SOCIEDADE EVANGÉLICA BENEFICENTE DE CURITIBA
HOSPITAL UNIVERSITÁRIO EVANGÉLICO DE CURITIBA
FACULDADE EVANGÉLICA DO PARANÁ
INSTITUTO DE PESQUISAS MÉDICAS
UNIÃO EDUCACIONAL DO PLANALTO CENTRAL
MONRES JOSÉ GOMES
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DOS MARCADORES KI-67 E
CASPASE-3 NO ADENOCARCINOMA COLORRETAL ATRAVÉS DE
UM SISTEMA COMPUTADORIZADO DE ANÁLISE DE IMAGEM
Dissertação apresentada no Projeto
Interinstitucional – MINTER do Programa
em Princípios de Cirurgia do Hospital
Universitário Evangélico de Curitiba,
Faculdade Evangélica do Paraná e a União
Educacional do Planalto Central, como
requisito parcial para obtenção do grau
acadêmico de Mestre.
Orientador:
Prof. Dr. Jurandir Marcondes Ribas Filho
Coordenador do Programa Promotor:
Prof. Dr. Osvaldo Malafaia
Coordenador da Instituição Receptora:
Prof. Dr. Ronaldo M. Cuenca
CURITIBA/BRASÍLIA
2007
DEDICATÓRIA
À Zuleika Gomes, minha companheira de todas as horas, o amor que
Deus me deu. Fiel colaboradora em minhas causas com o progresso
da medicina.
À Lara e Hebe, minhas filhas, que privadas da presença do pai em
suas jornadas pela medicina adentro, sempre sublimam essas falhas
do pai-não-presente e me incentivam a continuar na senda do
conhecimento, esta estrada de rumo certo onde poderão trilhar um dia.
Aos meus pais, José Sebastião Gomes e Delfina Oliveira Gomes, pelo
sonho de formar os filhos, educá-los na formação cristã. Pelo
desprendimento no alcance destes objetivos, abrindo mão de outras
vitórias a favor de uma glória maior, e conseguiram.
Aos meus irmãos Mário Namoniêr Gomes e Márcio de Oliveira Gomes,
e suas famílias, sustentáculos da maior amizade que se poder ter,
irmãos unidos na prática médica aos moldes do juramento hipocrático.
Às minhas irmãs Meire, Marileide, Cleide e suas famílias, quem tanto
prezo e admiro, sempre aprendo com vocês.
Aos meus familiares, que direta ou indiretamente ajudaram nos meus
estudos até esta fase.
ii
AGRADECIMENTOS
Ao meu Orientador e amigo, Professor Doutor Jurandir Marcondes Ribas
Filho, agradeço por me mostrar o caminho do Magistério, a minha iniciação aos
estudos maiores da medicina de uma forma tão apaixonante. Pelo incentivo nos
momentos mais difíceis, pela confiança, dedicação, seriedade e pelo seu exemplo
humanístico e profissional. Muito Obrigado professor!
Ao meu amigo Luis Otávio Mantovani Bataglin, pela sua valiosa contribuição
durante a execução deste trabalho, pela sua paciência, pela sua educação, pela sua
vontade de aprender sempre, pela firmeza no seu ideal de exercer a futura profissão
de médico com as virtudes de um cristão convicto. Muito Obrigado Luis Otávio!
Ao coordenador do programa de Pós-Graduação em Princípios de Cirurgia,
Mestrado Interinstitucional (MINTER): Faculdade Evangélica do Paraná (FEPAR)
/Instituto de Pesquisas Médicas (IPEM) e União Educacional do Planalto Central
(UNIPLAC), Professor Doutor Osvaldo Malafaia, pelos ensinamentos passados,
carinho e confiança prestada. Muito Obrigado!
Aos colegas de curso deste mestrado em princípios de cirurgia, amizades
conquistadas durante os dois anos que estivemos juntos, houve muito aperto nesta
jornada, mas houve também boas gargalhadas, e enfim fiat lux. Eis que surgem as
grandes conquistas intelectuais para todos. Muito Obrigado meus colegas de turma!
Aos professores que nos auxiliaram durante todos os cursos que
compuseram o mestrado, pela indispensável ajuda em nossa formação.
Aos demais Doutores que fazem parte do grupo de orientadores deste
mestrado, Dr. Antônio Carlos Campos, Dr. Erickson Blun, Dr. Nicolau Gregori
Czeczko, Dr. Ronaldo Mafia Cuenca, cada um a seu modo colaborou muito em
todas as fases deste evento. Muito Obrigado!
A Dra. Carmen Austrália Paredes Marcondes Ribas, pela paciência com este
aluno e fineza de me atender sempre, nas minhas dúvidas com a execução dos
trabalhos em laboratório.
Ao Dr. Marcos Leal Brioschi, jovem médico paranaense, mestre e doutor em
cirurgia, grande incentivador nesta empreitada.
iii
AGRADECIMENTOS
Aos acadêmicos de Medicina, Thiago Marçal e Valdivino Diniz, pela presteza
quando nos princípios deste trabalho na procura e seleção dos blocos.
À bióloga Fernanda Santos Cavalcanti, pela prestimosa colaboração na fase
de material e método.
Às doutoras Syomara Pereira da Costa Melo e Raimunda Ribeiro da Silva, do
Hospital Aldenora Bello de São Luís -MA, pela presteza da ajuda na seleção dos
primeiros blocos parafinados, serei sempre grato!
Ao doutor Sebastião Alves Pinto, do laboratório INGOH, em Goiânia-GO, pela
amizade demonstrada e ajuda importante no início deste trabalho e seleção de
casos.
Ao doutor Paulo Sérgio Peres Fonseca do Centro de Anatomia Patológica e
Citopatologia de Anápolis-GO, pela presteza em ajudar-me selecionar os blocos
parafinados na fase inicial da tese.
Ao doutor Teodoro Ostrowski, do Laboratório Micra - Hospital Brasília, Brasilia
- DF, por confiar em minha força de vontade e ceder os blocos necessários para
nosso trabalho.
Ao doutor Sergio Ioshio, do CITOLAB, em Curitiba-PR, por ceder o restante
dos blocos e pela ajuda inestimável nas aulas.
Ao Dr. Luís Alberto Neves, de Belém-PA, representando todos os meus
alunos e ex-alunos espalhados por todo o Brasil, agradeço pela força do incentivo.
Aos meus familiares e amigos, que mesmo indiretamente ajudaram, com o
apoio e carinho nesses dois anos até a realização deste trabalho.
iv
EPÍGRAFE
Sê escravo do saber se quiseres ser verdadeiramente livre.
Sêneca
v
SUMÁRIO
LISTA DE ILUSTRAÇÕES . .................................................................................................................vii
LISTA DE GRÁFICOS ..........................................................................................................................viii
LISTA DE TABELAS ...........................................................................................................................ix
LISTA DE SIGLAS E SÍMBOLOS .......................................................................................................x
RESUMO . .............................................................................................................................................xi
ABSTRACT . .........................................................................................................................................xii
1
INTRODUÇÃO . .......................................................................................................................1
2
REVISÃO DE LITERATURA . .................................................................................................5
2.1
KI-67 ........................................................................................................................................6
2.1
CASPASE-3 .............................................................................................................................12
2.3
ANÁLISE COMPUTADORIZADA DE IMAGEM ......................................................................16
3
MATERIAL E MÉTODO . .........................................................................................................18
3.1
AMOSTRA E SELEÇÃO . ........................................................................................................19
3.2
DELINEAMENTO DO ESTUDO ..............................................................................................20
3.3
HISTOLOGIA . ..........................................................................................................................20
3.3.1 Processamento Histológico .....................................................................................................20
3.3.2 Avaliação Histológica . .............................................................................................................20
3.4
IMUNOISTOQUÍMICA . ............................................................................................................20
3.4.1 Procedimento Imunoistoquímico .............................................................................................20
3.4.2 Anticorpos para Antígenos Ki-67 e caspase-3 . .......................................................................22
3.4.3 Critérios de Avaliação . .............................................................................................................23
3.4.3.1 Análise qualitativa da imunoistoquímica .................................................................................23
3.4.3.2 Análise quantitativa da imunoistoquímica . ..............................................................................23
3.4.3.3 Procedimento de leitura ...........................................................................................................25
3.4.3.4 Parâmetros analisados pelo sistema Samba 4000 . ................................................................26
3.5
ANÁLISE ESTATÍSTICA . ........................................................................................................27
4
RESULTADOS . .......................................................................................................................28
4.1
EXPRESSÃO DE KI-67 ...........................................................................................................29
4.2
EXPRESSÃO DE CASPASE-3 ...............................................................................................31
4.3
COMPARAÇÃO ENTRE VARIÁVEIS DE KI-67 E CASPASE-3 . ............................................33
4.4
CORRELAÇÃO ENTRE VARIÁVEIS ......................................................................................33
5
DISCUSSÃO ...........................................................................................................................37
5.1
CARCINOGÊNESE COLORRETAL .......................................................................................38
5.2
PRESENÇA E QUANTIFICAÇÃO DE KI-67 ...........................................................................40
5.3
PRESENÇA E QUANTIFICAÇÃO DE CASPASE-3 ...............................................................42
5.4
CORRELAÇÃO ENTRE KI-67 E CASPASE-3 ........................................................................44
5.5
ANÁLISE DA IMUNOMARCAÇÃO DE KI-67 E CASPASE-3 PELO SAMBA 4000 ................44
5.6
NOVAS PERSPECTIVAS . ......................................................................................................45
6 CONCLUSÕES .................................................................................................................................47
GLOSSÁRIO ........................................................................................................................................49
REFERÊNCIAS ....................................................................................................................................51
BIBLIOGRAFIA ....................................................................................................................................58
APÊNDICE ...........................................................................................................................................64
vi
LISTAS
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1 FIGURA 2 FIGURA 3 FIGURA 4 FIGURA 5 FIGURA 6 -
IMUNOISTOQUÍMICA PARA CASPASE-3 ..................................................................23
IMUNOISTOQUÍMICA PARA KI-67 . .............................................................................24
SISTEMA SAMBA 4000 – HARDWARE .......................................................................25
HOT SPOTS ..................................................................................................................27
IMUNOISTOQUÍMICA PARA CASPASE-3 ..................................................................31
IMUNOISTOQUÍMICA PARA KI-67 . .............................................................................33
vii
LISTAS
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1 GRÁFICO 2 GRÁFICO 3 GRÁFICO 4 GRÁFICO 5 -
DISTRIBUIÇÃO DO ÍNDICE DE MARCAGEM PARA KI-67 ......................................30
DISTRIBUIÇÃO DO ÍNDICE DE MARCAGEM PARA KI-67 ......................................31
DISTRIBUIÇÃO DO ÍNDICE DE MARCAGEM PARA CASPASE-3 . .........................32
DISTRIBUIÇÃO DO ÍNDICE DE MARCAGEM PARA CASPASE-3 . .........................33
CORRELAÇÃO ENTRE O ÍNDICE DE MARCAGEM E A DENSIDADE ÓPTICA
MÉDIA DO KI-67 ........................................................................................................35
GRÁFICO 6 - CORRELAÇÃO ENTRE O ÍNDICE DE MARCAGEM E A DENSIDADE ÓPTICA
MÉDIA DA CASPASE-3 . ............................................................................................36
GRÁFICO 7 - CORRELAÇÃO ENTRE OS ÍNDICES DE MARCAGEM DE KI-67 E CASPASE-3
. ....................................................................................................................................36
GRÁFICO 8 - CORRELAÇÃO ENTRE AS DENSIDADES ÓPTICAS MÉDIAS DE KI-67 E
CASPASE-3 ................................................................................................................37
GRÁFICO 9 - COMPARAÇÃO ENTRE AS MÉDIAS DOS ÍNDICES DE MARCAGEM DE KI-67
E CASPASE-3 ............................................................................................................64
GRÁFICO 10- COMPARAÇÃO ENTRE AS MÉDIAS DAS DENSIDADES ÓPTICAS MÉDIAS
DE KI-67 E CASPASE-3 .............................................................................................65
viii
LISTAS
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 TABELA 2 TABELA 3 TABELA 4 TABELA 5 -
PARÂMETROS DAS VARIÁVEIS DOS MARCADORES KI-67 E CASPASE-3
34
COMPARAÇÃO DAS VARIÁVEIS PELO COEFICIENTE DE CORRELAÇÃO DE
PEARSON
35
TESTE DE DISTRIBUIÇÃO NORMAL
63
RESULTADOS IMUNOISTOQUÍMICOS DE KI-67
63
RESULTADOS IMUNOISTOQUÍMICOS DE CASPASE-3
64
ix
LISTAS
LISTA DE SIGLAS E SÍMBOLOS
5-FU
ABNT
APC
ATP
Bcl-2
CAD
CCR
CDI
CEA
CPP32
dATP
DCC
DFF
DNA
FADD
FEPAR
G1
G2
H/E
HPV
HUEC
ICAD
ICE
INCA
INF-γ
IPARDES
IPEM
kDa
Ki-67
K-RAS
LI
M
MOD
p53
RNA
S
SAMBA
-
TNF-α
TNM
TUNEL
-
-
5-fluorouracil (quimioterápico)
Associação Brasileira de Normas Técnicas
Adenomatosis Polyposis of the Colon
Adenosina Trifosfato
B-cell lymphoma/leukemia-2
Caspase-Activated Deoxyribonuclease (desoxirribonuclease ativada por caspase)
Câncer Colorretal
Cyclin-Dependent kinases Inhibitor (inibidor de ciclina dependente de quinase)
Carcinoembryonic antigen (antígeno carcinoembrio
32 kDa Cysteine Protease (cisteíno-protease de 32 kDa)
Desoxiadenosina Trifosfato
Deleted in Colorectal Carcinoma
DNA Fragmentation Factor (fator de fragmentação de DNA)
Ácido Desoxirribonucléico
Fas-Associated Death Domain (domínio de morte associado a Fas)
Faculdade Evangélica do Paraná
Gap 1
Gap 2
Hematoxilina-Eosina
Human Papillomavirus
Hospital Universitário Evangélico de Curitiba
Inibidor de CAD
Interleukin-1b-Converting Enzyme (enzima conversora de interleucina-1b)
Instituto Nacional do Câncer
Interferon-γ
Instituto Paranaense de Desenvolvimento Econômico e Social
Instituto de Pesquisas Médicas
Quilodalton
Kiel 67
v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma 2 viral oncogene homologue
Labeling Index (índice de marcagem)
Mitosis
Mean Optical Density (Densidade Óptica Média)
Proteína 53 kDa
Ácido Ribonucléico
Synthesis
Systeme d'Analyse Microphotometrique a Balayage Automatique (sistema de análise
microscópica de busca automática)
Fator de Necrose Tumoral-α
Tumour-Node-Metastasis
Terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP-biotin End Labeling of
fragmented DNA
x
RESUMO
AVALIAÇÃO DA EXPRESSÃO DOS MARCADORES KI-67 E CASPASE-3 NO
ADENOCARCINOMA COLORRETAL ATRAVÉS DE UM SISTEMA
COMPUTADORIZADO DE ANÁLISE DE IMAGEM.
