UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA
JOÃO FRANCISCO DOS ANJOS JUNIOR
ESTUDO FITOQUÍMICO E ATIVIDADE BIOLÓGICA
DE Piper permucronatum Yuncker (Piperaceae).
Porto Velho – 2007
JOÃO FRANCISCO DOS ANJOS JUNIOR
ESTUDO FITOQUÍMICO E ATIVIDADE BIOLÓGICA
DE Piper permucronatum Yuncker, (Piperaceae).
Dissertação apresentada como parte dos
requisitos para obtenção do título de
Mestre em Biologia Experimental, área de
concentração: Parasitologia com ênfase
na
relação
patógeno/hospedeiro
do
Programa de Pós-Graduação em Biologia
Experimental.
Orientador: Prof. Dr. Valdir Alves Facundo
Porto Velho – 2007
JOÃO FRANCISCO DOS ANJOS JUNIOR
ESTUDO FITOQUÍMICO E ATIVIDADE BIOLÓGICA DE Piper
permucronatum Yuncker, (Piperaceae).
Aprovada em:
BANCA EXAMINADORA:
_________________________________________
Prof. Dr. Valdir Alves Facundo - Orientador
Universidade Federal de Rondônia - UNIR
_________________________________________
Profa. Dra. Izaltina Silva Jardim
Instituto de Pesquisa de Patologias Tropicais - IPEPATRO
_________________________________________
Prof. Dra. Mariza Gomes Reis
Universidade Federal de Rondônia - UNIR
Dedico esta dissertação aos meus
pais Dorasonia A. dos Anjos e
João Francisco dos Anjos, aos
irmãos Jean Carlos A. dos Anjos e
Sônia Karina A. dos Anjos e ao
mais novo membro da família
Maria Clara dos Anjos.
AGRADECIMENTOS
Meus sinceros agradecimentos...
...a Deus, pois, sem sua ajuda, nada teria sido possível;
...à minha família, pela confiança e pelo apoio;
...à minha Namorada Ivana Paula Veríssimo Alpirez pela companhia,
amizade e pelo seu amor.
...ao Prof. Dr. Valdir Alves Facundo, pela orientação, por sua força,
conhecimento e disposição diante das minhas limitações.
...à Dra Selene Maia de Morais, da Universidade Estadual do Ceará
(UECE) pela obtenção dos espectros e disponibilização de seu laboratório para
os ensaios com as Artêmias e antioxidante sem qualquer ônus.
...à Dra. Izaltina Silva Jardim do Instituto de Pesquisa em Patologias
Tropicais (IPEPATRO) e à mestranda e amiga Carolina Bione Garcia Teles
pela realização dos experimentos com as Leishmanias sem qualquer ônus.
...à Dra. Telma Lemos da Universidade Federal do Ceará (UFC) pela
oportunidade de realização dos ensaios antioxidantes dos isolados sem
qualquer ônus.
...ao Dr. Raimundo Braz Filho, da Universidade Estadual do Norte
Fluminense pela obtenção dos espectros.
...à família Santiago pela estadia, companhia, pela cerveja, pelo
camarão frito e, principalmente pela amizade conquistada durante o mês no
qual foram realizados os experimentos em fortaleza-CE sem qualquer ônus.
...aos amigos do mestrado, pelas conversas e pela amizade.
...aos amigos do Laboratório de Pesquisa em Química dos Produtos
Naturais.
...à Edneia Chagas Muniz, secretária do mestrado em biologia
experimental pela paciência e dedicação em atender os alunos do Mestrado.
... ao FINEP-PROINFRA (processo No 01.05.056700).
... à CAPES pelo fornecimento da Bolsa de Mestrado.
“O mundo, com suas múltiplas enfermidades
tão fáceis de contrair, é um vasto hospital, e a
natureza, com a sua infinidade de plantas, é
uma farmácia em que todo o homem pode
encontrar um bálsamo para qualquer espécie
de dor.”
Alfons Balbach
RESUMO
Continuando os estudos sobre a fitoquímica e a atividade biológica de Plantas
Medicinais da Amazônia brasileira foi investigada, neste trabalho, a espécie
Piper permucronatum conhecida popularmente como elixir paregórico. Os
extratos hexânicos das folhas e dos frutos foram submetidos ao fracionamento
de seus constituintes químicos por cromatografia em coluna de sílica gel.
Dessa forma foi possível isolar quimicamente três metabólitos secundários.
Através da espectroscopia de massas, RMN
13
C, 1H uno e bidimensionais foi
possível caracterizar o monoterpeno acetilado 8-carvotacetona acetato e as
neolignanas tetrahidrofurânicas galbelgina e veraguensina. O óleo essencial
extraído em diferentes ocasiões após análise quantitativa e qualitativa por CGEM apresentou variação de seus componentes químicos sendo que ambos
apresentaram como majoritários arilpropanóides. O teste larvicida contra Aedes
aegypti realizado com o óleo essencial coletado em janeiro de 2005 apresentou
alta atividade larvicida com IC50 de 36 g/mL. Os extratos hexânicos das folhas
e dos frutos obtiveram pronunciada atividade sobre Artemia salina com IC50 de
17,8 e 9,1
crescimento
g/mL, respectivamente. Sua posterior avaliação de inibição de
das
formas
promastigotas
de
Leishmania
amazonensis
demonstrou que ambos os extratos foram ativos apresentando o IC 50 para o
extrato dos frutos de 22,5 g/mL, enquanto para o extrato das folhas o IC50 foi
de 50 g/ mL. Ambos os extratos não apresentaram toxicidade em macrófagos
retirados intraperitonealmente de camundongos BALB/c nas concentrações de
50 e 25 g/mL. Galbelgina e o 8-hidroxicarvotacetona acetato foram também
avaliados quanto a atividade inibitória de L. amazonensis sendo que apenas
galbelgina mostrou-se ativo com IC50 de 8,6
g/mL. Veraguensina e 8-
carvotacetona acetato obtiveram certo grau de atividade de seqüestro do
radical livre DPPH-.
Palavras-chave: Piper permucronatum, atividade biológica, óleo essencial.
ABSTRACT
In the course to study the phytochemistry and biological activity of the Medicinal
plants from Brazilian Amazon, Piper permucronatum known popularly as elixir
paregórico was submitted to the frationament of its leaves and fruits hexanic
extracts which it was possible isolate and characterize three secondary
metabolites, namely: the acetilated monoterpene 8-cavotacetone acetate; and
the galbelgin and veraguensin tetrahydrofuranic neolignans. The essential oil
extracted in different occasions presented quantitative and qualitative variation
of its components being that both had presented as major component
arilpropanoids. The larvicidal test against Aedes aegypti carried through with
one of these essential oils presented high larvicidal activity with IC50 36 g/mL.
The leaves and fruits extract shown strong activity in Artemia salina with IC50 of
17.8 and 9
g/mL, respectively. Its posterior evaluation of the Leishmania
amazonensis promastigotic forms inhibition growth activity reproduced the
results gotten with the A. salina one being that the IC50 for the fruits extract was
22,5
g mL, while the IC50 for the leaves extract
was 50
g/mL. Both the
extracts had not presented toxicity in BALB/c mice macrophages in the 25 and
50
g/mL concentrations. Galbelgin and 8-hidroxicarvotacetone acetate also
had been evaluated for the inhibitory growth activity of the L. amazonensis.
Only galbelgina revealed active with IC50 of 8,6
g/mL. Veraguensin and 8-
hydroxicarvotacetone acetate had gotten certain degree of DPPH- free radical
scavenging activity.
Key-words: Piper permucronatum, biological activity, essential oil
LISTA DE FIGURAS________________________________________________
Figura
Página
1.
Estágios de desenvolvimento de Artemia salina. a) Nauplii b)Adulto.
24
2.
Implicações patológicas das ERO’s.
26
3.
Estrutura química da quinina [1], artemisinina [2], quercetina [3] e
28
ácido diidroguaiarético [4].
4.
Ciclo de vida de Leishmania sp.
31
5.
Formas a) Promastigotas e b) Amastigotas de L. amazonensis.
31
6.
Núcleos básicos das lignanas e neolignanas identificados no gênero
Piper.
40
7.
Estruturas do -pineno [5], germacreno D [6],
8.
Porcentagem dos compostos voláteis identificados no gênero Piper.
9.
Estruturas da Piperovatina [8] e do metil 4-hidroxi-3-(3’-metil-2’-
-copaeno [7].
butenil) benzoato [9].
41
41
42
10. Estruturas da Piperkadsina A [10],
Piperkadsina B [11] e do
futoquinol [12].
43
11. Piper permucronatum, Yuncker (PIPERACEAE).
47
12. Cromatograma do óleo essencial extraído em 02/10/2006.
63
13. Cromatograma do óleo essencial extraído em 13/01/2005.
63
14. Espectro de massas do safrol [13].
64
15. Espectro de massas da asaricina [14].
64
16. Espectro de massas da miristicina [15].
65
17. Espectro de massas da elemicina [16].
65
18. Espectro de massas do dilapiol [17].
66
19. Estruturas dos constituintes químicos identificados nos óleos
essenciais das folhas de P. permucronatum.
1
20. Espectro de RMN H (CDCl3, 400MHz) do óleo essencial.
21. Espectro de RMN
13
22. Espectro de RMN
essencial.
C (CDCl3, 100 MHz) do óleo essencial.
66
68
69
13
C – DEPT-135 (CDCl3, 100 MHz) do óleo
70
23. Estrutura da Galbelgina [18], semelhante à proposta estrutural
atribuída para PPHFr-1.
74
24. Proposta de fragmentação responsável pelo pico base m/z 206 do
espectro de massas de PPHFr-1.
75
25. Espectro de massas de PPHFr-1 exibindo o pico base de m/z 206.
75
26. Espectro de RMN`1H de PPHFr-1.
77
27. Espectro de RMN 13C – DEPT 135.
78
28. Espectro de HMQC de PPHFr-1.
79
29. Espectro HMBC de PPHFr-1.
80
30. Espectro NOESY de PPHFr-1.
81
31. Estrutura da Veraguensina [20], semelhante à proposta estrutural
atribuída para PPFr- 2.
83
32. Espectro d e RMN 1H (CDCl3 , 100 MHz) de PPHFr-2.
85
33. Espectro de RMN 13C (CDCl3 , 100 MHz) de PPFr-2.
86
34. Espectro HMQC (CDCl3 , 100 MHz) de PPHFr-2.
87
35. Espectro HMBC (CDCl3 , 100 MHz) de PPHFr-2.
88
36. Espectro DEPT 13C (CDCl3 , 100 MHz) de PPHFr-2.
91
37. Estrutura proposta para PPFH – 7.
91
38. Espectro de RMN 1H (CDCl3 , 100 MHz) de PPFH-7.
92
39. Espectro de Infravermelho de PPHF-7.
93
40. Espectro de HMBC de PPFH-7.
94
41. Espectro de RMN 13C -APT (CDCl3 , 100 MHz) de PPFH-7.
95
42. Regressão Linear dos resultados do teste larvicida em Aedes
97
aegypti do Óleo essencial extraído em jan. de 2005 de P.
permucronatum.
43. Regressão linear dos resultados do teste de toxicidade em Artemia
salina Extrato Hexânico dos Frutos (EHFr) de P. permucronatum.
101
44. Regressão linear dos resultados do teste de toxicidade em Artemia
salina Extrato Éter de Petróleo das Folhas (EEF) de P.
permucronatum.
102
45. Inibição de crescimento de Leishmania amazonensis em diferentes
concentrações
permucronatum.
do
extrato
hexânico
dos
frutos
de
Piper
103
46. Inibição de
crescimento de
L.
amazonensis
em
diferentes
concentrações do extrato etéreo das folhas de P. permucronatum.
47. Inibição de
crescimento de
L.
amazonensis
em
104
diferentes
concentrações de PPHFr-1.
48. Porcentagem
de
Inibição
104
de
crescimento
de
Leishmania
amazonensis pelos extratos dos frutos e das folhas de P.
permucronatum e de seu isolado PPHFr-1 em função da
concentração.
105
49. Teste de citotoxicidade em macrófagos peritoneais de camundongos
BALB/c.
106
50. Regressão linear dos resultados do teste Inibição de crescimento de
Leishmania amazonensis pelo Extrato Hexânico das Folhas (EEF)
de P. permucronatum.
108
51. Regressão linear dos resultados do teste Inibição de crescimento de
Leishmania amazonensis pelo Extrato Hexânico dos Frutos (EHFr)
de P. permucronatum.
108
52. Regressão linear dos resultados do teste Inibição de crescimento de
Leishmania
amazonensis
por
PPHFr-1
isolada
de
P.
permucronatum.
109
53. Porcentagem de atividade antioxidante dos isolados de P.
permucronatum em comparação com Trolox e BHT.
113
LISTA DE TABELAS___________________________________________
Tabelas
1.
Páginas
Compostos voláteis identificados no óleo essencial de espécies do
gênero Piper
2.
Metabólitos isolados de 21 espécies de Piper, L. e suas respectivas
atividades biológicas
3.
44
Espécies de Piper com suas respectivas atividades biológicas de
seus extratos
4.
46
Relação dos constituintes químicos identificados nos óleos
essenciais extraídos das folhas de P. permucronatum, com os IK e
os percentuais.
5.
67
Comparação dos dados de RMN
dados de RMN
13
C do óleo essencial com os
13
C da asaricina [14], miristicina [15], elemicina [16]
e dilapiol [17] descritos na literatura (ref).
6.
Atribuições dos dados de RMN
1
H e
71
13
C para PPHFr-1 e
comparação destes dados com dados da literatura para a
Galbegina
7.
76
Atribuições dos dados de RMN 1H e 13C para PPFr-7 e comparação
destes dados com dados da literatura para a Veraguensinaref .
8.
1
Dados de RMN H e
C dos átomos de hidrogênio e carbonos de
PPFH – 5
9.
84
13
91
Teste larvicida em Aedes aegypti do Óleo essencial extraído em
jan. de 2005 de P. permucronatum
98
10. Teste de toxicidade sobre Artemia salina do Extrato Hexânico dos
Frutos (EHFr) de P. permucronatum.
100
11. Teste de toxicidade sobre Artemia salina do Extrato Hexânico das
Folhas (EEF) de P. permucronatum.
101
12. Valores da concentração inibitória 50% e seus respectivos
intervalos com 95% de confiança das atividades Leishmanicida e
toxicidade em Artemia salina de Piper permucronatum, Yuncker.
112
13. Atividade de sequestro de radical livre dos isolados de P. permucronatum. 114
LISTA DE ABREVEATURAS E SIGLAS_________________________
BB – Broad Band
CCD – Cromatografia em camada delgada
EHFL - Extrato Hexânico das folhas de Piper permucronatum
EHFr – Extrato Hexânico dos frutos de Piper permucronatum
DEPT – Distortioness enhacement by polarization transfer
EM – Espectrômetro de Massas
HMBC – Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HMQC – Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
NOESY – Nuclear Overhauser Effect
RMN 1H – Ressonância magnética nuclear de hidrogênio
RMN 13 C - Ressonância magnética nuclear de Carbono 13
IV – Infravermelho
UV - Ultravioleta
δ – Deslocamento químico
J –Constante de acoplamento
2
J – Acoplamento Geminal
3
J – Acoplamento Vicinal
MHz - Megahertz
INPA – Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia
TR – Tempo de retenção
IK – índice de Kovats
CL50 - Concentração necessária para causar letalidade em 50% dos indivíduos.
IC50 – Concentração necessária para inibir o crescimento em 50%.
ERO – Espécie Reativa de Oxigênio
CD4 – Cluster of Diferenciation 4
IFN- - Interferon gama
SOD – Superóxido Dismutase
CAT – Catalase
DNA – Desoxidy Ribonucleic Acid
Th1 – Lifócitos T helper – 1
Th2 – Linfócitos T helper – 2
IL-4 – Interleucina 4
MDR – Multi Drug Resistence
NEC – Novas Entidades Químicas
SUMÁRIO_____________________________________________________
1. INTRODUÇÃO
20
1.1 Metabolismo secundário
22
1.2 Aspectos metodológicos sobre atividade biológica dentro da Química de 23
Produtos Naturais
1.2.1 Toxicidade sobre Artemia salina Leach
24
1.2.2 Teste Larvicida em Aedes aegypti
25
1.2.3 Avaliação antioxidante de Produtos Naturais e o Estresse oxidativo
26
1.3 Leishmaniose
29
1.3.1 Perspectivas sobre o tratamento da leishmaniose
32
2. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O GÊNERO Piper
35
2.1 Botânica
36
2.2 Fitoquímica do gênero Piper
37
2.3 Estudos farmacológicos no gênero Piper
42
2.4 Piper permucronatum (Yuncker)
47
3. OBJETIVO
48
3.1 Objetivo geral
49
3.2 Objetivos específicos
49
4. MATERIAIS E MÉTODOS
50
4.1 Identificação do espécime Vegetal
50
4.2 Métodos cromatográficos
50
4.3 Métodos Espectroscópicos
51
4.3.1 Infravermelho (I.V.)
51
4.3.2 Ressonância magnética nuclear de hidrogênio - 1H (RMN 1H) e de
Cabono - 13 C (RMN13C).
51
4.3.3 Análise do óleo Essencial por Cromatografia Gasosa (CG) acoplado
ao Espectrômetro de Massas (EM)
4.4.
Estudo
dos
Metabólitos
secundários
52
das
folhas
de
Piper
permucronatum
52
4.4.1 Obtenção dos óleos essenciais das folhas de P. permucronatum
52
4.4.2 Obtenção do extrato das folhas de P. permucronatum.
52
4.4.2.1 Tratamento cromatográfico de EHF
52
4.4.3 Obtenção do extrato hexânico dos frutos de P. permucronatum
53
4.4.3.1 Tratamento cromatográfico de EHFr
53
4.5 Ensaios biológicos
54
4.5.1 Toxicidade em Artemia salina, Leach - TAS
54
4.5.2 Atividade antioxidante
54
4.5.3 Atividade Larvicida em Aedes aegypti.
55
4.6 Obtenção e Cultivo de Leishmania amazonensis
56
4.6.1 Parasitas
56
4.6.2 Criopreservação do parasita
56
4.6.3 Meio de cultura
56
4.6.4 Cultivo do parasita
57
4.6.5 Curva de crescimento
57
4.6.6 Avaliação da viabilidade das formas promastigotas de L. amazonensis
sob a ação dos extratos e isolados de P. permucronatum.
58
4.6.7 Teste de citotoxicidade em Macrófagos peritoneais de BALB/c
58
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES I: Estudo fitoquímico.
60
5.1 Introdução
60
5.2 Identificação dos compostos químicos dos óleos essenciais das folhas 61
de P. permucronatum
5.3 Determinação estrutural de PPHFr-1 {Galbelgina}
78
5.4 Determinação estrutural de PPHFr-2 {Veraguensina}
82
5.5 Determinação estrutural de PPFH-7 {8-Carvotacetona acetato}
90
6. RESULTADOS E DISCUSSÕES II: Ensaios Biológicos.
97
6.1 Introdução.
97
6.2 Atividade larvicida do Óleo essencial.
97
6.3 Ensaios biológicos com extratos e substâncias isoladas.
100
6.3.1 Avaliação da toxicidade sobre Artemia salina – TAS.
100
6.3.2 Atividade inibitória do crescimento celular in vitro das formas
Promastigotas de Leishmania amazonensis.
102
6.3.3 Teste de toxicidade em Macrófagos.
106
6.3.4. Atividade Leishmanicida e sua possível correlação com TAS.
111
6.3.5 Atividade Antioxidante de Veraguensina e 8-carvotacetona acetato.
112
7. CONCLUSÃO.
116
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
119
9. APÊNDICE A – Tabela 1. Constituintes químicos identificados no óleo 138
essencial de espécies do gênero Piper
1. INTRODUÇÃO
O uso de plantas medicinais na arte de curar é uma forma de tratamento de
origem muito antiga, relacionada aos primórdios da medicina e fundamentada no
acúmulo de informações por sucessivas gerações. Ao longo dos séculos, produtos de
origem vegetal constituíram as bases para tratamento de diferentes doenças. A
Organização Mundial da Saúde tem expressado a sua posição a respeito da
necessidade de valorizar a utilização de plantas medicinais no âmbito sanitário, tendo
em conta que 80% da população mundial utiliza essas plantas ou preparações destas
no que se refere à atenção primária a saúde. Ao lado disso, destaca-se a participação
dos países em desenvolvimento nesse processo, já que possuem 67% das espécies
vegetais do mundo (BRASIL, 2006)
De fato, a fonte natural mais explorada para fins terapêuticos tem sido o reino
vegetal, o qual oferece as maiores oportunidades em virtude do grande potencial
metabólico que as espécies vegetais apresentam (Tamella, 2004). As estruturas
derivadas de vegetais têm a mais alta diversidade química, especificidade bioquímica e
características físico-químicas desejáveis entre outras propriedades moleculares que as
tornam favoráveis como fornecedoras de moldes estruturais para a descoberta de
novos fármacos (Baso et. al., 2005).
Por conta disso, os vegetais, sobretudo os de uso medicinal têm ganhado grande
relevância no seu potencial de aplicação farmacêutica. Paradoxalmente, existe uma
considerável falta de conhecimento fitoquímico comparado à grande diversidade
existente particularmente nos trópicos. Poucas espécies têm sido estudadas
quimicamente e um número menor tem sido avaliado biologicamente (Baso et. al.,
2005; Verpoorter, 1998).
1. Introdução
21
Embora o uso de plantas na prática terapêutica tenha iniciado nos primórdios da
civilização humana, só em 1820 é que o isolamento de constituintes químicos começou
a ser feito. A descoberta da quinina [1] (Figura 3, pág. 28) a partir de Cinchona
succiruba (Rubiaceae), planta utilizada por indígenas da região amazônica, por
Caventou e Pelletier e o subseqüente desenvolvimento de derivados (Primaquina e
Cloroquina) no tratamento da malária representou o início da exploração da
quimiodiversidade da natureza contra doenças infecciosas não apenas para
Plasmodium sp. mas também para Leishmania e Trypanossoma ssp. (Phillipson, 2001).
A abordagem inovadora de Caventou e Pelletier ainda hoje é útil e, portanto,
consagrada pelas indústrias farmacêuticas. De um total de 119 princípios ativos
disponíveis no mercado derivados de 90 espécies de plantas cerca de 74% foram
descobertas através de estudos químicos dirigidos ao isolamento de substâncias ativas
de plantas utilizadas pela medicina tradicional (Gurib-Fakim, 2006).
Durante as últimas décadas tem se aumentado o interesse pelo uso da Natureza
como fonte de quimioterápicos principalmente pelo desenvolvimento da multiresistência às drogas por diversos agentes infecciosos. A descoberta da Artemisinina
[2] (Figura 3, pág. 28), uma lactona sesquiterpênica isolada de Artemisia annua
(Asteraceae), representa um importante avanço contra o fenótipo MDR e constitui uma
alternativa de tratamento nos locais onde as cepas de Plasmodium sp. são resistentes
(Gurib-Fakim, 2006).
O Brasil possui grande potencial para o desenvolvimento dessa terapêutica, pois
possui a maior diversidade vegetal do mundo, ampla sociodiversidade, com uso de
plantas medicinais vinculado ao conhecimento tradicional e tecnologia para validar
cientificamente
esse
conhecimento
(MS,
2006).
A
Amazônia,
única
região
remanescente de floresta tropical úmida do planeta, merece a maior atenção, pois
muitos dos grupos de animais e plantas estão nela representadas e em maior
diversidade de espécies (Val, 2006)
1. Introdução
22
1.1 Metabolismo secundário
Por metabolismo entende-se o conjunto de reações de degradação (catabólicas)
ou de síntese (anabólicas) que as substâncias químicas sofrem no interior da célula
necessárias para a aquisição e utilização da energia livre para a realização de funções
fisiológicas importantes para a manutenção da vida. As vias metabólicas são inúmeras
e consistem em uma série de reações catalisadas por enzimas que produzem
compostos intermediários ou produtos finais denominados de metabólitos (Voet, 2002).
O metabolismo pode ser ainda definido como a soma de todas as
transformações químicas de uma célula ou organismo, ocorrido através de uma série de
reações catalisadas por enzimas que constituem as vias metabólicas. Cada passo
consecutivo em uma via metabólica traz pequenas mudanças químicas, normalmente a
remoção, transferência ou adição de um átomo particular ou grupo funcional. O
precursor é convertido em produto através de uma série de intermediários metabólicos
chamados de metabólitos (Leningher, 2005).
No caso das plantas o metabolismo é dividido em dois grandes grupos baseado
na sua funcionalidade. Esses grupos são denominados:
a) primário ou essencial, importante para a manutenção da homeostasia celular
participando diretamente do crescimento e desenvolvimento do vegetal; e
b) secundário ou especial, especializado na adaptação da planta ao ambiente
natural. (Simões et. al. 2005; Buchanan, 2000).
Os metabólitos primários podem ser designados como compostos de alto peso
molecular normalmente utilizados pelo metabolismo para a construção de estruturas
macromoleculares como proteínas, lipídeos, membranas biológicas, receptores,
organelas, enfim, estruturas que compõem, regulam e mantêm a base molecular de
todos os seres vivos e, portanto, de distribuição universal (Simões et. al., 2005).
1. Introdução
23
Já os metabólitos secundários são micromoléculas de baixo peso molecular que
por uma série de reações catalisadas por enzimas adquirem uma alta diversidade
estrutural. Frequentemente estão relacionados com as funções de defesa e sinalização
do vegetal contra outros organismos, sendo, portanto, conservados e diversificados e,
por conta disso, de distribuição restrita a certos grupos de plantas, ou seja, com
freqüentes implicações quimiotaxonômicas (Wink, 2003; simões et. al., 2005).
As substâncias produzidas pelo metabolismo secundário de plantas podem ser
divididas em 3 grandes grupos estruturais: os terpenóides, formados pela união de
unidades isoprênicas de 5 carbonos; os compostos fenólicos (lignanas, neolignanas,
flavonóides, cumarinas) formados a partir da via do ácido chiquímico baseada na
estrutura do fenilpropano (C6C3) e os alcalóides/amidas derivados dos aminoácidos
aromáticos (Dewick, 2002).
1.2 Aspectos metodológicos sobre avaliação da atividade biológica dentro da
química de Produtos naturais.
No estudo da atividade biológica de extratos vegetais é importante a seleção de
bioensaios para a detecção do efeito específico. Entretanto, poucos laboratórios de
pesquisa em química de produtos naturais apresentam os requerimentos e as
facilidades necessárias para a realização de bioensaios como cultura de células e
biotérios, necessitando para isso, a cooperação com outros grupos de pesquisa com
infra-estrutura apropriada. Nesse contexto há um grande interesse, principalmente em
países em desenvolvimento, na procura por bioensaios simples e de baixo custo
capazes de serem realizados por pessoas não especializadas (Hambúrguer e
Hostettmann, 1991). Dentre estes bioensaios vale citar o teste de toxicidade sobre
Artemia salina e o larvicida contra Aedes aegypti os quais foram utilizados neste
estudo.
