
CK-20
CK5,6,18
Proteínas de origem epitelial
Figura 14. Freqüência de expressão das proteínas epiteliais nos espécimes de
carcinomas epidermóides de esôfago.
58
Figura 15. Fotomicrografia de uma amostra de CEE mostrando a marcação da
membrana pelo anticorpo para o ESA. Aumento 400x.
4.6.
FREQÜÊNCIA
DE
EXPRESSÃO
DE
OUTRAS
PROTEÍNAS
INVESTIGADAS
O antígeno carcinoembriônico (CEA) e o CA 19-9, também conhecido como
Sialyl-Lewis,
também foram
investigados
nos
espécimes
de
carcinoma
epidermóide de esôfago.
O CEA foi analisado em 38 amostras de CEE detectando-se uma freqüência
de expressão de 78,9%, o que corresponde à presença desta proteína em 30
amostras.
O CA19-9 foi investigado em 37 amostras de CEE, sendo sua presença
detectada em 54% das amostras.
59
Na Figura 17 é apresentada uma fotomicrografia de um espécime de CEE
mostrando
a
marcação
citoplasmática
do
anticorpo
contra
o
antígeno
carcinoembriônico.
Tabela 10. Freqüência de expressão do antígeno carcinoembriônico e CA19-9
nos espécimes de carcinoma epidermóide de esôfago.
Expressão
Freqüência
N
+
−
%
CEA
38
30
8
78,9
CA 19-9
37
20
17
54,0
Freqüência de expressão
Proteína
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
78,9%
54,0%
CEA
CA-19-9
Proteínas envolvidas em outros processos celulares
Figura 16. Freqüência de expressão do antígeno carcinoembriônico e CA19-9 nos
espécimes de carcinoma epidermóide de esôfago.
60
Figura 17. Fotomicrografia de uma amostra de CEE mostrando a marcação
citoplasmática do anticorpo para o CEA. Aumento 400x.
V. DISCUSSÃO
Existe uma grande variabilidade com relação às estratégias de análises dos
resultados obtidos pela técnica de imunohistoquímica, o que dificulta a
comparação com os dados disponíveis na literatura. Alguns autores consideram
que uma proteína está sendo expressa em um determinado tumor, somente
quando, pelo menos, 50% das células tumorais encontram-se marcadas com o
anticorpo específico. Outros autores adotam o critério de 20%, mas a grande
maioria dos pesquisadores ainda considera positividade quando, pelo menos,
10% das células tumorais expressam a proteína em estudo. Além disto, do ponto
de vista de reconhecimento do antígeno, os anticorpos utilizados são muito
variáveis. Por exemplo, se um anticorpo reconhece um epítopo considerado como
ponto preferencial de mutações (hot spot) em um gene que codifica determinada
proteína é muito provável que muitas amostras sejam consideradas negativas
para a presença dessa proteína. Assim, comparações entre os dados obtidos em
estudos que empregam anticorpos que reconhecem epítopos diferentes devem
ser considerados com muita cautela.
A progressão das células no ciclo celular e a expressão das proteínas
responsáveis pelo seu controle são eventos que precisam ser muitos bem
coordenados. A função das proteínas controladoras do ciclo celular é de manter
as células em seu estado funcional, ou mesmo levá-las à morte celular
programada (apoptose) quando as condições não forem apropriadas. Isto
significando que tais proteínas, quando íntegras e funcionantes, podem evitar que
as células tornem-se cancerosas.
