METABOLISMO
Estequiometria e balanço de fluxos
(em perspectiva sistêmica)
Notas de Aula
Manuel Mateus Ventura
Brasília, 2006
•
METABOLISMO
• Estequiometria e balanço de fluxos
•
(em perspectiva sistêmica)
• Notas de Aula
(apresentação em MS - ppt)
por Manuel Mateus Ventura
• Brasília, 2006
2
• Estas notas de aula visam apresentar aos
•
•
•
•
•
estudantes de graduação e, particularmente,
aos de pós-graduação, na área de Biologia,
um dos tópicos de maior relevância teórica
e prática, que se insere em Biologia de Sistemas. São um esforço didatização.
•
[email protected] (para contacto).
• Disponível em www.manuelmateusventura.pro.br
• jun-2006
corrigido em 11-08-2006
3
REAÇÕES QUÍMICAS
• Reações químicas ocorrem quando
moléculas que se encontram alteram suas
composições e estruturas com reordenação de seus átomos constitutivos e surgimento de outra(s) molécula(s).
4
REAÇÕES QUÍMICAS 2
• Equação estequiométrica: indica as es –
pécies que participam da reação (reagen tes e produtos) e suas proporções mole culares relativas (estequiometria):
a1A1+ a2A2+...+anAn = b1B1+ b2B2 +...+bmBm
ou, de forma mais compacta,
∑r arAr -∑P bPBP = 0
r = 1, 2, ... , n
p = 1, 2, ... , m
5
Equações de reações
• ∑ij aijXj = 0 i = 1, ... , m reações
j = 1, ... , n
R1
R2
espécies
a11X1 + a12X2 + ... + a1nXn = 0
a21X1 + a22X2 + ... + a2nXn = 0
-------------------------------------------------------------
Rm
am1X1+ am2X2+ ... + amnXn = 0
6
• A equações estequiométricas em forma
matricial:
a11 a12 ... a1m
X1
a21 a22 ... a2m ∙ X2 =
-------------------------------
an1 an2 ...
---
anm
a11X1 + a12X2 + ... + a1mXm
a21X1 + a22X2 + ... + a2nXm
Xm
=
0
0
= 0
---------------------------------------------------
am1X1+ am2X2 + ... + amnXm
0
7
• Conservação de elementos
A equação estequiométrica deve ser
balanceada para os elementos que
constituem as espécies moleculares
(reagentes e produtos) que participam
da reação.
Os elementos conservam seus números
atômicos Z.
8
Matriz de elementos:
Cada de seus elementos dá o número de
átomos de um elemento químico por molécula de reagente ou produto.
Exemplo, a seguir.
9
• Consideremos a reação:
GLICOSE(G) + ATP = G6P + ADP + H+
Matriz de elementos:
G ATP G6P ADP
H + H+
C
E =
O
N
P
12
6
6
0
0
13
10
13
5
3
12
6
9
0
1
13
10
10
5
2
10
• Conservação da carga:
Em uma reação deve haver balanço de
carga elétrica.
Matriz de carga:
para a reação anterior, tem-se
G ATP G6P ADP H+
Cel = 0
-4
-2
-3
1
11
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Redes de reações químicas
Estamos habituados a ver seqüencias de reações que se ramificam
ao nível de espécies moleculares
que participam das transformações
químicas. Por exemplo:
E
A
B
C
F
D
12
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Nessas redes, distinguem-se nós
ou vértices, em correspondência
às espécies moleculares e conexões ou arestas que indicam as
transformações químicas entre os nós.
Em sistemas muito complexos, como
os do metabolismo celular, as redes
de multirreações interconectadas
podem ter tamanho enorme,
constituidas por milhares de nós e
conexões.
13
• Redes biológicas são representações abstratas de sistemas biológicos, que apresentam muito das
propriedades fundamentais desses
sistemas.
De tais características, destacam-se:
a)modularidade, b)robustez ou
resiliência e c)recorrência na utili• zação de certos elementos.
14
• Redes de moléculas e reações
entre elas são o centro da
atividade celular, a qual resulta,
no todo, da combinação de todas
essas redes
(metabolismo e seu controle,
sinalização, expressão gênica
etc.)
15
• A arquitetura (topologia) de uma
rede relaciona-se à sua robustez
ou
resiliência, ou seja, a capacidade
de
resistência aos agentes externos e
internos que podem afetar ou
destruir
a integridade da rede.
16
• Redes biológicas são sistemas
dinâmicos, i.e., seu estado global
evolui no tempo.
• A dinâmica de uma rede depende
dos estados internos atingidos
pelos seus vértices e sua evolução
temporal.
17
• O estudo de redes como um todo
está a levar à descoberta de propriedades e princípios gerais válidos
para as mais diversas redes, inclusive biológicas.
Para esse fim, a contribuição de físicos tem sido relevante, por meio de
uma ferramenta adequada- a mecâ –
nica estatística.
18
• A representação de sistemas
biológicos por redes tem a
vantagem de permitir o uso de
conceitos e procedimentos da
teoria dos grafos, a qual tem
sido muito usada em tecnologia.
19
•
•
•
•
•
•
GRAFOS: representação simbólica
de interações ou transformações
entre quaisquer entidades(moléculas,elementos em crcuitos elétricos,
indivíduos em uma população,ecossistema ou grupo social,emissores e
receptores de informação etc.).
• Grafos são entidades matemáticas.
