UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE - CPGCS
ALINE MENEZES CARLOS
ALFA TALASSEMIA: OCORRÊNCIA E ASSOCIAÇÃO COM O
PERFIL
CLÍNICO, EPIDEMIOLÓGICO
E
LABORATORIAL
EM
DIFERENTES GRUPOS ATENDIDOS NO HOSPITAL DE CLÍNICAS DA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO.
Uberaba - MG
Outubro/2013
ALINE MENEZES CARLOS
ALFA TALASSEMIA: OCORRÊNCIA E ASSOCIAÇÃO COM O
PERFIL
CLÍNICO, EPIDEMIOLÓGICO
E
LABORATORIAL
EM
DIFERENTES GRUPOS ATENDIDOS NO HOSPITAL DE CLÍNICAS DA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO.
Dissertação apresentada ao Curso de PósGraduação em “Ciências da SaúdePatologia Humana” da Universidade
Federal
do
Triângulo
Mineiro,
como requisito parcial para obtenção de
Título de Mestre em Ciências da SaúdePatologia-Humana.
Orientador: Prof. Dr. Helio Moraes de
Souza.
Professor Titular da Disciplina de
Hematologia
e
hemoterapia
da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro
(UFTM).
Uberaba - MG
Outubro/2013
Catalogação na fonte: Biblioteca da Universidade Federal do Triângulo Mineiro
Carlos, Aline Menezes
Alfa Talassemia: Ocorrência e associação com o perfil
clínico, epidemiológico e laboratorial em diferentes grupos atendidos no
Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Triângulo
Mineiro/Aline Menezes Carlos. – 2013.
00000
000 f. : tab. ; graf. ; fig.
Tese (Mestrado em Ciências da saúde-Patologia Humana) - Universidade Federal
do Triângulo Mineiro, Uberaba, MG, 2013.
Orientador: Prof. Dr. Helio Moraes de Souza
1. Hemoglobinopatias. 2. Talassemia Alfa. 3. Análise laboratorial. 4. Perfil clínicoepidemiológico. I. Moraes- Souza, Helio. II. Universidade Federal do Triângulo
Mineiro. III. Título.
CDU 000.00-000.000.0
ALINE MENEZES CARLOS
Alfa Talassemia: Ocorrência e associação com o perfil clínico, epidemiológico e
laboratorial em diferentes grupos atendidos no Hospital de Clínicas da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro.
Esta dissertação será submetida ao processo de avaliação da Comissão Examinadora
para a obtenção do Título de:
MESTRE EM CIÊNCIAS DA SAÚDE-PATOLOGIA-HUMANA
__________________________________
Prof. Dr. Helio Moraes de Souza
Professor Titular da Disciplina e Pesquisas de Hematologia e Hemoterapia da UFTM.
Comissão Examinadora:
__________________________________
Prof. Dr. Helio Moraes de Souza
- OrientadorProfessor Titular da Disciplina e Pesquisas de Hematologia e Hemoterapia da UFTM.
__________________________________
Prof. Dr. Paulo Cesar Naoum
Professor Livre Docente da Universidade
Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho UNESP e diretor da Academia de Ciência
e Tecnologia de São José do Rio Preto
__________________________________
Prof. Drª. Sheila Soares
Professora Adjunta da Universidade
Federal do Triângulo Mineiro - UFTM e
Gerente Técnica do Hemocentro Regional
de Uberaba
Uberaba, 22 de outubro de 2013
DEDICATÓRIA
D
edico
àqueles
que são os
pilares de
minha vida, aos meus
pais, Evandro e
Aparecida, que mesmo
sem nunca terem
frequentado um curso
superior despertaram
em mim, desde a mais
tenra idade o desejo de
estudar e frequentar
uma Universidade.
Graças aos seus
incentivos e apoio, que
mesmo limitados pelo
conhecimento escolar
sempre me ensinaram e
me motivaram a
galgar meus desejos e
sonhos e nunca desistir
mesmo após momentos
desanimadores.