62
Conforme já citado anteriormente, a perda do gene que codifica a proteína
p53, ou as mutações que interferem com a sua função protetora, são as mutações
mais freqüentes nos cânceres humanos. A p53 atua como ativadora da
transcrição, propriedade que é responsável, pelo menos em parte, pela atividade
supressora de tumor. Este conceito baseou-se na observação de que
oncoproteínas virais mutantes bloqueavam a função da indução de transcrição ao
atingir o gene p53, assim como também no fato de que as mutações do p53
encontradas nos tumores humanos tinham, igualmente, essa função inativadora
(110). Alguns investigadores têm mostrado que a p53 induz a transcrição
interagindo e inibindo vários complexos de ciclinas e quinases dependentes de
ciclinas. Além disso, há pelo menos um mecanismo quando a p53 interrompe a
progressão da célula danificada, no ciclo celular, para reparo, durante a fase G1,
que depende da habilidade de manter a Rb no seu estado desfosforilado (Figura
2). Níveis celulares de p53 aumentam dramaticamente em resposta a um dano no
DNA. Esse aumento dos níveis celulares de p53 leva a proteína p53 normal a
interromper o ciclo celular no final da fase G1 para que tais danos no DNA sejam
corrigidos (37).
Nos carcinomas epidermóides de esôfago analisados neste estudo a
freqüência de expressão da p53 foi de 28,9%. Ikeguchi e colaboradores
encontraram uma freqüência de expressão desta proteína de 50% para o mesmo
tipo histológico de carcinoma. No entanto, os autores consideraram positividade
quando mais de 20% das células tumorais apresentavam a proteína investigada
(38). Em um outro estudo foi encontrado uma freqüência de expressão da p53 de
61%, onde os autores consideraram positividade quando mais de 25% das células
tumorais haviam sido marcadas pelo anticorpo específico (80). Ainda outros
63
estudos apresentaram 53 e 41% de freqüência para a p53, mas consideravam
positividade quando a proteína p53 encontrava-se expressa em mais de 50% das
células tumorais (40, 41). Os resultados obtidos no presente estudo apresentaram
uma freqüência da proteína p53 inferior aquelas descritas por outros autores,
embora seja difícil comparar, pois os dados da literatura mostram não haver um
consenso entre os pesquisadores para a determinação de tumores positivos para
essa proteína.
Assim como a MDM2 atua inibindo a p53, o produto do gene Rb1 tem um
papel fundamental na regulação das células para a entrada na fase S do ciclo
celular. Além disso, no início da fase G1 a proteína Rb encontra-se desfosforilada,
e portanto, inativada. No final da fase G1, a proteína Rb torna-se fosforilada,
permanecendo hiperfosforilada até a fase de anáfase durante a mitose, quando é
então, rapidamente, desfosforilada e novamente inativada. No início de G1,
quando a Rb encontra-se desfosforilada, ocorre a fase ativa supressora de
crescimento desta proteína (25). Não se sabe exatamente como a Rb controla a
progressão do ciclo celular. Evidências sugerem que
este
controle
é
acompanhado pelas ligações da proteína Rb com alguns fatores de transcrição.
Muitas destas evidências vieram de estudos da interação da Rb com o E2F, um
fator de transcrição inicialmente identificado pela sua habilidade em ativar o gene
promotor do adenovírus E2 (111). O E2F liga-se preferencialmente com a forma
desfosforilada da Rb na fase G1 do ciclo celular, ligação esta que bloqueia a
capacidade do E2F em ativar alguns genes promotores, necessários para a
síntese de DNA. Em adição, o complexo Rb-E2F inibe a ativação da expressão de
outros genes promotores, como o c-myc. Algumas oncoproteínas virais atuam
desfazendo esta ligação Rb-E2F, contribuindo para a progressão do ciclo.
64
Avanços nos estudos moleculares que levem à compreensão da função dos
genes Rb e p53 certamente trarão contribuições importantes no entendimento das
neoplasias como um todo, pois estas são as proteínas que se encontram
alteradas com maior freqüência nos cânceres humanos.
