LMA – Diagnóstico laboratorial
Nydia S. Bacal
LMA – OMS
Leucemia Promielocítica Aguda
LMA M3 clássica
LMA M3 variante
Classificação da OMS
Freqüência
Categoria
L.M.A. com anormalidades genéticas recorrentes
LMA com t(8;21)(q22;q22)/ AML1-ETO
LMA com inv(16)(p13q22) ou t(16;16)(p13;q22)/ CBF/MYH11
LMA com t(15;17)(q22;q12)/ PML-RAR
LMA com anormalidades do 11q23 / MLL
5-12%
10-12%
5-8%
5-6%
LMA com displasia de múltiplas linhagens
Pós-SMD ou doença mieloproliferativa
Sem antecedentes
Variável
Variável
LMA/SMD associada a tratamento
LMA/SMD associada com agentes alquilantes
LMA/SMD associada com inibidores da topoisomerase II
Variável
Variável
LMA não categorizada nos itens anteriores
LMA com mínima diferenciação
LMA sem maturação
LMA com maturação
Leucemia mielomonocitária aguda
Leucemia monoblástica e monocitária aguda
Leucemia eritróide aguda
Leucemia megacariocitária aguda
Leucemia basofílica aguda
Pan-mielose com mielofibrose aguda
Sarcoma mielóide
5%
10%
30-45%
15-25%
3-6%
5-6%
3-5%
Rara
Rara
Rara
LMA 99P - LMA12
inv(16)
normal
t(8;21)
D835
11q23
bcr-abl
flt3
dek-can
Robin Foá – Atibaia 03/2007
Vanderson Rocha – Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007
LMA não categorizada
• > 60% dos casos de LMA
• Base para classificação é a morfologia, grau de maturação
e citoquímica
• Não existem anormalidades citogenéticas recorrentes
• O critério diagnóstico é ≥20% de blastos na MO (em 500
células) ou SP (200 leucócitos)
• Se houver leucopenia acentuada pode se fazer esfregaços
do buffy coat
• Biópsia de MO é necessária para o diagnóstico de
leucemia aguda hipocelular em S.P. e M.O.
• Recomendações para classificação são aplicáveis apenas
em amostras obtidas antes da quimioterapia.
IMUNOFENOTIPAGEM
• Fundamental para o diagnóstico de:
• LMA-M0
• LMA-M7
• Pode ser importante no diagnóstico de:
LMA-M6b (Leucemia eritróide pura)
• LMA-M3 (hipogranular)
Diagnóstico Laboratorial
LMA e LPA – LMA M3
• Diagnóstico na rotina
PML-RARα qualitativo PCR e FISH – HIAE
PML-RARα quantitativo - Nichols– 72horas(s/ estabilidade)
FLT3 qualitativo – Nichols
NPM – Exon 12 – Nichols
C-Kit – qualitativo – Nichols – 72horas(s/ estabilidade)
CBFβ MHY11 (inv 16) – Quali/quantitativo– Nichols – 72horas(s/ estabilidade)
FISH – envio de células
AML1-ETO (t:8;21) – Quali e quantitativo – Nichols – 72horas(s/ estabilidade)
FISH – HIAE
MLL PTD 11q23 - FISH – HIAE
Não Disponíveis: t(11;17) PLZF-RARα/NuMA- RARα/ t(5;17)NPM-RARα/
t(17;17)STSTSb-RARα
CEBPα ; BAALC ; ERG ; NRAS ;
