Universidade do Vale do Paraíba
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
" AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE MORTE CELULAR APÓS TERAPIA
FOTODINÂMICA"
Nilcenéia Soares Martines
Dissertação de Mestrado apresentada no
Programa
Engenharia
de
Pós-Graduação
Biomédica,
em
como
complementação dos créditos necessários
para obtenção do título de Mestre em
Engenharia Biomédica.
São José dos Campos, SP
2003
Universidade do Vale do Paraíba
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
" AVALIAÇÃO DO PROCESSO DE MORTE CELULAR APÓS TERAPIA
FOTODINÂMICA"
Nilcenéia Soares Martines
Dissertação de Mestrado apresentada no
Programa
Engenharia
de
Pós-Graduação
Biomédica,
em
como
complementação dos créditos necessários
para obtenção do título de Mestre em
Engenharia Biomédica.
Orientadora: Profª. Drª. Cristina Pacheco Soares
São José dos Campos, SP
2003
M336a
Martines, Nilcenéia Soares
Avaliação do Processo de Morte Celular Após
a Terapia Fotodinâmica / Nilcenéia Soares
Martines. São José dos Campos: Univap, 2003.
85p. il.; 31cm.
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós Graduação Engenharia
Biomédica do Instituto de Pesquisa e
Desenvolvimento da Universidade do Vale do
Paraíba, 2003.
1.Terapia Fotodinâmica 2. Zinco ftalocianina
3. Lasers 4. Fotossensibilizantes I. Soares,
Cristina Pacheco, Orient. II. Título
CDU:615.831
Autorizo, exclusivamente para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou
parcial desta dissertação, por processo fotocopiador ou transmissão eletrônica.
Assinatura do aluno:
Data:
“AVALIAÇÃO DA MORTE CELULAR APÓS A TERAPIA
FOTODINÂMICA”
Nilcenéia Soares Martines
Banca Examinadora:
Prof. Dr. Egberto Munin, Presidente (UNIVAP)________________________________
Profª. Drª. Cristina Pacheco Soares, Orientadora (UNIVAP)______________________
Profª. Drª. Claudia Barbosa Ladeira de Campos (UNICAMP)_____________________
Prof. Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco
Diretor do IP&D - UNIVAP
São José dos Campos, 10 de junho de 2003.
DEDICATÓRIA
À
Deus força divina que nos mantém vivos, fonte de toda sabedoria.
Aos meus pais;
Avelino Rufo Padim Martines e
Olga Soares Martines,
fonte eterna de amor e de luz, os quais me deram a própria vida, o próprio nome, a
própria honra.
Ao meu namorado
Alessandro Adriano
pela ajuda, amor e companheirismo
que soube compreender minha ausência acreditando sempre nesta realização pessoal,
encorajando-me a superar os momentos de dificuldades na vida e na elaboração deste
trabalho.
A
Nivaldo e Luciana Martines
pelo suporte fundamental, carinhoso e
sólido que estiveram sempre presentes. À toda minha família irmãos, irmã, cunhadas,
cunhado e sobrinhos, pelas palavras e gestos de encorajamento e confiança em todos
meus passos.
AGRADECIMENTOS
À Profª . Drª . Cristina Pacheco Soares pela oportunidade em tê-la como
orientadora, por sua competência e amor à pesquisa, paciência e dedicação nos
ensinamentos e por suas palavras sempre carinhosas em todos os momentos.
“Os Mestres ideais são os que se
fazem de pontes e convidam os alunos
a atravess-las, então, tendo
facilitado a travessia desmoronam-se
com prazer, encorajando-os a criarem
as suas
próprias pontes”
Ao Profº Dr. Newton Soares pela valorosa colaboração e apoio durante o
processamento e análise dos espécimes ao Microscópio Eletrônico além do auxílio dado
durante a elaboração desta tese.
Às amigas de mestrado, em especial Lilian Nunes de Oliveira, Ritchelle Ricci e
Karina D. Figueiredo pela preciosa amizade construída ao longo do curso dividindo os
momentos difíceis e alegres.
Às funcionárias do IP&D e UNIVAP Rebeca, Rosângela, Rúbia, Claúdia, D.
Ivone pelo carinho e atenção durante a realização deste trabalho.
Às colegas de laboratório Graziela, Zélia, Marta, Paula e Bianca que de uma
maneira direta ou indireta participaram desta fase tornando possível a elaboração desta
pesquisa.
À CAPES, pelo suporte disponibilizado em forma de bolsa auxílio, e à FAPESP
pelo apoio financeiro.
"... Há duas formas para viver sua vida:
Uma é acreditar que não existe milagre.
A outra é acreditar que todas as coisas são um
milagre."
Albert Einstein (1879-1955)
RESUMO
A Terapia Fotodinâmica (TFD) é uma promissora modalidade de tratamento do
câncer, que envolve a administração de um agente fotossensibilizante que se localiza
preferencialmente em células tumorais. Esta terapia desencadeia uma série de processos
fotoquímicos e fotobiológicos, cujo resultado envolve múltiplas vias durante morte
celular. Um conhecimento completo dos mecanismos envolvidos na TFD pode conduzir
a uma melhor eficácia terapêutica. Tanto estudos in vitro quanto in vivo mostraram o
envolvimento de um processo apoptótico durante a morte celular mediada pela TFD.
Para analise do processo de morte celular em células Hep-2, após TFD, utilizamos Zinco
Ftalocianina (9 µM), e laser diodo com comprimento de onda 670 nm, densidade de
energia de 4,5 J/cm2. Nossos resultados indicaram que as células Hep-2 submetidas a
terapia,
foram
alteradas
ultraestruturalmente
ocorrendo
comprometimento
de
mitocôndrias, do núcleo e membrana nuclear, gerando morte celular pelo processo de
apoptose.
Palavras-chave: Terapia Fotodinâmica, Zinco ftalocianina, Apoptose, Microscopia
Eletrônica, Microscopia de Fluorescência, Cultura Celular
ABSTRACT
Photodinamic therapy (PDT) is a promissing modality of cancer treatment, which
involves the administration of a photosensitizer, which is preferentialy located in
tumors. This therapy triggers a series of photochemical and photobiological processes,
whose result involves multiple ways during cell death. A complete knowledge of the
mechanisms involved in PDT may lead to a better therapeutical effectiveness. Both
studies in vitro and in vivo have shown the envolvement of an apoptotic process during
celular death mediated by PDT. For analysis of the process of celular death in Hep-2
cells, after PDT, we used Zinc Phthalocyanine (9 µM), and a diode laser at 670 nm
wavelenght, energy density of 4,5 J/cm2. Our results indicated that the Hep-2 cells
submitted to the therapy, were modifed ultrastructurally, with the commitment of
mitochondria, nucleus and cellular membrane, generating cellular death by apoptosis.
Key-words: Phothodynamic Therapy, Zinc Phthalocyanine, Apoptosis, Electronic
Microscopy, Fluorecence Microscopy, Cell culture.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.........................................................................................................1
1.1. Objetivos .......................................................................................................1
2. TERAPIA FOTODINÂMICA...................................................................................2
2.1 Fotossensibilização .......................................................................................4
2.2 Morte Celular ................................................................................................6
2.3 Limitações da Terapia Fotodinâmica ............................................................9
2.4 Terapia Fotodinâmica na Morte Celular .....................................................10
2.5 Fotossensibilizantes.....................................................................................12
2.6 Zinco Ftalocianina ......................................................................................14
2.7 Laser.............................................................................................................15
3. MITOCÔNDRIA ....................................................................................................17
4. NÚCLEO ................................................................................................................18
5. MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA............................................................19
5.1. Marcadores Fluorescentes ............................................................................19
5.1.1
JC-1 .................................................................................................19
5.1.2
DAPI.................................................................................................20
6. MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................21
6.1 Cultura de Células..........................................................................................21
6.1.1 Linhagem Celular .............................................................................21
6.1.2
Manutenção da Cultura Celular.........................................................21
6.1.3
Reagentes,
Soluções
e
Tampões
Necessários
para
Cultura
Celular................................................................................................23
6.2 Incubação e Irradiação.................................................................................23
6.3 Teste de Citotoxicidade ...............................................................................25
6.4
6.3.1
Teste de MTT......................................................................................25
6.3.2
Teste de Exclusão com Azul de Tripan - Após Doses de Energia.....27
6.3.3
Exclusão com Azul de Tripan - Após a Terapia Fotodinâmica..........28
Microscopia de Fluorescência.....................................................................29
6.4.1
JC-1 - Marcação para Mitocôndria....................................................29
6.4.2 DAPI - Marcação para Núcleo..........................................................30
6.5
Microscopia Eletrônica .............................................................................30
7. RESULTADOS........................................................................................................35
7.1 Relação entre Número de Fótons/Moléculas e Células....................................35
7.2 Absorbância da ZnPc.........................................................................................36
7.3 Teste de Citotoxicidade.....................................................................................37
7.3.1 Para Padronização Concentração do Fotossensibilizador Zinco
Ftalocianina ......................................................................................................37
7.3.2 Citotoxicidade para Concentrações do DMSO.................................38
7.4 Teste de Viabilidade Celular ............................................................................39
7.4.1 Para Padronização da Dose de Energia..............................................39
7.4.2 Viabilidade Celular após a Terapia Fotodinâmica............................40
7.5 Microscopia de Fluorescência..........................................................................41
7.5.1 Microscopia de Fluorescência - Marcação Mitocôndria....................41
7.5.2 Microscopia de Fluorescência - Marcação Núcleo.............................50
7.6 Microscopia Eletrônica.....................................................................................59
8. DISCUSSÃO............................................................................................................66
9. CONCLUSÃO..........................................................................................................72
10. BIBLIOGRAFIA...................................................................................................73
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1:
Diagrama de Jablonski simplificado para o processo de
fotossensibilização ...................................................................................................
5
Figura 6.1. (A) Placa de 96 poços, (B) placa de 24 poços, (C) garrafa de cultura
onde eram mantidas as células Hep-2 e (D) placa de Petri utilizadas em
microscopia eletrônica..............................................................................................
22
Figura 6.2: Laser Thera Lase - DMC, utilizado nas irradiações das células...........
24
Figura 7.1: Espectro de absorção da ZnPc filtrada na concentração de 9µM em
DMSO.......................................................................................................................
36
Figura 7.2: Atividade mitocondrial em células não irradiadas. (A) Células Hep-2
marcadas com JC-1, (B) após incubação com ZnPc as células Hep-2....................
42
Figura 7.3: (A) Células Hep-2 incubadas 24 horas após tratamento somente laser,
(B) células incubadas 30 minutos após o tratamento TFD marcadas com JC-1......
44
Figura 7.4: (A/B) Células Hep2 incubadas 12 horas com após o tratamento
TFD...........................................................................................................................
Figura 7.5: Célula Hep-2, incubada após 12 horas com após o tratamento
46
TFD...........................................................................................................................
48
Figura 7.6: (A) Grupo de células Hep-2 controle, sem tratamento, e (B) tratadas
somente com laser marcadas com DAPI...................................................................
51
Figura 7.7: Célula Hep-2 marcadas com DAPI, (A) controle tratadas somente
com ZnPc, (B) após o tratamento TFD incubadas 30 minutos com meio MEM.....
53
Figura 7.8: Células Hep-2 marcadas com DAPI, após 30 minutos e 1 hora da
TFD...........................................................................................................................
55
Figura 7.9: (A/B)Células Hep-2 marcadas com DAPI 1 e 12 horas após tratamento
TFD...........................................................................................................................
57
Figura 7.10: Células Hep-2 Microscopia Eletrônica, (A) controle: sem tratamento
e (B) tratamento somente fotossensibilizador ZnPc. 3.270x....................................
60
Figura 7.11: (A/B) Células Hep-2 30 minutos após tratamento com TFD. 3.270 e
3.810x........................................................................................................................
62
Figura 7.12: (A/B) Células Hep-2 24 horas após tratamento com TFD. 2030 e
1.450x........................................................................................................................
64
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 7.1:
Viabilidade de Células Hep-2 após 24h do tratamento com
fotossensibilizador Zinco ftalocianina (ZnPc),
média e desvio padrão de 6
experimentos....................................................................................................................
Gráfico 7.2:
Viabilidade de Células Hep-2 após 24h de incubação com DMSO
variando as concentrações média e desvio padrão de 6 experimentos.............................
Gráfico 7.3:
37
38
Viabilidade Celular linhagem Hep-2 irradiadas sem corante, variando
densidade de Energia entre 0,5 a 4,5 J/cm2. Usando o método de Azul de Trypan após
24 h da irradiação.............................................................................................................
Gráfico 7.4:
39
Viabilidade de células Hep-2 sob tratamento PDT, frente a
administração do corante ZnPc nas concentrações 4,5 e 9 ìM, analisados em 24 e 48
horas após o tratamento....................................................................................................
40
LISTA DE TABELAS
Tabela 6. 1. Parâmetros utilizados para irradiação em placas de Petri e placas de
24 poços....................................................................................................................
25
Tabela 6. 2. Concentrações e volumes utilizados de ZnPc e DMSO........................