Outra questão a ser considerada é em relação à freqüência de expressão da
proteína do retinoblastoma. A freqüência de expressão da Rb na maioria dos
CEE, descritos na literatura, variou entre 0 e 100% (47). Ikeguchi e colaboradores
encontraram uma freqüência de expressão de 52%, considerando positividade
quando mais de 50% das células tumorais estavam marcadas (48). Em um outro
estudo retrospectivo, no qual foram analisadas 172 amostras de tumores de
pacientes submetidos à esofagectomia por CEE, os autores observaram uma
freqüência de expressão para a proteína Rb de 91,8% (112). Os resultados
encontrados no presente estudo mostraram uma freqüência de expressão de 47%
para a proteína do retinoblastoma. A grande variabilidade nas expressões
encontradas por diferentes autores pode ser justificada pelas diferenças de
metodologia de quantificação ou mesmo entre os epítopos reconhecidos pelos
anticorpos empregados.
As ciclinas são proteínas que controlam a progressão das células de uma
fase para outra no ciclo celular, formando complexos com as quinases
dependentes de ciclinas (CDKs). As ciclinas e as CDKs não funcionam só como
reguladoras do ciclo celular, mas também atuam na transcrição e no reparo do
DNA e na apoptose. Inúmeros trabalhos correlacionando a ciclina D1 com o CEE
tem sido descritos na literatura, a maioria deles associando esta proteína com
baixa sobrevida (Tabela 2). Entretanto, o papel específico desta proteína nos
cânceres não parece claro.
65
Os resultados obtidos neste estudo chamam atenção para uma freqüência
de expressão da ciclina D1 (18%) inferior quando comparado com os dados
disponíveis na literatura cuja média está em torno de 45%, considerando, à
semelhança da maioria dos autores, positividade quando mais de 10% das
células tumorais
estavam marcadas pelo anticorpo. Esta diferença não era
esperada, pois o presente estudo é composto de amostras de câncer avançado
de esôfago, e muitos trabalhos correlacionam a freqüência de expressão da
ciclina D1 com a invasão tumoral e o comprometimento linfonodal (59,60).
No CEE, a prevalência da ciclina B1 é significativamente alta nos tumores
que apresentam invasão da muscular, o que sugere, conforme alguns autores, a
sua relação com um pior prognóstico neste tipo de carcinoma (53,54). Murakami e
colaboradores, analisando 87 amostras de CEE, encontraram uma freqüência de
expressão da ciclina B1 de 72,4%, considerando positividade quando pelo menos
10% das células tumorais estavam marcadas (53). Takeno e colaboradores,
considerando
positividade
quando
mais
de
20%
das
células
tumorais
apresentavam-se marcadas, ao contrário de Murakami, encontrou uma freqüência
de expressão de 49% para a ciclina B1, em uma amostra de 71 CEE (55). No
entanto, no presente estudo, apenas 13,5% dos tumores analisados expressavam
esta proteína, uma freqüência de expressão inferior comparada com as já
descritas na literatura. Este resultado surpreende, à semelhança da ciclina D1,
pois se trata de um estudo com amostras de tumor avançado.
A proteína Murine Double Minute2 (MDM2) é um marcador nuclear, e o
produto do gene MDM2, conforme citado anteriormente, é um potente inibidor da
proteína p53 normal, o que explicaria sua relação com o processo da
tumorigênese (46). Uma pesquisa recente detectou uma freqüência de 36% para
66
a proteína MDM2 em 64 amostras de CEE. Mathew e Arora encontraram uma
freqüência de expressão de 42% desta proteína em 100 amostras de CEE (49).
Considerando tais dados, a freqüência determinada para a MDM2 neste estudo
(41,1%) foi similar aos dados da literatura.
As proteínas p53, Rb, ciclina D1 e ciclina B1, que atuam no controle do ciclo
celular analisadas neste estudo, tiveram uma freqüência de expressão inferior
àquelas encontradas na literatura, sugerindo que o ciclo celular nestas amostras
de CEE não estava adequadamente controlado.
