Universidade Federal da Bahia
Escola de Medicina Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal nos Trópicos
ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE
BACTÉRIAS CANDIDATAS A PROBIÓTICOS EM ORGANISMOS
AQUÁTICOS
ISABELLE FRANCO
Salvador – Bahia
2009
ii
ISABELLE FRANCO
ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE
BACTÉRIAS CANDIDATAS A PROBIÓTICOS EM ORGANISMOS
AQUÁTICOS
Dissertação apresentada à Escola de
Medicina Veterinária da Universidade
Federal da Bahia, como requisito para
obtenção do título de Mestre em
Ciência Animal nos Trópicos, na área
de Produção e Reprodução Animal.
Orientadora: Profª. Drª. Adriana Regina Bagaldo
Co-orientador: Prof. Dr. Mateus Matiuzzi da Costa
Salvador – Bahia
2009
iii
ISOLAMENTO, IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE
BACTÉRIAS CANDIDATAS A PROBIÓTICOS EM ORGANISMOS
AQUÁTICOS
ISABELLE FRANCO
Dissertação defendida e aprovada para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal
nos Trópicos.
Salvador, 20 de março de 2009.
Comissão Examinadora,
__________________________________________
Profª. Drª. Adriana Regina Bagaldo
Orientadora
__________________________________________
Prof. Dr. Mateus Matiuzzi da Costa
Co-orientador
__________________________________________
Prof. Dr. Ricardo Castelo Branco Albinati
iv
“Só se vê bem com o coração, o essencial é invisível para os olhos”.
Antoine de Saint-Exupéry
v
À minha família, pelo
amor que tenho a
vocês.
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus, por ter me dado saúde e por todas as coisas que aconteceram ao longo da minha
vida.
Aos camarões e peixes que contribuíram com suas vidas para a realização dessa
pesquisa, meus agradecimentos e minhas desculpas.
A minha mãe, por apoiar meus estudos, por ser meu porto seguro, por todo amor que
recebi em todos os momentos.
Aos meus irmãos, sobrinhos e demais familiares, pelo apoio, carinho e incentivo.
Aos meus amigos Rodolfo (Inho), Lu, Eliene, Nara, Márcia, Chirles, pela amizade,
conselhos e paciência.
À professora Eugênia (in memorian), por acreditar na minha capacidade, por ser uma
referência na minha vida, pelo modelo profissional e pessoal, carinho e amizade.
À professora Adriana, pela orientação, confiança e apoio.
Ao professor Albinati, pelas sábias, sempre sábias palavras.
Ao professor Maurício, pelo apoio no momento em que mais precisei ao longo do
Mestrado.
Ao professor Mateus, cuja conduta pessoal e profissional são para mim exemplo de
vida, pelo auxílio, disposição, ensinamentos e amizade.
Ao Eduardo, pela ajuda incondicional no desenvolvimento das minhas análises.
Aos colegas do Mestrado, pelos anos de convívio e batalha.
Aos professores do Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos – UFBA, pelos
ensinamentos.
Aos funcionários do Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos – UFBA, pela amizade,
dúvidas tiradas e pelos serviços prestados, Kátia e Angélica.
As meninas do Laboratório de Bacterioses da UFBA, em especial, Soninha e Eliene,
pelo apoio e disposição na realização deste trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Microbiologia e Imunologia Veterinária da UNIVASF,
pela convivência e companheirismo.
Aos amigos de sempre.
A Universidade Federal da Bahia, Universidade Federal do Vale do São Francisco, a
CAPES pela bolsa concedida e a FAPESB pelo financiamento do Projeto.
vii
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................... ix
LISTA DE TABELAS................................................................................................ xi
LISTA DE FIGURAS................................................................................................
xii
RESUMO.................................................................................................................... xiii
SUMMARY................................................................................................................
xiv
1. INTRODUÇÃO GERAL.......................................................................................
1
2. REVISÃO DE LITERATURA..............................................................................
4
2.1. CARCINICULTURA.......................................................................................... 4
2.2. BACTÉRIAS ENCONTRADAS EM AMBIENTE E ORGANISMOS
6
AQUÁTICOS.............................................................................................................
2.2.1. Bacillus spp....................................................................................................... 6
2.2.2. Plesiomonas spp...............................................................................................
6
2.2.3. Aeromonas spp.................................................................................................
7
2.2.4. Vibrio spp.........................................................................................................
9
3. RESISTÊNCIA A DROGAS ANTIMICROBIANAS UTILIZADAS NA
AQUICULTURA.......................................................................................................
10
4. PROBIÓTICOS......................................................................................................
12
5. ARTIGOS CIENTÍFICOS.....................................................................................
19
viii
Caracterização molecular e susceptibilidade aos antimicrobianos de isolados
bacterianos de camarões (Litopenaeus vannamei) com potencial utilização
probiótica....................................................................................................................
20
RESUMO.................................................................................................................... 20
SUMMARY................................................................................................................ 20
INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 21
MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................ 22
RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................................ 26
REFERÊNCIAS.........................................................................................................
30
Aeromonas spp. from aquatic organisms: biochemical, molecular and
antimicrobial drugs sensitivity characterization………………………………….....
34
SUMMARY................................................................................................................ 34
RESUMO.................................................................................................................... 34
INTRODUCTION......................................................................................................
35
MATERIAL AND METHODS.................................................................................. 36
RESULTS AND DISCUSSION................................................................................. 37
REFERÊNCES...........................................................................................................
41
6. CONSIDERAÇÕES GERAIS................................................................................ 45
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................
46
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
APA – Água Peptonada Alcalina
APT – Água Peptonada Tamponada
DNA – Ácido Desoxirribonucléico
ºC – Graus Celsios
dNTPs – Mistura desoxirribonucleotídeos (A, C, G, T)
GOF – Glicose Oxidativa/Fermentativa
HCl – Ácido Clorídrico
MgCl2 - Cloreto de Magnésio
min - Minuto
ml - Mililitro
mM – Mili molar
µl – Microlitro
µg - Micrograma
ng – Nanograma
pb – Par de bases
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
rRNA 16S – Gene do RNA ribossômico 16S
RFLP – Restriction fragment lenth polymorfism (polimorfismo do comprimento dos
fragmentos de restrição)
seg - Segundo
Taq – Thermus aquaticus
Taq buffer – Tampão de Taq
TCBS - Thiosulphate Citrate Bile Salt Sucrase
TSA - Tryptone Soya Agar
TSI - Triple Sugar Iron Agar
x
KCl – Cloreto de Potássio
UFC – Unidade Formadora de Colônias
u – Unidade enzimática
xi
LISTA DE TABELAS
1.2. Probióticos utilizados na aqüicultura................................................................ 13
1.3. Bactérias identificadas em camarões da espécie Litopenaeus vannamei..........
26
2.3. Restriction fragment length polymorphism of 16S rRNA identification and
virulence genes prevalence among Aeromonas spp. isolates from
aquatic organisms.....................................................................................................
38
xii
LISTA DE FIGURAS
1.3. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos de isolados de Litopenaeus
vannamei..................................................................................................................
27
2.3. Susceptibility to antimicrobial drugs of Aeromonas spp. isolates from aquatic
organisms…………………………………………………………………………...
40
xiii
FRANCO, I. Isolamento, identificação e caracterização molecular de bactérias
candidatas a probióticos em organismos aquáticos. Salvador, Bahia, 52p. Dissertação
(Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) - Escola de Medicina Veterinária,
Universidade Federal da Bahia, 2009.
RESUMO
A carcinicultura marinha é hoje uma das principais atividades agroindustriais no Brasil,
onde se concentra especialmente na região Nordeste. A presença de agentes bacterianos
no ambiente aquático podem desencadear várias enfermidades nos animais, cuja
prevenção está associada ao uso de um limitado número de agentes antimicrobianos. Os
probióticos constituem-se em uma das alternativas de controle dessas doenças. O
objetivo deste trabalho foi o isolamento, identificação e caracterização molecular de
bactérias candidatas a probióticos em organismos aquáticos. A partir do material
avaliado, foram identificadas Aeromonas caviae, A. veronii, Alcaligenes denitrificans,
Bacillus cereus, Enterobacter spp. e Pasteurella spp.. Nenhum antagonismo foi
encontrado entre as bactérias analisadas. O ácido nalidíxico e a norfloxacina foram as
drogas antimicrobianas que apresentaram maior eficácia contra os isolados avaliados.
Foram encontrados genes de virulência de Aeromonas spp. isoladas de organismos
aquáticos, sugerindo o potencial de causar infecções nos peixes e seres humanos. Tendo
em vista, a múltipla resistência e a possível transferência horizontal de genes entre
bactérias de origem aquática, pesquisas devem ser realizadas na busca de terapias
alternativas contra esses microrganismos.
Palavras-chave: bactérias, drogas antimicrobianas, organismos aquáticos, probióticos.
xiv
FRANCO, I. Isolation, identification and characterization molecular of probable
probiotic bacterials in aquatic organisms. Salvador, Bahia, 52p. Dissertation (Master in
Animal Science in the Tropics) - Veterinary Medicine School, Federal University of
Bahia, 2009.
SUMMARY
Shrimp production is actually a main agro-industrial activities in Brazil, where is
concentrated in northeast region specially. Presence of bacterial agents in aquatic
environment can be associated to diseases in aquaculture. The prevention and treatment
of infectious diseases is supported by a few number of antimicrobial drugs. Probiotic
agents are an alternative for control these diseases. The aims of this study were perform
isolation, identification and characterization molecular of probable probiotic bacteria
from aquatic organisms. Were identified Aeromonas caviae, A. veronii, Alcaligenes
denitrificans, Bacillus cereus, Enterobacter spp. e Pasteurella spp. in shrimps. No
antagonistic activity was determinate among bacterial isolates. Nalidixic acid and
norfloxacin were more efficient antimicrobial drugs against bacterial isolates. Virulence
genes were founded in Aeromonas spp. isolated from aquatic organisms, suggesting a
potential to human pathogenesis. Considering the multidrug resistance and the
horizontal gene transference in aquatic bacteria the search for alternatives as probiotic
bacteria may be performed.
Keywords: bacterials, antimicrobial drugs, aquatic organisms, probiotics.
FICHA CATALOGRÁFICA
F 825 Franco, Isabelle.
Isolamento, identificação e caracterização molecular
probióticos em organismos aquáticos / Isabelle Franco. 2009.