26
ABREVIATURAS
AIF : Fator indutor apoptose
ALA : 5'- ácido aminolevulínico
AlPc : Alumínio ftalocianina
AlPcS4 : Alumínio ftalocianina tetrasulfonada
AsGa : Arseneto de gálio
ATP : Adenosina trifosfato
Ca2+ : Íon cálcio
CO2 : Dióxido de carbono
CsA : Ciclosporina A
D.E. : Densidade de energia
DMSO : Dimetilsulfóxido
DNA : Ácido desoxirribonucleico
DAPI : 4', 6' - diamidino, 2' phenylindole- 5 ìM
EDTA : Ácido etilenodiaminotetraacético sal dissódico
EROs : Espécies reativas de oxigênio
FADD : Fas associado com domínio da morte
H2O2 : Peróxido de hidrogênio
Hp : Hematoporfirina
Hep - 2 : Linhagem celular de carcinoma de laringe humana
HpD : Derivado de hematoporfirina
HeLa : Linhagem celular de carcinoma de cérvix humana
Hz: Hertz
InGaAlP : Fosfeto de índio-gálio-alumínio
J : Joules
JC-1 : (5,5’,6,6’,-tetrachloro-1,1’3,3’, tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide)
K+ : Íon potássio
MEM : Meio de cultura meio Mínimo Essencial
MCP : Morte celular programada
µl : Microlitro
µm : Micrômetro
µM : Micromolar
ml : Mililitro
mW : Miliwatts
M : Molar
µs : Microsegundo
mM : Milimolar
MTT : 3-(4,5-dimethylthiazolone-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide
N : Número de fótons
NaCl : Cloreto de sódio
NaH2PO4.H2O : Bifosfato de sódio monohidratado
Na2HPO4.7H2O : Fosfato de sódio heptahidratado
NaHPO4.12H2O : Fosfato de sódio dodechidratado
nm : Nanômetro
O*- : Íon superóxido
1
O2 : Oxigênio singleto
*OH : Hidroxil
OsO4 : Tetróxido de ósmio
PBS : Salina tampão fosfato
Pc : ftalocianinas
Pc4 : ftalocianina 4
pH : Potencial de hidrogênio
PP : Protoporfirina
PPS4 : Meso tetrafenilporfirinasulfonada
PTPC : Complexo de Poro de Transição de Permeabilidade
S0 : Estado de energia singlete fundamental
S1 : Primeiro estado singlete excitado
SMAC : Ativador secundário de caspases derivado da mitocôndria
SFB : Soro Fetal Bovino
T1 : Estado tripleto
TFD : Terapia fotodinâmica
tTGase : Transglutaminase tecidual
T TRP : µ-[meso-5,10,15,20,-tetra(piridil)porfirina]te-trakis-bis(bipiridina)(cloro)
rutênio(II)]
UV : Ultravioleta
UVA : Ultravioleta A
UVB : Ultravioleta B
VIS : Visível
W : Watt
ZnPc : Zinco ftalocianina
λ : Comprimento de onda
c : Velocidade da luz no vácuo
h : Constante de Planck
ν : Frequência
1. INTRODUÇÃO
_____________________________________________________________________________________
A Terapia Fotodinâmica (TFD) se estabeleceu em todo mundo como um
processo seletivo, no qual as células displásicas são retiradas do organismo com um
traumatismo mínimo para as células normais. O fundamento da Terapia Fotodinâmica
baseia-se na irradiação de células tumorais que absorveram fotossensibilizantes, que se
acumulam preferencialmente em células neoplásicas. Esta característica permite que a
radiação atue somente na região neoplásica, elevando a possibilidade de sobrevida dos
pacientes para mais de 95%. Esta terapia desencadeia uma série de processos
fotoquímicos e fotobiológicos, cujo resultado é um dano irreversível do tecido tumoral
(DOUGHERTY et al.,1998; BELMONT et al.,1999; LIPSON; BALDES, 1960). O
fotossensibilizador ao receber radiação eletromagnética com comprimento de onda
específico, na presença de oxigênio do meio, induz vários processos fotoquímicos
envolvendo a produção de espécies reativas de oxigênio – EROs (1O2, O2*-, *OH,
H2O2) os quais atacam centros dos sistemas celulares, desencadeando a morte dos
tecidos tumorais ou apoptose celular (TAKEMURA et al., 1995; JACQUES, 1992)
1.1 OBJETIVOS
_____________________________________________________________________________________
Desta forma objetivando uma melhor avaliação do processo de morte celular,
ocasionado pela TFD e a participação de fotossensibilizante e laser, analisamos:
Ø Alterações morfofisiológicas das células neoplásicas submetidas a TFD, avaliando
ultraestruturalmente os danos acarretados.
Ø A ação do agente fotossensibilizante ZnPc e seus efeitos fisiológicos em culturas de
células Hep-2, e os eventos celulares desencadeados por esse processo.
Ø A participação das mitocôndrias e núcleo no processo de morte celular.
2. TERAPIA FOTODINÂMICA
______________________________________________________________________
O tratamento de neoplasias pode ser realizado por cirurgia, radioterapia e
quimioterapia. Alguns tratamentos alternativos como a Terapia Fotodinâmica (TFD)
têm surgido visando otimizar o tratamento das neoplasias (SIBATA et al., 2000). A
TFD envolve a administração de sistemas de liberação contendo fármacos
fotossensibilizantes que direcionam a liberação para o tecido neoplásico seguido pela
exposição de luz. O fotossensibilizante é ativado pela luz e em presença de oxigênio
molecular produz espécies reativas de oxigênio. Como o oxigênio singleto é citotóxico,
oxida e lesa componentes vitais das células neoplásicas levando-as a apoptose (SIBATA
et al., 2000, REDDI et al., 1987).
O desenvolvimento histórico da TFD foi detalhado por Daniell e Hill em 1993.
As reações fotodinâmicas foram estudadas sistematicamente no começo do século
passado por um estudante de medicina alemão, Raab, em 1900 usando culturas de
paramécios e acridina. Raab notou que os paramécios expostos à acridina e em seguida
a luz, morriam. Von Tappeiner em 1903, professor de Raab demonstrou a dependência
deste fenômeno à presenç a de oxigênio e relatou o uso clínico da eosina como um
fotossensibilizador para tratamento de câncer de pele, candyloma lata e cutaneous
lupus. O termo ação fotoquímica foi subseqüentemente utilizado por Von Tappeiner,
para caracterizar a necessidade de oxigênio na fotossensibilização. Foi Meyer-Betz em
1913, que desenvolveu testes cutâneos de fototoxicidade (injetando hematoporfirina em
si mesmo), demonstrando o efeito fotossensibilizante em humanos. A autofluorescência
tumoral, devido ao acúmulo de porfirina endógena em tumores experimentais, foi
demostrado por Policard em 1942, usando uma lâmpada de Wood. Entretanto Auler e
Banzer, 1942,
usaram a hematoporfirina
para destruição seletiva de tumores em
animais. O derivado da hematoporfirina (HpD) foi desenvolvido por Schwartz, ao reagir
ácido acético glacial e ácido sulfúrico com hematoporfirina e posterior solubilização
em álcali diluído. O HpD, para a localização tumoral, apresentou melhores propriedades
que a hematoporfirina e foi utilizado com sucesso por Lipson em 1961. Dougherty em
1975 usou o termo terapia fotorradiação para descrever o tratamento de tumores de
animais, usando luz visível filtrada e HpD. A primeira grande série de pacientes que
passaram pela TFD utilizando HpD foram também reportados por Dougherty em 1977,
que notou que 111 dos 113 casos de tumores malígnos em 25 pacientes sofreram
redução volumétrica parcial ou completa. (DANIELL;HILL, 1993 apud FURUZAWA,
1997)
Aronoff (1997), fez uma revisão sobre a evolução do laser e suas aplicações
terapêuticas, descrevendo a TFD como um procedimento fotoquímico envolvendo
droga fotossensibilizante que, quando ativada por luz com comprimento de onda
adequado, transfere energia ao oxigênio molecular, gerando oxigênio singleto com
destruição de células tumorais. Além disso, o efeito tumoricida seria devido à necrose e
oclusão vascular, parcialmente mediada por tromboxana A2.
Um dos grandes interesses de estudo na área de TFD ocorre em relação aqueles
associados à administração e biodistribuição de corantes fotossensibilizantes nos
diferentes sistemas biológicos (HENDERSON ; DOUGHERTY, 1992; DOUGHERTY ;
POTTER, 1991). Estudos utilizando sensibilizadores marcados têm demonstrado que
tanto tecidos normais quanto tecidos neoplásicos apresentam capacidade de reter os
corantes (HENDERSON ; DOUGHERTY, 1992). Tal fato justifica o grande número de
estudos a fim de desenvolver compostos mais específicos na retenção e distribuição nos
tecidos neoplásicos.
O ácido 5-aminolevulínico (ALA) tem se tornado um promissor agente para
TFD uma vez que ele pode ser administrado tópica e oralmente, causando uma
fotossensibilidade somente por curto período de tempo (CHARLESWORTH;
TRUSCOTT, 1993; MIKVY et al, 1995). O ALA é um precursor na biossíntese de
pigmentos heme, citocromo, clorofila, bile e outras porfirinas. Ele é convertido
intracelularmente a uma protoporfirina IX monomérica que apresenta uma alta
fluorescência e forte capacidade fotossensibilizante (SCHNECKENBURGER et al.,
1993). Estudos in vitro utilizando culturas de células (CPAE e PTK2) e células
miocárdicas têm demonstrado que nas duas primeiras ocorre uma concentração seletiva
de protoporfirina IX na região perinuclear do citoplasma, enquanto na terceira o
sensibilizador encontra-se ligado seletivamente à mitocôndria (LIANG et al, 1998).
Entretanto alguma fluorescência difusa em outras regiões do citoplasma e outras
organelas, ou ligações não específicas não devem ser excluídas.
Um dos critérios básicos na escolha de um agente a ser utilizado em TFD, é que
o mesmo apresente uma absorção espectral acima de 600 nm, a chamada janela óptica
onde os componentes endógenos do tecido biológico são transparentes à radiação
incidente (RICCHELLI et al, 1991a; BIOLO et al, 1994; GROSS et al., 1993), além do
que tais agentes deverão apresentar
retenção seletiva aos tecidos neoplásicos em
relação aos tecidos sadios.
2.1 FOTOSSENSIBILIZAÇÃO
______________________________________________________________________
A Terapia Fotodinâmica envolve a ativação de uma droga fotossensibilizadora
por meio de luz com comprimento de onda específico com a absorção espectral do
fotossensibilizador. Na
presença de oxigênio no tecido a TFD causa geração de
espécies reativas de oxigênio, os quais exercem efeitos citotóxicos nas organelas
celulares e membranas resultando em morte (VISONA et al., 2000).
A luz interagindo com o corante, torna-o excitado passando de seu estado
fundamental (S0) ao estado tripleto (T1). Neste segundo estado, sua meia vida é de
poucos milionésimos de segundos, durante o qual é capaz de rápida energização do
oxigênio dissolvido, que é ativado para seu primeiro estado eletrônico excitado. Este
estado energético (1O2) também é de vida curta, porém muito reativo. Típicas moléculas
orgânicas sensibilizadoras são convertidas a estado singleto (S1) de vida curta na
absorção do fóton. O estado excitado singleto (S1) de bons fotossensibilizadores, passa
eficientemente pelo cruzamento inter-sistema para atingir o estado tripleto (T1), como
mostrado na figura 2.1
A maioria das reações fotossensibilizadas nos sistemas biológicos, é mediada
por este estado (T1) do fotossensibilizador devido ao seu tempo de vida prolongado. O
fotossensibilizador no seu estado tripleto pode interagir com outras moléculas por 2
modos principais, as chamadas reações Tipo I e Tipo II. O processo Tipo I, envolve a
transferência de um átomo de hidrogênio ou de um elétron entre o fotossensibilizador e
alguma outra molécula, enquanto a reação Tipo II envolve a transferência de energia do
fotossensibilizador para o oxigênio no estado fundamental (T1). As reações do Tipo I,
são favorecidas por alta concentração de substrato e baixa concentração de oxigênio,
enquanto as reações do Tipo II são engrandecidas pela situação reversa. Nas células, a
ligação dos fotossensibilizadores às estruturas celulares fotossensitivas podem aumentar
os processos do Tipo I.
Sn
λ1
+
R*,X*,R *
Φic
S1
Tn
λ1
λ2
kf
Φic
Fotossensibilização
Celular
T1
Φisc
λ1
+
R*,X*,R *
kp
S0
O2
1
O2
EROs
Figura 2.1. Diagrama de Jablonski simplificado para o processo de fotossensibilização.
O corante no estado fundamental (S0) é excitado ao primeiro estado singleto (S1), podendo
fluorescer e retornar ao estado fundamental, ou realizar um cruzamento intersistemas para o
estado tripleto de mais baixa energia. A reação deste com o oxigênio molecular, inicia o
processo de produção dos EROs.
Esse processo Tipo I, mais comum nos tecidos biológicos, envolve o
seqüestro de um elétron de um substrato redutor, resultando na forma semi-oxidada do
substrato e forma semi-reduzida do fotossensibilizador. Freqüentemente, o radical do
substrato resultante pode reagir com o oxigênio, formando produtos oxidados; em
alguns casos esses são peróxidos, os quais podem iniciar processos em cadeia. Alguns
sensibilizadores semi-reduzidos reagem com o oxigênio no estado fundamental para
regenerar o sensibilizador para o estado fundamental e produzir superóxido. Corantes
semi-reduzidos podem também interagir para retornar ao estado fundamental e produzir
peróxido de hidrogênio (PAZOS, 2001).