20
METABOLISMO
• O metabolismo da célula viva é uma rede
(“network”) de interconversões de espécies
químicas pela qual a célula obtém os blocos
estruturais e a energia necessários à sua
organização estrutural e funcional.
É um conjunto de reações químicas conectadas e integradas, caracterizado por uma topologia e uma dinâmica. As reações são, em geral, catalisadas por enzimas. Além de reações,
podem ocorrer processos de transporte.
21
Genética Proteínas Metabolismo Sinalização
Biologia Celular
Química - Computação- Biologia de sistemas
22
• ERA PÓS-GENÔMICA
(dados produzidos em alto fluxo por
NMR, MS, 2d-gel, DNA arrays, two-hybrids technique etc.)
(com base no Dagstuhl Seminar on
• Integrative Bioinformatics 2004)
•
segue
23
•
•
BIOLOGIA MOLECULAR
• Meta- OGE
bolismo
PRR
ProteTransômica criptômica
OGE:organização genômica estrutural
Metabo- PRR:padrões de regiões regulatórias
lômica
24
CERCA DE 600 BASES DE DADOS E VÁ RIAS FERRAMENTAS ANALÍTICAS DISPONÍVEIS NA WEB
CIÊNCIA DA
COMPUTAÇÃO
TAREFAS
BIOLÓGICAS
( MÈTODOS E
(EXPERIMEN-
CONCEITOS)
TAIS)
25
• A N Á L I S E (extração de informação)
•
integração
desafio
BIOINFORMÁTICA
INTEGRATIVA (novos níveis de entendimento)
CÉLULA VIRTUAL
26
•
•
•
•
•
O funcionamento de uma célula
envolve um sistema altamente
complexo de processos químicos
interconectados, o metabolismo, cuja
reconstrução, constitui a meta final
da biologia de sistemas.
27
Metabolismo decompõe nutrientes em moléculas mais simples e energia (catabolismo);
sintetisa moléculas orgânicas complexas (anabolismo), as quais são a base estrutural e
funcional da célula.
Metabolismo compreende:
- reações químicas catalisadas por enzimas
- metabolitos: pequenas moléculas consumi
das e produzidas nos processos químicos.
28
• Dado o papel relevante das enzimas, po –
de-se dizer que o metabolismo celular é a
expressão bioquímica (fenótipo bioquímico)
do genoma.
1 - Uma enzima pode catalisar mais de uma
reação química (promiscuidade de substrato); as reações catalisadas apresen –
tam, geralmente, similaridade.
2 – Enzimas podem ser formadas por mais
de uma cadeia peptídica e constituir oligômeros.
29
3 – Mais de uma enzima podem catalisar
a mesma reação química.
Assim, o número de enzimas não corres –
ponde ao número de genes que as codifi
cam e ao número de reações catalisadas.
30
• O METABOLISMO E SUA RE• GULAÇÃO SÃO AS FUNÇÕES
• MAIS FUNDAMENTAIS DE
UMA CÉLULA
31
• RECONSTRUÇÃO METABÓLICA
•
•
•
•
•
•
•
identifica, categoriza e interconecta
genes, proteínas, reações e metabolitos que participam do metabolismo de
um sistema biológico para constituir
uma rede, a qual pode ser usada como
base para caracterizar crescimento e
predizer fenótipos celulares.
32
• Reconstrução metabólica
•
GENOMA
•
SEQUENCIAMENTO (base de dados)
•
ANOTAÇÃO
• (identificação de segmentos codificantes+
•
dados bioquímicos e fisiológicos)
•
•
RECONSTRUÇÃO
da rede metabólica e regulatória
33
A modelagem e simulação de redes
• metabólicas são de grande relevân• cia para o entendimento quantitati • vo do metabolismo de um micro• organismo e servem ao aperfeiçoa• mento deliberado das capacidades
• metabólicas por meio das técnicas
• de DNA recombinante (engenharia
• metabólica).
34
SIMULAÇÕES COMPUTACIONAIS:
VANTAGENS:
podem mostrar a não viabilidade de hipóteses aparentemente plausíveis e, ao
confirmarem uma hipótese, podem
prover
predições quantitativas e mesmo direcionar o trabalho experimental.
Entretanto, não se deve esquecer de
que usam modelos e são simulações.
35
•
•
•
•
•
•
•
•
•
A enorme massa de dados de que
se dispõe e que resulta de técnicas
analíticas de alto fluxo (“high
throughput”) está a exigir o aperfei çoamento intenso e contínuo de
algorítmos que possibilitem o tratamento computacional para atingir
o entendimento integrado da dinâmica celular (tecnologias- “omics”).
36
•
•
•
•
•
•
•
Os dados que resultam do tra balho experimental com células
vivas constituem a base para
trabalhar com a modelagem computacional do metabolismo.
Simulação e modelagem,contudo,
são de relevância em conseguir, a
partir desses dados, visão mais pene• trante da dinâmica dos sistemas em
• estudo.
37
•
•
•
•
•
•
Para ter em mente !
“The important thing in science is
not so much to obtain new facts
as to discover new ways of
thinking about them.”
Sir William Bragg
38
• ABORDAGEM CINÉTICA
•
NO ESTUDO DO
•
METABOLISMO
39
•
•
•
•
•
•
•
•
A expressão das velocidades de
reações químicas por equações
diferenciais, com base na lei de
ação das massas, tem possibilitado o estudo da evolução no
tempo de sistemas metabólicos
não muito complexos, i.e., em escala subgenômica.
