Diagnóstico das Leucemias
na Infância
Dra. Maria Lúcia de Martino Lee
Instituto de Oncologia Pediátrica
– UNIFESP/EPM
Desenvolvimento das Técnicas de
Coloração
• EHRLICH - 1877 
NEUTRÓFILOS

BASÓFILOS

ACIDÓFILOS ( Eo)
Descrição morfológica das
leucemias
SÉCULO XX
AVANÇOS
TECNOLÓGICOS

Reconhecimento
da heterogenecidade
das leucemias
Técnicas convencionais:
morfologia e citoquímica
Imunofenótipo
Citogenética
convencional
Genética molecular.
Expressão
genética/proteica.
SECULO XXI
• Reconhecimento
subgrupos
biologicamente
homogeneos
• Identificação
fatores
prognósticos
• Delineamento de
tratamentos mais
específicos
Diagnóstico e Classificação
• Diagnóstico + classificação precisos =
Essenciais para o estudo biológico e o
sucesso terapêutico das leucemias infantis;
• Sistema de classificação ideal deve ser
biologicamente relevante;
• Deve ser útil tanto ao onco-hematologista
clínico, quanto ao pesquisador;
• Deve ser reproduzível e amplamente
utilizável.
Diagnóstico das Leucemias
Sangue Periférico
Mielograma
Morfológico
FAB
Citoquímica
Imunofenotipagem
POX/SB
Linhagem
PAS
Sub-linhagem
Esterases
Citogenética/
Genética
Molecular
Alterações:
- estruturais
- numéricas
Diagnóstico das Leucemias
Avaliação morfológica
Aplasia
Medular
Infiltração
MO Tu
Leucemias
SMD
PTI
SHF
Calazar
Anemia
Meg
HIV
S.Chediak
Higashi
Diagnóstico das Leucemias
Avaliação morfológica
• Aspiração seca: a avaliação será
enfocada apenas no SP e no estudo
histológico da BIÓPSIA de MO.
• Cerca de 20 % dos pacientes com
leucemia não apresentam blastos
circulantes ao diagnóstico.
Diagnóstico e Classificação das
Leucemias
AGUDAS
• Representam 95 % das leucemias infantis
• Proliferação de células imaturas: BLASTOS.
• Sua enumeração na MO é fundamental para
a definição diagnóstica de leucemia aguda.
CRÔNICAS
• Representam 3 a 5 % casos das leucemias
infantis.
• Proliferação de células relativamente bem
diferenciadas.
Avaliação Morfológica/Citoquímica
• Introduzidas na década de 60,
algumas colorações citoquímicas
(MPO, SBB, NSE) auxiliam na
definição da linhagem e no
diagnóstico de alguns subtipos de
LMA.
Mieloperoxidase (MPO)
• Cora os grânulos primários dos
precurssores granulocíticos e menos
intensivamente dos monócitos.
• Ainda é considerada a reação “gold
standard” para a diferenciação
morfológica entre blastos linfóides
(negativos) e mielóides (positivos).
MPO
Negro de Sudan (SBB)
• Coloração não
enzimática dos
fosfolipídeos das
membranas dos
grânulos.
Interpretação de
positividade paralela
a MPO, porém mais
intensa.
Esterases não Específicas (NSE):
Esterases não específicas (NSE):
• alfa naftil acetato ( ANA ) esterase
• alfa naftil butirato (ANB) esterase
• Cruciais para a determinação de
monoblastos/monócitos. É descrita em
escala de 0 a + 4, e somente em níveis
+3 ou +4 é caracterizado o blasto como
monocítico.
• Monócitos maduros reagem menos
intensamente que monoblastos.
ANB esterase
• Demais (PAS, Esterase Específica - CAE),
Fosfatase Ácida, Ferro Medular): são
atualmente de limitado valor diagnóstico.
PAS
Diagnóstico e Classificação
Morfológica / Citoquímica
Linfóides:
– Representam 80 % das leucemias infantis.
– Caracterizam -se pela presença na MO de >25 %
de blastos de características linfóides.
MIelóides:
– Representam 20% das leucemias infantis.
– Blastos constituem no mínimo 30% do total das
cels nucleadas ou não eritróides da MO ou mais
de 20% de acordo OMS.
Diagnóstico e Classificação
Morfológica / Citoquímica
Classificação FAB (1976):
• Primeira a unificar a classificação das
leucemias
• Permitiu a comparação entre diferentes
protocolos terapêuticos
• Atualmente,ainda é a base
citomorfológica para a classificação das
LMA e SMD.
Diagnóstico e Classificação
Morfológica / Citoquímica
FAB
LLA
LMA
SMD
(L1, L2, L3)
(M1 – M6)
1985
(M7)
(RA, RARS, AREB,
AREBt, LMMC)
Outras classificações
Classificação MIC (1986):
• Classificação das LLA e posteriormente das LMA.
• Baseia-se em critérios morfológicos, imunológicos
e citogenéticos.
Classificação da OMS (2001):
• Inclui achados morfológicos/citoquímicos, além
de características imunofenotípicas, genéticas e
clínicas específicas.
Classificação Morfológica FAB
LLA
L1
L2
L3
Classificação Morfológica FAB LLA
Classificação Morfológica FAB - LMA
M4Eo
a/b
M3v
LMA - M0
LMA – M1
LMA – M2
LMA - M2
LMA - M3v
LMA – M4Eo
LMA – M5
LMA – M6
LMA – M7