1. Introdução
24
1.2.1 Toxicidade sobre Artemia salina, Leach
Artemia salina (Figura 1, nesta página) é um microcrustáceo amplamente
utilizado na aqüicultura como alimento para as diversas fases larvais e pós-larvais de
peixes e crustáceos por apresentar um alto valor nutritivo, além de não possuir
carapaça rígida de quitina, facilitando a alimentação dos peixes e camarões (Pereira,
2001).
Artemia
sp.
apresenta
importantes
características:
-1
contém
uma
ampla
o
adaptabilidade a salinidade (5-250gL ) e temperatura (6-35 C), ciclo de vida curto
(21dias), alta adaptabilidade a condições ambientais adversas, alta fecundidade,
estratégia de reprodução assexuada/sexuada, tamanho reduzido, adaptabilidade a
variação nutricional (Nunes et.al., 2006).
a)
b)
Figura 1. Estágios de desenvolvimento de Artemia sp. a) Nauplii b)Adulto
Fonte: www.geocities.com
Quando comparado a outros organismos-alvo que vão desde equinodermos,
moluscos até microalgas, sob as mesmas condições experimentais Artemia se mostrou
mais resistente, o que o torna um dos mais valiosos organismos-teste disponíveis para
1. Introdução
25
bioensaios toxicológicos e ecotoxicológicos sendo por isso considerado um bioindicador
(Nunes et. al.,2006). Além disso, significante correlação (r=0,85, p<0,05) foi
estabelecida entre o sistema TAS e o teste sobre toxicidade oral em camundongos
sugerindo o uso de Artemia como um teste preliminar de baixo custo para avaliação de
toxicidade em mamíferos (Parra et. al. 2001).
O teste de toxicidade em Artemia salina (TAS) é um dos mais utilizados para a
realização de um fracionamento guiado por bioatividade de extratos vegetais (Tazcova
et. al., 2003; Moreira et. al., 2003; Noldim et. al. 2002). A validade e confiabilidade deste
tipo de teste fazem com que ele seja capaz de convergir para o isolamento de
substâncias bioativas correlacionadas com outros tipos de atividades biológicas como
antitumoral, antifúngica, viruscida, antimicrobiana, parasiticida e tripanocida (Siqueira
et.al., 1998)
1.2.2 Teste larvicida em Aedes aegypti.
Plantas com ação inseticida têm sido utilizadas como método alternativo de
controle por meio de produtos com formulação em pó, óleos e extratos contra as
principais pragas e vetores de doenças. Nesse contexto a atividade larvicida em Aedes
aegypti tem ganhado importância devido às crescentes endemias de dengue que
ocorrem em países de clima tropical.
Considerado um grave problema de saúde pública estima-se que cerca de 100
milhões de casos da Dengue são diagnosticados todos os anos. Destes, 500 mil
representam a Dengue hemorrágica (DHF), a forma mais severa da doença, a qual
apresenta taxa de mortalidade variando de 2,5 a 5% dos casos (Stephenson, 2006).
Sem nenhum tratamento específico ou vacina licenciada o controle da doença
tem sido centrada única e exclusivamente na redução da população do inseto vetor
através da aplicação de inseticida o que demanda altos custos ao governo
(Stephenson, 2006).
1. Introdução
26
A descoberta de Produtos Naturais que possam ser empregados no lugar de
inseticidas sintéticos além de reduzir o custo pode aumentar a segurança química na
sua aplicação contra o inseto vetor diminuindo a contaminação ambiental. A flora
brasileira tem sido uma imensa fonte de novos agentes no controle mais eficiente de
Aedes aegypti (Mendonça et. al., 2005).
1.2.3 Avaliação antioxidante de Produtos Naturais contra o estresse oxidativo
O stress oxidativo é um desequilíbrio químico da célula a um estado próoxidativo onde há uma grande formação de radicais livres os quais estão na gênese de
diversas patologias ligadas ao processo de envelhecimento como as doenças
cardiovasculares, arterosclerose, diabetes, cegueira, doenças neurodegenerativas e
cânceres (Floyd, 1999). Dentre os radicais livres, moléculas contendo um ou mais
elétrons desemparelhados, as Espécies Reativas de Oxigênio (ERO) representam a
classe mais importante de radicais gerados pelos sistemas biológicos e são capazes de
causar danos a biomoléculas (Barreiros et. al., 2006; Valko et.al., 2007). As implicações
patológicas das ERO’s podem ser visualizadas na figura 2, abaixo.
Figura 2. Implicações patológicas das ERO’s (Valko et. al. 2007). Dependendo do tipo
celular o estresse oxidativo pode comprometer o funcionamento de diferentes
órgãos e sistemas.
1. Introdução
27
Nas proteínas, as ERO’s atacam preferencialmente as cadeias laterais da
cisteína, histidina, triptofano, metionina e fenilalanina, inativando-as.
Nos resíduos de
ácido graxo dos fosfolipídeos de membrana há uma extrema sensibilidade à
peroxidação comprometendo a integridade física da célula. No DNA as ERO’s reagem
com as bases púricas e pirimídicas além de reagir também com o esqueleto açúcarfosfato
através
da
abstração
de
Hidrogênio
causando
ruptura
na
cadeia
desoxiribonucleotídica (Barreiros et. al., 2006; Valko et.al., 2007). Modificação
permanente no material genético resultante desse dano oxidativo é o primeiro passo
para formação de cânceres os quais são a terceira maior causa de morte no Brasil
(Sasse, 2006).
Os Antioxidantes, por sua vez, são substâncias que diminuem a formação de
radicais livres ou previnem o dano causado por eles e podem ser divididos em dois
grandes grupos: os antioxidantes enzimáticos e os não enzimáticos. Enquanto os
enzimáticos são produzidos endogenamente e incluem na sua maioria enzimas tais
como superoxido dismutase (SOD) e catalase (CAT), os não enzimáticos representam
compostos que são obtidos diretamente da dieta (Ratnam, et. al., 2006).
Nesse
nutracêuticos.
contexo
desenvolveu-se
Alimentos
que
contém
a
idéia
níveis
dos
alimentos
significativos
de
funcionais
ou
componentes
biologicamente ativos que trazem benefícios à saúde além da nutrição básica. Eles são
aproveitados no próprio consumo dos alimentos in natura ou então isolados e inseridos
em outro produto passando então a ser enriquecido com nutrientes (PLANETA, 2006).
Os polifenóis representam a classe mais importante de compostos naturais com
propriedades antioxidantes obtidos diretamente da dieta.
O flavonóide quercetina [3] (Figura 3, pág. 28) é um grande exemplo de polifenol
amplamente distribuído no reino vegetal cuja propriedade antioxidante é capaz de
suprimir a carga oxidativa de netrófilos polimorfonucleados além de proteger a
membrana celular contra peroxidação lipídica (Zielinska et. al. 2001, Nakagawa et. al.,
2000). O ácido nordiidroguaiarético [4] (Figura 3, pág. 28), uma neolignana, apresenta
atividade antimicrobiana e antineoplasica e, durante anos, foi utilizada como
1. Introdução
28
antioxidante e adicionado em alimentos (Gottlieb, 1988). As estruturas da quercetina e
do ácido nordiidroguaiarético estão ilustradas na figura 3.
Alem disso a oxidação lipídica pode promover a rancidez que é um dos maiores
problemas encontrados na estocagem de alimentos ricos em ácidos graxos. Extratos de
plantas ou isolados podem ser utilizados como aditivos úteis na promoção da
estabilidade nutricional e na qualidade dos alimentos (Medina et. al. 2003).
N
HO
O
O
O
O
O
N
O
[1]
[2]
OH
OH
HO
O
HO
OH
OH
OH
O
[3]
HO
OH
[4]
Figura 3. Estrutura química da Quinina [1], Artemisinina [2]; Representam metabólitos
secundários úteis no tratamento da malária. Estrutura química da quercetina
[3] e do ácido nordiidroguaiarético [4]; úteis para a redução do estresse
oxidativo.
1. Introdução
29
1.3 Leishmaniose
A leishmaniose é uma doença que acomete isoladamente ou em associação a
pele e as mucosas do nariz, boca, faringe e laringe. É causado por protozoários do
gênero Leishmania pertencente à Ordem Knetoplastidae e à Família Tripanossomatidae
(Falqueto e Sessa, 2002).
Em uma das primeiras descrições clínicas feitas sobre a leishmaniose, Alexander
Russel em 1756, determinou como característica principal desta enfermidade as
horríveis lesões e deformações faciais que os seus pacientes apresentavam. Estas
características foram descobertas em representações faciais feitas em cerâmica Inca
que datam dos primeiros séculos depois de Cristo indicando que a doença, além de ter
origens muito antigas, prevaleceu nas Américas próxima a esta data. Textos Incas que
datam do século XV e XVI referem-se a esta doença como doença do Vale ou dos
Andes. Em 1901, Leishman identificou microorganismos nas amostras retiradas do
baço de pacientes que morreram de “febre Dum-Dum”, outra denominação atribuída à
Leishmaniose. Dum-Dum era uma cidade próxima a Calcutá cujos habitantes eram
considerados “não-saudáveis”. Em 1903, Donovam descreveu estes microorganismos
como sendo uma nova espécie de protozoário e Ross foi quem o denominou de
Leishmania donovani estabelecendo pela primeira vez o vínculo deste parasito com a
doença (WHO, 2006).
O ciclo biológico da Leishmaniose (Figura 4, página 31) envolve obrigatoriamente
mamíferos silvestres como hospedeiro definitivo e insetos hematófagos como
hospedeiro intermediário, os quais pertencem à subfamília Phlebotominae, gêneros
Phlebotomus e Lutzomia. Enquanto nos mamíferos silvestres há uma relação de
equilíbrio sem qualquer sinal da doença, hospedeiros acidentais, como o homem,
reagem intensamente com o aparecimento de lesões que ocorrem inicialmente na pele
no local de picada do inseto (Falqueto e Sessa, 2002). Em seu ciclo de vida são
diferenciadas duas formas morfológicas do parasito. A forma promastigota extracelular
(Figura 5a, página 31) é flagelar, móvel, tem cerca de 30 µm de extensão e pode ser
encontrado livre ou junto à cutícula intestinal do inseto vetor. Já as amastigotas (Figura
1. Introdução
30
5b, página 31) menores em tamanho (cerca de 10 µm de diâmetro), são ovóides,
imóveis e com flagelo muito pequeno vivem em vacúolos lisossomais presentes em
células fagocíticas (monócitos/macrófagos).
Devido à ampla variedade de espécies de Leishmania combinado com a
resposta imune do hospedeiro pode-se observar um largo espectro de manifestações
clínicas, histopatológicas e imunopatológicas convencionalmente conhecidas como
Leishmaniose
Cutânea
Localizada,
Leishmaniose
Muco-Cutânea, Leishmaniose
Cutânea Difusa Anérgica e Leishmaniose Visceral. A patogenicidade depende do perfil
de citocinas produzidas pelas células do sistema imune sendo que a resistência à
infecção é determinada pela resposta imune de linfócitos CD4+ tipo Th1 com grande
produção de IFN- enquanto que a susceptibilidade é atribuída à resposta de linfócitos
CD4+ tipo Th2 com produção de IL-4 (Silveira et. al., 2004).
Estima-se que 2 milhões de pessoas são infectados no mundo anualmente e a
distribuição geográfica da Leishmaniose tem se expandido desde 1993 com um
concomitante aumento do número de casos (WHO, 2006). Isto tem sido atribuído ao
aumento dos fatores de risco como o êxodo rural, inchaço urbano, desflorestamento e
condições sanitárias precárias (Desjoux, 2001).
1. Introdução
31
Figura 4. Ciclo de vida de Leishmania sp.
a)
b)
Figura 5. Em a): Promastigotas de L. amazonensis. Foto cedida gentilmente pela Dra.
Izaltina Silva Jardim. Em b): Amastigotas de L. donovani fagocitados por Macrófago.
Fonte: www.msu.edu/course/zol/316/lsppscope.htm
1. Introdução
32
1.3.1 Perspectivas sobre o Tratamento das Leishmanioses
O tratamento da Leishmaniose baseia-se em antimoniais pentavalentes
(Pentostan e Glucantime). O antimoniato de N-metil-glucamina, único no Brasil, tem 300
g/ml do sal equivalentes a 85
g/ml do princípio ativo. Em várias espécies de
Leishmania o medicamento pode variar de resultado. Além disso, ele é instável e
apresenta resultados que variam com o lote de fabricação e da forma de como é
conservado. Os antimoniais ainda causam efeitos colaterais relacionados à função
cardíaca além de causar dores articulares, epigástricas, entre outros (Falqueto e Sessa,
2002). A resistência aos antimoniais por espécies de Leishmania é outra preocupação
crescente. Sendo diagnosticado em até 80% dos casos registrados, a resistência a
antimoniais por Leishmania sp. tem sido identificado em diferentes espécies e cepas
parasitárias (Abdo, et. al., 2003; Sundar et.al., 2001).
Doenças infecciosas tropicais, tais como a leishmaniose, continuam a causar
significante morbidade e mortalidade principalmente em populações pobres dos países
em desenvolvimento. O baixo poder aquisitivo destes povos torna a pesquisa e
desenvolvimento de novos fármacos pouco atrativo para este mercado farmacêutico.
De 1393 NEC´s que entraram no mercado entre 1975 e 1999, apenas 16 (1%)
correspondem a doenças infecciosas. Destas, poucas representaram avanços
terapêuticos nos tratamentos existentes (Trouiller et. al., 2002).
Um exemplo disso está no tratamento das leishmanioses onde os antimoniais
pentavalentes, introduzidos há 5 décadas atrás, ainda são utilizados. Isto tem
implicações importantes, pois sem tratamentos mais eficazes e seguros, há uma
pressão seletiva que determina o surgimento de cepas resistentes. Fármacos já
conhecidos por possuírem atividades antitumorais, como Azitromicina e miltenfosina;
antifúngica como cetoconazol e fluconazol; e antihelmínticos como paramomicina, tem
sido utilizado no tratamento de leishmaniose cutânea. Entretanto, sua eficácia varia
conforme a espécie de Leishmania. O tratamento da leishmaniose sem conhecimento
da espécie de parasita, prática relativamente comum na clínica médica em países em
desenvolvimento, pode originar cepas com o fenótipo MDR (Multi Drug Resistent)
(Minodier e Parola, 2006).
1. Introdução
33
No Brasil a maioria das populações tradicionais não tem acesso aos
medicamentos industrializados e por isso o uso de plantas medicinais é predominante
para a cura de doenças sendo adotada em até 91% das famílias (Bieski, 2004). Embora
esta seja uma prática que tem sido aprovada pelo Ministério da Saúde através da
Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares no Sistema Único de
Saúde, as doenças infecciosas, tais como a Leishmaniose, continuam sendo
negligenciadas pelo fato de que a fitoterapia no Brasil só ser permitido para doenças
“leves”, por exemplo, para uso como antiinflamatórios, analgésicos, e outros (BRASIL,
2006; Gilbert, 2006).
É importante o isolamento de novos compostos a partir de extratos de plantas
medicinais para o desenvolvimento de novos fármacos, mas nem sempre esta
abordagem é satisfatória desde que o princípio ativo seja encontrado em baixa
concentração ou que a atividade do extrato seja atribuída a um efeito sinérgico entre
vários compostos (Gilbert, 2006).
Por outro lado, é inegável que plantas medicinais representam uma rica fonte de
diversidade química e potencial aplicação terapêutica e a Flora brasileira tem sido
submetida à avaliação de sua potencialidade parasiticida (Mesquita et. al., 2005). A
pesquisa por novas drogas mais efetivas e seguras tem se tornado uma prioridade no
tratamento da Leishmaniose. O uso de Produtos Naturais tem sido visto como uma
valiosa fonte de novos agentes químicos o qual tem sido avaliado exaustivamente para
a leishmaniose. Das 239 moléculas naturais quimicamente definidas relatada na
literatura com bioatividade contra diversas espécies de Leishmania, a classe dos
alcalóides tem se mostrado a mais efetiva com 68 estruturas relatadas ao lado dos
triterpenos com 29 e sesquiterpenos com 19 estruturas contendo atividade biológica
contra diversas espécies de Leishmania (Rocha et. al., 2005). Entretanto poucos são os
estudos feitos com espécies de Piper contra parasitas do gênero Leishmania. Neste
estudo determinou-se a inibição de crescimento das formas promastigotas de L.
amazonensis para os extratos hexânicos dos frutos e das folhas de P. permucronatum.
2. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O GÊNERO Piper.
Piper é o gênero que dá nome à família Piperaceae e constitui a denominação
árabe para a pimenta. Supõe-se que foram os próprios árabes que introduziram a
pimenta na Europa pelas antigas rotas das especiarias que cruzavam o Mar
Vermelho. A pimenta-do-reino (Piper nigrum) foi e até hoje é a mais utilizada de
todas as especiarias. Embora o uso para fins medicinais data do século V a.C. mais
da metade do mercado entre Àsia e África no Século I d.C. era de especiarias as
quais eram utilizadas como conservantes e para realçar o sabor dos alimentos o
que, durante grande parte da história das civilizações, foi e ainda é uma prática
indispensável. A demanda crescente por estes condimentos, em especial por P.
nigrum, estimulou uma procura global que deu início à era dos descobrimentos (Le
Couteur, 2006).
Com exceção de P. nigrum, poucas espécies de Piper têm algum valor
econômico, entretanto, P. methysticum tem ganhado popularidade na indústria de
fitofármacos sendo utilizado como sedativo (Greig, 2004). P. hispidinervum em
função do seu alto conteúdo de safrol (93%) oferece uma oportunidade para
obtenção dessa importante matéria prima que é utilizada pela indústria química para
preparação de derivativos (Rocha e Ming, 1999). O interesse medicinal por este
gênero tem aumentado em função do largo número de metabólitos secundários que
sintetizam, de tal forma que, não menos do que 65% da publicação mundial tem
objetivado o estudo das atividades biológicas destas espécies nos últimos anos
(Jaramillo e Marquis, 2004).
2. Considerações gerais sobre o gênero Piper
36
2.1 Botânica
A família Piperaceae apresenta cerca de 10 a 12 gêneros com cerca de 1400
espécies. No Brasil esta família está representada por 5 gêneros – Ottonia Spreng.,
Piper L., Peperomia Ruiz & Pav., Pothomorphe Miq. e Sarcochachis Trel - e um total
aproximado de 460 espécies (Barroso, 1978).
O gênero Piper compreende cerca de 1200 espécies distribuídas em regiões
tropicais e subtropicais nos dois hemisférios. A maior diversidade, porém está na
região Neotropical onde cerca de dois terços das espécies descritas são
encontradas. Na região Amazônica é estimada a existência de cerca de 300
espécies (Tawan et. al., 2002; Jaramilo e Manos, 2001).
As espécies de Piper apresentam características morfológicas bastante
uniformes onde as inflorescências são particularmente distintivas. Compreendem de
12 a milhares de diminutas flores sésseis reunidas em inflorescências verticais na
forma de espiga sendo que estas são opostas às folhas. São Plantas lenhosas e
com mais de um estigma (Barroso, 1978). As espécies de Piper do Novo Mundo
apresentam flores hermafroditas enquanto que as do Novo Mundo as flores são
dióicas (Greig, 2004).
Espécies de Piper do sudeste do Brasil apresentam como sistema primário de
polinização a ambofilia, isto é, anemofilia associado à entomofilia sendo que o pico
de floração coincide com o pico de velocidade do vento (de Figueredo e Sazima,
2000). Existe ainda uma preferência alimentar do morcego frugívoro Carollia
perspicillata por frutos de Piper tornando-o um grande dispersor de sementes deste
gênero (Lima e Reis, 2004; Passos et.al., 2003). Este fato pode estar associado ao
odor do óleo essencial produzido pelas espécies de Piper o que acaba por ajudar C.
perpicillata na localização do alimento em situações de campo (Mikich et. al., 2004).
2. Considerações gerais sobre o gênero Piper
37
2.2 Fitoquímica do gênero Piper L.
A caracterização química das espécies no gênero Piper tem sido amplamente
investigada em todo o mundo. Suas espécies são reconhecidas pela medicina
popular em vários países na América Latina. Algumas são listadas como remédio
para doenças gastrointestinais; utilizadas para aliviar dores no peito; como agente
antiinflamatório; como antídoto contra veneno de cobra; entre outros usos. As
investigações fitoquímicas no gênero Piper têm revelado uma ampla variedade de
constituintes químicos produzidos por suas espécies. De um total de 667 diferentes
compostos isolados de 112 espécies mais da metade corresponde às classes
alcalóide/amida (190), terpenos (97), neolignanas (70) e lignanas (49) (Parmar et al.
1997; Dyer, Dodson and Richard, 2004).
Sob o ponto de vista biossintético, a via do ácido chiquímico parece ser uma
das mais importantes rotas quanto à produção de metabólitos secundários no
gênero Piper. O ácido chiquímico é o precursor central para a biossíntese do ácido
gálico utilizado para a formação de galotaninos; para a formação de diversos tipos
de alcalóides a partir de aminoácidos aromáticos; do ácido cinâmico para a
formação de lignanas, neolignanas e fenilpropenóides; e do álcool p-cumárico
utilizado na formação dos flavonóides (Esquema 1, página 37) (Dewick, 2002). Dos
metabólitos citados apenas os galotaninos não tem sido encontrados em espécies
de Piper (Parmar et. al. 1997).
O gênero Piper é conhecido pela biossíntese de amidas isobutílicas de longa
cadeia com potencial inseticida (pipericida), com diversas ações farmacológicas
(piperina) e microbicidas (aduncamida) (Boll et. al., 1994; Parmar et.al.,1997).
Alguns estudos suportam a hipótese de que as amidas isobutílicas junto com as
Lignanas/Neolignanas são os compostos de defesa produzidos pela família
Piperaceae contra a herbivoria (Bernard et. al., 1995).
A nomenclatura das lignanas/neolignanas adotada para esta dissertação é a
proposta por Gotlieb (1978) por ser a única a respeitar a origem biossintética destes
metabólitos secundários. Segundo esta nomenclatura as lignanas são derivadas de
alcoois e ácidos cinâmicos que apresentam o cabono 9 e 9’ oxigenado ao passo que
neolignanas são derivados de aril e propenilfenóis que não apresentam carbono 9 e
2. Considerações gerais sobre o gênero Piper
38
9’ oxigenado (Simões et. al.,1999). Entretanto, a IUPAC recomenda como
nomenclatura oficial a de Haworth (1936) o qual denomina de lignanas as estruturas
fenilpropânicas (C6C3) acopladas entre si pelo carbono beta (C8), enquanto as
neolignanas são aquelas provenientes de qualquer outro tipo de acoplamento
(IUPAC, 2000).
CO2H
CO2H
CO2H
Galotaninos
HO
O
OH
OH
OH
HO
OH
OH
Ác. chiquímico
OH
Ác. 3-hidroxichiquímico
CO2H
Ác. Gálico
CO2H
CO2H
L-Ser
NH2
O
NH2
N
H
CO2H
OH
Antranilato
Corismato
HO2C
Indol
CO2H
CO2H
N
H
Alcalóides
Indólicos
Quinolínicos
L-Trp
CO2H
NH2
O
Cumarina
OH
Profenato
L-Phe
Ác. cinâmico
CO2H
CO2H
NH2
Fenilpropanóides
OH
L-Tyr
OH
Ác. p-cumárico
Malonil-CoA
CO2
X2
Lignanas
Alcalóides
Flavonóides
Protoalcalóides
Benzilisoquinolínicos
Isoquinolínicos
Esquema 1. Rota biossintética mostrando a via do ácido chiquímico como precursor
dos metabólitos secundários identificados nos vegetais.
2. Considerações gerais sobre o gênero Piper
39
As espécies do gênero Piper podem ser divididas em dois grandes grupos
quanto ao tipo de lignanas ou neolignanas que sintetizam. No primeiro grupo
encontram-se espécies que contém lignanas com estrutura tipo 2,3-dibenzilbutan1,4-diol [a]; 3,4-dibenzil-gama-butirolactol [b], -butirolactonas [c] e 2,3-bisaril-3,7dioxa [3,3,0] biciclooctano [d]. No segundo grupo encontram-se espécies que
contém neolignanas com estrutura tipo 1,4-diaril-2,3-dimetilciclobutano [e], 1,2diarilpropanos [f], benzofurânicos [g] e 2,5-bisaril-3,4-dimetil tetrahidrofurânicos [h].
As exceções são P. cubeba e P. sumatranum os quais sintetizam tanto lignanas
como neolignanas (Jensen et. al., 1993). As espécies de Piper que sintetizam
exclusivamente lignanas ou neolignanas estão representadas na figura 12.
Espécies
P. arborescens
P. brachistachium
P. clusii
P. guineense
P. lacunosum
P. longum
Lignanas
P. lowong
P. nigrum
P. peepuloides
P. retrofractum
P. ribesoides
P. sylvaticum
P. trichostachyon
P. sarmentosum
P. attenuatum
P. capense
P. clarkii
P. futokadsura
P. hancei
P. interruptum
Neolignanas P. polysyphorum
P. schmidtii
P. thomsonii
P. wallichii
P. kadsura
P. solmsianum
P. argyrophylum
P. cubeba
P. sumatranum
Esquema 2. Divisão biossintética de lignanas e neolignanas em espécies
de Piper segundo Jensen et. al. (1993).
2. Considerações gerais sobre o gênero Piper
Ar
7
40
Ar
O
9
8
7
8'
7'
Ar
Ar'
[b]
9
7'
9
7
7'
Ar
Ar'
[e]
Ar
7
Ar
[f]
7
9'
Ar'
9'
9
8'
8
8
7'
[d]
9
8'
7
[c]
9'
8
8'
8
8'
7'
[a]
OH
O
9'
O
9'
9'
9
HO
O
O
Ar'
9
8
8
Ar
O
[g]
7
8'
O
7'
Ar'
[h]
Figura 6. Núcleos básicos das lignanas e neolignanas1 identificados no gênero Piper
de acordo com a nomemclatura proposta por Gotlieb. Ar = Anel aromático
Isto demosntra que, de alguma forma, a biossíntese de lignanas é
independente da biossíntese de neolignanas pelo menos para a maioria das
espécies do gênero Piper com algumas exceções.
Trabalhos mais recentes registram para a família Piperaceae uma grande
quantidade de espécies produtoras de óleo essencial. Na região amazônica, isto foi
constatado em várias espécies do gênero Piper como fornecedores de óleo
essencial (Maia et al, 1987; Machado et al, 1994; Facundo et al 2006: 2007). Em
recente revisão sobre a fitoquímica do gênero Piper, 88 compostos terpênicos
(monoterpenos e sesquiterpenos) foram identificados de 29 diferentes espécies
(Parmar et. al. 1997).