AGRADECIMENTOS
Tenho tanta gente para agradecer que tenho muito medo de ser
injusta com algum. De todo modo, fica aqui a tentativa de agradecer
a alguns, e que estes representem todos os outros. Como não poderia
deixar de ser, agradeço inicialmente:
A Deus, que, pela Sua presença e força, me conduziu ao longo desta
jornada, tornando possível a conclusão de mais uma etapa de minha
vida.
Aos meus pais, Evandro e Aparecida, por sempre me proverem de
ensinamentos para a vida e para todos os momentos difíceis, sem que,
para isso, exigissem nada em troca. Pai, Mãe, devo tanto em troca e
sou tão grata pelo exemplo que vocês são em minha vida, amo vocês.
Ao meu filho, Lucas, meu tesouro e minha força propulsora, minha
maior realização, obrigada pela paciência e pela compreensão nos
momentos de ausência.
Ao meu esposo Cleomar, que representa minha segurança em todos os
aspectos,, que com muito carinho, ternura e inestimável amor soube
ser paciente e compreensivo, sempre ao meu lado.
Ao meu irmão, Leandro, pelo carinho e dedicação, tanto nos
momentos festivos quanto nos tumultuados. A tarefa de irmã mais
velha que cuida, defende e apoia não me faz jus, pois esse mérito é
seu, Lê tenho muita admiração por você.
À minha cunhada Karine e minha prima Tati, pela amizade,
carinho e outros tantos momentos de lazer e partilha de vida,
obrigada!
À toda minha família, pelo apoio tão querido em todos os momentos
felizes, emocionantes e tristes. Aos meus queridos tios, tias, primos e
primas, sem o apoio e carinho de vocês nada disso seria possível.
Aos meus familiares e amigos de longe... Mas, cuja distância física
não nos separou.
Meu especial agradecimento ao professor Dr. Helio Moraes de Souza,
cujos conhecimentos iluminadores e entusiasmo contagiante foram
fundamentais para que este trabalho fosse realizado com sucesso,
obrigado pelo voto de confiança recebido e pela oportunidade de
trabalhar ao seu lado.
Às professoras Dr. Renata Margarida Etchebehere e Dr. Roseli A. da
Silva Gomes, modelos de clareza e objetividade, sempre esclarecendo
minhas
minhas dúvidas neste meu caminhar.
caminhar.
À Dr. Cibele Veloso, pela infinita disponibilidade e por todos os
ensinamentos para condução deste trabalho.
Aos professores Dr. Sebastião Tostes Júnior e Gilberto Pereira pelas
orientações e apoio técnico no desenvolvimento deste projeto.
Aos professores Dr. Paulo Cesar Naoum, Drª Sheila Soares, membros
da Banca Examinadora, por terem atendido ao convite para
desempenhar este papel, dispondo de seu tempo e conhecimento para
analisar este trabalho. Agradeço também ao professor Dr. Paulo
Naoum por permitir o meu estágio no Laboratório de
Hemoglobinopatias da Academia de Ciências e Tecnologia, Centro de
Referência de Hemoglobinas.
À todos os meus amigos que me apoiaram, me corrigiram, me
toleraram e me fizeram saber, antes de tudo, que a vida sem eles não
teria graça alguma. Um muito obrigado às amigas, Fernanda, Aline
Ferreira, Márcia, Alexandra, Bruna, Andreza, pelo incentivo,
amizade e bom humor que amenizaram momentos difíceis e
divertiram momentos descontraídos.
Em especial agradeço à minha grande amiga/irmã Glaucia, que me
proporcionou vivenciar uma amizade verdadeira, quem sempre me
incentivou e ajudou sempre pronta a me ouvir. Não sei o que faria
sem você.
À minha amiga Renata, verdadeira companheira de pesquisa,
sempre gentil, agradeço os conselhos, a amizade e carisma raramente
encontrados nas pessoas e por ser a maior incentivadora na
superação de meus limites.