2.2 MORTE CELULAR
______________________________________________________________________
O termo apoptose foi criado para descrever somente as mudanças estruturais e
morfológicas que ocorrem durante a morte celular. Durante a apoptose as células são
encolhidas drasticamente, a membrana plasmática e o retículo endoplasmático formam
vacúolos, a cromatina é condensada ao longo da membrana nuclear, depois formando
esferas em formas crescentes. No final do estágio, o núcleo e os fragmentos formam
unidades compactas chamadas de corpos apoptóticos, que são primariamente removidos
por células específicas, os macrófagos. Porém se estes não forem removidos, podem
iniciar uma necrose secundária. Como já descrito, a célula em apoptose encolhe
drasticamente, característica esta que pode ser usada para apontar uma porcentagem
quantitativa. Isto pode ser conseguido através de vários métodos de microscopia ou
citometria de fluxo, baseados nas diferenças de tamanho e granulosidade. Durante
apoptose ocorre diminuição do potencial transmembrana mitocondrial imediatamente ou
em 2 horas e pode ser medido usando um corante fluorescente específico tal como JC-1
(5,5’,6,6’,-tetrachloro-1,1’3,3’,
tetraethylbenzimidazolcarbocyanine
iodide)
por
citometria de fluxo. As caspases são ativadas durante este processo e podem ser
monitoradas durante alguns dos mecanismos de apoptose, considerando a liberação de
alguns dos “ativadores” das caspases. Como um processo estritamente organizado, elas
destroem e modificam componentes celulares vitais, tal como Bcl-2, proteína associada
ao retinoblastoma (Rb), lâmina nuclear, U1 70-kDa proteína quinase ribonuclear
(envolvido no RNA) de adesão focal, quinase 2 ativada p-21, proteína quinase C[gama], proteína fosfatase 2A, poli ADP-ribose polimerase (PARP) e muitos outros,
sendo sua ativação ou destruição documentada pela técnica Western Blots (GODAR,
1999).
Godar (1999), citou em seus trabalhos três termos referentes a apoptose:
imediata, intermediária e tardia, junto, aos diferentes mecanismos cinéticos pré-MCP
(morte celular programada) e MCP. A apoptose imediata é provocada em menos de
meia hora e é um mecanismo pré- MCP, isto é, não requer síntese de proteínas pósexcitadas, por exemplo após TFD (GODAR, 1996). Apoptose intermediária ocorre
dentro de quatro horas, mas requer mais que meia hora para iniciar (WANG et al.,1997)
e é um mecanismo pré-MCP. Entres os agentes que excitam a ativação da apoptose
intermediária podemos citar: altas doses de qualquer radiação UVB (ultravioleta B) ou
UVC (ultravioleta C) e qualquer agente que ative um receptor na membrana contendo
um domínio da morte celular, tal como Fas/CD95/APO-1(ASHKENAZI ; DIXIT, 1998;
GODAR, 1999b). Uma vez ocorrendo ligação cruzada, estes receptores ligados à
membrana, traduzem um sinal para a mitocôndria através da ação proteolítica das
caspases. Apoptose tardia ocorre após 4 horas (podendo levar dias) e é um mecanismo
MCP, dependendo de síntese
de proteína. Exemplos de agentes que induzem
primariamente apoptose tardia são radiações UVB, UVC (GODAR, 1996 ;GODAR et
al., 1994), PUVA (MARKS ; FOX, 1991; VOWELS et al., 1996; YOO et al., 1996),
raio X (OLIVE ; DURAND, 1997; GODAR, 1999a) e qualquer outro agente que cause
danos significativos ao DNA. Danos no DNA levam a regulação de certos produtos
gênicos, alguns dos quais são conhecidos como participantes do mecanismo de morte
celular por apoptose; a morte ligada ao receptor Fas, a proteína Bax, que forma poros
mitocondriais e retração relativa. Qualquer dano no DNA ativa o fator de transcrição
AP-1, aumentando a expressão de receptor Fas ou ativando a transcrição do fator p53,
aumentando a expressão da proteína Bax que forma o poro mitocondrial.
As radiações UVA e TFD primeiramente mediado pela produção de oxigênio
singleto provocam apoptose imediata pré-MCP, com despolarização do potencial
transmembrana mitocondrial. Um megaporo se abre no local "S", sulfidrila sensível,
liberando FAI (fator que induz apoptose) a menos que a Ciclosporina A (CsA) esteja
presente. A apoptose imediata também pode ser ativada no local "P", pirimidina
nucleotídeo sensível, por altos níveis de ânions superóxidos (por exemplo 1mM
vitamina K3), porém este mecanismo envolve a liberação de citocromo c, o qual não é
inibido pela CsA. TFD e radiação UVA-1 provocam apoptose imediata pré- MCP e
pode ser inibida ou atrasada por uma grande concentração de BcL-2, uma proteína
antioxidante; embora antioxidantes apenas retardem o processo de apoptose, pois muito
pouco das células realmente sobrevivem (GODAR, 1999).
Apoptose intermediária pré-MCP é normalmente iniciada pela ligação cruzada
do receptor que pode ser ativado usando altas doses de radiação UVB e UVC, que tem
um perfil cinético, partido de apoptose iniciada por anti-Fas. Altas doses de radiação
UV iniciam uma ligação cruzada com Faspor mecanismos ainda não conhecidos, mas
este é um processo que pode envolver radicais livres, ânions superóxido e radicais
hidroxila (GORMAN et al., 1997). É conhecido, entretanto, que FasL não é controlado
pela FasR porque a apoptose não é inibida por um anticorpo bloqueador, como ZB4.
Além disso, a microscopia confocal associada a imunoprecipitação e coimunoprecipitação com FADD (Fas associado com domínio da morte), confirmou que a
ligação cruzada FasR está diretamente ligada a ação da radiação UV. Depois do FasR
estar ligado, FADD recruta pró caspase 8 que torna caspase 8 ativa, uma ativadora de
caspase pré-mitocondrial. A caspase 8 através da Bid pode formar poros na membrana
mitocondrial (LI et al., 1998), ou pode ser inibida diretamente pela clivagem da pró
caspase 3 (STENNICKE et al., 1998). Outros receptores de domínio da morte, como
fator de necrose tumoral (TNF) também podem iniciar a apoptose intermediária
(ASHKENAZI; DIXIT.1998), aparentemente atua em algum mecanismo de apoptose
iniciada por fóton (SCHWARZ et al., 1995; SHEIKH et al., 1998.)
Apoptose tardia MCP é iniciada por danos no DNA que podem ser provocados
por luz visível, UVA, UVB, UVC ou raio-X (LEY; APPLEGATE, 1985; JONES et al,
1987; PEAK; PEAK, 1991; GODAR; LUCAS, 1995; GODAR, 1999a). Além de danos
na membrana da mitocôndria, radiação UVA também causa apoptose tardia (GODAR ;
LUCAS, 1995). Altas doses de radiação UV afetam não somente alvos celulares como
também membrana plasmática e o citoplasma (SCHWARZ, 1995), resultando em
apoptose intermediária, provocando danos no DNA que levam à uma apoptose tardia
(GODAR, 1999a). Um mecanismo de apoptose tardia induzida por danos no DNA
envolve transcrição do fator AP-1, considerando outros fatores, envolvendo a
transcrição do p53.
Ellerby (1997), propôs três mecanismos para a iniciação de apoptose: Indutores
Pré-Mitocondriais, como por exemplo, tamoxifen podem iniciar uma cascata de
transdução de sinal resultando em liberação de fatores mitocondriais que iniciam
apoptose. Esta classe de agentes inclui a maioria dos agentes de anti-tumor comuns e
talvez radiação ionizante; Indutores Mitocondriais, por exemplo, atractilosideo embora
não permeável, pode agir diretamente na mitocôndria isolada resultando em fatores
indutores de apoptose; Indutores Pós-Mitocondriais, representado por citocromo c,
considerando perturbações mitocondriais suficientes para causar uma liberação de
citocromo c, a mitocôndria tem sido proposta como um alvo potencial para TFD
(DECAUDIN et al., 1998) que fornece um estímulo direto a morte de célula por
apoptose.
Células tratadas com altas doses de fotossensibilizador podem morrer sem
apresentar as características normais de apoptose e são geralmente consideradas
necrosadas. Além disso, células que sofrem apoptose tardia podem eventualmente
perder a integridade de suas membranas sendo então impossível o teste de exclusão de
corantes vitais, como Azul de Tripan, consideradas então como células em necrose.
(OLEINICK, 2002).
2.3 LIMITAÇÕES DA TERAPIA FOTODINÂMICA
______________________________________________________________________
A TFD
é um caso particular da aplicabilidade da Óptica
na Medicina,
destacando-se não só pela possibilidade de caracterização como também pela
possibilidade de tratamento através da absorção óptica (REIS et al.,2002). Entretanto a
TFD ainda apresenta algumas limitações como:
Ø Pelo excesso da energia, os estados excitados dos fotossensibilizadores possuem
curto tempo de vida (< 10-3s). Isso diminui a probabilidade da transferência de
energia do fotossensibilizante para o oxigênio.
Ø A concentração de oxigênio dentro dos tecidos
tumorais é baixa. Isso diminui
também a probabilidade da formação de oxigênio singleto.
Ø O tempo de vida do oxigênio singleto também é muito curto (nas soluções aquosas
< 10-5s), reduzindo a probabilidade das reações entre o oxigênio singleto e as
estruturas celulares.
Ø Os fotossensibilizadores utilizados atualmente em TFD possuem baixa absorção
óptica na região da janela terapêutica (λ > 600 nm).
Ø A maioria dos fotossensibilizantes orgânicos possui alta afinidade para formação
dos agregados, que diminui sua eficácia em TFD.
Estes fatores estimulam a busca de novos tipos de fotossensibilizadores mais
efetivos para TFD (BORISSEVITCH, 2002) e um maior conhecimento dos corantes já
existentes. A compreensão do efeito da TFD no metabolismo celular e as organelas
afetadas por este tipo de terapia, são necessários para um melhor conhecimento e
aprimoramento de drogas cada vez mais específicas para células tumorais. A análise das
alterações causadas pelo fotossensibilizante ZnPc, bem como sua interação com células
neoplásicas, se faz necessária para compreensão do papel biológico deste corante, assim
tornando-o mais eficaz .
2.4 TFD NA MORTE CELULAR
______________________________________________________________________
Um conhecimento completo dos mecanismos envolvidos na TFD pode conduzir
a uma melhor eficácia terapêutica. Tanto estudos in vitro quanto in vivo mostraram o
envolvimento de um processo apoptótico durante a morte celular mediada pela TFD.
Não são conhecidas as vias pelas quais a terapia fotodinâmica causa este processo.
Várias técnicas existentes têm sido utilizadas, tais como: liberação do citocromo c e
fosfotirosina, alteração no potencial de membrana, ensaio de atividade de caspases,
identificação de núcleo apoptótico, detecção por sondas fluorescentes, Western Blots,
microscopia eletrônica e outras.
Estudos realizados por DAHLE et al., 1999 mostraram diferenças significativas
no tipo de morte celular, isto é, necrose/apoptose, em relação a diferentes densidades
celulares tratadas com moderadas doses de TFD. Foi verificada, quatro horas depois da
exposição a TFD, uma maior fração de células em apoptose em cultura em
monocamadas (alta densidade celular) que em microcolônias (baixa densidade celular),
matando menos que 55% das células. STRAUSS et al., 1995 também fizeram esta
observação em suas investigações quando Meso Tetrafenilporfirinasulfonada (TPPS4)
foi localizada em lisossomos e citoplasma em células do epitélio mas não em camadas
confluentes, causando apoptose. Estudos de Dahle (1999) mostraram ainda que células
distribuídas em monocamada confluente apresentam quase três vezes mais sensibilidade
para TFD que as células em microcolônias, conseqüentemente levando então uma
fração maior de células à apoptose em culturas em monocamada que em microcolônias.
Isto é causado em parte pelo fato das células em única camada terem apresentado uma
maior concentração intracelular de TPPS4 (MOAN et al., 1992). Em altos níveis de
morte, o modo de morte foi similar em microcolônias e em monocamadas. Para ambas
densidades, houve uma alta fração de morte celular por necrose. Uma explicação para
alta taxa de necrose em ambas densidades celulares pode ser dada pelos grandes danos
intra celulares que podem impedir as células de metabolizarem a energia necessária para
iniciar e regular os eventos apoptóticos dependentes de energia (LEIST et al., 1997).
Um importante evento que leva à morte celular é a liberação de citocromo c da
mitocôndria para o citosol, provocando assim, a ativação de caspase-3 e iniciação da
resposta apoptótica em um estágio relativamente tardio (KLUCK et al., 1997a; Yang et
al. 1997). O tipo de morte celular, apoptose ou necrose, parece ser dependente do
agente fotossensibilizador, da linhagem celular e do protocolo (HE et al., 1994,
DELLINGER.,1996, OLEINICK et al., 1993). Uma dose supra letal de TFD pode
causar necrose, confirmada por fragmentação de DNA em gel de agarose (LUO et al.,
1997). Como resultado seguinte pode ocorrer fotodano de membrana, levando à
liberação de componentes do citosol, liberação de citocromo c, ativação das caspases, e
outros componentes da resposta apoptótica. Kessel et al.,1999 trabalhando com
linhagem celular de leucemia mostrou que fotodano causado por TFD leva à perda de
potencial de membrana mitocondrial, liberação de citocromo c no citosol, fragmentação
celular e aparecimento de núcleos apoptóticos. Neste estudo foi verificado também que
a perda imediata do potencial de membrana é conseqüência direta do fotodano
mitocondrial. Estes resultados caracterizam a mitocôndria como uma fonte de fatores
que iniciam a resposta apoptótica mediada por TFD (KLUCK et al., 1997a, LIU et al.,
1996, KLUCK et al 1997b, SUSIN et al.,1997). Embora haja relatos que TFD possa
iniciar outros eventos de transdução de sinal (OLEINICK et al., 1993). Kessel et al.
(1999), propuseram que a liberação de citocromo c sozinho é suficiente para iniciar uma
resposta apoptótica. A liberação do citocromo c imediatamente após a irradiação de
células fotossensilizadas no citosol, foi demonstrada pela técnica de Western Blot. Essa
liberação teve um crescente aumento com incubação à 37ºC, aumentando ainda mais na
presença de staurosporina, inibidor de proteína quinases, um agente que potencializa a
apoptose.