Na tabela 1 (Apêndice A, página 121) são apresentados composições de 43
óleos essenciais de 37 diferentes espécies de Piper num total de 227 compostos
identificados discriminando, quando possível, se o óleo foi extraído das folhas ou
dos frutos. Dessa forma é apresentada a mais abrangente revisão dos compostos
voláteis identificados no gênero Piper não se retringindo apenas aos terpenóides,
mas também aos hidrocarbonetos e fenilpropanóides.
A figura 8 (página 41) apresenta uma distribuição de freqüência dos
compostos voláteis identificados em óleos essenciais de diferentes espécies de
1
Segundo a nomenclatura da IUPAC (2000) os núcleos básicos da figura 6 podem ser assim
descritos: (a), (c), (d), (e) e (h) são lignanas; (b), (f) e (g) são neolignanas.
2. Considerações gerais sobre o gênero Piper
41
Piper de acordo com os dados da tabela 1 (Apêndice A). Pode-se verificar que o
gênero Piper apresenta uma riqueza de sesquiterpenos (55%) sendo maior para os
não oxigenados (33%) do que os sesquiterpenos oxigenados (22%). Entretanto, o
composto de maior ocorrência é o monoterpeno hidrocarboneto
-pineno [5]
identificado na composição de 34 óleos essenciais. Dentre os sesquiterpenos
germacreno D [6] e -copaeno [7] são os que apresentaram as maiores ocorrências
identificadas em 29 óleos essenciais (Figura 7, abaixo).
[5]
[6]
Figura 7. Estruturas do -pineno [5], germacreno D [6],
-copaeno [7].
Monoterpenos não Oxigenados
Monoterpenos Oxigenados
Sesquiterpenos não Oxigenados
Sesquiterpenos Oxigenados
Fenilpropanóides
Outros
50 (22%)
75 (33%)
[7]
22 (9.6%)
17 (7.4%)
35 (15%)
30 (13%)
Figura 8. Porcentagem dos compostos voláteis identificados no gênero Piper.
2. Considerações gerais sobre o gênero Piper
42
2.3 Estudos farmacológicos no gênero Piper L.
As espécies do gênero Piper tem sido investigadas fitoquímica e
biologicamente em todo o mundo e por conta disso, várias compostos contendo
importantes atividades biológicas tem sido isolados e identificados. Dentre as
atividades biológicas apresentadas por compostos isolados no gênero destacam-se
as propriedades antimicrobiais (antiviral, antifúngica, antibacterial e antiparasítica)
determinando um grande potencial biocida das espécies que compõem este gênero
(Tabela 2, página 44). As estruturas com maior número de atividades biológicas
relatadas na literatura são pertencentes à classe das lignanas/neolignanas e amidas.
A mudança na concentração de cálcio intracelular é um importante indicativo
de atividade sináptica em células neuronais. A isobutilamida Piperovatina [8] isolada
de P. piscatorum induziu um aumento no fluxo de cálcio através de um mecanismo
que envolve canais de sódio mediado por voltagem o que ajuda a elucidar as bases
moleculares e farmacológicas do seu uso popular como veneno contra peixes e
anestésico local (Mcferrem et. al. 2002).
O extrato clorofórmio de P. guanacastensis apresentou atividade larvicida
contra Aedes atropalpus (CL50 = 80,5
g/ml). O fracionamento bioguiado desta
espécie convergiu para o isolamento de metil 4-hidroxi-3-(3’-metil-2’-butenil)
benzoato [9] como maior constituinte ativo (CL50 20,5 g/ml) (Pereda-Miranda et. al.,
1997).
CO2CH3
H3CO
O
N
H
[8]
OH
[9]
Figura 9. Estruturas da Piperovatina [8] e do metil 4-hidroxi-3-(3’-metil-2’-butenil)
benzoato [9]
2. Considerações gerais sobre o gênero Piper
43
A neolignana piperkadsina A [10] (figura 9) isolada dos talos de P. kadsura
mostrou a maior atividade antiinflamatória (IC50 4,3 μM) do que as neolignanas
piperkadsina B [11] e futoquinol [12] também isoladas desta planta e avaliadas para
a mesma atividade (Lin et. al., 2006).
O
O
O
O
O
O
HO
O
O
O
O
O
[10]
[11]
O
O
O
O
O
[12]
Figura 10. Estruturas da Piperkadsina A [10], Piperkadsina B [11] e do futoquinol
[12].
2. Considerações gerais sobre o gênero Piper
44
Tabela 2. Metabólitos isolados de 22 espécies de Piper, L. e suas respectivas atividades biológicas.
Espécie
Atividade
Grupo de Substâncias
Referência
P. regnelii
Antibacteriana
Benzofurânos
Pessini et. al. 2003
P. caninum
Antibacteriana
Éster hidroxicinâmicos
Setzer et. al. 1999
Dano ao DNA
Alquilamida
Ma et. al., 2004 e Ma, Jones e Hecht,
2004.
P. crassinervum
Antifúngica
Flavanonas e hidroquinonas preniladas
Danelutte et. al. 2003
P. hispidum
Antifúngica
Amidas pirrolidínicas
Alécio et. al., 1998
P. methysticum
Inibição TNF-
Kavapironas
Hashimoto et. al., 2003
Inibição de NF- B
Kavachalconas
Folmer et. al., 2006
Citotoxicidade
Flavokavaina B
Jhoo et. al., 2006
P. sarmentosum
Antiplasmódico e antituberculose
Amidas pirrolidínicas, fenilalquila
Rukachaisirikul et. al. 2004
P. hispidum
Antiplasmódico
Chalcona
Janett-Siems et. al. 1999
P. solmsianum
Tripanocida
Lignanas
Martins et. al. 2003
P. kadsura
Antiviral
Neolignanas e lignanas
Huang et. al., 2001
Imunomodulador
Lignana, Neolignana e Amidas
Kuo, et. al., 2002
Antiinflamatória
Neolignanas
Lin et.al., 2006
Antioxidante
Amida e alcalóide
Tsai et. al. 2003
P. malacophylum
Antifúngica
Piperolídeos
Lago et. al., 2005
P. fulvescens
Antifúngica
Neolignanas
Freixa et. al. 2001
P. betle
Antifúngica;
Propenilfenóis
Evans, Bowers e Funk, 1984
Nematocida;
Williams et al., 2002
Antiinflamatória e antimicrobiana
P. gibbilibum
Citotóxica;
Antibacteriana
Alcanilfenóis
Orjala et.al., 1998
2. Considerações gerais sobre o gênero Piper
45
Tabela 2. Metabólitos isolados de 22 espécies de Piper, L. e suas respectivas atividades biológicas. (Continuação)
P. elongatum
Antileishmania
Diidrochalcona
Hermoso et. al. 2003
P. multiplinervium
Antimicrobiana
Derivado cinâmico
Ruegg et. al., 2006
P. sanctum
Antimicrobiana
Fenilpropanoides
Mata et. al., 2004
P. futokadsura
Inibição da produção de NO
Neolignanas
Konishi et. al., 2005
P. cubeba
Inibidor de CYP3A4
Lignanas
Usia et. al. 2005
P.longicaudatum
Antibacteriana
Dihidrochalcona
Joshi et. al.; 2001
P. fimbriulatum
Larvicida, Antiplasmódico e
Lignana
Sólis et. al., 2005
tripanocida
Leon et al., 2002
Atividade anti-inflamatória
P. arborescens
Anti-PAF e citotóxica
Amidas ciclobutânicas
Tsai et. al., 2005
Lignanas furânicas
P. decurrens
Inseticida
Neolignanas
Chauret et. al. 1996
2. Considerações gerais sobre o gênero Piper
46
Outros trabalhos apresentaram estudos farmacológicos de extratos os quais
podem ser vistos na Tabela abaixo.
Tabela 3. Espécies de Piper com suas respectivas atividades biológicas de seus
extratos.
Espécie
Extrato
Parte utilizada
Atividade
Referência
P. chaba
Metanólico
Caule
Antiinflamatória
Taufiq-Ur-Rahman et.
Diurética
al., 2005
Antidiarréica
P. cumenense
Etanólico
Frutos e Folhas
Antiplasmódica
Garavito, 2006
P. holtonii
Etanólico
Folhas e talos
Antiplasmódica
Garavito, 2006
P. sarmentosum
Metanólico
Folhas
Inibição da liberação
Ridtitid et. al., 1998
de Acetilcolina
P. longum
Etanólico
Frutos
Citotóxica
Padmaja et. al.,2003
P. betle
Etanólico
Folhas
Antidiabética
Arambewela et. al.
Infertilidade reversível
2005,
aquoso
Sarkar et. al., 2000
Piper
regnellii
var.
Folhas
Leishmanicida
Nakamura et. al., 2006
Fotoprotetivo
Bhattacharya et.
pallescens
P. betel
Etanólico
al.,2007
Quanto ao óleo essencial estes têm sido investigados principalmente quanto
ao seu potencial inseticida e microbicida.
Efeitos depressivos no sistema nervoso central foram descobertos no
componente majoritário do óleo essencial de P. solmsianum (sarisan) (Moreira et.
al., 2001).
A atividade antibacterial foi avaliada para os óleos essenciais de 6 espécies
vegetais. Nesse estudo P. nigrum obteve amplo espectro de atividade apresentando
zona de inibição de crescimento em 22 de 25 bactérias Gram positivas e Gram
negativas testadas (Dorman & Deans, 2000). O óleo essencial de P. crassinervum
apresentou atividade antioxidante e antimicrobial (Sachetti et. al., 2005).
O óleo essencial de P. guineense causou significativa mortalidade no inseto
Callosobruchus maculatus (Coleóptera; Bruchidae) além de inibir a eclosão de seus
2. Considerações gerais sobre o gênero Piper
47
ovos (Keita et. al., 2000). Outras espécies em que foram avaliadas as atividades
inseticidas de seus óleos foram P. aduncum e P. hispidinervum contra o gorgulho
Sitophilus zeamais (Estrela et. al. 2006). P. aduncum também apresentou toxicidade
em Cerotoma tingomarianus, praga comum na cultura do feijoeiro (Fazolin et. al.
2005).
2.4 Piper permucronatum, Yuncker.
P. permucronatum é um arbusto aromático, conhecida pelo nome popular de
elixir paregórico cujas folhas são utilizadas na forma de um chá contra cólicas
menstruais e intestinais, problema digestivo, dor de estômago, diarréia, hemorragia
e náusea.
Em pesquisa a literatura observou-se a existência de um estudo sobre o óleo
essencial extraído das folhas desta espécie coletado no estado do Rio de Janeiro
(Torquilho et. al., 1999), porém, não se observou nenhuma citação sobre atividade
biológica deste óleo e também não existe nenhum registro sobre o estudo
fitoquímico e farmacológicos dos constituintes fixos.
Figura 11. Piper permucronatum, Yuncker (PIPERACEAE).
3. OBJETIVO
3.1 Objetivo geral
Estudar quimicamente e biologicamente a espécie Piper permucronatum
(Piperaceae)
em
busca
de
metabólitos
secundários
com
propriedades
Leishmanicida, citotóxica, larvicida e antioxidante.
3.2 Objetivos específicos
o Isolar e caracterizar os constituintes químicos fixos e voláteis da
parte aérea de P. permucronatum.
o Realizar ensaios de Toxicidade sobre Artemia salina com os
extratos hexânicos das folhas e frutos.
o Realizar ensaios para a inibição do crescimento da Leishmania
amazonensis.
o Avaliar a atividade larvicida do óleo essencial extraído das
folhas de P. permucronatum..
o Avaliar a atividade antioxidante dos constituintes fixos isolados.
o Correlacionar teste de toxicidade sobre Artemia salina - TAS
com atividade leishmanicida.
o Contribuir para o estudo químico e biológico das espécies de
Piper da Amazônia.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Identificação do espécime vegetal.
Os materiais vegetais para estudo, folhas e frutos, foram coletados em datas
diferentes do ano, a primeira coleta foi realizada em 13/01/2005 e a segunda em
02/10/2006. Ambas as coletas foram feita no município de Porto Velho capital do
Estado de Rondônia. Foram confeccionadas exsicatas e enviadas para identificação
botânica no INPA onde se encontra depositada sob o número 215.649.
4.2. Métodos Cromatográficos
Nas cromatografias de adsorções em colunas foram utilizadas gel de sílica 60
da Merck e da Vetec (
m 63-200). O comprimento e diâmetro das colunas
variaram de acordo com as quantidades de amostras a serem cromatografadas e de
gel de sílica a serem utilizadas. Para cromatografia em camada delgada (CCD)
utilizou-se cromatoplacas de gel de sílica 60 (
m 2-25) sobre poliéster T – 6145 da
Sigma Chemical CO ( com indicador de fluorescência na faixa de 24 m).
Os solventes utilizados nas eluições cromatográficas foram: éter de petróleo
(Etp), hexano (Hex), acetato de etila (AcEt) e metanol (MeOH), puros ou combinados
em gradiente crescente de polaridade.
A revelação das substâncias cromatográficas em CCD se deu por exposição
das cromatoplacas analíticas à luz ultravioleta (UV), reveladas em um comprimento
de onda (254 nm) e por pulverização com revelador universal (mistura de
etanol:acido acético:ácido sulfúrico – 8:1:1), seguido de aquecimento em estufa à
100 0C por aproximadamente cinco minutos.
4. Materiais e métodos
51
4.3. Métodos espectroscópicos
Os espectros apresentados neste trabalho foram obtidos em aparelhos
pertencentes ao Instituto de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro e
Central Analítica da Universidade Federal do Ceará. Os modelos e condições dos
aparelhos para a caracterização das substâncias isoladas estão descritas abaixo.
4.3.1. Infravermelho (I.V.)
Os espectros de absorção na região do infravermelho foram registrados em
Espectrômetros Perkin-Elmer 720, utilizando-se para substâncias sólidas e líquidas
pastilhas de KBr e filmes, respectivamente.
4.3.2 Ressonância magnética nuclear de hidrogênio-1 (RMN 1H) e de carbono –
13
C (RMN 13C).
Os espectros de RMN unidimensionais e bidimensionais foram registrados em
espectromêtros Bruker AC – 200 e 500, operando a 200 e 500 MHz para hidrogênio
– 1 (RMN 1H) e 50 e 125 MHz para carbono –
13
C (RMN
13
C). As seqüências de
pulsos utilizadas nas experiências bidimensionais estão contidas nos programas
Bruker XHCORREAU, para correlação heteronuclear de hidrogênio – 1 e carbono –
13
C a uma ligação e a longa distância (1H x 13C – COSY, ‘JCH, n = 1, 2 e 3) e COSY –
UA, para correlação Homonuclear (1H x
1
H – COSY). Nos experimentos
unidimensionais de DEPT UA (ângulo de mutação 135 0). Os deslocamentos
químicos ( ) foram expressos em partes por milhão (ppm) e as multiplicidades dos
deslocamentos indicados segundo a convenção: s (silgleto), Sl (singleto largo), d
(dubleto), dd (duplo dubleto), t (tripleto), q (quarteto) e m (multipleto).
4. Materiais e métodos
52
4.3.3 Análise do Óleo essencial por Cromatografia Gasosa acoplado ao
Espectômetro de Massas (EM).
O óleo foi analisado utilizando um instrumento Heulett-Packard 5971 CG/EM
empregando as seguintes condições: Coluna: Dimetilpolisiloxano revestido com
sílica fusionada; Gás: Helio (1ml/min); temperatura do injetor: 250o C; temperatura
do detector: 200o C; temperatura da coluna: 35-180oC à 4oC/min então 180-250oC à
10oC/min: espectro de massas: impacto do elétron 70 eV. A identificação dos
constituintes foi feita por pesquisa no banco de dados do computador, índice de
retenção e interpretação visual dos espectros de massas (Adams, 2001).
4.4 Estudo dos metabólitos secundários das folhas de P. permucronatum
4.4.1 Obtenção dos óleos essenciais das folhas de P. permucronatum
As folhas frescas e trituradas (1,2 kg – folhas coletadas em 13/01/2005, 1,0
Kg coletadas em 02/10/2006) foram submetidas, em separadas, à extração com
arraste de vapor d’ água em aparato tipo Clevenger modificado. Os óleos essenciais
foram secos, utilizando-se sulfato de sódio anidro.
4.4.2 Obtenção do extrato das folhas de P. permucronatum
As folhas após terem sido extraídas o óleo essencial (folhas coletadas em
13/01/2005) foram secas á 60 0C, em estufa com ventilação e submetidas à extração
com hexano a temperatura ambiente (3 x 5 litros) por 5 dias. A destilação do
solvente sob pressão reduzida forneceu 8 g de extrato hexânico denominado EHF.
4.4.2.1 Tratamento cromatográfico de EHF
O extrato EHF (8 g) foi adsorvido em 35 g de gel de sílica, pulverizado em
grau de porcelana, adicionado sobre 50g de sílica em coluna cromatográfica e eluido
com uma mistura de hexano/acetato de etila em polaridade crescente. Foram
4. Materiais e métodos
53
coletadas 53 frações de 50 mL que foram concentradas por destilação do solvente
sob pressão reduzida.. As frações 6-9 (800mg) eluídas com hexano foram
analisadas em CCD e reunidas conforme o perfil cromatográfico semelhante para
recromatografia a qual permitiu isolar uma substância oleosa (56mg) eluída com
hexano/cloroformio (95%/5%) incolor denominada PPFH-7..
4.4.3. Obtenção do extrato hexânico dos frutos de P. permucronatum
Os frutos secos e triturados (44g) foram submetidas à extração com hexano a
temperatura ambiente (3 x 5 litros) por 7 dias. A destilação do solvente sob pressão
reduzida forneceu 3 g de extrato denominado EHFr.
4.4.3.1 Tratamento cromatográfico de EHFr
O extrato EHFr (3 g) foi adsorvido em 15 g de gel de sílica, pulverizado em
grau de porcelana, adicionado sobre 50 g de sílica em coluna cromatográfica e
eluido com uma mistura de hexano/acetato de etila em polaridade crescente. Foram
coletadas 43 frações de 50 mL que foram concentradas por destilação do solvente
sob pressão reduzida. A fração 9 (240 mg) eluída com Hex/AcEt (90-10%) foi
analisada em CCD e submetida a recromatografia. Desta foram obtidas 32 frações
sendo que as frações 20-25 (23 mg) eluídas com Hex/AcEt (98-2%) mostraram-se
conter um sólido amorfo de coloração branca denominado PPHFr-1.
As frações
27-32 (70 mg) eluídas com Hex/AcEt (90-10%) foram reunidas e novamente
submetidas à cromatografia em coluna de sílica gel e eluida com uma mistura de
Hex/AcEt em polaridade crescente, sendo possível obter-se 15 mg de um substância
denominada PPHFr-2
4. Materiais e métodos
54
4.5 Ensaios biológicos
4.5.1 Toxicidade em Artemia salina, Leach - (TAS)
Ovos de A. salina foram postos para eclodir em água do mar previamente
filtrada na presença de luz. As Artemias são coletadas após 48 horas da eclosão
para a realização dos experimentos. O ensaio TAS foi realizado com 10 larvas
(náuplios) por tratamento com 3 repetições para cada concentração testada. A
contagem dos animais mortos e vivos foi feita após 24 horas. Foram testadas as
concentrações iniciais de 1, 10, 100 e 1000 ppm. A partir daí foram feitas diluições
sucessivas a fim de determinar o CL50. Os extratos foram considerados ativos
quando o CL50 for < 1000 ppm. Utilizou-se a análise de regressão para a
determinação do CL50. Os dados foram analisados estatisticamente com o programa
Microcal Oringin versão 6.0.
4.5.2 Atividade Antioxidante
Para a determinação da atividade antioxidativa de compostos orgânicos ou
extratos, 2 ml de amostra em diferentes concentrações foram submetidos a uma
mistura reacional com o mesmo volume de solução metanólica (60
M) do radical
estável 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) conforme descrito por Hegazi e El
Hady (2002). A redução do DPPH é monitorada pela diminuição de sua absorvância
medida a 520nm após 30 minutos de reação. O resultado é a média de três
determinações. A porcentagem de seqüestro de radical livre é determinada pela
seguinte equação:
(%) = ((
Abs A
)
Abs DPPH
– 1 )
x 100
4. Materiais e métodos
55
Onde Abs A é absorvância da amostra na presença do radical e Abs DPPH é
a absorvância do radical DPPH sem amostra. Foram utilizados como controle
positivo os antioxidantes Acido 6-Hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico
(Trolox) e hidroxitolueno de butila (BHT).
3.5.3 Atividade Larvicida em Aedes aegypti.
Larvas de 3o ínstar de A. aegypti, oriundas de criações mantidas no
Laboratório de Entomologia do Núcleo de Doenças Endêmicas da Secretaria da
Saúde do Estado do Ceará (NUEND/SESA) foram separadas para a realização dos
bioensaios. O óleo essencial foi diluído em solução aquosa de dimetil sulfóxido 2%
(DMSO, Synth ACS) nas concentrações: 100, 50, 10, e 1,0 mg/ml. As larvas foram
separadas com o auxílio da pipeta de Pasteur distribuindo-se 50 larvas em copos de
plástico descartáveis (50 ml) contendo 20 ml das diluições. Como controle utilizou-se
água e DMSO 2%.
Após 24h de exposição das larvas aos tratamentos, o número de larvas
mortas foi registrado sendo consideradas mortas àquelas que não apresentavam
movimento ou não respondiam aos estímulos com a pipeta de Pasteur. Os testes
foram feitos em triplicatas a análise estatística feita por regressão linear para a
determinação do CL50.
4. Materiais e métodos
56
4.6 Obtenção E Cultivo de Leishmania amazonensis
4.6.1 Parasitas
Os parasitos utilizados neste trabalho foram a forma promastigotas de
Leishmania (Leishmania) amazonensis cepa IFLA/BR/67/PH8, cuja cultura original
foi cedida pelo prof. Dr. Francisco Juarez Ramalho-Pinto do Departamento de
Bioquímica e Imunologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP.
4.6.2 Criopreservação do Parasita.
Para
preservação
e
posterior
utilização,
as
promastigotas
eram
criopreservadas em meio de cultura de RPMI-1640 acrescidos de glicerina a 10%
(v/v). A glicerina foi adicionada gota a gota na cultura, sob agitação manual
constante. Após 30 min de agitação, alíquotas da cultura glicerinada eram
distribuídas em tubos de criopreservação de 1,8 ml (Nuclon-Delta, Nunc,
Dinamarca), mantidas por 24 horas a 20ºC em suporte de isopor, em seguida
transferida para deep-freezer (Bio Freezer, Forma Scientific, Marietta, Ohio, USA) a
80ºC, e finalmente conservadas em nitrogênio liquido (botijão modelo Omega EM32, MVE Cryogenics, New Prague, Minnesota, USA). Para recuperação das
promastigotas criopreservadas, o material é retirado do nitrogênio liquido e degelado
rapidamente em banho a 37ºC e inoculado em 10 ml de meio de cultura e mantidos
a 23ºC em estufa BOD (Quimis modelo Q-315M).
4.6.3 Meio de Cultura.
O meio de cultura utilizado para a propagação in vitro das promastigotas de L.
amazonensis é o meio de RPMI-1640 (Sigma Chemical Co St. Louis, MO, USA),
suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB) (Fetal Bovine Serum
Characterized, HyClone, Logan, Utah, USA). O meio é preparado segundo as
4. Materiais e métodos
57
instruções do fabricante, sendo adicionado sulfato de gentamicina (Sigma Chemical
Co) na concentração final de 50 mg/l. O meio é esterilizado por filtração em
membrana de nitrocelulose de poro 0,22 µm (Sartorius, Göttingern, Alemanha). O
SFB, previamente inativado a 56ºC por 30 min, é adicionado ao meio no momento
do uso.
4.6.4 Cultivo do Parasita
Como mencionado, para a propagação in vitro das promastigotas de L.
amazonensis, utiliza-se o meio de cultura de RPMI, suplementados com soro fetal
bovino a 10% (RPMI/SFB). Utiliza-se o inóculo de 5 x 105 promastigotas por ml.
Avalia-se o crescimento dos parasitos mantidos a 23ºC, por contagens de alíquotas
de 10 µl de cultura diluída 1:100 em PBS (NaCl 145 mM, Na2HPO4 9 mM,
NaH2PO4H2O
1mM,
pH
7,6).
Realiza-se
a
contagem
em
uma
câmera
hemocitométrica de Neubauer (C.A. Hausser & Son, Philadelphia, USA) em
microscópio óptico com aumento de 400 vezes, utiliza-se a média aritmética de duas
contagens para calcular o número de parasitas contido em 1,0 ml de cultura.
Utilizando a seguinte fórmula:
no de parasitas = média dos 4 quadrantes x inverso da diluição da
amostra x 104.
4.6.5 Curva de Crescimento
Avalia-se o crescimento dos parasitas no meio de cultura através de curvas
de crescimento. Diluíram-se alíquotas do meio de cultura em 1 ml de PBS gelado
(NaCl 145 mM, Na2HPO4 9mM, NaH2PO4H2O 1mM, pH 7,6). Acrescenta-se 100 L
do corante Eritrosina B (MERCK, Darmstadt, Alemanha) diluído a 0,4% (p/v). Após 5
minutos no gelo conta-se as promastigotas em câmara de Neubauer. Consideram-se
os parasitas corados de vermelho como mortos e os birrefringentes e móveis como
sendo os vivos. Para fins de cálculo considera-se apenas o número de parasitas
vivos.
4. Materiais e métodos
58
4.6.6 Avaliação da viabilidade das formas promastigotas de L. amazonensis
sob a ação dos extratos e isolados de P. permucronatum.
5x105 promastigotas/ml de L. amazonensis em início de fase estacionária de
crescimento foram lavadas duas vezes por centrifugação a 1000xg por 10 min em
PBS estéril e distribuídas em placas de 24 poços e incubadas com diferentes
concentrações dos extratos EHF e EHFr, bem como das substâncias isoladas
PPFH-7 e PPFr-1 diluídos em DMSO. As amostras foram incubadas por cinco dias a
24ºC e, no terceiro e no quinto dia de crescimento, alíquotas das culturas eram
diluídas em PBS gelado contendo o corante eritrosina B 0,04% (v/v) para contagem
do número de parasitas na cultura. O controle para determinar a morte dos parasitas
foi a Pentamidina (100 g/mL). E as culturas contendo o controle do solvente foram
incubadas com DMSO na maior concentração (10%).
4.6.7 Teste de Citotoxicidade em Macrófagos peritoneais de BALB/c
Para obtenção de macrófagos, os camundongos BALB/c foram inoculados por
via intraperitoneal com 2 mL de tioglicolato 3%. Após 4 dias, 5 mL de PBS gelado
foram injetados na cavidade peritoneal desses roedores e em seguida o líquido
peritoneal foi recolhido com seringa. O líquido foi então lavado 3 vezes por
centrifugação a 2000 rpm por 10 minutos em PBS estéril, contendo 50 mg/mL de
sulfato
de
gentamicina.
