Apoptose
2001/2002
Prof.Doutor José Cabeda
Biologia Celular
Apoptose





Apoptosis=grego para ‘falling off’
(Caír, desfazer)
Processo fisiológico de morte celular
programada
Processo activo
Inibição deste processo é activa e
altamente regulada
Fases:
 A Célula Compacta-se
 A membrana forma invaginações
 A cromatina condensa
 O DNA Fragmenta-se
 A célula morta divide-se em
vesículas membranares (corpos
apoptóticos) que são fagocitados
Os processos bioquímicos da
apoptose
Proteólise
 Fragmentação
genómica
 Perda de assimetria
da membrana celular
 Fragmentação celular

www.nih.gov/sigs/Aboutapo.html
Apoptose versus Necrose








Apoptose
Determinada genéticamente
Ocorre dentro dos intervalos
fisiológicos
Célula compacata-se
Resulta de diversos passos
intrinsecamente regulados
Participa no equilibrio homeostático
do organismo
Fenómeno individual celular (suícidio
celular)
Nunca ocorre perda de estanquicidade
membranar
As vesículas formadas são removidas
por fagocitose, num processo muito
rápido que não deixa vestígios








Necrose
Determinada genéticamente
Resulta da alteração súbita de um
ou mais intervalos fisiológicos (pH,
Temperatura, [iónicas], etc)
Citoplasma “incha”
Resulta da inviabilização
metabólica da célula
Não tem funções homeostáticas
Fenómeno colectivo a todas as
células vizinhas
Resulta na perda de estanquicidade
da membrana
O derramamento do fluido celular
inicia processos tecidulares
(inflamação) que duram horas ou
dias e originam marcas duradouras
(cicatrizes)
Controlo da apoptose



A apoptose em condições biológicas é uma resposta celular a
variações subtis
 no meio extracelular
 Na membrana citoplasmática
 No interior da célula
O mesmo estímulo pode desencadear apoptose num tipo de
célula, ser inócuo noutro, e desencadear a proliferação
noutro
A resposta de um tipo de célula a um dado estímulo pode ser
variável pois depende de outros factores celulares (ex:fase de
maturação) e ambientais (outros estímulos)
Funções da apoptose
Moldar os tecidos na embriogénese
 Eliminar células alteradas (ex. cancro)
 Eliminar células que deixaram de ser
necessárias (ex. Sistema Imunológico)

Programmed Cell Death
A. Form digits
B. Form lumina
C. Vestigal structure
D. Mullerian/Wolffian
E. Cull extras (neurons)*
F. Cull immune system*
G. Cull damaged cells*
*focus of many studies
Anomalias da apoptose
Malformações congénitas
 Doenças Neurodegenerativas
 Disfunções imunológicas
 Tumores

Apoptose em patologias



Cancro
 Inibição da apoptose
 HPV inactiva o promotor do p53
 EBV aumenta a produção de bcl-2
 Algumas Leucemias B expressam níveis elevados de bcl-2
 Melanoma inibe a expressão de Apaf-1
 Alguns tipos de cancros do pulmão e do colon secretam uma
proteína que bloqueia o FasL
 Alguns tipos de tumores expressam níveis elevados de FasL
induzindo apoptose nas CTL que com elas interactuam
Doenças Auto-imunes
 Defeitos na indução de apoptose
 Defeitos na selecção celular
 Dificuldade em desligar as respostas imunológicas
Imunodeficiências
 Excesso de apoptose
 Deficiências na selecção positiva
Regulação da apoptose

Estudos em Caedorhabditis elegans permitiram identificar
4 grupos de genes:
 Responsáveis por desencadear a apoptose
 Genes envolvidos no processo apoptótico
 Genes necessários para a fagocitose dos corpos
apoptóticos
 Genes necessários para a dissolução final dos corpos
fagocitados
bloqueio
Ced-9
detonação
Egl-1, ces-1, ces-2
apoptose
Ced-3, ced-4, ced-8, ced-11
fagocitose
dissolução
Ced-1,ced-2,ced-5,
ced-6, ced-7, ced-10
Nuc-1
Apoptose em mamíferos
bloqueio
Ced-9
detonação
Egl-1, ces-1, ces-2
apoptose
Ced-3, ced-4, ced-8, ced-11
fagocitose
dissolução
Ced-1,ced-2,ced-5,
ced-6, ced-7, ced-10
Nuc-1
A Família bcl-2
Ligação a
proteínas
de outras
famílias