• Valor Prognóstico e Futuro
Forma Clássica - LPA - LMAM3
Faggot Cells
Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007
Forma Variante LPA - M3v
S. P.
Forma Variante LPA - M3v
MO
Citoquímica para MPO – deve ser fortemente positiva
Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007
Forma Hiperbasofílica
Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007
Diferenciação Granulocítica – MO normal
Painéis de anticorpos monoclonais
II
Mieloblasto
CD34
CD117
HLA-DR
CD13+forte
CD33+forte
II
II
Promielócito
III
III
IV
IV
Mielócito
Metamielócito
Bastão
CD13+fraco
CD33+fraco
CD15
CD11b
CD13+
CD33+fraco
CD15
CD11b
CD16
VV
Neutrófilo
CD117
CD13+forte
CD33+forte
CD15
CD13+forte
CD33+fraco
CD15
CD11b+forte
CD16+forte
CD34/CD117/CD45/CD13.33
Dra. Maria Silvia – Florianópolis Santa Catarina
CD16/CD13/CD45/CD11b
Imunofenotipagem
1
0
10
10
CD13 PE ->
FJL.002
2
10
3
10
Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/20
LMA M3
CD45xSS
CD2xCD45
HLA-DRxCD45
CD34xCD45
MPO(c)xCD45
CD56xCD45
CD33xCD45
CD13xCD45
CD117xCD45
CD71xCD45
IMUNOFENOTIPAGEM
• Antígenos mielomonocíticos (CD13, CD15 e CD33) e
ausência de expressão de antígenos monocíticos
(CD14, incluindo My4, Leu M3 e Mo2) e ausência de
HLA-DR
• Estudos iniciais - ausência de CD34 e CD7,mas
Edward et al (1999) observaram que 41% dos casos
de LPA com CD34 (+).
• HLA-DR (+) em LPA e HLA-DR (-) em LMA com
morfologia não M3
Dr. Alberto Orfao – Universidade de Salamanca
LMA - TRIAGEM FENOTÍPICA DE
ALTERAÇÕES GENÉTICAS
t(8;21) MPO+, CD13, CD33, CD19+, CD56+
Comumente LMA-M2
t(15;17) MPO+, CD13+ heterogêneo, CD33++
homogêneo, CD15-, CD34-, HLA-DRLMA Promielocítica – FAB M3
Hurwitz, CA et al, Blood, 80: 3182, 1992
Orfao, A et al, Haematologica, 84:405, 1999
• 111 casos de LMA de novo
• 38 morfologia de M3 (34 morfologia típica e 4 M3v)
• PML-RARα - 39 dos 111 (35%)
• 34 morfologias M3 e 5 casos foram classificados
como M0 (2 casos), M1(1 caso) e M2 (2 casos)
ORFAO et al
•
Quatro grupos conforme
Morfologia / genética molecular
1) M3 / PML- RARα +
(n=34)
2) Não-M3 / PLM-RARα +
(n=5)
3) M3 com PML- RARα -
(n=4)
4) Não-M3 / PML- RARα – (n=68)
ORFAO et al
• CD33 homogêneo nas células blásticas em 82% dos casos
• CD13 em todas as células leucêmicas com padrão heterogêneo de
expressão (100%)
•
Expressão de CD34/CD15 (100%)
• Discriminação entre M3/PLM-RARα (+) e M3/PLM-RARα (-) :
‫ ٭‬padrão fenotípico CD34/CD15
‫ ٭‬expressão de CD13
‫ ٭‬presença de subtipo maior de células blásticas.
ORFAO et al
• A sensibilidade da imunofenotipagem para selecionar
casos PLM-RARα foi de 100% e especificidade 99%
• HLA-DR negativo é provavelmente o achado mais
específico ( 91%)
Expressão e quantificação do CD33 em LMA / LPA
80% Blasti CD33+
N O molecole CD33/cell = 23017
APL
0
256
512
768
1024
FSC-Height ->
Spalice R. MO 14/11/02.003
10 0
256
512
768
1024
FSC-Height ->
Petriconi R. MO 30/12/02.003
256
FSC-Height ->
10 3
512
10 4
10 0
10 1
10 2
molecole CD33/cell =1648
10 3
10 4
FL3-H ->
Petriconi R. MO 30/12/02.003
70% Blasti CD34+ CD33+
NO
molecole CD33/cell = 2992
AML M2
0
10 2
80% Blasti CD33 +
NO
AML M4
0
10 1
CD33 PE ->
Spalice R. MO 14/11/02.003
768
1024
10 0
10 1
CD34 FITC ->
10 2
10 3
10 4
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
LEUCEMIA PROMIELOCÍTICA AGUDA (LPA)
 LPA é caracterizada por uma translocação específica
t(15;17)
 t(15;17) envolve o gene receptor do ácido retinóico
RAR-alpha no cromossomo 17 e o gene PML, um fator
de transcripção, no cromossomo 15,
gerando o gene quimérico PML-RAR-alpha
 o resultado da proteina quimérica PML/RARα é
crucial para a patogênese da LPA
Dr. Zago – Atibaia 03/2007
SLD de acordo com o grupo de risco citogenéticomolecular
Median:
Standard:
Intermediate:
High:
3.2 years (C.I. 95%: 38,6 - 60,6)
1.6 years (C.I. 95%: 36,9 - 63,1)
0.62 years (C.I. 95%: 39,2 - 59,7)
standard-risk: median DFS = 3.2 years
intermediate-risk: median DFS = 1.6 years
high-risk: median DFS = 0.62 years
p<0.0001
years from CR
standard:
85 events 47
intermediate: 56 events 34
high:
91 events 75
Mancini et al, Blood 2005
Translocações Cromossômicas
Envolvendo o Gene RARα
Translocação
Gene de Fusão
Morfologia
t(15;17)(q22;q12)
PML-RAR
t(11;17)(q23;q21)
PLZF-RAR
t(11;17)(q13;q21)
NuMA-RAR
Clássica ou
microgranular
Assoc.
