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IV Mostra de Pesquisa
da Pós-Graduação
PUCRS
Caracterização comparativa de células dendríticas em pacientes
com neoplasia mamária por estágio tumoral
Carolina Antas Torronteguy, Cristina Bonorino (orientador)
Programa de Pós Graduação em Biologia Celular e Molecular, Faculdade de Biociências, PUCRS,
Resumo
Introdução
A neoplasia mamária é a de maior mortalidade entre as mulheres brasileiras, sendo
que o Rio Grande do Sul encontra-se entre os estados com as maiores taxas (7,7 a 18,4 óbitos
por 100 000 mulheres). Nos estágios mais avançados é necessário fazer quimioterapia e/ou
radioterapia cujos efeitos deletérios no sistema imune são bastante conhecidos. Nos últimos
anos, diversos trabalhos tem mostrado tentativas de utilização de terapia celular como
alternativa terapêutica para várias neoplasias como: melanoma, cólon, mama, sarcoma renal.
A grande estrela desta nova abordagem terapêutica é um subtipo celular especializado na
apresentação de antígenos: a célula dendrítica.
As células dendríticas fagocitam os antígenos tumorais no sítio do tumor, migram para
os linfonodos drenantes, onde os apresentam em um contexto MHC I, para as células T. Além
disso, as células dendríticas fazem o prime das células T naive e representam a união entre a
imunidade inata e a celular. No entanto, são conflitantes os resultados do uso clínico de
vacinas com células dendríticas em humanos. Estudos recentes mostram que os tumores
induzem um estado de tolerância imune. Os estudos clínicos de terapia celular são realizados
em pacientes com neoplasias avançadas e nossa hipótese é de que as células dendríticas se
comportem de maneira diferente conforme o estágio tumoral. Nosso objetivo é caracterizar
fenotipicamente as células dendríticas em cada estágio tumoral comparando com controles
saudáveis e com controles portadores de patologia mamária benigna e um ensaio de
sinalização através de western blots após estimulação destas células com diferentes ligantes
de receptor toll.
Metodologia:
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O estagiamento tumoral é determinado por um padrão internacional denominado sistema
TNM. No total teremos 6 grupos: Sem neoplasia e sem alterações benignas nas mamas –
controles, sem neoplasia, mas com alterações benignas nas mamas – controles, com neoplasia
estágio clínico I, com neoplasia estágio clínico II, com neoplasia estágio clínico III, com
neoplasia estágio clínico IV. Critérios de Exclusão: Uso de quimioterápicos (prévio ou atual),
uso de radioterapia (prévio ou atual), uso de imunossupressores (prévio ou atual). Geração de
células dendríticas à partir de monócitos do sangue periférico: Serão coletados 12 mL de
sangue venoso periférico de cada paciente e cada controle, em tubo heparinizado. As células
mononucleares serão separadas por ficoll histopaque. Após isoladas, as células aderentes
serão colocadas em cultura com meio AIMV com 1mL de R-10 acrescido de 50 ng/mL de IL4 e 50 ng/mL de GMCSF e deixadas incubar. No quarto dia, são adicionados novamente IL-4
(50ng/mL) e GMCSF (25 ng/mL), sem trocar o R-10. No quinto dia, acrescenta-se TNF-α
(50ng/mL), para maturação das MoDCs. No sétimo dia de cultura, as células não aderentes
serão removidas e marcadas para citometria de fluxo, em placas de 12 poços: 5x106 células
por poço e incubadas por 2 horas em estufa a 5% de CO2 a 37oC e após, lidas por citometria
de fluxo. Marcadores: CD1a, CD14, CD11c, CD83, CD86, CD40, CCR7, CD80, HLADR.
Sinalização - Western Blot: Parte das células dendríticas retiradas da cultura no dia sete,
serão replaqueadas e colocadas em culturas para estímulo com LPS (via TLR4), CPG (via
TLR9), PGN (via TLR 2, NOD1 e NOD 2) e nada (controle negativo) por 15min, 30 min e
1h. A seguir parte delas será coradas para P38 e ERK1/2 para posterior análise por citometria
de fluxo e parte delas será lisada. O lisado celular será então analisado por meio de western
blot para a expressão de diferentes marcadores das diferentes vias inflamatórias do receptor
toll. Anticorpos: Anti Erk , pErk, NFkB, Map kinase p 38. Análise estatística: KolmogorovSmirnov, Kruskal-Wallis, ANOVA. Um valor de p menor que 0.005 será considerado
estatísticamente significante. A análise dos dados será feita com o programa GraphPad Prism
versão 4.0 (GraphPad Software, San Diego, CA) e com programa programa SPSS
Resultados (ou Resultados e Discussão)
Nossos resultados são preliminares ainda, mas encontramos diferenças no número de células
dendríticas geradas à partir de monócitos de pacientes e controles, sendo que os pacientes
parecem ter menos células dendríticas. Interessante que nem pacientes nem controles parecem
expressar CD80. As células parecem aumentar a expressão de HLS DR e CD 11c após
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estímulo com peptidoglicano (PGN), o que não observamos após o estímulo com LPS. Os
pacientes parecem expressar meno CD11c e menos HLADR em relação aos controles
saudáveis.Os dados estatísticos ainda não foram realizados devido ao pequeno número de
amostras até o momento. Os blots serão feitos assim que chegarem os anticorpos (já
encomendados).
Conclusão
É possível que estejamos estimulando as células dendríticas com excesso de LPS, faremos
uma curva e LPS, para determinarmos se a falta de resposta por nós observada é devido à
dose inadequada. Até o momento, nossos dados são condizentes com a literatura, mostrando
um estado de menor ativação das DCs das pacientes em relação aos controles, mas
necessitamos de um número maior de pacientes para realizarmos análise estatística e termos
dados objetivos.
Referências
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