40
Tem sido o procedimento adotado
na cinética enzimática, para o estudo de enzimas individuais ou em
pequeno número.
Exige que sejam conhecidas as constantes de velocidade das reações envolvidas, o que representa grande obstáculo
no estudo de redes metabólicas complexas, em escala genômica.
41
• Contudo,
• eritrócito e mitocôndrio têm tido
seus metabolismos estudados por
via cinética.
42
Para a reação
k1
aA + bB
cC + dD,
k-1
tem-se
v = - (1/a)d[A]/dt = - (1/b)d[B]/dt
= 1/c)d[C]/dt = (1/d)d[D]/dt
v = velocidade da reação
k1, , k-1 = constantes de velocidade
43
• As equação cinética será
v = v - v = k1[A]α [B]β - k-1[C]γ [D]δ
onde os expoentes indicam a
ordem cinética relativa a cada
reagente; a ordem cinética da reação,
n = α + β + γ + δ.
Note-se que as ordems cinéticas
podem não ser necessariamente
Iguais aos respectivos coeficientes
estequiométricos.
44
• Seqüências de reações.
Seja o seguinte caso simples:
k1
k2
X1
X2
X3
X1´= dX1/dt = - k1[X1]
X2´= dX2/dt = k1[X1] – k2[X2]
X3´= dX3/dt = k2[X2]
[X1]0 + [X2]0 + [X3]0 = [X1]t + [X2]t + [X3]t
estado estacionário: X1´= X2´= X3´= 0
45
• No estado estacionário, os fluxos
de reação não se anulam, como no
equilíbrio, mas compensam-se de
tal modo que dXi/dt = 0. Neste caso,
as equações diferenciais da cinética
convertem-se em um sistema de
equações algébricas simultâneas.
46
• Integração das equações
cinéticas:
• - em forma analítica ou exata,
possível somente em casos
especiais;
• - por métodos
numéricos,aproxima• dos e computacionais
47
• Equações cinéticas para sequências de reações, lineares ou
ramificadas, podem ser obtidas
pelo método computadorizado de
King- Altman, bem conhecido em
cinética enzimática.
48
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Programas para o estudo cinético
do metabolismo:
dos inúmeros disponíveis, indicaremos os seguintes:
GEPASI Pedro Mendes 1989 2002 //www.gepasi.org;
E-cell2 Keio University;
CellDesigner V. 2.26 2003-2005
The Systems Biology Institute
//www.celldesigner.org
49
MATRIZ
ESTEQUIOMÉTRICA
S
um conceito básico
em análise do metabolismo
50
Matriz estequiométrica (S)
•
Smn é uma matriz de ordem mxn, onde m
filas correspondem ao número de espécies
químicas (substratos e produtos) e n colu –
nas indicam o número de reações envolvendo essas espécies.
Os elementos de S são os coeficientes estequiométricos aij das espécies que correspondem às filas i e colunas j
i = 1,2,...,m
j = 1,2,...,n
S = aij
aij < 0 substratos
aij >0 produtos
aij = 0
51
UM IMPORTANTE CONCEITO
O conceito de matriz estequiométrica é es –
sencial para representar e analisar mate –
maticamente os sistemas metabólicos.
Possibilita o uso da álgebra linear, inclusive
da análise convexa, em bioinformática e
biologia computacional.
52
Matriz estequiométrica 2
R1 R 2
Rn
a11 a12 ... a1n
S =
a21 a22 ... a2n
1,...,m
reações j = 1,...,n
espécies
químicas i =
--------------------------------
am1 am2 ... amn
aij : coeficientes estequiométricos
aij < 0 substratos aij > 0 produtos
aij = 0 a espécie molecular i não participa
da reação j
53
• Na matriz estequiométrica, como definida
aqui, temos:
a)as filas de S representam as espécies
químicas (substratos e produtos);
b)as colunas de S indicam as reações;
c)os elementos de S são os coeficientes
estequiométricos aij com sinal negativo
para substratos e positivo para produtos.
aij = 0 indica que a espécie i não partici
–
54
pa da reação j.
• Subespaços de S:
a11 a12 ... a1n
S = a21 a22 ... a2n
espécies: 1, ... , m
reações: 1, ... , n
--------------------------------
am1 am2 ... amn
S pode ser representada tanto pelos vetores
coluna quanto pelos vetores fila:
rT1
a1k
S = c1 ... cn = .
ck = .
ri =
.
.
.
.
rTm
amk
ai1
.
.
.
ain
55
Subespaço de vetores coluna:
é determinado pelo conjunto de vetores
coluna de S e denotado por R(S).
R(S) determina o espaço de concentração
dinâmico.
Os vetores coluna, que correspondem às
reações químicas da rede metabólica considerada e que constam de S, contribuem
para as variações das concentrações dos
metabolitos.
56
Subespaço de vetores fila:
é determinado pelo conjunto de vetores fila.
e denotado por R(ST).
No espaço de fila estão as variações de
concentração que contribuem às taxas de
fluxo das reações.
57
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Posto (“rank”) de uma matriz, r .
Definição. O posto de uma matriz A é a
ordem da maior sub-matriz quadrada cujo
determinante não é nulo.