Hsieh et al. 2003, apontaram membrana plasmática e complexo de Golgi como
os principais alvos para Fotofrin levando a formação instantânea de EROS e
subseqüentemente ativação de vários eventos que levariam a apoptose, mas as
características típicas de apoptose (fragmentação de DNA e externalização
fosfatidilserina)
não foram encontradas, concluindo que os danos causados na
membrana plasmática resultaram em morte celular por necrose.
2.5 FOTOSSENSIBILIZANTES
______________________________________________________________________
Terapia Fotodinâmica tem mostrado excelentes resultados em clínicas
experimentais com porfirinas, particularmente com Fotofrin. Como este composto está
longe de ser ideal, pesquisas estão desenvolvendo novos fotossensibilizadores
melhorando suas características, como uma alternativa para Fotofrin. Uma variedade
de porfirinas sintetizadas, benzoporfirinas, clorinas, e ftalocianinas têm sido propostas
como segunda geração de fotossensibilizadores (ROSENTHAL, 1991, JORI, 1996). As
ftalocianinas constituem uma larga classe de componentes com alto coeficiente de
excitação em uma região espectral do vermelho (630-800 nm), apresentando grande
eficiência e excelentes propriedades para localização de tumor (BEN-HUR, 1992). A
Zinco ftalocianina (ZnPc) é um potente sensibilizador de segunda geração que tem sido
muito utilizada para tratamento in vivo de tumores de rato (MILANESI et al., 1990,
ZHOU et al.,1996) e para indução de efeitos de citotoxicidade em várias linhagens
celulares (RODAL et al., 1998; VALDUGA et al., 1998.).
A morte celular tende a ser proporcional a quantidade de fotossensibilizador
captado pela célula, então a quantidade de células mortas causada por TFD é
dependente da concentração de fotossensibilizador existente no interior da célula
(WOOD et al., 1997). A eficiência do fotossensibilizador em sensibilizar as células para
a fotoativação depende da habilidade da célula em captá-lo e das suas propriedades
fotoquímicas. A captação celular da droga é altamente dependente da propriedade
lipofílica, embora existam outros fatores que também influenciem, por exemplo, a
captação das ftalocianinas é maior que aquelas das porfirinas com similar lipofilicidade
(RODAL et al., 1998). TEITEN, et al. 2003, relatam que a localização intracelular do
fotossensibilizador (intracelular) influencia significativamente os mecanismos de
resposta a TFD, desde a primeira localização bem como a distribuição específica do
fotossensibilizador.
Estudos realizados por Villanueva et al., (1999), descreveram os efeitos
fotodinâmicos da ZnPc na linhagem celular HeLa, de carcinoma humano, na qual a
droga mostrou alta eficiência para induzir morte celular, por mecanismos de apoptose e
necrose, em tratamentos fotodinâmicos letais e subletais, respectivamente, inativando o
carcinoma.
Uma discussão recente feita por Juarranz et al., (2001) sobre efeitos do
fotossensibilizador ZnPc nos componentes do citoesqueleto de células HeLa, comenta a
implicação destes elementos frente à morte da célula usando doses subletal e l etal.
Muitas destas células mostraram formação de vacúolos no citoplasma, fragmentação de
cromatina, perda de sua adesão pelo substrato, sendo estes resultados típicos de morte
celular causada por apoptose (MILANESI et al., 1990; VILLANUEVA et al., 1999,
VERHAEGEN 1998). A implicação de microtúbulos em apoptose tem sido descrita por
vários autores, em células HeLa sendo proposto que haja um bloqueio mitótico, com
inibição da proliferação celular pelo bloqueio da transição anáfase-telófase, induzindo
apoptose (JORDAN et al.,1996). Apoptose pela desestabilização de microtúbulos tem
sido vista também em culturas de células leucemicas (MARTIN; COTTER, 1990).
Células em apoptose, danificadas pela fotossensibilização, perdem a aderência com
outras células e com o substrato, indicando que ambos actina e α-actina foram também
alterados pela TFD. Neste sentido a actina tem sido descrita como participante na
formação de corpos apoptóticos (COTTER et al., 1992).
É bem conhecido que as reações de fotossensibilização são dependentes da
localização subcelular do fotossensibilizador (BERG ; MOAN, 1997). Neste sentido,
que a localização do fotosessibilizador influencia significativamente no mecanismo de
resposta para TFD, diferentes localizações subcelulares têm sido descritas para ZnPc,
dependentes da linhagem celular e protocolo de incubação: distribuída difusamente no
citoplasma de células epiteliais RR 1012 (RÜCK et al., 1996), localizada na membrana
plasmática de fibroblasto de embrião de rato, ou em complexo de Golgi ou mitocôndria
em células NHIK 3025 (RODAL et al., 1998). É notado que o tempo de vida do 1O2 é
muito curto (< 0.04µs), então a reação de oxidação inicial ocorre em organelas nas quais
os sensibilizadores estão localizados e secundariamente em outras estruturas celulares.
Assim os fotodanos observados em elementos do citoesqueleto poderiam ser induzidos
por ambos: direta, pela ligação do sensibilizador as proteínas do citoesqueleto ou
indiretamente, pelas espécies reativas de oxigênio depois da exposição à luz (MOAN;
BERG, 1991).
Rück et al., (1996) citaram em seus trabalhos que a fluorescência da ZnPc é
distribuída difusamente a nível subcelular no citoplasma após 24h de incubação e que
acontece um decaimento dessa fluorescência à medida em que aumenta a exposição à
luz. Decaimento, que é a fotodegradação do corante, observado em corantes
hidrofóbicos. Este fenômeno, que também foi observado in vivo neste mesmo trabalho,
confirma o comportamento de fotodegradação de outros corantes hidrofóbicos,
indicando assim a ligação do corante com membranas de outras estruturas.
2.6 ZINCO FTALOCIANINA
______________________________________________________________________
As ftalocianinas (Pc) são agentes fotossensibilizantes de segunda geração e
apresentam elevada absorbância molar na região do espectro eletromagnético
correspondente a cor vermelha, sendo esta, a região que apresenta a máxima
transmissão de luz através dos tecidos, portanto, a de maior uso no tratamento de
tumores. Essa característica resulta em elevada resposta fototerápica. As Pc são potentes
fotossensibilizantes e são capazes de eliminar células neoplásicas in vivo e in vitro após
irradiação de luz. Esses compostos produzem estados tripletos de meia vida longa na
ordem de µs e são eficientes produtores de oxigênio singleto. A ZnPc é um dos agentes
mais utilizados em TFD porque tem caráter lipofílico e capacidade de atravessar a
membrana plasmática, sendo acumulando no tecido alvo (SIBATA et al., 2000).
Devido à estrutura hidrofóbica, as ftalocianinas se localizam em uma ou mais
membranas celulares. Usuda (2003) relatou que a ftalocianina 4 (Pc4) liga-se
preferencialmente à membrana mitocondrial, ao retículo endoplasmático e ao complexo
de Golgi em células tumorais.
Zinco ftalocianina (ZnPc) é um promissor fotossensibilizante de segunda
geração para uso em Terapia Fotodinâmica devido a sua alta seletividade para tecidos
tumorais (REDDI et al., 1987 e 1990) e alta eficiência de fotogeração de oxigênio
singleto citotóxico (VALDUGA et al., 1988) além de seu caráter altamente hidrofóbico
(BEN
HUR
et
al.,1985).
A
ZnPc
tem
apresentado
excelentes
resultados
fototerapêuticos quando testada como agente da TFD em uma grande variedade de
modelos de tumores de rato (SCHIEWECK et al.,1993).
Martinez et al., (2002) avaliou duas porfirinas TRP (µ-[meso-5,10,15,20,tetra(piridil)porfirina]te-trakis-bis(bipiridina)(cloro) rutênio(II)] ) e seu complexo de
Zn2+
ZnTRP onde determinou-se o rendimento quântico de produção de 1O2. Os
resultados indicaram que essas porfirinas possuem um alto rendimento de produção de
1
O2, além disso, o valor maior é para ZnTRP, indicando que a presença de zinco
aumenta a habilidade de fotossensibilização e a capacidade de gerar 1O2.
As propriedades farmacológicas da ZnPc e a necessidade de baixas doses para
obter uma redução satisfatória do tumor após tratamento de TFD fizeram desta droga
um promissor candidato a TFD (SCHIEWECK et al., 1993). A localização do corante
na célula determina a extensão da atividade fotodinâmica. A distribuição do corante
certamente é determinada pelo mecanismo de captação, o qual é principalmente
influenciado pelos sistemas carreadores (RÜCK et al., 1996). A maioria dos corantes
hidrofílicos são captados por pinocitose e acumulados em grânulos extracelulares, como
observados por alumínio ftalocianina sulfonada (PENG. et al., 1991).
2.7
LASER
______________________________________________________________________
A luz laser é uma radiação eletromagnética, sendo um tipo de fonte luminosa
com características bastante distintas daquelas de uma luz fluorescente ou de uma
lâmpada comum; apresenta monocromaticidade, coerência e colimação.
A radiação laser é monocromática porque emite radiações em um único
comprimento de onda (λ). A monocromaticidade é obtida devido aos fótons
que compõem a luz laser estarem todos com o mesmo comprimento de onda. É,
portanto, uma luz pura. Essa característica é importante devido à absorção
seletiva do tecido humano. A coerência é uma propriedade obtida devido à
emissão estimulada que gera fótons, cujas energias se somam e viajam na
mesma direção, movendo-se em fases no tempo e no espaço, ou seja as cristas e
as cavidades das ondas coincidem. A colimação é a unidirecionalidade do feixe
de fótons, paralelo ao eixo do tubo que o produz, apresentando uma divergência
angular muito pequena. De um ponto de vista prático, um laser pode ser
considerado como a fonte de um estreito feixe de ondas eletromagnéticas
monocromáticas e coerentes nas regiões do visível, infravermelho ou
ultravioleta do espectro eletromagnético. O fato da luz laser estar contida em
um feixe, serve para concentrar a potência de saída em uma pequena área.
Assim, um laser de potência modesta, pode produzir uma alta intensidade na
pequena área do feixe do laser, concentrando a energia somente onde é focado.
Similarmente, o feixe de um laser cirúrgico pode ser focado em um pequeno
ponto sem danificar o tecido adjacente (HECTH, 1992).
A radiação pode ser refletida, absorvida ou espalhada pelo tecido. O fenômeno
de espalhamento é bastante relevante na interação laser tecido-biológico, fazendo com
que a radiação perca sua coerência logo após penetrar no tecido, porém ele não é
responsável pela transferência de energia ao tecido. A ação do laser sobre o tecido
biológico se dá pela absorção seletiva de cromóforos por um determinado comprimento
de onda. Para alguns materiais biológicos o comprimento de onda é fator determinante
na interação laser-tecido, correspondendo a distância percorrida pela onda em uma
oscilação completa, sendo medida em nanômetros (nm) e a freqüência de suas
oscilações em Hertz (Hz). O comprimento de onda típico dos lasers comerciais situamse entre infravermelho e ultravioleta e depende fundamentalmente do meio ativo. É o
meio ativo, em geral, que dá o nome ao laser, determinando sua pureza espectral
(BORTOLETO, 2000).
3. MITOCÔNDRIA
______________________________________________________________________
A mitocôndria realiza a maior parte das oxidações celulares e produz a massa de
ATP (adenosina trifosfato) das células animais. Geralmente são descritas como cilindros
rígidos e alongados, com um diâmetro de 0,5 a 1µm, assemelhando-se a bactéria.
Microfilmagens em intervalos de tempos de células vivas mostraram que as
mitocôndrias são organelas notavelmente móveis e plásticas, mudando constantemente
as suas formas e mesmo fundindo-se umas com as outras e separando-se novamente.
A mitocôndria é limitada por duas membranas altamente especializadas com
funções vitais para atividade mitocondrial. Juntas elas definem dois compartimentos
mitocondriais distintos: o interno da matriz e o espaço intermembranas, bem mais
estreito. A matriz contém uma mistura altamente concentrada de centenas de enzimas,
incluindo aquelas necessárias à oxidaç ão do piruvato e ácidos graxos e para o ciclo do
ácido cítrico. A matriz contém também várias cópias idênticas do DNA genômico
mitocondrial, ribossomos mitocondriais especiais, tRNAs, e várias enzimas requeridas
para expressão dos genes mitocondriais. A membrana interna é dobrada em numerosas
cristas que aumentam grandemente a sua área superficial total. Ela contém proteínas
com três tipos de funções: (1) aquelas que conduzem as reações de oxidação de cadeia
respiratória, (2) um complexo enzimático ATP sintase, que produz ATP na matriz, (3)
proteínas transportadoras específicas, que regulam a passagem de metabólitos para
dentro e para fora da matriz. Membrana externa, devido ao fato de conter uma grande
proteína formadora de canais (porina), é permeável a todas as moléculas 5.000 daltons
ou menos.
Outras proteínas existentes nessa membrana
incluem as enzimas que
convertem substratos lipídicos em formas que possam ser subseqüentemente
metabolizadas na matriz. (ALBERTS et al., 1997)
4. NÚCLEO
______________________________________________________________________
O núcleo quando observado na intérfase da divisão celular apresenta uma
membrana envoltória denominada de envoltório nuclear, o qual abriga um conjunto
heterogêneo de fibrilas e de áreas densas, formadas pela cromatina (cromossomos num
estado relativamente desespiralizados) e o nucléolo. A cromatina, que abriga o material
genético (DNA), apresenta duas regiões, que podem ser caracterizadas pelo grau de
espiralização: a eucromatina (desespiralização máxima) e a heterocromatina (regiões do
DNA que estão espiralizadas).