As células cancerosas podem se multiplicar na ausência de fatores
promotores do crescimento necessários para a proliferação de células normais e
são resistentes aos sinais que determinam, normalmente, a morte celular
programada. Uma das características mais significativas do câncer é quando
ocorre uma mutação em algum gene envolvido na proliferação celular, fazendo
com que o seu produto seja hiperativo ou expresso em excesso, resultando em
proliferação celular descontrolada. No presente estudo foram investigadas três
proteínas relacionadas com a proliferação celular: o antígeno nuclear de
proliferação celular (PCNA), o receptor do fator de crescimento epidérmico
(EGFR) e o antígeno Ki67.
O PCNA auxilia nos mecanismos de reparo do DNA, durante a fase de
síntese do ciclo celular, além de ser muito útil no estudo de células em fase
proliferativa. Okuno e Nishimura encontraram uma freqüência de expressão de
52% para o PCNA em 65 biópsias de esôfago de pacientes portadores de CEE
que haviam sido submetidos somente à radioterapia (65). Ao analisar a freqüência
de expressão desta proteína nas amostras de CEE aqui investigadas, o resultado
foi de 68,4%. Conforme relatos da literatura, há uma variação muito grande entre
67
os autores com relação à freqüência de expressão do PCNA, a qual pode variar
entre 4,4 e 96,2%. Além disto, há controvérsias entre os pesquisadores com
relação ao papel prognóstico do PCNA no CEE (66, 67).
Uma célula normal requer fatores de crescimento extracelulares para ativar
seus receptores de fator de crescimento. A célula cancerosa, freqüentemente,
produz e secreta fatores de crescimento que estimulam seu próprio crescimento.
Um outro mecanismo aberrante que ocorre no câncer é quando receptores de
fator de crescimento estão mutados ou superexpressos. Neste caso, ocorre o
envio de sinais para a célula, mesmo sem a ligação entre os fatores de
crescimento extracelulares e seus ligantes, ou seja, os receptores da célula
cancerosa começam a agir independentemente.
Estudos comprovaram que o EGFR tem um potencial carcinogênico (36). No
câncer esofagiano há estudos que se contrapõe, pois alguns autores confirmaram
um valor prognóstico do EGFR no CEE (75), enquanto outros concluíram que o
EGFR tem um valor limitado no CEE (66). No presente estudo detectou-se uma
freqüência de expressão de 63,1% do EGFR nas amostras de CEE, a qual é
semelhante aos descritos na literatura, pois Deguchi e colaboradores, analisando
63 amostras de CEE, encontraram 69,6% dos tumores com presença do EGFR
(113). Igualmente, Friess e colaboradores, no estudo de 39 amostras de CEE,
detectaram a freqüência de expressão do EGFR em 59% das amostras (114). Em
uma série com 217 amostras de CEE avançado, Itakura e colaboradores,
observaram uma freqüência de expressão de 71% para o EGFR (31).
A superexpressão do Ki67, que é um antígeno usado para estimar
proliferação celular, pode ser útil na identificação precoce de neoplasias de
esôfago. Jin e colaboradores, analisando 366 espécimes de biópsias de esôfago
68
de pacientes habitantes de uma área de alta incidência de câncer de esôfago na
China, observaram uma freqüência de expressão de 58,8% para a proteína Ki67
nos carcinomas in situ e 41,1% quando havia displasia severa (115). Resultado
semelhante também foi encontrado por Xu e Jin, quando estudaram 31 amostras
de displasia severa em mucosa esofágica, obtendo uma freqüência de expressão
de 58,1% da proteína Ki67 (70). No presente estudo, a proteína Ki67 não foi
detectada, embora tenham sido empregados controles para o anticorpo utilizado.