Promoção da apoptose
Na ausência de
BH1 e BH2
Formação de
homo/hetero-dimeros
Ancoragem
à membrana
Three subfamilies
 Bcl-2 (survival, 4BH)
 Bax (apoptosis, 3BH)
 BH3 only (apoptosis)
BH= bcl-2 homology domain
Apoptose mediada por sinais
internos à célula






A membrana da mitocondria contém bcl-2
ligado a Apaf-1
Dano interno provoca:
 Dissociação entre o bcl-2 e Apaf-1
 Saída de cyt-c para o citoplasma
O cyt-c e o Apaf ligam-se a caspase-9
formando o apoptosoma (com ATP)
Os apoptosomas agregam, a caspase-9 inicia
uma cascata de activação de caspases por
proteólise
Degradação de proteínas estruturais do citosol
Degradação do DNA nuclear
www.ultranet.com/~jkimball/BiologyPages/A/Apoptosis.html
Apoptose mediana por sinais
externos à célula


Fas e o receptor do TNF são proteínas de
membrana constitucionais
A ligação de FasL e TNF induz:
 Activação de caspase 8
 Inicia a cascata de activação de
caspases
• Degradação de proteínas
estruturantes
• Degradação do DNA nuclear
www.ultranet.com/~jkimball/BiologyPages/A/Apoptosis.html
Apoptotic Pathways






Extrinsic pathway the death machinery is triggered by death
ligands interacting with DRs to activate initiator caspases. Intrinsic
pathway centers on mitochondria which release cyto-c into the
cytosol activating caspase cascade.
The extrinsic and intrinsic death pathways can operate singly but
crosstalk between the pathways occurs at many levels.
Cyto-c binds Apaf-1 in turn binds to procaspase-9 and activates it
and the cascade.
Smac/DIABLO released from mitochondria can bind to IAPs
overcoming their inhibition on various caspases.
The extrinsic and intrinsic death pathways are linked by the
cleavage of Bid by caspase-8.
Cleaved Bid translocates to mitochondria and induces Bax/Bakdependent release of mitochondrial proteins.
Death Receptors



Modular Structures
 CRD=cysteine rich extracellular domain
 DD=cytoplasmic death domain
Adapters/FADD,etc
 contain DDs to interact with receptors and
transmit apoptotic signal to machinery
Receptors have unique features to recognize
ligand with specificity
 TNFR1/TNF-a, lymphotoxin alpha
 Fas (CD95)/FasL, DAXX
 DR3 & DR4/TRAIL
Not Death Receptors
 Other TNF members, B & T cell antigens,
lack DDs
Executioners of Apoptosis
Caspases: A Common Pathway
Caspases are proteases involved in 2 stages
of the apoptotic pathway
 Caspases are synthesized as inactive
procaspases that are activated by cleavage
to form the active dimer
 A complex forms at the receptor that
activates caspase-8 to ‘initiate’ the pathway

Caspase Activation



Synthesized as single
chain precursor
Cleavage site at
conserved Asp-297
N-peptide contains
death-effector domain
required to recruit the
death receptors (DRs)
to the cytosolic face
Caspase Family Members



Structural features
 CARD (caspase
recruitment domain
 DED (death effector
domains) for adaptors
Caspase cleavage
 Site separates subunits
Substrate cleavage
 caspase cleaves motifs
(P1-P4 )in substrates
Pro-apoptotic regulators promote
caspase activation
Figure 23-50
Some trophic factors prevent apoptosis by
inducing inactivation of a pro-apoptotic
regulator
Figure 23-50
Death Machinery



Initiators of cascade
caspases-1,-8, -9, -10
Effectors of cascade
caspases-2, -3, -6, -7
Proteins cleaved during
execution phase of
apoptosis (eg, PARP,
lamin A) for irreversible
cell death decision
Cysteine Aspartate-specific Proteases
Caspase
Substrates
Cleavage motif
Caspase-1
pro-IL-1beta
YVHD-A
Caspase-3
PARP
DEVD-G*
DNA-PK
DEVD-N
Rb
DEAD-G
Caspase-8
all other pro-caspases
Caspase-9
PARP
DEVD-G*
procaspase-3
DEVD-G*
Caspase Inhibitors




Defining motif BIR=
baculovirus IAP repeat
Multiple BIR domains
CARD for caspase
recruitment domain
RING domain
homolog of ubiquitin
E3 adaptors
Caspase Inhibitors

IAPs (inhibitors of apoptosis)



FLIPS (FLICE inhibitory proteins)