Poros nucleares foram observados ao longo da membrana nuclear. Tais
estruturas, de forma poliédrica, surgem pela junção da superfície interna e externa do
envoltório nuclear. Os poros medem cerca de 50 a 80 nanômetros de diâmetro,
ocupando de 10 a 30% da superfície da membrana. É através dos poros que ocorrem a
passagem de substâncias entre o citoplasma e o interior do núcleo. Grânulos,
provavelmente RNA, já foram vistos dentro dos poros, o que pode indicar que estariam
de passagem em direção ao seu destino, o citoplasma. Outra estrutura que encontramos
no núcleo é o nucléolo, de forma esférica, formado principalmente por RNA
ribossômico enovelado, mais proteínas, fosfolipídeos e algum DNA. Os nucléolos há
muito foram associados a produção de RNA. O envoltório nuclear, um saco achatado
que envolve o núcleo, é de muita importância para as interações que ocorrem entre o
núcleo e o citoplasma. Ao microscópio eletrônico, tal estrutura parece ser muito
semelhante ao retículo endoplasmático, o que é confirmado pelos resultados de estudos
citoquímicos, os quais também revelaram uma semelhança enzimática e bioquímica
com aquela organela. A superfície externa da membrana nuclear (voltada para o
citoplasma) apresenta grânulos de ribonucleoproteínas ligadas a ela; tais grânulos são
provavelmente ribossomos (BIOTEMAS, 2003)
5. MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA
______________________________________________________________________
O surgimento dessa técnica de microscopia e seu uso na biologia devem-se ao
conhecimento dos princípios básicos de fluorescência. Esse fenômeno pode ser descrito,
de maneira genérica, como um tipo de luminescência (emissão de luz) em que um corpo
absorve luz e logo depois a emite, durante curto intervalo de tempo. Há vários tipos de
luminescência,
conforme
a
fonte
de
energia,
como
eletroluminescência,
adioluminescência, quimioluminescência e fotoluminescência. A última é a forma de
luminescência que ocorre quando a fonte da energia absorvida são os fótons (radiação
luminosa, inclusive a ultravioleta). Esse princípio é a base da microscopia de
fluorescência, na qual compostos químicos denominados fluoróforos são usados para
produzir fluorescência no material em estudo (células), ajudando a visualizar com maior
nitidez estruturas ou processos em curso nesse material. Na biologia, os fluoróforos
usados em microscopia são projetados para localizar uma área específica da amostra a
ser observada ou para responder a um estímulo específico. Tais compostos permitem
que os pesquisadores detectem componentes particulares do complexo biomolecular,
inclusive de células vivas. Este processo apresenta três estágios: excitação, tempo de
vida do estado de excitação e emissão de luz. (MICROSCOPIA, 2003)
5.1 MARCADORES FLUORESCENTES
______________________________________________________________________
5.1.1 JC-1
Para detectar variações no potencial de membrana de células isoladas uma nova
técnica de citofluorimetria usando JC-1 (1 - 5,5’,6,6’,-tetrachloro1,1’3,3’,tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide) tem sido utilizada. O JC-1 (marcador específico de
mitocôndria) é capacitado a entrada seletiva na mitocôndria, já que fluoresce na de cor
(verde) devido ao potencial de membrana. A vantagem do JC-1 é que ele pode ser
qualitativo, considerando a emissão de fluorescência de verde para laranja e
quantitativo, considerando a intensidade de fluorescência pura (REERS et al., 1991).
5.1.2 DAPI
O DAPI é marcador fluorescente específico para ácido nucleico, parece estar
associado com o complexo Adenina Timina. A ligação DAPI e DNA aumenta sua
fluorescência em aproximadamente 20 vezes, aparentemente devido a deslocamento de
moléculas de água do DAPI (MOLECULAR PROBES, 2003).
11.MATERIAL E MÉTODOS
_____________________________________________________________________________________
6. 1 CULTURA DE CÉLULAS
11.1.1
Linhagem Celular
A linhagem celular utilizada neste trabalho foi Hep-2, carcinoma de laringe
humana. Foram cultivadas em meio de cultura meio Mínimo Essencial - MEM (Gibco)
suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino - SFB, 1% de antibiótico Antibiotic
Antimycotic (Gibco) e incubadas em atmosfera de 5% de CO2 a 37°C (estufa de CO2
marca Forma Scientific), em garrafas plásticas Nunc de 25cm2. As células foram
adquiridas da Associação Técnico Científica Paul Ehrlich - URFJ - RJ. O estudo em
cultura de células têm relevância especial para o melhor entendimento de problemas e
aplicações da TFD.
11.1.2
Manutenção da Cultura Celular
O estoque celular foi mantido em nitrogênio líquido. Partindo deste, foi
preparado uma garrafa de cultura de 25cm2, contendo 1 ml de cultura de células
(~106células/ml), adicionado-se 2 ml de meio de cultura MEM, enriquecido com 10%
SFB. As células foram mantidas na estufa com controle automático de temperatura
37°C e pressão de CO2. O crescimento celular foi acompanhado por meio da observação
em microscópio invertido Olympus CK40.
Estas células foram subcultivadas após tripsinização, quando a densidade celular
formava uma monocamada confluente. Após o período de 3 minutos com 2 ml de
tripsina retirou-se a mesma, adicionando-se 3 ml de meio de cultura MEM
suplementado com 10% de SFB. Para liberação das células da parede da garrafa, usouse jatos fortes com o auxílio de pipetador automático. Deste volume foram retirados
alíquotas de 1 ml e passados para novas garrafas, adicionando-se mais 2 ml de meio
MEM e incubadas em atmosfera de 5% de CO2 a 37°C.
Para manter o estoque foi realizado o congelamento das células durante a
utilização das mesmas. As células foram removidas das garrafas com auxílio da tripsina
e centrifugadas por 8 minutos a 12000 rotações por minuto. Desprezou-se o
sobrenadante e ressuspendeu-se o sedimento em meio de congelamento contendo 60%
de meio MEM, 30% de SFB e 10% DMSO. Transferiu-se este material para criotubos e
estocou-se em nitrogênio líquido.
A
C
B
D
Figura 6.1. (A) Placa de 96 poços, (B) placa de 24 poços, (C) garrafa de cultura onde foram mantidas as
células Hep-2 e (D) placa de Petri utilizadas em microscopia eletrônica.
A
6.1.3 Reagentes, Soluções e Tampões Necessários Para Cultura Celular
Meio de Cultura MEM - Minimum Essencial Medium - (Gibco)
Soro Fetal Bovino - (Cultilab)
Antibiótico Antimicótico (Gibco)
Tripsina - (GibcoBRL- USA)
Tampão fosfato - PBS - Preparado a partir de 50 ml de tampão Fosfato, 950 ml
água destilada e 9 g NaCl (Merck)
Tampão PHEM - (Sigma)
Dimetil Sulfóxido DMSO - (Synth)
6.2 INCUBAÇÃO E IRRADIAÇÃO
Preparação do Fotossensibilizador - A ZnPc sendo um fotossensibilizante
hidrofóbico, exige um solvente para sua diluição, então foi empregado o Dimetil
Sulfóxido (DMSO) como citado em outros trabalhos (KILANKZYC et al., 2002,
WRÓBEL et al., 2001, SCHEMPP et al.,2001, FRACKOWIAK et al., 2001). Diluiu-se
em tubo se microcentrífuga 0,57mg em 1 ml de DMSO formando então a solução
estoque 1mM. O fotossensibilizador após o seu preparo, foi filtrado e mantido em estufa
a 37°C por 24 horas para sua completa dissolução, posteriormente conservado em
temperatura -28°C.
Incubação
-
Células Hep-2 plaqueadas em placas de 24 poços (1x105
células/ml) foram incubadas com o fotossensibilizante ZnPc em uma concentração
4,5µM e 9µM por 60 minutos a 37°C. Ao término deste tempo lavou-se as células com
PBS.
Irradiação - As células em PBS foram irradiadas no escuro, utilizando um
aparelho clínico portátil diodo laser 670 nm semicondutor Thera Lase - DMC, com
meio ativo de fosfeto de índio-gálio-alumínio (InGaAlP). A irradiação foi utilizada em
dois protocolos diferentes, no primeiro as células foram plaqueadas em placas de 24
poços destinadas a: doses variadas de energia, viabilidade celular após TFD e
microscopia de fluorescência, enquanto que no segundo protocolo, as células foram
plaqueadas em placas de Petri e foram destinadas ao tratamento para Microscopia
Eletrônica. Ambos os protocolos mantiveram as doses de energia e potência iguais.
Incubou-se as células após a irradiação com meio de cultura MEM suplementado com
10% de soro fetal bovino, por períodos de: 30 minutos, 1, 4, 12 e 24 horas.
Figura 6.2. Laser Thera Lase - DMC, utilizado nas irradiações das células.
Parâmetros
Comprimento de onda (λ)
Aparelho
Valores para placa de
Valores para placa de 24
Petri
Poços
670 nm
670 nm
Thera Lase - DMC
Thera Lase - DMC
Dose de Energia (E)
4,5 J/cm2
4,5 J/cm2
Densidade de Potência (P)
0,025 W
0,025 W
Área
9,6 cm2
0,8 cm2
28 minutos e 8 segundos
144 segundos
20 cm
7 cm
3,48 cm
1 cm
Tempo
Distância da fibra a placa
Diâmetro do feixe
Tabela 6. 1. Parâmetros utilizados para irradiação em placas de Petri e placas de 24 poços.
6.3 TESTE DE CITOTOXICIDADE
6.3.1 Teste de MTT.
Reagentes Necessários para MTT
MTT(3-(4,5-dimethylthiazolone-2-yl)-2,5-diphenyl
tetrazolium
bromide)
-
(Sigma)
Dimetil Sulfóxido DMSO - (Synth)
Tampão fosfato PBS - Preparado a partir de 50 ml de tampão Fosfato, 950 ml
água Destilada e 9 g NaCl (Merck).
A técnica de MTT é um ensaio quantitativo para determinar a interrupção de
uma função bioquímica crítica. Este ensaio quantifica atividade mitocondrial medindo-
se a formação de cristais de formazana, produto formado pela redução de tetrazoliuo
MTT. A redução do MTT ocorre principalmente na mitocôndria através da ação da
succinato desidrogenase
fornecendo
então uma medida da função mitocondrial.
(LOBNER, 2000).
Plaqueamento - As células Hep-2 foram plaqueadas (5x104 células/mL) em
microplacas de 96 poços, com meio de cultura MEM suplementado com 10% de soro
fetal bovino (SFB) para adesão das células em estufa de CO2 5% e temperatura 37 ºC
incubadas overnight. No dia seguinte foi retirado o meio de cultura, lavadas as células
três vezes com PBS para que fosse removido totalmente o meio com SFB pois a
presença de elementos do soro poderiam modificar a interação das células com a droga
in vitro (RICHTHER et al., 1990), e acrescentado as concentrações de ZnPc e DMSO
(1, 2, 4, 9, 11 e 22 µl de ZnPc e as porcentagens de DMSO que corresponderam a este
volume de droga: (0,1; 0,2; 0,4; 0,9; 1,8; 2,2; e 4,4 %) em seus respectivos poços para o
teste.
ZnPc (µM)
% DMSO
ZnPc retirado
PBS (µl)
do estoque (µl)
Volume Total
(µl)
1
0,1
0,2
199,8
200
2
0,2
0,4
199,6
200
4
0,4
0,8
199,2
200
9
0,9
1,8
198,2
200
11
1,1
2,2
197,8
200
22
2,2
4,4
195,4
200
Tabela 6. 2. Concentrações e volumes utilizados de ZnPc e DMSO.
O tempo de incubação das células com o corante foi de 1 hora a 37ºC em uma
atmosfera de 5% de CO2. Após este período foi retirado o corante, as células foram
lavadas com PBS 3x e novamente incubadas com meio de cultura MEM contendo 10%
de SFB. Após a incubação por 24h na mesma atmosfera, foi realizado o teste de MTT.
Incubação com MTT
submetidas
ao
tratamento
-
Após o período de incubação as células foram
de
MTT(3-(4,5-dimethylthiazolone-2-yl)-2,5-diphenyl
tetrazom bromide) onde adicionou-se 10µL, uma concentração final de 0,5 mg/ml de
MTT-formazana deixando-as incubadas por 4h a 37°C em atmosfera de 5% de CO2.
Adição do Solvente
-
Sobre os precipitados de formazana adicionou-se o
solvente orgânico DMSO (200µL) em cada poço.
Processo de solubilização - A placa foi mantida sob agitação para a
solubilização dos cristais de formazana por 10 minutos.
Leitura - A leitura da absorbância, 570 nm, foi realizada no leitor de ELISA
Spectra Count. Os dados obtidos foram tratados de acordo com a fórmula:
% Viabilidade = (Absorbância de Células Tratadas - Absorbância do Branco) x 100
(Absorbância de Células Controle - Absorbância do Branco)
Onde o branco é representado pela absorbância do poço vazio. Após este
tratamento os resultados foram plotados no programa GraphPad Prism com média e
desvio padrão de 6 amostras em triplicata.
6.3.2 Teste de exclusão com Azul de Tripan - após doses de Energia
Esta técnica é utilizada para análise da integridade da membrana celular. Uma
definição comum para morte celular é baseada em mudanças na permeabilidade
membrana celular. A técnica Azul de Tripan define a morte da célula como uma
mudança nas propriedades da membrana tal que em uma célula morta, este corante se
difunde rapidamente para dentro do citoplasma, enquanto que em uma célula viva, sua
membrana plasmática não permite a penetração do corante. Conservado em câmara fria
entre 2 a 8 °C. (SPIKES, 1998).
Plaqueamento - As células foram plaqueadas em uma densidade de 1x105
células/ml em poços alternados em placas de 24 poços. Depois da adesão das células
por 24 h estas foram incubadas com o fotossensibilizador ZnPc por uma hora a 37ºC
em atmosfera de 5% de CO2. Após lavadas com PBS foram novamente incubadas com
PBS para a irradiação.