52f.
de
bactérias
candidatas
a
Orientadora: Drª. Adriana Regina Bagaldo
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal da Bahia – UFBA.
Salvador.
1. Bactérias. 2. Drogas antimicrobianas. 3. Organismos aquáticos. 4. Probióticos. I. Bagaldo,
Adriana Regina. II. UFBA. III. Título.
CDD 574.232 2
CDU
1
1. INTRODUÇÃO GERAL
A produção mundial de camarão cultivado tem crescido de forma contínua, sendo que
no Brasil, em 2005, alcançou 65.000 toneladas e na Bahia 6.196 toneladas (BAHIA
PESCA, 2006). A produção de crustáceos em 2006 foi equivalente a 9% da produção
aquícola total e a 23% do valor em dólares (FAO, 2009).
As enfermidades infecciosas têm sido uma das preocupações do carcinocultor, uma vez
que as mesmas podem ser responsáveis por perdas significativas de indivíduos na
população e, conseqüentemente, decréscimo sensível na produção de camarões (Bueno
& Gastelú, 1998). Tradicionalmente, o controle de doenças bacterianas nos tanques de
larvicultura tem como princípio o uso de componentes químicos, principalmente as
drogas antimicrobianas. Entretanto, o uso destes fármacos na aqüicultura pode
selecionar bactérias resistentes e desta forma representar um risco para a saúde pública e
para o meio ambiente (Chang & Liu, 2002). Além disso, o tratamento quimioterapêutico
exige grandes quantidades de medicamentos que são onerosos do ponto de vista
econômico (Sealey & Gatlin, 1999).
O equilíbrio ecológico é uma questão importante e existem debates acirrados. No
oceano há uma vasta população de bactérias naturalmente na água e em tanques de
aqüicultura há uma tendência do mesmo processo ocorrer. Quando se utiliza um
antibiótico, a população de bactérias decresce rapidamente, porém em pouco tempo
volta a se estabelecer (Maeda et al., 1997).
A antimicrobianoterapia pode ter como função somente a redução dos impactos da
bactéria na saúde do hospedeiro. As consequências benéficas para o hospedeiro podem,
portanto, ser esperadas somente quando a infecção é a principal causa da morbidade ou
mortalidade da população. Desta forma, as medidas de diagnóstico não podem estar
2
pautadas somente na detecção de patógenos específicos, mas sim no entendimento do
papel destes no desenvolvimento da enfermidade (Smith et al., 2008). Esta afirmação
torna clara a importância da determinação da virulência bacteriana e dos fatores
primários da doença antes da implementação de uma antimicrobianoterapia.
Em qualquer situação o sucesso da terapia antimicrobiana está em função da escolha do
agente apropriado, mas existem poucos fármacos antimicrobianos de escolha para
aquicultura. Entretanto, em muitos países não há somente a falta de profissionais
treinados, mas também a indisponibilidade de agentes antimicrobianos para uso
aqüicultura (Smith et al., 2008). Essa situação tem alertado para a necessidade da
criação de medidas profiláticas e terapêuticas eficazes, ambientalmente corretas e que
não tragam risco à saúde humana. O controle de doenças na aqüicultura exige, cada vez
mais, uma abordagem efetiva e ambientalmente segura. O aumento da resistência
bacteriana aos antibióticos utilizados mundialmente tem estimulado a investigação de
meios alternativos para o controle de patógenos, como por exemplo, o uso de
microrganismos benéficos. As restrições ao uso de antimicrobianos, mediante
imposições legais, paralelo a uma maior conscientização quanto à necessidade de
garantir produtos saudáveis e inócuos ao consumidor final, contextualizam a
importância do desenvolvimento e utilização dos probióticos nesse setor (Sotomayor &
Balcázar, 2003).
Segundo Verschuere et al. (2000), probiótico é um adjunto microbiano vivo que tem
efeito benéfico sobre o hospedeiro, ao modificar a comunidade microbiana do ambiente
ou associada ao hospedeiro, assegurando uso melhorado do alimento ou aumentando
seu valor nutricional, ao acentuar a resposta do hospedeiro a doenças, ou ao aumentar a
qualidade de seu ambiente imediato. Com base nessa definição, probióticos podem
incluir adjuntos microbióticos que impedem patógenos de se proliferarem no trato
3
intestinal, nas estruturas superficiais, e no ambiente da espécie cultivada que asseguram
o uso ótimo da alimentação ao auxiliar na digestão. Além disso, melhoram a qualidade
da água e estimulam o sistema imune do hospedeiro.
O passo inicial para o desenvolvimento de um probiótico efetivo para qualquer sistema
de produção de animais aquáticos é o conhecimento de probiontes que seriam
normalmente encontrados tanto no ambiente aquático quanto no trato intestinal, é
determinado que bactérias probióticas não devem ser patogênicas para seus hospedeiros
(Verschuere et al., 2000). Um dos principais desafios em obter-se bactérias probióticas é
usar métodos de seleção e colonização apropriados. Uma seleção criteriosa por bactérias
probióticas deverá avaliar os métodos de colonização, a capacidade de competição
contra patógenos e crescimento imunoestimulatório eficiente em camarões (Gullian et
al., 2004).
Desta forma, nesse estudo, sabendo-se que o uso indiscriminado de antimicrobianos na
carcinicultura, pode resultar em produtos destinados para o consumo humano com
resíduos de antibióticos e bactérias resistentes que podem comprometer a saúde da
população humana. O objetivo deste trabalho foi o isolamento, identificação e
caracterização molecular de bactérias candidatas a probióticos em organismos
aquáticos, com o intuito de contribuir para o uso de bactérias preventivas, como uma
alternativa de reduzir a utilização de drogas antimicrobianas.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. CARCINICULTURA
A carcinicultura foi introduzida no Brasil na década de 1970, no estado do Rio Grande
do Norte, aproveitando os tanques abandonados das salinas, mas somente após o
desenvolvimento do pacote tecnológico do camarão originário da costa do Pacífico
(Litopenaeus vannamei) entre 1996/1997, ocorreu crescimento intenso, principalmente,
no final da década passada e início desta. Esse crescimento continua vigoroso e ocorreu
em muitos aspectos, nos moldes do que já havia acontecido nos países do sudeste
asiático, sem ordenamento adequado, sem regulamentação, com forte incentivo
governamental e geração de impactos ambientais e sociais graves (IBAMA, 2005).
A carcinicultura brasileira enfrentou uma crise econômica entre 2004-2007, chegando
ao final do último ano mostrando sinais claros de superação de seus principais
problemas, inclusive, apontando para uma retomada do crescimento já a partir de 2008
decorrentes da dificuldade econômica, doenças e política cambial. Evidentemente, que a
perda de competitividade das exportações, decorrente da desvalorização cambial,
associado ao amadorismo e a incipiente estrutura da cadeia de comercialização interna,
juntamente com o descaso governamental na concessão de créditos e do próprio
licenciamento ambiental, constituem sérios desafios que o setor precisa superar para
restabelecer a normalização das condições de operacionalidade e, permitir um
desenvolvimento econômico com a necessária sustentabilidade sócio-ambiental (Rocha,
2008).
A atividade do cultivo de camarão é um dos segmentos da aqüicultura que mais se
destaca no contexto do setor pesqueiro mundial, tanto pela inclusão social, através da
5
viabilização de oportunidades para micro e pequenos empreendedores, como pela
geração de empregos, renda e divisas para as populações desfavorecidas do meio rural
litorâneo dos países em desenvolvimento. Em realidade, a carcinicultura se constitui a
alternativa de maior viabilidade para o estabelecimento do crescimento econômico no
setor primário, onde a qualificação prévia de mão-de-obra não representa um
impedimento para a implantação dos seus empreendimentos, contribuindo de forma
bastante positiva para o desenvolvimento de tecnologias que beneficiam toda a cadeia
produtiva da aqüicultura mundial (Rocha, 2007; Carli, 2002).
A carcinicultura marinha é uma das atividades agroindustriais mais atrativas
economicamente, já que nos últimos quatro anos registra taxa média de expansão
territorial de 20% ao ano. No país, essa atividade está concentrada na região Nordeste,
principalmente Rio Grande do Norte, Bahia, Ceará e Pernambuco, e com pequenas
iniciativas nas regiões Norte, Sul e Sudeste (Morais, 2002). O clima tropical do Brasil, a
sazonalidade e riquezas litorâneas (8.400 km de costa marítima e disponibilidade de
água) proporcionam condições ideais para o cultivo de camarão marinho. O Brasil
consolida-se entre os principais países líderes no que diz respeito, a produção de
camarões no hemisfério ocidental (ABCC, 2005).
O crescimento da carcinicultura mundial, tem suscitado debates acirrados sobre a
sustentabilidade ambiental dessa atividade em longo prazo e as vulnerabilidades dos
ecossistemas brasileiros frente a grande quantidade e dimensão dos investimentos nessa
área. Isso se deve às crises ambientais associadas ao rápido crescimento da
carcinicultura em alguns países como Taiwan, China e Equador que contribuiu para a
degradação dos ecossistemas estuarinos, na proliferação de doenças e conseqüente
queda de produção do sistema (Figuerêdo et al., 2003).
6
2.2. BACTÉRIAS ENCONTRADAS EM AMBIENTE E ORGANISMOS
AQUÁTICOS
2.2.1. Bacillus spp.
O gênero Bacillus é um dos componentes da família Bacillaceae, o qual abrange na
atualidade mais de 60 espécies de bacilos gram-positivos aeróbios ou anaeróbios
facultativos que produzem endosporos. As espécies de Bacillus são ubíquas, habitam o
solo, a água e poeira; também encontradas na microbiota intestinal de humanos e outros
animais, inclusive em animais aquáticos (Koneman et al., 2001). Apesar de não serem
consideradas bactérias autóctones, fato que poderia tornar inviável sua utilização como
probiótico, muitos bacilos apresentam um ciclo de vida duplo, que envolve germinação
de esporos, proliferação e re-esporulação sob condições adversas, o que lhes permite
crescer e sobreviver no meio ambiente e no intestino de animais, sendo este ciclo a base
do seu efeito probiótico (Hong et al., 2005).
