Técnicas de Biologia Molecular em Microbiologia Clínica TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS Prof.Doutor José Cabeda Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos PCR Real Time PCR NASBA/TMA PCR OPTIMIZAÇÃO DO PCR [MgCl2] Th [dNTP] [primers] [DNA] [inibidores] Variantes do PCR RT-PCR RT RNA Nested PCR 1º PCR 2º PCR PCR cDNA prod. ampl. Nested - PCR PCR Multiplex Variantes do PCR RT-PCR Multiplex PCR Nested PCR Assymetric PCR Degenerate PCR Hot Start PCR In Situ PCR Long-PCR PCR-ELISA PCR-RFLP PCR-SSCP RAPD-PCR REP-PCR Touchdown PCR Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos PCR Real Time PCR NASBA/TMA Principio de funcionamento do Real-Time PCR Prof.Doutor José Cabeda Detecção dos produtos de PCR Montar uma reacção Químicas Utilizáveis Prof.Doutor José Cabeda SYBR-Green I 3’ 5’ Excitation SG SG SG 3’ 5’ SG SG SYBR-Green I Excitation Emission 5’ 3’ SG SG SG SG SG 3’ 5’ Detcção com SybGreen Sybr-Green Detection Intercalates to dsDNA Inhibits DNA amplification so concentration is critical Detects specific and nonspecific targets Low starting background with large increase in signal Can run a melt curve to look at product specificity Detecção com sondas Quimicas utilizáveis: sondas taqman Sequence specific probes: Dual labeled probes 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ Excitation Excitation 3’ R Q Q 5’ Quimicas utilizáveis: molecular beacons Molecular Beacons I FAM DabCyl 10mer 25mer Molecular Beacons II Excitation Emission R Q Molecular Beacons III Can be used to quantitation and mutation detection Need beacons for the normal and mutation sequence Design is difficult due to nature of folding structure Expensive when compared to FRET Quimicas utilizáveis: sondas FRET TM Hyb-Probes Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: Quencher Transfer Excitation Emission Prof.Doutor José Cabeda Quenched FRET analysis 5’ 3’ Two labeled probes, FAM at the 5’ and BH1 on the 3’ When the probes hybridize the FAM energy is quenched by the BH1 After the product is amplified run a melt curve to determine genotype Different melt points are seen for normal and mutation Quimicas utilizáveis: sondas Eclipse F Q MGB F Q Aplicações Quantificação Prof.Doutor José Cabeda End Point versus Real-Time Quantificação Aplicações Detecção de Mutações / SNP Prof.Doutor José Cabeda Detecção de mutações Aplicações Multiplex Detection Prof.Doutor José Cabeda Detecção simultânea de vários produtos Os equipamentos Prof.Doutor José Cabeda LightCycler SmartCycler Rotorgene The samples spin continually during a run at 500 rpm The samples are heated and cooled in a low mass air oven Tubes are illuminated as they pass the detector On data acquisition energy is averaged over 20 revolutions to give the fluorescence of each sample Four Channels • • • • Ch1: ex 470nm, det 510nm Ch2: ex 530nm, det 550nm Ch3: ex 585nm, det 610nm Ch4: ex 625nm, det 660nm Near Patient Testing Laboratório de Urgência Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos PCR Real Time PCR NASBA/TMA NASBA/ NUCLISENS Amplification: schematic diagram Primer 1 Legend: • sense RNA • antisense RNA • sense DNA • antisense DNA Reverse Transcriptase RNase H Primer 2 Reverse Transcriptase T7 RNA polymerase Primer 2 Reverse Transcriptase Reverse Transcriptase RNase H Primer 1 Técnicas de amplificação de Sinal bDNA (Quantiplex) bDNA (I) bDNA (II) bDNA (III) bDNA (IV) bDNA (V) SDA DNA Plymerase Restriction enzyme Aplicações de técnicas de amplificação de AN ao