Variabilidade genética de populações naturais e em viveiro de
Juniperus brevifolia (Seub.) Antoine (Cupressaceae)
Luís Silva1, Rui Elias2, Eduardo Dias2, Mónica Moura1, Samuel Menard1 e Sandra Couto1
1Departamento
de Biologia, CIRN, Universidade dos Açores, Apartado 1422, PT 9501-855 Ponta Delgada, Portugal; Telefone: 296650463; fax: 296 650 100; e-mail: [email protected];
2Departamento de Ciências Agrárias, CITA, Universidade dos Açores, Largo da Igreja, 9701-851 Terra-chã, Portugal. Telefone: 295402200; Fax: 295402205; e-mail: [email protected]
Financiado pela Direcção Regional dos Recursos Florestais - Açores
Introdução
Resultados
Juniperus brevifolia (Seub.) Antoine (Cupressaceae) é uma espécie lenhosa
endémica dos Açores com grande importância ao nível da estrutura e
funcionamento de várias comunidades vegetais endémicas dos Açores (Dias,
1996; Dias et al. 2004; Elias, 2001; Elias & Dias, 2004). Os objectivos deste
trabalho são os seguintes:
- Determinar a variabilidade genética intra e inter-populacional em populações
naturais e de viveiro;
- Estimar o grau de diferenciação genética das populações;
- Avaliar as consequências ao nível taxonómico;
- Avaliar as consequências ao nível da conservação.
Figura 1 – Géis obtidos utilizando
primers do tipo RAPD e ISSR.
Dos 30 primers inicialmente testados,
foram aplicados 5 primers RAPD e 5
primers ISSR. Utilizaram-se 8 amostras
(72 indivíduos) o que resultou na análise
de um total de 140 bandas polimórficas.
TMN
TCM
Tabela 2. A diversidade genética,
estimada através do índice de
Shannon,
foi
relativamente
elevada
no
interior
das
populações (67%), com alguma
variabilidade entre ilhas e entre
populações.
TS
TC
TS
Helder Fraga
Helder Fraga
TM
TQR
Material e Métodos
PV
Amostragem - As amostras incluem, sempre que possível, 10 indivíduos de cada
população (5 plantas femininas e 5 masculinas). Foram amostradas 6 populações na
Ilha Terceira e 2 na Ilha do Pico. Sempre que possível, evitou-se a amostragem de
plantas vizinhas.
PM
Extracção de DNA - O DNA foi extraído a partir dos raminhos terminais, mantidos no
frigorífico até ao início do processo de extracção. O material excedentário foi
conservado a –80ºC. Todo o material foi processado recorrendo ao kit de extracção
DNeasy Plant Mini kit (Qiagen).
Verificação da qualidade e quantidade do DNA extraído - As amostras de DNA,
mantidas em tampão TE e no congelador a –20ºC, foram analisadas num gel de
agarose a 1,2 % de modo a aferir da presença e da quantidade de DNA extraído.
Amplificação - Por reacção foram utilizados 10 µmol/L (1µL) do respectivo primer,
cerca de 35 ng de DNA purificado (1µL) e um tubo de 0,2 ml com “puReTaq ReadyTo-Go PCR bead” (Amersham Biosciences), para um volume final de 25 µl. A reacção
de amplificação foi realizada num amplificador T-Gradient (Whatman Biometra) com
o seguinte programa: i) desnaturação 3 min a 94ºC; ii) 45 ciclos de amplificação
(94ºC, 1 min; 36ºC, 1 min; 72ºC, 2 min); iii) extensão final de 4 min a 72ºC.
Análise dos fragmentos amplificados - Os fragmentos de DNA resultantes da
amplificação foram separados num gel de agarose a 1,4% (tampão TBE), corados
com brometo de etídio e visualizados com o sistema Gel Doc 2000. Foi utilizado como
referência um marcador molecular de 50–2000 ou de 50–10000 pares de bases
(Sigma-Aldrich).
Análise estatística - As bandas polimórficas foram registadas como presentes (1) ou
ausentes (0). Para evitar enviesamentos as bandas com uma frequência inferior a
3/N (N é a dimensão da amostra) foram excluídas da análise (Lynch & Milligan,
1994). A diversidade fenotípica (com base nas bandas) foi estimada por população,
por ilha e globalmente, utilizando o índice de Shannon (Morgan-Richards & Wolff,
1999). A variação genética dentro das populações, dentro das ilhas, entre
populações e entre ilhas foi estimada utilizando uma Análise de Variância Molecular
(AMOVA) com a aplicação Arlequin ver. 2.000 (Schneider et al., 2000). A
diferenciação genética das populações foi estimada, com base nas distâncias
Euclideanas entre indivíduos, as quais foram utilizadas no cálculo dos valores de FST
(Schneider et al., 2000). Foi construída uma árvore (Neighbor-Joining tree) com base
na matriz de distâncias (Nei & Li, 1979), recorrendo à aplicação RAPDistance 1.06
(Armstrong
et al.,1.1994).
Local
Abreviatura Código Indivíduos
Tabela
Populações
Mistérios Negros
TMN
T01
1-10
amostradas
nas
ilhas
Serra de Santa Bárbara
TC
T02
11-20
Terceira (6) e Pico (2).