As
células
obtidas
foram
contadas
em
câmara
hemocitométrica tipo Neubauer. 1x105 células foram incubadas por 24 horas com os
extratos de P. permucronatum nas concentrações de 50 e 25
g/mL. Realiza-se
contagens de 100 células utilizando como corante diferencial o azul de tripan.
Utilizaram-se como controle positivo DMSO e como controle negativo apenas os
macrófagos em meio RPMI. Os resultados são expressos como o valor médio dos
experimentos feitos em duplicatas.
5.Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
73
5.3. Determinação estrutural de PPHFr-1 { Galbelgina }
A substância denominada PPHFr-1, isolada dos fruto de P. permucronatum,
apresentou-se como um sólido branco, com ponto de fusão 137-139 0C e solúvel em
clorofórmio.
A análise do espectro de massas (Figura 24, página 75) exibiu o pico íon
molecular 372 sugerindo a formula molecular de C22H28O5 cuja fragmentação indicou
a estrutura geral de uma neolignana contendo o anel tetraidrofurânico com pico base
característico m/z de 206 sugerindo com isso a substituição do anel aromático igual
a uma dimetoxifenila (Figura 25, página 75) (Barata 1976).
O espectro de RMN 1H (Figura 26, página 77) de PPHFr-1, exibiu absorções
em δ 4,66 (2H, d, J=7,0 Hz) na região de hidrogênios oxibenzilico, em δ 1,05 (6H, m)
de grupamentos metílicos ligados a átomos de carbonos terciários. Estes dados
sugerem a presença de um anel tetrahidrofurânico na molécula de PPHFr-1. Na
região de hidrogênio aromático observou-se absorções na faixa de δ 6,85 – 6,97 (m)
e absorções relacionadas a grupamentos metoxilas em δ 3,91 – 3,88 (singletos), que
pela integração pode ser relacionada a quatro destes grupamentos.
O espectro de RMN
13
C de PPHFr-1, confirmou a presença dos grupamentos
metoxilas através das absorções em δ 56,1. Os átomos de carbonos oxibenzílicos
absorveram em δ 88,2, os grupamentos metilas ligados a átomos de carbonos
terciários absorveram em δ 13,8.
A análise comparativa entre os espectros de RMN
13
C – BB com o RMN 13C –
DEPT 135 (figura 27, página 78), revelou que as absorções em δ 148,5; 149,0 e
134,9 são de átomos de carbonos aromáticos não-hidrogenados.
Todos estes dados permitiram propor para PPHFr-1 a estrutura de uma
neoliganana tetrahidrofurânica [18]. Com relação à estereoquímica do anel furânico
foi possível determinar através da comparação dos deslocamentos químicos dos
hidrogênios oxibenzilicos H-7 e H-7’ e dos hidogênios H-8 e H-8’ (tabela 6, página
84), a semelhança com a estereoquímica relativa da galbelgina e, principalmente a
partir dos dados do espectro bidimensional NOESY (Figura 30, página 81). Esta
substância já foi isolada em outras espécies de Piper, P. futokadsura, P. attenuarum,
P. thomsoni e P. wightii (Parmar et. al., 1997), porém esta é a primeira vez que a
mesma foi identificada em P. permucronatum.
5.Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
74
Através dos dados de RMN bidimensional, HMQC (figura 28, página 79) e
HMBC (Figura 29, página 80), foi possível atribuir os deslocamentos químicos dos
átomos de hidrogênios e dos átomos de carbonos, bem como, os acoplamentos a
longa distância (2J e 3J) para PPHFr-1 e comparar estes dados com os dados
descritos na literatura para a Galbegina (tabela 6, página 76) (Sumathykutty e Rao,
1991; Barata, 1996).
9'
9
6
5
8
1
7
4
H3CO
3
2
OCH3
6'
8'
O
5'
1'
Ou enanciômero
7'
2'
3'
4'
OCH3
OCH3
Correlações a partir do espectro bidimensional NOESY
Figura 23. Estrutura da Galbelgina2, semelhante à proposta estrutural
atribuída para PPHFr-1 [18]. As setas indicam as correlações
bidimensionais homonucleares de 1H utilizando a técnica NOESY.
As absorções, neste caso, são de Hidrogênios que estão no
mesmo plano da molécula.
2
Nomenclatura IUPAC: Rel -(7 , 7’ , 8 , 8’ ) 3,3’,4,4’ tetrametoxi-7,7’-epoxilignana.
5.Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
75
Figura 24. Espectro de massas de PPHFr-1 exibindo o pico base de m/z 206.
H3CO
O
H3CO
H3CO
OCH3
H3CO
OCH3
H3CO
+
H3CO
O
O
OCH3
OCH3
OCH3
OCH3
C13H18O2
206,1
Figura 25. Proposta de fragmentação responsável pelo pico base m/z 206 de
PPHFr-1.
5.Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
76
Tabela 6. Atribuições dos dados de RMN 1H e
13
C para PPHFr-1 e comparação
destes dados com dados da literatura para a Galbegina.
PPHFr-1
C
δC
δH
1/’1
134,9
-
Galbelgina
2
3
JCH
δC*
H-5/H-5’; H-8/H-8’
135,3
JCH
H-2/H-2’;
δH**
H-6/H-6’
3/3’
149.0
-
-
H-5/H-5’; MeO-3’/MeO-3’
149,5
4/4’
148,5
-
-
H-2/H-2’; H-6/H-6’; MeO-
148,9
4/MeO-4’
CH
2/2’
109,2
6,97 (m)
-
H-6/H-6’; H-7/H-7’
109,9
6,82 (d)
5/5
110,9
6,85 (m)
-
-
111,5
6,74 (d)
6/6’
118,6
6,94 (m)
H-5/H-5’
H-2/H-2’; H-7/H-7’
118,8
6,74 (d)
7/7’
88,2
4,66 (d, J=7,0 Hz)
H-8/H-8’
3H-9/3H-9’
88,3
4,52 (d) J=9 Hz
8/8’
50,8
1,80 (m)
H-7/H-7’;
-
51,1
1,7 (m)
3H-9/3H-9
CH3
9/9’
13,8
1,05
H-8/H-8’
H-7/H-7’
14
1,04 (d) J=6 Hz
MeO-3/3’
56,1
3,91(s)
-
-
56,1
3,84 (s)
MeO-4/4’
56,1
3,88(s)
-
-
56,1
3,80 (s)
* Sumathykutty e Rao, 1991; ** Barata, 1976.
5.Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
Figura 26. Espectro de RMN 1H (CDCl3 , 100 MHz) de PPHFr-1.
77
5.Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
Figura 27. Espectro de RMN 13C – DEPT 135 (CDCl3 , 100 MHz) de PPHFr-1.
78
5.Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
Figura 28. Espectro de HMQC (CDCl3 , 100 MHz) de PPHFr-1.
79
5.Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
Figura 29. Espectro HMBC (CDCl3 , 100 MHz) de PPHFr-1.
80
5.Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
Figura 30. Espectro NOESY (CDCl3 , 100 MHz) de PPHFr-1.
81
5.Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
78
Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
82
5.4. Determinação estrutural de PPHFr-2 { Veraguensina }
A substância denominada PPHFr-2, isolada dos fruto de P. permucronatum,
apresentou-se como um sólido branco, ponto de fusãp 127-129 0C, solúvel em
clorofórmio.
O espectro de RMN 1H (Figura 32, página 85) de PPHFr-2, exibiu absorções
na região de hidrogênios oxibenzilico em δ 4,66 (2H, d, J=9,1 Hz) e δ 5,18 (1H, d,
J=8,9 Hz), em δ 0,72 (3H, d, J=6,2 Hz) e δ 1,10 (3H, d, J= 5,8 Hz) de grupamentos
metílicos ligados a átomos de carbonos terciários, estes dados sugerem a presença
de um anel tetrahidrofurânico na molécula de PPHFr-2. Na região de hidrogênio
aromático observou-se absorções na faixa de δ 6,90 – 7,12 (m) e absorções
relacionadas a grupamentos metoxilas em δ 3,90 – 3,95, que pela integração pode
ser relacionada a quatro destes grupamentos.
O espectro de RMN
13
C (Figura 33, página 86) de PPHFr-2, confirmou a
presença dos grupamentos metoxilas através das absorções em δ 56,9. Os átomos
de carbonos oxibenzílicos absorveram em δ 87,4 e δ 83,2, os grupamentos metilas
ligados a átomos de carbonos terciários absorveram em δ 15,2.
A análise comparativa entre os espectros de RMN
13
C – BB com o RMN 13C –
DEPT 135 (Figura 36, Pág 89), revelou que as absorções em δ 148,9; 148,5; 148,0;
133,7 e 133,4 são de átomos de carbonos aromáticos não-hidrogenados.
Todos estes dados permitiram propor para PPFr- 2 a estrutura de uma
neoliganana tetrahidrofurânica [19] com grandes semelhanças da neoliganana
tetrahidrofurânica denominada de PPHFr-1. Com relação à estereoquimica relativa
do anel furânico foi possível determinar através da comparação dos deslocamentos
químicos dos hidrogênios oxibenzilicos H-7 e H-7’ e dos hidrogênios H-8 e H-8’
(Tabela 7, Página 84), a semelhança com a estereoquímica da veraguensina, já
isolada em outras espécies de Piper, P. futokadsura, P. cuneifolium e P. puberculum
(Parmar et al., 1997), porém esta é a primeira vez que a mesma foi identificada em
P. permucronatum.
Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
83
Ainda sobre a estereoquímica segundo Barata (1976), o deslocamento em
campo alto dos hidrogênios da metila C9’ indica que esta é protegida pelo anel
aromático que está em posição cis, enquanto que a os hidrogênios da outra metila
C9 ocupa uma posição trans em relação ao anel aromático e por isso está menos
protegido pela nuvem eletrônica deste. Os carbonos 7, 7’ e 8, 8’ são afetados pela
orientação destas metilas refletindo em um deslocamento químico diferencial
também para os hidrogênios destes carbonos.
Através dos dados de RMN bidimensional, HMQC (figura 34, página 87) e
HMBC (Figura 35, página 88), foi possível atribuir os deslocamentos químicos dos
átomos de hidrogênios e dos átomos de carbonos, bem como, os acoplamentos a
longa distância (2J e 3J) para PPHFr-2 e comparar estes dados com os dados
descritos na literatura para a Veraguensina (tabela 7, página 84) (Barata, 1976;
Fonseca, 1980).
9'
9
8'
8
6
5
1
4
H3CO
3
2
7'
7
H
OCH3
O
6'
5'
1'
ou enanciômero
H
2'
3'
4'
OCH3
OCH3
[19]
Figura 31. Estrutura da Veraguensina3 , semelhante à proposta estrutural atribuída
para PPFr- 7.
3
Nomenclatura IUPAC: Rel -(7 , 7’ , 8 , 8’ ) 3,3’,4,4’-tetrametoxi-7,7’-epoxilignana
Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
84
Tabela 7. Atribuições dos dados de RMN 1H e
13
C para PPFr-2 e comparação
destes dados com dados da literatura para a Veraguensina.
PPFr-2
δC
δH
1
133,4
-
1’
133,7
3
Veraguensina
2
3
JCH
δC*
δH**
H-2; H-6
H-5;H-8
133,2
-
-
H-2’;H-6’
H-5’;H-8’
133,6
-
148,1
-
-
H-5; MeO-3
148,3
-
3’
148,9
-
-
H-5’; MeO-3’
148,7
-
4
148,5
-
-
H-2; H-6; OMe-4
148,3
-
4’
148,5
-
-
H-2’; H-6’; OMe-4’
147,8
-
2
109,2
7,0 (m)
-
H-6; H-7
109,7
7,0
2’
109,9
-
-
H-6’; H-7’
110,5
-
5
111,2
6,85 (m)
-
-
110,8
6,86
5’
110,6
-
-
-
110,5
-
6
118,1
6,94 (m)
H-5
H-2; H-7; 3H-9
118,1
6,96
6’
119,6
-
H-5’
H-2’; H-7’; 3H-9’
118,4
-
7
87,4
4,46 (d, J=7,0 Hz)
H-8
3H-9
87,1
4,4 (d, J=9)
7’
83,2
5,18
H-8’
3H-9’
82,8
5,12 (d, J=8)
8
47,8
1,80 (m)
H-7;3H-9
-
47,8
1,8
8’
45,9
2,27 (m)
H-7’;3H-9’
-
45,9
2,25 (q)
9
14,9
1,07
14,9
1,07
9’
14,9
0,69
H-8/H-91
H-7/H-7’
14,9
0,66
MeO-3/3’
56,1
3,91(s)
-
-
55,7
3,85
MeO-4/4’
56,1
3,88(s)
-
-
55,7
3,85
JCH
C
CH
CH3
*Fonseca, 1980; **Barata, 1976
Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
1,1
0,7
1,8
2,3
H3CO
4,4
5,2
OCH3
O
H3CO
OCH3
Figura 32. Espectro d e RMN 1H (CDCl3 , 500 MHz) de PPHFr-2.
85
Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
14,9
14,9
47,89
H3CO
109,9
148,1
148,5
H3CO
110,6
83,24
45,94
87,47 110,3
133,7
O 133,4
119,2
118,6
OCH3
148,9
148,5
111,2
OCH3
Figura 33. Espectro de RMN 13C (CDCl3 , 500 MHz) de PPHFr-2.
86
Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
Figura 34. Espectro HMQC (CDCl3 , 500 MHz) de PPHFr-2.
87
Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
Figura 35. Espectro HMBC (CDCl3 , 500 MHz) de PPHFr-2.
88
Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
Figura 36. Espectro DEPT 13C (CDCl3 , 500 MHz) de PPHFr-2.
89
Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
86
Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
90
5.5. Determinação estrutural de PPFH – 7 {8-carvotacetona acetato}
A substância denominada PPFH – 7 isolada das folhas e frutos de P.
permucronatum, apresentou-se na forma de um óleo incolor, solúvel em clorofórmio.
O espectro de RMN 1H (Figura 38, página 92) de PPFH – 5 apresentou
absorções em δ 6,72 (1H, ddd, J=5,2; 2,2; 1,5 Hz) de um átomo de hidrogênio
olefínico, em δ 1,42 (3H, s), δ 1,72 (6H, s) e δ 1,93 (1H, s) de quatro grupamentos
metilas.
O espectro na região do infravermelho (Figura 39, página 93) de PPFH – 7,
exibiu bandas de absorção relacionadas a dois grupamento carbonilas, uma em
1675 cm-1 de carbonila conjugada e a outra em 1736 cm-1.
O espectro de massas de PPFH – 5, exibiu o pico [M+ - 60], compatível com a
saída de um fragmento neutro com fórmula C2H4O2 relacionada a uma molécula de
ácido acético. Isto sugere a presença de um grupamento acetato como parte da
molécula de PPFH – 5, e ainda, fórmula molecular C12H18O3.
O espectro de RMN
13
C de PPFH – 7 apresentou duas absorções
relacionadas a átomos de carbonos olefínicos em, δ 144,6 e δ 135,2. Duas
absorções, δ 199,8 e 170,2, relacionadas a átomos de carbonos de grupamentos
carbonilicos, sendo uma de carbonila de uma função éster (δ 170,2).
A análise comparativa entre os espectros de RMN
13
C – BB com o RMN
13
C
– DEPT 135 (figura 41, página 95), revelou que a ligação dupla carbono – carbono é
do tipo trisubstituída, esta dedução foi feita através da absorção δ 144,6 de um CH
olefinico. Duas absorções no espectro de RMN
13
C - DEPT-135 em 30,1 e δ 28,9
podem ser relacionadas a dois átomos de carbonos dihidrogenados (CH2).
Todos estes dados sugeriam propor a estrutura [18] (Figura 37, página 91)
para PPFH–7, trata-se de um monoterpeno naturalmente acetilado, já identificado
em Elettaria cardamomum (Zingiberaceae) e nomeado 8-Acetoxicarvotanacetone
(Noleau et. al., 1987), sendo esta a primeira vez que foi identificado em P.
permucronatm. Os dados de RMN 1H e 13C dos átomos de hidrogênio e carbonos de
PPFH – 7 estão relacionados na tabela 8, página 91.
Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
Tabela 8. Dados de RMN 1H e
91
13
C dos átomos de hidrogênio e carbonos de PPFH –
5
1
2
JCH (1)
3
JCH (2)
C
δC
1
199,8
-
H-6
H-3; H-5; 3H-12
2
135,2
-
3H-12
H-5
8
82,9
-
H-4
H-5; 6H-6 e 9
11
170,2
-
3H-11
-
3
144,6
6,72 (1H, ddd, J=5,2; 2,2; 1,5 Hz)
-
3H-12
5
44,1
2,32 (1H, m)
H-3
H-6
4
27,4
2,23 (1H, m)
H-6
-
6
39,5
2,53 (2H, dt, J=9,8; 2,7 Hz)
H-5
-
7
15,5
1,72 (3H, s)
10
23,0
1,42 (3H, s)
H-5
-
9
23,2
1,42 (3H, s)
-
-
12
22,2
1,93 (1H, s)
-
-
JCH
CH
CH2
CH3
H-3
(1) e (2) Estes dados foram obtidos através do espectro de RMN
(Figura 39, página 94).
O
6
7
1
2
10
5
3
O
12
4
8
11
9
O
Figura 37. Estrutura proposta para PPFH – 7
[18]
13
C bidimencional
Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
Figura 38. Espectro de RMN 1H (CDCl3 , 100 MHz) de PPFH-7.
92
Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
Figura 39. Espectro de Infravermelho de PPHF-7.
93
Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
Figura 40. Espectro HMBC (CDCl3 , 100 MHz) de PPFH-7.
94
Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
Figura 41. Espectro de RMN 13C -APT (CDCl3 , 100 MHz) de PPFH-5.
95
Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
96
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO I: Estudo Fitoquímico
5.1. Introdução
As análises dos óleos essenciais de espécies de Piper revelaram a presença de
monoterpenos, sesquiterpenos e fenillpropanoides (apiol, dilapiol, myristicina, safrol,
asaricina) os quais têm mostrado interessantes atividades biológicas (Parmar et al.,
1997). Em recente registro na literatura sobre o estudo fitoquímico de P.
permucronatum, revelou a presença de óleo essencial extraído das folhas em um
espécime coletado na Floresta da Tijuca no Estado do Rio de Janeiro em 1995
(Torquilho et al., 1999). O resultado desta pesquisa demonstrou a presença de trinta e
três constituintes químicos, sendo que os majoritários foram o β-cariofileno (6,80 %), muroleno (7,40 %) e δ – cadineno (12,70 %) (Torquilho et al., 1999).
Neste trabalho foi investigado o óleo essencial das folhas de P. permucronatum
em datas de coletas diferentes, porém na mesma localidade (município de Porto Velho).
Na primeira, as folhas foram coletadas em 13/01/2005, e foram identificados quatro
fenilpropanoides. Na segunda coleta, em 02/10/2006, foram identificados quinze
constituintes químicos, cinco monoterpenos, três sesquiterpenos, um hidrocarboneto e
seis fenilpropanoides.
Não foi encontrado nenhum registro na literatura sobre o estudo fitoquímico dos
constituintes fixos de P. permucronatum, porém existem vários registros descrevendo a
identificação de lignanas e neolignanas de outras espécies de Piper (Parmar et al.,
1997; Martins et al., 2000; Pessine et al., 2005). Neste estudo, foram isoladas três
substâncias dos extratos hexânico das folhas e frutos de P. permucronatum. Do extrato
hexânico dos frutos foram isolados e identificados um monoterpeno acetilado e duas
neoliganas furânicas. Do extrato hexânico das folhas foi também isolado o monoterpeno
acetilado.
5. Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
61
5.2. Identificação dos Compostos Químicos dos Óleos Essenciais das folhas de P.
permucronatum
Os óleos essenciais das folhas de P. permucronatum foram extraídos com o
auxilio de um sistema de arraste com vapor d’água, e analisado pelo processo de
cromatografia gás-liquído acoplado a um espectrômetro de massa com auxilio de um
computador. O cromatograma do óleo essencial extraído em 02/10/2006 (Figura 12,
página 63) apresentou dois constituintes majoritários, o primeiro com abundância
relativa de 41,77 % (TR 21,371 min) e o segundo com abundância relativa de 37,30 %
(TR 27,911 min.). Quanto ao óleo essencial extraído em 13/01/2005 o cromatograma
(Figura 13, página 63) apresentou quatro constituintes, o primeiro com abundância
relativa de 8,55 %, (TR 11,45 min), o segundo 25,61 % (TR 11,89 min), o terceiro 9,92
% (TR 12,33 min) e o quarto 54,70 % (TR 13,53 min).
A identificação dos constituintes químicos dos óleos essenciais foi feita por
comparação dos espectros de massa de cada substância com padrões arquivados na
espectroteca do computador, da comparação visual dos espectros de massas com
espectros de catálogos e observação dos índices de Kovats, além de Espectroscopia
de Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H) e de Carbono – 13 (RMN
13
C). Com isto foi possível identificar, no óleo essencial extraído em 02/10/2006, quinze
constituintes químicos, cinco monoterpenos, três sesquiterpenos, um hidrocarboneto e
seis fenilpropanoides. Os fenilpropanoides, safrol [13] 41,77% e asaricina [14] 37,67%,
foram os constituintes majoritários no óleo. Na tabela 4 (página 67), encontra-se a
relação de todos os constituintes químicos identificados com os respectivos Índices de
Kovats (IK) e abundância relativa. Os espectros de massas de [13] e [14] estão
representados na figura 14 e 15, pagina 64.
Foram identificados os quatro constituintes químicos do óleo essencial, extraído
em 13/01/2005, são todos fenilpropanoides, asaricina [14] 8,55%, miristicina [15]
25,61%, elemicina [16] 9,92% e dilapiol [17] 54,70%. Na tabela 4, encontra-se a
relação de todos os constituintes químicos identificados com os respectivos Índices de
Kovats (IK) e abundância relativa. Os espectros de massas de [15], [16] e [17] estão
representados nas figuras 16, 18 e 17, respectivamente (páginas 65 e 66).
5. Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
62
Com o objetivo de garantir uma maior certeza da constituição dos componentes
do óleo essencial extraído em 13/01/2005, e levando em consideração a quantidade de
constituintes, foram obtidos espectros de Ressonância Magnética Nuclear – RMN de
1
H e de 13C desse óleo.
O espectro de RMN 1H (figura 20, pagina 68) do óleo essencial apresentou
absorções na faixa de δ 3,27 - 3,30 (seta 1) dos hidrogênios olefinicos H-7 dos quatro
constituintes, em δ 3,87; 3,86 e 3,76 (setas 2 e 3), absorções relacionadas aos
grupamentos metoxilas, em δ 5,00 – 5,08 (seta 4) correspondentes aos hidrogênios da
ligação dupla terminal do grupamento alila dos quatro constituintes, em δ 5,88 – 5,93
(seta 5) correlacionados aos hidrogênios do grupamento metilenodioxido da asaricina
[14], miristicina [15] e dilapiol [17], bem como aos hidrogênios da H-8 dos quatro
constituintes. Outras absorções, na faixa de δ 6,52 – 6,75 (seta 6), dos hidrogênios dos
anéis aromático dos quatro constituintes.
O espectro de RMN
13
C (Figura 21, página 69) do óleo essencial, confirmou a
presença dos grupamentos alilas dos quatro constituintes, através das absorções em δ
31,5; 33,9; 39,8 e 39,9 (C-7) (setas 1 e 2), em δ 137,5 e 137,2 (C-8) (seta 8 e 9), em δ
115,2 e 115,6 (C-9) (setas 6 e 7). Os grupamentos metilenodioxido foram confirmados
através das absorções em δ 100,7 e 100,9 (seta 4).
A análise comparativa entre os espectros de RMN
13
C – BB com o RMN
13
C–
DEPT 135 (figura 22, pág 71), confirmou as afirmações citadas acima através das
absorções em δ 40,3 (seta 1); δ 34,3 (seta 2); δ 101,3 e 101,8 (seta 3); δ 115,6 e 116,6
(seta 4).
Todos estes dados e a comparação dos dados de RMN
com os dados de RMN
13
C do óleo essencial
13
C da asaricina [14], miristicina [15], elemicina [16] e dilapiol
[17] descritos na literatura (Benevides et. al., 1999; Jayasinghe et. al., 2003; Moreira et.
al., 1998) (tabela 5, pág 71), confirmaram a constituição do óleo essencial.
5. Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
Figura 12. Cromatograma do óleo essencial extraído em 02/10/2006.
Figura 13. Cromatograma do óleo essencial extraído em 13/01/2005.
63
5. Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
Figura 14. Espectro de massas do safrol [13]
OCH3
O
O
Figura 15. Espectro de massas da asaricina [14]
64
5. Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
OCH3
O
O
Asaricin
OCH3
O
Figura 16. Espectro de massas da miristicina [15]
O
Asaricin
OCH3
H3CO
OCH3
Figura 17. Espectro de massas da elemicina [17]
OCH3
OCH3
O
O
Figura 18. Espectro de massas do dilapiol [16]
65
5. Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
66
9
9
8
8
7
7
1
2
6
1
R1
3
5
4
O
2
6
3
5
R2
H3CO
O
[13] R1 = R2 = H
4
OCH3
OCH3
[17]
[14] R1 =H; R2 = OCH3
[15] R1 = OCH3; R2 = H
[16] R1= R2 = OCH3
Figura 19. Estruturas dos fenilpropanóides identificados nos óleos essenciais
das folhas de P. permucronatum.
5. Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
67
Tabela 4. Relação dos constituintes químicos identificados nos óleos essenciais
extraídos das folhas de P. permucronatum, com os IK e os percentuais.