Às amigas e pós-graduandas Fernanda Bernadelli Garcia e Márcia
M. Ferreira, pelas orientações e auxílio na revisão da redação do
trabalho.
A colaboradora Telma Flora, pelos ensinamentos em análise
diagnóstica de hemoglobinas anormais no laboratório de coagulação
e ainda, pelo exemplo profissional.
À todos colaboradores e amigos do Hemocentro Regional de
Uberaba, em especial Vânia, Malu, Aline, Matheus, , Marise, Maria
Célia, Cíntia, Eloisa, Marieta, Gisele, Artur, Carlos Lima, Thiago,
Nara, Denise, Gerusa, Leila, Eliane, Maria Amélia, Nilson, Bartoneli,
Mirian, Bebel, Carlos Mota, Solange, Maiume, Sr. José (enf.), Sueide,
Vandeir, Telma, Ruan, Carlos (recepção), Marcelo, Sergio, Ieda, Rosa,
Darci, José Carlos, Ramiro, Cacildo, obrigado por me acolherem com
tanta generosidade e me fazer sentir em casa. Foi uma alegria e um
aprendizado diário estar com vocês. A vocês todo o meu carinho,
admiração e respeito.
Ao Corpo Docente e Funcionários do curso de Pós-Graduação em
Ciências da saúde da Universidade Federal de Uberaba, que fazem
com que me orgulhe tanto de mencionar o nome da instituição.
À Silvana, secretária do setor de epidemiologia da Prefeitura
Municipal de Uberaba, pela colaboração inestimável neste trabalho.
À todos os paciente e participantes, pela delicadeza e sensibilidade
no compartilhamento deste meu aprendizado.
Agradeço à Fundação de Amparo à Pesquisa do estado de Minas
Gerais, FAPEMIG, pela bolsa concedida durante os anos do curso.
Aos demais pelas amizades conquistadas...
Enfim, a todos que contribuíram direta ou indiretamente na
elaboração deste trabalho, quer criticando, quer incentivando,
gostaria de manifestar meus sinceros agradecimentos.
“Jamais considere seus estudos como uma obrigação,
mas como uma oportunidade invejável para
aprender a conhecer a influência libertadora da
beleza do reino do espírito, para seu próprio prazer
pessoal e para proveito da comunidade à qual seu
futuro trabalho pertencer”
(Albert Einstein)
Resumo
Introdução: As talassemias são distúrbios hereditários da hemoglobina humana,
resultantes de alterações em genes responsáveis pela produção das cadeias de globina.
São classificadas de acordo com o tipo de cadeia cuja produção está afetada em: α, β, σ,
γσβ e σβγ, sendo a primeira a mais prevalente. A gravidade do quadro clínico da alfa
talassemia (α-tal) está associada ao número de genes alfa afetado, permitindo a seguinte
classificação da doença: portador silencioso; traço alfa talassêmico; doença da Hb H e
hidropsia fetal por Hb Bart´s. Considerando as variações regionais da α-tal no país, o
presente estudo tem o objetivo de conhecer o perfil da alfa talassemia em recémnascidos, doadores de sangue inaptos por anemia em crianças com anemia a esclarecer
de um hospital de referência, mediante a realização de testes laboratoriais de triagem.