2.2.2. Plesiomonas spp.
O gênero Plesiomonas é composto pela espécie P. shigelloides, caracterizada como um
bacilo gram-negativo, pertencente à família Enterobacteriaceae, anaeróbio facultativo
que apresenta motilidade por meio de dois a sete flagelos polares. O principal habitat
desta espécie é o ambiente aquático, incluindo a água doce e do mar, é comumente
encontrada no intestino de peixes (Falcão et al., 2007). A espécie P. shigelloides é
descrita como patógeno emergente de importância crescente em alimentos, como
também em infecções intestinais e extraintestinais (Lehane & Rawlin, 2000).
Segundo Shama et al. (2000), Plesiomonas shigelloides foi a bactéria com maior
percentual de isolamento, presente em 15% (15/100) dos jundiás (Rhamdia quelen),
7
principalmente nos rins e em algumas lesões externas. Em humanos, P. shigelloides
causa a maioria das doenças gastrointestinais, geralmente são relatados surtos pelo
consumo de alimentos do mar e água não tratada (Salerno et al., 2007). No experimento
realizado por Boijink et al. (2001), estes demonstraram que apesar do número elevado
de bactérias em jundiás não ocorreu desenvolvimento de manifestações clínicas e
patológicas refletindo na ausência de virulência.
2.2.3. Aeromonas spp.
A presença de agentes bacterianos no ecossistema aquático, destacam aqueles
pertencentes às famílias Aeromanadaceae e Enterobacteriaceae, cuja presença nesse
ambiente pode ser reconhecida pela detecção na pele, brânquias e intestinos dos peixes e
quando há desequilíbrio no sistema bactéria-hospedeiro-ambiente, podem estar
envolvidos como agentes primários, inclusive desencadeando epizootias em piscicultura
(Lehane & Rawlin, 2000).
Aeromonas spp. são microrganismos comumente encontrados em água do mar e
ambientes estuarinos e vem sendo reconhecidas como patógenos oportunistas de répteis,
peixes e diferentes mamíferos (Carnahan et al., 1991). O complexo Aeromonas reúne
bactérias patogênicas importantes em peixes, que são responsáveis por septicemia e
lesões ulcerativas, associadas a significativas perdas econômicas para a aqüicultura
(Costa & Cyrino, 2006). Membros do gênero Aeromonas pertencem a família
Aeromonadaceae e são bactérias anaeróbicas facultativas, bacilos gram-negativos,
encontrados em diversos ambientes, incluindo solo e água (Nam & Joh, 2007).
Por muitos anos, a taxonomia da Aeromonas spp. foi desconhecida e depois de
significativas revisões, parece razoavelmente esclarecida. As metodologias para
identificação de espécies de Aeromonas spp. abrangem o estudo de complexas rotas
8
metabólicas, que refletem em diversos testes bioquímicos (Abott, 1992), de diferenças
em componentes celulares e nas sequências de nucleotídeos (Figueras et al., 2000). As
técnicas moleculares como, polimorfismo de fragmento de restrição (RFLP), são
vantajosas, rápidas e fáceis, contudo exibem discrepâncias na identificação de algumas
espécies e para sua interpretação exigem pessoal treinado (Borrel et al., 1997). A técnica
de amplificação do DNA por PCR (Reação em Cadeia pela Polimerase) fornece uma
ferramenta altamente sensível e específica para a detecção destes microrganismos
através de seus produtos de secreção (Cascón et al., 1996).
Métodos moleculares são de interesse especial, quando um grupo de bactérias
patogênicas são difíceis de cultivar ou de crescimento muito lento (Harmsen & Karch,
2004; Dostal et al., 2003). Além disso, diagnósticos independentes de cultura são
preferíveis no tratamento com antibiótico que já foi iniciado antes dos testes
microbiológicos (Heijden et al., 1999).
Aeromonas spp. possuem elevada patogenicidade em humanos e alguns vertebrados,
incluindo peixes (Abdulah et al., 2003). Estas foram causadoras de doenças em peixes,
incluindo A. hydrophila, A. veronii biovar sobria, A. allosaccharophila e A.
salmonicida. Destas, A. hydrophila, A. veronii biovar sobria, A. jandaei, A. schubertii, e
A. caviae são os mais comumente encontrados em infecções intestinais humanas
(Jacobs & Chenia, 2007). Nos jundiás, quando a infecção por Aeromonas hydrophila
ocorrem lesões ulcerativas com significativas alterações histológicas e comportamentais
(Boijink & Brandão, 2001).
As espécies Aeromonas secretam muitas proteínas extracelulares, incluindo amilase,
quitinase, elastase, aerolisina, nuclease, gelatinase, lecitinase, lipase e protease. Estas
proteínas são conhecidas como fatores de virulência que causam doenças em peixes e
humanos (Nam & Joh, 2007). A. hydrophila pode causar diarréia através da produção de
9
enterotoxinas citotóxicas. Até agora, duas toxinas hemolíticas foram descritas: a A.
hydrophila hemolisina (hlyA) e aerolisina (aerA). A maioria dos isolados hemolíticos de
Aeromonas spp. descritos produzem uma destas toxinas. Isolados virulentos de A.
hydrophila produzem hemolisinas (Aslani & Hamzeh, 2004). Além do mais, foi
sugerido que variações na distribuição de genes de potencialidade virulenta entre
isolados de Aeromonas spp. podem contribuir para o seu grau de virulência (Abdulah et
al., 2003). Genes que codificam fatores de virulência foram isolados e sequenciados
permitindo a detecção de regiões de assinaturas para estes genes e avaliação de sua
presença em isolados clínicos e ambientais de Aeromonas spp. (Cascón et al., 2000;
Chacón et al., 2003).
2.2.4. Vibrio spp.
Os membros do gênero Vibrio pertencem a família Vibrionaceae, são microrganismos
aquáticos definidos como bastonetes retos ou curvos, móveis, gram-negativos e nãoesporogênicos (Quinn et al., 1994). A maioria fermenta a glicose sem produção de gás e
apresenta reação de oxidase positiva (Silva & Cristina, 1995). Estudos prévios
mostraram que V. parahaemolyticus possui genes importantes de virulência
contribuindo à patogênese bacteriana, tal como tdh, que codifica diretamente hemolisina
termoestável (TDH); trh, codificando hemolisina de TDH-relacionando (TRH); e tlh,
codificando hemolisina termolábil (Xie et al., 2005).
O uso de espécies de Vibrio como probiótico é controverso, uma vez que este gênero
integra inúmeras cepas patógenas para o homem e para os animais (Vandenberghe et al.,
1999). Entretanto, Vibrio alginolyticus, cepa Ili, tem demonstrado boas propriedades
como probiótico pela exclusão competitiva (Gullian et al., 2004), atuando como agentes
de controle biológico por redução de Vibrios patógenos (Sotomayor & Balcázar, 2003).
10
Portanto, deve-se ter muita cautela na seleção de vibrios, sendo essencial uma correta
identificação genotípica das cepas utilizadas, evitando os perigos do uso daquelas
patogênicas (Vandenberghe et al., 1999).
3. RESISTÊNCIA AS DROGAS ANTIMICROBIANAS UTILIZADAS NA
AQUICULTURA
Redução do desempenho de camarões marinhos cultivados são desencadeados por
desequilíbrio entre as condições ambientais dos viveiros, os agentes potencialmente
patogênicos e a saúde geral dos camarões. Doenças causadas por agentes bióticos e
abióticos interferem no estado imunológico dos camarões, podendo favorecer ataques
de patógenos oportunistas, levando à debilidade e morte dos mesmos (Nunes & Martins,
2002). Uma das formas de tentar controlar a proliferação bacteriana e reduzir o risco do
desenvolvimento de enfermidades consiste no uso profilático de drogas antimicrobianas
(Sealey & Gatlin, 1999).
Evidências sugerem que a maioria dos antimicrobianos usados na aqüicultura são
adicionados na ração, de modo generalizado e somente quando do estabelecimento da
enfermidade nos animais. Contudo, existem muitos trabalhos profiláticos na larvicultura
de camarão e moluscos. Entretanto, o uso de antimicrobianos como promotores de
crescimento na aqüicultura é raro (Smith et al., 2008).
As conseqüências potenciais do uso de antibióticos na alimentação de animais levam ao
desenvolvimento de drogas resistentes a bactérias, resistência antibiótica múltipla,
transferência de resistência por bactérias patogênicas e redução da eficácia dos
tratamentos antibióticos de doenças em humanos e animais causadas por patógenos
resistentes (Frappaola & Guest, 1986).
11
As terapias antimicrobianas são aplicadas comumente na produção de peixes e
crustáceos (camarões e larvas) nas doenças que acometem a aqüicultura comercial. Nas
culturas de moluscos o uso de antimicrobianos ocorre nos estágios inicias da fase larval
e em quantidades pequenas. O uso de antimicrobianos em peixes ornamentais não está
regulamentado e pouco se sabe das dosagens e outros aspectos farmacológicos destas
drogas, por isso, é de grande importância o estudo da terapêutica destes compostos
nestes animais, já que há uma proximidade maior com os seres humanos (Smith et al.,
2008).
As conseqüências negativas potenciais da utilização de drogas antimicrobianas na
aqüicultura, tal como a seleção de bactérias resistentes as drogas antimicrobianas nos
humanos e animais, estimulou a busca por bactérias não patogênicas que podem ser
empregadas como probióticos e agentes controladores (Farfanzar, 2006). Uma série de
alternativas ao uso de antibióticos no controle de doenças têm sido propostas e com
sucesso na aqüicultura, sendo os probióticos uma das possíveis alternativas
(Nikoskelainen et al., 2001; Gram et al., 1999). Alguns progressos têm sido
recentemente desenvolvidos nos métodos padrões para determinação da susceptibilidade
in vitro de bactérias associadas com as doenças em animais aquáticos (Smith et al.,
2008). Embora estudos apontam que mais de 90% dos protocolos para testes de
sensibilidade avaliem somente isolados clínicos, em aquicultura seria interessante o
estabelecimento de parâmetros para sensibilidade baseados em estudos epidemiológicos
da região do surto (Smith, 2006; Kronvall et al., 2003).
A prevenção e tratamento de doenças infecciosas em animais aquáticos, no Egito, inclui
um número reduzido de antibióticos e quimioterápicos aprovados pelo governo, além de
poucas vacinas que podem ser utilizadas para acompanhar o manejo ambiental (FAO,
2004).