Componentes N0
1
OE-13/01/2005 (%)
2
OE-02/10/2006 (%)
IK
β-Pineno
-
<1
979
Limoneno
-
1,81
1029
1,8-Cineol
-
1,28
1031
-
<1
1060
Linalol
-
1,44
1097
Safrol
-
41,77
1287
α-Cubebeno
-
<1
1351
Metil – eugenol
-
<1
1404
(E)-Cariofileno
-
<1
1419
β-Gurjuneno
-
<1
1434
8,55
37,30
1496
-
<1
1500
Miristicina
25,61
-
1519
Elemicina
9,92
1,30
1557
(E) – Assarona
-
1,23
1676
(Z) – Assarona
-
1,5
1617
54,70
-
1621
-Terpineno
Asaricina
Pentadecano
Dilapiol
1
OE-13/01/2005=Óleo essencial extraído em 13/01/2005
2
OE-02/10/2006=Óleo essencial extraído em 02/10/2006
5. Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
1.2623
1.2554
1.2408
1.0546
1.0218
1.0047
0.8336
3.8717
3.8616
3.7613
6.7501
6.7299
6.6845
6.6807
6.6479
6.5229
5.9332
5.9212
5.9167
5.8909
5.8864
5.8808
5.0878
5.0833
5.0638
5.0600
5.0499
5.0455
5.0417
5.0379
5.0341
5.0309
5.0095
5.0057
5.0025
PROTON CDCl3 u UNIR 26
3.3086
3.2959
3.2922
3.2833
3.2795
68
*** Current Data Parameters ***
NAME
:
desftpp
EXPNO
:
1
PROCNO
:
1
*** Acquisition Parameters ***
Seta 2
Seta 5
Seta 3
Seta 6
Seta 1
Seta 4
BF1
: 400.1300000 MHz
BF2
: 400.1300000 MHz
BF3
: 400.1300000 MHz
CPDPRG
:
D[1]
:
DATE_t
:
DATE_d
: May 09 2006
NS
:
16
NUC1
:
1H
O1
:
2470.97 Hz
O2
:
2470.97 Hz
P[1]
:
PROBHD
: 5 mm DUL 13C-1H-D Z3756/0186
PULPROG
:
RG
: 114.0000000
SFO1
: 400.1324710 MHz
SFO2
: 400.1324710 MHz
SFO3
: 400.1324710 MHz
SOLVENT
:
SW
:
SW_h
:
8278.146 Hz
TD
:
65536
TE
:
300.0 K
1.0000000 sec
04:46:02
7.6 usec
zg30
CDCl3
20.6885 ppm
*** Processing Parameters ***
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
(ppm)
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
GB
:
LB
:
SI
:
0.0000000
0.30 Hz
32768
*** 1D NMR Plot Parameters ***
1
SOLVENT
:
Figura 20. Espectro de RMN H (CDCl3, 400MHz) do óleo essencial extraído em 13/01/2005
?
39.9106
39.8088
33.9606
31.4875
56.5676
55.7820
C13CPD CDCl3 u UNIR 26
69
121.2971
120.7370
120.3806
115.6817
115.2380
111.8048
111.1865
109.6590
109.0916
108.1606
100.9377
100.7995
94.8714
152.0652
147.6136
146.2607
145.8025
140.9218
137.5976
137.2194
133.8589
132.6224
5. Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
*** Current Data Parameters ***
NAME
:
desftpp
EXPNO
:
15
PROCNO
:
1
*** Acquisition Parameters ***
Setas 6 e 7
Setas 1 e 2
Setas 8 e 9
Seta 4
Seta 3
BF1
: 100.6127290 MHz
BF2
: 400.1300000 MHz
BF3
: 100.6127290 MHz
CPDPRG
:
waltz16
D[1]
:
2.0000000 sec
DATE_t
:
DATE_d
: May 09 2006
NS
:
512
NUC1
:
13C
O1
:
10060.79 Hz
O2
:
1600.52 Hz
P[1]
:
PROBHD
: 5 mm DUL 13C-1H-D Z3756/0186
PULPROG
:
RG
:32768.0000000
SFO1
: 100.6227898 MHz
SFO2
: 400.1316005 MHz
SFO3
: 100.6227898 MHz
SOLVENT
:
SW
:
SW_h
:
23980.815 Hz
TD
:
65536
TE
:
300.0 K
05:10:29
10.5 usec
zgpg30
CDCl3
238.3239 ppm
*** Processing Parameters ***
150
140
130
120
110
100
90
80
(ppm)
70
60
50
40
30
20
10
0
GB
:
LB
:
SI
:
0.0000000
1.00 Hz
32768
*** 1D NMR Plot Parameters ***
Figura 21. Espectro de RMN
13
SOLVENT
:
C (CDCl3, 100 MHz) do óleo essencial extraído em 13/01/2005
?
34.3591
40.3090
56.9660
70
95.2698
101.3362
101.1834
110.0574
109.4901
108.5590
116.0801
115.6364
C13DEPT135 CDCl3 u UNIR 26
121.6955
137.9961
137.6179
5. Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
*** Current Data Parameters ***
NAME
:
desftpp
EXPNO
:
16
PROCNO
:
1
*** Acquisition Parameters ***
Seta 2
Seta 4
Seta 3
Seta 1
BF1
: 100.6127290 MHz
BF2
: 400.1300000 MHz
BF3
: 100.6127290 MHz
CPDPRG
:
waltz16
D[1]
:
2.0000000 sec
DATE_t
:
DATE_d
: May 09 2006
NS
:
256
NUC1
:
13C
O1
:
10060.79 Hz
O2
:
1600.52 Hz
P[1]
:
PROBHD
: 5 mm DUL 13C-1H-D Z3756/0186
PULPROG
:
RG
:46341.0000000
SFO1
: 100.6227898 MHz
SFO2
: 400.1316005 MHz
SFO3
: 100.6227898 MHz
SOLVENT
:
SW
:
SW_h
:
23980.815 Hz
TD
:
65536
TE
:
300.0 K
05:22:13
10.5 usec
dept135
CDCl3
238.3239 ppm
*** Processing Parameters ***
150
140
130
120
110
100
90
80
(ppm)
70
60
50
40
30
20
10
GB
:
LB
:
SI
:
0.0000000
1.00 Hz
32768
*** 1D NMR Plot Parameters ***
SOLVENT
:
?
Figura 22. Espectro de RMN 13C – DEPT-135 (CDCl3, 100 MHz) do óleo essencial extraído em 13/01/2005
5. Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
Tabela 5. Comparação dos dados de RMN
RMN
13
71
13
C do óleo essencial com os dados de
C da asaricina [14], miristicina [15], elemicina [16] e dilapiol [17]
descritos na literatura.
Carbono
Dilapiol*
Miristicina*
Elemicina**
Asaricina+
O. Essencial
1
126,0
126,0
130,8
120,5
120,7
2
135,1
104,9
105,5
151,9
152
3
137,6
137,6
153,2
94,6
137,6; 94,8
4
144,6
144,5
135,8
146,1
146,2
5
144,3
144,3
153,2
140,8
140,9; 152; 145,8
6
102
102,7
105,5
109,4
109,4
7
33,9
33,8
40,5
33,8
33,9; 39,9
8
137,4
137,3
137,2
137,0
137,2;
9
115,5
115,5
116,0
114,9
115,2; 115,6
OCH2O
101,1
101,0
-
100,7
100,7; 100,9
OCH3 -2
61,3
-
-
56,3
56,5
OCH3 -3
50,9
51,0
56,1
-
56,5
OCH3 -4
-
-
60,9
-
-
OCH3 -5
-
-
56,1
-
56,5
* Benevides et. al., 1999 (50 MHz); + Moreira et. al., 1998 (100 MHz);
** Jayasinghe et. al., 2003 (50,2 MHz)
É fato observar que a biossíntese de Metabólitos Secundários pode variar de
acordo com a idade da planta, clima local ou por diversidade intraespecífica. Em
termos de variação anual foi constatado em 8 espécies de Piper um aumento dos
sesquiterpenos oxigenados após 3 anos de coletas consecutivas inclusive com
variações intraespecífica (Mesquita et. al., 2004). Outra espécie que, assim como P.
permucronatum, apresenta Dilapiol como componente majoritário é P. aduncum.
Entretanto, existem trabalhos em que essa espécie apresenta quimiotipos diferentes
de acordo com a localização geográfica. O óleo de P. aduncum coletado no Panamá
foi
caracterizado
contendo
uma
alta
porcentagem
de
sesquiterpenos
hidrocarbonetos (38,9%). Em contraste, o óleo extraído da mesma espécie coletada
na Bolívia apresentou um alto conteúdo de monoterpenos (76%). Fenilpropanóides
5. Resultados e Discussão I: Estudo Fitoquímico
72
foram encontrados apenas no óleo extraído da espécie coletada na Bolívia
(asaricina 12,9%) (Vila et. al., 2005).
P. guineense também apresentou polimorfismo químico. O óleo essencial
extraído de espécie coletado na Nigéria não apresentou o fenilpropanóide miristicina
comumente encontrado em P. guineense (Oyedeji et.al., 2005).
Alguns trabalhos tentam relacionar os diferentes quemótipos a algum fator
genético que opere a biossíntese de fenilpropanóides nos óleos essenciais. Isto foi
feito nas espécies P. aduncum, P. hispidinervium e P. lanceofolium (Mundina et. al.,
2001; Wadt et. al.2004).
No primeiro caso, os estudos de diversidade genética de P. aduncum (rico em
dilapiol) e P. hispidinervum (rico em safrol) baseados em nove marcadores RAPD
demonstraram que as espécies coletadas em diferentes regiões do estado do Acre
apresentaram polimorfismo genético. Entretanto, a composição do óleo não variou
significativamente (Wadt et. al.2004).
No caso de P. lanceofolium a análise multivariada do óleo permitiu distinguir 3
grupos bem definidos de óleo essencial com base na concentração de
fenilpropanóides (elemicina, dillapiol e apiol) presentes nesta espécie. Como cada
grupo apresenta indivíduos coletados em diferentes regiões, logo, tal variabilidade
não poderia ser explicada com base na sua localização geográfica (Mundina et. al.,
2001).
6. RESULTADOS E DISCUSSÕES II: Ensaios Biológicos
6.1 Introdução
Nos últimos anos tem-se aumentado os estudos sobre a atividade biológica
de diversas espécies do gênero Piper revelando um grande potencial terapêutico. As
atividades antimicrobiana e parasiticida são as mais estudadas as quais tem sido
relacionada a compostos pertencentes às classes das lignanas, neolignanas e
amidas isoladas neste gênero. Entretanto o estudo da atividade biológica de Piper
ainda está aquém do desejado para a grande maioria de suas espécies.
Neste trabalho foi realizado, pela primeira vez, o estudo da atividade biológica
de P. permucronatum a qual pode estar relacionada com a presença de neolignanas
e fenilpropanóides aqui identificados pela primeira vez nesta espécie.
6.2 Atividade Larvicida do óleo essencial de P. permucronatum.
O óleo essencial obtido das folhas de P. permucronatum em 13/01/2005
apresentou uma grande atividade larvicida frente ao Aedes aegypti com um CL
50
de
36 g/mL estimado a partir da análise de regressão dos resultados obtidos pelo teste
larvicida (Figura 42, abaixo; e Tabela 9, página 98)
Concentração versus letalidade
Ajuste Linear
40
30
20
o
Letalidade (n de Artemias mortas)
50
10
0
20
25
30
35
40
45
50
Concentração (ppm)
Y= -40,6569 + 1,8248X, R=0,99, p=<0,0001
Figura 42. Regressão Linear dos resultados do teste larvicida em Aedes aegypti do
Óleo essencial extraído em jan. de 2005 de P. permucronatum.
6. Resultados e Discussão II: Ensaios biológicos
98
Tabela 9. Teste larvicida em Aedes aegypti do Óleo essencial extraído em jan. de
2005 de P. permucronatum.
o
Concentrações de EEF
(ppm)
N de Artemia mortas + Desvio Padrão
(média)
50
30
28
26
25
24
50 + 0,0
16 + 3,5
12 + 0,5
6 + 0,5
4 + 0,5
2 + 1,0
Teste realizado em triplicatas com p = 0,0001
De quatro espécies de Piper em que foi feito o teste larvicida, P.
permucronatum foi o mais ativo seguido de P. hostmanianum (CL
gaudichaudianum (CL
50
121 g/mL) e P. humaytanum (CL
50
50
54 g/mL), P.
156 g/mL)1. A alta
atividade larvicida de P. permucronatum pode estar relacionada com a alta
concentração de arilpropanóides em especial de Dilapiol. Esta substância é um
reconhecido sinergista e vários derivativos têm sido preparados a partir desta com o
objetivo de potencializar esse efeito sobre Aedes. Nesse caso o efeito sinérgico foi
associado à cadeia alila ligado ao anel benzênico de Dilapiol (Belzile et.al., 2000).
Entretanto, outros autores atribuem a atividade sinérgica de compostos com
estrutura do tipo metilenodioxifenil através de um mecanismo inibitório do citocromo
P450 pelo grupo metilenodioxido (Hodgson, et. al.1995).
Este segundo mecanismo pode ser corroborado por outro importante
composto sinérgico que é a Miristicina, o segundo maior componente químico
encontrado no óleo essencial de P. permucronatum. Ele foi considerado grande
inibidor de CYP6D1, uma isoforma do citocromo P450 de insetos o qual está
relacionado à resistência de insetos a piretroides (Scott et. al., 2000).
Os citocromos p450 são uma super família de monooxigenases que catalizam
reações de oxigenação estéreo e regioespecíficas, hidroxilações aromáticas e
alifáticas entre outras reações que tornam moléculas hidrofóbicas mais solúveis para
excreção funcionando, portanto como uma defesa química da célula (Voet, 2002).
Em vegetais, os citocromos p450 catalizam a maioria das oxidações no metabolismo
secundário entre os quais se encontra a biossíntese de fenilpropanóides cuja enzima
1
Trabalho submetido à Revista Bioresource Tecnology.
6. Resultados e Discussão II: Ensaios biológicos
99
cinamato-4-hidroxilase (C4H) tem um papel chave convertendo ácido trans-cinâmico
em p-cumárico (Chen e Morgan, 2005).
Miristicina e elemicina são encontradas no óleo essencial de Myristica
fragrans utilizada como codimento alimentar. Foram relatados casos recentes de
intoxicação por Myristica fragans em doses acima de 5 mg/kg (Sangalli, Sangali e
Chiang, 2000). Diante disso vários estudos tentam avaliar a toxicidade destes
compostos. No que tange a elemicina, os dados toxicológicos não são conclusivos
quanto ao potencial risco à saúde que este composto possa oferecer (Vicenzi,
Vicenzi e Silano, 2004). Quanto à miristicina, esta inibiu a formação de tumor
induzido por benzo- -pirona (Zheng et. al. 1992a) e foi hepato protetivo, atividade
esta atribuída a inibição da liberação de TNF- (Morita et. al., 2003) além de induzir
a atividade de Glutationa-S-transferase (Zheng et. al. 1992b). Entretanto, miristicina
exibiu atividade neurotóxica através de um mecanismo indutor de apoptose pela
liberação do citocromo c e ativação da caspase-3 (Lee et. al. 2005) e em alguns
casos tem sido observado a formação de adducts de DNA sugerindo uma possível
ação carcinogênica. Estruturas relacionadas à miristicina como estragol e safrol, tem
induzido a formação de carcinomas hepáticos em camundongos bem como a
formação de adducts de DNA (National Toxicology Program).
Em um estudo relacionando o potencial antiplaquetário com a porcentagem
de fenilpropanóides em 23 óleos essenciais foi demonstrada a existência de boa
correlação (r=0,91; p=0,01) entre esses constituintes químicos e a atividade
biológica específica. Muitos dos constituintes identificados compartilham a presença
de um anel fenil conectado a uma cadeia propilênica tais como miristicina, elemicina,
dilapiol, asaricina e safrol (Tognolini et. al. 2006). Isto sugere que a o óleo essencial
de P. permucronatum coletado na Amazônia possa ter atividade antiplaquetária
dado a grande porcentagem de fenilpropanóides.
6. Resultados e Discussão II: Ensaios biológicos
100
6.3 Ensaios Biológicos com Extratos e substâncias isoladas.
6.3.1 Avaliação da toxicidade sobre Artemia salina - TAS
Com o intuito de avaliar o potencial biológico de P. permucronatum os
extratos éter de petróleo das folhas e hexânico dos frutos foram submetidos a um
teste de toxicidade sobre Artemia salina. Os resultados foram analisados a partir de
um modelo de regressão linear (Figuras 43 e 44, página 101 e 102) com o objetivo
de descrever a relação existente entre as variáveis concentração e letalidade. Desde
que o valor médio da variável letalidade seja uma função linear da concentração
utilizada no experimento pode-se predizer a CL
50
a partir deste modelo interpolando
os valores de concentração versus letalidade em um gráfico obtendo desta forma o
modelo preditor. Para isto foram utilizados os valores das tabelas 10 e 11.
Tabela 10. Teste de toxicidade sobre Artemia salina do Extrato Hexânico dos Frutos
(EHFr) de P. permucronatum.
o
Concentrações de EHFr
(ppm)
N de Artemia mortas + Desvio Padrão
(média)
15
14
13
10
2
10+ 0,0
8+ 0,0
7+ 0,0
6+ 0,0
0+ 0,0
Teste realizado em triplicatas com P = 0,00204.
6. Resultados e Discussão II: Ensaios biológicos
16
Concentração X Letalidade
Ajuste Linear
14
Concentração (ppm)
101
12
10
8
6
4
2
0
0
2
4
6
8
10
o
Letalidade (n de mortos)
Y = -1,42238 + 0,70578X, R = 0,98574
Figura 43. Regressão linear dos resultados do teste de toxicidade em Artemia salina
Extrato Hexânico dos Frutos (EHFr) de P. permucronatum
Tabela 11. Teste de toxicidade sobre Artemia salina do Extrato Hexânico das Folhas
(EEF) de P. permucronatum.
o
Concentrações de EEF
(ppm)
N de Artemia mortas + Desvio Padrão
(média)
40
30
25
20
15
10+ 0,0
8+ 0,0
7+ 0,0
6+ 0,0
5+ 0,0
Teste realizado em triplicatas com P = 0,0001
6. Resultados e Discussão II: Ensaios biológicos
Concentração X Letalidade
Ajuste Linear
40
Concentração (ppm)
102
30
20
10
0
0
2
4
6
8
10
o
Letalidade (N de mortos)
Y = 0,51001 + 0,25145X, R = 0,98545
Figura 44. Regressão linear dos resultados do teste de toxicidade em Artemia salina
Extrato Hexânico das Folhas (EEF) de P. permucronatum
Os extratos testados apresentaram alta toxicidade frente a Artemia salina. O
mais ativo foi o extrato hexânico dos frutos com CL 50 de 9,1 ppm enquanto o extrato
hexânico das folhas mostrou um CL
50
de 17,87 ppm. A partir destes resultados
foram selecionados estes extratos para uma posterior avaliação da atividade
Leishmanicida.
6.3.2 Atividade inibitória do crescimento das formas Promastigotas de
Leishmania amazonensis in vitro.
Neste estudo sobre a inibição de crescimento de L. amazonensis determinouse a atividade leishmanicida para os extratos hexânico dos frutos e das folhas de P.
permucronatum. Foram utilizados como controle positivo a Pentamidina que é um
medicamento de 2a escolha utilizada no tratamento da leishmaniose quando o
parasito não responde mais ao tratamento com glucantime, e o DMSO utilizado
como agente solubilizante das amostras. A forma promastigota de L. amazonensis
não é capaz de suportar um volume de DMSO acima de 1,6% do volume total
utilizado no meio de cultura conforme descrito na literatura (Alves et. al. 2003).
6. Resultados e Discussão II: Ensaios biológicos
103
O controle utilizando o DMSO a 10%, que corresponde ao volume de DMSO
adicionado junto com a maior concentração testada (100
g/ml), foi tóxico ao
parasito obtendo grande inibição em seu crescimento (85%). Na concentração de
100
g/ml de EHFr, entretanto, não foram detectados parasitos vivos utilizando
eritrosina como corante diferencial nas contagens das promastigotas em câmara de
Neubauer. Mesmo na concentração de 50 g/ml, EHFr obteve uma maior atividade
inibitória do crescimento de L. amazonensis do que o controle com DMSO a 10% e
com um volume adicionado de DMSO 2 vezes menor. A figura 45, nesta página,
mostra a inibição do crescimento de L. amazonensis em diferentes concentrações
Promastigotas
de EHFr.
10
Controle
DMSO 10%
1
100 µg/mL
2
50 µg/mL
3
25 µg/mL
4
12,5 µg/mL
5
6,25 µg/mL
100µg/mL Pentamidina
6
1:DMSO 10%
2:DMSO 5%
3:DMSO 2,5%
4:DMSO 1,25%
5:DMSO 0,65%
10
5
1
2
3
4
5
Tempo (Dias)
Figura 45. Inibição de crescimento de Leishmania amazonensis em diferentes
concentrações do extrato hexânico dos frutos de Piper permucronatum.
Já o extrato hexânico das folhas (Figura 46, página 104) apresentou um efeito
inibitório menos pronunciado. Apenas a concentração de 100 g/ml apresentou uma
alta inibição do crescimento de L. amazonensis (88,3%) fato este que pode ser
atribuído ao DMSO utilizado como agente solubilizante dos extratos que nesta
concentração é tóxica ao parasito.
6. Resultados e Discussão II: Ensaios biológicos
104
As substâncias isoladas PPHFr-1 e PPHF-7 foram submetidas também ao
teste de inibição de crescimento de L. amazonensis. Apenas PPHFr-1 demonstrou
atividade inibitória (Figura 47, nesta página).
7
10
6
Controle
DMSO 10%
1
100 µg/mL
2
50 µg/mL
3
25 µg/mL
4
12,5 µg/mL
5
6,25 µg/mL
100 µg/mL Pentamidina
Promastigotas. mL
-1
10
1:DMSO 10%
2:DMSO 5%
3:DMSO 2,5%
4:DMSO 1,25%
5:DMSO 0,65%
10
5
1
2
3
4
5
Tempo (dias)
Figura 46. Inibição de crescimento de L. amazonensis em diferentes concentrações
Promastigotas.mL
do extrato hexânico das folhas de P. permucronatum.
10
10
Controle
DMSO 10%
DMSO 2,4%
1
100 µg/mL
2
50 µg/mL
3
25 µg/mL
4
12,5 µg/mL
5
6,25 µg/mL
6
3 µg/mL
6
1:DMSO 10%
2:DMSO 5%
3:DMSO 2,5%
4:DMSO 1,25%
5:DMSO 0,65%
5
1
2
3
4
5
Tempo (Dias)
Figura 47. Inibição de crescimento de L. amazonensis em diferentes concentrações
de PPHFr-1.
6. Resultados e Discussão II: Ensaios biológicos
105
Tabela 12. Porcentagem de inibição de crescimento de L. amazonensis em
diferentes concentrações de EHF, EHFr e PPHFr-1.
Tratamentos
EHF (%)
EHFr (%)
PPHFr-1
Controle
0,0
0,0
0,0
DMSO 10%
85,9
85,9
98
100 ug/mL
88,3
100
98,6
50 ug/mL
56,3
95,1
91,3
25 ug/mL
37,3
53
97,1
12,5 ug/mL
12,8
35
76,9
6,25 ug/mL
0,0
35
56,53
3 ug/mL
-
-
71,1
A Figura 48, na página 106, e tabela x, nesta página, comparam as
porcentagens de inibição de crescimento de L. amazonensis dos extratos de P.
permucronatum bem como de PPHFr-1. Pode-se observar a melhor atividade de
Extrato Hexânico dos Frutos (EHFr) em relação ao Extrato Hexânico das Folhas
(EHF) principalmente nas concentrações de 6,25
g/mL e 50
g/mL onde a
porcentagem de inibição de crescimento foi de 35% e 95,1%, respectivamente, para
EHFr e 0% e 56%, respectivamente, para EHF.
A substância isolada PPHFr-1, Galbelgina, mostrou a maior atividade. Na
concentração de 12
g/mL obteve 76,9% de inibição de crescimento. Nesta
concentração, o DMSO não ultrapassa 1,25% do volume total no meio de cultura,
portanto, sem apresentar toxicidade nas promastigotas de L. amazonensis.
Entretanto, é necessário relatar que os resultados de PPHFr-1 são representativos
de um único experimento.
O Interessante é que a substância PPHFr-1 na maior concentração testada
(100
g/ml) não foi apta em causar a total mortalidade das promastigotas de L.
amazonensis tal qual foi observado em relação ao EHFr na mesma concentração.
Isto sugere que outros metabólitos possam estar agindo em sinergia no extrato
hexânico dos frutos de P. permucronatum.
6. Resultados e Discussão II: Ensaios biológicos
106
EHFr
EHF
PPHFr-1
Inibição de Crescimento (%)
100
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Concentração (ug/mL)
Figura 48. Porcentagem de Inibição de crescimento de Leishmania amazonensis
pelos extratos dos frutos e das folhas de P. permucronatum e do isolado
PPHFr-1 em função da concentração.
6.3.3 Teste de toxicidade em Macrófagos
Um importante critério na pesquisa de compostos ativos com potencial
terapêutico contra L. amazonensis, é determinar a ausência de efeitos tóxicos nas
células do hospedeiro. O teste de viabilidade celular em macrófagos retirados de
camundosngos BALB/c foi realizado para definir se os extratos realmente
apresentam uma atividade exclusivamente leishmanicida em vez de ser fruto de uma
toxicidade celular. Para isso os extratos e DMSO foram testados nas concentrações
de 50 e 25 μg/mL (Figura 49, nesta página). Os extratos testados, o DMSO e o
controle foram submetidos à análise de variância - ANOVA (p=0,03) e não
apresentaram diferenças significativas entre si determinando deste modo que os
extratos e DMSO nas concentrações testadas não comprometeram a viabilidade
celular dos macrófagos após 24 horas de incubação, não apresentando, portanto,
toxicidade em células de mamíferos.
6. Resultados e Discussão II: Ensaios biológicos
107
Controle
50 µg/mL
25 µg/mL
% de Macrófagos vivos
100
80
60
40
20
0
1
2
3
4
Tratamentos
1 = DMSO; 2 = EHF; 3 = EHFr
Figura 49. Teste de citotoxicidade em macrófagos peritoneais de camundongos
BALB/c.
A análise de regressão (Figuras 50, 51 e 52; página 108 e 109) feita a partir
dos resultados do teste de inibição de crescimento de L. amazonensis permitiu
estimar o IC50 do EHF, EHFr e PPHFr-1 como sendo de 50,3 g/mL, 22,5 g/mL e
8,6
g/mL, respectivamente. Considera-se, portanto, que ambos os extratos se
mostraram ativos, pois o IC50 foi inferior a 100 g/mL. O IC
50
de EHFr está muito
próximo da fração hexânica de Piper regnellii (Miq.) C. DC. var. pallescens (C. DC.)
Yunck que obteve IC50 = 21,5
g/mL seguido pela fração clorofórmica (IC50 = 32
g/mL) (Nakamura et. al., 2006). As neolignanas eupomatenoide-5, eupomatenoide6 e conocarpan foram isolados como principais componentes ativos desta espécie
apresentando IC50 = 7 g/mL, 7,5 g/mL e 8 g/mL, respectivamente (Vendrametto
et. al. 2006; Luize et. al. 2006) valores também muito próximo ao obtido por PPHFr-1
o que sugere que as neolignanas ou uma mistura delas possa ser responsável pela
atividade do extrato hexânico dos frutos e folhas.
O gênero Piper é conhecido pela biossíntese de amidas isobutílicas de longa
cadeia com potencial inseticida (pipericida), com diversas ações farmacológicas
6. Resultados e Discussão II: Ensaios biológicos
108
(piperina) e microbicidas (aduncamida) (Boll et. al., 1994; Parmar et.al.,1997).