Introdução. O câncer colorretal é uma das causas mais comum de mortes por
neoplasias malignas no mundo ocidental, sendo que o adenocarcinoma colorretal
representa mais de 90% dos tumores malignos que acometem o intestino grosso.
Dessa forma, o estudo da biologia molecular é de fundamental importância para a
compreensão da gênese e comportamento biológico desta doença. A proteína Ki-67,
que é um marcador de proliferação celular, e a cisteíno-protease caspase-3, uma
das mais importantes enzimas participantes do processo apoptótico, podem ser
utilizados como marcadores tumorais. Objetivo. Identificar e quantificar a expressão
das proteínas Ki-67 e caspase-3 em amostras de adenocarcinomas colorretais
através de um sistema computadorizado de análise de imagem, bem como
correlacionar a expressão destes marcadores. Material e método. Foram estudadas
por imunoistoquímica as proteínas Ki-67 e caspase-3, utilizando-se,
respectivamente, os anticorpos clone MIB-1 (código M7240, Dako) e anti-CPP32
(código A3537, Dako) em 55 amostras de adenocarcinoma colorretal parafinizadas.
Para analisar os tecidos imunomarcados, o sistema SAMBA 4000 foi utilizado.
Avaliou-se as lâminas com o programa IMMUNO 4.00 através da leitura de 8 a 10
campos, determinando-se dois parâmetros: O Índice de Marcagem (LI, Labeling
Index) que descreve a porcentagem de área tecidual especificamente marcada pela
prova imunoistoquímica, e a Densidade Óptica Média (MOD, Mean Optical Density),
a qual representa a intensidade de coloração do tecido medida por pixels positivos.
O delineamento utilizado foi transversal não controlado. Para a análise estatística,
utilizou-se o teste t-Student para grupos pareados a fim de verificar existência de
diferença significativa entre os parâmetros de Ki-67 e caspase-3, e o coeficiente de
Pearson para verificar a existência de correlação entre o LI e a MOD do mesmo
marcador, e entre estas variáveis de Ki-67 e caspase-3. Resultados. Todas as
amostras estudadas apresentaram positividade ao Ki-67 (LI médio: 52,56% ±
23,06% de núcleos positivos) e à caspase-3 (LI médio: 85,24% ± 8,71% de células
positivas). Em média, o percentual de células expressando caspase-3 foi 59,1%
maior do que o de células com expressão de Ki-67. Houve correlação
estatisticamente significante entre o LI e a MOD da caspase-3, não se verificando
isto entre os parâmetros de Ki-67, nem entre as expressões deste e de caspase-3.
Conclusões. O sistema SAMBA 4000 demonstrou expressão aumentada de Ki-67,
não ocorrendo correlação significante entre a intensidade de expressão e o número
de células positivas para este marcador (p=0,750). A intensidade da expressão de
caspase-3 e o número de células expressando este marcador correlacionaram-se
positivamente (p=0,013). Não houve correlação entre as expressões de Ki-67 e
caspase-3 (p=0,671).
Palavras-chave: adenocarcinoma colorretal, Ki-67, caspase-3, SAMBA 4000
xi
ABSTRACT
EVALUATION OF KI-67 AND CASPASE-3 MARKERS EXPRESSION IN
COLORECTAL ADENOCARCINOMA BY A COMPUTADORIZED IMAGE
ANALYSIS SYSTEM.
Introduction. The colorectal cancer is one of the most common causes of deaths by
malignant neoplasm in the occident the colorectal adenocarcinoma represents more
than 90% of tumors in large bowel. The molecular biology application is of
fundamental importance in the comprehension of genesis and biological behavior of
this disease. The Ki-67 protein, a marker of cell proliferation, and the cysteineprotease caspase-3, one of the most important enzymes participating in the
apoptatical process, may be used as tumor markers. Objective. Identify and quantify
the Ki-67 and caspase-3 expressions in colorectal adenocarcinomas samples using a
computadorized image analysis system and correlate the expressions of these
markers. Material and Method. Ki-67 and caspase-3 expressions have been studied
by immunohistochemistry with anti-CPP32 (code A3537, Dako) and clone MIB-1
(code M7240, Dako) antibodies, respectively, in 55 paraffinized colorectal
adenocarcinoma samples. The SAMBA 4000 system has been used for the
immunostained tissues analysis. Microscopy evaluation has been performed by the
IMUNNO 4.00 software, which analyzed 8 to 10 fields in order to determine two
parameters: The Labeling Index (LI), indicating the percentage of cells specifically
stained by immunohistochemistry, and the Mean Optical Density (MOD), which
represents the intensity of the stain measured by positive pixels. This study used the
uncontrolled transversal design. For the statistical analysis, the t-Student test for
matched groups was used to compare Ki-67 and caspase-3 parameters, and the
Pearson coefficient was used to verify correlation existence between a marker’s LI
and MOD and between caspase-3 and Ki-67 variables. Results. All the studied
samples showed Ki-67 and caspase-3 positivity (mean LI: 52,56% ± 23,06% positive
nuclei and 85,24% ± 8,71% positive cells, respectively). The number of cells
expressing caspase-3 was 59,1% higher than the cells with Ki-67 expression.
Caspase-3 LI and MOD statistically correlated to each other (p = 0,013), whereas no
correlation was observed between Ki-67 parameters. Ki-67 and caspase-3
expressions didn’t show statistically significant correlation. Conclusions. The
SAMBA 4000 system showed increased Ki-67 expression and absence of correlation
between cell expression intensity and positive cells for this marker (p=0,750).
Caspase-3 expression intensity and number of positive cells positively correlated
(p=0,013). There was no correlation between Ki-67 and caspase-3 expressions
(p=0,671).
Keywords: colorectal adenocarcinoma, Ki-67, caspase-3, SAMBA 4000
xii
1 INTRODUÇÃO
INTRODUÇÃO
2
O câncer colorretal (CCR) apresenta incidência variável nos diferentes
países, predominando naqueles mais desenvolvidos. Incidências menores são
registradas na América do Sul, sudoeste da Ásia, África equatorial e Índia. Nos EUA,
é a segunda maior causa de morte por câncer, desconsiderando-se o sexo (LANDIS,
MURRAY, BOLDEN, WINGO, 1998), estimando-se o surgimento aproximado de
145 mil novos casos de câncer e mais de 56 mil mortes causadas por este tumor no
ano de 2005 naquele país (JEMAL, MURRAY, WARD, SAMUELS, TIWARI,
GHAFOOR, FEUER, THUN, 2005). Após os cânceres de pulmão, mama e próstata,
o CCR é a causa mais comum de mortes por doença maligna no mundo ocidental, e
o adenocarcinoma colorretal representa mais de 90% dos tumores malignos que
acometem o intestino grosso.
Com o aumento da expectativa de vida do povo brasileiro e com a
progressiva industrialização e globalização, as neoplasias ganharam importância
crescente no perfil de mortalidade do país, ocupando o segundo lugar como causa
de óbito. As estimativas de incidência de câncer no Brasil para 2006 apontam o
CCR como o 5º tumor maligno mais freqüente entre homens (com 11.390 casos
novos) e 4º entre as mulheres (13.970 casos novos). A maior incidência de casos
ocorre na faixa etária entre 50 e 70 anos, mas as possibilidades de desenvolvimento
já aumentam a partir dos 40 anos. Apesar das indiscutíveis melhoras nas práticas
médicas e cirúrgicas, a taxa de mortalidade por CCR pouco se alterou nos últimos
40 anos e a sobrevida global após cinco anos se mantém em cerca de 40% (INCA,
2006).
A manifestação esporádica corresponde a aproximadamente 85% dos
casos, os demais 15% são pertencentes a grupos de pacientes com determinação
hereditária da doença, como famílias com polipose colônica familiar, portadores de
colite ulcerativa e de câncer colônico não polipóide (Síndrome Lynch tipos I e II). O
CCR produz, com freqüência, sintomas pouco perceptíveis aos doentes, até que a
doença esteja em fase avançada e tem a particularidade de exibir lesão precursora
conhecida, que é o pólipo adenomatoso. O tempo estimado para o aparecimento do
adenoma, seu crescimento e transformação em tumor é superior a 10 anos, período
este longo para permitir sua identificação, ressecção e, portanto, prevenção do
câncer.
INTRODUÇÃO
3
A aplicação clínica dos conhecimentos obtidos pelos estudos de genética
molecular visando identificar pacientes sob risco, o desenvolvimento de estratégias
de intervenção dietética e, sobretudo, os programas de rastreamento em indivíduos
com risco aumentado para CCR representam caminhos a serem percorridos visando
diminuir a mortalidade. O objetivo destes rastreamentos não é diagnosticar mais
pólipos ou mais lesões planas, porém diminuir a mortalidade por CCR nas
populações alvo.
Em relação ao prognóstico, acredita-se que indivíduos jovens desenvolvam
tumores localmente mais agressivos e com maior capacidade de metastatizar-se,
quando comparados a indivíduos mais idosos (TURKIEWICZ, MILLER, SCHACHE,
COHEN, THEILE, 2001).
Mecanismos genético-moleculares têm sido implicados na tumorigênese e
progressão dos cânceres. Tais mecanismos se originam na biologia molecular, que
por sua vez se inicia com o estudo do ciclo celular. Este consiste em uma complexa
cadeia de eventos metabólicos cujo objetivo é a duplicação da célula. A proliferação
celular, assim como a apoptose e a angiogênese, tem forte correlação com a
intensidade da carcinogênese.
Uma vez que o crescimento tumoral resulta do desequilíbrio entre a
proliferação celular e a apoptose, um amplo espectro de marcadores moleculares
envolvidos na tumorigênese tem sido estudado. A identificação de alguns genes e
seus
respectivos
produtos
protéicos
como
elementos
relacionados
ao
desenvolvimento do câncer, assim como o desenvolvimento de métodos para sua
detecção como imunoistoquímica, entre outros, deram origem a nova fase de
estudos em carcinogênese.
Muitos marcadores biológicos têm sido avaliados de forma retrospectiva em
pacientes com câncer de cólon a fim de determinar características prognósticas.
Alguns destes biomarcadores estão sendo investigados e correlacionados como
verdadeiros preditores de sobrevida. Entre muitos marcadores de proliferação celular
está o Ki-67, o qual é expresso em todas as fases do ciclo celular, exceto em G0.
Esta molécula tem sido usada para avaliação e mensuração de proliferação celular
porque é expressa apenas em células participantes da divisão celular (BROWN,
GATTER, 2002). Os marcadores da apoptose, tipo Proteína 32, protease da cisteína
ou caspase-3, são responsáveis tanto parcial como totalmente pela clivagem
INTRODUÇÃO
4
proteolítica de muitas proteínas (COHEN, 1997). Com a informatização dos métodos
de imagem, a técnica de SAMBA (Systeme d’Analyse Microphotometrique a
Balayage Automatique) é atualmente uma das utilizadas para avaliação de
quantificação da imunoistoquímica (MADY, MELHEM, 2002).