diagnóstico microbiológico Prof.Doutor José Cabeda MÉTODOS CONVENCIONAIS NO DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO Caracterização microscópica Crescimento “in vitro” em meios sintéticos Caracterização bioquímica Demonstração imunológica da presença dos/ contacto com microorganismos LIMITAÇÕES DOS MÉTODOS CONVENCIONAIS MÉTODO Cultural LIMITAÇÃO EXEMPLOS Meios e condições de cultura especiais Mycoplasma spp., Legionella spp...... Culturas celulares Vírus, bactérias intracelulares obrigatórias Incapacidade de crescer “in vitro” Microrganismos de crescimento lento M. leprae, T. pallidum, HPV, HCV.... Mycobacterium spp., fungos LIMITAÇÕES DOS MÉTODOS CONVENCIONAIS MÉTODO Serológico LIMITAÇÃO Sem utilidade na fase aguda diagnóstico retrospectivo Problemático no hospedeiro imunocomprometido Reactividade cruzada Interpretação complexa DIAGNÓSTICO MOLECULAR • Diagnóstico etiológico em tempo Sensibilidade Especificidade Rapidez clinicamente útil • Evitar terapias empíricas • Administração precoce de terapia específica • Diminuição do tempo e custos da hospitalização PCR Tempo Real ÁREAS DE APLICAÇÃO Diagnóstico das Doenças Infecciosas Detecção de Resistência aos Antimicrobianos UBM - HGSA O que fazemos (Microbiologia) Microbiologia Detecção/quantificação de agentes patogénicos Vírus Bactérias Genotipagem viral Detecção de resistências a drogas Detecção de genótipos associados a resistência Epidemiologia Infecção nosocomial Áreas de Intervenção (II) Urgentes Virologia Detecção de agentes Identificação de agentes Resistências a drogas Microbiologia Detecção de agentes Identificação de agentes Resistências a drogas Hematologia Doenças oncológicas Estudo de genes quimera Estudo de Doença Res.Mín. Estudo de monoclonalidade Estudo de Quimerismo Não Urgentes Hematologia/Imunologia Doenças Genéticas Monogénicas • Estudo de Mutações • Estudo de haplótipos Multifactoriais • Estudo de polimorfismos (factores genéticos de risco) Anatomia Patológica Biópsias Detecção de patogénios Detecção de monoclonalidade ThinPrep Detecção de HPV Virologia Sistema Nervoso Central Transmissíveis p/ sangue HIV HSV1/2 HBV EBV HCV CMV VZV Outros HHV-6 HTLV-1 Enterovirus HPV Poliomavirus (JCV e BKV) Microbiologia Detecção de bacterias Micobacterium tuberculosis Leptospira spp Pneumonias atípicas Legionella spp. Legionella pneumophila Legionella genus Micoplasma pneumoniae Chlamydia pneumoniae Staphylococcus spp. Enterococcus spp. Helicobacter pylori Clostridium difficile (tcdA,tcdB) Bordetella pertussis Borrelia burgdorferi 16S rDNA Identificação de bactérias Micobacterium tuberculosis complex Micobacterium avium Micobacterium avium complex Micobacterium kanzasii Micobacterium intracelulare Micobacterium Gordonae Resistencias a drogas Meticilina Glicopeptídeos Rifampicina Isoniazida Antiretrovirais Escolha da tecnologia (I) Real-Time-PCR Mais rápido (até 1 hora) Mais sensível Menor risco de contaminação Uma só tecnologia faz Amplificação Detecção Caracterização PCR convencional Mais barato Muitos protocolos disponíveis Mais fácil de montar para: Multiplex Nested Escolha da tecnologia (II) R.A.P.I.D (Yahoo) LightCycler SmartCycler SmartCycler-TD (cepheid) (cepheid) 7000 / 7300 / 7500 / 7900HT (Applied Biosystems) MX3000P MX4000 (Stratagene) (Stratagene) Rotorgene MyiQ (pyrosequencing) (BioRad) Opticon Chromo 4 (MJ Research) (MJ Research) http://www.biocompare.com/matrix/2838/Real-Time-Thermal-Cyclers-(Thermocyclers).html Escolha da tecnologia (III) LightCycler O mais rápido (cerca de 20’) Muitos protocolos disponíveis 32 amostras/corrida Fluorocromos limitados na versão original SmartCycler Bastante rápido (cerca de 30’) Disponível em 25ml e 100ml: PCR preparatívos Aumento do input amostra Conversão de PCR convencional facilitada 16 estações independentes 16 programas simultânos Apenas 16 amostras Infecções víricas do SNC HERPESVIRUS ENTEROVIRUS Sensitivity HSV-1 200 copies/mL HSV-2 100 copies/mL VZV 500 copies/mL CMV 315 copies/mL HHV-6 1/50 EBV 1/10 Response time: 4 hours+ Sensitivity* CoxA16 0.25 TCID50 CoxA9 0.036 TCID50 CoxB5 320 TCID50 Echo11 25 TCID50 Echo6 2000 TCID50 ENT71 56 TCID50 Response time: 4 hours A vantagem do Nested (Enterovírus) TCID50/ml Lab1 Cox A9 3,9 Cox A16 0,25 Cox B5 320 320 32 32 56 ENT71 RHINO 3,2 0 Neg. 0 Neg. + 10-2 + 10-4 + 10-5 + 10-6 + 10-7 + 10-8 + + - Lab2 Lab3 Single Nested ++ ++ -+/-+/--+ - + + + + + + + + + + + + - Single Nested + + + - + + + + + + + - A vantagem do Nested (Enterovírus) Amostras clínicas (162 LCR) Single RT-PCR Nested RT-PCR Positivas 13% Negativas 87% Negativas 56% Positivas 44% Detecção de bactérias Leptospiras Bacteriologia Leptospiras B.burgdorferi H.pylori M.pneumoniae C.pneumoniae L.pneumophila M.tuberculosis Bordetella Pertussis Clostridium difficile B.burgdorferi M.pneumoniae H.pylori M.tuberculosis Helicobacter pylori Biópsias Gástricas Frescas Biópsias Gástricas Fixadas Extracção de DNA: Homogeneização dos Tecidos Lise Celular Desnaturação Proteica Tampão de Lise de Tecidos Fast Prep Temperatura de 95 ºC Proteinase K Magna Pure LC DNA Isolation Kit - Tissue 60 m Helicobacter pylori Detecção de H. pylori – Multiplex PCR em Tempo Real Smart Cycler Urease -Globina (Controlo Interno) Ensaio “in house” 2 Pares de Primers (Urease / -Globina) Sondas TaqMan Helicobacter pylori Detecção de Resistência à Claritromicina – PCR em Tempo Real Light Cycler Amplificação do Gene 23S rRNA Sondas FRET Análise de Melting Tempo de Resposta: ~ 5 H Estirpe Tmelting (ºC) Wild - type 61.5 Mut (A2142C) 58.0 Mut (A2142G) 53.0 Mut (A2143G) 53.6 PNEUMONIAS ATÍPICAS M. pneumoniae, C. pneumoniae e L. pneumophila TÉCNICA: PCR em Tempo Real – SMART CYCLER 3 ENSAIOS DE PCR Efectuados individualmente para a detecção de cada um dos microrganismos PNEUMONIAS ATÍPICAS M. pneumoniae, C. pneumoniae e L. pneumophila TEMPO DE RESPOSTA: 3 H VS 48 H PCR Convencional ESPECIFICIDADE SENSIBILIDADE L. pneumophila LIMITE DE DETECÇÃO: L. pneumophila - 18 UFC/ml AMOSTRAS: LBA LCR Expectorações... C. pneumoniae M. pneumoniae LEPTOSPIROSE (UBM-HGSA) Amplificação do 23SrDNA (género Leptospira) e detecção específica de 6 espécies patogénicas Amostras de urina, sangue, LCR PCR em Tempo Real (Light Cycler) Limite de detecção: cultura = 10-12; Urina inoculada = 10-7 LEPTOSPIRA TÉCNICA : PCR em Tempo Real – LIGHT CYCLER Amplificação do gene 23S rDNA que permite num só ensaio a detecção de 6 espécies patogénicas TEMPO DE RESPOSTA: 3 H (Considerando o tempo dispendido no pré-tratamento das amostras de urina) AMOSTRAS: Urina Sangue LCR Biópsias... Bordetella pertussis Detecção molecular de IS 481 Amostras: Secreções nasofarínge Zaragatoa nasofarínge Armazenar a 4ºC Volume mínimo amostra 400ml Extracção de ácidos nucleicos EZ 1 BioRobot – Qiagen Bordetella pertussis Limite de detecção ATCC 9797D Bordetella pertussis ATCC 9797D Diluição Concentração Resultado 10-1 14ng/mL POS 10-2 1,4ng/mL POS 10-3 1,4x10-1ng/mL POS 10-4 1,4x10-2ng/mL POS 10-5 1,4x10-3ng/mL POS 10-6 1,4x10-4ng/mL POS 10-7 1,4x10-5ng/mL POS 