Em tecidos normais, a proliferação e a morte celular encontram-se em
equilíbrio. A fisiologia da morte celular programada, também chamada de
apoptose, tem sido intensamente investigada nos últimos anos. Hoje uma célula
apoptótica pode ser reconhecida morfologicamente. A principal característica do
aspecto morfológico da apoptose é o encolhimento celular. A cromatina aparece
picnótica e compactada em uma massa densa homogênea contra a membrana
nuclear. O núcleo também pode se desintegrar em vários fragmentos (79). Este
fenômeno contrapõe-se à necrose celular, na qual ocorre a desintegração do
citoplasma seguido de autólise nuclear. A apoptose geralmente ocorre em células
individuais, ao contrário da necrose celular que atinge grupos de células e partes
de órgãos. Uma vez iniciada, a apoptose processa-se rapidamente. A célula
submetida a esse processo desaparece em quatro horas. Parece claro que a
apoptose tem um papel importante no desenvolvimento de órgãos e tecidos
durante a embriogênese, assim como em algumas doenças. No câncer, a
apoptose desempenha um papel crucial, bem como na resolução de processos
inflamatórios e em doenças degenerativas. Durante muito tempo pensou-se que o
principal, e até mesmo único, mecanismo que levava ao câncer era o aumento da
proliferação celular. Hoje se sabe que a diminuição da morte celular também pode
69
contribuir para o desenvolvimento das neoplasias. Entretanto, os detalhes do
mecanismo de funcionamento da morte celular programada ainda não foram
totalmente esclarecidos.
Muitos genes envolvidos na apoptose já foram identificados, entre eles,
alguns têm um importante papel de reguladores, como os genes da família do bcl.
Dois membros dessa família, o bcl-2 e o bcl-x foram analisados neste estudo. A
superexpressão da bcl-2 já foi descrita como inibidora de apoptose e, assim,
contribuiria para o desenvolvimento do câncer (76). Na verdade, o papel da bcl-2
no comportamento do câncer humano é muito mais complexo do que pode ser
explicado somente pela regulação direta da apoptose.
O papel do bcl-x, além de ser independente, parece ser antagônico ao do
bcl-2, ou seja, atua induzindo a apoptose. No CEE esta proteína tem sido
implicada como um fator prognóstico independente (85).
Os dados disponíveis na literatura com relação à freqüência de expressão
da bcl-x pela técnica de imunohistoquímica, mostram que há resultados
conflitantes. Natsugoe e colaboradores, em um estudo retrospectivo no qual
analisaram 111 pacientes que haviam sido submetidos à esofagectomia,
encontraram uma freqüência de expressão para a bcl-x de 46,8% (84). Sarbia e
colegas estudaram 38 amostras de CEE, obtendo uma freqüência de expressão
de 97,4% (87). No presente estudo foi detectada uma freqüência de expressão de
92,1%, resultado compatível com o encontrado por Sarbia. A elevada freqüência
de expressão da proteína bcl-x encontrada neste estudo, pode estar relacionada
com a tentativa desta proteína de induzir células mutadas a entrar em apoptose,
evitando com isso que células indesejáveis se proliferem.
70
Outra proteína estudada, também envolvida na apoptose, foi a bcl-2. A
freqüência de expressão desta proteína, em espécimes de CEE descrita na
literatura apresenta grande variabilidade. Hsia e colaboradores encontraram uma
freqüência de expressão de 18% para a bcl-2 em CEE (116). Ohbu e
colaboradores, analisando 105 amostras de CEE, detectaram uma freqüência de
expressão de 58% para a proteína bcl-2 (117). Patel e colaboradores, por sua
vez, encontraram uma freqüência de expressão de 67% em 46 amostras (118),
enquanto Sarbia e colaboradores detectaram a proteína em 26,6% dos espécimes
em uma amostra de 150 CEE (119). No presente estudo, foi detectada uma
freqüência de expressão de 8,1%, o que é inferior àquelas obtidas por outros
investigadores. Esta baixa freqüência era esperada, pois a freqüência de
expressão da bcl-2, decresce com o avanço tumoral e esta amostra é constituída,
em sua totalidade, por tumores avançados.
A superexpressão do c-erbB-3, em linhagens celulares humanas, está
associada com transformações neoplásicas (89), embora ainda não existam
estudos descritos na literatura avaliando a expressão desta proteína no CEE.