Métodos: No período de setembro de 2011 a dezembro de 2012 foram coletadas 1.238
amostras de sangue, das quais 1.004 foram provenientes de recém-nascidos, 214 de
doadores e 20 de crianças. As amostras foram submetidas à eletroforese em pH alcalino,
neutro e ácido, dosagem das hemoglobinas A2 e fetal, além de testes citológicos com
coloração pelo azul de crezil brilhante. O diagnóstico de α-tal foi feito por eletroforese
de hemoglobina em pH alcalino e neutro e pesquisa citológica dos corpúsculos de
inclusão de hemoglobina β e/ou γ. Os dados foram analisados a partir de frequências
absolutas e percentuais e as associações pelo teste χ2 e t-Student com 5% de
significância. Resultados: Dentre os 1.004 recém-nascidos, observamos a incidência da
α-tal de 10,46% (105), destas 92 (9,16%) isoladamente e 13 (1,30%) em associação com
a Hb S; a idade oscilou entre 17 e 64 anos e foi observada associação estatisticamente
significante com a etnia negra (p<0,01). Na análise do perfil hematológico,
identificamos uma diminuição significante da Hb, HCM e CHCM (p<0,0001) nos
doadores sugestivos de α-tal, enquanto que a Hb A2 e Fetal não mostrou diferença. Das
20 crianças analisadas, verificamos a ocorrência da α-tal de 25% (5), sendo que esta foi
identificada somente em associação com a β talassemia. Neste grupo também
evidenciamos associação significativa da α-tal com a etnia negra (p<0,05) e aumento da
Hb A2 (p=0,0328). Em relação aos testes eletroforéticos e citológicos para a pesquisa de
Hb H, 71,49% apresentaram concordância e 31,77% resultados inconclusivos,
evidenciando a dificuldade na identificação visual dessa hemoglobina quando bandas
tênues são formadas e/ou na interpretação dos corpúsculos de inclusão. O diagnóstico
de α-tal foi firmado quando as duas técnicas foram positivas. Conclusão: A incidência
de α-tal nos recém-nascidos, doadores e crianças com anemia a esclarecer foi similar a
de outros estudos no Sudeste; foi constatada a associação entre a presença de α-tal com
a etnia negra, com diminuição dos níveis da Hb A e com a elevação dos níveis de Hb
Fetal e com baixos índices de HCM e CHCM. Enfim, os testes de triagem, isolados ou
em associação com outros parâmetros hematológicos, se constituem como importantes
ferramentas para o diagnóstico da α-talassemia.
Abstract
Introduction: The thalassemias are inherited disorders of human hemoglobin, resulting
from changes in genes responsible for the production of globin chains. Are classified
according to the type of chain whose production is affected in: α, β, σ, and γσβ, σβγ, the
first being the most prevalent. The severity of the clinical alpha thalassemia (α-tal) is
associated with the number of alpha genes affected, allowing the following
classification of the disease: silent carrier, alpha thalassemia trait, Hb H disease and
hydrops fetal Hb Bart's. Considering the regional variations of α - such in the country,
this study aims to identify the characteristics of alpha thalassemia in newborns, blood
donors unfit for anemia in children with sickle clarify a referral hospital by conducting
testing laboratory screening. Methods: From September 2011 to December 2012 were
collected 1.238 blood samples, of which 1.004 were from newborns, 214 donors and 20
children. The samples were subjected to electrophoresis in alkaline, neutral and acid
dosage and fetal hemoglobin A2, and testing with cytological staining crezil bright blue.
The diagnosis of α-tal was made by hemoglobin electrophoresis in neutral and alkaline
pH and cytological screening of inclusion bodies in hemoglobin β and/or γ. Data were
analyzed from absolute frequencies and percentages also associations by χ2 test and
Student t test with 5% significance. Results: Among the 1.004 newborns, the observed
incidence of α-tal of 10,46% (105) of these 92 (9,16%) alone and 13 (1,30%) in
association with Hb S , the ages ranged between 17 and 64 years and statistically
significant association was observed with black ethnicity (p<0,01). In the analysis of
hematological parameters, we identified a significant decrease in Hb, MCH and MCHC
(p<0,0001) in donors suggesting α-tal , while the Hb A2 and Fetal showed no difference.
Of the 20 children studied, we found the occurrence of α-tal of 25 % (5), and this was
identified only in association with β thalassemia. This group also detect significant
association of α - such as black race (p<0,05 ) and increased Hb A2 (p=0,0328).