10-8 1,4x10-6ng/mL POS 10-9 1,4x10-7ng/mL +/- 10-10 1,4x10-8ng/mL NEG DNA genómico B. pertussis Diluições seriadas 10-1 a 10-10 Clostridium difficile Detecção de C. difficile de fezes - Multiplex PCR em Tempo Real Smart Cycler Gene tcdA: Toxina A Gene tcdB: Toxina B 2 Pares de Primers Sondas FAM: Toxina A TET: Toxina B Tempo de Resposta: ~ 3 H Controlo de Inibição Sensibilidade Analítica: 10 cópias genoma por reacção de PCR DETECÇÃO DE RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS (UBM-HGSA) BACTÉRIA Mycobacterium tuberculosis Helicobacter pylori RESISTÊNCIA MUTAÇÕES Rifampicina rpoB 526(CACGAC) 531 (TCGTTG) 533 (CTGCCG) Isoniazida katG 315 (AGCACC) 315 (AGCAAC) Claritromicina 23S rDNA TUBERCULOSE Identificação de isolados de cultura Identificação directa de produtos biológicos (em desenvolvimento) Espécie Tm M. tuberculosis 63ºC M. kansasii 59ºC M.avium 58ºC M.intracellulare 54ºC M.gordonae 49ºC 16S rDNA Gene 16S rDNA – natureza conservada no reino procariota PCR Universal uma reacção amplifica vários agentes Detecção da presença de bactérias em amostras clínicas estéreis 16S rDNA Aplicações: LCR, Sangue, produtos biológicos “estéreis” Problemas: Detecção de bactérias inviáveis Risco de contaminação laboratorial Risco de contaminação na colheita Correlacionar resultados positivos com a clínica 16S rDNA Inactivação do DNA exógeno (irradiação UV reagentes/material) Extracção de ácidos nucleicos Bactérias Gram - Bactérias Gram + Micobactérias Lise enzimática / mecânica Magna Pure LC, Roche Amplificação Total Nucleic Acid Isolation Kit Smart Cycler, Cepheid - PCR em Tempo Real Múltiplos controlos negativos (extracção, amplificação) 16S rDNA Sensibilidade analítica do método S. aureus 160 UFC/mL E. coli 200 UFC/mL Aplicação a 76 amostras de LCR (Meningite Bacteriana Aguda) Sensibilidade: 80%; Especificidade: 94.5% VPP: 84%; VPN: 92.7% Resultado – POSITIVO/NEGATIVO 16S rDNA Espécie Origem PCR em tempo real E. coli ATCC 25922 Pos S. aureus ATCC 25923 Pos E. faecalis ATCC 25212 Pos S. pneumoniae ATCC 6305 Pos P. mirabilis ATCC 12453 Pos E. cloacae ATCC 13047 Pos K. pneumoniae ATCC 13883 Pos P. aeruginosa ATCC 27853 Pos H. influenzae ATCC 49766 Pos N. meningitidis Isolado clínico Pos L. monocytogenes Isolado clínico Pos S. epidermidis Isolado clínico Pos S.agalactiae Isolado clínico Pos M. tuberculosis Isolado clínico Pos Leptospira sp Isolado clínico Pos 16S rDNA Estirpes detectadas por outros autores com os mesmos primers Acinetobacter calcoaceticus Clostridium perfringens Aeromonas hydrophila Corynebacterium genitalium Alcaligenes faecalis Erysipelothrix rhusiophathiae Bacteroides fragilis Gardnerella vaginalis Campylobacter fetus Lactobacillus acidophilus Campylobacter jejuni Leuconostoc paramesenteroides Eikenella corrodens Micrococcus luteus Flavobacterium meningosepticum Mycoplasma genitalium Legionella pneumophila Mycoplasma hominis Moraxella catarrhalis Mycoplasma pneumoniae Neisseria gonorrhoeae Peptostreptococcus anaerobius Providencia stuartii Peptostreptococcus magnus Salmonella typhimurium Propionibacterium acnes Serratia marcescens Streptococcus mitis Yersinia enterocolitica Streptococcus sanguis 16S rDNA Desafio: sensibilidade sem comprometer a especificidade Kits de Extracção MGrade Enzimas LowDNA Essencial: Resultados positivos Identificação do produto amplificado Distinguir contaminações de verdadeiros positivos Correlação com clínica Valor Preditivo Positivo Sensibilidade
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