Irradiação - Para irradiação foi utilizado laser Thera Lase (DMC), um
semicondutor, com uma potência de 25mW e comprimento de onda (λ) de 670 nm. O
tempo foi variado de acordo com as diferentes doses de energia: 0,5; 1,5; 2,5; 3,5 e 4,5
J/cm2. A irradiação foi realizada no escuro e em seguida o PBS foi removido e
adicionado meio de cultura e incubou-se por 24 e 48 horas a 37ºC em atmosfera de 5%
de CO2.
Contagem Celular - Após 24h de incubação realizou-se a contagem de células
vivas e mortas por exclusão do Azul de Tripan. Os valores foram obtidos por contagem
em microscópio invertido de fase. Adicionou-se 5 µL de Azul de Tripan 0,4% no poço
contendo 195µL de PBS, incubou-se por 5 minutos a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2
e realizou-se a contagem.
6.3.3 Exclusão com Azul de Tripan - após a Terapia Fotodinâmica.
Plaqueamento - As células Hep-2 foram plaqueadas (1x105 células/ml) após
sua adesão em 24 h, foram submetidas a incubação com fotossensibilizador (ZnPc) por
1 h em uma concentração 4,5 µM e 9 µM a 37°C. Após este período as células foram
lavadas 2x com PBS e mantidas novamente com PBS para irradiação.
Irradiação - A irradiação foi realizada por 144s. Foi utilizado o diodo laser 670
nm, a dose de luz foi de 4,5 J/cm2, potência de 0,025W, com uma distância de 7cm da
saída do laser até os poços, realizada no escuro. Em seguida foi retirado o PBS,
incubadas novamente na estufa a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2 com meio cultura
MEM suplementado com 10% de soro fetal bovino. Foram incubadas de acordo com o
protocolo já definido nos tempos de 30 minutos, 1, 4, 12 e 24 horas.
Contagem Celular
-
Obteve-se a viabilidade através do teste de Azul de
Tripan, ao final de cada tempo de incubação descritos acima. Os resultados de
viabilidade celular após a Terapia Fotodinâmica foram plotados em histograma no
programa de computador GraphPad Prism.
6.4 MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA
Reagentes Necessários para Microscopia de Fluorescência
Tampão PHEM - (Sigma)
Tampão Fosfato 0,1M (pH 7,2)
Glutaraldeído (Fluka - Biochemica)
Paraformaldeído 4% (Sigma)
Marcador para núcleo DAPI - 4', 6' - diamidino, 2' phenylindole- 5 µM - (Molecular
Probes)
Marcador para mitocôndria JC-1 - 5,5’,6,6’,-tetrachloro-1,1’3,3’,tetraethylbenzimidazol
carbocyanine iodide - (Molecular Probes Inc. USA)
6.4.1 JC-1 - Marcação para Mitocôndria
A fluorescência verde de JC-1 ocorre quando este encontra-se como monômero
em baixas concentrações ou em baixo potencial de membrana. Em altas concentrações
(soluções aquosas acima de 0,1 µM) ou altos potenciais, o marcador JC-1 forma
agregados com fluorescência verde alaranjado, que exibe um espectro em
aproximadamente em 590 nm. Na verdade a emissão deste marcador pode ser utilizada
como estimativa do potencial elétrico da membrana mitocondrial.
Marcação - As células submetidas a TFD, assim como os controles sem
tratamento,
foram
marcadas
com
0,13µl
de
JC-1
(5,5’,6,6’,-tetrachloro-
1,1’3,3’,tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide - Molecular Probes Inc. USA),
diluídos em 100µl de PBS em uma concentração final de 10 µM, incubou-se por15
minutos e lavou-se com PBS. Realizou-se a marcação com JC-1 fixou-se as células com
4% de paraformaoldeído em 0,1M de tampão fosfato (pH 7,2) por 10 minutos e lavouse com PBS. A seguir as lamínulas foram montadas sobre lâminas contendo N-propil
galato, vedadas com esmalte na periferia da lamínula. Realizou-se toda manipulação do
material ao abrigo de luz. As lâminas foram analisadas em Microscópio de
Fluorescência
Leica DMLB utilizando
o filtro de excitação e emissão
aproximadamente de 530 e 590 nm, respectivamente.
6.4.2 DAPI - Marcação para Núcleo
Fixação – As células submetidas a TFD, assim como os controles sem
tratamento, foram fixadas com 4% de paraformaoldeído em 0,1M de tampão fosfato
(pH 7,2) por 10 minutos e foram lavadas com PBS. Adicionou-se 0,06µl de DAPI,
diluídos em 200µl de PBS a uma concentração final de 0,03 µM, incubou-se por10
minutos e lavou-se com PBS. A seguir as lamínulas foram montadas sobre lâminas
contendo N-propil galato, vedadas com esmalte na periferia da lamínula. Realizou-se
toda manipulação do material ao abrigo de luz. As lâminas foram analisadas em
Microscópio de Fluorescência
Leica DMLB utilizando
aproximadamente de 358 nm e emissão de 461 nm.
6.5 MICROSCOPIA ELETRÔNICA
Reagentes Utilizados :
Tetróxido de Ósmio 1% (Fluka - Biochemica)
Tampão Fosfato 0,1M (pH 7,2)
o filtro de excitação
em
Glutaraldeído (Fluka - Biochemica)
Paraformaldeído 4% (Sigma)
Acetona 50, 70, 90 e 100% (Carlo Erba Reagenti)
Ferricianeto de Potássio (Carlo Erba Reagenti)
Acetato de Uranila 5% (Sigma)
Citrato de Chumbo (Polysciences, Inc.)
Plaqueamento - As células foram plaqueadas em placas de Petri de 35x10 mm
em uma densidade celular de 1,5x 106 cels/ml e deixadas 24h para adesão celular em
estufa a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2 com meio cultura MEM suplementado com
10% de soro fetal bovino. Para Microscopia Eletrônica foram utilizados quatro grupos
experimentais: grupo controle, controle somente droga, grupo controle somente laser e
grupo tratado pela TFD.
Incubação com o fotossensibilizante - As células foram lavadas 2x com PBS e
incubou-se com o fotossensibilzador por 1 hora no escuro. Para o grupo controle-droga
depois deste período as células foram lavadas com PBS e incubadas com meio MEM
suplementado com 10% de SFB em 37ºC em atmosfera de 5% de CO2. Já o grupo de
TFD após a incubação com a droga foi lavado com PBS e mantido em PBS novamente
para seguir a irradiação.
Irradiação - As células foram irradiadas com laser Thera Lase (DMC), um
semicondutor com comprimento de onda (λ) de 670 nm por 28 minutos e 8 segundos,
onde a dose de energia foi 4,5 J/cm2 e potência de 0,025 w, respeitando uma distância
de 24cm da ponteira do laser até a placa de Petri, para que se formasse um feixe com
uma área de 9,6cm2 cobrindo a placa. Toda a irradiação foi mantida no escuro. No
momento seguinte as células foram incubadas com meio de cultura MEM suplementado
com 10% de soro fetal bovino, por um períodos de 30 minutos, 1, 4, 12 e 24 horas na
estufa a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2.
Após estes períodos retirou-se o meio, as células foram lavadas com PBS e
adicionou-se fixador.
Fixação – A suspensão celular foi centrifugada (10 minutos/3000 rotações por
minuto), desprezou-se o sobrenadante e ressuspendeu-se as células em 300µl de fixador.
Transferiu-se este para a placa de Petri com as células e completou-se com fixador para
600µl, onde foram deixadas por 2 horas em temperatura ambiente.
Fixador:
tampão Fosfato 0,1M (pH 7,2).............2,50ml
Glutaraldeído 2,5%...............................0,50ml
paraformoldeído 4% .............................2,0ml
5,0ml
Esta etapa visa matar rapidamente as células preservando sua estrutura e
permeabilizando-as, a fim de permitir a penetração do próprio fixador e de outras
substâncias. Na microscopia eletrônica os fixadores mais utilizados são os
formaldeídos, o glutaraldeído e tetróxido de ósmio. O glutaraldeído forma ligações
cruzadas entre as proteínas por possuir dois grupamentos aldeído em sua molécula.
Geralmente é utilizado numa concentração de 2,5% em tampão. O formaldeído não
forma ligações cruzadas, sendo muito empregado para preservar a integridade
bioquímica e antigênica das células. Após fixação as células foram removidas e
centrifugadas (3000 rotações por minuto por 10 minutos) em microcentrífuga lavandoas por 3 vezes.
Pós-fixação - Adicionou-se 200µl de Tetróxido de Ósmio (OsO4) da solução
estoque a 2% (diluído em tampão fosfato 1:1) e deixados por exatos 30 minutos.
Passado este tempo lavou-se 3 vezes com PBS.
O OsO4 é utilizado na segunda fixação e é um excelente fixador de lipídios.
Sendo o tetróxido de ósmio um metal pesado, também confere certo contraste às
membranas. Por outro lado, o poder de penetração do ósmio é reduzido (1mm/h),
requerendo que as amostras sejam bem pequenas e finas (1 a 2 mm). O tetróxido de
ósmio também se reduz em presença de luz, é volátil e extremamente tóxico. Por estes
motivos sua manipulação deve ser feita sob exaustores especiais (capela) e no escuro.
Desidratação - A desidratação consiste na passagem das amostras por uma série
de concentrações crescentes de acetona ou etanol até atingir 100% Incubou-se as
amostras nas diferentes concentrações de acetona:
Acetona 50% incubada por 10 minutos
Acetona 70% incubada por 10 minutos
Acetona 90% incubada por 10 minutos
Acetona 100% incubada 3 vezes por 10 minutos.
Uma vez que a coluna dos microscópios eletrônicos permanece constantemente
em vácuo, a observação de células hidratadas levaria a vários problemas como
evaporação desta água no interior da coluna, interferindo na trajetória de feixe e levando
à queima do filamento. Além disso, as células se romperiam e se deformariam
profundamente. A etapa da desidratação tem por objetivo a substituição subseqüente
destes solventes orgânicos por resinas epoxi ou acrílicas que geralmente não são
miscíveis em água. Entretanto estas resinas só são utilizadas no caso do processamento
para microscopia eletrônica.
Infiltração - Preparou-se em um tubo de microcentrífuga uma mistura acetona epon 1:1, transferiu-se a mistura para o sedimento. Deixou-se overnight, no dia seguinte
retirou-se a mistura e adicionou epon puro na mesma quantidade.
As resinas utilizadas
em microscopia eletrônica são inicialmente líquidas,
infiltrando-se lentamente em todos os espaços intra e extracelulares, substituindo a
acetona utilizada na desidratação.
Inclusão - No final do dia seguinte removeu-se o material para a fôrma e epon
puro foi adicionado. Permaneceu na estufa por 48 horas para polimerização da resina e a
formação do bloco.
Ultramicrotomia - O bloco com material foi cortado em cortes ultrafinos (60 e
70 nm) em um ultramicrótomo (Ultracut UCT, Leica) e coletados em grades (300 mesh,
Leica).
Contrastação - Deixou-se as grades contendo os cortes sobrepostas gotas de
acetato de uranila 5% por exatos 30 minutos. Em seguida, lavou-se suavemente 10
vezes em água destilada e secou-se em papel de filtro. Incubou-se por 5 minutos os
cortes em citrato de chumbo, e lavou-se suavemente em água destilada 3 vezes.
Análise - As grades foram analisadas em Microscópio Eletrônico de
Transmissão marca ZEISS modelo EM10, no laboratório de Microscopia Eletrônica da
Faculdade de Odontologia de Piracicaba - Universidade Estadual de Campinas Campus Piracicaba.
7. RESULTADOS
____________________________________________________________
7.1 Relação entre Número de Fótons/Moléculas e Células
Para que a TFD tenha um resultado satisfatório é necessário que o protocolo
aplicado obedeça uma norma onde o número de fótons tem que ser muito maior que o
número de moléculas e o de moléculas muito maior que de células.
ü Número de moléculas:
Partindo da concentração utilizada no protocolo temos 9 ìM de fotossensibilizador
ZnPc ou 9x10-6 moles/litro, sendo M = mol/l = 6,02 x 1023 moléculas/litro temos:
9x10-6 mol ----- 1 litro
X ----------------- 1x10-3
X
= 9x10-9 mol/ml
6,02 x 1023 moléculas
1 mol ---------
9x10-9 mol ----------- x
X = 5,4 X 1015 moléculas/ml
ü Cálculo do número de Fótons:
ν = freqüência
c = velocidade da luz do vácuo
λ = comprimento de onda
N = número de fótons
D. E. = dose de energia
h = constante de Planck
ν=
c
λ
N = D.E
= 3. 108 m/s = 4,45 . 1014 Hz
675. 10-9
=
N=
4,5 J/cm2
= 1,6 x 1019 fótons/cm2
h.ν
6,626 x 10-34 4,45 . 1014 Hz
ü Número de células utilizadas 1x105 células/ml.
De acordo com os cálculos acima foi estabelecido o protocolo respeitando o
número de fótons muito maior que moléculas, aumentando assim a probabilidade das
moléculas
serem ativadas pelos fótons. Permanecendo a mesma relação entre
moléculas, tendo seu número muito maior que o número de células.
Relação entre do número de fótons/moléculas e células:
1,6 x 1019 (fótons/cm2) >> 5,4 X 1015 (moléculas/ml) >> 1x105 (células/ml).
7.2 Absorbância da ZnPc
Figura 7.1: Espectro de absorção da ZnPc filtrada na concentração de 9µM em DMSO.
Pico de absorção em 675 nm.
7. 3 Teste De Citotoxicidade
7.3.1
Para Padronização da Concentração do fotossensibilizador Zinco
Ftalocianina
O teste de MTT foi aplicado para analisar a citotoxicidade do fotossensibilizador
ZnPc nas diferentes concentrações (1; 2; 4,5; 9; 11 e 22 µM) frente a linhagem Hep-2.