12
Resistência a antibióticos é particularmente relevante em espécies patogênicas de
Aeromonas spp. nas quais, além da resistência clássica a β-lactâmicos, múltipla
resistência vêm sendo frequentemente identificado (Kampfer et al., 1999; Vila et al.,
2002; Vila et al., 2003). Esta bactéria pode receber e transferir genes de resistência a
antibióticos para outras bactérias gram-negativas (Marchandin et al., 2003).
Múltipla resistência antibiótica (MAR) foi registrada para Aeromonas hydrophila
isoladas nas fazendas de peixes de água doce em associação com uma variedade de
drogas, comumente usadas como aditivo alimentar. O principal problema envolvendo o
uso de antibióticos contra infecções ocasionadas por Aeromonas é o desenvolvimento
da resistência, geralmente relacionados a presença de plasmídeos; sendo um assunto
importante para a saúde pública (Costa & Cyrino, 2006; Akinbowale et al., 2006).
4. PROBIÓTICOS
A utilização de probióticos vem ganhando espaço no sistema de produção brasileiro,
graças a boa produtividade natural, que é complementada com o uso destes
microrganismos na ração. Muitos estudos têm sido conduzidos com o intuito de mostrar
o efeito positivo da utilização de probióticos na produção de camarões. Os relatos
negativos estão associados ao uso de bactérias que não foram isoladas do trato digestivo
do animal em estudo (Vieira, 2006).
“Probiótico” é derivado do Grego que significa “para vida”. Lilly e Stillwell (1965)
introduziram o termo “probióticos” para fatores promotores de crescimento produzidos
por microrganismos. O termo usado por Parker (1974) para “organismos e substâncias”
com efeitos benéficos para animais por influência da microbiota intestinal. O termo
“substâncias” é impreciso e pode incluir até mesmo antibióticos. Portanto, Fuller (1989)
13
definiu probiótico como “um suplemento alimentar microbiano vivo que afeta
beneficamente o animal hospedeiro melhorando seu balanço microbiano intestinal”.
Essa é a melhor definição uma vez que os probióticos são restritos a microrganismos
vivos.
Tabela 1.2. Probióticos utilizados na aqüicultura
Organismos aquáticos
Microrganismos
Autor
Ano
Penaeus monodon
Bacillus S11
Rengipat et al.
1998
Lates niloticus
Pseudomonas fluorescens AH2
Gram et al.
1999
Truta arco-íris
Vibrio fluvialis,
Irianto e Austin
2002
(Oncorhynchus mykiss)
Carnobacterium spp.
Anguilla Anguilla
Enterococcus faecium SF68
Chang e Liu
2002
Turbot larvae
Lactobacillus plantarum
Gatesoupe
1994
Fenneropenaeus indicus
Bacillus spp.
Ziaei-Nejad et al.
2006
Diversas bactérias têm sido utilizadas no cultivo de camarões marinhos em substituição
aos antimicrobianos, com o objetivo de promover a saúde dos cultivos. Essas podem ser
adicionadas diretamente na água, ou por meio de carreadores vivos, como artêmias e
rotíferos. Os principais grupos de bactérias testados no cultivo de camarões,
caranguejos, ostras e peixes têm sido Vibrio spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp. e
Lactobacillus spp. (Gomez-Gil et al., 2000). Entretanto, nem todas essas espécies foram
isoladas do trato intestinal desses animais, e os resultados de desempenho são
contrastantes.
Na aqüicultura, a microbiota intestinal está em constante interação com o ambiente e as
funções dos hospedeiros. Cahill (1990) revisou resultados dessa relação em peixes, e
evidenciou que a bactéria presente no ambiente aquático influencia a composição da
microbiota no trato digestivo de peixes e vice-versa. A microbiota bacteriana intestinal
14
de organismos aquáticos, ao contrário dos organismos terrestres, é constituída
predominante por bactérias gram-negativas (Gomez-Gil et al., 2000) podendo variar de
acordo com o ambiente, escassez de alguns nutrientes ou pelo uso de bactérias
probióticas (Ringo & Gatesoupe, 1998).
Das cepas candidatas ao uso como probióticos, deve-se fazer um teste in vivo para
avaliar a capacidade destas em colonizar o trato intestinal observando se há algum efeito
benéfico da adição destas cepas ao animal no cultivo com relação à infecção por
patógenos (Gullian et al., 2004).
As características in vitro de espécies bacterianas nem sempre refletem a capacidade de
isolados específicos demostrarem um efeito positivo no peixe durante condições
padrões de criação. No caso das larvas marinhas de peixe, observaram mortalidades
elevadas durante a primeira etapa de alimentação raramente são atribuídos a patógenos
específicos. A seleção de bactérias probióticas para os estágios larvais baseados
inteiramente em inibição in vitro de patógenos de peixe seria, portanto, errôneo (Munro
et al., 1994).
Espécies probióticas têm inibido bactérias patogênicas tanto in vitro e in vivo por
diferentes mecanismos. Estes incluem proteção criando um ambiente propício para
patógenos pela produção de componentes inibitórios como as bacteriocinas, sideróforos,
lisozimas, proteases, peróxido de hidrogênio, formação de amônia e diacetil, alteração
nos valores de pH, competição por nutrientes, sítios de adesão e enzimas que resultam
no melhoramento nutricional do cultivo animal. A adição direta de material orgânico
dissolvido mediado pelas bactérias modulam interações com o ambiente e o
desenvolvimento de respostas imunes benéficas (Gómez et al., 2007).
Alguns trabalhos demonstraram pouco tempo de fixação dos microrganismos favoráveis
ao trato digestivo de peixes hospedeiros, sendo este achado comum para aquelas
15
espécies bacterianas não pertencentes à microbiota dominante. Como no caso de
bactérias produtoras de ácido lático, utilizadas comumente em animais terrestres (Garcia
et al., 1997; Gatesoupe, 1994; Gildberg et al., 1995). Excepcionalmente se o hospedeiro
tiver sido exposto a uma quantidade limitada de microrganismos durante o seu
desenvolvimento, é improvável que a adição de probiótico em uma comunidade
microbiana já estabelecida resultasse numa colonização dominante num período longo
(Verschuere et al., 2000).
Bactérias gram-positivas tal como Bacillus spp. oferecem uma alternativa a terapia
antibiótica para a carcinicultura, estas espécies de bactérias são comumente encontradas
em sedimentos marinhos e, portanto, naturalmente são engolidos por camarões que
alimentam-se destes. Além do mais, uma das vantagens destes microrganismos como
probióticos são a menor capacidade de aquisição de genes para resistência aos
antimicrobianos e virulência nos hospedeiros oriundos de Vibrio spp. e outros
patógenos gram-negativos (Moriarty, 1999).
Bacillus subtilis (B. subtilis) tem demonstrado possuir atividades antitumorais e
imunomodulatórias (Cohen et al., 2003). Alguns estudos têm demonstrado que B.
subtilis agem como probióticos promovendo crescimento e viabilidade de bactérias
ácido láticas no trato intestinal de humanos e alguns animais (Hoa et al., 2000).
Em Fenneropenaeus indicus observou-se que as atividades das enzimas digestivas
lipase e amilase foram superiores em camarões alimentados com Bacillus spp. (ZiaeiNejad, 2006). Cepas de bactérias de Bacillus P64 e Vibrio P62 isolados do trato
digestivo de camarões adultos de L. vannamei apresentaram ação exclusão competitiva
contra a bactéria patogênica V. harveyi. Adicionalmente, estas cepas mostraram-se
eficientes na estimulação da enzima fenoloxidase (Gullian et al., 2004).
16
Bactérias láticas são comumente utilizadas em probióticos para animais terrestres, e
alguns trabalhos relatam o seu uso em espécies aquáticas. As bactérias ácido-láticas são
gram-positivas, geralmente imóveis, não produtoras de esporos e produzem ácido lático
como principal ou único produto do metabolismo fermentativo. São bactérias muito
exigentes do ponto de vista nutricional, requerem inúmeros substratos para sua
sobrevivência. Pertencem a este grupo os Lactobacillus spp., Streptococcus spp.,
Carnobacterium spp. e Leuconostoc spp., entre outros, podendo ser encontrados na
microbiota intestinal de peixes saudáveis. Apesar dos testes já realizados, a ação
antagonista e mecanismo de colonização destas bactérias não foram satisfatoriamente
esclarecidos, sendo necessários novos desafios, especialmente in vivo, para um melhor
entendimento (Ringo & Gatesoupe, 1998; Gatesoupe, 1999).
Diferentes gêneros de bactérias láticas (Streptcoccus, Lactococcus, Vagococcus,
Enterococcus, Lactobacillus, Carnobacterium, Aerococcus) se adaptaram a crescer em
diferentes condições ambientais (Farfanzar, 2006). Contudo, as bactérias ácido- láticas
não são dominantes na microbiota inestinal de organismos aquáticos e muitas tentativas
têm sido relatadas no intuito de induzir uma dominância artificial destes
microrganismos nestes animais (Gatesoupe, 1999).
Em experimentos feitos por Gildeberg et al. (1995), alevinos de salmão atlântico (Salmo
salar) suplementados com uma bactéria produtora de ácido lático (Carnobacterium
divergens) foi desafiada com peixes coabitantes infectados com Aeromonas salmonicida
demonstrando que bactérias produtoras de ácido lático administradas como suplemento
no alimento seco podiam colonizar o intestino, mas nenhuma proteção contra infecção
por A. salmonicida pode ser detectada ao contrário do que se esperava.
No Brasil, o probiótico mais comumente utilizado é o EM-4, que apresenta na sua
composição bactérias ácido-láticas, fototróficas e leveduras. Segundo o fabricante, esse
17
probiótico cria um melhor balanço microbiano e pode ajudar a suprimir doenças e ainda
criar um ambiente eficiente pelo decréscimo no uso de antibióticos e químicos. Padilha
et al. (2005) verificaram que os efeitos do EM-4, em viveiros de cultivo de Litopenaeus
vannamei, sobre os parâmetros físico-químicos e índices de produtividade dos viveiros,
bem como a análise da interferência sobre as bactérias mesófilas, láticas, bolores,
leveduras, Vibrio spp. e coliformes termotolerantes não corresponderam ao propósito do
produto especificado no manual. Este também não melhorou os níveis de oxigênio,
amônia, nitrito e nitrato. Além disso, o ganho de peso, conversão alimentar, produção
por hectare e sobrevivência dos camarões não justificou o uso do produto, sendo sua
aplicação não recomendada economicamente.