BIR motif necessary/sufficient for anti-apoptotic activity
XIAP, cIAP1, cIAP2 inhibit processing of procaspases-3, 6, 7 by
inhibiting cytochrome-c induced activation of caspase-9
Contain 2 death effector domains (DEDS)
DEDs interfere with FADD/caspase-8 interaction and activation
Block early events of other death receptors (TNFR1,TRAIL/DR4)
Peptide inhibitors

Synthetic peptide sequences based on substrate binding pocket
motif in positions P1-P4 (Ac-YVAD-cho, c-DEVD-cho)
Apoptotic Pathways Converge:
Role of Bcl-2 Family

Extrinsic Pathway:





Ligation of receptors
Adaptor recruitment
Activation of caspase-8
Transmit death signal
Intrinsic Pathway:




Cellular stress (xray/drug)
Mitochondria
integrator
Bcl-2 family regulators
Activation of caspase-9
The Bcl-2 Family Mechanism of Action

Bcl-2/Bcl-XL/Apaf-1


Bcl-2 and cyto-c



BH4 of Bcl-2 & Bcl-XL
bind to C-term of Apaf-1
inhibiting binding to Casp-9
Bcl-2 directly or indirectly
prevents release of cyto-c
from mitochondria
Bid of BH3 family mediates
release of cyto-c c/o PT
Bax death pathway


BH1 and BH2 form pores
Death caspase independent
Summary of Bcl-2 Family Roles
Mitochondrial dysfunction





Many apoptotic stimuli use mitochondrial
dysfuntion to signal apoptosis (intrinsic cues)
 Steroids
 Drugs (DNA damage)
 Irradiation (redox imbal)
 Loss of growth factors
 Ceramide generation
Distinct ‘BH3 only’ proteins respond to specific
death stimuli
Activated BH3 proteins translocate to
mitochondrial surfaces to associate with Bcl-2
related proteins to form membrane-spanning
pores
Cytochrome c release induces formation of the
apoptosome, a ternary complex of cyto-c, Apaf-1
and caspase-9
Apoptosis disrupts mitochondrial membrane
potential

PT (permeability transition)
Mitochondrial Permeability Transition



Effectors of PT
 Divalent cations Ca2+
 ROS and nitric oxide
 Conc of some peptides (transport signal
sequens)
 Lipid mediators
 Any major change in energy balance
(ATP, NAD) or redox state
PT functions to integrate stress responses and
any major damage of cells will trigger PT.
PT itself causes change in energy and redox
balance, when massive, can lock the cell into
irreversible stage.
Permeability Transition Pore

Bcl-2 family members control PTP channel


PTP a large pore induced by necrotic or
apoptotic signals







Bcl-2 proteins in membrane of mitochondria
OM, outer membrane
IM, inner membrane
IMS, inner membrane space
PT is achieved by H+ ion gradient generated
by electron transport.
The H+ gradient is used by the FoF1 synthase
to synthesize ATP.
Opening of PTP results in mitochondrial
depolarization, uncoupling of oxidat
phosphorylation and swelling of mitochondria
Direct association between Bax and ANT or
Bax and VDAC have been proposed
Role of Mitochondria in Apoptosis




Releases pro-apoptotic
molecules into cytosol
upon death stimuli
Apoptosome is formed
(Cyto-c,Apaf-1, casp-9)
Opening of PTP can
release procasp-2 or -9
Bcl-2 (tethering protein)
can regulate activation
of mitochondrial pool
Summary of the Players






Death Pathways
Triggering stimuli
Caspases
Bcl-2 family
Mitochondria
Death by apoptosis vs
necrosis
Oncologia
2001/2002
Prof.Doutor José Cabeda
Biologia Celular
CANCRO: UMA DOENÇA GENÉTICA DE CÉLULAS
SOMÁTICAS

A origem genética dos tumores


Proto-oncogenes e oncogenes
Factores de crescimento







Genes de Supressão tumoral
Os carcinogénios como mutagénios
Agentes virais na origem dos tumores





Receptores para factores de crescimento
Transdutores intracelulares de sinal
Factores de transcrição nuclear
Proteínas de controlo do ciclo celular
Oncogenes virais
Conversão de proto-oncogenes celulares em oncogenes
Activação de proto-oncogenes
Amplificação de proto-oncogene
A "estatística" na origem dos tumores
Proto-oncogenes e Oncogenes