microgranular
Clássica
t(5;17)(q23;q12)
t(17;17)
NPM-RAR
STAT5b- RAR
Clássica ou
microgranular
Resposta ao
ATRA
Sensível
Resistente
Sensível
Sensível
Resistente
Genes X
Genes X-RAR
Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007
MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
Estrut.
Alvo
Cromosso t(15;17)
mos
Método
Cariótipo
FISH
T
Vantagem
13-14 Específico
dias
2-3
dias
Céls. intérfase
Desvantagem
Crescimento em cultura; fusões
crípticas não são detectadas,
não define alvo para MRD
Custo, não define alvo para
MRD
DNA
genes PML e
RARα
Southern
7 dias Específico
Laborioso, uso de radioativos,
não define alvo para MRD
RNA
fusão
PML/RARa
RT-PCR
1 dia
Rápido,
Qualidade do RNA, falsos
sensível, define positivos
alvo p/ MRD
Núcleo
Proteína PML
Imunofluores.
1 dia
Rápido, barato
Artefatos, não define alvo para
MRD
Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007
Imunofluorescência anti-PML
PML
RAR
RA
PML
RXR
5’
RAR
DR5
3’
LMA – não LPMa
Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007
Acute Myeloid Leukemia
Tyrosine Kinase Receptor Mutations
Gene
Mutation
Frequency
FLT-3
Duplication
Point Mutation
15-30%
5-10%
FMS
Point Mutation
10-20%
c-KIT
Various
<10%
Vanderson Rocha – Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007
Core Binding Factor AML
Prognostic impact of TK receptor mutations
E F S (%)
1.0
0.8
FLT3 wildtype
0.6
0.4
0.2
FLT3 mutation
p<0.001
1
2
3
years
4
5
6
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
Core Binding Factor AML
Prognostic impact of TK receptor mutations
E F S (%)
1.0
0.8
FLT3 wildtype
0.6
0.4
0.2
FLT3 mutation
p<0.001
1
2
3
years
4
5
6
1.0
O S (%)
0.8
0.6
c-KIT wildtype
0.4
0.2
c-KIT mutation
p=0.03
1
2
3
years
4
5
6
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
LMA. Carcaterísticas clínicas de acordo com o
status FLT3
FLT3 pos
Pts
Idade(mediana)
Sexo F/M
G.B.(mediana)
Blastos (%)
FLT3 neg
150 (20%)
582
15-60 (48.5)
16-60 (40.5)
86/64
290/292
10.1-410 (126.0)
1.0-170 (28.2)
50-100 (85)
12-98 (46)
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
NPM
1 Kb
1
Exon 12
2 3 4
Oligomerization
MB
5 6
Ac NLS
78
Ac
NLS
9
10
11
12
Heterodimerization
Mutations
None (wild
Mutation A
Mutation B
Mutation C
Mutation D
Mutation E
Mutation F
type)
(77%)
(13%)
(2%)
(2%)
(2%)
(2%)
GATCTCTG....GCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG
GATCTCTGTCTGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG
GATCTCTGCATGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG
GATCTCTGCGTGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG
GATCTCTGCCTGGCAGT....GGAGGAAGTCTCTTTAAGAAAATAG
GATCTCTG....GCAGTCTCTTGCCCAAGTCTCTTTAAGAAAATAG
GATCTCTG....GCAGTCCCTGGAGAAAGTCTCTTTAAGAAAATAG
Pelo menos 40 variantes da mutação NPM já foram identificadas
Falini et al., NEJM 352: 254-266, 2005
NIH 3T3
NPM MUTANTS
LOCALIZE ABERRANTLY IN THE CYTOPLASM
GFP
NPMm
GFP
NPMwt
NPM wild-type