Objetivando ainda encontrar a máxima concentração de ZnPc na qual a linhagem Hep-2
demonstrasse uma alta percentagem de sobrevivência celular na ausência de luz.
Os resultados demonstraram uma queda na percentagem de sobrevivência em
aproximadamente 95 e 80%, somente nas maiores concentrações 11 e 22 µM
respectivamente (gráfico 7.1). Afirmando assim que ZnPc apresenta baixa toxicidade,
característica esta necessária para os fotossensibilizadores. Com estes dados
determinamos as condições de tratamento para TFD utilizando as concentrações de 4,5
% Viabilidade Celular
e 9µM.
ZnPc
Controle
100
80
60
40
20
0
c
1
2
4,5
9
11
22
Concentração µM de ZnPc
Gráfico 7.1. Viabilidade de Células Hep-2 após 24h do tratamento com fotossensibilizador Zinco
ftalocianina (ZnPc), média e desvio padrão de 6 experimentos.
7.3.2 Citotoxicidade para concentrações do DMSO
Baseado no mesmo objetivo que a citotoxicidade da ZnPc, este teste foi aplicado
também ao seu veículo DMSO procurando encontrar a máxima concentração para o
qual a linhagem Hep-2, demonstrasse uma alta percentagem de sobrevivência celular na
ausência de luz. A incubação foi realizada por 60 minutos.
Para as células tratadas somente com o DMSO, observou-se uma queda em 1,1%
e 2,2%, mantendo a porcentagem de células vivas na faixa de 93% e 92%
respectivamente (gráfico 7.2). O veículo DMSO não se mostrou tóxico nas
Viabilidade Celular %
concentrações utilizadas permanecendo o número de células vivas acima de 90%.
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
*
c
0,1
0,2
0,4
0,9
1,1
Controle
DMSO
2,2
Concentrações DMSO %
Gráfico 7.2. Viabilidade de Células Hep-2 após 24h de incubação com DMSO variando as concentrações
média e desvio padrão de 6 experimentos. Asterisco indica diferença significativa do tratamento em
relação ao controle como determinado pelo programa ANOVA seguido pelo teste Dunnett (P< 0,05).
7.4 Teste de Viabilidade Celular
7.4.1
Para Padronização da Dose de Energia
A viabilidade celular no tratamento variando as doses de energia empregadas
sob as células Hep-2, teve como objetivo definir a maior dose de energia que pudesse
ser utilizada mas com uma alta percentagem de sobrevivência celular. As doses de
energia utilizadas foram 0,5; 1,5; 2,5; 3,5 e 4,5 J/cm2. A irradiação foi realizada no
escuro e a contagem celular foi realizada após 24 horas.
Os resultados demonstraram (gráfico 7.3) em todas as doses de energia uma alta
viabilidade celular, dentre estas optamos para o tratamento de TFD a dose maior de 4,5
J/cm2, apresentando 95% de viabilidade. Este resultado confirma também que o
tratamento somente com a luz assim como o fotossensibilizador sozinhos (gráfico 7.1)
Viabilidade Celular %
não apresentam morte para as células neoplásicas, ou alterações fisiológicas.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Controle
Irradiadas
C
0,5
1,5
2,5
3,5
4,5
Densidade de energia J/cm2
Gráfico 7.3. Viabilidade Celular linhagem Hep-2 irradiadas sem corante, variando dose de Energia entre
0,5 a 4,5Jcm2. Usando o método de Azul de Tripan após 24 h da irradiação. Média e desvio padrão de 6
amostras. Não houve diferença significativa do controle em relação às irradiadas como determinado pelo
programa ANOVA seguido pelo teste Dunnett (P< 0,05).
7.4.2
Viabilidade Celular Após a Terapia Fotodinâmica
Os resultados anteriores de citotoxicidade da ZnPc (gráfico 7.1) e viabilidade
celular com as doses de energia (gráfico 7.2), foram utilizados para determinar as
condições de tratamento para a TFD utilizando 4,5 e 9 ìM de ZnPc e 4,5 J/cm2.
Após incubação de 1 hora, as células foram contadas em microscópio invertido
de fase pelo método de exclusão de Azul de Tripan. Média e desvio padrão
foram obtidos de 3 experimentos em duplicata e permitiram a elaboração dos
gráficos pelo programa Graph Pad Prism.
O
protocolo
aplicado
neste
tratamento
em
células
Hep-2
com
o
fotossensibilizador ZnPc apresentou viabilidade celular de 11,5 e 4% (gráfico 7.4.)
Viabilidade Celular %
confirmando resultado esperado na Terapia Fotodinâmica com baixa viabilidade.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
TFD 24h
TFD 48h
*
*
*
*
c
4,5
9
Concentração µ M
Gráfico 7.4 - Viabilidade de células Hep-2 sob tratamento TFD, frente a administração do corante ZnPc
nas concentrações 4,5 e 9 ìM, analisados em 24 e 48 horas após o tratamento. Nota-se uma viabilidade
de aproximadamente 4% na concentração 9 ìM 24 horas após o tratamento. Asterisco indica diferença
significativa do controle em relação a TFD como determinado pelo programa ANOVA seguido pelo teste
Dunnett (P< 0,05).
7.5 Microscopia De Fluorescência
7.5.1 Microscopia de Fluorescência - Marcação Mitocôndria
A atividade e potencial de membrana mitocondrial após a TFD foram avaliados
com auxílio da microscopia de fluorescência, através da marcação com o marcador JC1, especifico para mitocôndria. As células foram incubadas com o marcador após o
tratamento de TFD, bem como aquelas tratadas com laser e ZnPc (respeitando o
protocolo com todos os tempos: 30 minutos, 1, 4, 12 e 24 horas). As células controle
(sem tratamento e tratamento somente ZnPc) apresentaram morfologia normal com
distribuição de mitocôndria por todo citoplasma e aspecto filamentoso (morfologia
observada em todos os tempos do protocolo), figura 7.2.
A microscopia de fluorescência nos revelou um alto potencial de membrana no
tratamento somente laser, observa-se um intenso agrupamento de mitocôndria
distribuída no citoplasma, enquanto a periferia apresenta um número reduzido (figura
7.3A). A análise das células marcadas com JC-1 30 minutos após a TFD, revelou a
presença de mitocôndrias com aspecto granular, distribuídas no citoplasma (figura
7.3B), porém em número reduzido quando comparado aos grupos controles (figura
7.2A/B). Doze horas após a TFD, observou-se prolongamentos da membrana
citoplasmática, sugerindo inicio da formação de corpos apoptóticos, fato confirmado
com as células 24 horas após o tratamento, com o comprometimento total do núcleo e
membrana plasmática com formação de corpos apoptóticos (figura 7.4B e 7.5
respectivamente). Observou-se baixo potencial de membrana com concentração de
mitocôndrias ao redor do núcleo, apresentando-se escassas na região periférica do
citoplasma e evidente retração celular, doze horas após TFD (figura 7.4A).
Figura 7.2: Atividade mitocondrial em células não irradiadas. (A) Células Hep-2
marcadas com JC-1, nota-se mitocôndrias distribuídas em todo citoplasma apresentando
baixo potencial de membrana e aspecto filamentoso. (B) Após incubação com ZnPc as
células Hep-2
foram marcadas com JC-1. Nota-se mitocôndrias com a mesma
distribuição e aspecto das células controle. 2500x.
Figura 7.3: (A) Células Hep-2 marcadas com JC-1 incubadas 24 horas após tratamento
somente laser, é evidente intenso agrupamento de mitocôndria na região perinuclear,
enquanto na periferia este número diminuiu. (B) Células incubadas 30 minutos após o
tratamento TFD, nota-se mitocôndrias com baixo potencial de membrana, pequenas
concentrações granulares sendo bem clara a redução deste potencial em relação aos
controles. 2500x.
Figura 7.4: (A/B) Células Hep-2 marcadas com JC-1 12 horas após tratamento TFD. (A)
As mitocôndrias apresentam baixo potencial e localizam-se na região perinuclear
(seta), enquanto a periferia do citoplasma encontra-se escassa (
), é bastante clara a
retração celular (cabeça de seta). (B) Observa-se prolongamento, bolhas, na membrana
plasmática sugerindo início de formação corpos apoptóticos. 2500x.
Figura 7.5: Célula Hep-2 marcadas com JC-1 12 horas após o tratamento TFD. As
células apresentam comprometimento total de núcleo e membrana plasmática com
formação de corpos apoptóticos. 2500x.
7.5.2
- Microscopia de Fluorescência - Marcação Núcleo
A visualização das células com o marcador DAPI núcleo, nos forneceu
informações sobre o núcleo e membrana
nuclear, permitindo assim apontar as
alterações após os tratamentos: somente laser, somente fotossensibilizador e terapia
fotodinâmica.
O grupo controle (sem tratamento), bem como os controles tratamento somente
laser e somente droga aplicados as células, não apresentaram alterações na estrutura
nuclear (observada na figura 7.6A/B controle 1 hora e 12 horas após laser). Esta
observação é válida para todos os tempos do controle (30 minutos, 1, 4, 12 e 24 horas)
somente laser bem como para controle somente droga. Observa-se membrana nuclear
íntegra e bem delineada no grupo de células tratadas somente com droga , não sendo
notado alterações no núcleo (figura 7.7A).
Enquanto a luz laser aplicada após a sensibilização com a ZnPc, em 30 minutos
provocou comprometimento da membrana nuclear com clara fragmentação do núcleo
(figura 7.7B e 7.8A).
Constatou-se retração celular devido diminuição da adesão 1 hora após o
tratamento da TFD e comprometimento da membrana nuclear com a formação de
prolongamentos ao longo da mesma (figura 7.8B). A formação de bolhas ao longo da
membrana plasmática foi bastante constante após tratamentos TFD (figura 7.9 A/B).
Figura 7.6: (A) Grupo de células Hep-2 controle, sem tratamento, (B) tratadas somente
com laser marcadas com DAPI. Observa-se núcleo preservado, cromatina e membrana
nuclear intactas. 2.500x.
Figura 7.7: Célula Hep-2 marcadas com DAPI, (A) controle tratadas somente com ZnPc
o núcleo permanece normal. (B) Após o tratamento TFD incubadas 30 minutos com
meio MEM a membrana apresenta alterações morfológicas com perda da integridade
nuclear (cabeça de seta) 2.500x.
Figura 7.8: Células Hep-2 marcadas com DAPI. (A) Nota-se fragmentação nuclear e
comprometimento da membrana (30 minutos após TFD). (B) Após 1 hora de tratamento
TFD é possível observar retração celular e formações de prolongamentos nucleares
(cabeça de seta ). 2500x.
Figura 7.9: (A/B) Células Hep-2 marcadas com DAPI. É possível observar e
comprometimento da membrana plasmática com formação de bolhas, após 1 e 12 horas
(respectivamente) de tratamento. 2500x.
7.6
Microscopia Eletrônica
A microscopia eletrônica nos permitiu analisar ultraestruturalmente as alterações
ocasionadas às células Hep -2, devido o tratamento de TFD, assim como compará-las
aos controles em sua morfologia natural.
As células controles apresentaram a morfologia normal em todos os tempos
com mitocôndria e membrana plasmática intactas (figura 7.10A), cromatina
homogeneamente distribuída e membrana nuclear preservada, sendo possível ainda
identificar as cristas mitocondriais.
O grupo controle de células tratadas somente com fotossensibilizador ZnPc não
apresentou alterações morfológicas, como esperado. Observa-se a integridade das
organelas no citoplasma como complexo de Golgi, mitocôndrias (figura 7.10B) em
todos os tempos.
Após 30 minutos da TFD (figura 7.11A/B) notam-se alterações morfológicas
como cromatina condensada na periferia, um afastamento da membrana nuclear em
relação ao citoplasma, em conseqüência da perda de adesão da membrana nuclear. Tais
características não são observadas no controle. É bastante evidente a invaginação da
membrana nuclear, sugerindo futura formação de corpos apoptóticos e presença de
vacúolos (figura 7.11A/B).
Observa-se nítidas invaginações da membrana nuclear, cromatina condensada,
após 24 do tratamento. É interessante notar que a grande maioria do conteúdo
citoplasmático está envolvido por membrana citoplasmática de forma organizada (figura
7.12A/B)
Figura 7.10: (A) Células Hep-2 (Controle: sem tratamento). Microscopia Eletrônica
apresentando mitocôndrias (M), membrana plasmática (MP) e nuclear preservadas e
núcleo intacto (N). (B) Células Hep-2 Controle: tratamento somente fotossensibilizador
ZnPc após 30 minutos de incubação. Nota-se a integridade das organelas no citoplasma
complexo de Golgi (G) mitocôndrias e núcleo (N). 3.270x
MP
N
M
G
N
Figura 7.11: (A/B) Células Hep-2 30 minutos após tratamento com TFD. Observa-se
cromatina condensada na periferia (cabeça de seta grande) e um afastamento da
membrana nuclear em relação ao citoplasma (cabeça de seta pequena). Nota-se um
início de invaginação da membrana nuclear (seta) e presença de vacúolos (V). (A) 3.270
e (B) 3.810x.
V
Figura 7.12: (A/B) Células Hep-2 24 horas após tratamento com TFD. Observa-se
(duas) nítidas invaginações da membrana nuclear (
), cromatina condensada (c),
extensa tumefação das organelas, conteúdo do citoplasma envolvido por membrana
citoplasmática de forma organizada (cabeça de seta). (A) 2.030 e (B) 1.450x.
C
8. DISCUSSÃO
_____________________________________________________________________________________
Devido a estrutura hidrofóbica, as ftalocianinas localizam-se em uma ou mais
membranas celulares. Usuda (2003) relatou que a ftalocianina 4 (Pc4) interage com
células tumorais preferencialmente na membrana mitocondrial, no retículo
endoplasmático e no complexo de Golgi.