Ex.:
3 0 3
3 0 3
A= 2 4 6
detA = 2 4 6 =
1 5 6
1 5 6
=
3 4 6 + 3 2 4
5 6
1 5
= 0
• O posto de A não pode ser 3, pois detA = 0, mas
• é igual a 2, como se pode ver.
58
• Proposição. O posto da matriz A é igual à
dimensão do subespaço de seus vetores
coluna ou vetores fila:
postoA = dimR(A) = dimR(AT) = r
59
• ESPAÇO –N U LO DE S
Definição. O espaço –n u l o (direito) da
matriz
S é o conjunto de todas as soluções
v1
v = ... =
v1 ... Vn T
vn
das soluções do sistema de equações
Sv = 0,
o qual corresponde ao estado estacionário.
60
O espaço-n u l o é um subespaço e é
denotado por N(S) ou nulo(S).
Se r = posto de Smn, tem-se
dimN(S) = n-r , N(S) ┴ R(ST)
N(S) determina o espaço que compreende
os caminhos de estado estacionário da
rede metabólica considerada.
61
• Espaço-nulo (esquerdo) de Smn é o con –
junto das soluções
y1
y = ...
= y1 ... ym T
ym
do sistema de equações
STy = 0 .
É denotado por L = N(ST) ou nulo(ST) e
tem-se dim(ST) = m-r , N(ST) ┴ R(S).
62
• Seja a equação de balanço dinâmico
dx/dt = Sv = 0
e multipliquemos ambos os membros por L:
Ldx/dt = LSv = 0
Ldx/dt = 0
Lx = const.
A última expressão indica que os vetores de
L definem as relações de conservação entre
concentrações de metabolitos em uma rede
metabólica.
63
Matriz de espécies (reagentes
e produtos)
Vetor coluna:
•
•
Xm = X1
X2
... Xm
T
64
• CONSERVAÇÃO DE ELEMENTOS
• Seja a reação
G+ATP = G6P+ADP+H+
G ATP G6P ADP
S = -1 -1 1
1
H
C
O
N
P
12 13 12 13
6 10 6 10
6 13 9 10
0 5 0 5
0 3 1 2
.
-1
-1
1
1
=
0
0
0
0
= 0
E ∙ ST = 0
65
• CONSERVAÇÃO DA CARGA ELÉTRICA
•
G ATP G6P ADP
S = -1 -1 1
1
Cel= 0
-4
-1
-3
Cel ∙ ST = 0
A ortogonalidade entre Cel e ST indica
a conservação da carga.
66
MATRIZ ESTEQUIOMÉTRICA:um exemplo mais complexo
• Uma seqüência de reações da glicólise:
R1 Glicose(G) + ATP = G6P + ADP + H+
R2
G6P = F6P
R3
F6P + ATP = FBP + ADP + H+
R4
FBP = 63P + DHAP
R5 2G3P + NAD+ + Pi= BPG + NADH + H+
S, a seguir
67
R1
G
ATP
ADP
G6P
F6P
FBP
G3P
DHAP
BPG
NAD+
NADH
Pi
H+
-1
-1
1
1
1
R2
R3
R4
R5
-1
1
-1
1
-1
1
-1
1
1
1
-2
=
S
1
-1
1
-1
1
Posições em branco correspondem a zeros.
68
S de uma rede metabólica
• X1
X2
•
•
R1
R2
• X1 -1
• X2 1
-1
• X3
1
• X4
• X5
• X6
• X7
X3
X4
R3
X5
X6
R4
X7
R5
R6
R7
-1
-1
1
-1
1
-1
1
1
-1
1
69
Conectividades em S
• S é uma matriz que conecta todas as espécies químicas (metabolitos) que partici –
pam de um determinada sistema metabóli –
co.
Propriedades de conectividade.
- Número de participação: número de vezes que um
metabolito participa das
- reações do sistema. É, no mínimo, 2 para
- Metabolitos internos.
- Número de moléculas em uma reação: soma
- de todos os coeficientes estequiométricos na equação
- de uma reação.
70
Partição de S
• A matriz estequiométrica plena S abrange
reações internas (n) e metabolitos internos
(m) da célula que correspondem a uma partição denotada por Sint. Entretanto, outras
partições ou subpartições podem ser consideradas, como para substratos, produtos,
Intermediários metabólicos, constituintes de
biomassa e reações de troca entre organeloas e outros compartimentos da célula.
71
Partição de S
Sint
S =
Sext
72
Partição de S: exemplo específico
R1
R2
R3
R4
R5
R6
R7
R8
Glicose
-1
subtratos
------------------------------------------------------------------------Succin..
1
Lactato
1
H2
1
produtos
Acetato
1
etanol
1
-------------------------------------------------------------------------PEP
2
-1
-1
NAD+
-1
2
1
2
NADH
1
-2
-1
-2
intermediários
CO2
-1
1
ATP
1
1
Acetl-CoA
1
-1
-1
73
•
•
•
•
•
•
•
•
•
No sistema metabólico da célula, as espécies químicas que participam das várias
reações são distinguidas como
a) substratos,
b) produtos metabólicos,
c) metabolitos intermediários e
d) produtos de biomassa.
O termo metabolito, freqüentemente, tem
significação abrangente.
74
•
•
•
•
•
•
Coeficientes estequiométricos:
αij para substratos Xs ; βij para produtos
metabólicos Xp; γij para constituintes de
biomassa Xb; gij para metabolitos intermediários Xint.