NPM-mutated
WT
Mutated
C
86
47
WB: anti-NPM (376)
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
Tratamento: Fatores Prognósticos
• Pacientes idosos (>60 anos ? ; >80 anos)
• Sanz et al (PETHEMA+GIMEMA)
– Baixo risco: GB<10.000/μl e Plt>40.000/ μl
– Alto risco: GB≥10.000/ μ l
– Risco intermediário:GB<10.000/ μl e Plt<40.000/ μl
• Persistência do PML/RARα pós-consolidação
• Mau prognóstico mas não modificam o tratamento:
CD56+, isoforma S do PML/RARα e mutações do
FLT3
• Não são fatores de mau prognóstico: anormalidades
citogenéticas adicionais (30%)
Dr. Eduardo Rego – Atibaia 03/2007
GIMEMA-AIEOP “AIDA” Trial
Risco de recaída de acordo com
monitoramento precoce de RT-PCR após
consolidação
1
RT-PCR positive
Probability
0.8
0.6
p=0.0001
0.4
0.2
RT-PCR negative
0
0
12
24
36
48
Months
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
Sobrevida da LPA em pacientes
tratados por recaída hematológica vs
molecular
1.0
Molecular
0.8
0.6
Hematologico
0.4
0.2
P = 0.01
0.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
32
20
7
2
94
47
26
14
5.0
Robin Foá – Atibaia 03/2007
Expressões gênicas em LMA: grupos moleculares e
resultados
Clear correlation between cytogentic groups
and gene expression (Kohlmann, 2003, Genes,
Chrom Cancer)
Identification of a HOX signature in samples
with normal cytogenetics (Debernardi, 2003,
Genes, Chrom Cancer)
54 AML pediatric samples with a different signature
that is associated with outcome (Yagi, 2003, Blood)
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
Vanderson Rocha – Board Review-MDAnderson/HIAE/ Junho 2007
AmpliChip Leukemia
MILE: Clinical Objectives
Objective 1:
Clinical accuracy of the microarray test as compared to
standard leukemia laboratory methods (“gold standard”)
n = 4000 patients
Gold standard Diagnostic
Information
Morphology
Cytogenetics
Cytochemistry
FISH
Microarray-based gene expression
profile
Immunophenotyping
PCR
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
AmpliChip Leukemia
The “MILE” multi-center premarketing study
Microarray Innovations in LEukemia
A retrospective and prospective study to
compare laboratory standard leukemia
tests with a new microarray-based gene
expression test
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
AmpliChip Leukemia
Key hematological centers participating in Phase-I
The MILE study will be conducted in collaboration with the
European Leukemia Network plus US participants
European Leukemia Network (WP13)
Principal Investigator: T. Haferlach
• Site 1 Montpellier / France
• Site 2 Munich / Germany
• Site 3 Berlin / Germany
• Site 4 Rome / Italy
• Site 5 Padua / Italy
• Site 6 Salamanca / Spain
• Site 7 Cardiff / UK
US Sites – Memphis, La Jolla
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
Classification performance of 17 - class
algorithm: MDS not included in data set
Class
C1
C2
C3
C4
C5
C6
C7
C8
C9
C10
C11
C12