Destas, piperina (5mg/kg) foi avaliada em camundongos BALB/c infectados com L.
donovani e conseguiu reduzir a carga parasitária no fígado e baço em 38% e 31%,
respectivamente. Sua encapsulação em nano esferas de lipídeos contendo
estearilamina obteve redução da carga parasitária de 90% e 85% , respectivamente
(Veerareddy et. al., 2004).
Estudos preliminares feitos com o extrato éter de petróleo das folhas de P.
alatabacum avaliados contra L. amazonensis apresentou atividade inibitória de
crescimento (LC50 = 36,2 g/mL) (Alpirez, 2006). As amidas piplartina, piperovatina,
N-(3’,4’,5’- Trimetoxidihidrocinnamoil-D3-piridin-2-ona e a flavona 5,5’,7-Trimetoxi3’,4’-metilenodioxiflavona foram previamente isoladas das folhas desta planta
(Facundo et. al., 2005).
8
Concentração X Letalidade
Ajuste Linear
6
5
Promastigotas x 10 . mL
-1
7
5
4
3
2
1
0
0
20
40
60
80
100
Concentração mcg/mL
Y = 7,41757-0,06897.X, R = - 0,97799, p = 0,003
Figura 50. Regressão linear dos resultados do teste Inibição de crescimento de
Leishmania amazonensis pelo Extrato Hexânico das Folhas (EEF) de P.
permucronatum
6. Resultados e Discussão II: Ensaios biológicos
109
9
Concentração x Letalidade
Ajuste Linear
7
6
6
Promastigotas x 10 . mL
-1
8
5
4
3
2
1
0
0
10
20
30
40
50
Concentração (mcg/mL)
Y = 6,95636 - 0,13357.X, R = - 0,96835, p = 0,006
Figura 51. Regressão linear dos resultados do teste Inibição de crescimento de
Leishmania amazonensis pelo Extrato Hexânico dos Frutos (EHFr) de P.
Promastigotas.mL
-1
permucronatum.
7x10
6
6x10
6
5x10
6
4x10
6
3x10
6
2x10
6
1x10
6
Concentração x Letalidade
Ajuste linear
0
0
5
10
15
20
25
Concentração (ug/mL)
Y=55,462-2,4383X, R=-0,90, p=0,09
Figura 52. Regressão linear dos resultados do teste Inibição de crescimento de
Leishmania amazonensis por PPHFr-1 isolada de P. permucronatum.
6. Resultados e Discussão II: Ensaios biológicos
110
O melhor resultado contra L. amazonensis é atribuída à espécie P. aduncum.
O extrato diclorometano das inflorescências diminuiu significativamente a viabilidade
das formas promastigotas (IC50 = 2,2 g/mL). O fracionamento bioguiado permitiu a
purificação de 2’,6’-Dihidroxi-4’-Metoxichalcona como princípio ativo o qual exibiu
atividade contra as formas amastigotas (ED50 = 24
g/mL) (Torres-Santos et. al.,
1999a). Da mesma forma, dihidrochalconas foram isoladas de P. elongatum e se
mostraram ativas contra L. brasiliensis, L. tropica e L.infantum (Hermoso et. al.,
2003).
Além das chalconas isoladas de Piper, muitos outros produtos naturais de
estruturas moleculares diversas têm demonstrado potencial leishmanicida como é o
caso dos alcalóides berberina, chimanina, dioncofilina e da quinona plumbagina
(Kaiser et. al., 2003).
Em uma investigação do potencial leishmanicida de auronas foi determinado
que esta depende de um padrão de oxigenação de seus substituintes. Estruturas
com limitado número de substituintes oxigenados apresentaram as maiores
atividades sugerindo uma natureza lipofílica desejável para estes tipos de
compostos (Kaiser e Kiderlen, 1999).
Isso faz sentido desde que o composto se difunda através de uma série de
membranas até alcançar o parasito dentro do fagossoma do macrófago infectado.
Entretanto, extratos mais polares podem revelar a presença de saponinas
triterpênicas pentacíclicas com potente atividade leishmanicida (IC50 variando de 20
ng/mL a 15 g/mL) e, portanto, com diferente mecanismo de ação (Mandal et. al.,
2005; Germonprez et. al., 2004).
Sobre a classe das Lignanas estas apresentam importantes atividades
biológicas (Gottlieb, 1988). Lopes et. al. (1998) demonstrou que a neolignana
Veraguensina, isolada de Virola surinamensis, foi ativa in vitro contra as formas
tripomastigotas de Trypanossoma cruzi sem apresentar citotoxicidade em eritrócitos
com potência 50 vezes maior do que a droga de referência. Leishmania sp. e
Trypanossoma sp pertencem à mesma família Tripanossomatidae e por isso
guardam relações filogenéticas muito próximas que podem refletir na avaliação da
atividade parasiticida de produtos naturais de origem vegetal.
6. Resultados e Discussão II: Ensaios biológicos
111
De 11 derivados preparados com estrutura do tipo 2,5-diaril e 2-arilfuranos
avaliados contra T. cruzi uma apresentou 65% de inibição das formas amastigotas a
qual difere de Veraguensina apenas por não conter metilas ligadas ao anel furânico
(Oliveira et. al., 2006).
Filho et. al. (2004) ao estudar a atividade em T. cruzi de lignanas
Tetraidrofurânicas com diferentes padrões de substituição e estereoquímica relativa
definiu que a atividade é dependente de ambas, sendo que a hidroxilação do anel
aromático diminui a atividade e a presença do grupamento metilenodioxido aumenta.
Neste estudo as estruturas relacionadas com a Veraguensina apresentaram IC50 de
12 M.
6.3.4. Atividade Leishmanicida e sua possível correlação com TAS.
Diversos autores têm utilizado o teste TAS como um pré-screnning de baixo
custo visando diversas atividades como, por exemplo, a atividade larvicida,
moluscicida e antiplasmodial (Luna et. al., 2005; Cheng et. al., 2003; Wanyoike et.
al., 2005). O teste TAS tem apresentado boa correlação com as atividades
antitumoral (in vitro) e toxicidade oral aguda (in vivo) (Arcanjo et. al. 2006; Parra et.
al., 2001). Embora alguns trabalhos tentem correlacionar a atividade tripanocida com
TAS poucos são os trabalhos realizados relacionando este teste com a atividade
leishmanicida (Siqueira et. al. 1998). Para isto foi realizada a análise de regressão
dos dados obtidos através do teste de inibição de crescimento de Leishmania para
fins de comparação entre os IC50 da atividade leishmanicida e TAS. Os valores dos
IC50 de ambos os testes se encontram na tabela 12 na página 112. Pode-se notar
que o teste TAS foi sensível o bastante para determinar uma atividade biológica
duas vezes maior para EHFr em relação a EEF fato este que foi posteriormente
confirmado pelo teste de inibição de crescimento de L. amazonensis. Isto indica que
Artemia salina pode ser utilizado como organismo-alvo na prática fitoquímica com o
objetivo de um fracionamento de extratos vegetais guiado por bioatividade visando a
atividade leishmanicida.
6. Resultados e Discussão II: Ensaios biológicos
112
Estes resultados vão de encontro ao de Chan-bacab et. al. (2003) que
concluiu que o teste TAS não deve ser um teste confiável para detecção de
atividade leishmanicida em extratos de plantas uma vez que o extrato metanólico
das raízes de Urechites andrieuxii se mostrou ativo contra A. salina (IC50 = 253,76)
e pouco ativo contra L. brasiliensis, L. amazonensis e L. donovani (Inibição de
crescimento de 15%) enquanto o extrato das folhas desta mesma planta obteve
resultado inverso. Os diferentes resultados entre o trabalho de Chan-bacab et. al
(2003) o de P. permucronatum entretanto, podem ser atribuídos a diferenças
metodológicas.
Tabela 13. Valores da concentração inibitória de 50% e seus respectivos intervalos
com 95% de confiança das atividades Leishmanicida, toxicidade em
Artemia salina e citotoxicidade de Piper permucronatum, Yuncker.
Extratos
IC50 ( g/ml) + IC 95%
L. amazonensis
TAS
Citotoxidade
EHF
50,3 (49,6 – 51,0)
17,85 (17,06 - 18,63)
>50
EHFr
22,5 (17,51 – 27,45)
9,1 (8,45 – 9,74)
>50
EHF: extrato hexânico das folhas; EHFr: extrato hexânico dos frutos;
6.3.5 Atividade Antioxidante de Veraguensina e 8-carvotacetona acetato.
Com o objetivo de avaliar a atividade antioxidante dos isolados de P.
permucronatum, foi feito o teste de redução do radical livre DPPH na presença de
uma amostra de diferentes concentrações do monoterpeno 8-carvotacetona acetato
e da neolignana veraguensina isolados do extrato hexânico das folhas e frutos de P.
permucronatum. Na concentração de 1 mg/ml a Veraguensina obteve uma atividade
moderada com 57% de seqüestro de radical resultado próximo ao antioxidante BHT
(64%) utilizado como aditivo pelas indústrias de alimentos, cosméticos e
farmacêuticas. Nas concentrações de 0,5 e de 0,25 mg/ml a atividade diminuiu para
44,74 e 30,7% de seqüestro de radical enquanto que para BHT foram de 62% e
48,6%, respectivamente. Já o monoterpeno obteve fraca atividade antioxidante com
34,65% de seqüestro de radical na concentração de 1 mg/ml enquanto nas
6. Resultados e Discussão II: Ensaios biológicos
113
concentrações de 0,5 e de 0,25 mg/ml a atividade diminuiu para 24,56 e 22,37% ,
respectivamente (Figura 53 e Tabela 13, páginas 113 e 114). Trolox, que é
conhecido por prevenir o estresse oxidativo mediado por peroxinitrito, foi o
antioxidante mais efetivo. Em todas as concentrações testadas obteve 95% de
Porcentagem de sequestro de DPPH
seqüestro de radical.
100
Trolox
BHT
Carvotaceto
Veraguensina
80
60
40
20
0
1
2
3
Concentração
1 = 1mg/mL; 2 = 0,5 mg/mL; 3 = 0,25 mg/mL
Figura
53.
Porcentagem
de
atividade
antioxidante
dos
isolados
de
P.
permucronatum em comparação com Trolox e BHT.
As lignanas/neolignanas estão entre os compostos com maiores atividades
antioxidantes ao lado dos taninos e flavonóides. Entretanto, tal atividade depende de
um padrão de hidroxilação dos anéis aromáticos o que acaba por acrescentar um
caráter ácido e, portanto, doador de H à molécula. Substâncias que têm OH
fenólicas em posição
orto geralmente apresentam as maiores atividades
antioxidantes (Torres et. al., 2003). Lignanas com estrutura do tipo catecol (3,4
dihidroxifenil) apresentaram a maior atividade antioxidante em um estudo
relacionando a estrutura com a atividade antioxidante, o que suporta o padrão de
hidroxilação em posição orto (Eklund et. al., 2005).
6. Resultados e Discussão II: Ensaios biológicos
114
Tabela 14. Atividade de sequestro de radical livre dos metabólitos isolados de P.
permucronatum.
Concentração ( mg.mL-1)
Compostos
1.0
0.5
0.25
Absorvância
%
Absorvância
%
Absorvância
%
Controle
0.228
00.00
0.228
00.00
0.228
00.00
Trolox
0.010
95.60
0.010
95.60
0.010
95.60
BHT
0.082
64.00
0.087
62.00
0.117
48.60
PPF-7
0.149
34.65
0.172
24.56
0.177
22.37
PPHFr-2
0.098
57.02
0.126
44.74
0.158
30.70
Veraguensina por não apresentar OH fenólica apresentou uma atividade de
seqüestro de radical não tão pronunciada sendo apenas moderada na maior
concentração testada. Entretanto, a lignana sesamina, que não apresenta tal padrão
de hidroxilação em seus anéis aromáticos, não demonstrou atividade antioxidante in
vitro contra radicais O2-, OH, DPPH e TBARS. Mas os estudos in vivo indicaram sua
metabolização no fígado de ratos com o padrão 3,4-dihidroxifenil presente após 24
horas de administração oral da droga. Os metabolitos formados (2-{3,4metilenodioxifenil}-6-{3,4-dihidroxifenil}-cis-dioxabiciclo
octano
e
2-{3,4-
dihidroxiphenil}-6-{3,4-dihidroxifenil}-cis-dioxabiciclo octano exibiram alta atividade
antioxidante e sesamina pode ser considerada uma pró-droga (Kiso, 2004; Nakai et.
Al., 2003).
Diferentes resultados antioxidantes entre testes in vitro e testes in vivo sugere
uma falta de correlação entre estes diferentes tipos de testes.
Este é um dos
maiores problemas ao se avaliar a atividade antioxidante em extratos e isolados de
plantas. Aliado a isto, o número de testes e variações nos métodos de avaliação de
antioxidantes tem aumentado assustadoramente (340%) levando a uma falta de
padronização (Prior et. al., 2005; Gaulejac et. al., 1999).
Desmarchelier (2006) tem atribuído, ao menos em parte, as propriedades
terapêuticas de plantas medicinais, à capacidade de seqüestro de radicais livres os
quais estão envolvidas em muitas doenças. Diferentes extratos de 70 plantas
medicinais da América do Sul foram submetidos a um screnning para atividade
antioxidativa. Descobriu-se que as plantas que foram aptas como antioxidantes eram
6. Resultados e Discussão II: Ensaios biológicos
115
utilizadas contra desordens inflamatórias sugerindo uma possível correlação entre
estas duas atividades.
O extrato etanólico das folhas de P. betel demostrou alta atividade
antioxidante sobre DPPH. O tratamento cromatográfico permitiu o isolamento dos
fenilpropanóides chavibetol e alilpirocatecol como constituintes majoritários os quais
se mostraram aptos em prevenir a peroxidação lipídica e o dano induzido por raios
gama no DNA (Rathee et. al., 2006). Em outro estudo, Williams et. al. (2002)
verificou que a atividade antiinflamatória de fenilpropanóides de P. betel depende, de
novo, de OH ligado anel aromático o que suporta a hipótese de que a atividade
antioxidativa e antiinflamatória estão correlacionadas.
Neolignanas do tipo tetrahidrofurânica, tais quais as isoladas de P.
permucronatum, tem demonstrado atividade neuroprotetora que, novamente foi
relacionada à presença de OH fenólica (Zhai et. al. 2005).
Galbelgina apresentou atividade neuroprotetora e hepatoprotetora os quais
foram relacionados com a capacidade antioxidativa (Young et. Al. 2000). Três
compostos com atividade anti-PAF (fator ativador plaquetário) tem sido encontrados
nos talos de P. futokadsura e identificados como sendo galgravina, galbelgina e
Veraguensina (Chen et. al. 1993). O fator ativador plaquetário está envolvido em
diversas desordens inflamatórias, cardiovasculares e respiratórias (Foster, 2002).
8-carvotacetona acetato junto com outros derivativos de carvona foram ativos
ao induzir em diferentes tecidos de camundongos a enzima detoxificante GlutationaS-transferase (GST) a qual tem importante papel na prevenção do câncer ao
promover a eliminação de xenobióticos (Zheng; Kenney e Lam, 1992c). Isto sugere
que P. permucronatum tenha propriedades quimiopreventiva do câncer e antitumoral
uma vez que consta na literatura disponível que tanto miristicina como 8carvotacetona acetato apresentaram atividade indutora de Glutationa-S-Transferase,
além disso, o teste de toxicidade em Artemia salina apresenta boa correlação com a
atividade antitumoral.
7. CONCLUSÃO_________________________________________
Neste estudo sobre a fitoquímica de P. permucronatum foram
identificados quatro constituintes químicos do óleo essencial extraído em
13/01/2005, sendo eles a asaricina (8,55 %), miristicina (25,61 %), elemicina
(9,92 %) e dilapiol (54,70 %). Já o óleo essencial extraído em 02/10/2006,
apresentou
quinze
sesquiterpenos,
constituintes
um
químicos,
hidrocarboneto
e
cinco
seis
monoterpenos,
três
fenilpropanoides.
Os
fenilpropanoides, safrol (41,77%) e asaricina (37,67%), foram os constituintes
majoritários neste óleo.
Neste trabalho foram identificados pela primeira vez as neolignanas
tetrahidrofurânicas galbelgina e veraguensina na espécie Piper permucronatum
(Parmar et al., 1997). O monoterpeno acetilado 8-carvotacetona acetato
apenas foi identificado na natureza em Elettaria cardamomum (Zingiberaceae)
sendo identificada pela segunda vez como um produto natural em P.
permucronatum e pela primeira vez é identificada na família Piperaceae.
De acordo com os resultados obtidos sobre a atividade biológica do óleo
essencial das folhas de P. permucronatum extraído em 13/01/2005 conclui-se
que este apresentou uma grande atividade larvicida frente ao Aedes aegypti
com um IC
50
de 36
g/mL fato este associado a alta concentração dos
componentes sinergistas Dilapiol e Miristicina. Este resultado abre a
perspectiva de que o óleo essencial de P. permucronatum possa ser utilizado
no controle mais eficaz da dengue.
Sobre os extratos hexânicos das folhas e frutos estes demonstraram alta
letalidade sobre Artemia salina com LC50 de 17,8 e 9,1 g/mL, respectivamente.
A avaliação de inibição de crescimento das formas promastigotas de
Leishmania amazonensis demonstrou que ambos os extratos foram novamente
ativos apresentando o IC50 para o extrato dos frutos de 22,5 g/mL, enquanto
para o extrato das folhas o IC50 foi de 50
g/mL. A avaliação da toxicidade
celular frente a macrófagos peritonais de camundongos BALB/c demonstrou
Conclusão
117
que os referidos extratos não comprometeram a viabilidade das células do
hospedeiro.
Das substâncias isoladas Galbelgina demonstrou interessante atividade
inibitória do crescimento de L. amazonensis com IC50 8,6 g/mL sugerindo que
as neolignanas podem ser os metabólitos responsáveis pelas bioatividades
apresentadas pelos extratos de P. permucronatum. Estes resultados abrem a
perspectiva de que P. permucronatum possa ser utilizado no tratamento da
leishmaniose cutânea entretanto, é necessária a realização de experimentos in
vitro contra as formas amastigotas bem como experimentos in vivo para
assegurar sua eficácia.
Veraguensina e 8-carvotacetona acetato demonstraram capacidade
antioxidativa ao diminuir a absorvância do radical livre DPPH a 520nm.
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS___________________________
ABDO, M.G.; Elamin, W.M.; Khalil, E.A.G.; Mukhtar, M.M. Antimony-resistant
Leishmania donovani in eastern Sudan: incidence and in vitro correlation. Eastern
Mediterranean Health Journal, Vol. 9, No. 4, Pág. 837-846, 2003.
ALÉCIO, A. C.; Bolzani, V. S.; Young, M. C. M., Kato, M. J., Furlan, M. Antifungal
Amide from Leaves of Piper hispidum. Journal of Natural Products, Vol. 61, Pág.
637-639, 1998.
ALPIREZ, I. P. V. Atividade inseticida e leishmanicida de Piper alatabacum Trel
& Yuncker (Piperaceae). Monografia.
ALVES, L. V.; DO CANTO-CAVALHEIRO, M. M.; CYSNE-FINKELSTEIN, L.; LEON,
L.; In Vitro Antiproliferative Effects of Several Diaryl Derivatives on Leishmania
spp. Biological and Pharmaceutical Bullettin, Vol. 26(4), Pág. 453—456, 2003.
ANDRADE, E. H. A.; Guimarães, E.F.; Maia, J.G.S.; Bastos, C.N. Óleos essenciais
de Piper humaytanum. In: Anais XLVI Congresso Brasileiro de Química, 2006,
Salvador.
ANDRADE, E. H. A.; Guimarães, E.F.; Maia, J.G.S.; Bastos, C.N. Constituintes
químicos do Óleo essencial de Piper trichocarpon C. D. C. In: Anais XLVI Congresso
Brasileiro de Química, 2006, Salvador.
ARAMBEWELA, L.S.R.; Arawwawala, L.D.A.M.; Ratnasooriya, W.D. Antidiabetic
activities of aqueous and ethanolic extracts of Piper betle leaves in rats. Journal
of Ethnopharmacology, 2005.
7. Referências
120
ARCANJO, D. D. R.; Deus, A. S. O.; Nunes, L. C. C.; Neto, L. B. C., Medeiros, M. G.
F.; Neto, P. J. R.; Lopes, J. A. D.; Cito, A. M. G. L. Constituintes químicos e Ensaio
de Letalidade em Artemia salina da Própolis vermelha de Pernambuco. In: Anais
XLVI Congresso Brasileiro de Química. Salvador – BA, 2006.
BARATA, L. E. S. Isolamento e síntese de neolignanas de Virola surinamensis.
1976. Tese (Doutorado) – Instituto de Química. Universidade Estadual de Campinas,
Campinas, São Paulo, 1976.
BARATA, L. E. S.; Santos, L. S.; Ferri, P. H.; J. Phillipson, D.; Paine, A.; Croft, S. L.
Anti-leishmanial activity of neolignans from Virola species and synthetic
analogues. Phytochemistry. Vol. 55, pág. 589-595, 2000.
BARREIROS, A. L. B. S.; David, J. M.; David, J. P. Estresse oxidativo: relação
entre geração de espécies reativas e defesas do organismo. Quimica Nova, Vol. 29,
No. 1, 113-123, 2006
BARROSO, G. M. Sistemática das Angiospermas do Brasil. Rio de Janeiro,
Livros Técnicos e Científicos Ed., 1978.
BELZILE, A. Majerus, S. L.; Podeszfinski, C.; Guillet, G.; Durst, T.; Arnason, J. T.
Dillapiol Derivatives as Synergists: Structure–Activity Relationship Analysis.
Pesticide Biochemistry and Physiology. Vol. 66, pág. 33–40, 2000.
BENEVIDES, P. J. C. ; Sartorelli, P.; Kato, M. J. Phenylpropanoids and neolignans
from Piper regnellii. Phytochemistry. Vol. 52, pág. 339-343, 1999.
BERNARD, C. B.; Krishanmurty, H. G.; Chauret, D.; Durst, T.; Philogène, B. J. R.,
Sánchez-Vindas, P.; Hasbun, C.; Poveda, L., San Román, L.; Arnason, J. T.
Insecticidal defenses of Piperaceae from the neotropics. Journal of Chemical
Ecology. Publisher Springer Netherlands ISSN 0098-0331 (Print) 1 Vol. 21, Number
6, Pag. 801-814, June, 1995.
7. Referências
121
BHATTACHARYA, S.; Mula S.; Gamre, S.; Kamat, J. P.; Bandyopadhyay, S.K.;
Chattopadhyay,
S.
Inhibitory
property
of
Piper
betel
extract
against
photosensitization-induced damages to lipids and proteins. Food Chemistry.
Vol. 100, Pág. 1474–1480, 2007.
BIESKI, I. G. C. Marketing das plantas medicinais na saúde pública.
Especialização. Centro Amazônico de ensino pesquisa e extensão - CAEPE. Pág. 3,
Cuiabá-MT, Novembro de 2004
BOLL, P. M. Parmar, V. S.; Tyagi, O. D.; Prasad, A.; Wengel, J.; Olsen, C. E. Some
recent isolation studies from potencial inseticidal Piper species. Pure & Applied
Chemistry, Vol. 66, Nos10/11, Pág. 2339-2342, 1994.
BRASIL. Ministério de Estado da Saúde. Portaria No 971/2006 Aprova a Política
Nacional de Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC) no Sistema Único de
Saúde.
CHAN-BACAB, M. J. Balanza, E.; Deharo, E.; Muñoz, V.; García, R. D.; PeñaRodríguez, L. M. et. al. Variation of leishmanicidal activity in four populations of
Urechites andrieuxii. Journal of ethnopharmacology. Vol. 86, no 2-3, pág. 243247, 2003.
CHAURET, D. C. ; Bernard, C. B.; Arnason, J. T.; Durst, T. Insecticidal Neolignans
from Piper decurrens. Journal of Natural Products. Vol. 59, pág. 152-155, 1996.
CHEN, H.; Morgan, J. A. High throughput screening of heterologous P450 whole
cell activity. Enzyme and Microbial Technology, 2005.
CHENG, S.; Chang, H.; Chang, S.; Tsai, K.; Chen, W. Bioactivity of selected plant
essential oils against the yellow fever mosquito Aedes aegypti larvae.
Bioresource Technology. Vol. 89, pág. 99–102, 2003.
7. Referências
122
CICCIÓ, J. F. Constituyentes de los aceites esenciales de las hojas y espigas
de Piper bisasperantum (Piperaceae). Revista de Biologia Tropical. Vol. 44, pág.
35-38, 1997.
COSTANTIN, M. B.; Sartorelli, P.; Limberger, R.; Henriques, A. T.; Steppe, M.;
Ferreira, M. J. P.; Ohara, M. T., Emerenciano, V. P.; Kato, M. J. Essential Oils from
Piper cernuum and Piper regnellii: Antimicrobial Activities and Analysis by
GC/MS and 13C-NMR. Planta Médica Vol. 67, pág. 771-773, 2001.
DEWICK, Paul M. Medicinal Natural Products: A Biosynthetic Approach. Second
edition, John Wiley & Sons, Ltd. 2002.
DANELUTTE, A. P.; Lagoa, J. H. G. ; Young, M. C. M.; Kato, J. M. Antifungal
flavanones and prenylated hydroquinones from Piper crassinervium Kunth.
Phytochemistry, 64, 555–559, 2003.
DESJEUX, J. The increase in risk factors for leishmaniasis worldwide.
Transations of the royal society of tropical medicine and hygiene. Vol. 95, pág. 239243, 2001.
DORMAN, H. J. D.; Deans, S.G. Antimicrobial agents from plants: antibacterial
activity of plant volatile oils. Journal of Applied Microbiology. Vol. 88, Pág. 308–316,
2000.
DYER, L.A., Dodson, C.D., and J. Richards. Isolation, synthesis, and evolutionary
ecology of Piper amides. in: Dyer, L.A. and A.N. Palmer (eds.). Piper: A model
genus for studies of evolution, chemical ecology, and trophic interactions. Kluwer
Academic
Publishers,
Boston,
Pag.
117-139,
2004.
Disponível
em
http://www.tulane.edu/~ldyer/papers.htm. Acesso em 13/10/2006
ESTRELA, J. L. V.; Fazolin, M.; Catani, V.; Alécio, M. R.; Lima, M. S. Toxicidade de
óleos essenciais de Piper aduncum e Piper hispidinervum em Sitophilus
zeamais. Pesq. agropec. bras., Brasília, Vol. 41, No 2, pág. 217-222, fev. 2006.
7. Referências
123
EKLUND, P. C.; Långvik, O. K.; Wärnå, J. P.; Salmi, T. O.; Willför, S. M.; Sjöholmet,
R. E. Chemical studies on antioxidant mechanisms and free radical scavenging
properties of lignans. Org. Biomol. Chem., Vol.3, pág. 3336 – 3347, 2005.
EKUNDAYO, O. Laakso, I.; Adegbola, R.; Oguntimein, B.; Sofowora; Hiltunen, R.