O uso de Vibrio alginolyticus como um probiótico foi recomendado para aumentar a
sobrevivência e crescimento do camarão (Litopenaeus vannamei). Exclusão competitiva
de bactérias potencialmente patogênicas efetivamente reduz ou elimina a necessidade
para profilaxia antibiótica na larvicultura de sistema intensivo (Garriques & Arevalo,
1995 apud Gómez et al., 2007).
Recentemente, provas de inibição para patógenos do trato digestório (Carnobacterium
piscicola, Vibrio alginolyticus, Vibrio pelagius e Vibrio splendidus) de peixes
(Scophthalmus maximus), na presença de extratos de bactérias ácido láticas, foram
realizadas para avaliar a ação das bacteriocinas, geralmente citadas como responsáveis
pela ação antagonistas dessas bactérias sobre os patógenos. Um grande número de
bactérias foi avaliado: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus brevis, Lactobacillus
casei ssp. casei, Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus helveticus,
Lactobacillus plantarum, Lactococcus lactis ssp. lactis, Leuconostoc mesenteroides ssp.
mesenteroides e Pediococcus acidilactici. O estudo in vitro atribuiu o mecanismo de
ação aos ácidos lático e acético produzidos pelas bactérias, e não às bacteriocinas,
18
conforme esperado, acentuando a importância de novas pesquisas (Vázquez et al.,
2005).
Apesar de algumas cepas de bactérias láticas colonizarem o intestino de peixes, elas não
são dominantes na microbiota intestinal nativa dos mesmos. Embora possa ocorrer
colonização do trato digestivo via alimento artificial combinado com cepas ácido
láticas, o número dessas bactérias tende a diminuir bastante ou desaparecer pouco
tempo depois de cessado o fornecimento do probiótico, por não serem naturalmente
encontradas no trato digestivo destas espécies (Lidbeck & Nord, 1993 citado por Ringo
& Gatesoupe, 1998). Contudo, há relatos bem sucedidos do emprego de diversas
bactérias ácido-láticas na aqüicultura (Joborn et al., 1997; Nikoskelainen et al., 2001),
sendo necessários maiores estudos quanto à relação custo-benefício e viabilidade do seu
uso.
19
5. ARTIGOS CIENTÍFICOS
20
ARTIGO 1
Caracterização molecular e susceptibilidade aos antimicrobianos de isolados
bacterianos de camarões (Litopenaeus vannamei) com potencial utilização
probiótica
Molecular caracterization and susceptibility to antimicrobial drugs of isolated
bacterials from shrimps (Litopenaeus vannamei) with potential probiotic utilization
FRANCO, Isabelle1*, BAGALDO, Adriana Regina2, GIL, Laura3, OLIVEIRA, Eduardo Alves Gamosa de4,
ALBINATI, Ricardo Castelo Branco1, COSTA, Mateus Matiuzzi da5
RESUMO
O objetivo desse trabalho foi isolar bactérias provenientes do trato intestinal de
camarões da espécie Litopenaeus vannamei, avaliando sua caracterização bioquímica e
molecular, atividade de inibição e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos. As
espécies bacterianas identificadas foram Aeromonas caviae (n=7), Alcaligenes
denitrificans (n=1), Bacillus cereus (n=1), Enterobacter spp. (n=3). Com relação aos
demais antimicrobianos perfis de sensibilidade foram observados, sendo 68,7% a
eritromicina, 50% a tetraciclina, 81,2% a sulfametoxazol/trimetoprina, neomicina e
estreptomicina, 12,5% a lincomicina e ampicilina, 87,5% a enrofloxacina e a
nitrofurantoína, 93,7% a ceftriaxona. Os camarões podem ser portadores de bactérias
patogênicas. Bacillus cereus não apresentou atividade de inibição para as bactérias
isoladas de camarões avaliadas. A caracterização molecular é útil para identificação dos
microrganismos estudados. O ácido nalidíxico e a norfloxacina são drogas
antimicrobianas com elevada sensibilidade, para bactérias isoladas de camarões.
Palavras-chave: antimicrobianos, bactérias, carcinicultura, Litopenaeus vannamei.
1*
Universidade Federal da Bahia. E-mail do autor para correspondência: [email protected]
Universidade Federal do Recôncavo Baiano
3
Instituto Aggeu Magalhães
4
EMBRAPA Semi-árido
5
Universidade Federal do Vale do São Francisco
2
SUMMARY
The purpose of present study was to isolate bacteria from gut of shrimps from
Litopenaeus vannamei, by perform biochemical and molecular identification, inhibition
activity and sensitivity pattern determination. The bacterial species isolated were:
Aeromonas caviae (n=7), Alcaligenes denitrificans (n=1), Bacillus cereus (n=1),
Enterobacter spp. (n=3). Regarding the too antimicrobial drugs, profiles of sensibility
were observed, being 68,7% to erythromycin, 50% to tetracycline, 81,2% to
trimethoprim:sulfamethoxazole, neomycin and estreptomycin, 12,5% to lincomycin and
ampicillin, 87,5% to enrofloxacin and nitrofurantoin, 93,7% to ceftriaxone. The shrimps
can carry pathogenic bacterials. Bacillus cereus do not have inhibitory activity to
shrimps bacterials isolates evaluated. The characterization molecular is important to
identification of the microrganisms studied. The nalidixic acid and norfloxacin were
antimicrobial drugs with sensibility high, bacterials isolates of shrimps.
Keywords: Antimicrobial drugs, bacteria, shrimp production, Litopenaeus vannamei.
21
INTRODUÇÃO
A atividade do cultivo de camarão é um dos segmentos da aqüicultura que mais se
destaca no contexto do setor pesqueiro mundial. A carcinicultura constitui uma das
alternativas de maior viabilidade para o crescimento econômico no setor primário, onde
a qualificação de mão-de-obra não representa um impedimento para a implantação dos
empreendimentos, contribuindo de forma positiva para o desenvolvimento de
tecnologias que beneficiam toda a aqüicultura mundial (Rocha, 2007; Carli, 2002).
As enfermidades que acometem os animais têm sido uma importante preocupação dos
carcinocultores, uma vez que podem ser responsáveis por perdas significativas de
indivíduos na população e decréscimo na produção de camarões (Bueno & Gastelú,
1998). Tradicionalmente, o controle de doenças bacterianas nos tanques incubadores
tem como princípio o uso de componentes químicos, principalmente as drogas
antimicrobianas. Entretanto, a utilização destes fármacos na aqüicultura pode selecionar
bactérias resistentes e desta forma representar um risco para a saúde pública e para o
meio ambiente (Chang & Liu, 2002). As restrições ao uso de antimicrobianos, mediante
imposições legais, aliadas a uma maior conscientização quanto à necessidade de garantir
produtos saudáveis e inócuos ao consumidor final, contextualizam a importância de
estudos sobre probióticos (Sotomayor & Balcázar, 2003).
Segundo Verschuere et al. (2000), probióticos são adjuntos microbianos vivos que têm
efeito benéfico sobre um hospedeiro, ao modificar a comunidade microbiana associada
a ele ou ao ambiente. Seu uso na criação animal pode melhorar o valor nutricional do
produto, ao acentuar a resposta do animal a doenças, ou ao aumentar a qualidade de seu
ambiente imediato. Em estudo sobre o uso de probióticos em peixes, Cahill (1990)
evidenciou a relação e dependência direta entre a microbiota intestinal e do meio
22
aquático. A microbiota bacteriana intestinal de organismos aquáticos, ao contrário dos
organismos terrestres, é constituída em sua maioria por bactérias gram-negativas e
gram-positivas (Gomez-Gil et al., 2000), podendo variar de acordo com o ambiente,
com a escassez de alguns nutrientes ou pelo uso de bactérias probióticas (Ringo &
Gatesoupe, 1998).
Diversas bactérias têm sido utilizadas em substituição aos antimicrobianos no cultivo de
camarões marinhos, com o objetivo de promover a saúde dos animais, podendo ser
adicionadas diretamente na água, ou por meio de carreadores vivos, como artêmias e
rotíferos. Os principais grupos de bactérias testados em criações de camarões,
caranguejos, ostras e peixes têm sido Vibrio spp., Pseudomonas spp., Bacillus spp. e
Lactobacillus spp. (Gomez-Gil et al., 2000). Entretanto, nem todas essas espécies foram
isoladas do trato intestinal desses animais, e os resultados de seu desempenho são
contrastantes.
Na literatura, é possível encontrar estudos que identificam alguns microrganismos com
ação probiótica que podem ser utilizados na criação de peixes em cativeiro, entretanto
para a carcinicultura poucas são ainda as pesquisas realizadas (Boijink & Brandão,
2001; Gildeberg et al., 1995). Este trabalho teve como objetivo realizar a caracterização
bioquímica e molecular de bactérias provenientes de camarões, bem como determinar a
atividade de inibição e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos dos isolados
bacterianos candidatos a probióticos.
MATERIAL E MÉTODOS
Local e animais experimentais
23
Para a realização desta pesquisa, foram feitas seis coletas de camarões cinza
(Litopenaeus vannamei), na Fazenda BAHIA PESCA, especializada em aqüicultura,
localizada no município de Santo Amaro/BA.
Coleta da amostras
A partir dos espécimes coletados foram obtidos os conteúdos digestivos por meio da
remoção de todo o trato intestinal dos camarões após a desinfecção dos mesmos com
álcool a 70%, cujo excesso foi removido por evaporação. O material obtido foi então
encaminhado para o isolamento e identificação no Laboratório de Bacterioses (LABAC)
da UFBA.
Isolamento e identificação
Para o isolamento dos microrganismos, foi realizado quatro “pools” do trato intestinal
(com cinco camarões em cada) que foi semeado em diferentes meios de cultura. Foram
utilizados tubos contendo APA (Água Peptonada Alcalina) e APT (Água Peptonada
Tamponada), meios selecionados para o pré-enriquecimento das bactérias ambos
incubados a 25°C por 24 a 48 horas. Em seguida, uma alíquota de cada meio, retirada
com alça de platina, foi semeada pela técnica de esgotamento por estrias, em placas de
Ágar Sangue Ovino 5%, ágar TCBS (Thiosulphate Citrate Bile Salt Sucrase) e ágar
TSA (Tryptone Soya Agar), que foram incubados a 25°C por 24 a 48 horas.