A
elucidação
completa
dos
mecanismos
genéticos
envolvidos
na
patogênese molecular do CCR é um fator de grande relevância na busca da
diminuição tanto da mortalidade desta doença, quanto no impacto social por ela
imposto, e com o conhecimento obtido através da genética avançada, é possível
desenvolver métodos, investigar e identificar marcadores prognósticos de carcinoma
colorretal para permitir decisões terapêuticas mais precisas aos pacientes
acometidos. Com base nestas considerações preliminares elaborou-se a presente
pesquisa, que tem como objetivos:
1. Analisar a expressão de Ki-67 em adenocarcinoma de cólon.
2. Analisar a expressão de caspase-3 neste mesmo tumor.
3. Correlacionar as expressões destes marcadores entre si.
2 REVISÃO DE LITERATURA
REVISÃO DA LITERATURA
6
2.1 Ki-67
VAN DIERENDONCK, KEIJZER, VAN DE VELDE, CORNELISSE (1989)
descreveram os padrões específicos da expressão e distribuição topológica do
antígeno Ki-67 durante o ciclo celular de células de câncer mamário. Os resultados
reforçaram a hipótese de que o Ki-67 pertenceria a uma classe de antígenos
associados à organização estrututral de cromossomos metafásicos e anafásicos, e
de regiões corticais de corpos prenucleolares e nucléolos. Sabendo-se que o Ki-67
pode ser utilizado para avaliar frações de crescimento em cânceres humanos, a
comparação entre as frações de Ki-67 e as frações de crescimento revelou que as
primeiras eram invariavelmente maiores do que estas últimas. Como os resultados
mostraram que células não-proliferativas podem reter o antígeno Ki-67 por períodos
consideráveis, a fração de Ki-67 pode não ser sempre um indicador seguro de fração
de crescimento.
BROWN, GATTER (1990) afirmaram que o anticorpo monoclonal Ki-67 é um
método imunoistoquímico para pesquisa da proteína Ki-67 de fácil execução e alta
confiabilidade para avaliar com precisão a fração de crescimento em neoplasias
humanas. No entanto, esta ferramenta fornece apenas um parâmetro de análise do
tumor, não servindo isoladamente para fins diagnósticos. O anticorpo também é
usado em pesquisas, sendo útil na mensuração da atividade proliferativa em outras
situações, além do câncer.
CATTORETTI, BECKER, KEY, DUCHROW, SCHLUTER, GALLE, GERDES
(1992) utilizaram o anticorpo monoclonal Ki-67 e seus equivalentes, MIB-1, MIB-2 e
MIB-3, para a preparação imunoistoquímica rotineira de lâminas a partir de material
incluído em parafina. Enquanto que os anticorpos Ki-67 e MIB-2 falharam em corar
as lâminas, os anticorpos MIB-1 e MIB-3 marcaram células com figuras mitóticas,
sendo que as células proliferativas não mitóticas (ou seja, nas fases G1, S ou G2 do
ciclo
celular)
apresentaram-se
negativas.
No
entanto,
quando
material
desparafinizado através de processamento em forno de microondas foi utilizado,
MIB-1 e MIB-3 coraram fortemente o núcleo destas células proliferativa não
mitóticas. A utilização dos anticorpos MIB-1 e MIB-3 permite a detecção da proteína
Ki-67 em material arquivado, possibilitando estudos retrospectivos.
REVISÃO DA LITERATURA
7
BRUNO, DARZYNKIEWICZ (1992) investigaram a expressão e estabilidade
do antígeno nuclear Ki-67 ao longo do ciclo celular em leucemia promielocítica
humana. A expressão foi mínima em células no final de G1 e início de S, passando o
antígeno a acumular-se predominantemente nesta última fase. O acúmulo de Ki-67
excedeu o de DNA durante a fase S, havendo aumento de 80% na taxa Ki-67/DNA
entre as fases G1 e G2 + M. O antígeno desapareceu rapidamente em células pósmitoticas. Os dados do estudo sugerem que as variações nos níveis de Ki-67 ao
longo do ciclo celular são conseqüência de variações em sua síntese, e não em sua
taxas de degradação nas diferentes fases. Ainda, é possível que células no final da
fase G1 sejam erroneamente classificadas como células em repouso por
expressarem níveis muito baixos de Ki-67.
GRIGOLATO, BERENZI, BENETTI, CHIRICO, CADEI, CASELLA, SALERNI,
LOJACONO (1994) estudaram a ploidia citométrica e a atividade proliferativa em
carcinoma colorretal. Trinta casos foram avaliados pela pesquisa de antígeno Ki-67 e
citometria de fluxo para determinar o nível de ploidia, a fração de células em fase S
mitótica e o índice de DNA. Os parâmetros considerados não apresentaram
correlação estatística significante entre si ou com os parâmetros histopatológicos
comuns. No entanto, detectou-se certo valor prognóstico na ploidia, sendo possível
incluir na categoria de alto risco pacientes que apresentaram células tumorais
diplóides com alta fração de fase S. O estudo buscou identificar subgrupos, dentro
de grupos do mesmo estado histológico, com significado evolutivo diferente em
relação ao conteúdo de DNA, positividade ao Ki-67, fração de fase S e ploidia na
tentativa de direcionar as terapias de suporte, principalmente aos pacientes sob alto
risco.
CHEN, HENK, CARNEY, WONG, ROTHENBERGER, ZHENG, FEYGIN,
MADOFF (1997) estudaram o significado prognóstico de marcadores tumorais (DNA,
fração de fase S, p-53 e Ki-67) avaliando 70 pacientes com CCR. Dos quatro
marcadores avaliados, o Ki-67 foi significativamente associado com recorrência de
doença em pacientes com estádio clínico II. Os doentes com índice de Ki-67 > 45%
apresentaram 6,5 vezes maior risco de recorrência do que os pacientes com baixo
índice.
KIKUCHI,
DINJENS,
BOSMAN
(1997)
avaliaram
a
expressão
imunoistoquímica de Ki-67, p53, c-myc e Bcl-2 com a finalidade de medir
REVISÃO DA LITERATURA
8
proliferação celular (Ki-67) e apoptose (demais marcadores) em 12 espécimes de
mucosa colônica normal, 8 pólipos hiperplásicos, 39 adenomas de cólon com
diferentes graus de displasia e 10 adenocarcinomas de cólon. Observaram um
aumento progressivo da expressão do Ki-67 em hiperplasia e displasia, atingindo
níveis mais altos em adenocarcinomas (Índice de Marcagem = 53.1 ± 10.5%).
Concluíram que a progressão de adenoma para carcinoma inclui o aumento da
proliferação celular e a diminuição da apoptose.
JANSSON & SUN (1997) examinaram a expressão de Ki-67 em 255
adenocarcinomas colorretais através de imunoistoquímica com o anticorpo MIB-1.
Observou-se positividade maior que 50% das células em 177 casos, sendo os
demais menores que 50%. Os tumores apresentaram expressão de Ki-67 entre 13%
e 90%, indicando variação na atividade proliferativa. O estudo não encontrou
correlação entre a atividade proliferativa medida pelo Ki-67 e diversos parâmetros
clínicopatológicos (idade, sexo, localização tumoral, estadiamento de Dukes,
padrões de crescimento, diferenciação, conteúdo de DNA, fração de fase S e
sobrevida – p>0,05), bem como entre este marcador e o prognóstico em câncer
colorretal.
TANIMOTO,
TANAKA,
HARUMA,
YOSHIHARA,
SUMII,
KAJIYANA,
SHIMAMOTO (1998) estudaram a relação entre apoptose (p53 e Bcl-2) e
proliferação celular (Ki-67) em 57 casos de carcinoma de cólon tipo polipóide, 55
casos de carcinoma tipo superficial e 28 casos de tipo granular. Observaram maior
índice de proliferação celular (medido pelo Ki-67) em carcinoma tipo superficial.
Além disso, quanto maior a expressão do índice de proliferação celular, menor o
índice de apoptose, o que é útil para conhecer o comportamento biológico do tumor.
SALEH, JACKSON, KHATIB, BANERJEE (1999) estudaram a expressão da
oncoproteína Bcl-2 correlacionando-a aos índices de proliferação celular e
parâmetros histopatológicos em neoplasias colorretais. Investigou-se a expressão de
Ki-67 e Bcl-2 em adenomas e carcinomas de cólon, constatando-se que a expressão
de Bcl-2 era mais alta em adenomas do que em carcinomas, e que o contrário
ocorria em relação à expressão de Ki-67. A expressão de Bcl-2 em carcinomas foi
associada a menores índices de positividade ao Ki-67 e a parâmetros
histopatológicos favoráveis. Concluiu-se que a expressão de Bcl-2 é provavelmente
um passo inicial na carcinogênese de cólon e pode estar associada a uma
REVISÃO DA LITERATURA
9
progressão clínica favorável. Além disso, ficou evidenciada a existência de uma
relação inversa entre as expressões de Ki-67 e Bcl-2 nas neoplasias de cólon.
SALEH, JACKSON, BANERJEE (2000) estudaram em 52 amostras de
carcinoma colorretal e 56 adenomas a relação da expressão imunoistoquímica do
Bcl-2, Ki-67 (MIB-1) e p-53 com padrões anátomo-clínicos como o tamanho do
tumor, estadiamento, metástases linfonodais, invasão angiolinfática, grau do tumor e
de diferenciação. O LI médio de Ki67 foi 30.05 ± 7.6 e 38.12 ± 11.01 em adenomas e
carcinomas, respectivamente. Altos níveis de p-53 e Ki-67 foram associados com
achados histopatolígicos mais agressivos, como a diferenciação celular e o estádio
Dukes C. A expressão de Bcl-2 foi maior em carcinomas. Concluíram que a
expressão de Bcl-2, ao contrário das expressões de Ki-67 e p53, é uma alteração
precoce no processo de carcinogênese colônica, além de poderem estar associados
a parâmetros patológicos favoráveis.
RIBEIRO
JR,
ALVES,
SOUZA,
RIBEIRO,
RAWET,
NONOGAKI,
RODRIGUES, GAMA (2000) correlacionaram a expressão de p53 e Ki-67 com
parâmetros clinicopatológicos, resposta ao tratamento e prognóstico em pacientes
com adenocarcinoma de reto distal. Todos os pacientes receberam radioterapia e
quimioterapia (5-FU + leucovorin). Os pacientes com resposta completa foram
acompanhados sem tratamento cirúrgico, enquanto a ressecção foi realizada
naqueles com resposta parcial. A hiperexpressão do p53 foi detectada em 56,9%
dos tumores e alto índice de proliferação (Ki-67) foi observado em 50% dos tumores.
O LI de Ki-67 foi de 49,2 ± 20,3 (variando de 10 a 90%) das células tumorais.
Reatividade ao p53 e Ki-67 correlacionou-se com recidiva da doença, contudo não
se associou com idade, sexo, estádio TNM e doença residual após quimioterapia e
radioterapia. As expressões de p53 e Ki-67 associaram-se com menores índices de
sobrevivência geral e intervalo livre de doença.
SCHOLZEN, GERDES (2000) afirmaram que o antígeno Ki-67 é encontrado
apenas no núcleo durante a intérfase, sendo encontrado em sua maior parte na
superfície dos cromossomos durante a mitose. O fato de a proteína estar presente
em todas as fases ativas do ciclo celular (G1, S, G2 e mitose) e ausente em células
em repouso (G0) faz do Ki-67 um excelente marcador para determinar a fração de
crescimento de uma determinada população celular. A fração de células tumorais Ki67-positivas está frequentemente correlacionada com o curso clínico da doença.
REVISÃO DA LITERATURA 10
Apesar de sua função ainda não estar bem esclarecida, há indicações de que a
expressão da proteína Ki-67 seja uma exigência para a ocorrência do ciclo celular.
JUNG, SCHRAUDER, OSWALD, KNOLL, SELLBERG, PALMQVIST,
NIEDOBITEK, BRABLETZ, KIRCHNER (2001) estudaram a frente invasiva de
adenocarcinomas colorretais bem diferenciados, que são conhecidas como zonas de
baixa proliferação celular e expressam p16INK4A, um inibidor do ciclo celular.
Investigou-se a expressão de -catenina nuclear, ciclina D1, p16INK4A e Ki-67 em
adenocarcinomas colorretais bem diferenciados, comparando-se frentes invasivas
(com presença de -catenina nuclear) às áreas centrais do tumor (sem presença de
-catenina nuclear). A frente invasiva apresentou baixa expressão de Ki-67,
indicando baixas taxas de proliferação celular. Ainda, verificou-se a expressão de catenina nuclear, ciclina D1 e p16INK4A nesta região. Desta forma, a função da catenina e de seu gene-alvo, a ciclina D1, parece não estar relacionada à indução
da proliferação de células tumorais em CCR.
BROWN, GATTER (2002) afirmaram que a correlação entre a expressão da
proteína Ki-67 e a sobrevida dos pacientes varia nos diferentes tipos tumorais.
Algumas neoplasias, como as do intestino grosso, parecem apresentar pouca
correlação. Dois estudos de carcinoma colorretal cujo resultado mostrou correlação
entre estes fatores foram contraditórios. PALMQVIST, SELLBERG, OBERG,
TAVELIN, RUTEGARD, STENLING (1999) concluíram que o prognóstico de
carcinomas colorretais com baixa expressão da proteína Ki-67 na margem invasiva é
ruim. No entanto, o estudo de KIMURA, TANAKA, HARUMA, SUMII, KAJIYAMA,
SHIMAMOTO, KOHNO (2000) chegou a conclusão de que tumores com altos níveis
de expressão de Ki-67 na área de invasão mais profunda apresentam prognóstico
pior. Estes achados aparentemente contraditórios podem ser o resultado da
heterogeneidade de expressão da proteína Ki-67 em carcinomas colorretais.