Essential oil of Ashanti Pepper (Piper guineense) Fruits. Journal of Agricultural
Food Chemistry. Vol. 36, pág. 880-882, 1988.
EVANS, P. H.; Bowers; W. S.; Funk, E. J. Identification of Fungicidal and
Nematocidal Components in the Leaves of Piper betle (Piperaceae) J. Agric.
Food Chem. Vol. 32, 1254-1256, 1984.
FACUNDO, V. A.; Morais, S. M. de M. Essential Oil of Piper tuberculatum var.
tuberculatum C. D. C. Leaves. Journal of Essential Oil Research. Vol. 17, pág. 304305, 2005.
FACUNDO, V.A.; Silveira, A.S.P.; Morais, S.M. Constituents of Piper alatabaccum
Trel & Yuncker (Piperaceae). Biochemical Systematics and Ecology, 2005.
FACUNDO,
V.
A.;
Rezende,
C.
M.;
Pinto,
A.
Essential
oil
of
Piper
carniconectivum C. D. C. Leaves and stems. Journal of essential oil research. Vol.
18, 296-297, 2006.
FALQUETO, A.; SESSA, P.A. Leishmaniose Tegumentar Americana In “Tratado de
Infectologia.” VERONESI, R.; FOCACCIA, R. – São Paulo: Ed. Atheneu, 2a Edição,
Pág. 1241-1252, 2002.
FAZOLIN, M.; Estrela, J. L.V.; Catani, V.; Lima, M. S.; Alécio, M. R. Toxicidade do
Óleo de Piper aduncum L. a Adultos de Cerotoma tingomarianus Bechyné
(Coleoptera: Chrysomelidae). Neotropical Entomology. Vol. 34(3), Pág. 485-489,
2005.
FIGUEIREDO, R. A.; Sazima, M. Pollination Biology of Piperaceae Species in
Southeastern Brazil. Annals of Botany , 85, 455-460, 2000.
7. Referências
124
FILHO, V. F.; YUNES, R. A. Estratégias para obtenção de compostos
farmacologicamente ativos a partir de plantas Medicinais. Conceitos sobre
modificação estrutural para otimização da atividade. Química Nova, Vol. 21, Pág.
99-105, 1998.
FILHO, A. S.; Albuquerque, S.; Silva, M. L. A.; Eberlin, M. N.; Tomazela, D. M.;
Bastos, J. K. Tetrahydrofuran Lignans from Nectandra megapotamica with
Trypanocidal Activity. Journal of Natural Products, Vol. 67, pág. 42-45, 2004.
FOLMER, F. Inhibition of TNFa-induced activation of nuclear factor kB by kava
(Piper methysticum) derivatives.
Biochemical pharmacology. 71, 1206 –
1218,2006.
FOSTER,
S.
Ginkgo.
Steven
Foster
Group,
2002.
Disponível
http://www.stevenfoster.com/education/monograph/ginkgo.html.
Acesso
em
em
16/10/2006.
FLOYD, R. A. Antioxidants, Oxidatives stress and Degenerative Neurological
Disorders. Society for Experimental Biology and Medicine. Vol. 222, Pág. 236-245,
1999.
FREIXA, B.; Vila, R.; Ferro, E. A.; Adzet, T.; Cañigueral, S. Antifungal Principles
from Piper fulvescens. Planta Medica. Vol. 67, pág. 873-875, 2001.
GARAVITO, G.; Rincón, J.; Arteaga, L.; Hata, Y.; Bourdy, G.; Gimenez, A.; Pinzón,
R., Deharoet, E. Antimalarial activity of some Colombian medicinal plants.
Journal of Ethnopharmacology., 2006.
GERMONPREZ, N.; Puyvelde, L. V.; Maes, L. ; Trib, M. V. ; Kimpe, N. New
pentacyclic triterpene saponins with strong anti-leishmanial activity from the
leaves of Maesa balansae. Tetrahedron. Vol. 60 pág. 219–228, 2004.
7. Referências
GILBERT,
Benjamin.
125
Desenvolvimentos
de
fitoterápicos
para
doenças
negligenciadas: Algumas considerações científicas. In: XIX Simpósio de Plantas
Medicinais do Brasil. Salvador-BA, 2006.
GOTTLIEB, O. R.; Koketsu, M.; Magalhães, M. T.; Maia, J. G. S.; Mendes, P. H.;
Rocha, A. I.; Silva, M. L.; Wilberget, V. C. Óleos essenciais da Amazônia. VII. Acta
Amazonica, Vol. 11, pág. 143-148, 1981.
GOTTLIEB, O. R. Lignóides de plantas amazônicas: investigações biológicas e
químicas. Acta Amazonica, Vol. 18, No. 1/2, pág. 333-344, 1988. Suplemento.
GREIG, N. Introduction. In: Dyer, L.A. and A.N. Palmer (eds.). Piper: A model
genus for studies of evolution, chemical ecology, and trophic interactions.
Kluwer Academic Publishers, Boston, Pag. 3, 2004.
GURIB-FAKIM, A. Medicinal plants: Traditions of yesterday and drugs of
tomorrow. Molecular Aspects of Medicine. Vol. 27, pág. 1–93, (2006).
HEGAZI, A. G.; El Hady, F. K. A. Egyptian Propolis: 3. Antioxidant, Antimicrobial
Activities and Chemical Composition of Propolis from Reclaimed Lands. Z.
Naturforsch. Vol. 57c, pág. 395-402, 2002.
HAMBURGER, M.; Hostettmann, K. Bioactivity in plants: The link between
Phytochemistry and Medicine. Phytochemistry, Vol. 30, No 12, Pág. 3864-3874,
1991.
HASHIMOTO, T.; Suganuma, M., Fujiki, H.; Yamada, M.; Kohno, T.; Asakawa, Y.
Isolation and synthesis of TNF-a release inhibitors from Fijian kawa (Piper
methysticum). Phytomedicine. Vol. 10 Pág. 309–317, 2003.
HERMOSO, A.; Jimenez, I. A.; Mamani, Z. A.; Bazzocchi, I. L.; Piñero, J. E.; Ravelo,
A. G.; Valladares, B. Antileishmanial Activities of Dihydrochalcones from Piper
elongatum and Synthetic Related Compounds: Structural Requirements for
Activity. Bioorganic & Medicinal Chemistry. Vol. 11, Pág. 3975–3980, 2003.
7. Referências
126
HODGSON, E. Ryu, D.; Adams, N.; Leviet, P. E. Biphasic responses in
synergistic interactions. Toxicology. Vol. 105, pág. 211-216, 1995.
HUANG, R. ; Chen, C.; Feng, H. ; Lin, L.; Chout, C. Anti-hepatitis B virus of seven
compounds isolated from Piper kadsura (choisy) ohwi. Journal of Chinese
Medicine, Vol. 12, Pág. 179 – 190, 2001.
INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY (IUPAC).
NOMENCLATURE OF LIGNANS AND NEOLIGNANS (IUPAC Recommendations
2000). Pure Applied Chemistry, Vol. 72, No. 8, Pág.. 1493–1523, 2000.
JAYASINGHE, L. Kumarihamy, B. M. M.; Jayarathna, K. H. R. N.; Udishani, N. W. M.
G.; Bandara, B. M. R., Harad, N.; Fujimoto, Y. Antifungal constituents of the stem
bark of Bridelia retusa. Phytochemistry. Vol. 62, pág. 637–641, 2003.
JARAMILLO, M. A.; Marquis, R. Future Research in Piper Biology. in: Dyer, L.A.
and A.N. Palmer (eds.). Piper: A model genus for studies of evolution, chemical
ecology, and trophic interactions. Kluwer Academic Publishers, Boston, Pag. 201,
2004.
JARAMILLO, M. A.; MANOS, P. S. Phylogeny and patterns of floral diversity in
the genus Piper (Piperaceae). American Journal of Botany, Vol. 88, Pág. 706-716,
2001.
JENETT-SIEMS, K.; Mockenhaupt, F. P.; Bienzle, U.; Gupta, M. P.; Eich, E. In vitro
antiplasmodial activity of Central American medicinal plants. Tropical Medicine
and International Health, Vol. 4, No 9, Pág. 611-615, September, 1999.
JENSEN, S.; H. J.; Boll, P. M. Lignans and neolignans from Piperaceae.
Phytochemistry, Vol. 33, No 3, Pág. 523-530, 1993.
7. Referências
127
JHOO, J.; Freeman, J. P.; Heinze, T. M.; Moody, J. D.; Schnackenberg, L. K.; Beger,
R. D.; Dragull, K.; Tang, C.; Ang, C. Y. W. In Vitro Cytotoxicity of Nonpolar
Constituents from Different Parts of Kava Plant (Piper methysticum). Journal of
Agricultural Food Chemistry. Vol. 54, pág. 3157-3162, 2006.
JOSHI, A.S.; Nimrod, A. C.; ElSohly, H. N.; Walker, L. A.; Clarket., A. M.
Dihydrochalcones from Piper longicaudatum. Planta Medica. Mar; Vol. 67(2),
Pág.186-188, 2001.
KAYSER, O.; Kiderlen, A. F.; Croft, S. L. Natural products as antiparasitic drugs.
Parasitology Research. Vol. 90, Sup. 2, pág. 1432-1955, June, 2003.
KAYSER, O.; KIDERLEN, A. F. Leishmanicidal Activity of Aurones. Tokai J. Exp.
Clin. Med. Vol. 23, No. 6, pág. 423-426, 1999.
KÉITA, S. M. ; Vincent, C. ; Schmita, J.; Ramaswamy, S. ; Belanger, A. Effect of
various
essential
oils
on
Callosobruchus
maculatus
(F.)
(Coleoptera:
Bruchidae). Journal of Stored Products Research, Vol. 36, Pág. 355-364, 2000.
KONISHI, T.; Konoshima, T.; Daikonya, A.; Kitanaka, S. Neolignans from Piper
futokadsura and Their Inhibition of Nitric Oxide Production. Chem. Pharm. Bull.
53(1), 121—124, 2005.
KUO, Y.; Lin, L.; Yang, N.; Tsai, W.; Lin, A.; Lee, M.; Chou, C. Some
immunomodulatory principles isolated from Piper kadsura. Journal of Chinese
Medicine. Vol. 13(3) , pág. 159-170, 2002.
LAGO, J. H. G.; Tanizaki, T. M.; Young, M. C. M.; Guimarães, E. F.; Kato, M. J.
Antifungal Piperolides from Piper malacophyllum (Prels) C. DC. J. Braz. Chem.
Soc., Vol. 16, No. 2, 153-156, 2005.
LE COUTEUR, Penny; Burreson, Jay. Pimenta, noz-moscada e cravo-da-índia In:
Os Botões de Napoleão: As 17 moléculas que mudaram a história. Jorge Zahar
Editor, 2006.
7. Referências
128
LEE, B. K., Kimb, J. H.; Jung, J. W.; Choi, J. W.; Han, E. S.; Lee, S. H.; Ko, K. H.;
Ryu, J. H. Myristicin-induced neurotoxicity in human neuroblastoma SK-N-SH
cells. Toxicology Letters. Vol. 157, pág. 49–56, 2005.
LEHNINGER, A. L.; Nelson, D. L.; Cox, M. M. Princípios de Bioquímica. 3o
Edição, Savier, 2002.
LIMA, I. P.; Reis, N. R. The availability of Piperaceae and the search for this
resource by Carollia perspicillata (Linneus) (Chiroptera, Phyllostominae,
Carollinae) in parque Municipal Arthur Thomas, Londrina Paraná, Brazil.
Revista Brasileira de Zoologia. Vol. 21 (2), Pág. 371-377, Junho, 2004.
LIN, L.; Shen, C.; Shen, Y.; Tsai, T. Anti-inflammatory Neolignans from Piper
kadsura. Journal of Natural Products. 69, 842-844, 2006.
LOPES, N. P., Chicaro P.; Kato, M. J.; Albuquerque, S.; Yoshida, M. Flavonoids
and lignans from Virola surinamensis twigs and their in vitro activity against
Trypanosoma cruzi. Planta Medica. Vol. 64, pág. 667-669, 1998.
LUIZE, P. S.; Ueda-Nakamura, T.; Filho, B. P. D.; Cortez, D. A. G.; Nakamura, C. V.
Activity of Neolignans Isolated from Piper regnellii (MIQ.) C. DC. var. pallescens
(C. DC.) YUNCK against Trypanosoma cruzi. Biological and
Pharmaceutical
Bulletin. Vol. 29(10), Pág. 2126—2130, 2006.
LUNA, J. S.; Santos, A.F.; Lima, M.R.F.; Omena, M.C.; Mendonça, F.A.C.; Biebera,
L.W.; Sant’Ana, A.E.G. A study of the larvicidal and molluscicidal activities of
some medicinal plants from northeast Brazil. Journal of Ethnopharmacology. Vol.
97, pág. 199–206, 2005.
LUZ, A. I. R.; Zoghbi, M. G. B.; Maia, J. G. S. The essential oils of Piper
reticulatum L. and P. crassinervium H. B. K. Acta Amazônica, Vol. 33, Pág. 341344, 2003.
7. Referências
129
MA, J.; Jones, S.; Marshall, H. R.; Johnson, R. K.; Hecht, S. M. A DNA-Damaging
Oxoaporphine Alkaloid from Piper caninum Journal of Natural Products. 67 (7),
1162 -1164, 2004.
MA J., Jones, S. H.; Hecht, S. M. Phenolic acid amides: a new type of DNA strand
scission agent from Piper caninum. Bioorganic Medicinal Chemistry. Jul
15;12(14):3885-3889, 2004.
MACIEL, M. A. M.; Pinto, A. C.; Veiga, Valdir F. Plantas Medicinais: A Necessidade
de Estudos Multidisciplinares. Química Nova, Vol. 25, No. 3, pág. 429 – 438, 2002.
MAIA, R. M.; Barbosa, P. R.; Cruz, F. G.; Roque, N. F.; Fascio, M.; Química Nova
23, Pág. 623, 2000.
MANDAL, D.; Panda, N.; Kumar, S.; Banerjee, S.; Mandal, N.; Niranjan, B.; Sahu, P.
A triterpenoid saponin possessing antileishmanial activity from the leaves of
Careya arborea. Phytochemistry. 2005.
MATA, R. et. al. Antimycobacterial compounds from Piper sanctum. Journal of
Natural Products. Volume 67, Pág. 1961-1968, 2004.
MARTINS, A. P.; Salgueiro, L.; Vila, R.; Tomi, F.; Igueral, S. C.; Casanova, J.;
Cunha, A. P.; Adzet, T. Essential oil from four Piper species. Phytochemistry. Vol.
49, No 7, pág. 2019-2023, 1998.
MARTINS, R. C. C.; Lago, J. H.; G. Albuquerque, S.; Kato, M. J. Trypanocidal
tetrahydrofuran
lignans
from
inflorescences
of
Piper
solmsianum.
Phytochemistry, Vol. 64, Pág. 667–670, 2003.
MCFERREN, M. A.; Cordova, D.; Rodriguez, E.; Rauhet, J. J. In vitro
neuropharmacological evaluation of piperovatine, an isobutylamide from Piper
piscatorum (Piperaceae). Journal of Ethnopharmacology. Vol. 83, 201-207, 2002.
7. Referências
130
MENDONÇA, F. A. C.; Silva, K.F.S.; Santos, K.K.; Ribeiro Junior, K.A.L., Sant’Ana,
A.E.G. Activities of some Brazilian plants against larvae of the mosquito Aedes
aegypti. Fitoterapia. 76, 629– 636, 2005.
MESQUITA, M. L. ; Desrivot, J.; Bories, C. ; Fournet, A.; Paula, J. E. ; Grellier, P.;
Espindola, L. S. Antileishmanial and trypanocidal activity of Brazilian Cerrado
plants. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 100(7): pág. 783-787,
November, 2005.
MINODIER, P. e Parola, P. Cutaneous leishmaniasis treatment. Travel Medicine
and Infectious Disease (2006),
MIKICH, S. B.; Bianconi, G. V.; Maia, B. H. L.; Teixeira, S. D. Attraction of the FruitEating Bat Carollia perspicillata to Piper gaudichaudianum. Journal of Chemical
Ecology, Vol. 29, Number 10 / October, Pág. 1573-1561, 2003.
MOREIRA, D. L.; Souza, P. O.; Kaplan, M. A. C.; Pereira N. A.; Cardoso, G. L.;
Guimarães, E. F. Effect of leaf essential oil from Piper solmsianum C.DC. in
mice behaviour. Anais da Academia Brasileira de Ciência, Vol. 73, Pág. 33-37,
2001.
MOREIRA, D. L.; Kaplan, M. A.; Guimarães, E. F. Essential oil analysis of two
Piper species (Piperaceae). Annais of Academy of Brazilian Science. Vol. 70, N 4,
1998.
MOREIRA, F. P. M.; Coutinho, V.; Montanher, A. B. P.; Caro, M. S. B.; Brighente, I.
M. C.; Pizzolatti, M. G.; Monache, F. D. Flavonoides e triterpenos de Baccharis
pseudotenuifolia – Bioatividade sobre Artemia salina. Quimica Nova, Vol. 26, No.
3, 309-311, 2003.
MORITA, T.; Jinno, K.; Kawagishi, H.; Arimoto, Y.; Suganuma, H.; Inakuma, T.;
Sugiyama, K. Hepatoprotective Effect of Myristicin from Nutmeg (Myristica
fragrans) on Lipopolysaccharide/D-Galactosamine-Induced Liver Injury. Journal
Agricultural Food Chemistry, Vol. 51, No (6), pág. 1560 -1565, 2003.
7. Referências
131
MUNDINA, M.; Vila, R.; Tomi, F.; Guopta M.; Tom, P. A.; Casanova, J.; Cañiguera,
S. Leaf essential oils of three panamanian Piper species. Phytochemistry. Vol 47,
No. 7,pag. 1277-1282, 1998.
NAKAGAWA, K.; Kawagoe, M.; Yoshimura, M.; Arata, H.; Minamikawa, T.;
Nakamura, M.; Matsumoto, A. Differential Effects of Flavonoid Quercetin on
Oxidative Damages Induced by Hydrophilic and Lipophilic Radical Generators
in Hepatic Lysosomal Fractions of Mice. Journal of Health Science, vol. 46(6),
pág.509–512, 2000.
NAKAMURA, C. V.; Santos, A. O.; Vendrametto, M. C.; Luize, P. S.; Filho, B. P. D.;
Cortez, D.A.G.;
Ueda-Nakamura, T. Atividade antileishmania do extrato
hidroalcoólico e de frações obtidas de folhas de Piper regnellii (Miq.) C. DC.
var. pallescens (C. DC.) Yunck. Revista Brasileira de Farmacognosia, Vol. 16(1),
Pág. 61-66, Jan./Mar, 2006.
NOLDIN, V. F.; Filho, V. C.; Monache, F. D. ; Benassi, J. C. ; Christmann, I. L. ;
Pedrosa, R. C.; Yunes, A. R. Composição química e atividades biológicas das
folhas de Cynara scolymus L. (Alcachofra) cultivadas no Brasil. Química Nova,
Vol. 26, No. 3, 331-334, 2003
NOLEAU, I.; Toulemonde, B.; Richard, H. Volatile constituents of cardamom
(Elettaria cardamomum maton) cultivated in Costa Rica. Flavour and Fragrance
Journal . Vol. 2(3), pág. 123-127, 1987.
NUNES, B. S. ; Carvalho, F. D.; Ghilhermino, L. M., Stappen, G. V. Use of the
genus Artemia in ecotoxicity testing. Environmental Pollution. Vol.144, pág. 453462, 2006.
OLIVEIRA, R. B.; Vaz, A. B. M.; Alves, R. O.; Liarte, D. B.; Donnici, C. L.; Romanha,
A. J.; Zani, C. L. Arylfurans as potential Trypanosoma cruzi trypanothione
reductase inhibitors. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. Vol. 101(2), pág. 169173, 2006.
7. Referências
132
ORJALA, J.; Mian, P. ; Rali, T. ; Sticher, O. Gibbilimbols A-D, Cytotoxic and
Antibacterial Alkenylphenols from Piper gibbilimbum. Journal of Natural
Products, Vol. 61, pág. 939-941, 1998.
OYEDEJI, O. A.; Adeniyi, B. A.; Ajayi, O.; Konig, W. Essential oil composition of
Piper guineense and its antimicrobial activity. Another chemotype from Nigeria.
Phytotherapy Research. Vol. 19(4), pág. 362-364, 2005
PADMAJA, R.; Arun, P. C.; Prashanth, D.; Deepak, M.; Amit , A.; Anjana, M. Brine
shrimp lethality bioassay of selected Indian medicinal plants. Fitoterapia Vol. 73,
Pág. 508–510, 2002.
PARMAR, V. S.; Jain, S. C.; Bisht, K. S.; Jain, R.; Taneja, P.; Tyagi, O. D.; Prasad,
A. K.; Wengel, J.; Olsen, C. E.; Boll, P. Phytochemistry of Genus Piper.
Phytochemistry, Vol.46, No 4, Pág. 597-673, 1997.
PARRA, A. L. ; Yhebra, R. S.; I. Sardiñas, G. L.; Buela, I. Comparative study of the
assay of Artemia salina L. and the estimate of the medium lethal dose (LD50
value) in mice, to determine oral acute toxicity of plant extracts. Phytomedicine,
Vol. 8(5), pp. 395–400, 2001.
PASSOS, F. C.; Silva, W. R.; Pedro, W. A.; Bonin, M. R. Frugivoria em morcegos
(Mammalia, Chiroptera) no Parque Estadual Intervales, sudeste do Brasil.
Revista Brasileira de Zoologia. Vol. 20 (3): Pág. 511–517, Setembro, 2003.
PESSINI, L. G. ; Nakamura, C. V. ; Filho, B. P. D. ; Cortez, L.; Cortez, D.
Antibacterial Activity of Extracts and Neolignans from Piper regnellii (Miq) C. D.
C. var. pallescens (C. DC.) Yunck. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. Vol. 98,
Pág. 1115-1120, Rio de Janeiro, Dezembro de 2003.
7. Referências
133
PEREDA-MIRANDA, R.; Bernard, C. B.; Durst, T.; Arnason, J. T. ; Sanchez-vindas,
P. ;
Poveda,
L.;
Román,
L.
S.
Methyl
4-Hydroxy-3-(3¢-methyl-2¢-
butenyl)benzoate, Major Insecticidal Principle from Piper guanacastensis. J.
Nat. Prod. Vol. 60, Pág. 282-284,1997.
PEREIRA, G. L. S. Bioecologia de Artemia sp. 2001. Disponível em
(http://br.geocities.com/artemiafranciscana/biologia.htm). Acesso em 26/10/2006.
PHILLIPSON, J. David. Phytochemistry and medicinal plants. Phytochemistry,
Vol. 56, pág. 237-243, 2001.
PLANETA ORGÂNICO. Conhecendo os alimentos funcionais e os seus
segredos:
os
fitoquímicos.
Disponível
em
http://www.planetaorganico.com.br/saudnut8.htm. Acesso em 13/10 2006.
RAMOS, L. S.; Silva, M. L., Luz, A. I. R.; Zoghbi, M. G. B.; Maia, J. G. S. Essential
oil of Piper marginatum. Journal of Natural products. Vol. 49, No 4, pág. 712-741,
1986.
RATHEE, J. S.; Patro, B.; Mula, S.; Gamre, S.; Chattopadhyay, S. Antioxidant
Activity of Piper betel Leaf Extract and Its Constituents. Journal of Agricultural
Food Chemistry. Vol. 54, pág. 9046-9054, 2006.
RATNAM, D. V.; Ankola, D.D.; Bhardwaj, V.; Sahana, D.K.; Kumar, M.N.V.R. Role
of antioxidants in prophylaxis and therapy: A pharmaceutical perspective.
Journal of Controlled Release. Vol. 113, pág. 189–207, 2006.
RIDTITID, W.; Rattanaprom, W.; Thaina, P. ; Chittrakarn, S. Sunbhanich, M.
Neuromuscular blocking activity of methanolic extract of Piper sarmentosum
leaves in the rat phrenic nerve-hemidiaphragm preparation. Journal of
Ethnopharmacology. Vol. 61, Pág. 135–142, 1998.
RIES, L. A. G.; Harkins, D.; Krapcho, M.; Mariotto, A.; Miller, B.A.; Feuer, E.J.;
Clegg, L.; Eisner, M.P.; Horner, M.J.; Howlader, N.; Hayat, M.; Hankey, B.F.;
7. Referências
134
Edwards, B.K. (eds). SEER Cancer Statistics Review, 1975-2003, National Cancer
Institute. Bethesda, MD, http://seer.cancer.gov/csr/1975_2003/, based on November
2005 SEER data submission, posted to the SEER web site, 2006. disponível em
http://seer.cancer.gov/csr/1975_2003/ Acesso em 16/10/2006
ROCHA, L.G.; Almeida, J. R.; Macedo, R. O.; Barbosa-Filho, J. M. A Review of
natural products with antileishmanial activity. Phytomedicine. Vol 12, Pág. 514535, 2005.
ROCHA, S. F. R. and Ming, L. C. Piper hispidinervum: A Sustainable Source of
Safrole. Reprinted from: Perspectives on new crops and new uses. J. Janick (ed.),
ASHS Press, Alexandria, VA. Pág. 479-481, 1999.
RUEGG, T.; Calderón, A. I.; Queiroz, E. F.; Sólis, P. N.; Marston, A.; Rivas, F.;
Ortega-Barría, E.; Hostettman, K.; Gupta, M. P. 3-Farnesyl-2-hydroxybenzoic acid
is a new anti-Helicobacter pylori compound from Piper multiplinervium. Journal
of Ethnopharmacology, Vol. 103, Pág. 461–467, 2006.
RUKACHAISIRIKUL, T.; Siriwattanakit, P.; Sukcharoenphol, K.;
Wongvein, C.;
Ruttanaweang, P.; Wongwattanavuch, P.; Suksamrarn, A. Chemical constituents
and bioactivity of Piper sarmentosum. Journal of Ethnopharmacology, Vol. 93,
Pág. 173-176, 2004.
SACCHETTI, G.; Maietti, S. ; Muzzoli, M. ; Scaglianti, M. ; Manfredini, S. ; Radice,
M. ; Bruni, R. Comparative evaluation of 11 essential oils of different origin as
functional antioxidants, antiradicals and antimicrobials in foods. Food
Chemistry. Vol. 91, Pág. 621–632, 2005.
SANGALLI, B. C. ; Sangalli, B.; Chiang, W. Toxicology of Nutmeg Abuse. Journal
of Toxicology: Clinical Toxicology. Vol. 38, No 6, pág. 671 – 678, 2000.
SANTOS, P. R. D.; Moreira, D. L.; Guimarães, E. F.; Kaplan, M. A. C. Essential oil
analysis of 10 Piperaceae species from the Brazilian Atlantic forest.