Proto-oncogenes
 Genes normais que depois de alterados por
mutação originam um fenótipo tumoral
 Fazem parte do património genético de todos
Oncogenes
 Gene resultante da alteração de um protooncogene, e que causa um fenótipo tumoral
 Fazem parte do património genético das células
transformadas
Receptores para
factores de
crescimento
A GENÉTICA MOLECULAR EM
HEMATO-ONCOLOGIA
ANOMALIAS GENÉTICAS EM HEMATOONCOLOGIA
CANCRO: UMA DOENÇA GENÉTICA DE CÉLULAS SOMÁTICAS

A origem genética dos tumores


Proto-oncogenes e oncogenes
Factores de crescimento







Genes de Supressão tumoral



Oncogenes virais
Conversão de proto-oncogenes celulares em
oncogenes
Activação de proto-oncogenes
Amplificação de proto-oncogene
A "estatística" na origem dos tumores
Translocações cromossómicas em hematooncologia







Translocações envolvendo genes das Ig
ou TCR
translocação t(8;14)(q24;q32) e o EBV
A t(14;18) - BCL2/IgH
Translocações que originam genes hibridos

t(9;22) - bcr/abl
t(15;17) - pml/rar
Delecções cromossómicas em hemato-oncologia
Mutações pontuais em hemato-oncologia

Os carcinogénios como mutagénios
Agentes virais na origem dos tumores


Receptores para factores de
crescimento
Transdutores intracelulares de sinal
Factores de transcrição nuclear
Proteínas de controlo do ciclo
celular

mutações no gene p53
UTILIDADE CLÍNICA DA GENÉTICA MOLECULAR EM
HEMATO-ONCOLOGIA



Aprofundamento de conhecimentos
Escolha de tratamentos específicos
Monitorização da doença
Transdutores
intracelulares
de sinal
Factores de transcrição nuclear
Proteínas de controlo do ciclo
celular (ciclinas)


O ciclo celular é controlado por ciclinas (cdk), p53 e RB
(entre outros factores)
 Permite uma sincronia entre o crescimento,
duplicação de DNA e divisão nuclear
Alterações nos genes das ciclinas podem originar
fenótipo tumoral se:
 Ocorrer alteração da expressão de uma ou mais
ciclinas
 se ocorrem mutações nas sequências codificantes dos
genes que codificam as ciclinas, o p53 ou o RB
Genes de supressão tumoral

Genes que suprimem o desenvolvimento de tumores
 Mutações germinais associadas com predisposição
tumoral
 Fenótipo dominante, mas recessivo ao nível celular (a
>parte)
 O fenótipo depende da inactivação da cópia normal do
gene (ex. Retinoblastoma-gene RB, um regulador do
ciclo celular)
 Fenótipo dominante (casos raros)
 O p53 é um estimulador da apoptose que funciona
como tetrâmero. Uma diminuição da concentração
Os carcinogéneos como
mutagéneos

Os mutagéneos são substâncias capazes de se
interagirem com os ácidos nucleicos,
modificnado-lhes propriedades