Cão Morto
Sanguinhal
Quatro Ribeiras
Mistérios
Viveiros
Manhanha
TCM
TS
TQR
TM
PV
PM
T03
T04
T05
T06
P01
P02
23-30
31-40
41-48
54-60
1-10
11-20
Bibliografia
•Adams, R. P., A. . Schwarzbach and R. N. Pandey (2003). The concordance of terpenoid, ISSR and RAPD markers, and ITS sequence data
sets among genotypes: na example from Juniperus. Biochemical Systematics and Ecology, 31: 375-387.
•Armstrong, J., Gibbs, A., Peakall, R. and G. Weiller (1994). The RAPDistance Package. Australian National University, Canberra,
Australia.
•Dias E. 1996. Vegetação natural dos Açores. Ecologia e sintaxonomia das florestas naturais. Tese de Doutoramento. Universidade dos
Açores. Angra do Heroísmo, Azores.
•Dias E., Elias R. B. & Nunes V. (2004). Vegetation mapping and nature conservation: a case study in Terceira Island (Azores).
Biodiversity and Conservation 13: 1519-1539.
•Elias R. B. (2001). Sucessão primária em domas traquíticos. Tese de Mestrado em Ecologia Insular e Evolução. Universidade dos Açores,
Departamento de Ciências Agrárias. Angra do Heroísmo, Azores.
•Elias R. B. & Dias E. (2004). Primary succession on lava domes on Terceira (Azores). Journal of Vegetation Science 15: 331-338.
•Lynch, M., and B. Milligan (1994). Analysis of population-genetic structure using RAPD markers. Molecular Ecology 3: 91-99.
•Morgan-Richards, M. and K. Wolff (1999). Genetic structure and differentiation of Plantago major reveals a pair of sympatric sister
species. Molecular Ecology, 8: 1027-1036.
•Nei, M. and W.-H. Li, (1979). Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proceedings of
the National Academy of Sciences USA, 76: 5269-5273.
•Schneider, S., D. Roessli, and L. Excoffier (2000). Arlequin ver. 2.000: A software for population genetics data analysis. Genetics and
Biometry Laboratory, University of Geneva, Switzerland.
TQR
Figura 2. Estrutura genética de 8 populações de Juniperus brevifolia das ilhas Terceira e
Pico. Dendrograma baseado na distância genética de Nei. Existe uma estrutura genética
algo complexa ao nível da Ilha Terceira. Observa-se um certo agrupamento das populações
de Mistérios Negros e Cão Morto, por um lado, e das populações de Sanguinhal, Mistérios e
Serra de Santa Bárbara, por outro, ficando a população das Quatro Ribeiras algo isolada, e
aparentemente mais próxima das populações do Pico.
Graus de Soma de
Percentagem
liberdade quadrados Variância de variação
Fonte de Variação
Entre grupos
Entre populações
dentro dos grupos
Dentro das
populações
Total
1
226,9
5,6
20,6
6
366,0
5,0
18,5
64
1054,0
16,5
60,8
71
1648,9
27,1
FST
Tabela 4. Distância genética
entre as amostras analisadas.
Todas
as
distâncias
significativas
(*
são
p<0,05).
Foram encontradas distâncias
genéticas consideráveis entre
as
populações
amostradas,
especialmente
populações
entre
de
ilhas
diferentes.
0,39
Fst
T01
T02
T03
T04
T05
T06
P01
P02
T01
0,000
0,262
0,240
0,262
0,269
0,282
0,387
0,407
p < 0.001
T02
*
0,000
0,268
0,168
0,191
0,215
0,403
0,407
T03
*
*
0,000
0,283
0,195
0,284
0,368
0,368
Tabela 3. Análise da variância
molecular - foram definidos
dois grupos (6 populações da
ilha Terceira e 2 populações
da Ilha do Pico). Confirma-se
que
a
percentagem
de
variabilidade genética dentro
das populações (61%) é o
factor responsável pela maior
parte
da
variância
encontrada.
T04
*
*
*
0,000
0,195
0,154
0,425
0,442
T05 T06 P01 P02
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
0,000
*
*
*
0,151 0,000
*
*
0,342 0,437 0,000
*
0,359 0,431 0,236 0,000
Conclusões
A variabilidade genética intrapopulacional é relativamente elevada.
A distância genética, considerável, encontrada entre amostras das ilhas
Terceira e do Pico, indica que se deverá proceder com cautela no que respeita à
utilização das plantas originárias do Pico em outras ilhas dos Açores. Deve
ainda considerar-se o facto da população de viveiro apresentar a diversidade
genética mais reduzida. Dada a distância genética encontrada entre populações
de diferentes ilhas, nesta fase do estudo aconselha-se que o material vegetal de
uma ilha não seja utilizado para plantio noutra ilha. Uma tal prática acarretaria,
muito provavelmente, uma progressiva homogeneização ao nível genético das
populações de J. brevifolia das diferentes ilhas.
No que respeita à variabilidade genética de J. brevifolia na ilha Terceira, esta é
uma realidade, pelo que, os dados referentes aquela Ilha serão alvo de uma
análise mais detalhada, de modo a confirmar a estrutura genética agora
detectada.
Agradecimentos: Ao Engº. Jorge Belerique pelo apoio prestado.