Para as j reações, tem-se
∑j ∑i αijXs + ∑j ∑i βijXp + ∑j ∑iγijXb + ∑j ∑igijXint =0
A seguir, em forma matricial :
75
• Estequiometria global da célula em forma
• matricial:
ATXs + BTXp+ ΓTXb + GTXint = 0
ou ainda, por partição da matriz estequio –
métrica única para o sistema.
•
•
•
•
•
ST
-------------------------------------------------
---------------------------------------
Xs
Xp = 0
Xb
Xint
76
REAÇÕES E FLUXOS
• As reações químicas do metabolismo podem ser vistas
como fluxos de matéria associados a trocas de
energia e processos de transporte.
Ao serem referidas, reações são quase sempre tomadas como os fluxos que ocorrem
através delas.
As redes metabólicas são fluxos interconectados que a célula viva mantém sob controle por me –
canismos de modulação enzimática (ativação e inirição) e regulação da expressão de genes.
77
Fronteiras em sistema metabólicos
• Sistemas metabólicos podem ser delimi –
tados por fronteiras, físicas ou não.
Ao ser definida a fronteira, tem-se
- interior, onde está o sistema metabólico
considerado;
- exterior .
Fluxos internos ocorrem no interior e fluxos
externos entre o interior e o exterior.
78
Rede metabólica
•
•
•
v6
v3
b1
v1
A
•
•
•
•
v2
B
b2
D
E
F
G
v4
C
v5
v7
b3
fronteira
79
• Matriz estequiométrica da rede:
•
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 b1 b2 b3
•
-1
•
1 -1
•
1 -1 1 -1
• S=
1 -1
•
•
1
•
-1
-1
1
-1
-1
1
-1
A
B
C
D
E
F
G
80
• Vetor de concentração
•
•
x1
x = x2
.
.
.
xm
Vetor de fluxo
v1
v2
v3
v = v4
v5
v6
v7
b1
b2
b3
81
O vetor de fluxo é função das concentra –
ções e das constantes cinéticas k das
reações:
v = v (kj) j = 1, 2, ... , n
kj são parâmetros experimentais de difícil
determinação e nem sempre disponíveis.
As velocidades de reação são funções não
lineares das concentrações dos metabolitos,
na forma dada na cinética química.
82
•
•
•
•
Equação de balanço dinâmico :
dx/dt = S ∙ v
Estado estacionário:
dx/dt = S ∙ v = 0
• Metabolitos intermediários não variam
• suas concentrações dentro do intervalo de
tempo dos experimentos. São consumi• dos na mesma taxa em que são produzi• dos.
83
•
•
•
•
•
•
•
•
•
O estado estacionário, onde dXi/dt = 0, é
uma idealização, matematicamente vantajosa.
A escala de tempo dos processos enzimáticos, comparada com a dos vários pro –
cessos fisiológicos, justifica a aproxima –
ção do estado estacionário.
O tempo t não está presente nas equa –
ções de balanço do estado estacionário.
84
dx/dt = S ∙ v = 0
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 b1 b2 b3
•
-1
1 -1
1 -1 1 -1
1 -1
1
-1
-1
1
-1
1
-1
-1
v1 -v1-b1
v2
v1-v2
v3 v2-v3+v4-v5
v4 v3-v4-v6
v5 = v7-b2
v5 v5-v7
v6 v7-b3
b1
b2
b3
85
•
•
•
•
•
•
•
A consideração do estado estacionário permite substituir sistemas
de equações diferenciais em sistemas de equações algébricas lineares.
As derivadas dx/dt não mais aparecem.
86
• Para ilustração, tome-se a rede
metabólica (grafo) simples:
•
•
•
•
b1
v1
X1
v2
b2
v3
X2
v4
X3
87
•
•
•
•
•
•
•
•
O balanço de fluxo em estado
estacionário:
dx/dt = S ∙ v = o
Xi´ = dX1´/dt
v1
X1´
-1 -1 0 0 -1 0 v2
0
X2´ = 1 0 1 -1 0 -1 v3 = 0
X3´
0 1 -1 1 0 0
v4
0
b1
b2
88
•
•
•
•
•
-1 -1 0 0 -1 0
1 0 1 -1 0 -1
0 1 -1 1 0 0
v1
v2
-v1-v2-b1
v3 = v1+v3-v4-b2
v4
v2-v3+v4
b1
b2
89
•
Balanço de fluxos em estado
estacionário
•
•
•
dX1/dt = -v1-v2-b1
= 0
dX2/dt = v1+v3-v4-b2 = 0
dX3/dt = v2-v3+v4
= 0
90
• RESTRIÇÕES ADICIONAIS
• Sobre fluxos internos:
•
vj ≥ 0 j = 1, . . . ,n
• Sobre fluxos externos:
• exterior
sistema bj ≤ 0
• exterior
sistema bj ≥ 0
91
•
CONE DE FLUXOS
• n >> m : o número de reações
• excede de muito o número de
• metabolitos, o que correspon –
• de a dizer que o número de
• colunas de S é muito maior do
• o número de filas.
92
• Os sistemas de equações line• ares homogêneas formados
• pelas equações de balanço di• nâmico do estado estacionário,
•
S ∙ v = 0,
• têm um número infinito de solu• ções em seu espaço-nulo.