SCOPA, TSAMANDAS, ZOLOTA, KALOFONOS, BATISTATOU, VAGIANOS
(2003) propuseram a investigação de apoptose e proliferação celular e sua relação
em marcadores prognósticos clássicos em 117 pacientes com carcinoma colorretal.
Analisaram a expressão imunoistoquímica de Ki-67, Bcl-2 e apoptose através do
método TUNEL. Houve correlação positiva entre apoptose e proliferação celular (Ki-
REVISÃO DA LITERATURA 11
67). Concluíram que apenas o estadiamento e o grau tumoral constituem fatores
prognósticos independentes no CCR.
DUCHROW, ZIEMANN, WINDHOVEL, BRUCH, BROLL (2003) estudaram a
expressão do Ki-67 e de seu RNA mensageiro (mRNA) em carcinoma colorretal
através das técnicas de hibridização in situ e pesquisa de MIB1. Em 32 dos 47
adenocarcinomas investigados, a expressão do Ki-67 e seu mRNA correlacionaramse de acordo com o esperado. Nos casos restantes, mais de 30% das células
expressavam o antígeno Ki-67, mas não seu mRNA, possivelmente devido ao
interrompimento do ciclo celular. Os pacientes deste grupo tiveram um prognóstico
significativamente melhor. Desta forma, os autores concluíram que tumores com
altos níveis de Ki-67 e baixa expressão de seu mRNA proliferam-se mais devagar do
que calculado apenas com base no índice de positividade ao Ki-67, o que
possivelmente explica a melhor evolução clínica dos pacientes.
SEONG, CHO, YANG, CHUNG, KIM (2004) estudaram a apoptose e
proliferação celular em adenocarcinomas colorretais primários e suas metástases
hepáticas,
analisando
os
índices
de
apoptose
espontânea
(medido
pela
porcentagem de células com núcleo apoptótico) e de proliferação celular (medido
pelo Índice de Marcagem do Ki-67). Os índices de apoptose espontânea dos
tumores primários e metastáticos não diferiram estatisticamente. No entanto, o
índice médio de proliferação celular dos tumores primários foi superior ao de suas
metástases (23.9±3.4 e 16.4±2.5, respectivamente). Os resultados deste estudo
podem explicar parcialmente o comportamento indolente das metástases hepáticas
de câncer colorretal e fornecer princípios científicos para o tratamento de ambos os
tumores.
ROSATI, CHIACCHIO, REGGIARDO, DE SANCTIS, MANZIONE (2004)
determinaram se as expressões p-53, Ki-67 e outros marcadores tumorais em 103
pacientes com adenocarcinoma de cólon estádio Dukes B e C correlacionaram-se
com sobrevida livre de doença e sobrevida global. A análise multivariada de
sobrevida global demonstrou que no estádio C, o p53 negativo e o Ki-67 positivo
foram associados com menor sobrevida global, contribuindo para a caracterização
do prognóstico nestes pacientes.
IHMANN,
LIU,
SCHWABE,
HAUSLER, BEHNKE,
BRUCH,
BROLL,
WINDHOVEL, DUCHROW (2004) examinaram a expressão de Ki-67 e seu RNA
REVISÃO DA LITERATURA 12
mensageiro em carcinoma colorretal correlacionando-o ao curso clínico dos
pacientes. Foram determinados o LI médio do Ki-67 (31.3%) e o nível médio de
mRNA em amostras de carcinoma colorretal primário de pacientes tratados somente
com a ressecção cirúrgica. Altos níveis de mRNA foram significativamente
associados a prognóstico favorável, enquanto o índice de positividade ao Ki-67 não
correlacionou-se ao prognóstico. Uma análise multivariada de fatores clínicos e
biológicos indicou serem o estágio tumoral e o mRNA de Ki-67 fatores prognósticos
independentes. Assim, a determinação quantitativa do mRNA de Ki-67 desponta
como um novo e bom marcador prognóstico para o carcinoma colorretal primário.
HILSKA, COLLAN, LAINE, KOSSI, HIRSIMAKI, LAATO, ROBERTS (2005)
investigaram marcadores biológicos tumorais (p53, Ki-67, ciclina D1, entre outros)
associados a apoptose e proliferação celular com a finalidade de definir indicadores
prognósticos para os cânceres retal e de cólon. O estudo foi feito através da análise
de amostras de câncer retal ou de cólon primários de 363 pacientes. Em câncer
retal, observou-se que pacientes com índice de positividade ao Ki-67 maiores ou
iguais a 5% apresentavam melhor prognóstico do que aqueles com índices
inferiores. Ainda, a expressão citoplasmática de p53 também se correlacionou a
cursos clínicos favoráveis. Em câncer de cólon, a expressão de ciclina D1 nuclear
correlacionou-se com melhor sobrevida. Os autores chegaram à conclusão de que
os cânceres em questão apresentam comportamentos biológicos diferentes, sendo
necessários mais estudos para elucidar a significância destes marcadores no
prognóstico.
2.2 CASPASE-3
ARMSTRONG, AJA, XIANG, GAUR, KREBS, HOANG, BAI, KORSMEYER,
KARANEWSKY, FRITZ, TOMASELLI (1996) demonstraram que a protease indutora
de apoptose CPP32, também denominada caspase-3, é inibida por Bcl-2 e por
inibidores de proteases da família das enzimas conversoras de interleucina-1b. A
proenzima CPP32 (pró-caspase-3) é proteoliticamente processada e ativada em
células de Jurkat induzidas à morte pela estimulação de Fas. A ativação da CPP32 é
bloqueada por inibidores das cisteíno-proteases direcionadas ao aspartato,
sugerindo que a pro-CPP32 é clivada pela CPP32 ativa ou por outros membros da
REVISÃO DA LITERATURA 13
família das enzimas conversoras de interleucina-1b. A expressão heteróloga do Bcl2 em células de Jurkat inibe a morte induzida por Fas, bem como o processamento e
ativação proteolítica da CPP32. Dessa forma, o Bcl-2 age sobre ou contra a ativação
da CPP32 com a finalidade de inibir a apoptose induzida pela estimulação de Fas.
COHEN (1997) afirmou que desde o reconhecimento de semelhanças entre
a proteína CED-3 do nematódeo Caenorhabditis elegans e a cisteíno-protease ICE
de mamíferos, foi identificada uma família de mais de 10 cisteíno-proteses: as
caspases. Estas enzimas são caracterizadas por especificidade ao ácido aspártico,
clivando proteínas sempre após um resíduo deste aminoácido. As caspases são
sintetizadas como enzimas inativas, sendo que a estrutura cristalina da caspase-1 e
caspase-3 mostra que a enzima ativa é um heterotetrâmero. A ativação das
caspases durante a apoptose resulta em clivagem de substratos celulares críticos,
desencadeando as alterações morfológicas dramáticas deste evento. A apoptose
induzida por CD95 e TNF ativa a caspase-8, tendo por mediador o FADD,
estabelecendo um elo entre os receptores de morte celular e as caspases e
desencadeando uma cascata de reações que ativam uma hierarquia de caspases.
CHENG, KIRSCH, CLEM, RAVI, KASTAN, BEDI, UENO, HARDWICK (1997)
relataram a conversão de Bcl-2 em um efetor de morte celular semelhante a Bax
pelas caspases. Experiências in vitro com células superexpressando caspase-3
demonstraram a ocorrência de clivagem do domínio em forma de alça da proteína
Bcl-2 após um resíduo de ácido aspártico por esta caspase, ocorrendo isto também
após indução de apoptose pela ativação do receptor Fas e retirada de interleucina-3.
O produto de clivagem carboxi-terminal da proteína Bcl-2 desencadeou a morte
celular e acelerou a apoptose induzida pelo vírus Sindbis. É possível que a clivagem
de Bcl-2 resulte em ativação de caspases e contribua para a ampliação da cascata
destas enzimas. Proteínas Bcl-2 mutantes resistentes a clivagem apresentaram
proteção aumentada à retirada de interleucina-3 e apoptose induzida pelo vírus
Sindbis. Dessa forma, a clivagem de Bcl-2 pelas caspases pode assegurar a
inevitabilidade da morte celular.
LIU, ZOU, SLAUGHTER, WANG (1997) identificaram e purificaram uma
proteína que induz fragmentação de DNA após ser clivada pela caspase-3.
Designada Fator de Fragmentação de DNA (DFF), esta proteína é um heterodímero
cujas subunidades apresentam massa de 40 e 45 kDa, A caspase-3 cliva a
REVISÃO DA LITERATURA 14
subunidade de 45 kDa em dois sítios, resultando em um fator ativo que produz
fragmentação do DNA sem necessidade da caspase-3 ou qualquer outra proteína
citossólica. Estes dados delineiam um caminho de transdução direta do sinal durante
a apoptose: de caspase-3 a DFF a fragmentação do DNA.
MEDINA, EDMONDS, YOUNG, JAMES, APPLETON, ZALEWSKI (1997)
demonstraram que o butirato induz um programa de apoptose em uma linhagem
celular de câncer colorretal e em células linfóides de Jurkat. Este programa é
estritamente dependente da síntese de novas proteínas e leva à ativação da
caspase-3,
resultando
em
morte
celular.
Células
preparadas
com
baixa
concentração de butirato (sem ativação da caspase-3), apresentaram alta
suscetibilidade a indução da apoptose pela estaurosporina, um agente causador de
liberação mitocondrial de citocromo c, devendo-se este fato à presença de um fator
no citossol destas células que aumenta em mais de sete vezes a ativação da
caspase-3 induzida por citocromo c e dATP. Os autores propõem que mudanças
induzidas pelo butirato à estrututura da cromatina ocasionam a expressão de uma
proteína que facilita a via pela qual a mitocondria ativa a caspase-3, desencadeando
a apoptose de células de câncer linfóide e colorretal.
ADACHI, TAKETANI, OYAIZU, IKEBUKURO, TOKUNAGA, IKEHARA (1999)
estudaram a apoptose em adenocarcinoma colorretal induzida por 5-FU e/ou IFN- γ
através da caspase-3 e -8. Sabe-se que o efeito citotóxico do 5-FU baseia-se em
sua capacidade de induzir a apoptose, sendo sua ação potencializada pelo IFN- γ. O
papel mediador das caspases na indução da apoptose por 5-FU e IFN-γ foi
examinado utilizando uma linhagem celular de adenocarcinoma colorretal,
observando-se aumento da atividade das caspase-3 e -8. Todas as células
apoptóticas apresentaram atividade aumentada da caspase-3, independentemente
do fator estimulante. Apesar dos inibidores de caspase-3/-8 inibirem a apoptose,
anticorpos anti-Fas ligante não afetam a apoptose induzida por 5-FU, mostrando o
papel crucial das caspases-3 e -8 no processo apoptótico estudado, independente
do sistema Fas-Fas ligante.
SCHLOTTMANN,
WACHS,
KRIEG,
KULLMANN,
SCHÖLMERICH,
ROGLER (2000) estudaram os efeitos de diferentes sais biliares sobre a apoptose
em linhagens de câncer de cólon. A incubação destas células em concentrações
fisiológicas de ácido desoxicólico levou a indução de apoptose, ocorrendo clivagem
REVISÃO DA LITERATURA 15
e ativação das caspases -2, -3, -7 e -8 após 30 minutos. A ativação de caspase e da
apoptose induzida pelos sais biliares foi revertida por inibidores de caspase seletivos
e de amplo espectro. Ao contrário do que ocorre nos hepatócitos, na morte celular
mediada por desoxicolato não ocorre participação de CD95 (Fas). Além disso, o
ácido ursodesoxicólico não apresentou efeito citoprotetor (anti-apoptótico). Os
resultados questionam a participação dos sais biliares na carcinogênese colorretal.
JONGES, NAGELKERKE, ENSINK, VAN DER VELDE, TOLLENAAR,
FLEUREN, VAN DE VELDE, MORREAU, KUPPEN (2001) estudaram a correlação
entre atividade da caspase-3 e prognóstico no câncer colorretal, em relação a
diferentes fatores envolvidos na indução de apoptose. Alta atividade de caspase-3
correlacionou-se a maior recorrência do câncer, sendo preferencialmente encontrada
do lado direito do cólon. Não houve correlação entre alta atividade de caspase-3 e
expressão alterada de p53, -catenina ou genes do sistema de reparo de DNA,
indicando não existir correlação evidente entre a atividade da caspase-3 e a via de
sinalização Wnt ou alterações do sistema de reparo. A atividade desta caspase
correlacionou-se significativamente com as células tumorais infiltrativas CD571.
Apesar dos resultados, a relevância do nível de intensidade apoptótica no curso
clínico da doença ainda não está clara.