Neste estudo foi encontrada uma freqüência de expressão de 92,1% da proteína
c-erbB-3. Assim, pode-se inferir que esta proteína possa ter algum valor
prognóstico no carcinoma epidermóide de esôfago. No entanto, mais estudos
serão necessários para comprovar esta hipótese.
A superexpressão da proteína c-myc está associada a muitos tipos de
cânceres, um achado não-esperado, já que tal fator de transcrição estimula a
expressão de muitos genes necessários à progressão do ciclo celular. Este
protooncogene codifica proteínas reguladoras e, quando expresso em excesso,
devido a uma mutação, pode causar proliferação celular não-controlada (46). Nas
71
neoplasias humanas sabe-se que a ativação do oncogene c-myc dá-se por
amplificação gênica ou por translocação cromossômica. No presente estudo, 67%
das amostras de CEE expressavam esta proteína, dados similares aos
encontrados por Kuwano e colaboradores quando estudaram 27 espécimes de
CEE e encontraram 66,7% de suas amostras com a presença de c-myc (120).
Entre as proteínas de origem epiteliais estudadas no CEE, estão as
citoqueratinas. No câncer esofágico, a CK20 parece ter um papel importante na
definição da origem dos tumores da transição esofagogástrica, se a origem dos
mesmos está no epitélio de Barrett ou se são primários do estômago (95). A
importância já comprovada da CK20 no adenocarcinoma de esôfago foi uma
prerrogativa para estudá-la no CEE. A freqüência de expressão desta proteína
neste estudo, entretanto, foi baixa (3,1%), quando comparada com outras
proteínas do mesmo grupo, como era esperado para amostras de esôfago de
origem não-glandular.
A freqüência de expressão das citoqueratinas 5, 6 e 18 foi investigada e, ao
contrário da CK20, cuja freqüência de expressão ainda não havia sido
determinada para CEE, as CKs 5, 6 e 18 foram pesquisadas em um estudo
realizado na China por Cintorino e colaboradores, no qual os autores sugerem
que a CK18 pode ser um marcador de péssimo prognóstico para o CEE (98). Os
resultados encontrados no estudo sob avaliação apontaram uma freqüência de
expressão de 55,8% para as CKs 5, 6 e 18. Este resultado somado com poucos
relatos na literatura não permite classificar estas citoqueratinas como marcadores
importantes de CEE.
O antígeno específico epitelial (ESA) e o antígeno de membrana epitelial
(EMA), pertencem ao mesmo grupo das citoqueratinas (proteínas de origem
72
epitelial) e, embora sejam marcadores celulares de inúmeros tecidos epiteliais
humanos, ainda não tinham sido estudados por outros autores para o CEE. Neste
estudo, ambos apresentaram uma freqüência de expressão de 71 e 81,5%,
respectivamente. Estes achados permitem inferir que tais proteínas possam ser
potenciais marcadores a serem usados em estudos futuros no CEE, embora
outras investigações sejam ainda necessárias para comprovar esta hipótese.
O antígeno carcinoembrionário conhecido por ser um marcador sérico para
tumores do trato gastrointestinal, estava presente em 78,9% das amostras
investigadas. Os resultados conflitantes encontrados por alguns autores, com
relação a esta proteína, salientam a necessidade de mais investigações para que
seja possível definir a função do CEA, se existente, em CEE.
O CA 19-9, marcador útil no diagnóstico e no seguimento de pacientes com
câncer pancreático (106), foi detectado em 54% das amostras. Considerando-se a
ausência de dados na literatura que relacione os níveis de expressão do CA 19-9
com os CEE, acredita-se que outras pesquisas devam ser realizadas para a
identificação do papel desta proteína na tumorigênese do CEE.
