QBQ 0316 – Bioquímica Experimental
Carlos Hotta
Análise de dados (P1 e P2)
20/08/2014
Prática 2 – Dosagem de proteína
O que podemos medir:
Concentração de proteínas no lisado (mg/ml)
Quantidade total de proteínas extraídas (mg)
Eficiência da extração de proteínas (mg/g
levedura)
Como proceder:
1. Calcular as concentrações de proteínas
usadas na curva-padrão
2. Plotar a curva padrão da concentração de
proteína pela Abs595nm
3. Calcular a equação da reta para o gráfico
plotado
4. Calcular a concentração de proteínas
(mg/ml) no L100x (ou L20x)
5. Calcular a concentração de proteínas
(mg/ml) no lisado inicial
6. Calcular a quantidade total de proteínas
no lisado (mg) e a eficiência da extração de
proteínas (mg/g de levedura)
Curva-padrão do reagente do Bradford
Cuidados:
• O reagente de Bradford, em
contato com proteínas, fica
gradativamente mais azul com o
passar do tempo. Por isso é
necessário prestar bastante
atenção ao tempo de incubação
• A curva-padrão de proteínas do
reagente de Bradford é logarítmica
mas o ideal é usar apenas a fase
linear
• Apenas as absorbâncias que estão na faixa compreendida pela curva-padrão
devem ser usadas
• A unidade do eixo X e Y são importantes pois elas que indicarão as unidades
que você deverá utilizar na sua equação da reta
P3 - Determinação da atividade enzimática
O que é uma α-glicosidase?
• as α-glicosidases quebram as ligações alfa-1,4 entre glicoses
• as β-glicosidades quebram as ligações beta-1,6 entre glicoses
4
maltose
3
2
1
4
3
2
• as α-glicosidases quebram principalmente amido e dissacarídeos, como a
maltose
1
Quanto temos de α-glicosidase?
• Não é prático medir diretamente o número de α-glicosidases na solução de
lisado
• No entanto, é fácil medir a atividade enzimática da α-glicosidase
• A atividade de uma enzima pode ser estimada medindo-se a formação de um
produto ou o desaparecimento de substrato
S → P (reação lenta)
E + S ↔ ES → E + P (reação rápida)
↓
V = k [E] [S]
• Assim, se [S] inicial é praticamente constante, a velocidade inicial da reação é
diretamente proporcional à concentração de enzima
Como medir a velocidade de uma reação?
V = k [E] [S]
Se menos de 5% do substrato for consumido, pode-se assumir que a Vinicial é
constante e que é diretamente proporcional à concentração de enzima.
Medida da velocidade inicial
1. Construir uma curva de [P] x tempo e ver se é linear
Determinação da atividade enzimática do lisado (U)
1 unidade (U) – quantidade de enzima que transforma 1 µmol de substrato (ou 1
µmol de produto) em 1 minuto
A medida da atividade enzimática pode ser facilitada se o produto ou o substrato
forem coloridos ou fluorescentes
p-nitrofenil-α-glicosídeo (NPαGlc)
Atividade enzimática do lisado (U) - quantidade de
enzima que transforma 1 µmol de substrato (ou 1
µmol de produto) em 1 minuto
Concentração de atividade enzimática do lisado
(U/ml) – Atividade enzimática contida em 1 ml de
solução
Atividade específica do lisado (U/mg) - Atividade
enzimática contida em 1 mg de proteína (medida
de pureza da enzima)
Temperatura e pH são controlados!!
P3 - Determinação da atividade enzimática
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•
•
•
Monitoramento da concentração do produto ao longo do tempo, mantendo-se
a mesma concentração de substrato e lisado
Diferentes concentrações de lisado (L10x, L50x e L500x) serão utilizado para se
observar se há síntese de produtos com velocidade constante
Manter reagentes no gelo, iniciar a reação transferindo para o banho a 30oC e
parar a reação adicionando tampão bicarbonato (pH 11)
A absorbância (420 nm) será medida no espectrofotômetro de
microplacas (200 µl). Cada ponto será medido três vezes.
P4 - Determinação do pH ótimo
P4 - Determinação do pH ótimo
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Monitoramento da atividade enzimática do lisado em diferentes tampões com
pH diferentes (4.0, 5.0, 6.0, 8.0 e 9.0)
Usar a diluição com melhor padrão de crescimento de absorbância
Os dados da P3 serão utilizados para se medir a atividade enzimática em pH 7.0