Segundo Juarranz et al., (2001), é bem conhecido que a reação de
fotossensibilização é dependente da localização do fotossensibilizador. Neste sentido
diferentes localizações subcelulares têm sido descritas para ZnPc, dependendo da
linhagem celular tais como: distribuição difusa no citoplasma de células epiteliais RR
1012 (RÜCK et al., 1996), localização na membrana plasmática de fibroblasto de
embrião de rato, em Complexo de Golgi ou mitocôndria em células NHIK 3025
(RODAL et al., 1998). Além disso, é conhecido que o 1O2 tem um curto tempo de vida,
portanto inicialmente as reações de oxidação ocorrem em organelas nas quais os
fotossensibilizadores se ligam e secundariamente em outras estruturas celulares.
Os resultados no teste de citotoxicidade demonstraram uma queda na
percentagem de sobrevivência de aproximadamente 95 e 80%, somente nas maiores
concentrações, 11ìM
ZnPc
apresenta
e 22 ìM respectivamente (gráfico 7.1). Afirmando assim que
baixa
toxicidade,
característica
esta
necessária
para
os
fotossensibilizadores.
O fato do fotossensibilizador não ser tóxico no escuro, reflete como vantagem na
aplicação clínica, pois não há necessidade de se preocupar com a toxicidade em órgãos
como fígado, rins, baço e medula óssea, uma vez que estes órgãos encontram-se ao
abrigo de luz em humanos (MOAN et al., 1992). As ftalocianinas são acumuladas em
larga quantidade no fígado, como é típico da maioria dos fotossensibilizadores
hidrofóbicos, os quais são predominantemente eliminados do organismo pelas vias
intestinais e biliar. A ZnPc apresenta máxima concentração no fígado de 3,27 + 0,62
nmol/g em 24 horas. (JORI; FABRIS, 1998).
Estudos recentes sugerem que a estrutura química pode fortemente influenciar a
localização das ftalocianinas em células tumorais, e o início da resposta apoptótica é
modulada pelo tipo de interação do fotossensibilizador
adjacentes (JORI; FABRIS. 1998).
com a organela alvo e
É necessário notar que as células tratadas somente com luz e as células tratadas
somente com a ZnPc não apresentam mudanças morfológicas no núcleo. Afirmação
que pode ser constatada pela microscopia de fluorescência, com marcador DAPI
(núcleo), observa-se distribuição normal da cromatina e membrana nuclear intacta após
incubação com fotossensibilizador e após tratamento com laser. A análise ultraestrutural
pela microscopia eletrônica confirma estes resultados; reforçando ainda os resultados de
viabilidade celular com dose de energia variada, os quais demonstraram alta viabilidade.
Notamos em nosso trabalho que as células controle tratadas somente com
irradiação, exibiram fluorescência mais intensa indicando um alto potencial de
membrana, uma vez que a utilização do marcador JC-1 permite visualizar as alterações
na morfologia, funcionamento e alterações destas organelas. Resultado previsto, uma
vez que o laser utilizado diodo, é um Laser de Baixa Potência (dose de energia utilizada
4,5 J/cm2) ocorrendo efeito de bioestimulação. Para se obter o efeito bioestimulador é
necessário que se administre doses baixas (dose de energia de 2 a 4 J/cm2) do laser
operando na região do vermelho e infravermelho, sendo que sob doses altas de energia
as células são destruídas (CARNEVALLI, 2001; LUBART et al, 1992; KARU et al,
1995; RIGAU, 1996).
Yu et al. (1997) e Karu, (1999), demonstraram através de estudos que a
irradiação de células cultivadas in vitro com laser de baixa potência, aumenta a síntese
de ATP, certificada através da intensa fluorescência de JC-1.
Deformações na membrana plasmática, como bolhas, têm sido observadas
imediatamente após a TFD com culturas celulares com vários sensibilizadores, e são
considerados como uma manifestação morfológica da membrana danificada relacionada
com alterações no citoesqueleto (JUARRANZ, et al., 2001). Esta protuberância na
membrana plasmática deve-se a um aumento da fluidez da mesma pelo possível
comprometimento dos componentes do citoesqueleto em contato com a superfície
celular, uma vez que os filamentos do citoesqueleto servem de âncora que conectam a
membrana plasmática ao interior da célula (MARTINKOVICS, 2002).
É possível observar 12 horas após TFD, prolongamentos da membrana
plasmática, protuberâncias (figuras 7.4B, 7.9B e 7.9A), que confirmamos com a
microscopia eletrônica em células submetidas a TFD, após 30 minutos; observa-se
cromatina condensada e perda da adesão nuclear, características também descritas por
Zhou et al, (1996). Estas protuberâncias evidentes na superfície das células sugerem
início de formação de corpos apoptóticos, o que é confirmado com o tratamento
observado 24 horas após TFD (figura 7.5), com formação de corpos apoptóticos.
Células que sofrem apoptose apresentam mudanças morfológicas típicas
incluindo deformação do núcleo, condensação da cromatina, formação de protuberância
na membrana plasmática e fragmentação de DNA (ZHOU et al, 1996). Várias destas
mudanças foram constatadas repetidamente neste estudo com ZnPc em diferentes
tempos após a TFD, observadas
em microscopia eletrônica e microscopia de
fluorescência; portanto é consistente a hipótese de que linhagem celular Hep-2
sensibilizadas com a ZnPc após a TFD sofre morte celular por apoptose.
Células em apoptose, danificadas pela fotossensibilização, perdem a aderência
com outras células e com o substrato, indicando que ambas as estruturas do
citoesqueleto a actina e α-actina foram também alteradas pela TFD. Neste sentido a
actina tem sido descrita como participante na formação de corpos apoptóticos
(COTTER et al., 1992.).
Nas figuras 7.4A e 7.8B, representadas por células após o
tratamento fotodinâmico, nota-se uma acentuada retração celular em conseqüência da
perda da adesão celular.
O tempo necessário para iniciação da apoptose é bem variável. A maior parte
das células em resposta a agentes indutores, experimenta um período de latência, cuja
duração é indeterminada a priori, resultando usualmente a morte de mais de 80% da
população celular em intervalo de tempo compreendido entre 1 e 3 dias (KESSEL;
LUO, 1998, 1999).
Godar, 1999 citou em seus trabalhos três termos referentes a apoptose: imediata,
intermediária e tardia, junto, aos diferentes mecanismos cinéticos pré-MCP (morte
celular programada). A apoptose imediata é provocada em menos de meia hora e é um
mecanismo pré- MCP (morte celular programada), isto é, não requer síntese de
proteínas pós-excitadas, por exemplo após TFD (GODAR, 1996).
As radiações UVA e TFD primeiramente mediado pela produção de oxigênio
singleto provocam apoptose imediata pré-MCP, pela despolarização do potencial
transmembrana mitocondrial. Um megaporo se abre no local “S” (sulfidrila sensível)
liberando AIF (fator indutor de apoptose) a menos que a CsA (Ciclosporina A) esteja
presente. A apoptose imediata também pode ser ativada no local “P” (pirimidina
nucleotídeo sensível) por altos níveis de ânions superóxidos (e.g. 1mM vitamina K3),
porém este mecanismo envolve a liberação de citocromo c, porque não é inibido pela
CsA.
Em nosso trabalho constatou-se morte celular em 30 minutos após a TFD, onde
foi possível observar em microscopia de fluorescência a cromatina nuclear
desorganizada (figuras 7.7B, 7.8A). O aspecto morfológico ultraestrutural reforça este
resultado uma vez que observou-se a cromatina condensada na periferia do núcleo, um
afastamento da membrana nuclear em relação ao citoplasma, indicando perda da adesão
desta membrana e início de invaginação da membrana nuclear sugerindo provável
formação futura de corpos apoptóticos (figuras 7.11A/B e 7.12A/B).
É notado, no entanto, que de acordo com GODAR, 1999, o tratamento de células
Hep-2 com ZnPc obedecendo os parâmetros aplicados a TFD resultou em morte celular
por “apoptose imediata”.
Luo et al, (1996) sugerem que fotossensibilizadores que dividem para loci da
membrana e fazem a mediação da fotodestruição da membrana, podem evocar uma
resposta necrótica ao invés de uma resposta apoptótica. Já os sensibilizadores que se
localizam em mitocôndrias como Fotofrin, mais provavelmente induzem à apoptose
durante exposição à luz.
Kessel; Luo (1999) constataram que a perda imediata do potencial de membrana
é interpretado como um reflexo direto da conseqüência do fotodano mitocondrial. Estes
resultados são consistentes com os relatos que implicam a mitocôndria como uma fonte
de fatores os quais iniciam resposta apoptótica. Grebenova, et al. (2003) em estudos
com ALA em linhagem promielocítica de leucemia humana (HL60) observaram
alteração no potencial de membrana paralelo ao aumento dos níveis de ATP, e liberação
do citocromo c, sugerindo ativação da apoptose via mitocôndria. Entretanto concluem
que o tratamento inicia vários processos que levam rápida ativação de apoptose seguida
de uma lenta necrose.
A maioria dos corantes estudados em tratamentos clínicos e pré-clínicos de TFD
é localizado ou tem maior influência sob as mitocôndrias. A mitocôndria tem surgido
como a organela central promotora na maioria das vias apoptóticas. Os sinais dos
receptores da morte na superfície celular ou dos locais danificados, convergem para
mitocôndria, levando a permeabilização de ambas as membranas mitocondriais,
dissipação do potencial elétrico da membrana interna mitocondrial, e liberação de
proteínas associadas a apoptose, tais como citicromo c, fatores indutores de apoptose
(FIA), ativador secundário de caspases derivado da mitocôndria (SMAC), e certas prócaspases do espaço intermembranas (OLEINICK, 2002). Embora estas mudanças nas
mitocôndrias impliquem na maioria dos caminhos apoptóticos sua ordem permanece em
disputa (KROEMER; REED, 2000, REED 2000, COSTANTINI et al., 2000). Estudos
recentes sugerem que a liberação de fatores mitocondriais associados a apoptose e
colapso do potencial transmembrana mitocondrial resultem na formação de canal
conhecido como Complexo de Poro de Transição de Permeabilidade (PTPC), o qual
permite com a passagem de componentes das membranas mitocondriais interna e
externa para citosol (COSTANTINI et al., 2000, GOTTLIEB, 2000).
Rodal et al., 1998 trabalhando com as células NHIK 3025 de carcinoma de
cérvix humano incubadas com ZnPc, relatou uma redução de 60% na atividade
enzimática de UPD galactosil tranferase associada com complexo de Golgi. Enquanto a
atividade mitocondrial analisada através do citocromo c oxidase (marcador de enzima
para a mitocôndria) apresentou uma redução de 40%. O retículo endoplasmático
apresentou uma perda insignificante na atividade enzimática após tratamento com a
ZnPc indicando menor localização deste fotossensibilizador no retículo. Estes
resultados, medidos por microscopia de fluorescência, indicaram que a ZnPc se localiza
principalmente no complexo de Golgi e mitocôndria nas células NHIK 3025 e que estas
organelas são alvos importantes para a TFD. Valduga et al., 1998, sugeriram a
mitocôndria e membrana plasmática como sendo os principais alvos para o tratamento
TFD com a ZnPc em acordo com o trabalho de Rodal et al.,1998.
Em análise
ultraestrutural foi constatado danos na mitocôndria e membrana citoplasmática de
células tumorais in vivo após tratamento com ZnPc e luz (MILANESI et al., 1990).
Kessel; Luo, (1999), estudaram uma série de fotossensibilizadores em células de
leucemia (L1210) e em outras células demonstrando que os fotossensibilizadores que
se ligam à mitocôndria após a TFD induzem morte celular por apoptose, enquanto
aqueles que se ligam à lisossomo ou membrana plasmática resultam em morte por
mecanismos não apoptóticos.
Este fato contribui
como uma evidência em nossos
resultados, os quais também apontam para morte celular por apoptose uma vez que
observou-se potencial de atividade mitocondrial atenuado após a TFD. A emissão de
fluorescência do marcador JC-1 pesquisada em nossos trabalhos, pode ser utilizada para
uma medida sensível do potencial de membrana mitocondrial, esta nos confirmou uma
atividade mitocondrial comprometida tendo uma diminuição do potencial de membrana,
indicada pela baixa fluorescência após a TFD (figura 7.3B).
Estes resultados corroboram também com as conclusões de Rodal et al. (1998),
que relataram a queda de 40% da atividade mitocondrial (citado acima) após tratamento
de células NHIK 3025 de carcinoma de cérvix humano incubadas com ZnPc.
In vivo células em apoptose são reorganizadas e engolfadas pelos fagócitos,
prevenindo assim a resposta inflamatória que é permitida pela necrose, entretanto in
vitro a ruptura da membrana plasmática ocorre na apoptose somente nos estágios tardios
desta (EDWARDS et al., 1999).
9. CONCLUSÃO
_________________________________________________________________________________
Ø As células neoplásicas Hep-2 submetidas a TFD, mostraram-se fotodanificadas
ultraestruturalmente, com alterações no núcleo e membrana nuclear gerando
morte celular.
Ø A Terapia Fotodinâmica utilizando 9µM do fotossensibilizante zinco
ftalocianina (ZnPc), irradiada com luz de comprimento de onda 670 nm e dose
de energia de 4,5 J/cm2, causou danos celulares irreversíveis.
Ø A mitocôndria e o núcleo foram alterados morfologicamente pelo tratamento
com ZnPc e luz.
Ø A Zinco Ftalocianina aplicada a TFD sobre as células Hep-2 induziu a “Morte
Celular por Apoptose Imediata”, visto que se observou a alterações em 30
minutos após o tratamento.
10. BIBLIOGRAFIA
________________________________________________________________
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