O câncer do esôfago é uma das neoplasias que causa maior mortalidade e,
como mencionado anteriormente, os avanços terapêuticos foram insignificantes e
os métodos de diagnóstico precoce ainda deixam a desejar. A alta incidência e a
prevalência aumentada desta neoplasia mostram que esforços não devem ser
poupados pelas ciências médicas no combate amplo a esta enfermidade. A
intensificação das pesquisas no campo da oncologia molecular traz novas
perspectivas na abordagem das neoplasias. O inimigo câncer começa a ser visto
de frente, e o que nos mostra a Biologia Molecular é que ele é único, e não vários,
como até então se acreditava. Hoje biologistas moleculares afirmam que o câncer
73
origina-se de uma única célula alterada, e o completo conhecimento do
funcionamento desta célula e as interações entre seus genes são a chave para o
esclarecimento definitivo do processo da carcinogênese e de como esta doença
pode ser efetivamente combatida.
Uma consideração que deve ser feita em relação aos resultados obtidos
neste estudo é que os mesmos certamente servirão de base para futuros
trabalhos que envolvam o prognóstico de pacientes com câncer de esôfago.
Algumas proteínas que tiveram uma maior freqüência de expressão poderão ser
consideradas como potencialmente úteis em estudos que envolvam o carcinoma
epidermóide de esôfago, tal como foi o caso das proteínas bcl-x e a c-erb-3.
A ampliação dos conhecimentos e desenvolvimento de novas técnicas na
área da Biologia Molecular provavelmente trará novas perspectivas para o
entendimento das neoplasias, não só em termos de diagnóstico e prognóstico,
mas também na identificação de pessoas com alto risco de desenvolverem a
doença, bem como alternativas terapêuticas mais eficazes.
VI. CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos, pode-se concluir que nas amostras de
carcinoma epidermóide de esôfago investigadas neste estudo:
- A freqüência das proteínas estudadas variou entre 0 e 92,1%;
- As proteínas c-erbB-3 (oncogênica) e a proteína bcl-x (indutora de apoptose)
foram detectadas em mais de 92,1%;
- As proteínas envolvidas no ciclo celular estavam presentes em menos de
50%;
- A proteína Ki67, envolvida na proliferação celular, não foi detectada.
- As proteínas c-erbB-3, EMA, ESA, CA19-9 e CK20, que até o presente
estudo ainda não haviam sido investigadas em câncer de esôfago,
apresentaram uma freqüência de 92,1%, 81,5%, 71%, 54% e 3,1%,
respectivamente.
75
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109. Spector N. Manual para a redação de teses, projetos de pesquisa e artigos
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bcl-2 in T3-4N1M0 oesophageal carcinoma: an immunohistochemical
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squamous cell carcinoma--serial histopathologic and immunohistochemical
studies. Nippon Geka Gakkai Zasshi 1992; 93(9): 937-9.
VIII. ANEXO
Presença ou ausência das proteínas investigadas na amostras de carcinoma epidermóide de
esôfago.
1
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5
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CEM
CEM
CEM
CEP
CEM
CEP
CEM
CEM
CEP
CEM
CEM
CEM
CEM
CEM
CEM
CEM
CEM
CEM
CEP
CEP
CEM
CEM
CEM
CEB
CEM
CEM
CEM
CEM
CEM
CEM
CEM
CEP
CEM
CEM
CEM
CEM
CEM
CEM
CEA
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EMA
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PCNA
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BCL-X
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C-MYC
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ESA
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P53
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ERB-3 BCL-2
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nr
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EGFR Ki-67
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nr
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CB1
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nr
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CA19 MDM2
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nr
nr
nr
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nr
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nr
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-
Rb
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nr
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nr
nr
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nr
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-
LP34 CD1 CK 20
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nr
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nr
nr
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nr
nr
nr
nr
nr
nr
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nr
nr
nr
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nr
nr
nr
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nr
+
+
nr
+
-
CEB= Carcinoma epidermóide bem diferenciado; CEM= carcinoma epidermóide moderadamente diferenciado; CEP=
carcinoma epidermóide pouco diferenciado; nr= não realizado.