Universidade Estadual de Londrina
Departamento de Biologia Geral
Laboratório de Citogenética Animal - LACA
TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA DE INSETOS
Obtenção das Preparações Citológicas
MEIOSE (Sem a utilização de colchicina)
a. dissecar o animal em solução fisiológica para insetos, retirar os testículos e transferí-los
para uma placa de Petri contendo solução hipotônica (água de torneira), durante 3
minutos (variável);
b. transferir os testículos para uma placa de Petri contendo fixador Carnoy Ι (metanol - ácido
acético, na proporção 3:1), durante 30 minutos, no mínimo;
c. guardar o testículo em eppendorf com fixador Carnoy I novo na geladeira,
OU
d. macerar sobre uma lâmina, um dos testículos juntamente com uma gota de ácido acético
45%;
e. secar a lâmina em uma placa de metal a temperatura de 35 a 40°C.
MITOSE (Com a utilização de colchicina)
As preparações citológicas, para o estudo de cromossomos mitóticos, a partir
de embriões e órgãos de acordo com a técnica descrita por WEBB et al. (1978), com
algumas modificações, descritas a seguir:
EMBRIÕES
a. dissecar os ovos em solução fisiológica para insetos, retirar o embrião e transferí-lo
para um frasco, contendo colchicina 0,05% (em solução fisiológica para insetos),
durante 2 horas;
b. acrescentar um volume de água de torneira igual ao de colchicina, por 10 a 15 minutos;
c. adicionar 10 gotas de fixador Carnoy Ι (metanol - ácido acético, na proporção 3:1),
durante 5 a 10 minutos;
d. transferir os embriões para uma placa de Petri, contendo fixador Carnoy Ι durante 30
minutos, no mínimo;
e. macerar o embrião, juntamente com uma gota de ácido acético 45%, sobre uma lâmina;
f. secar a lâmina em uma placa de metal à temperatura de 35 a 40ºC.
COLORAÇÕES
Coloração Convencional Segundo Giemsa
corar a lâmina, à temperatura ambiente, durante 12 minutos (variável), com uma solução
contendo (nesta seqüência, não inverter):
47 ml de água destilada,
1,5 ml de solução comercial de Giemsa (Merck) e
1,5 ml de tampão fosfato pH 6.8
lavar em água destilada e secar ao ar.
Coloração Diferencial
Impregnação pelo Íon Prata
Coloração das regiões organizadoras de nucléolos (RONs - HOWELL &
BLACK,1980), com algumas modificações:
a. colocar sobre a lâmina uma gota de solução coloidal reveladora (1g de gelatina Merck ou
comercial, dissolvida em 50 ml de água destilada e 0,5 ml de ácido fórmico) e duas gotas
de solucão de nitrato de prata (50%);
b. cobrir com uma lamínula e incubar em câmara úmida, durante 3 a 5 minutos, à
temperatura de 67°C;
c. lavar em água destilada e secar ao ar.
Microscopia Eletrônica de Transmissão
Obtenção dos Microestendidos Celulares
Técnica segundo LOIDL & JONES (1986), com algumas modificações:
a. dissecar e retirar os testículos e, em um pedaço de Parafilm, macerá-los com lâmina de
barbear;
b. gotejar 3 a 4 gotas de lipsol (0.5%) em uma lâmina, previamente revestida com uma
película plástica (passar a lâmina em uma solução contendo 100 ml de clorofórmio P.A. e
0.7g de plástico "Falcon"), adicionar o macerado testicular (1 gota) e esperar alguns
segundos (20-40);
c. em seguida colocar de 7 a 8 gotas de solução contendo paraformaldeído a 4% e sacarose
0.1M;
d. deixar a lâmina secar, aproximadamente 24 horas, passá-la rapidamente (40 segundos)
em água destilada e secar ao ar.
Técnica segundo SOLARI & COUNCE (1977), com algumas modificações:
a. dissecar e retirar os testículos e, em um pedaço de "Parafilm", macerá-los com lâmina de
barbear, em 1 ou 2 gotas de solução contendo 100 ml de solução fisiológica para insetos
e 3 a 4 gotas de soro albumina bovina a 22% (Prothemo), até se obter uma suspensão
celular;
b. encher mini-cubas com solução de NaCl 0.55% e com o auxílio de uma pipeta Pasteur
bem fina, pingar uma gota da suspensão celular na superfície tensionada da solução de
NaCl, com a finalidade de espalhar a gota na hipofase de NaCl ;
c. esperar 45 segundos;
d. encostar levemente, na superfície tensionada, uma lâmina previamente plastificada (em
uma solução contendo 100 ml de clorofórmio P.A. e 0.7g de plástico "Falcon"), esperar
alguns segundos e retirar;
e. mergulhar a lâmina em uma solução fixadora de Paraformaldeído 4%/SDS 0,03% (pH 8.0
- 8.2 ajustado com tampão borato pH 9.2), deixar por 3 minutos e retirar;
f. escorrer o excesso de fixador, encostando a base da lâmina em um papel de filtro;
g. mergulhar novamente a lâmina em uma solução fixadora de Paraformaldeído 4% (pH 8.0 8.2 ajustado com tampão borato pH 9.2), deixar por 5 minutos;
h. logo em seguida, sem deixar secar, passar a lâmina em solução de Photoflo (0.4%), de
pH 8.0 - 8.2, por 15 segundos e retirar;
i. encostar a lâmina verticalmente sobre um papel de filtro e deixar secar ao ar.