A identificação das bactérias, após seu isolamento, foi realizada por meio de
características morfológicas, bioquímicas (provas de catalase, oxidase, citrato,
mobilidade, uréia, manitol, glicose, sacarose, adonitol, lactose, malonato, vermelho de
metila, indol, inositol, esculina, gelatina, redução de nitrato, lisina, arginina, ornitina e
oxidação/fermentação), e tintoriais conforme descrições de Quinn et al., 1994.
Caracterização molecular dos isolados
24
As bactérias com perfil fenotípico de Aeromonas spp. foram submetidas à técnica de
reação em cadeia da polimerase (PCR) seguida de restrição enzimática, para
caracterização da espécie bacteriana. Esta técnica seguiu descrições de Borrel et al.
(1997) & Ghatak et al. (2007) e foi realizada no Laboratório de Microbiologia no
Campus da Fazenda Experimental da Universidade Federal do Vale do São Francisco
(UNIVASF).
Na
PCR
foram
utilizados
primers
AerRFLP/F
5'AGAGTTTGATCATGGCTCAG3' e AerRFLP/R 5'GGTTACCTTGTTACGACTT3'
específicos para o fragmento de DNA que codifica o rRNA16S do gênero Aeromonas.
Para realização da reação foram utilizados 2µl de DNA molde, primers (0,5 ng de cada),
Taq buffer (10mM Tris, 50mM KCl, 2.5mM MgCl2), 1mM de dNTPs, 0,125 U de Taq
DNA polimerase (Ludwig Biotech) e água ultra pura (Ludwig Biotech) q.s.p 20 µL. As
condições para amplificação seguiram descrições de Borrel et al. (1997) & Ghatak et al.
(2007), com algumas modificações e envolveram a desnaturação a 94°C por 2 min e 25
ciclos de desnaturação a 94°C por 30 seg, anelamento a 46,7°C por 30 seg e um passo
de extensão a 72°C por 2 min. Após a ciclagem, foi realizada uma extensão final a 72°C
por 7 min.
Para os isolados com identificação fenotípica duvidosa, foi realizada uma reação de
PCR utilizando primers universais para amplificação de um fragmento de
aproximadamente 800pb correspondente a uma região que codifica a subunidade 16S do
rRNA de bactérias (Fredricks & Relman, 1998). Os fragmentos amplificados foram
purificados a partir de géis de agarose de acordo com a metodologia descrita por Li &
Ownby (1993) e submetidos ao seqüenciamento automático em equipamento
MegaBace500. A reação de terminação de cadeia foi implementada com o uso do kit
DYEnamic ET. As seqüências obtidas foram analisadas e comparadas com as
seqüências depositadas no GenBank (Benson et al., 2002), pelo programa BLASTn.
25
Para um alto nível de qualidade das seqüências, admitiram-se índices de confiança para
cada nucleotídeo acima de 97% e níveis de identidade de seqüência acima de 93%,
admitindo-se E = 1e-100.
Teste de Inibição
O teste de inibição de microrganismos foi realizado conforme descrições de
(Spanggaard et al., 2001). As bactérias isoladas a partir dos camarões foram inoculadas
em caldo Mueller Hinton e incubadas por 24 horas a 37ºC. Em seguida, com auxílio de
swabs foram semeadas em placas de Petri contendo ágar Mueller Hinton, onde foram
realizadas perfurações, para inoculação de 20µL, utilizando suspensão bacteriana do
potencial probiótico (Bacillus cereus), ajustada de acordo com a escala 0,5 MacFarland
(106 UFC/ml), sendo as placas incubadas por 24 horas a 37ºC. A avaliação da atividade
inibitória foi realizada observando-se a formação de halos de inibição do crescimento
das bactérias avaliadas.
Teste de sensibilidade aos antimicrobianos
O teste de sensibilidade dos isolados aos antimicrobianos foi realizado pelo método de
difusão em disco Kirby-Bauer modificado, a partir de uma turvação microbiana na
escala 0,5 de Mac Farland em caldo Mueller Hinton (Bauer et al., 1966; NCCLS, 2000).
Essa cultura foi transferida com swab estéril para placas de ágar Mueller Hinton, onde
foram aplicados os discos contendo os antimicrobianos: lincomicina (2µg),
enrofloxacina (5µg), ceftriaxona (30µg), nitrofurantoína (300µg), estreptomicina
(10µg), norfloxacina (10µg), neomicina (30µg), ampicilina (10µg), eritromicina (15µg),
ácido nalidíxico (30µg), sulfametoxazol/trimetoprina (25µg), tetraciclina (30µg). As
placas foram incubadas por 24 horas a 37ºC, e em seguida foi realizada a leitura dos
resultados.
26
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados da caracterização bioquímica e morfo-tintorial dos isolados permitiu a
identificação de Aeromonas spp. (n=2), Plesiomonas shigeloides (n=1), Pasteurella spp.
(n=2), Enterobacter aerogenes (n=2), Bacilos gram-negativos (n=2), Aeromonas
salmonicida (n=1), Vibrio alginolyticus (n=1), Vibrio parahaemolyticus (n=1), Bacillus
spp. (n=1), Vibrio spp. (n=1), Alcaligenes denitrificans (n=1). Para identificação da
espécie de alguns desses isolados, e confirmação de sua identidade a caracterização
molecular foi realizada e evidenciou os seguintes microrganismos Aeromonas caviae
(n=7), Alcaligenes denitrificans (n=1), Bacillus cereus (n=1), Enterobacter spp. (n=3)
(Tabela 1.3). Na avaliação do Bacillus cereus como potencial probiótico, não foi
observada atividade de inibição para nenhum desses microrganismos isolados dos
camarões.
Tabela 1.3. Bactérias identificadas em camarões da espécie Litopenaeus vannamei
Isolados
Identificação Bioquímica
C2.5
Aeromonas spp.
C3.5
Plesiomonas shigelloides
C41.5
Pasteurella spp.
C42.5
Aeromonas spp.
C11.6
C13.6
C41.6
C42.6
Enterobacter aerogenes
Enterobacter aerogenes
Bacilos gram Bacilos gram -
C1.6
Aeromonas salmonicida
C2.6
C3.6
Pasteurella spp.
Vibrio alginolyticus
C4.6
Vibrio parahaemolyticus
C1.6
Bacillus spp.
C4CVPE
Vibrio spp.
C3MAC
Alcaligenes denitrificans
PCR RFLP16S rRNA
Aeromonas spp.
A. caviae
NR: Não Realizado; SC: Sem Caracterização.
A. caviae
NR
A. caviae
Sequenciamento
rDNA 16S
NR
NR
NR
NR
NR
NR
Negativo
Negativo
A. caviae
NR
NR
Enterobacter spp.
Enterobacter spp.
NR
A. caviae
A. caviae
Enterobacter spp.
NR
NR
A. caviae
Bacillus cereus
NR
NR
NR
NR
Alcaligenes
denitrificans
27
Todos os 15 isolados de camarões cinza (Litopenaeus vannamei), foram sensíveis a
norfloxacina e ao ácido nalidíxico. Com relação às demais drogas antimicrobianas
testadas, os perfis de susceptibilidade obtidos foram de 68,7% a eritromicina, 50% a
tetraciclina, 87,5% a nitrofurantoína, 81,2% a sulfametoxazol/trimetoprina, neomicina e
estreptomicina, 12,5% a lincomicina e ampicilina (Figura 1.3).
Figura 1.3. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos de isolados de Litopenaeus
vannamei
O complexo Aeromonas agrega bactérias patogênicas importantes em peixes, causando
infecções septicêmicas e perdas econômicas associadas ao cultivo mundial de peixes
(Costa & Cyrino, 2006). Neste trabalho a espécie A. caviae foi encontrada nos isolados
de camarões. As metodologias para identificação de espécies de Aeromonas spp.
abrangem o estudo de complexas rotas metabólicas, que refletem em diversos testes
bioquímicos (Abott, 1992), de diferenças em componentes celulares e nas sequências de
nucleotídeos (Figueras et al., 2000). No presente estudo, o polimorfismo de fragmento
de restrição (RFLP) (Borrel et al., 1997), foi utilizado para identificação de algumas
espécies, bem como a técnica de amplificação do DNA por PCR para a detecção destes
microrganismos através de seus produtos de secreção (Cascón et al., 1996).
28
Aeromonas spp. é um dos principais patógenos na aqüicultura e pode ocasionar
infecções alimentares em seres humanos (Austin & Austin, 1993). Os isolados foram
particulamente sensíveis a todos os antimicrobianos com destaque para o ácido
nalidíxico e a norfloxacina (Figura 1.3), o que corrobora com resultados de Costa et al.
(2008). Em nosso experimento foi observado que os isolados foram menos sensíveis a
lincomicina e ampicilina. A resistência aos antimicrobianos pode ser disseminada por
plasmídeos (Akimbowale et al., 2006), isolados de Aeromonas spp. possuem uma
resistência inerente aos beta-lactâmicos, em particular a ampiclina (Saavedra et al.,
2004).
O desenvolvimento de um probiótico efetivo, para qualquer sistema de produção de
organismos aquáticos requer a identificação de probiontes normalmente encontrados no
ambiente aquático e no trato intestinal, considerando a complexidade de relações entre
hospedeiro e habitat (Verschuere et al., 2000). Nesse trabalho, a partir do intestino dos
animais avaliados, foram encontrados isolados de Bacillus cereus, uma das principais
espécies descritas na aqüicultura. Esses achados corroboram com os de Gomez-Gil et al.
(2000) e apontam para o potencial uso deste microrganismo como probiótico.
Apesar de os bacilos não serem considerados bactérias autóctones, fato que poderia
tornar inviável sua utilização como probiótico, muitos apresentam um ciclo de vida
duplo, que envolve germinação de esporos, proliferação e re-esporulação sob condições
adversas, o que lhes permite crescer e sobreviver no meio ambiente e no intestino de
animais, sendo este ciclo a base do seu efeito probiótico (Hong et al., 2005). Não foram
encontrados relatos que descrevam B. cereus como patogênico para camarões
Litopenaeus vannamei.