Regarding electrophoretic and cytological tests for the detection of Hb H, 71,49% and
31,77% showed agreement inconclusive results, showing the difficulty in visual
identification of this hemoglobin when soft bands are formed and/or interpretation of
inclusion bodies. The diagnosis of α-tal was signed when the two techniques were
positive. Conclusion: The incidence of α-tal in newborns, donors and children with
suspected anemia was similar to other studies in the Southeast, found the association
between the presence of α-tal as black race, with decreased levels of Hb A and with
elevated levels of fetal Hb and low levels of MCH and MCHC. Finally, the screening
tests, alone or in combination with other hematological parameters, they constitute an
important tool for the diagnosis of α-thalassemia.
Lista de Figuras
Figura 1- Esquema representando uma hemoglobina
tetramérica.........................................................23
Figura 2- Síntese das diferentes cadeias globínicas ao longo do desenvolvimento
humano.................25
Figura 3- Localização do loci do gene α-globínico no cromossomo 16 e do loci βglobínico no cromossomo
11.......................................................................................................................................2
6
Figura 4- Distribuição mundial das talassemias e hemoglobinas
anormais..........................................32
Figura 5- Genótipos da alfa
talassemia..................................................................................................36
Figura
1Preparação
do
Saponina..............................................................................51
hemolisado
com
Figura 2- Preparação do hemolisado com
clorofórmio.........................................................................52
Figura 3- Hemolisado com clorofórmio e Hemolisado com
saponina..................................................53
Figura 4- Eletroforese em acetato de celulose em pH
8,4.....................................................................53
Figura 5 - Eletroforese em Agar fosfato pH 6,2.
................................................................................54
Figura 6- Procedimento da quantificação da Hb A2.
..........................................................................55
Figura 7- Procedimento de desnaturação alcalina pelo método de Singer para
quantificação da Hb
Fetal.....................................................................................................................................
...................55
Figura 8- A: Preparação da solução azul de crezil brilhante com sangue
total...................................57
Figura 9-Incidência da α-tal nos 1.004 recém-nascidos
analisados.....................................................59
Figura 10- Comparação dos achados do presente estudo com a incidência de algumas
hemoglobinopatias nas diferentes regiões do
Brasil...............................................................................61
Figura 11- Ocorrência da α-tal nos 214 doadores
estudados.................................................................62
Figura 12- Ocorrência da α-tal nas 20 crianças
investigadas................................................................65
Figura 13- Distribuição das formas isoladas e associadas identificadas neste
estudo...........................68
Figura 14- Disposição eletroforética das frações algumas de hemoglobinas em acetato
de celulose, tampão Tris-EDTA-Borato pH
8,6.........................................................................................................69
Figura 15- Visão parcial de fitas de acetato de celulose em pH alcalino contendo a
fração da Hb H..69
Figura 16- Visualização de esfregaços sanguíneos com Hb
H..............................................................70
Figura 17-Desempenho dos testes de
triagem.......................................................................................71
Lista de tabelas
Tabela 1- Incidência mundial de algumas hemoglobinopatias
comuns...................................28
Tabela
2Classificação
clinica
................................................33
Tabela 3- Incidência da
associada)..........................34
e
talassemias
laboratorial
beta
da
α
(intermediária,
talassemia
major
e
Tabela 4- Distribuição absoluta e percentual dos recém-nascidos para cada
característica epidemiológica segundo a presença ou ausência da αtal.........................................................60
Tabela 5 - Ocorrência e características clínicas epidemiológicas segundo a presença ou
ausência da α talassemia, observadas nas 214 amostras de
doadores.....................................................................64
Tabela 6 - Ocorrência e características clínicas epidemiológicas segundo a presença ou
ausência da α talassemia, observadas nas 20
amostras.........................................................................................67
Tabela 7- Comparação entre os testes eletroforéticos e citológicos para a identificação e
pesquisa de Hb H na triagem das amostras com diagnóstico sugestivas de αtal......................................................70
Lista de abreviações e siglas
CEP- Comitê de Ética em Pesquisa
CHCM - Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média