93
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Ao tomar em conta as restri –
ções (inequações) impostas
ao sistema, a análise convexa
mostra que o espaço de solução é um cone poliédrico comvexo, o qual contém todos os
pontos do espaço-nulo de coordenadas não negativas, mais
os pontos correspondentes aos
fluxos externos de coordenadas
negativas.
94
• Palsson & Schuster propõem
• que o espaço inteiro de fluxo,
• no qual estão contidas as so• luções do sistema, representa
• a capacidade da rede metabó• lica considerada.
95
• CONE DE FLUXO (estado estacionário)
p1
p3
p2
p4
pi arbitrários, somente para ilustração
96
•
•
•
•
•
•
•
•
“Caminhos extremos”
(extreme pathways)
Constituem um número míni –
mo de vetores que, por combinação linear, podem gerar
qualquer vetor do cone de
fluxo:
v = ∑i wipi , wi ≥ 0 , i = 1, ... , k
97
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Caminhos extremos:
são as arestas do cone poliédri –
co;
não podem ser representados por
combinações de quaisquer outros
vetores do cone, lembrando o que
ocorre com os vetores de base de
um espaço vetorial; são “conicamente independentes” (Schilling).
98
• Caminhos extremos:
• qualquer vetor do cone polié • drico pode ser representado
• por combinação linear não ne• gativa dos vetores de caminho
• extremo.
99
• Cada caminho-extremo de um
• cone poliédrico corresponde a
um conjunto de fluxos que sa• tisfaz à equação de balanço
• de massa mais as restrições.
100
• Restringindo o cone de estado
• estacionário:
• vimos que esse cone contem
• um número infinito de solu –
• ções;
• somente algumas soluções
• têm significação fisiológica.
101
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Restrições relativas a fluxos externos têm que ser consideradas, além das que já foram
citadas, tais como o organismo,
ambiente, disponibilidade de
substratos, transporte por difusão e outras.
Todas essas restrições resultam
em diminuição do espaço de fluxo.
102
• DISTRIBUIÇÃO OTIMIZADA
•
DE FLUXOS
• pode ser computada com re• lação a uma certa função-objeti• vo,linear, Z = ∑j cjvj .
103
• Escolhida a função-objetivo Z,
• a otimização (minimização/maxi• mização) de S∙v =0 + restrições
é um problema de
• programação linear (PL), geral –
• mente resolvido pelo algorítmo
• simplex.
104
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
A escolha de Z:
a função Z deve atender à maximização (ou minimização) de
uma determinada característica
da rede metabólica:
crescimento celular (max.);
concentração de um determinado metabolito (max./mini.);
demanda de energia (mini.)
etc.
105
Determinação dos caminhos
extremos de uma rede metabólica pelo algorítmo de Shilling:
Schlling,C.H.,Letscher,D. and
Palsson,B.O. 2000. J. theor.
Biol. 203: 229-248.
106
• Retome-se a rede metabólica
(grafo):
•
•
•
•
b1
v1
X1
v2
b2
v3
X2
v4
X3
• e, a seguir, sua matriz S.
107
•
v1 v2 v3 v4 b1 b2
•
X1 -1 -1 0 0 -1 0
• S = X2 1 0 1 -1 0 -1
•
X3 0 1 -1 1 0 0
• 3 metabolitos
• 4 fluxos internos, 2 fluxos externos
108
• Matriz inicial: ST unida a I4x4
•
X1 X2
•
1
-1 1
• T(0)=
1
-1 0
•
1
0 1
•
1
0 -1
• T(E)
1
-1 0
•
1
0 -1
X3
0
1
-1
1
v1
v2
v3
v4
b1
b2
109
• Na matriz inicial, identificar os metabolitos
que não têm fluxos externos a eles associados e cujo número é denotado por μ .
O metabolito X3, como se pode ver, é o único a não estar associado a um fluxo externo.
Assim, tem-se μ = 1.
A seguir, forme-se uma nova matriz por cópia de
todas as filas de T(0) que contenham um zero
na coluna de ST que corresponda a X3. No caso presente, copia-se somente a 1a. fila.
Em continuação, sejam adicionadas todas as combinações possíveis, de tal modo que se tenha zero na
coluna que corresponde a X3.
110
• Do procedimento anterior, tem-se
•
X1 X2 X3
•
1
-1 1 0 v1
•
1 1
-1 1 0 v2
• T( μ) =
1 1
0 0 0 v3
•
•
•
1
1
-1 0
0 -1
b1
b2
111
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
A partir da matriz T(μ), é formada a matriz
final T(final):
v1 v2 v3 v4
b1 b2
p1 1
0
0
0
-1 1
T(final)= p2 0
1
1
0
-1 1
p3 0
0
1
1
0 0
donde os caminhos extremos:
p1 = v1 – b1+b2 , p2 = v2 + v3 -b1+b2
p3 = v3 + v4
112
•
•
•
•
•
•
Exemplo
Verifique se o vetor
v = 5 2 3 -3 6 1 T
está contido no cone de fluxo da
rede metabólica em consideração
•
•
p1
p2
p3
v1
1
0
0
v2
0
1
0
v3
0
1
1
v4
0
0
1
b1
-1
-1
0
b2
1
1
0
5
2
3
0
-3 = 0 = 0
6
0
1
113
• Rede metabólica (grafo):
•
•
•
•
b1
p2
v1
X1
v2
X3
p1
b2
X2
v3 v4
p3
• com “caminhos extremos” indicados
114
MATRIZ ESTEQUIOMÉTRICA
Análise por
DECOMPOSIÇÃO DE VALOR
SINGULAR (SVD)
Por conveniência, é usada a abreviação em
inglês.