Algumas espécies de Bacillus spp. têm mostrado atividade inibitória contra vários
patógenos (Rengipat et al., 1998). Diversos estudos informaram que este microrganismo
29
produz antibióticos polipeptídeos, como a bacitracina, granicidina S, polimixina e
tirotricidina, que são ativos contra bactérias gram-positivas e gram-negativas (Perez et
al., 1993). Ravi et al. (2007), revelaram que Bacillus cereus são eficientes na inibição de
patógenos em larvas de camarões, como Vibrio spp. e Vibrio harveyi ambos in vitro e in
vivo. No presente estudo não foi encontrada nenhuma atividade de inibição do Bacillus
cereus para as bactérias testadas. Contudo, outros estudos devem ser realizados para
confirmar atividade inibitória desta espécie, uma vez que vários fatores podem estar
associados com a inibição de patógenos por probióticos, como a exclusão competitiva
(Gullian et al., 2004).
Nesta pesquisa, observou-se o isolamento de microrganismos do gênero Enterobacter.
Em seu estudo, McDaniel (1979) encontrou essas bactérias em 2% dos animais
avaliados, sendo que não foram encontrados outros relatos de doenças causadas por esse
microrganismo
em
peixes.
Espécies
de
Enterobacter
pertencem
à
família
Enterobacteriaceae, sendo anaeróbios facultativos que apresentam motilidade por meio
de dois a sete flagelos polares. O principal habitat desta espécie é o ambiente aquático,
incluindo a água doce e do mar, é comumente encontrada no intestino de peixes (Falcão
et al., 2007). A maioria das doenças gastrintestinais causadas por representantes desta
família, envolvem surtos pelo consumo de alimentos do mar e água não tratada (Salerno
et al., 2007), indicando seu impacto a saúde pública e fraco potencial probiótico.
Tendo em vista a crescente preocupação de técnicos e da população com a presença dos
resíduos de antimicrobianos nos produtos para consumo humano e animal e com a
seleção de bactérias resistentes (Cabello, 2006), a busca por técnicas alternativas para
controle de doenças é muito importante. Neste sentido, o isolamento e caracterização de
bactérias encontradas normalmente no ambiente aquático é fundamental para a
investigação de potenciais probióticos (Verschuere et al., 2000). Contudo, os
30
microrganismos isolados do ambiente aquático possuem uma caracterização bioquímica
laboriosa e em alguns pontos imprecisa (Harmsen & Karch, 2004). Neste sentido o uso
de técnicas moleculares tem se mostrado eficaz como uma ferramenta de apoio, o que
foi observado no presente estudo onde as técnicas moleculares, em particular o
seqüenciamento do fragmento do gene que codifica para o rRNA 16S permitem a
correta identificação dos microrganismos.
CONCLUSÃO
Os camarões podem ser portadores de bactérias descritas como patogênicas, tais como
Aeromonas caviae, Alcaligenes denitrificans e Enterobacter spp. O isolado de Bacillus
cereus utilizado no presente estudo não apresentou atividade de inibição para as
bactérias isoladas de camarões avaliadas. As técnicas de PCR-RFLP e sequenciamento
do fragmento que codifica para o rRNA 16S são úteis para reduzir problemas na
caracterização fenotípica dos microrganismos estudados. O ácido nalidíxico e a
norfloxacina são drogas antimicrobianas com elevada sensibilidade frente as bactérias
isoladas de camarões.
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34
ARTIGO 2
Aeromonas spp. from aquatic organisms: biochemical, molecular and antimicrobial
drugs sensitivity characterization
Aeromonas spp. em organismos aquáticos: caracterização bioquímica, molecular e
sensibilidade a drogas antimicrobianas
FRANCO, Isabelle 1, BAGALDO, Adriana Regina 2, SANTANA, Sheilla Rios Assis 3, MEURER, Fábio 4, MELLO,
Natoniel Franklin de 5, ALBINATI, Ricardo Castelo Branco 1, COSTA, Mateus Matiuzzi da 3*
SUMMARY
Aeromonas spp. are ubiquitous bacteria found in aquatic environment and organisms,
vegetables and intestine of animals and man. The purpose of the present study was to
characterize Aeromonas spp. isolates. Twenty three (23) Aeromonas spp. isolates were
analyzed by biochemical tests and submitted to molecular characterization by PCR
RFLP from 16S rRNA and amplification of aerolysin, lipase, hidrolipase, DNA gyrase
and elastase virulence genes. The susceptibility to antimicrobial drugs was performed
by disk diffusion method. Thirteen (13) of the twenty three (23) Aeromonas spp.
isolates were classified by PCR RFLP from 16S rRNA analysis as A. veronii and 10 as
A. caviae. No A. hydrophila was isolated from aquatic organisms evaluated. The more
present virulence factors were aerolysin (n=9), lipase (n=8), hydrolipase (n=4), gyrase
veronii (n=5) and elastase (n=3). The susceptibility to antimicrobial drugs patterns
were: ampicillin (0%), tetracycline (72%), norfloxacin (100%), enrofloxacin (96%),
neomycin
(60%),
lincomycin
(4%),
erythromycin
(36%),
trimethoprim:sulfamethoxazole (64%), ceftriaxone (88%), nitrofurantoin (72%),
streptomycin (80%) and nalidixic acid (64%). The virulence genes detected and
antimicrobial drugs resistance is concerning in Aeromonas spp. isolates from aquatic
organisms due the potential to cause human infections, and may carry economic lost to
aquaculture systems.
Keywords: Aeromonas spp., virulence, antimicrobial drugs.
1
Universidade Federal da Bahia
Universidade Federal do Recôncavo Baiano
3*
Universidade Federal do Vale do São Francisco. E-mail: [email protected] .br
4
Universidade Federal Rural do Paraná
5
Pesquisador EMBRAPA Semi-árido
2
RESUMO
Aeromonas spp. são bactérias ubíquas encontradas em ambientes e organismos
aquáticos, vegetais e trato intestinal de animais e seres humanos. O objetivo do presente
estudo foi caracterizar isolados de Aeromonas spp. Vinte e três (23) isolados de
Aeromonas spp. foram analisados pelos testes bioquímicos e submetidos a
caracterização molecular por PCR RFLP rRNA 16S e amplificação dos fatores de
virulência aerolisina, lipase, hidrolipase, DNA girase e elastase. A susceptibilidade das
drogas antimicrobianas foram observadas pelo método de difusão em discos. Treze (13)
dos vinte e três (23) isolados de Aeromonas spp. foram classificados por PCR RFLP
rRNA 16S identificados como 13 A. veronii e 10 como A. caviae. Não foram isoladas A.
hydrophila nos organismos aquáticos avaliados. Os fatores de virulência mais presentes
nos isolados foram aerolisina (n=9), lipase (n=8), hidrolipase (n=4), girase veronii (n=5)
35
e elastase (n=3). Os padrões de susceptibilidade para as drogas antimicrobianas foram:
ampicilina (0%), tetraciclina (72%), norfloxacina (100%), enrofloxacina (96%),
neomicina (60%), lincomicina (4%), eritromicina (36%), sulfametoxazol: trimetoprina
(64%), ceftriaxona (88%), nitrofurantoína (72%), streptomicina (80%) e ácido
nalidixíco (64%). Aeromonas spp. isoladas dos organismos aquáticos analisados
mostram genes virulentos e resistência múltipla a medicamentos, sugerindo potencial
para causar infecções de difícil tratamento em humanos, podendo ocasionar perdas
significativas na aquicultura.
Palavras-chave: Aeromonas spp., virulência, drogas antimicrobianas.
INTRODUCTION
Aeromonas spp. are ubiquitous bacteria found in aquatic environment, fish, vegetables
and intestine of animals and man (Aslani & Hamzeh, 2004), where are associated to
several diseases specially in cultured and feral fishes and in man (Cipriano, 2001). The
fish disease outbreaks are associated with stressors agents commonly found in intensive
management (Eissa et al., 1994). Many fish species as tilapia (Oreochromis niloticus),
carp (Cyprinus carpio) and catfish (Ictalurus punctatus) (Cipriano, 2001; Monete et al.,
2006) may be infected by Aeromonas. In Brazil, the pathogenicity of this
microrganisms was demonstrated in jundias (Rhamdia quelen) (Boijink & Brandão,
2001).
Many putative virulence factors are described in Aeromonas spp., including haemolytic
toxins (aerA and hlyA), lipases and proteases (Guerra et al., 2007). Aerolysin is one of
most representative virulence factor used to determine the pathogenicity of isolates from
human and fish (Nam & Joh, 2007). Recently, PCR technologies have been developed
to identify virulence factors and determine Aeromonas spp. virulence (Chacón et al.,
2003; Sen & Rodgers, 2004; Nam & Joh, 2007).
The pathogenicity of Aeromonas spp. to man and fish, associated to antimicrobial drug
resistance is emerging (Akinbowale et al., 2006). Besides the well determined resistance
to β-lactamic, multiple-resistance was detected and proved to be received and
36
transferred among gram negative bacteria, as well as Aeromonas spp. (Marchandin et
al., 2003; Guerra et al., 2007; Jacobs & Chenia, 2007). The multiple resistance have
been registered in farms using feed additives (Vivekenandhan et al., 2002; Belém-Costa
& Cyrino, 2006). In aquaculture, the resistant bacteria transfer may occur through
consumption of contaminated fish and shellfish, being a potential risk to public health
(Cabello, 2006).
Difficulties in biochemistry, genetic and serologic identification of these bacteria are
reported (Cipriano, 2001). Enzyme restrictions of fragments 16S rRNA gene are very
useful to Aeromonas spp. identification (Borrel et al., 1997; Ghatak et al.; 2007)
Considering, that many Aeromonas spp. are isolated from sick and healthy fish and that
some of them are considered virulent, the correct species identification is important for
implement diagnostic and control strategies. This study realized biochemical and
molecular characterization of Aeromonas spp. isolates and determined the antimicrobial
drugs sensitivity.
MATERIAL AND METHODS
Bacteria isolates and biochemical characterization
Twenty three Aeromonas spp. isolates from fish kidney extracts, external lesions, and a
pool of shrimps were cultured on TSA agar. The biochemical characterization was
performed according to Quinn et al. (1994) using the GOF (Glucose Oxidation and
Fermentation), TSI (Triple Sugar Iron Agar), indol production, motility, nitrate
reduction, esculin hydrolysis, gelatin, gas from glucose and ornitine desamination.