CLAP- Cromatografia Líquida de Alta Performance
DNA- Ácido Desoxirribonucleico
EDTA - EthyleneDiamineTetrAcetic acid - Ácido etilenodiamino tetra-acético
FAPEMIG- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais
fL – fentolitros
g - gramas
g/dL - gramas por decilitro
Hb – Hemoglobina
Hb A- hemoglobina A
Hb A2- hemoglobina A2
Hb C- hemoglobina C
Hb D- hemoglobina D
Hb E- hemoglobina E
Hb F- hemoglobina fetal
Hb H- hemoglobina H
Hb- hemoglobina
Hb S- hemoglobina S
HC- Hospital de Clínicas
HCM – Hemoglobina Corpuscular Média
HRU- Hemocentro Regional de Uberaba
kb – kilobase
LCR - Locus control region – Região controladora do locus
LCR- Região Controladora do Lócus
MCH – mean corpuscular hemoglobin
MCV – mean corpuscular volume
MG - Minas Gerais
mL- mililitros
OMS - Organização Mundial de Saúde
OMS- Organização Mundial da Saúde
pb – pares de bases
PCR – Polymerase Chain Reaction - Reação em cadeia da polimerase
pg – picogramas
PHHF- Persistência Hereditária da Hemoglobina Fetal
PNTN- Programa Nacional de Triagem Neonatal
UFTM- Universidade Federal do Triângulo Mineiro
VCM - Volume corpuscular médio
µL-: microlitros
Lista de símbolos
α-tal.- alfa talassemia
β-tal.- beta talassemia
α- alfa
β- beta
δ- delta
γ- gama
σ- sigma
ε- épsilon
ζ- zeta
ψ- pseudogene
θ- teta
GAG- ácido glutâmico
GTG- valina
AAG- lisina
O2 - oxigênio
CO2- dióxido de carbono
NO- óxido nítrico
NaOH- hidróxido de sódio
(NH4)2SO4 – sulfato de amônio
SUMÁRIO
RESUMO.............................................................................................................................
...................xii
ABSTRACT........................................................................................................................
..................xiii
LISTA DE
FIGURAS......................................................................................... xiv LISTA
DE TABELAS............................................................................................................................xv
LISTA DE ABREVEAÇÕES E
SIGLAS.............................................................................................xvi
LISTA DE
SÍMBOLOS......................................................................................................................x
viii
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA ........................................................................................... 20
2.
EMBASAMENTO
TEÓRICO........................................................................................................23
Estrutura
das
hemoglobinas:
............................................................................23
síntese
e
2.1
ontogenia
2.2
Hemoglobinopatias..............................................................................................................
.............26
2.3
Variantes
estruturais
de
hemoglobinas
anormais)...................................................................28
(Hb
2.4
Talassemia...........................................................................................................................
.............31
Alfa
2.4.1
Talassemia...........................................................................................................................
..35
2.4.2
Diagnostico
laboratorial:
testes
de
triagem
para
alfa
talassemia...................................................38
3.
HIPÓTESE.........................................................................................................................
...............43
4.
OBJTIVOS.........................................................................................................................
...............43
4.1
Geral....................................................................................................................................
..............43
4.2
Específicos...........................................................................................................................
.............28
5.
CASUÍSTICA
E
MÉTODO.............................................................................................................47
5.1
Casuística.............................................................................................................................
.............47
5.1.2
População/Amostra..............................................................................................................
..........47
5.1.3 Critérios de inclusão para ambos os
grupos...................................................................................49
5.1.3.1 Critérios de inclusão para os
doadores.......................................................................................49
5.1.3.2 Critérios de inclusão para as
crianças.........................................................................................49
5.1.4
Critérios
de
exclusão
para
ambos
os
para
as
grupos..................................................................................49
5.1.4.1
Critérios
de
exclusão
crianças........................................................................................50
5.2
Métodos...........................................................................................................................................