ZIMMERMANN & GREEN (2001) revisaram a morte celular apoptótica e as
duas vias principais pelas quais esta se processa: a dos receptores de morte celular
e a mitocondrial. A primeira envolve a interação do receptor de morte (como o RTNF-1 ou o receptor Fas) com seu ligante. A segunda via depende de estímulos
celulares internos que alteram a permeabilidade mitocondrial, com conseqüente
liberação de citocromo-c, o qual participa ativamente da indução apoptótica. Esta via
é regulada por membros da família do Bcl-2. O resultado final de qualquer uma das
vias é ativação das caspases e clivagem de substratos celulares específicos,
resultando nas alterações bioquímicas e morfológicas associadas ao fenótipo
apoptótico. O papel das caspases é ordenar e conduzir a apoptose e suas
alterações.
DZIEGIEL, DUMANSKA, FORGACZ, WOJNA, ZABEL (2004) analisaram a
apoptose pela técnica TUNEL, relacionando-a à expressão doa marcadores
caspase-3 e Ki-67 com o objetivo de avaliar sua relação com a sobrevida de
pacientes portadores de adenocarcinoma colorretal. Os resultados revelaram fraca
REVISÃO DA LITERATURA 16
correlação entre a intensidade apoptótica e a expressão de seus marcadores em
células de adenocarcinoma colorretal. A sobrevida dos pacientes foi menor quando a
apoptose e a expressão de Ki-67 foram intensas, não ficando evidenciada nenhuma
correlação entre a sobrevida dos pacientes e a expressão de caspase-3.
2.3 ANÁLISE COMPUTADORIZADA DE IMAGEM
KUBOTA, PETRAS, EASLEY, BAUER, TUBBS, FAZIO (1992) usaram a
expressão imunoistoquímica do Ki-67 para mensurar a fração de crescimento celular
em carcinoma colorretal. Analisaram 100 casos de carcinoma de cólon. A área
nuclear com expressão de Ki-67 e a área total do núcleo foram analisados em 20
campos microscópicos e mensurados através de
análise citomorfométrica
computadorizada. O escore do Ki-67 foi calculado e as características do paciente
analisadas. Os escores de Ki-67 por esta análise foram mais altos em pacientes com
estadiamento Dukes A e não se relacionaram com o índice de sobrevida e
prognóstico.
CHENG, WERNESS, BABB, MEROPOL (1999) correlacionaram as
expressões de dois inibidores de quinase dependente de ciclina (CDI) - p27kip1 e
p21waf1/cip1 - com a expressão de Ki-67, sobrevida e resposta à quimioterapia em
pacientes com câncer de cólon avançado metastático. Os pesquisadores utilizaram
material incluído em parafina para a confecção de lâminas, corando-as através de
imunoistoquímica com anticorpos para ambos os CDIs e Ki-67. Dois métodos de
interpretação foram utilizados para avaliação das lâminas: (1) inspeção visual
(método semi-quantitativo), realizada por consenso entre dois observadores sem
conhecimento prévio dos dados clínicos dos pacientes; (2) análise computadorizada
de imagem (método objetivo), realizada pelo sistema SAMBA 4000. O estudo
detectou correlações positivas entre Ki-67 e ambos CDIs, e uma tendência a
intensas colorações para CDI poderem indicar prognósticos piores.
MADY, MELHEM (2002) estudaram 100 cânceres colorretais através de
imunoistoquímica e um método de análise computadorizada de imagem para avaliar
a expressão de FHIT, um gene supressor de tumor, e as taxas de apoptose em
neoplasias e sua mucosa correspondente. Foram preparadas lâminas a partir de
tecidos parafinizados, submetendo-as à análise pelo SAMBA 4000 para avaliar o
REVISÃO DA LITERATURA 17
Índice de Marcagem e a Densidade Óptica Média do tecido corado. Os autores
concluíram que o método de análise computadorizada de imagem fornece uma
avaliação objetiva e precisa dos padrões da coloração tecidual. Por gerar dados
numéricos, este método torna-se um instrumento mais eficaz de avaliação da
intensidade de coloração tecidual do que a simples análise subjetiva da microscopia
óptica.
YAMAMOTO, BUDEL, GASPARIN JÚNIOR, ARAÚJO, SCHUH, SALLES
JUNIOR, INÁCIO, CORRÊA NETO, MINIOLI, SATO, ARAÚJO (2002) realizaram um
estudo envolvendo 69 pacientes para determinar características citofotométricas dos
núcleos das células do colo uterino. Após confirmação de infecção pelo HPV e
quantificação das partículas virais, realizou-se citofotometria pela coloração de
Feulgen e uso do sistema SAMBA 4000. O software do sistema Samba calculou 15
parâmetros nucleares, subdivididos em 3 grupos de variáveis (morfométrica,
densitométricas e texturais), para o estudo comparativo dos respectivos núcleos.
Assim, concluiu-se que a citofotometria do DNA nuclear das células do colo uterino
foi capaz de diferenciar células infectadas ou não pelo HPV, em diferentes níveis de
sensitividade e especificidade, segundo os diversos parâmetros analisados.
3 MATERIAL E MÉTODO
MATERIAL E MÉTODO 19
O presente estudo foi realizado no Instituto de pesquisas Médicas (IPEM)
do Hospital Universitário Evangélico de Curitiba/ Faculdade Evangélica do Paraná
e no Laboratório de Citologia e Histologia Ltda - CITOLAB, em Curitiba/Paraná.
Aplicaram-se as Normas para apresentação de trabalhos da Universidade Federal
do Paraná (2001). Foram empregadas as normas para referências bibliográficas
(NBR-6023) e de abreviaturas de títulos e periódicos (NR-6032) da Associação
Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) de 2003 e a Nômina Histológica de 1975,
assim como as Normas para Apresentação Gráfica de Dados e Tabelas, do
Instituto Paranaense de Desenvolvimento Econômico e Social – IPARDES. Este
trabalho foi avaliado e aprovado pelo comitê de ética da Sociedade Evangélica
Beneficente – SEB.
3.1 AMOSTRA E SELEÇÃO
O número total de blocos de adenocarcinoma de cólon disponibilizados para
este estudo foi de 60. Entretanto, apenas 55 apresentavam laudo confirmatório e
material adequado para estudo imunoistoquímico. Foram confeccionadas 110
lâminas com a técnica de imunoistoquímica para caspase-3 e Ki-67. Destas, 37
foram lidas pelo Sistema IMMUNO 4.00, sendo 18 lâminas de Ki-67 e 19 lâminas de
caspase-3.
Todos os tumores estavam identificados e processados de acordo com
técnicas histológicas de rotina, tendo sido fixados em solução de formol,
tamponados e emblocados em parafina.
As coletas foram obtidas do Serviço de Anatomia Patológica do Hospital das
Forças Armadas, da cidade de Brasília-DF. As amostras que constituíram a
casuística deste estudo foram selecionadas entre aquelas que apresentaram
confirmação diagnóstica através de critérios histológicos de adenocarcinoma de
cólon, e estavam adequadas para a realização da técnica de imunomarcagem.
MATERIAL E MÉTODO 20
3.2 DELINEAMENTO DO ESTUDO
O estudo foi retrospectivo com delineamento tipo transversal não controlado.
3.3 HISTOLOGIA
3.3.1 Processamento Histológico
Os tumores estudados estavam emblocados em parafina de acordo com as
descrições técnicas de BANCROFT E STEVENS (1977) e SPENCER (1982).
3.3.2 Avaliação Histológica
Cada bloco histológico foi submetido à nova microtomia para obtenção de
novos cortes com espessura de 3m. A seguir, foram corados com a técnica de
hematoxilina e eosina (H/E) e reavaliados independentemente por dois patologistas
para se obter a confirmação do laudo histológico efetuado previamente. Os casos
em que não houve concordância total entre os dois observadores foram submetidos
à avaliação por outro patologista.
3.4 IMUNOISTOQUÍMICA
3.4.1 Procedimento Imunoistoquímico
A imunoexpressão das proteínas Ki-67 e caspase-3 foi obtida através do
método imunoenzimático da streptoavidina-biotina-peroxidase. Este consistiu nas
seguintes etapas: inicialmente foram obtidos cortes histológicos de 3m do material
emblocado em parafina, sendo estes estendidos sobre lâminas previamente limpas,
desidratadas e silanizadas. Em seguida, este material foi colocado em estufa a 37ºC
pelo período noturno para desfragmentação da parafina. O passo seguinte foi a
desparafinização da lâmina com dois banhos de xilol com duração de dez minutos
cada. Seguiu-se a isto a hidratação do material com etanol absoluto, depois a 70%
MATERIAL E MÉTODO 21
em banhos de 03 minutos e, na sequência, 02 banhos de um minuto em água
destilada para a remoção dos pigmentos formólicos.
A próxima etapa foi a de recuperação antigênica. Cabe ressaltar que para a
recuperação do antígeno contido no tecido e quebra das ligações cruzadas
provocadas pelo formol, os cortes foram submetidos à solução de ácido cítrico na
concentração de 0,01M (21,01g/1litro de água destilada) chamado de tampão A e
depois citrato de sódio (29,41g/1litro de água destilada), tampão B. Tornando esta
mistura o Tampão Citrato com 9ml do tampão A e 41ml do tampão B em 450ml de
água destilada, que ficaram por 20 minutos em banho-maria a 97°C de temperatura.
Após o esfriamento da recuperação antigênica, os frascos com as lâminas foram
lavados em água corrente suave sem atingir os cortes por três vezes e em seguida
realizado o procedimento de bloqueio da peroxidase endógena (PERHIDROL 30%
de H202 PA, ISSO) - Total de 10 minutos.
Os frascos foram lavados na seqüência, juntos com as lâminas em água
corrente e colocadas em solução tampão PBS 0,2M. Em seguida realizou-se o
procedimento de cobertura de todo o corte com o anticorpo escolhido e para cada
um existe a diluição própria com o Antibody Diluent, (código S3022, Dako), sendo o
Ki-67 na diluição de 1:100, e a caspase-3,
na diluição de 1:500 usando na
quantidade de 50 a 80 l, na dependência do tamanho de cada corte, que já foram
previamente preparados e circulados com caneta hidrofóbica. Estas lâminas foram
colocadas em bandejas próprias e condicionadas em câmara úmida a 4ºC por 18
horas (overnight). No dia seguinte as lâminas foram lavadas com água destilada e
seguida de um banho de tampão PBS por 05 minutos, sendo que na seqüência
realizou-se a incubação com Kit Dako LSAB+, Peroxidase-Universal-110ml (código
K0690, Dako) - cor amarela - por 30 minutos. Na seqüência veio outro banho de
PBS por 05 minutos, depois a incubação com streptoavidina - HRP (código K0377A,
Dako) - cor vermelha - por 30 minutos. Um terceiro e último banho de PBS por 05
minutos foi então realizado. Existiu uma antepenúltima operação que foi a
preparação e coloração com cromógeno diaminobenzidina (DAB) (código K3468,
Dako) Sistema susbtrato-cromógeno, que durou em torno de 20 minutos e a
proporção deste com a solução tampão foi de 1 gota/ml. Os cortes foram contracorados em hematoxilina de Mayer durante 35 segundos e lavados brevemente em
água corrente. As lâminas seguiram para desidratação em bateria de etanol durante
MATERIAL E MÉTODO 22
um minuto cada (respectivamente, 100%, 70%), seguida de diafanização em xilol e
montagem com lamínula para análise em microscópio de luz.
3.4.2 Anticorpos para Antígenos Ki-67 e caspase-3
Utilizaram-se os anticorpos primários clone MIB-1 (código M7240, Dako) anticorpo monoclonal de camundongo anti-Ki-67 humano e para caspase-3 (código
A3537, Dako) - anticorpo policlonal de coelho anti-CPP32 humano. O aspecto
histológico na avaliação imunoistoquímica destes marcadores em adenocarcinoma
de cólon está representado nas figuras 1e 2.
FIGURA 1 – IMUNOISTOQUÍMICA PARA CASPASE-3
LEGENDA: Caso F35. Aumento 100X.
NOTA: A coloração marrom indica a presença de caspase-3.
MATERIAL E MÉTODO 23
FIGURA 2 – IMUNOISTOQUÍMICA PARA Ki-67
LEGENDA: Caso F44. Aumento 100X.
NOTA: A coloração marrom indica a presença de Ki-67.
3.4.3 Critérios de Avaliação
3.4.3.1 Análise qualitativa da imunoistoquímica
O
estudo
imunoistoquímico
convencional
foi
realizado
utilizando-se
®
microscópio óptico NIKON com aumento de 100 a 400 vezes.
3.4.3.2 Análise quantitativa da imunoistoquímica
Foi utilizado O sistema SAMBA 4000® (Sistema de análise microscópica de
busca automática), desenvolvido pela Alcatel (Grenoble - França). Imagens
microscópicas são captadas pelo hardware e interpretadas por softwares.
Seis unidades compõem o hardware: microscópio, câmera de vídeo,
microcomputador, impressora e dois monitores (figura 3).
MATERIAL E MÉTODO 24
FIGURA 3 - SISTEMA SAMBA 4000 – HARDWARE
LEGENDA:
®
®
(1) Computador Pentium III , com Software IMMUNO 4.00
®
(2) Microscópio Axioskop
®
(3) Câmera DXC-970M3CCD
®
(4) Impressora Deskjet 680 C
(5) Monitores de Vídeo
O microscópio utilizado no estudo foi da marca Axioskop® (Zeiss/Alemanha).