Phytochemistry, 58, 547–551, (2001).
7. Referências
135
SARKAR, M.; Gangopadhyay, P. ; Basak, B. ; Chakrabarty, K. ; Banerji, J.; Adhikary,
P.; Chatterjee, A. The reversible antifertility effect of Piper betle Linn. on Swiss
albino male mice. Contraception. Vol. 62, Pág. 271–274, 2000.
SASSE, A. E-Câncer – informações para uma vida melhor.
Disponível em
http://www.andre.sasse.com/index.htm. Acesso em 13/10/2006.
SCOTT, J. G. ; Foroozesh, M.; Hopkins, N. E.; Alefantis, T. G.; Alworth, W. L.
Inhibition of Cytochrome P450 6D1 by Alkynylarenes, Methylenedioxyarenes,
and Other Substituted Aromatics. Pesticide Biochemistry and Physiology. Vol. 67,
pág. 63–71, 2000.
SETZER, W. N. ; Setzer, M. C.; Bates, R. B.; Nakkiew, P.; Jackes, B. R.; Chen, L.;
McFerrin, M. B.; Meehan, E. J. Antibacterial hydroxycinnamic esters from Piper
caninum from Paluma, north Queensland, Australia. The crystal and molecular
structure of (+)-bornyl coumarate. Planta Medica. Dec;65(8):747-749, 1999.
SILVEIRA, F. T.; Lainson, R.; Corbett, C. E. P. Clinical and Immunopathological
Spectrum of American Cutaneous Leishmaniasis with Special Reference to the
Disease in Amazonian Brazil - A Review. Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro,
Vol. 99(3): 239-251, May 2004
SIMÕES, C. M. O.; Schenkel, E. P.; Gosmann, G.; Mello, J. C. P.; Mentz, L. A.;
Petrovick, P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento ·Editor da UFSC, 821p,
1999.
SIQUEIRA, J. M.; Bomm, M. D.; Pereira, N. F. G.; Boaventura, M. A. D. Estudo
fitoquímico de Unonopsis lindmanii - Annonaceae, biomonitorado pelo ensaio de
toxicidade sobre a Artemia salina Leach. Química Nova, Vol. 21(5), pág 557-559,
1998.
7. Referências
136
SOLIS, P. N. ; Olmedo, D.; Nakamura, N.; Calderon, A. I.; Hattori, M.; Gupta, M. P. A
new larvicidal lignan from Piper fimbriulatum.
Pharmaceutical Biology. Vol.
43(4), pág. 378-381, 2005.
STEPHENSON, J. R. The problem with dengue. Transactions of the Royal Society
of Tropical Medicine and Hygiene. Vol. 99, pág. 643-646, 2005
SUMATHYKUTTY, M. A.; Rao, J. M. 8-Hentriacontanol and other Constituents
from Piper attenuatum. Phytochemistry. Vol. 30, No. 6, pág. 2075-2076, 1991.
SUNDAR, S. Pai, K.; Kumar, R. Pathak-Tripathi, K.; Kenney, R. T. Resistance to
treatment in kala-azar: speciation of isolates from northeast India. Am. J. Trop. Med.
Hyg., Vol. 65(3), Pág. 193–196, 2001.
TAWAN, C.S.; Ipor, I. B.; Fashihuddin, B. A.; Sani, H. A brief account on the wild
Piper (Piperaceae) of the Crocker range, Sabah. ASEAN Review of Biodiversity
and Environmental Conservation (ARBEC) July-september,2002. Disponível em
http://www.arbec.com.my/pdf/art6julysep02.pdf
TAMMELA, P. Screening Methods for the Evaluation of Biological Activity in
Drug Discovery. 2004. Dissertação (Mestrado) – Faculty of Pharmacy, University of
Helsinki, Helsinki, Finland, 2004.
TASKOVAA, R., Mitova, M.; Mikhova, B.; Duddeck, H. Bioactive Phenolics from
Carthamus lanatus L. Z. Naturforsch. Vol. 58c, pág. 704-707, 2003.
TAUFIQ-UR-RAHMAN, M. ; Shilpi, J. A. ; Ahmed, M. ; Hossain, C. F. Preliminary
pharmacological
studies
on
Piper
chaba
stem
bark.
Journal
of
Ethnopharmacology, Vol. 99, Pág. 203–209, 2005.
THE NATIONAL TOXICOLOGY PROGRAM. Evidence for possible carcinogenic
activity.
Executive
Summary
Myristicin
http://ntp.niehs.nih.gov/ntpweb/index.cfm?objectid=03E0D59B.
13/10/2006.
Disponível
Acesso
em
em
7. Referências
137
TOGNOLINI, M.; Baroceili, E. ; Ballabeni, V. ; Bruni, R. ; Bianchi, A. ; Chiavarini, M. ;
Impicciatore, M. et. al. Comparative screening of plant essential oils:
Phenylpropanoid moiety as basic core for antiplatelet activity. Life Sciences.
Vol. 78, pág. 1419 – 1432, 2006.
TORQUILHO, H. S.; Pinto, A. C.; Godoy, R. L. Essential Oil of Piper
permucronatum Yuncker (Piperaceae) from Rio de Janeiro. Journal of Essential
Oil Research, Vol. 11, pág. 429-430, 1999.
TORRES, R.; Urbina, F.; Morales, C.; Modak, B. ; Monache, F. D. Antioxidant
properties of lignans and ferulic acid from the resinous exudates of Larrea
nitida. Journal of the Chilean Chemical Society. Vol. 48, no.3, p.61-63, set. 2003.
TORRES-SANTOS, E. C. ; Moreira, D. L.; Kaplan, M. A. C.; Meirelles, M. N.; RossiBergmann, B. Selective Effect of 29,69-Dihydroxy-49-Methoxychalcone Isolated
from Piper aduncum on Leishmania amazonensis. Antimicrobial agents and
chemotherapy. Vol. 43, No. 5, p. 1234–1241, May 1999a.
TORRES-SANTOS, E. C.; Rodrigues, J. M.; Moreira, D. L.; Kaplan, M. A.; RossiBergmann, B. Improvement of In Vitro and In Vivo Antileishmanial Activities of
29, 69-Dihydroxy-49-Methoxychalcone by Entrapment in Poly(D,L-Lactide)
Nanoparticles. Antimicrobial agents and chemotherapy. Vol. 43, No. 7, pág. 1776–
1778, July 1999b.
TROUILLER, P.; Olliaro, P. ; Torreele, Orbinski, J. ; Laing, R. ; Ford, Nathan. Drug
development for neglected diseases: a deficient market and a public-health policy
failure. The Lancet, Vol 359, June 22, 2002.
TSAI, I. ; Lee, F.; Wu, C.; Duh, C.; Ishikawa, T.; Chen, J.; Chen, Y.; Seki, H.; Chen, I.
New Cytotoxic Cyclobutanoid Amides, a New Furanoid Lignan and Anti-Platelet
Aggregation Constituents from Piper arborescens. Planta Med. Vol. 71, pág.
535-542, 2005.
7. Referências
138
TSAI, J. et. al. Antioxidant activity of piperlactam S: Prevention of copperinduced LDL peroxidation and amelioration of free radical-induced oxidative
stress of endothelial cells. Planta medica., vol. 69, No1, pag. 3-8, 2003.
WILLIAMS, L. A. D. et. al. In Vitro Anti-Inflammatory and Antimicrobial Activities
of Phenylpropanoids from Piper Betle L. (Piperaceae).
Proceedings of the
Phytochemical Society of Europe. Vol. 47, pág. 221-227, 2002.
WINK, M. Evolution of secundary metabolites from an ecological and molecular
phylogenetic perspective. Review, Phytochemistry, Vol. 64, pág. 3 – 19, 2003.
USIA, T.; Watabe, T.; Kadota, S.; Tezuka, Y. Metabolite-cytochrome P450
complex formation by methylenedioxyphenyl lignans of Piper cubeba:
Mechanism-based inhibition. Life Sciences. Vol. 76, 2381–2391, 2005.
VAL, V. M. F. A. A Amazônia, a Biodiversidade e o novo milênio. In “Amazônia:
interesses
e
conflitos”
(2000).
Disponível
em
http://www.comciencia.br/reportagens/amazonia/amaz3.htm Acesso em 16/01/2007.
VALKO, M.; Leibfritz, D. ; Moncol, J. ; Cronin, M. T. D. ; Mazur, M. ; Telser, J. Free
radicals and antioxidants in normal physiological functions and human
disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. Vol. 39, pág. 44–
84, 2007.
VARGAS, L., Pérez-Alonso, M. J. ; Vellasco-Negueruela, A.; Pala-Paúl, J. Leaf
Essential Oil of Piper barbatum H. B. K. (Piperaceae) from Peru. Journal of
Essential Oil Research. Vol. 15, Pág. 163-164, 2005.
VEERAREDDY, P. R.; Vobalaboina; Nahid, V. A. Formulation and evaluation of
oil-in-water emulsions of piperine in visceral leishmaniasis. Pharmazie. Vol. 59,
No 3, Pag.194-197, 2004.
VENDRAMETTO, M.C.; Morgado-Díaz, J.A.; Cortez, D.A.G.; Dias Filho, B.P.;
Nakamura, C. V.;Ueda-Nakamura, T. Ultraestrutural changes in promastigote
7. Referências
139
forms of Leishmania amazonensis treated with eupomatenoid-5 a purified
compound
from
Piper
regnellii
var
palescens.
Disponível
em
http://www.sbmm.org.br/artigos/arq_724.pdf. Acesso em 18/02/2007.
VERPOOTER, Rob. Exploration of nature’s chemodiversity: the role of secondary
metabolites as leads in drug development. Drug Discovery Today. Vol. 3, No. 5, Pág.
232-238, May 1998.
VILA, R. et. al. Chemical composition of the essential oil from the leaves of
Piper
fulvescens,
a
plant
traditionally
used
in
Paraguay.
Journal
of
Ethnopharmacology. Vol. 76, pág. 105–107, 2001.
VILA, R. et. al. Constituents of the essential oils from Piper friedrichsthalii
C.DC. and P. pseudolindenii C.DC. from Central America. Flavour and Fragrance
Journal. Vol. 18, pág. 198–201, 2003.
VILA, R. et. al. Unusual composition of the essential oils from the leaves of
Piper aduncum. Flavour and Fragrance Journal. Vol. 20(1), pág. 67-69, 2005.
VINCENZI, M. De; Vincenzi, A. De; Silano, M. Constituents of aromatic plants:
elemicin. Fitoterapia. Vol. 75, pág. 615– 618, 2004.
VOET, D.; VOET, J.; PRATT, C. W. Fundamentos de Bioquímica. 2a Edição [S.l.],
Editora Art Méd, 2002.
YU, Y. U. et. al. Antioxidant lignans from machilus thumbergii protect CCL4injured primary cultures of rat hepatocytes. The Journal of Pharmacy and
pharmacology. Vol. 52, pág. 1163 – 1169.
ZIELIÑSKA, Magorzata et. al. The flavonoids, quercetin and isorhamnetin 3-Oacylglucosides
diminish
neutrophil
oxidative
metabolism
peroxidation. Acta Biochimica Apolonica. Vol. 48 No. 1/2001, 183–189.
and
lipid
7. Referências
140
ZHAI, H. et. al. Neuroprotective Effects of 2,5-Diaryl-3,4-dimethyltetrahydrofuran
Neolignans. Biol. Pharm. Bull. Vol. 28(2), pág. 289—293, 2005.
ZHENG, G.; Kenney, P. M.; Lam, L. K. T. Inhibition of benzo[a]pyrene-induced
tumorigenesis by myristicin, a volatile aroma constituent of parsley leaf oil.
Oxford Journals Life Sciences Carcinogenesis Vol. 13, No 10, Pág. 1921-1923,
1992a.
_________. Myristicin: A Potential Cancer Chemopreventive Agent from
Parsley Leaf Oil. Journal Agricultural Food Chemistry. Vol. 40, pág. 107-110, 1992b.
_________. Effects of Carvone Compounds on Glutathione S-Transferase
Activity in A/J Mice. Journal Agricultural Food Chemistry, Vol. 40, pág. 751-755,
1992c.
WANYOIKE, G.N. et. al. Brine shrimp toxicity and antiplasmodial activity of five
Kenyan medicinal plants. Journal of Ethnopharmacology. Vol. 90, pág. 129–133,
2004.
WILLIAMS, L. A. D. et. al. In vitro anti-inflammatory and antimicrobial activities
of phenylpropanoids from Piper betel L. (Piperaceae). Proceedings of the
Phytochemical Society of Europe. Vol. 47, pág. 221-227, 2002.
World Health Organization (WHO), Leishmaniasis: A brief history of the disease.
Disponível em http://www.who.int/leishmaniasis/en/. Acesso em 3/12/2006
Tabela 1. Constituintes químicos identificados no óleo essencial de espécies do gênero Piper
Compostos
1
2
3
4
+
+
+
+
+
+
+
5
6
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11
+
+
+
+
+
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16
17
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19
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+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
20
21
22
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Monoterpenos hidrocarbonetos
1. -tujano
2. -pineno
3. Canfeno
4. -pineno
5. Sabineno
6. Myrceno
7. –Phellandreno
8. -terpineno
9. δ-3-careno
10. ρ-cimeno
11. Limoneno
12. -phelandreno
13. (E)- -Ocimeno
14. (Z)- -ocimeno
15. -terpineno
16. Car-3-eno
17. Allo ocimeno
18. Terpinoleno
19. o-cimeno
20. (Z)-sabineno hidrato
21. -tepineno
22. isoterpinoleno
Monoterpenos Oxigenados
23. Estragol
24. Camfora
25. Isoborneol
26. L-borneol
27. piperitona
28. 1,8 cineol
29. Mirtenal
30. Linalool
31. Terpinen-4-ol
32. Metil chavicol
33. Alcanfor
34. ρ-cimen-8-ol
35. Acetato de Linalila
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
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+
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+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
141
Tabela 1. Constituintes químicos identificados no óleo essencial de espécies do gênero Piper. (Continuação)
Compostos
1
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
+
+
+
+
36. -terpineol
37. Neral
38. Nerol
39. Geraniol
40. Perilleno
41. Neo-Isopulegol Acetato
42. Acetato Bornyla
Sesquiterpenos hidrocarbonetos
43. -elemeno
44. (E)- -bergamoteno
45. δ-elemeno
46. -cubeno
47. -cubebeno
48. -copaeno
49. -bourboneno
50. -cubebeno
51. (E)-cariofileno
52. -muuroleno
53. -muuroleno
54. -ylangeno
55. -bisaboleno
56. Z- -bisaboleno
57. -sesquifelandreno
58. -gurjuneno
59. -gurjuneno
60. Germacreno C
61. -elemeno
62. Neryl acetona
63. -trans-bergamoteno
64. -guaieno
65. -farneseno
66. -farneseno
67. (Z)- -farneseno
68. Isocariofileno
69. -cariofileno
70. 6,9-guaiadieno
71. Cypereno
2
19
20
+
21
22
+
+
+
+
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+
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+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
142
Tabela 1. Constituintes químicos identificados no óleo essencial de espécies do gênero Piper. (Continuação)
(Continuação)
72. (Z)-cariofileno
73. -cariofileno
74. E- -farneseno
75. Seicheleno
76. E-Muurola-4-(14), 5 dieno
77. 9-epi-cariofileno
78. -gurjuneno
79. Viridifloreno
80. Germacreno D
81. Δ-guaieno
82. Guaieno
83. -Selineno
84. -selineno
85. -Selineno
86. Valenceno
87. Aromadendreno
88. Ishwarano
89. Biciclogermacreno
90. Germacreno A
91. (E,E)-a- Farneseno
92. Δ-cadineno
93. -cadineno
94. -cadineno
95. Cadina-1,4-dieno
96. -metil-ionona
C15H24
97. -Cadieno
98. -Cadieno
99. -humuleno
100. Ar-curcumeno
101. Trans-sesquisabineno hidrato
102. Calameneno
103. Calacoreno
104. Chamigreno
105. Germacreno B
Sesquiterpenos Oxigenados
106. Elemol
107. -elemol
1
2
3
4
5
6
+
+
+
+
+
7
8
9
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12
13
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20
21
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+
+
+
+
+
+
+
+
143
Tabela 1. Constituintes químicos identificados no óleo essencial de espécies do gênero Piper. (Continuação)
(Continuação)
108. Nerolidol
109. (E)-Nerolidol
110. (Z)-Nerolidol
111. 6(E)-Nerolidol
112. Bourbanonol
113. 1,5-epoxisalvial-4(14)-eno
114. Spathulenol
115. Globulol
116. Viridiflorol
117. Cariofileno epóxido
118. -cariofileno óxido
119. Cariofileno oxido
120. Isocariofileno óxido
121. Ledol
122. Guaiol
123. Humuleno epoxido
124. 10-epi-γ-Eudesmol
125. 1,10-di-epi-cubenol
C15H22O
126. -eudesmol
127. Hinesol
128. Epi- -muurolol
129. Cubenol
130. Cariofila-4(14),8(15)-dien-5- -ol
131. Epi-cubenol
132. -eudesmol
133. Kongol
134. -eudesmol
135. Cadina-1,4-dieno-3-ol
136. δ-cadinol
137. -Cadinol
138. T-cadinol
139. T-muurolol
140. -Muurolol
141. -bisabolol
142. -bisabolol
143. (Z)-trans-a-bergamotol
144. Bulnesol
1
2
3
+
+
4
5
6
+
+
7
8
9
+
10
11
+
+
12
13
14
15
16
17
18
19
+
+
+
+
20
21
22
+
+
+
+
+
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+
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+
+
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+
+
+
+
+
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+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
144
Tabela 1. Constituintes químicos identificados no óleo essencial de espécies do gênero Piper. (Continuação)
(Continuação)
1
2
3
4
145. Torreyol
146. (E,E)-Farnesol
Outros
147. Tridecano
148. 2-tridecanona
149. 2-Dodecanona
150. 2-Nonyl-1-ol
151. 1,3,5-trimetoxibenzeno
152. Dilapiol
153. Safrol
154. Eugenol
155. Metileugenol
156. (Z)-metil isoeugenol
157. (E)-metil isoeugenol
158. isoelemicina
159. Elemicina
160. (Z)-isoelemicina
161. (E)-isoelemicina
162. Miristicina
163. Metoxi 4,5-metilenodioxi propiofenona
164. 3,4-metilenodioxipropiofenona
165. 2-hidroxi-4,5-metilenodioxipropiofenona
166. 2-metoxi-4,5-metilenodioxi-propiofenona
167. -asarona
168. -asarona
169. -asarona
170. Apiol
171. Asaricina
172. Ácido hexadecanóico
173. Transanetol
1 : P. permucronatum (Torquillo et. al. 1999)
2 : P. amplum (Santos et. al., 2001)
3 : P. arboreum (Santos et. al., 2001)
4 : P. dilatatum (Santos et. al., 2001)
5 : P. goesii (Santos et. al., 2001)
6 : P. hispidum (Santos et. al., 2001)
7 : P. hoffmanseggianum (Santos et. al., 2001)
8 : P. mollicomum (Santos et. al., 2001)
9 : P. somlsianum (Moreira et. al., 2001)
5
+
6
7
8
9
10
11
+
+
12
13
14
15
16
17
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19
20
21
22
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+
+
+
+
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+
+
+
+
+
+
+
+
10 : P. reticulatum (Luz et. al., 2003)
11 : P. crassinervium (Luz et. el. 2003)
12 : P. aduncum (Gottlieb et. al., 1981)
13 : P. callosum (Gottlieb et. al., 1981)
14 : P. hispidinervum (Gottlieb et. al., 1981)
15 : P. fimbriolatum (Mundina et. al., 1998)
16 : P. obliquum (Mundina et. al. 1998)
17 : P. fulvescem (Vila et. al.,2001)
+
18 : P. tuberculatum var. tuberculatum (Facundo et. al., 2005)
19 : P. barbatum (Vargas et. al.,2003)
20 : P. lhotzkyanum (Moreira et. al.1998)
21 : P. guineense (frutos) (Ekundayo et. al., 1988).
22 : P. marginatum folhas (Ramos et. al., 1986)
145
Tabela 1. Constituintes químicos identificados no óleo essencial de espécies do gênero Piper. (Continuação)
(Continuação)
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
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+
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+
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+
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+
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37
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40
41
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+
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+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Monoterpenos hidrocarbonetos
1. Tricicleno
2. -tujano
3. -pineno
4. Canfeno
5. 6-methyl-5-heptanona
6. -pineno
7. Sabineno
8. Myrceno
9. –Phellandreno
10. -terpineno
11. δ-3-careno
12. ρ-cimeno
13. Limoneno
14. -phelandreno
15. (Z)-Ocimeno
16. (E)-Ocimeno
17. (E)- -Ocimeno
18. p-cimeneno
19. (Z)- -ocimeno
20. -terpineno
21. Car-3-eno
22. Allo ocimeno
23. Terpinoleno
24. (E)-sabinenp hidrato
25. (Z)-sabineno hidrato
26. 1,3,8-p-mentatrieno
27. -tepineno
28. Verbeneno
Monoterpenos Oxigenados
29. Isopulegol
30. Estragol
31. Camfora
32. Transpinocarveol
33. Pinocarvona
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
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+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
43
146
Tabela 1. Constituintes químicos identificados no óleo essencial de espécies do gênero Piper. (Continuação)
(Continuação)
34. Canfolenal
35. Borneol
36. (Z)-piperitol
37. (E)-piperitol
38. Piperitol
39. Piperitona
40. 1,8 cineol
41. Mirtenal
42. Acetato de mirtanila
43. Linalool
44. Terpinen-4-ol
45. Alcanfor
46. ρ-cimen-8-ol
47. Linalil acetato
48. Carvona
23
24
25
26
27
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
+
+
+
+
+
+
+
+
42
43
+
+
+
+
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+
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+
+
+
+
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+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
49. δ-terpineol
50. -terpineol
51. -terpineol
52. Neral
53. Verbenona
54. (Z)-p-ment-2-en-1-ol
55. Nerol
56. Timol
57. Bornyl acetato
Sesquiterpenos hidrocarbonetos
58. Ciclosativeno
59. -elemeno
60. E- -bergamoteno
61. δ-elemeno
62. -cubebeno
63. -copaeno
64. -bourboneno
65. -cubebeno
66. (E)-cariofileno
67. -muuroleno
68. -muuroleno
69. -ylangeno
28
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
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+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
147
Tabela 1. Constituintes químicos identificados no óleo essencial de espécies do gênero Piper. (Continuação)
(Continuação)
70. -bisaboleno
71. Sesquiceneol
72. -cedreno
73. -gurjuneno
74. -gurjuneno
75. Germacreno C
76. -elemeno
77. Neryl acetona
78. -trans-bergamoteno
79. -cariofileno
80. Tujopseno
81. 6,9-guaiadieno
82. E- -farneseno
83. -gurjuneno
84. Germacreno D
85. Δ-guaieno
86. Ledeno
87. -Selineno
88. -Selineno
89. Allo aromadendreno
90. Aromadendreno
91. Geranil cetona
92. Biciclogermacreno
93. Germacreno A
94. (E,E)-a- Farneseno
95. Δ-cadineno
96. - cadineno
97. Cadina-1,4-dieno
98. -Cadieno
99. -humuleno
100. -curcumeno
101. Calameneno
102. Calacoreno
103. Zingibereno
104. Furanodieno
105. Germacreno B
Sesquiterpenos Oxigenados
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Tabela 1. Constituintes químicos identificados no óleo essencial de espécies do gênero Piper. (Continuação)
(Continuação)
106. Elemol
107. -elemol
108. -elemol
109. Nerolidol
110. (E)-Nerolidol
111. (Z)-Nerolidol
112. 6E-Nerolidol
113. Germacreno-δ-4-ol
114. Isoespatulenol
115. Spathulenol
116. Globulol
117. Viridiflorol
118. Cariofileno epóxido
119. -cariofileno óxido
120. Cariofileno oxido
121. Bornil isovalerato
122. Neril isovalerato
123. Ledol
124. Epi cubebol
125. Guaiol
126. Humuleno epoxido
127. 10-epi-γ-Eudesmol
C15H22O
128. Epi- -muurolol
129. Cubenol
130. 1-epi-cubenol
131. Cariofila-4(14),8(15)-dien-5- -ol
132. -eudesmol
133. -eudesmol
134. δ-cadinol
135. -Cadinol
136. T-cadinol
137. T-muurolol
138. -Muurolol
139. -bisabolol
140. (Z)-trans-a-bergamotol
141. 11-selinen-4-ol
142. 2(E),6(E)-farnesol
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Tabela 1. Constituintes químicos identificados no óleo essencial de espécies do gênero Piper. (Continuação)
(Continuação)
143. 2(E),6(Z)-farnesol
144. 2(Z),6(Z)-farnesol
Outros
145. -ianona
146. Fitol
147. Tridecano
148. (E)-2-tridecenal
149. -ianona
150. 2-nonanona
151. (E)-2-hexenal
152. 2-hexil-butirato
153. Ácido bezenopropanoico etil ester
154. Trans diidroagarofurano
155. Ácido bezenopropanoico metil ester
156. undecanona
157. 2-nonanona
158. Octanal
Fenilpropanóides
159. Dilapiol
160. Safrol
161. Eugenol
162. Metileugenol
163. isoelemicina
164. Elemicina
165. Miristicina
166. 3,4-metilenodioxipropiofenona
167. 2-hidroxi-4,5-metilenodioxipropiofenona
168. Apiol
23 : P. marginatum talos (Ramos et. al.,1986)
24 : P. humaytanum (Andrade et. al., 2006).
25 : P. trichocarpon (Andrade et. Al., 2006).
26 : P. capense (Martins et. Al., 1998)
27 : P. nigrum Frutos (Martins et. Al., 1998)
28 : P. guineense (folhas) (Martins et. Al., 1998)
29 : P. umbellatum (Martins et. Al., 1998)
30 : P. bisasperantum (espigas) (Cicció, 1997)
31 : P. bisasperantum (Folhas) (Cicció, 1997).
32 : P. amalago (Mesquita et. al., 2005).
33 : P. cernum (Mesquita et. al., 2005).
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34 : P. submarginalum (Mesquita et. al., 2005).
35 : P. viscosanum (Mesquita et. al., 2005).
36 : P. carniconectivum Folhas (Facundo et. al., 2005)
37 : P. carniconectivum Talos (Facundo et. al., 2005)
38 : P. regnellii (Constantin et. al. 2001)
39 : P. friedrichsthalii (folhas) Panamá (Vila et. al, 2003)
40 : P. friedrichsthalii (espigas) Panamá (Vila et. al, 2003)
41 : P. friedrichsthalii (folhas) Costa Rica (Vila et. al, 2003)
42 : P. pseudolindenii (Vila et. al., 2003).
43 : P. arboreum var. latifolium (Machado et. al., 1994)
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