115
• DECOMPOSIÇÂO DE VALOR
• SINGULAR (SVD) DE UMA
• MATRIZ.
• Definição matemática.
• Seja Amxn uma matriz de elementos reais,
• geral.
•
•
•
•
•
A decomposição de valor singular de
Amxn é a fatoração A = Umxm∑mxn(Vnxn )T,
onde Umxm = “matriz de vetores singulares esquerdos”, ∑mxn= matriz diagonal e
Vnxn= “matriz de vetores singulares direitos” .
116
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Os elementos da matriz diagonal ∑mxn são
os valores singulares: σ1≥ σ2 ≥ ... ≥ σn ,
os quais são as raizes quadradas (não nulas) dos autovalores (eigenvalores) de
AAT e ATA.
U contém o espaço de coluna e o espaço
nulo esquerdo.
V contém o espaço de fila e o espaço nulo
de A.
O espaçp de fila contém informação
termodinâmica.
117
Colunas de U e V fornecem bases orto –
normais para os 4 subespaços fundamen –
tais de S.
As primeiras colunas de U e V fornecem
bases ortonormais para os espaços de co –
luna e fila, respectivamente.
As restantes m-r colunas de U dão uma
base ortonormal para o espaço-nulo esquerdo.
As n-r colunas de V dão uma base orto –
normal para o espaço-nulo.
118
• Mapeamento entre vetores singulares
• S = U ∑ VT
• SV = U ∑ VTV = U ∑
• Svk = σkuk
• S mapeia o vetor singular direito sobre
o vetor singular esquerdo por
• meio do valor singular correspondente.
119
•
•
•
•
•
•
•
•
SVD tem aplicações em várias áreas de
ciência e técnica e pode ser usada para
Identificar e caracterizar os aspectos bioquímicos dominantes da rede metabólica.
SVD mostra aspectos interessantes e de
utilidade da matriz decomposta, os quais
não são aparentes na matriz original.
A análise de S por SVD, a despeito de não
tratar explicitamente da dinâmica da
• rede considerada, fornece informação
• topológica sobre relações sistêmicas entre
120
• metabolitos e fluxos.
•
•
•
•
•
•
•
•
•
SVD torna evidentes aspectos úteis e importantes da matriz decomposta,os quais
não podem ser vistos diretamente a partir da matriz original.
As matrizes componentes U, ∑ ,V são, em
geral, ortogonais e independentes.
Os vetores singulares(modos) são ortonormais.
UTU = Imxm
VTV= Inxn
121
• Combinação linear de metabolitos e
de fluxos.
• dx/dt = S∙v
S= U∑VT
multiplicando por UT
•
• UT dx/dt = UTU∑VTv = ∑VTv
• d(ukTx)/dt = σk(vkTv) k = 1,...,r
• r : posto de S ; uk :vetor sing. esquer;
• Vk : vetror singular direito.
122
• Continuação
Do procedimento anterior, vemos que há
uma combinação linear de fluxos
vkT∙ v = vk1 v1 + vk2 v2 +... + vkn vn
que movimenta uma combinação linear de
Metabolitos. Os vk são contrbuições de eigenreações.
ukT∙ u = uk1 x1 + uk2 x2 +...+ ukr xm
em uma extensão dada por σk (valor singular). Os uk equivalem aos coeficientes este quiométricos sistêmicos.
123
Desde que, em SVD, os vetores singulares
são ortonormais um ao outro, cada dos k movimentos é desacoplado dos demais.
Então, a combinação linear de concentrações
dada para ukT∙u pode ser considerada como
uma reação sistêmica desacoplada e impul –
sionada pela combinação linear de reações
definidas em vkT∙ v .
As reações metabólicas sistêmicas ou eigenreações podem descrever a rede metabólica
como um todo.
124
• Seja
•
•
U ∑ VT
SV = U ∑ VT V = U ∑
• Assim, tem-se Svk = σkuk
• o que significa que S mapeia o vetor singu• lar direito sobre o vetor singular esquerdo,
por meio do valor singular relativo.
125
• Tratamento semelhante ao dado acima tem
sido usado em análise de expressão de genes
por SVD.
Alter, O., Brown, P.O., Botstein,D. Singular
Value decomposition for genome-wide
expression data processing and modeling.
PNAS 97(18) 10101-10106 (2000)
126
•
•
•
•
•
•
Computação dos valores singulares
Tomemos uma simples reação de isomerização que consiste na interconversão
v1
AB
BA ou X1
X2
v2
• A decomposição de valor singular (SVD)
• da matriz estequiométrica (S) dessa reação
• é obtida como a seguir:
127
• Continuação
•
v1 v2
X1 -1 1 = 2-1/2 -1 1 2 0 2-1/2 1 -1
X2 1 -1
1 1 0 0
1 1
•
S =
U ∙ ∑
VT
A 2a. coluna de U compreende o espaço-nulo
esquerdo de S.
A 2a. fila de VT compreende o espaço-nulo
(direito) de S.
