Construção e caracterização de Isca correspondente
ao domínio Citoplasmático de Semaforina 5A
Fernanda Rigo
CAPES/CNPQ
Silvio Marques Zanata, Adriana Frohlich Mercadante e Celso Fávaro Junior
Resultados e Discussão
Introdução e Objetivos
As semaforinas 5A são moléculas sinalizadoras que atuam no
desenvolvimento do sistema nervoso e desencadeiam respostas
atrativas e repulsivas no direcionamento dos axônios do
diencéfalo, associado a funções do sistema límbico¹. Além disso,
a Sema5A pode atuar como receptor e passar um sinal ao
interior da célula através do seu domínio citoplasmático².
O objetivo deste projeto é a contrução e caracterização de iscas
que mais tarde serão utilizadas em um sistema de duplo híbrido
para descrever interações proteicas entre a Sema5A e demais
proteínas.
Fig. 01: PCR de colônia –Colõnias de
1 a 5, GR: padrão de pares de base. *:
colônias positivas. +,-: controles
positivo e negativo da PCR.
Método
Desenho dos
iniciadores (Foward
e Reverse) para
Sema5A
PCR para
amplificação do
inserto e clonagem
no pGilda
Replicação do
Vetor em E. Coli
DH5α
Transformação em
leveduras RFY 206
Caracterização
(Autoativação e
expressão)
PCR de colônias
.
Obtenção do Vetor
pGi_A e
sequenciamento
Fig. 02: Digestão plasmídeo
purificado – LH,100bp: padrão de
pares de base, Flexa: inserto.
Os iniciadores desenhados foram utilixados em uma
PCR pare a obtenção do inserto referente à porção de
citoplasmática da Sema5A. O inserto foi clonado no
plasmídeo pGilda, através de digestão pelas enzimas
EcoRI e BamHI. O vetor foi replicado em bactérias
DH5α e uma colônia positiva foi escolhida, de acordo
com resultado da PCR de Colônia (fig. 01).
A partir da colônia selecionada o vetor
(pGi_A) foi purificado e linearizado (fig.
02)
e
sequenciado
(dados
não
mostrados) para confirmação da sua
correta construção. A colônia 04 foi
expandida e o vetor pGi_A purificado em
larga escala para transformação em
leveduras e caracterização da isca.
Os testes de autoativação e expressão
apresentaram indicios de autoativação do
gene repórter (fig. 03) e, através de
western blot não foram identificadas
03:
Teste
de
bandas para a expressão da porção Fig.
Autoativação – Colonias
citoplasmática da Sema5A nos testes de azuis
representam
ativação do gene reporter.
expressão.
Conclusões
¹HILARIO, J.D.; RODINO-KLAPAC, L.R.; WANG, C.; BEATTIE, C.E.
Semaphorin 5A is a Bifunctional axon Guidence Cue for Axial Motoneurons in
vivo. Dev. Biol. 1;326: 190, 200, 2008.
²TAMAGNONE, L.; COMOGLIO, P.M. Signalling by semaphorin receptors:
cellguidance and beyond. Trends Cell Biol 10: 377-83, 2000.
³ ORIGENE. DupLEX-A Yeast Two-Hybrid System. OriGene Technologies, Inc.,
v. 2,7, 2008
Devido ao seu potencial de autoativação, as iscas para porção
citoplasmática de Sema5A não são viáveis. Será necessário alterar o
plasmídeo e o tipo de levedura para versões menos sensíveis à
autoativação³ ou ainda eliminar sítios de autoativação da sequencia
da porção citoplasmática da Semaforina 5A.