Se as alterações genéticas resultantes ocorrerem
em proto-oncogenes, genes de factores de
crescimento, ou genes de supressão tumoral, o
genótipo resultante pode ser tumoral
Conversão de
proto-oncogenes
celulares em
oncogenes virais
Oncogene
Localização
Função
Oncogenes presentes em vírus de DNA
E1A
Nucleo/citoplasma
Regula a transcrição
E1B
Nucleo/citoplasma
Regula a transcrição
PV-ST
citoplasma
PV-MT
membrana citoplasmática liga e estimula pp60c-src e pp62c-yes
PV-LT
núcleo
inicia a síntese de DNA e regula a transcrição
SV40-ST citoplasma
SV40-LT núcleo, memb.citoplasm. inicia a sínt.DNA, reg.transcrição, liga p53
Oncogenes presentes em Retrovírus
abl
memb.citoplasm.
tirosina cinase
erb A
citoplasma
receptor da hormona tiroideia
erb B
membranas
tirosina cinase / EGF receptor
ets
núcleo
fes
memb.citoplasm.
tirosina cinase
fgr
memb.citoplasm.
tirosina cinase
fms
memb.citoplasm.
receptor do CSF-1 (tirosina cinase )
fos
núcleo
fps
kit
membranas
tirosina cinase
mil/raf
citoplasma
serina/tirosina cinase
mos
citoplasma
serina cinase
myb
núcleo
myc
núcleo
ras
memb.citoplasm.
proteina G
raf
rel
citoplasma
ros
citoplasma
tirosina cinase
sis
citoplasma e excretado
subunidade do PDGF
src
memb.citoplasm.
tirosina cinase
ski
núcleo
yes
tirosina cinase
Oncogenes não presentes em vírus
bcl - linfoma folicular humano
p53 – activo em células transformadas
bcr - LMC
ret – Linfoma
int-1,2,3,4 – cancro da mama (rato) rho – semelhante a ras
met – linha celular transformada
neu – neurogliobastoma de rato
Oncogenes
virais
Activação e
amplificação
de protooncogenes
Translocações envolvendo os genes
TCR e Ig
Translocações envolvendo os genes do TCR e das Ig
IgH
IgK
Ig
TCR-a
TCR-ß
Translocação
Doença
Gene afectado
t(8;14)(q24;q32)
t(11;14)(q13;q32)
t(14;18)(q32;q21)
t(14;19)(q32;q13)
t(3;14)(p27;q32)
t(5;14)(q31;q32)
t(2;8)(p12;q24)
t(2;3)(p12;q27)
t(8;22)(q24;q11)
t(3;22)(q27;q11)
t(1;14)(p32;q11)
t(10;14)(q24;q11)
t(11;14)(p14;q11)
t(11;14)(p13;q11)
t(8;14)(q24;q11)
t(1;7)(p32;q35)
t(7;9)(p34;q32)
t(7;11)(p35;p13)
t(7;9)(q34;q34.3)
t(;7)(q34;q34)
t(7;19)(q34;p13)
Burkitt
LNH-manto
LNH-foliculares
LLC-B
C-Myc
bcl-1 (CCND1/PRAD1)
bcl-2 (apoptose)
bcl-3 (ciclina?)
LLA-pre B
Burkitt
LNH-célula grande
Burkitt
IL-3 (citocina)
LLA-T
LLA-T
LLA-T
LLA-T
LLA-T
LLA-T
LLA-T & LNH
LLA-T
LLA-T
bcl-6 (zinc-finger)
Tal-1
TCL-3 (Hox11)
Rhombotin 1
Rhombotin 2 (TCL-2)
C-Myc
Tal-2
dominio LIM
TAN-1
lck
LYL1
Linfoma de burkit
t(8;14) - t(8;22) - t(8;2)

Origina a expressão do c-myc nos linfócitos B
Linfomas foliculares e difusos
Diagrama
mostrando os
cromossomas 14 e
18 normais, e os
cromossomas
resultantes da
translocação
t(14;18)(q32;q21),
envolvendo os
genes BCL-2
(18q21) e IgH
(14q32).
Translocação
Doença
Genes afectados
t(9;22)(q34;q11) LMC;LLA adulto/LMA
abl
bcra
t(15;17) (q22;q21) LMA-M3
PMLb RARad
t(11;17)(q35;q21) LMA-M3
PLZFc RARad
t(5;17)(q35;q21)
NPMe RARad
t(8;21)(q22;q22) LMA-M2
ETOc AML1
Inv(16)(p13;q22) LMA-M4Eo
MYHf CBFBg
t(6;9)(p23;q34) LMA,LMA-TdT+
DEK CAN
inv(3)(q21;q26) LMA-M1
EVI1c
t(3;3)(q21;q26)
t(1;9)(q23;q13) LLA-pre B
PBX1h E2A
t(12;21)(p13;q22) LLA-prec.B infantis
TEL
AML1
a
t(2;5)(p23;q35) LNH-anaplásico
ALK NPMe
t(4;11)(q21;q23) LLA-pre B
ALLc AF4i
t(1;11)(q32;q23) LAM
AF1Pe
t(6;11)(q27)(q23) LAM
AF6i
t(9;11)(p21;q23) LAM-M5,prec.B
AF9i
t(11;17)(q23;q21) LAM
AF19
t(11;19)(q23;p13) LAM,LLA-prec. B
ENLi
t(8;13)(p11;q12) sindrome mieloproliferativo ZNF198 FGFR-1
a) tirosina cinase
b) guanosina trifosfatase
c) zinc finger
d) receptor acido retinoico
e) fosfoproteina
f) gene da miosina
g) factor de transcrição
h) gene homeótico
i) transdução de sinal
Genes hibridos
resultantes de
translocções
Bcr/abl
Os genes BCR e ABL normais, e as
translocações que originam as
proteínas p190 e p210 do gene quimera
BCR-ABL.
A proteína p210 é característica da
CML, sendo a p190 a proteína BCRABL encontrada na maioria dos casos
de ALL
pml/rar
A localização cromossómica e estrutura
normal dos genes PML e RARa, e a
translocação t(15;17)(q22;21) que origina
o gene quimera PML-RARA.