Apoptose ou morte celular programada – por Márcia Regina Cominetti1
Apoptose, conhecida como "morte celular programada" é um tipo de auto
destruição celular que ocorre de forma ordenada e demanda energia para a sua
execução, ao contrário da necrose. A apoptose está relacionada com a manutenção da
homeostase e com a regulação fisiológica do tamanho dos tecidos, mas pode também
ser causada por um estímulo patológico, como a lesão ao DNA celular. O termo é
derivado do grego, que se referia à queda das folhas das árvores no outono - um
exemplo de morte programada fisiológica e apropriada que também implica renovação.
Muitos produtos naturais, candidatos a novas drogas antitumorais, agem
induzindo a morte celular programada nos tumores. Esta técnica, portanto é de
fundamental importância para o LABEN.
Protocolo utilizando kit FITC-Anexina V
O kit FITC-Anexina V é usado para determinar quantitativamente a
porcentagem de células dentro de uma população que podem ativamente sofrer
apoptose. Este comportamento se deve a propriedade que a célula tem de perder a
assimetria de membrana perto da fase de apoptose. Em células apoptóticas, o
fosfolipídeo fosfatidilserina (PS) é deslocado do interior da membrana plasmática para
fora dela, com a exposição de PS na ambiente externo*. Esta modificação da
estrutura celular sinaliza seu suicídio ao ambiente. Fagócitos captam este sinal e
removem a célula apoptótica por fagocitose. A anexina V é uma proteína dependente de
cálcio que tem uma grande afinidade por PS, tal característica pode utilizada para
identificar células apoptóticas com a exposição de PS. O iodeto de propídio (PI) é um
padrão para viabilizar a citometria de fluxo e é usado para distinguir células viáveis das
não viáveis. Células viáveis excluem o PI da interação com a membrana, enquanto que a
membrana de células mortas ou danificadas pode ser penetrada pelo PI. Células que são
positivas para FITC-Anexina V e negativas para PI são livres de apoptose. Células que
são positivas para FITC-Anexina V e PI estão no final do estágio de apoptose, em
estágio de necrose ou estão completamente mortas. Células que são negativas para
FITC-Anexina V e PI estão viáveis
Reagentes
1
Docente do curso de Graduação em Gerontologia e do Programa Interinstitucional de Pós-Graduação
em Ciências Fisiológicas (PIPGCF) Associação Ampla UFSCar/UNESP.
1. FITC Annexin V. Usar 5 μL por teste.
2. Iodeto de Propídio (PI), é convenientemente utilizado como corante de ácidos
nucléicos. Usar até de 10 μL por teste de uma solução 50μg/mL.
3. Tampão 10x. 0,1 M Hepes (pH 7,4), 1,4 M NaCl e 25mM de CaCl2. Estocado a
4º C.
Procedimento
1. Lavar as células duas vezes com PBS frio e ressuspender as células em tampão
1x até uma concentração de 1x105 células/mL.
2. Transferir 100μL da solução (1x105 células) para um tubo de 5 mL.
3. Adicionar 5μL de FITC-Anexina V.
4. Adicionar 10μL de PI. A concentração ótima de PI pode variar com a linhagem
da célula onde 10μL de uma solução estoque 50μg/mL é a quantidade ideal
máxima que pode ser requerida.
5. Rotacione (vórtex) as células e leve para incubação por 15min a temperatura
ambiente (25ºC) no escuro.
6. Adicione 400μL de tampão 1x em cada tubo. A analise por citometria de fluxo
deve ser realizada dentro de 1 hr.