Molecular characterization
37
The specie identification of Aeromonas spp. isolates were performed by PCR
amplification and RFLP analisys of 16S rRNA gene, using primers previously described
by Borrel et al. (1997); Ghatak et al. (2007). The PCR reactions were performed in
20µL reactions containing 2 ml of DNA template, primers (0,5 ng each), Taq buffer
(10mM Tris, 50mM KCl, 2.5mM MgCl2), 1mM dNTPs, 0,125 U of Taq DNA
polymerase (Cenbiot-Enzymes, UFRGS, Brazil). Amplification was performed in a first
desnaturing step at 95°C for 2 minutes then 30 cycles of 95°C for 30 seconds, 46.7°C
for 35 seconds and 72°C for 40 seconds and a final extension step at 72°C for 5
minutes. Thirty two isolates were tested and amplicons identities were confirmed by
DNA sequencing (Amersham Pharmacia Biotech). Restriction polymorphism analyses
were performed by enzymatic digestion of all positive amplicons using MboI, PvuII and
BstOI individually. All reactions were performed at 37°C overnight. The results were
confirmed with a 1,3% agarose gel electrophoresis. The presence of virulence genes
(aerolysin, lipase, hydrolipase, DNA gyrase, elastase) were also confirmed by
amplification in a multiplex PCR according to Chacón et al. (2003) and Sen (2005).
Susceptibility test
The Kirby-Bauer disc diffusion test (Bauer et al., 1966; NCCLS, 2000) was used to
determine the sensitivity of Aeromonas spp. isolates to antimicrobial drugs commonly
used in aquaculture like ampicillin (10 μg), tetracycline (30 μg), norfloxacin (10 μg),
enrofloxacin (5 μg), neomycin (30 μg), lincomycin (2 μg), erythromycin (15 μg),
trimethoprim:sulfamethoxazole (25 μg), ceftriaxone (30 μg), nitrofurantoin (300 μg),
streptomycin (10 μg) and nalidixic acid (30 μg).
RESULTS AND DISCUSSION
38
The taxonomy of Aeromonas genus isolates is complex (Laganowska & Kaznowski,
2004) and some discrepancies are observed between genetic and phenotypic
characterization of Aeromonas species (Kozinska et al., 2002). The restriction fragment
length polymorphism of 16S rRNA is used as standard to Aeromonas specific
identification (Ghatak et al., 2007; Guerra et al.; 2007). In our study, the biochemical
tests performed permitted isolates identification of the genus Aeromonas, however PCR
RFLP 16S rRNA analysis clearly determined the Aeromonas species, being 13 A.
veronii and 10 A. caviae (Table 2.3). No A. hydrophila was isolated from fish and
shrimps evaluated. According to Kozinska et al. (2002) the biochemical classification is
more useful to Aeromonas species with medical interest that to species with
ictiopathologic interest ones.
Table 2.3. Restriction fragment length polymorphism of 16S rRNA identification and virulence
genes prevalence among Aeromonas spp. isolates from aquatic organisms
Isolate
PCR/RFLP 16S rRNA
PCR amplificationa
Classification
aer
lip hydrolip gyrver elas
PX37
A. veronii
+
+
PX47
A. veronii
+
+
+
C1
A.caviae
+
+
+
+
C3
A.caviae
+
+
C4
A. caviae
+
PX8
A. caviae
+
+
PX15
A.veronii
+
+
PX19
A. caviae
PX21
A.caviae
+
PX25
A. caviae
+
PX34
A. veronii
+
PX22
A.caviae
+
PX84
A. veronii
PX38
A.veronii
+
+
+
PX04
A.caviae
+
165
A.veronii
+
PX78
A. veronii
+
30/07-7
A. veronii
+
+
PX81
A. veronii
PX83
A. veronii
C42.5
A.veroni
Px36
A. caviae
494
A.veroni
+
Total
23
9
8
4
5
3
a: PCR amplification of virulence genes, where aer: aerolisin, lip: lipase, hydrolip: hydrolipase,
gyrver: DNA gyrase and elas: elastase
39
A. veronii and A. caviae are considered pathogenic to fish and were responsible for
septicemias and furunculosis (Cipriano, 2001; Kozinska et al., 2002; Nam & Joh, 2007).
In Brazil, Guerra et al. (2007) found A. veronii and A. caviae in diarrheic human
patients. In Libia, A. caviae and A. veronii were cultured from sick children and chicken
carcass samples (Abdulah et al., 2003). Contaminated food is proved to be a major
source for human infection (Hanninen & Siitonen, 1995). A. hydrophilla, A. caviae and
A. veronii are considered significant pathogens to human (Guerra et al., 2007). The
occurrence of the A. veronii and A. caviae in our study stress the necessity of a correct
cooking prepare of fish, once minor lesions do not impair the fish commercialization.
Many virulence factors were found in Aeromonas spp.. The presence of these genes is
considered as an important indicative of pathogenicity to fish and human clinical
isolates (Chacón et al., 2003; Aslani & Hamzeh, 2004). The main virulence factors
found in our isolates were aerolysin (n=9), lipase (n=8), hydrolipase (n=4), gyrase
veronii (n=5) and elastase (n=3). In agree, aerolysin is the most frequent virulence gene
found in other studies Abdullah et al., 2003; Sen & Rodgers, 2004; Guerra et al., 2007.
The combination of aerolysin and hemolysin contributes to the virulence of Aeromonas
increasing the cytotoxicity (Aslani & Hanzeh, 2004). Mutations in lipase gene were
associated to lack of virulence in Aeromonas spp. (Merino et al., 1999). Virulence
factors genes alone or in association were found in 17 (77.28%) of Aeromonas spp.
isolates, indicating the pathogenic potential to aquatic organisms and human.
The susceptibility patterns to antimicrobial drugs of Aeromonas spp. isolates may be
observed in Fig. 2.3. As expected to Aeromonas genus, all isolates were resistant to
ampicillin (Cabello, 2006). According to Akinbowale et al. (2006) the resistance of
Aeromonas spp. to ampicillin and amoxicillin is not surprising because beta-lactamases
production are common in aquaculture isolates.
40
The major susceptibility was observed to norfloxacin (100%) and enrofloxacin (96%).
The quinolones, specially, oxonilic acid are used in furunculosis treatment, however,
resistance may be observed and is associated tho mutations in DNA gyrase genes
(Giraud et al., 2004). Conversely the sensitivity to nalidixic acid were low (64%), in
agreement to previous studies Akinbowale et al. (2006). In Brazil, Costa et al. (2008)
found the same sensibility pattern to nalidixic acid. Ceftriaxone and streptomycin
showed high activity among Aeromonas spp. tested isolates (Fig. 2.3). The same results
were described by Guerra et al. (2007) evaluating human clinical and environmental
isolates.
Figure 2.3. Susceptibility to antimicrobial drugs of Aeromonas spp. isolates from aquatic
organims. Where linc: lincomycin, enro: enrofloxacin, ceftr: ceftriaxone, nitro: nitrofurantoin,
strept: streptomycin, nor: norfloxacin, neo: neomycin, amp: ampicillin, ery: erythromycin, nal
ac: nalidixic acid, tri:sulf: trimethoprim:sulfamethoxazole and tet: tetracycline
Oxitetracycline is considered the best alternative to treatment of septicemia due
Aeromonas spp. in fish (Cipriano, 2001). In our study the susceptibility were detected in
72% of the tested isolates. The resistance to tetracycline is described in literature and
may be associated to several plasmidial genes may be carried to provide protection to
other tetracyclines produced by aquatic microbiota (Akinbowale et al., 2006; Jacobs &
41
Chenia, 2007). The same prevalence of tetracycline susceptibility were described in a
previous work involving Aeromonas fish isolates (Belém-Costa & Cyrino, 2006; Costa
et al., 2008).
The tested isolates were less sensible to erythromycin (36%), neomycin (60%),
trimethoprim: sulfamethoxazole (64%) and lincomycin (4%). Resistance to all these
drugs is reported in bacterial isolates from aquatic organisms (Schmidt et al., 2000;
Akinbowale et al., 2006; Costa et al., 2008). Major susceptibility patterns were previous
described in Brazil (Belém-Costa & Cyrino, 2006; Costa et al., 2008) and are described
by Akinbowale et al. (2006) evaluating Australian aquaculture isolates.
The multiple resistances to antimicrobial drugs are an increasing problem in aquaculture
systems, and it is associated to resistance genes transference in environment (Kruse &
Sorum, 1994; Kummerer, 2004). The resistance from aquatic isolates could easily be
transmited to human by inadequately prepared fish products (Cabello, 2006; Jacobs &
Chenia, 2007). Aeromonas spp. isolates from aquatic organisms analyzed showed
virulence genes and resistance to multiple drugs, suggesting the potential to cause
human infections with difficult treatment.
ACKNOWLEDGMENTS
The authors thank 3rd Regional Agency of CODEVASF of the bebedouro station,
Petrolina, PE;
BAHIA PESCA located in the town of Santo Amaro/BA. The
experiments were performed with CAPES and FAPESB.
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45
6. CONSIDERAÇÕES GERAIS
Aeromonas caviae, A. veronii, Alcaligenes denitrificans, Bacillus cereus, Enterobacter
spp. ocorrem em camarões cinza (Litopenaeus vannamei).
Nas condições desse experimento, os resultados sugerem que o Bacillus cereus é um
potencial probiótico. Entretanto, pesquisas devem ser direcionadas para determinar a
atividade inibitória.
Quanto à identificação das bactérias pelos métodos bioquímico e molecular, pôde-se
verificar que o método de seqüenciamento e análise filogenética de fragmentos do gene
de 16S rRNA foram importantes, devido as dificuldades encontradas na identificação
bioquímica.
O ácido nalidíxico e a norfloxacina foram as drogas antimicrobianas que apresentaram
maior eficácia contra os isolados testados.
Foram encontrados genes de virulência de Aeromonas spp. isoladas de organismos
aquáticos, sugerindo o potencial de causar infecções nos peixes e seres humanos.
Tendo em vista, a múltipla resistência e a transferência de genes de resistência nos
isolados analisados, deve-se ter muita cautela ao administrar de medidas preventivas no
que diz respeito ao uso de antimicrobianos, por isso, sugere-se à aplicação de medidas
alternativas como probióticos.
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