C13
C14
C15
C16
C18
Name
mature B-ALL with t(8;14)
Pro-B-ALL with t(11q23)/MLL
c-ALL/Pre-B-ALL with t(9;22)
T-ALL
ALL with t(12;21)
ALL with t(1;19)
ALL with hyperdiploid karyotype
c-ALL/Pre-B-ALL without t(9;22)
AML with t(8;21)
AML with t(15;17)
AML with inv(16)/t(16;16)
AML with t(11q23)/MLL
AML with normal karyotype + other
abnormalities
AML complex aberrant karyotype
CLL
CML
None of the above
N
18
101
127
152
61
44
Sensitivity
0.833
1.000
0.934
0.974
0.934
1.000
Specificity
1.000
0.999
0.999
0.998
0.997
1.000
50
188
72
72
73
82
0.853
0.871
1.000
0.986
1.000
0.855
0.997
0.991
1.000
0.999
1.000
0.997
685
0.962
0.984
144
455
151
172
2647
0.887
0.996
0.984
0.972
0.997
0.999
1.000
0.994
Accuracy by cross-validation:
95.65%
- based on 30fold CV
- HG-U133 Plus 2.0
- 2,647 samples for training
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
AmpliChip Leukemia Test
MILES Stage I data presented at ASH conference 2006
[852] An International Multi-Center Microarray Study for the Molecular
Classification of Leukemia Identifies Novel Sub-Groupings in MDS Overlapping
with AML.
Session Type: Oral Session
Authors: Ken I. Mills, Torsten Haferlach, Jesus M. Hernandez, Wolf-Karsten Hofmann,
Alexander Kohlmann, Mickey Williams, Lothar Wieczorek
Date/Time: Tuesday, December 12, 2006 - 8:45 AM
Session Info: Simultaneous Session: Myelodysplastic Syndromes: Molecular Biology (8:00
AM-10:00 AM)
Robin Foá – Atibaia – 03/2007
Illumina
Core Binding Factor
Genes
Proteins
 Subunity
(direct contact with DNA)
AML-1
(21q22)
CBF
 Subunity
(promotes interaction with DNA)
CBF
Core Binding Factor
Genes
Proteins
 Subunity
(direct contact with DNA)
AML-1
(21q22)
rhd
Runt homology domain (RUNX1)
 Subunity
(promotes interaction with DNA)
CBF
(16p13)
CBF
Core Binding Factor Translocations
in AML
MYH11
CBF
CBF
CBF-MHY11
inv (16)
rhd
rhd
Wild type
CBF
rhd
ETO
AML1-ETO
t(8;21)
5-12% AML
8
t(8;21)
21
LEUCEMIAS MIELÓIDES AGUDAS – 912 casos analisados
MDS – 59 casos / BIFENOTÍPICAS – 10 casos no HIAE
5.139 CASOS DE DOENÇAS ONCOHEMATOLÓGICAS
(Novembro 1991 a Julho 2006)
LMA M0
LMA M1
LMA M2
LMA M3
LMA M4
LMA M5
LMA M6
LMA M7
LMA (com expressão aberrrante)
LMA Indiferenciada
LMA
TOTAL
(17,7%)
LEUCEMIA (Bifenotípica)
(0,19%)
MIELODISPLASIA
(1,15%)
65
154
135
120
149
61
17
16
47
4
144
912
10
59
OBRIGADA PELA ATENÇÃO !
Nydia
[email protected]
Grupo de Citometria de Fluxo do
Laboratório Clínico HIAE - 2007
Ana Claudia Miranda Brito
Alexandra Cavalcante
Sonia Tsukasa Nozawa
Ruth Hissae Kanayama
Diferenciação Monocítica – MO normal
Painéis de anticorpos monoclonais
I
Monoblasto
CD34
CD117
HLA-DR
CD13+forte
CD33+forte
II
III
Promonócito
Monócito
CD117
HLA-DR
CD13+forte
CD33+forte
CD11b
CD15
CD14
HLA-DR
CD13+forte
CD33+forte
CD11b
CD15+fraco
CD14
IV
Macrófago
HLA-DR
CD13+
CD33+
CD11b
CD14
CD34/CD117/CD45/CD13.33
CD14/CD33/CD45/CD34
Dra. Silvia – Florianópolis Santa Catarina