Um potenciômetro que avalia com precisão a quantidade de luz controla o fluxo
luminoso oriundo da lâmpada de xenônio. Este feixe atravessa o condensador, a
lâmina histológica, a objetiva em uso e então, é separado em duas partes: uma via
destinada à observação visual através da ocular do microscópio e a outra é a via de
captação da imagem, pela câmara de vídeo, a qual é enviada ao monitor acoplado
ao computador.
As cores verde, azul e vermelha são padronizadas de forma que o sistema
trabalha com o mesmo nível de captação previamente determinado, isto é
conseguido através da câmera de vídeo DXC-970M3CCD® (Sony/Japão). Um
computador Pentium III® (Intel/EUA) foi utilizado no estudo, com 16Mb de RAM e
disco rígido de 12 gigabytes, que realizou as funções de importação das imagens do
microscópio e da câmera de vídeo, e da execução do software utilizado, o IMMUNO
4.00® do sistema SAMBA 4000, e a transferência dos dados para impressão.
A impressora foi Deskjet 680 C® (HP/ EUA).
MATERIAL E MÉTODO 25
Foi realizada a calibração do sistema SAMBA 4000 de acordo com as
seguintes etapas:
a) aquisição da imagem;
b) processamento e digitalização da imagem;
c) binarização da imagem;
d) segmentação da imagem;
e) identificação do objeto de interesse;
f) seleção e reconhecimento do objeto;
g) análise da imagem;
Imagens numéricas são obtidas através da transformação das imagens
analógicas, tais quais são percebidas, e que são captadas pela câmera.
Esta análise tem por finalidade transformar as imagens coradas pelo
marcador em matriz numérica e, a partir desta, calcular parâmetros matemáticos que
permitam a análise numerizada das imagens microscópicas.
As imagens processadas pelo sistema computadorizado são digitalizadas
em pixels. Este processo confere um valor para cada ponto-imagem (pixel). A luz
absorvida pelo tecido em cada segmento é quantificada. A quantificação da luz
absorvida é expressada através de uma escala de variações de níveis de cinza que
vai do 0 (preto) ao 255 (branco). Este processo corresponde a numerização da
imagem, que envolve duas etapas: geração da matriz em tons de cinza e
transformação desta em matriz numérica binária (TRUE, 1996).
3.4.3.3 Procedimento de leitura
Para otimização do aproveitamento das imagens em cada lâmina, seguiu-se
a metodologia a qual consiste no rastreamento dos campos visuais com o
procedimento de leitura sendo realizado em hot spots (figura 4).
MATERIAL E MÉTODO 26
FIGURA 4 – HOT SPOTS
LEGENDA: Delineada a área em círculo (cor azul), representando um hot spot. Superior: caspase-3.
Inferior: Ki-67.
Foi utilizada objetiva com aumento de 20 vezes em 9 a 10 campos por
lâmina, para identificar e quantificar, no núcleo celular, os marcadores para
proliferação e em número que variou de 8 a 10 campos para identificar e quantificar,
no citoplasma, os marcadores da apoptose.
O total de superfícies examinadas variou de 60000 a 120000 µm2. O tempo
de leitura para cada lâmina foi de aproximadamente 40 minutos. Esta metodologia
foi obtida e qualificada pelo laboratório da Universidade Livre de Bruxelas, Bélgica e
tem sido aplicada no Instituto de Pesquisas Médicas do Hospital Universitário
Evangélico de Curitiba.
3.4.3.4 Parâmetros analisados pelo sistema SAMBA 4000
O software IMMUNO 4.00 foi utilizado para leitura e nas áreas selecionadas
gerou-se dois parâmetros quantitativos de coloração imunoistoquímica: Índice de
Marcagem e Densidade Óptica Média.
O Índice de Marcagem (LI, Labeling Index) descreve a porcentagem de área
tecidual especificamente marcada pela prova imunoistoquímica. A Densidade Óptica
Média (MOD, Mean Optical Density) denota a intensidade de coloração de forma
proporcional, medida por pixels positivos e expressada em número absoluto.
Uma lâmina considerada controle-negativo, na qual os marcadores caspase3 e Ki-67 são omitidos, é utilizada para padronizar o sistema de análise microscópica
computadorizada de imagens, e os parâmetros já descritos são analisados.
As diferentes variáveis calculadas pela quantificação do marcador
imunoistoquímico através da imagem computadorizada permite, em um mesmo
MATERIAL E MÉTODO 27
momento, observar a área da superfície analisada e a intensidade de marcação da
mesma.
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Após a análise dos parâmetros estabelecidos pelo programa computacional
do sistema SAMBA 4000 (LI e MOD em cada amostra de tecido) utilizou-se os
programas Microsoft Excel para a criação do banco de dados, e Statistical Package
for Social Science (SPSS) 11.5 para a realização dos cálculos estatísticos.
O nível de significância foi fixado em 5%. O teste de Kolmogorov-Smirnov foi
utilizado para verificar a normalidade dos dados. Em seguida utilizou-se o teste tStudent para grupos pareados a fim de verificar a existência de diferença
significativa entre os Índices de Marcagem e as Densidades Ópticas Médias dos
marcadores Ki-67 e caspase-3. Por fim utilizou-se o coeficiente de Pearson para
verificar a existência de correlação entre as variáveis LI e MOD do mesmo marcador,
e entre os Índices de Marcagem e as Densidades Ópticas Médias do Ki-67 e da
caspase-3.
4 RESULTADOS
RESULTADOS 29
4.1 EXPRESSÃO DE KI-67
Para a variável Índice de Marcagem (LI), parte das lâminas analisadas
apresentou 15 a 30% ou 45 a 60% de células positivas para este marcador (27,78%,
n=5, em ambos os casos). Outra parte das lâminas apresentou 60 a 75% de células
positivas (22,22%, n=4) (gráfico 1).
GRÁFICO 1 - DISTRIBUIÇÃO DO ÍNDICE DE MARCAGEM PARA KI-67
6
5
4
NÚMERO
3
DE CASOS
2
1
0
15
30
45
60
75
90
>90
ÍNDICE DE MARCAGEM (%)
FONTE: CITOLAB/IPEM
Para a variável Densidade Óptica Média (MOD), parcela importante das
lâminas apresentou pontuação 30 a 35 (33,33%, n=6) ou 25 a 30 (22,22%, n=4)
(gráfico 2). A figura 5 ilustra a expressão de Ki-67 no adenocarcinoma de cólon em
avaliação imunoistoquímica.
RESULTADOS 30
GRÁFICO 2 - DISTRIBUIÇÃO DO ÍNDICE DE MARCAGEM PARA KI-67
6
5
4
NÚMERO
DE CASOS 3
2
1
0
10
15
20
25
30
35
40
DENSIDADE ÓPTICA MÉDIA
FONTE: CITOLAB/IPEM
FIGURA 5 – IMUNOISTOQUÍMICA PARA Ki-67
LEGENDA: Caso F44. Aumento 400X.
NOTA: O Ki-67 apresenta marcação predominante no núcleo celular (seta).
>40
RESULTADOS 31
4.2 EXPRESSÃO DE CASPASE-3
Para o LI, parte das lâminas analisadas apresentou 85 a 90% de células
positivas (36,84%, n=7). Outra parcela considerável das lâminas apresentou 70 a
75% ou 95 a 100% de células positivas (21,05%, n=4, em ambos os casos) (gráfico
3).
GRÁFICO 3 - DISTRIBUIÇÃO DO ÍNDICE DE MARCAGEM PARA CASPASE-3
8
7
6
5
NÚMERO
4
DE CASOS
3
2
1
0
70
75
80
85
90
95 100
ÍNDICE DE MARCAGEM (%)
FONTE: CITOLAB/IPEM
Para a MOD, grande parte das lâminas apresentou pontuação 45 a 50
(31,58%, n=6), vindo em seguida o intervalo 30 a 35 (21,05%, n=4) (gráfico 4). A
figura 6 ilustra a expressão de caspase-3 no adenocarcinoma de cólon em avaliação
imunoistoquímica.
RESULTADOS 32
GRÁFICO 4 - DISTRIBUIÇÃO DO ÍNDICE DE MARCAGEM PARA CASPASE-3
6
5
4
NÚMERO
3
DE CASOS
2
1
0
25
30
35
40 45
50 >50
DENSIDADE ÓPTICA MÉDIA
FONTE: CITOLAB/IPEM
FIGURA 6 – IMUNOISTOQUÍMICA PARA CASPASE-3
LEGENDA: Caso F35. Aumento 400X.
NOTA: A caspase-3 apresenta marcação predominante no citoplasma (setas).
RESULTADOS 33
Como em todos os testes para avaliação da distribuição dos dados os
valores de p indicaram a não rejeição da hipótese nula de normalidade, considera-se
que os dados apresentam distribuição normal (apêndice - tabela 3).
4.3 COMPARAÇÃO ENTRE VARIÁVEIS DE KI-67 E CASPASE-3
A comparação da variável LI entre Ki-67, com média 52,56% ± 23,06%, e
caspase-3, com média 85,24% ± 8,71%, revelou diferença significativa entre os
grupos (p<0,001). A comparação da variável MOD, com média 30,82 ± 9,64 para Ki67, e 41,67 ± 10,78 para caspase-3, também revelou diferença significativa entre os
grupos (p=0,017). Esses dados estão descritos na tabela 1
TABELA 1 - PARÂMETROS DAS VARIÁVEIS DOS MARCADORES KI-67 E CASPASE-3
VARIÁVEIS
KI-67 (n = 18)
CASPASE-3 (n = 19)
(1)
t
p
Índice de Marcagem
Média
52,56
85,24
DP
23,06
8,71
Mediana
54,30
85,66
Minimo
16,98
71,41
Máximo
95,45
99,41
Média
30,82
41,67
Desvio Padrão
9,64
10,78
Mediana
33,31
42,68
Minimo
14,06
26,32
5,733
< 0,001
2,634
0,017
Densidade Óptica Média
Máximo
51,21
75,27
FONTE: Dados obtidos pelo autor.
NOTA: Valores de p inferiores a 0,05 (p<0,05) indicam diferença significativa.
(1) Teste t-Student para amostras pareadas.
4.4 CORRELAÇÃO ENTRE VARIÁVEIS
A utilização do coeficiente de correlação de Pearson demonstrou correlação
estatisticamente significante apenas entre o LI e a MOD da caspase-3 (p=0,013). Os
resultados das correlações entre estas variáveis para o Ki-67 e a caspase-3 estão
descritos na tabela 2 e nos gráficos 5 a 8.
RESULTADOS 34
TABELA 2 – CORRELAÇÃO DAS VARIÁVEIS PELO COEFICIENTE DE PEARSON
(1)
COMPARAÇÃO
r
p
Índ. de Marcagem (Ki-67) X Dens. Ópt. Média (Ki-67)
0,081
0,750
Índ. de Marcagem (cas-3) X Dens. Ópt. Média (cas-3)
0,559
0,013
Índ. de Marcagem (Ki-67) X Índ. de Marcagem (cas-3)
0,107
0,671
Dens. Ópt. Média (Ki-67) X Dens. Ópt. Média (cas-3)
0,446
0,063
FONTE: Dados trabalhados pelo autor.
NOTA: Valores de p inferiores a 0,05 (p<0,05) indicam a existência de correlação.
(1) Teste de correlação bivariada.
GRÁFICO 5 – CORRELAÇÃO ENTRE O ÍNDICE DE MARCAGEM E A DENSIDADE ÓPTICA MÉDIA
DO KI-67
60
Dens. Ópt. Média
50
40
30
20
10
0
0
20
40
60
Índ. de Marcagem
FONTE: Dados trabalhados pelo autor.
80
100
RESULTADOS 35
GRÁFICO 6 – CORRELAÇÃO ENTRE O ÍNDICE DE MARCAGEM E A DENSIDADE ÓPTICA MÉDIA
DA CASPASE-3
80
Dens. Ópt. Média
70
60
50
40
30
20
10
0
60
70
80
90
100
110
Índ. de Marcagem
FONTE: Dados trabalhados pelo autor.
GRÁFICO 7 – CORRELAÇÃO ENTRE OS ÍNDICES DE MARCAGEM DE KI-67 E CASPASE-3
110
caspase-3
100
90
80
70
60
10
20
30
40
50
60
Ki-67
FONTE: Dados trabalhados pelo autor.
70
80
90
100
RESULTADOS 36
GRÁFICO 8 – CORRELAÇÃO ENTRE AS DENSIDADES ÓPTICAS MÉDIAS DE KI-67 E
CASPASE-3
110
caspase-3
100
90
80
70
60
10
20
30
40
50
60
Ki-67
FONTE: Dados trabalhados pelo autor.
70
80
90
100
5 DISCUSSÃO
DISCUSSÃO 38
5.1 CARCINOGÊNESE COLORRETAL
Segundo BARCINSKI (2004), uma das necessidades dos organismos
multicelulares que permite a longevidade destes é, entre outros fatores, a evolução
de mecanismos capazes de permitir a proliferação celular quando esta é necessária.