128
•
•
•
•
•
•
•
•
Computação dos valores singulares
Seja a matriz estequiométrica S3x6 correspondente à rede metabólica anterior:
v1 v 2 v3 v4 b1 b2
X1 -1 -1 0 0 -1 0
S = X2 1 0 1 -1 0 -1
X3 0 1 -1 1 0 0
A SVD de S pode ser obtida pelo uso
do matrix-calculator acessado em
//www.bluebit.gr/matrix-calculator/
calculate.asp
(resultado a seguir)
129
•
•
Decomposição SVD:
U=
•
•
•
-0.082 0.858 0.508 0.000 0.000 0.000
0.802 -0.245 0.544 0.000 0.000 0.000
-0.591 -0.452 0.068 0.000 0.000 0.000
•
∑=
•
•
•
•
•
•
2.361
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
•
V=
0.375
-0.216
0.590
-0.590
0.035
-0.340
0.000
1.953
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.782
0.000
0.000
0.000
-0.565 0.047
-0.671 0.205
0.106 -0.159
-0.106 0.159
-0.439 -0.649
0.126 - 0.696
0.000
0.000
0,000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
0.000
-0.734 0.000 0.000
0.419 0.363 -0.392
0.210 0.700 0.285
-0.210 0.337 0.677
0.314 - 0.363 0.392
-0.314 0.363 -0.392
•
130
•
•
MODOS ELEMENTARES
DE FLUXO
131
• Modo de fluxo:
• distribuição de fluxos estacionários
• que mantêm proporções fixas.
•
1
•
v1
•
2
3
•
v2
• v1 / v2 = constante
132
•
•
•
•
•
•
•
Formalmente, o modo de fluxo, M, é
definido com o conjunto
M = {V Є Rr: V = λ V*, λ >0} ,
satisfazendo às condições:
estado estacionário, SV* =0;
para reações irreversíveis, tem-se
que um subvetor de V, V*irr >=0.
133
•
•
•
•
Modo elementar de fluxo:
um modo de fluxo indecomponível;
compreende um conjunto mínimo
de reações enzimáticas irreversíveis
• e em regime estacionário;
• o conjunto de modos elementares
• E é único para uma dada rede meta• bólica.
134
•
•
•
•
•
•
•
•
Por computação dos modos elementares de fluxo (E), uma rede
metabólica pode ser decomposta
em partes mínimas, sob a condição de estado estacionário.
Os aspectos essenciais da estrutura da rede podem tornar-se aparentes.
135
•
•
•
•
•
•
Combinação linear de fluxos:
uma distribuição de fluxos pode
ser representada por uma combinação linear de fluxos elementares:
V = λ1e1 + λ2e2 + ... = ∑i λiei
λi ≥ 0
136
•
ANÁLISE DE ROTAS
• METABÓLICAS POR MODOS
• ELEMENTARES DE FLUXO
• Schuster,S., Fell, D., Dandekar, T. :
• A general definition of metabolic pathways
• useful for systematic organization and
analysis of complex metabolic networks.
Nature Biotechnol. 18(2000) 326-332.
137
• O programa usado para computar
• modos elementares de fluxo E
• em redes metabólicas:
•
YANA
• 2003-2004 Dep Bioinformatics, Univ. of
• Würzburg
• //yana.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de
138
• O algorítmo sobre o qual YANA é
• baseado não será detalhado aqui.
• Pode ser achado em
• //www.mpi-magdeburg.mpg.de/de/research/projects/
• 1010/1014/1020/mfaeng/mfapric.html
• //www.biomedcentral.com/1471-2105/6/135
139
• Como ilustração, pode ser executado o
• exemplo (contido na distrbuição do YANA)
que permite computar os modos
elementares de fluxo para a rota das
fosfopentoses (arquivo glycolysis+ppp.sbm).
• A matriz estequiométrica da sub-rede con• siderada é computada de início.
• Dados de entrada e saída são listados e gra• ficados.
•
140
•
•
•
•
•
•
•
ANÁLISE DE BALANÇO DE
FLUXOS EM REDES METABÓLICAS.
PROGRAMA DE COMPUTADOR
FBA versão 2.0
por Jeremy S. Edwards e
Bernhard Palsson
141
•
•
•
•
•
•
•
Capacidades do “software” FBA:
Calcula distribuições ótimas de
fluxo para função-objetivo definida pelo usuário.
Permite estudar o efeito da supressão de genes.
Gera mapa de fluxos.
142
•
•
•
•
•
Um excelente “primer” de FBA
(Nature Biotechnology) e uma
versão de demonstração do programa podem ser obtidos de
//gcrg.ucsd.edu/downloads/fba.html
143
•
•
•
•
•
•
•
•
Um programa interativo de demonstração (FBA/MOMA) para E. coli,
computa fluxos metabólicos e possibilta prever efeitos resultantes
da supressão de gene(s).
Pode ser usado em:
//atlas.med.harvard.edu/moma/
144
• Leitura sugerida:
•
•
•
•
•
•
Palsson, B.O. Systems BiologyProperties of Reconstructed Networks.
Cambridge University Press. 2006.
Stephanopoulos, G.N.,Aristidou. A.A.,Nielsen, J. Metabolic
Engineering. Academic Press. 1988.
Meyer,C.D. Matrix analysis and applied linear algebra.
SIAM. Philadelphia. 2003.
• Boldrini, J.L. et al. Álgebra Linear. Harper & Row
• do Brasil(editora Harbra Ltda.).3a.ed.1986.
• Campbell, H.G. Matrices with Applications.Mere• dith Corp. New York. 1968.
145