Contraste dos Microestendidos Celulares
Posteriormente, as lâminas contendo os microestendidos celulares, foram
impregnadas pelo nitrato de prata, com substituição da lamínula por um tecido de nylon
(Nybold 3XXX - 300 ou 68 GC - 243), ou contrastadas com PTA (ácido fosfotúngstico), como
descrito a seguir:
a. mergulhar a lâmina numa solução de PTA/etanólico 1% (1 parte de PTA aquoso a 4% e 3
partes álcool 100%), por 10 a 20 minutos no escuro e lavar em 3 banhos consecutivos e
novos de álcool etílico P.A.
Foram utilizadas telinhas de cobre (50 mesh) como suporte da película plástica
contendo os microestendidos celulares, obtidos com as técnicas decritas anteriormente.
SOLUÇÕES
Plastificação das lâminas
Usar lâminas novas e/ou que não estejam riscadas ou corroidas. Limpar estas
lâminas muito bem passando-as no álcool, e secá-las no secador. Lembrar que as lâminas
muito limpas e posteriormente plastificadas dificultam a retirada da película plástica, e que
nas lâminas não muito limpas a película plástica sai com muita facilidade, dificultando o
manuseio da lâmina durante a preparação.
Para 100ml de clorofórmio P.A. MERCK - 0.55g (ou 0.70g) de plástico "Falcon" (a
concentração do plástico na solução é importante pois é utilizada como suporte das células,
assim uma película muito grossa pode interferir durante a observação ao ME, o mesmo com
uma muito fina).
Fazer um suporte com uma linha e pregador (roupa). Prender a lâmina no
pregador e mergulhar na solução, segurando pela linha. Contar até 5 e retirar da solução
num movimento contínuo parando na coluna. Levantar em seguida, com movimento também
contínuo até retirar a lâmina da proveta. Não fazer movimentos rápidos. Deixar secar as
lâminas secarem e logo em seguida guarda-las. Tomar cuidado com a umidade relativa do
ar, se for muito alta ou se o clorofórmio estiver hidratado, a película plástica sairá repleta de
microburacos.
Paraformaldeído (LOIDL)
Paraformaldeído (4%) - 0.1M de sacarose.
Colocar num Erlenmeyer 80 ml de H2Od, aquecê-la num agitador (ou
microondas) 80 - 90ºC. Em seguida, acrescentar 4g de Paraformaldeído. Esperar 30 min. (80
- 90ºC com agitação), se a solução ainda não estiver clara, adicionar de 3 a 4 gotas (aos
poucos- sempre esperando algum tempo para não colocar gotas a mais) de NaOH 0.1N.
Depois de clara, adicionar sucrose, e completar o volume até 100ml com H2Od. Resfriar
imediatamente em gelo. Filtrar a solução em filtro milipore 0.2.
CUIDADO: vapores tóxicos, tampar com placa de Petri pequena.
Paraformaldeído (SOLARI)
Idem LOIDL sem acrecentar sucrose. Acrescentar traços de Phenol-red (a
solução ficará amarela, ± 6 gotas) a medida que dor acrecentando NaOH 0.1N a solução
ficará violeta. Esfriar com gela e filtrar com papel de filtro qualitativo. Normalmente, o pH da
solução fica mais ácido depois de fixo, neste caso acrescentar borato de sódio 0.01N gota a
gota até pH= 8.0 - 8.2.
vermelho de fenol
pH ácido - amarelo
pH básico violeta (8.0 - 8.2)
Solução PHOTO-FLO 200 (KODAK) para uso
Photoflo (0.4%) com traços de phenol-red e acertar o pH 8.0-8.2 com tampão
borato.
Não completar inicialmente o volume do photo-flo até 100ml (aprox. 80ml).
80ml H2Od
± 15 gotas Phenol-red
gotas de tampão borato.
SOLUÇÃO S.D.S. (mãe)
solução SDS 0.3% em Paraforma;deído 4% já preparado.
SOLUÇÃO S.D.S. para uso
soluç~`ao 0.03% também em fixador paraformaldeído 4%
C1 x V1 = C2 x V2
0.3 x 5 = 0.03 x V2
V2 = 50ml
5ml SDS 0.3%
45ml de paraformaldeído 4%
Esta concentração pode ser aumentada ou diminuída, dependendo dos
resultados obtidos com o material.
Na hora de usar, lembrar que o pH deve ser reajustado para 8.0-8.2, caso a
solução a ser utilizada estiver ácida. Para isso prepara a quantidade desejada e finalmente
pingar algumas gotas de tampão borato.
Contrastação das lâminas pelo PTA