No entanto, é de fundamental importância a capacidade de perceber e suprimir
qualquer evento molecular que leve ao descontrole desta proliferação.
A expansão clonal de uma célula transformada, o que em última análise
caracteriza a malignidade, depende de um descontrole de sua capacidade
proliferativa e de uma crescente incapacidade de morrer por apoptose. Dessa forma,
existem cada vez mais evidências, acumuladas principalmente pelos estudos
morfológicos e imunoistoquímicos de neoplasias humanas, de que a progressiva
resistência a apoptose é uma das características marcantes da maioria dos cânceres
(ZORNIG et al., 2001).
O processo de tumorigênese de qualquer tipo celular envolve o acúmulo de
alterações genômicas que promovem a seleção de células com comportamento
agressivo. Apenas 1 a 5% destas alterações são hereditárias, ocorrendo as demais
ao longo da vida. Uma mutação pode ocorrer espontaneamente em uma célula
durante seu crescimento ou desenvolvimento ou pode resultar da ação de fatores
mutagênicos, como os radicais livres de oxigênio e as radiações ionizantes. Para
que haja perda da função gênica é preciso que ambos os alelos sejam inativados,
uma vez que a maioria dos genes mantém sua funcionalidade mesmo com a
inativação de um dos alelos. Podem ser necessárias várias décadas para a
inativação de ambos os alelos dos genes relacionados à tumorigênese para a
evolução dos cânceres não hereditários, o que explica a maior incidência de
doenças como o câncer colorretal esporádico em indivíduos com idade mais
avançada.
Existem três diferentes classes de genes mutados nos cânceres. Em células
normais, os oncogenes estimulam a proliferação celular. Os genes supressores de
tumor são responsáveis pelo controle desta proliferação. Os genes de reparo do
DNA codificam enzimas que monitoram o material genético recém-duplicado e
corrigem eventuais erros ocorridos durante a replicação.
DISCUSSÃO 39
FEARON & VOGELSTEIN (1990) propuseram um modelo para a
carcinogênese colorretal em múltiplos passos denominado Seqüência AdenomaCarcinoma, o qual propõe que as mutações em genes supressores de tumor e
oncogenes que levam ao surgimento do câncer colorretal ocorrem em uma ordem
específica.
Na maioria das vezes, a primeira mutação a se processar no CCR ocorre no
gene supressor de tumor APC (Adenomatosis Polyposis of the Colon). A função
deste gene é a de inibição da atividade da proteína -catenina, que por sua vez está
relacionada ao estímulo de vias envolvidas com o crescimento e proliferação celular.
Alterações no APC geralmente estão associadas a um crescimento celular anormal,
permitindo o desenvolvimento de um epitélio hiperproliferativo. É preciso ressaltar
que o estudo de JUNG et. al (2001) sobre a frente invasiva de adenocarcinomas
colorretais bem diferenciados (zonas com presença de -catenina) demonstrou
baixas taxas de proliferação celular (medidas pela expressão de Ki-67), colocando
em questão a função da -catenina no CCR.
Vários outros genes estão relacionados com o processo de progressão do
adenoma para o carcinoma. O gene K-RAS (v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma 2 viral
oncogene homologue), quando mutado, codifica uma proteína que ativa uma
cascata de sinalização intracelular promovendo alterações neoplásicas, conforme
relatado por SOUZA (2001). O gene DCC (Deleted in Colorectal Carcinoma) codifica
a proteína homônima, responsável por manter adesão célula-à-célula. Assim, a
perda deste gene resulta em aumento do crescimento celular e disseminação de
metástases.
A mutação ou deleção do gene p53 constitui um dos passos finais para a
progressão do carcinoma, o que é reforçado pela sua raridade em adenomas. O
aumento dos níveis de seu produto, a proteína p53, promove a parada do ciclo
celular para a correção de eventuais alterações genômicas e, quando isto não é
possível, desencadeia a apoptose. A perda da função normal do p53 permite que a
célula acumule alterações em seu genoma, o que pode resultar em instabilidade
cariotípicas e redução do nível de apoptose.
Apesar das evidências de que este modelo de progressão tumoral seja
verdadeiro, cabe ressaltar que o acúmulo destas mutações, mais do que a
seqüência em que elas ocorrem, é o fator determinante da carcinogênese.
DISCUSSÃO 40
Com base no processo de formação tumoral, fica evidenciada a importância
de se caracterizar o processo de proliferação celular e apoptose no CCR. Tais
parâmetros estão amplamente discutidos na literatura como, por exemplo, nos
estudos de KIKUCHI et al. (1997), SCOPA et al. (2003) e DZIEGIEL et al. (2004),
encontrando-se aplicação na caracterização, prognóstico e terapêutica não apenas
nas neoplasis colorretais, mas em muitos outros cânceres. Os marcadores utilizados
neste trabalho constituem parâmetros de análise de proliferação celular (Ki-67) e
apoptose (caspase-3).
5.2 PRESENÇA E QUANTIFICAÇÃO DE KI-67
A proteína Ki-67 pode ser identificada no núcleo de células em interfase e na
superfície dos cromossomos durante a mitose, não sendo encontrada nas células
em G0. Dessa forma, é útil para avaliar frações de crescimento e a atividade
proliferativa de cânceres humanos, conforme descrito por SCHOLZEN & GERDES
(2000).
A presença da proteína nos tecidos foi inicialmente verificada através do
tratamento destes com o anticorpo Ki-67. A imunomarcação com este anticorpo não
detectava corretamente a proteína em tecidos que tivessem sido incluídos em
parafina. Os estudos retrospectivos só puderam ser realizados após o surgimento do
anticorpo MIB-1 e MIB-3, os quais têm a propriedade de reagir com a proteína Ki-67
após a desparafinização dos tecidos, sendo esta técnica descrita por CATTORETTI
et al. (1992).
Este estudo utilizou a imunoistoquímica com o anticorpo MIB-1 para a
detecção da proteína Ki-67. Comparado a outros anticorpos, o MIB-1 apresenta
grande eficiência na mensuração da atividade proliferativa pela presença e
quantificação da proteína Ki-67 contida no núcleo celular.
Para avaliar a expressão dos marcadores em questão pelo SAMBA 4000,
faz-se necessário recapitular a importância dos parâmetros Índice de Marcagem (LI)
e Densidade Óptica Média (MOD). O primeiro avalia a quantidade de núcleos/células
positivos/as, gerando um valor em índice percentual. O segundo mede a intensidade
de coloração das áreas positivas, gerando um valor absoluto que reflete a
intensidade de expressão média do marcador em todo o tecido analisado.
DISCUSSÃO 41
A expressão do Ki-67 (52,56% de células positivas), avaliada pelo LI,
apresentou-se em concordância com o estudo de JANSSON & SUN (1997), que
avaliou 255 adenocarcinomas através de imunoistoquímica para MIB-1, e também
com o estudo de CHENG et al. (1999), o qual utilizou o SAMBA 4000 para verificar a
porcentagem de células Ki-67-positivas em carcinoma colorretal e obteve média de
56%. Deve-se, ainda, considerar o estudo realizado no Brasil por RIBEIRO JR et al.
(2000), que obteve LI de Ki-67 igual a 49,2% em câncer de reto distal.
Entretanto, o estudo de SALEH et al. (2000), o qual avaliou 56 adenomas e
52 carcinomas colorretais também através de imunoistoquímica com o anticorpo
MIB-1 obteve média de 30,05% e 38,12%, respectivamente (p=0,0001). Apesar de
não reforçar os resultados do presente estudo, tais valores corroboram o aumento
da malignidade na seqüência adenoma-carcinoma pelo aumento da atividade
proliferativa.
Apesar de amplamente aceito como marcador de proliferação celular, devese levar em consideração alguns fatores que podem limitar a eficiência da proteína
Ki-67 como tal. VAN DIERENDONCK et al. (1989) observaram que células em G0
podem reter o antígeno Ki-67 por períodos de tempo consideráveis, sendo
incorretamente contadas como células prolifertivas. BRUNO & DARZYNKIEWICZ
(1992) descreveram expressão mínima de Ki-67 em células no final de G1 e início de
S, sendo possível que células no final da fase G1 sejam erroneamente classificadas
como células em repouso por expressarem níveis muito baixos da proteína. Assim, a
fração de células Ki-67-positivas pode não corresponder sempre à fração de
crescimento exata do tecido.
O fato de o LI do Ki-67 não se correlacionar estatisticamente com a MOD é
um indicativo da não existência de correlação entre a quantidade de núcleos
celulares expressando Ki-67 e a intensidade desta expressão. Esta situação é
ilustrada pela comparação destes parâmetros em dois casos distintos. Enquanto um
deles apresentou LI de 19,06% e MOD de 33,19, o outro apresentou valores iguais a
81,17% e 14,45, respectivamente (apêndice - tabela 4). Em outros termos, a
quantidade de células expressando Ki-67 não está relacionada com a intensidade de
sua expressão. Isto pode ser um indicativo da heterogeneidade de expressão desta
proteína nas neoplasias colorretais, como assinalado por BROWN & GATTER
(2002). Tal heterogeneidade é reforçada quantitativamente pelo estudo de
DISCUSSÃO 42
JANSSON & SUN (1997) e RIBEIRO JR et al. (2000), no qual os adenocarcinomas
apresentaram expressão de Ki-67 entre 13% e 90%, e entre 10% e 90%,
respectivamente, indicando variação na atividade proliferativa.
É interessante ressaltar, ainda, o estudo de HILSKA et al. (2005). Ao
analisarem vários marcadores tumorais em adenocarcinomas colorretais, os autores
em questão chegaram à conclusão de que os cânceres de cólon e reto apresentam
comportamentos biológicos diferentes. Dessa forma, seria interessante a realização
de estudos individuais para estes tumores.
5.3 PRESENÇA E QUANTIFICAÇÃO DE CASPASE-3
A família das caspases, pertencente à família das cisteíno-proteases, está
diretamente associada a apoptose. Estas enzimas possuem um resíduo de cisteína
em seu sítio ativo e clivam seus substratos quase que invariavelmente após resíduos
de ácido aspártico.
As diversas caspases apresentam diferentes funções na coordenação da
morte celular programada. As caspase-8 e caspase-9 são as primeiras a serem
ativadas, sendo denominadas iniciadoras. A caspase-3 é a responsável pela maioria
dos efeitos celulares deletérios da apoptose, recebendo suporte de outras como a
caspase-6 e a caspase-7. Estas caspases são referidas como as de execução ou
efetoras, e são ativadas proteoliticamente pelas iniciadoras conforme relatado por
WOLF et al. (1999) e ZIMMERMANN & GREEN (2001).
A caspase-3 está relacionada à fragmentação do material genético, como
por exemplo, através da ativação de fatores de fragmentação de DNA (DFFs) como
observado por LIU et al. (1997). Ainda, a literatura aponta para a participação desta
caspase no processo apoptótico induzido por diversos fatores em adenocarcinoma
de cólon, como diferentes quimioterápicos descritos no estudo de ADACHI et al.
(1999). A importância desta enzima é reforçada por BARCINSKI (2004), que afirma
ocorrer retardo ou até inibição da apoptose por mutação ou ação farmacológica
inibitória sobre as caspases.
No entanto, existem conflitos na literatura. No trabalho de DZIEGIEL et al.
(2004), foi demonstrada fraca correlação entre a quantidade de células expressando
caspase-3 e a intensidade de apoptose em adenocarcinoma de cólon (r=0,33;
DISCUSSÃO 43
p<0,05), havendo ainda variabilidade desta última entre os casos individuais. Desta
forma, surge o questionamento se a simples detecção deste marcador seria um bom
medidor da intensidade apoptótica.
A utilização de um anticorpo específico para caspase-3 ativada tem se
mostrado uma técnica de maior eficiência para avaliar a intensidade de apoptose em
tecidos humanos. MARSHMAN et al. (2001) encontraram correlação favorável entre
a detecção da caspase-3 ativada e a identificação de células apoptóticas em ambos
intestinos grosso e delgado em modelo animal experimental. O anticorpo monoclonal
anti-CPP32 utilizado neste trabalho reage com uma pró-enzima de 32 kDa de uma
variedade de tecidos humanos. Desta forma, é possível que a falta de correlação
encontrada se deva a inespecificidade do anticorpo utilizado, que reagiria tanto com
a pró-enzima (pró-caspase-3), quanto com a proteína clivada e ativa.
A expressão da caspase-3 (85,24% de células positivas), avaliada pelo LI,
não apresentou embasamento na literatura pesquisada, uma vez que são raros os
trabalhos empregando imunoistoquímica para caspase-3 em adenocarcinoma
colorretal.
No entanto, a observação de estudos utilizando a imunoistoquímica em
outros tumores pode ajudar a elucidar algumas características da expressão de
caspase-3 nas neoplasias. O estudo de FUJIKAWA et al. (2000), ao constatar
diminuição significativa da expressão de caspase-3 e da intensidade apoptótica em
células de carcinoma hepatocelular, reforçam as evidências de que a progressiva
resistência a apoptose é uma das principais características da maioria dos cânceres.