Proporção aproximada de casos LMA na infância
por subtipos
2
4
2
10
22
25
25
M0
M1
M2
M3
10
M4 / M4Eo
M5
M6
M7
Imunofenotipagem das
Leucemias Agudas
Dra. Maria Lúcia de Martino Lee
Instituto de Oncologia Pediátrica
– UNIFESP/EPM
Imunofenotipagem das leucemias agudas (LA)
Principais finalidades
Diagnóstico das LA
• Definir linhagem/
sublinhagem celular
(mieloides,linfoidesB,
linfoides T, NK)
• Definir estágio
maturativo do blasto
• Detecção DRM
Futuro
• Desenvolver e
monitorar novas
terapias
alvo(enzimas de
superfície,
moléculas de
adesão, receptores
de citocinas
Citometria de Fluxo Metodologia
Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.
Citometria de Fluxo Metodologia
Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.
Citometria de Fluxo
Vantagens do método
• Mede múltiplos parametros em células
individuais
• Grande número de células analisadas
com rapidez
• Disponibilidade de amplo perfil de
anticorpos específicos
• Análise de antígenos de superfície,
intracitoplasmáticos e intranucleares
Rocha, Maria Hsu. Imunofenotipagem em Leucemia Aguda. Instituto Fleury de Ensino e Pesquisa.
Imunofenótipo da LLA
Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.
Desenvolvimento da linhagem mielóide
Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.
Imunofenotipagem
Triagem Inicial – Painel de Marcadores
Linhagem
Marcadores Imunológicos
Linfóide B
CD19
CD79a
Linfóide T
CD3
CD7
Anti-MPO
CD45
Mielóide
Não
específica
CD10
CD22
CD13
CD33
CD117
CD34
tdt
Classificação Imunológica das LLA
Infantis
Marcadores monoclonais
CD19/
CD79a CD10
IMF
%
Cy Igs CD3cy
casos
Comum
+
+
Pré B
+
+
+
-
-
20-25
t(1;19)
B
+
+/-
-
+
-
3
t(8;14)
T
-
+/-
-
-
+
18
Pró B
+
-
-
-
1
-
-
-
50-60
TEL-AML,
Hiperdiploidia
MLL,t(4;11)
Rocha, Maria Hsu. Imunofenotipagem em Leucemia Aguda. Instituto Fleury de Ensino e Pesquisa.
Classificação Imunológica da
LLA T
Fred Behm. Laboratory Studies of Acute Leukemia. In: www.cure4kids.org.
Classificação Imunológica da
LLA T
Marcadores positivos
• CD 3c, CD 7
• CD5, CD2, tdt
• CD10 (45 %)
• CD45
Marcadores positivos/negativos
• CD19, CD 13, CD33
Marcadores negativos
• CD79a
• MPO
• CD1a, CD3, CD4,
CD8 <45 % casos
• Subdividida 3
estágios
maturativos:
Dificíl correlação
prognóstica
LLA com co-expressão de antígenos
mielóides
• Crianças: 4 -35 %
• Sem valor prognóstico
independente
CD10
CD19
CD79
CD33 (25%)
CD22cy CD13 (23%)
tdt
CD15 (16%)
CD14 (16%)
Imunofenotipagem na LMA
Essencial:
–LMA -MO
–LMA - M7
Auxiliar:
–LMA -M6
–LMA - M3
–LMA - 2 v
–LMA -M4Eo
–LMA - M5
Imunofenotipagem das LMAs
LMA minimamente diferenciada
Marcadores positivos
CD 13
CD 33
CD 117
--------------------------CD34,38,HLA-dr,
tdt 1/3 dos casos
Marcadores negativos
MPO
CD3c
CD 79a c
CD 22 c
---------------------CD 11b,15, as vezes
CD2,7,19 fracos
Leucemia Megacarioblástica Aguda
Marcadores Positivos
• Plaquetários:
– CD 41, CD 42,CD 61
Marcadores Negativos ou Positivos:
• Mielóides:
– CD13 +, CD 33+,CD 117+
Marcadores Negativos:
– anti MPO, CD 34, CD 45,HLA - DR
Eritroleucemia
Marcadores positivos
• Mielóides:
– CD117, CD13
• Eritróides:
– Glicoforina A
Marcadores negativos
• anti MPO
Rocha, Maria Hsu. Imunofenotipagem em Leucemia Aguda. Instituto Fleury de Ensino e Pesquisa.
Leucemia Aguda de Linhagem
Ambígua
• Leucemias agudas indiferenciadas
• Leucemias agudas bifenotípicas
• Leucemias agudas bi-linhagem
Leucemias Agudas Indiferenciadas
• 1 - 3% leucemias agudas
• Amplo painel de marcadores
negativos
• Em geral: CD34+, HLA-DR+,
CD38+, CD7+, tdt+.
Leucemias Agudas Bifenotípicas
• Concomitância de marcadores imunológicos
no mesmo blasto
– Mielóide + B
– Mielóide + T
–T +
B
CD19

• 4-6% das leucemias agudas
MPO

MPO
CD22

CD19
Rocha, Maria Hsu. Imunofenotipagem em Leucemia Aguda.
Instituto Fleury de Ensino e Pesquisa.
Leucemia aguda bi-linhagem
• Duas populações distintas de blastos
expressando marcadores diferentes
CD22
CD33
MPO CD33
CD19
CD19


CD13
CD79a
MPO

CD22
CD19
CD13 MPO

CD79a
CD33
MPO
CD33
CD19
Doença Residual Mínima
• Técnicas moleculares (FISH, RT-PCR)
• Citometria de fluxo:
– fenótipos anômalos
– Assincronismo maturativo
– Infidelidade linhagem
– Anormalidades quantitativas
– Ausência de antígenos
DRM em LLA - SLE
Rowe JM. Clinical Harmatology. Harcourt Çublishers, London, 2002.
Recidiva LLA vs DRM
Rowe JM. Clinical Harmatology. Harcourt Çublishers, London, 2002.