Por outro lado, PERSAD et al. (2004) contrariaram estes resultados ao analisar
carcinomas hepatocelulares e metástases hepáticas de carcinomas colorretais,
encontrando expressão elevada de caspase-3 em 52% das amostras. Estes dados
servem para ilustrar a diversidade de resultados apresentados pela literatura e levam
a questionar se a caspase-3 corresponderia a um bom marcador de apoptose.
Neste trabalho, houve correlação entre o LI e a MOD da caspase-3.
Considerando-se sua expressão citoplasmática, estes dados indicam que quanto
maior o número de células positivas para a caspase-3, maior a intensidade de
expressão deste marcador nos tecidos.
DISCUSSÃO 44
5.4 CORRELAÇÃO ENTRE KI-67 E CASPASE-3
A análise dos Índices de Marcagens e das Densidades Ópticas Médias pelo
teste t-Student revelou diferença estatisticamente significativa em ambos os
parâmetros.
O LI do Ki-67 expressa a relação entre o número de núcleos positivos para
este marcador e o número total de núcleos analisados. Este mesmo parâmetro
analisa a relação entre o número de células positivas para a caspase-3 e número
total de células analisadas. Em média, o percentual de células expressando
caspase-3 é 59,1% maior do que o de células com expressão de Ki-67 em seus
núcleos.
No entanto, a análise das Densidades Ópticas Médias não permite comparar
qualitativamente a expressão destes marcadores. Mesmo sendo a pontuação média
da caspase-3 35,2% maior do que a do Ki-67, as lâminas controle são distintas para
cada marcador. Uma vez que a pontuação da lâmina analisada é gerada
comparando-a com a lâmina controle, a MOD só é válida como parâmetro de
comparação dentro do mesmo marcador.
A expressão do Ki-67 não se correlacionou com a da caspase-3, o que se
infere pela ausência de correlação entre os Índices de Marcagem. Não foi possível
encontrar
estudos
correlacionando
a
expressão
destes
marcadores
pela
imunoistoquímica em adenocarcinoma de cólon. No entanto, HOSHI et al. (1999)
corroboram os dados do presente trabalho ao apresentarem uma tendência a
correlação inversa entre o LI dos marcadores em questão em adenomas e
carcinomas gástricos. Dessa forma, mais estudos correlacionando Ki-67 e caspase-3
em adenocarcinoma colorretal são necessários.
5.5 ANÁLISE DA IMUNOMARCAÇÃO DE KI-67 E CASPASE-3 PELO SAMBA 4000
Vários sistemas de análise computadorizada de imagem celular têm sido
utilizados na atualidade para avaliar a morfometria e a textura das células através da
microscopia óptica. A título de exemplo pode-se citar o BLISS (Bacus Laboratories),
utilizado por GARRITY et al. (2004), o CAS 200 (Cell Analysis Systems), por WONG
et al. (1995), e o OPTIMAS utilizado no trabalho brasileiro conduzido por ARAÚJO-
DISCUSSÃO 45
FILHO et al. (2006). Estes métodos aumentam a acurácia da análise tecidual,
transformando parâmetros antes analisados subjetivamente pelo examinador em
dados numérico. Por esta razão, MADY & MELHEN (2002) consideraram a análise
computadorizada de imagem celular um método mais eficaz do que o método
subjetivo, avaliando objetivamente os padrões da coloração tecidual. Além disso,
sistemas como o SAMBA 4000 são capazes de analisar outros parâmetros, como os
citomorfométricos, tornando ainda mais precisa a avaliação do tecido.
A análise computadorizada da imunomarcação do Ki-67 e outros dois
marcadores através do sistema SAMBA 4000 apresentou forte correlação com o
método semi-quantitativo no estudo de CHENG et al. (1999) (p<0,0001). Já que o
padrão ouro atual ainda é a análise subjetiva por observação da lâmina, eleva-se o
SAMBA 4000 no mínimo neste mesmo patamar.
5.6 NOVAS PERSPECTIVAS
A identificação de novos marcadores nos cânceres colorretais, seria útil na
prática clínica, pois permitiriam estratificar os pacientes de alto e de baixo risco.
Seria assim possível obterem-se programas de rastreamento mais efetivos, os quais
reduziriam os riscos da progressão tumoral, minimizariam o desconforto dos
pacientes e teriam custos menores. Desde que o comportamento do câncer
colorretal é altamente variável, é de grande importância encontrar marcadores
prognósticos acurados, baseando-se no fato que há uma maior conscientização dos
pacientes nos métodos de detecção que estão resultando em diagnósticos mais
precoces de neoplasias menores.
Novas estratégias terapêuticas, tendo por base vias moleculares ou
estruturas moleculares alteradas, serão mais eficientes e menos tóxicas que a
quimioterapia ou a radioterapia, por possuírem alvo específico. A manipulação dos
genes envolvidos na progressão da doença representa uma importante abordagem
para
intervenção
terapêutica
neste
tipo
de
câncer
(terapia
gênica).
O
desenvolvimento de novas abordagens para terapia gênica é crítico, já que não
existe tratamento efetivo para pacientes em estágios avançados da doença.
Após décadas de tratamento oncológico relativamente pouco específico,
baseado unicamente na remoção (cirurgia) ou destruição (quimioterapia ou
DISCUSSÃO 46
radioterapia) dos tumores, são finalmente vislumbrados tratamentos dirigidos contra
alvos moleculares específicos, identificados a partir de estudos que permitem
compreender a fisiopatologia do desenvolvimento e da progressão das neoplasias.
Novos estudos poderão ser conduzidos a partir dessas informações, não
somente em relação às diversas vias moleculares envolvidas na gênese do tumor,
como também em relação ao prognóstico, à resposta a terapias adjuvantes e, talvez,
futuramente, à novas modalidades terapêuticas. Este estudo poderia servir como
boa perspectiva futura, sendo que a utilização de uma maior amostragem contribuiria
para o esclarecimento da complexidade tanto do comportamento, quanto do
tratamento do adenocarcinoma de cólon.
Ainda, a utilização de anticorpo especifico para caspase-3 ativada (por
exemplo: AF835, R&D systems) nos estudos vindouros poderá aprimorar os
resultados imunoistoquímicos e, consequentemente, a mensuração da apoptose.
As informações contidas neste estudo fornecem dados a respeito da
carcinogênese em adenocarcinoma de cólon, procurando evidenciar e quantificar
marcadores celulares, assim como correlacioná-los.
Este trabalho faz parte dos
primeiros estudos a quantificar a expressão de Ki-67 e caspase-3 por método
computadorizado realizados no Brasil, utilizando software IMMUNO 4.00 do sistema
SAMBA 4000. Outros autores identificados na revisão de literatura utilizaram
diferentes sistemas computadorizados de análise de imagem celular (KUBOTA et al.,
1992; GARRITY et al., 2004; WONG et al., 1995; ARAÚJO-FILHO et al., 2006), os
quais também permitem quantificar, com facilidade e rapidez, o percentual de área
marcada e a intensidade da cor da marcação, evitando erros de leitura. Tendo em
vista estas vantagens, a tendência atual é a substituição da avaliação subjetiva por
métodos automatizados. Assim, o SAMBA 4000 desponta como uma excelente
opção, tanto para analisar morfometria, quanto para coloração tecidual.
6 CONCLUSÕES
CONCLUSÕES 48
Conforme os resultados obtidos pode-se concluir que:
1. Houve expressão aumentada de Ki-67, não ocorrendo correlação
significante entre a intensidade de expressão e o número de células positivas para
este marcador (p=0,750).
2. A intensidade da expressão de caspase-3 e o número de células
expressando este marcador correlacionaram-se positivamente (p=0,013).
3. As expressões de Ki-67 e caspase-3 não se correlacionaram
quantitativamente pelo Índice de Marcagem (p=0,671) e não puderam ser
correlacionadas pela Densidade Óptica Média.
GLOSSÁRIO
GLOSSÁRIO 50
Bax
-
Bcl-2
-
caspase-3 / CPP32
-
citocromo-c
-
Estadiamento TNM
-
Fas / CD95
-
kDa
-
Ki-67
-
MIB-1 e MIB-3
-
p53
-
Gene da família do Bcl-2 cujo produto homônimo, ao contrário da proteína
Bcl-2, é um indutor de apoptose.
Proto-oncogene cujo produto, a proteína Bcl-2, age a nível mitocondrial
inibindo a apoptose. Foi o primeiro proto-oncogene descrito cujo
mecanismo de ação não promove a proliferação celular.
Enzima pertencente à família das caspases. Estas são cisteíno-proteases
(possuem um resíduo de cisteína em seu sítio ativo) que clivam seus
substratos após um resíduo de ácido aspártico. Sua presença nos tecidos é
um indicador da atividade apoptótica, já que esta é a principal caspase
efetora da apoptose.
Molécula carreadora de elétrons, presente na mitocôndria e participante da
fosforilação oxidativa. É eventualmente liberado no citoplasma na
ocorrência de estímulos apoptóticos gerados no interior da célula,
participando ativamente na indução deste processo.
Classificação de estágio tumoral baseada na avaliação da extensão do
tumor primário (T - Tumor), presença e extensão de mestástase em
linfonodos (N - Node) e presença de metástases à distância (M Metastasis).
Proteína transmembrana de superfície celular envolvida na via dos
receptores de morte celular da apoptose.
Unidade de peso molecular. Um dalton equivale a massa de um átomo de
-24
hidrogênio (1.657 x10 g)
A designação Ki-67 foi inicialmente utilizada para o anticorpo original que
reagia com uma proteína nuclear expressa somente em células
participantes do ciclo celular (não expresso em células em G0). Atualmente
esta proteína é designada proteína Ki-67 (pKi-67), e a imunoglobulina
referida como anticorpo Ki-67.
Anticorpos monoclonais anti-Ki-67 criados em laboratório. Foram os
primeiros a permitir a detecção imunoistoquímica do Ki-67 em tecidos
parafinizados e, consequentemente, a realização de estudos retrospectivos
com material arquivado.
Refere-se ao gene ou à proteína p53. Quando ocorre um estresse celular
capaz de produzir lesão no DNA, a proteína p53 é ativada pelos sensores
do ponto de checagem (check-point) que verifica a passagem G1-S,
causando paralização do ciclo celular e, dependendo do caso,
desencadeamento da apoptose.
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APÊNDICE
APÊNDICE 65
TABELA 3 - TESTE DE DISTRIBUIÇÃO NORMAL
VARIÁVEL
(1)
z
p
Ki-67
Índice de Marcagem
0,542
0,931
Densidade Óptica Média
0,648
0,796
0,541
0,931
Densidade Óptica Média
0,864
FONTE: Dados trabalhados pelo autor.
NOTA: Valores de p superiores a 0,05 (p>0,05) indicam a não
rejeição da hipótese de normalidade dos dados.
(1) Distribuição normal.
0,444
caspase-3
Índice de Marcagem
TABELA 4 - RESULTADOS IMUNOISTOQUÍMICOS DE KI-67
CÓDIGO DO CASO
ÍNDICE DE MARCAGEM
F28
49,15
F29
45,94
F30
73,39
F31
28,67
F32
84,52
F33
59,68
F34
61,44
F35
27,07
F39
63,72
F40
26,93
F41
16,98
F42
41,50
F43
59,46
F44
95,45
F45
19,06
F46
46,99
F47
64,99
F49
81,17
FONTE: CITOLAB/IPEM
NOTA: O número de casos para Ki-67 foi 18.
DENSIDADE ÓPTICA MÉDIA
34,27
29,44
14,06
26,24
38,57
44,66
37,33
33,71
33,43
26,79
34,78
33,64
18,83
51,21
33,19
22,19
27,97
14,45
APÊNDICE 66
TABELA 5 - RESULTADOS IMUNOISTOQUÍMICOS DE CASPASE-3
CÓDIGO DO CASO
F28
F29
F30
F31
F32
F33
F34
F35
F38
F39
F40
F41
F42
F43
F44
F45
F46
F47
F49
ÍNDICE DE MARCAGEM
74,03%
71,73%
77,31%
95,92%
89,83%
85,66%
99,14%
88,45%
71,41%
85,51%
74,31%
79,00%
88,14%
89,05%
83,94%
97,04%
88,38%
83,92%
96,70%
DENSIDADE ÓPTICA MÉDIA
26,32
35,71
47,78
45,98
48,92
42,71
37,71
39,73
32,10
42,68
32,66
29,98
47,72
33,22
46,85
48,88
33,49
43,95
75,27
FONTE: CITOLAB/IPEM
NOTA: O número de casos para caspase-3 foi 19.
GRÁFICO 9 – COMPARAÇÃO ENTRE AS MÉDIAS DOS ÍNDICES DE MARCAGEM DE KI-67 E
CASPASE-3
120
100
80
60
40
20
0
N=
18
19
Ki-67
Caspase
Marcadores
FONTE: Dados trabalhados pelo autor.
APÊNDICE 67
GRÁFICO 10 – COMPARAÇÃO ENTRE AS MÉDIAS DAS DENSIDADES ÓPTICAS MÉDIAS DE KI67 E CASPASE-3
80
70
60
50
40
30
20
10
N=
18
19
Ki-67
Caspase
Marcadores
FONTE: Dados trabalhados pelo autor.