.50
5.2.1
Eritrograma....................................................................................................................................5
0
5.2.2
Ferritina
sérica...............................................................................................................................50
5.2.3
Estudo
das
Hemoglobinas/Perfil
Eletroforético............................................................................50
5.2.3.1.1
Preparação
dos
hemolisados....................................................................................................50
5.2.3.1.2
Hemolisado
rápido
com
saponina............................................................................................51
5.2.3.1.3
Hemolisado
com
clorofórmio..................................................................................................52
5.2.4
Eletroforese
de
Hemoglobina........................................................................................................52
5.2.5
Dosagem
de
Hemoglobina
A2........................................................................................................55
5.2.6
Dosagem
de
Hemoglobina
Fetal....................................................................................................55
5.2.7
Pesquisa
da
Hemoglobina
H
.........................................................................................................56
5.2.8
Análise
dos
dados..........................................................................................................................57
6.
RESULTADOS...............................................................................................................................
..59
6.1 Incidência da alfa talassemia e sua associação com o perfil clínico epidemiológico em
recémnascidos................................................................................................................................
......59
6.2 Ocorrência da alfa talassemia e sua associação com o perfil clínico epidemiológico
em
doadores
de
sangue
inaptos
anemia.....................................................................................................................61
por
6.3 Ocorrência da alfa talassemia e sua associação com o perfil clínico epidemiológico
em
crianças
com
anemia
a
esclarecer........................................................................................................................65
6.4 Concordância entre os testes de triagem utilizados para identificação da alfa
talassemia
nos
três
diferentes
grupos
analisados..................................................................................................................68
7.
DISCUSSÃO......................................................................................................................
................73
8.
CONCLUSÃO....................................................................................................................
...............81
9.
REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS............................................................................................83
10.
ANEXOS.............................................................................................................................
.............95
Introdução e Justificativa
1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
Dentre as desordens genéticas das células vermelhas mais comuns e
amplamente difundidas em todo o mundo, destacam-se as hemoglobinopatias, que
compreendem um grupo complexo de anemias1 hereditárias, enfatizando-se a anemia
falciforme e as talassemias como as mais frequentes. Em alguns países onde há grande
1
Condição onde há redução do teor de hemoglobina total no sangue a níveis abaixo das necessidades
fisiológicas determinadas pela demanda de oxigenação tecidual, o que leva a disfunções orgânicas
sistêmicas (BERNARD et al., 2000).
incidência, as hemoglobinopatias tornam-se um problema de saúde pública. Estima-se
que 7% da população mundial é composta por portadores de tais distúrbios e pelo
menos 300.000 a 500.000 nascimentos a cada ano, apresentam as formas severas dessas
patologias (WEATHERALL e CLEGG, 2001; WEATHERALL, 2010; AIMIUWU et
al., 2013; HIGGS, 2013).
Milhões de pessoas trazem na tradução de seu código genético hemoglobinas
(Hbs) anormais em várias combinações com consequências que variam de quase
imperceptíveis a letais. Sendo assim, as anemias hereditárias compreendem um grupo
de distúrbios consideravelmente complexo (ORLANDO et al., 2000).
Em determinadas regiões, a alta prevalência destas alterações pode ser
explicada pela disseminação na população por influência do efeito seletivo da malária
em áreas endêmicas ou introdução pela imigração de uma população afetada
(WEATHERALL e CLEGG, 2001; KRAUSE et al., 2012). No Brasil, pouco se conhece
sobre a verdadeira distribuição dos genes anormais das hemoglobinas, porém é sabido
que o país apresenta significativa mistura racial, onde o processo de colonização teve
grande influência na dispersão desses genes, principalmente nos casos de talassemias e
falcemias. Desta forma, a distribuição das hemoglobinas anormais, provenientes de
formas variantes e talassemias, estão relacionadas com as etnias que compõem nossa
população (ORLANDO et al., 2000).
As hemoglobinopatias são consequências de alterações na síntese de
hemoglobinas e compreendem principalmente os defeitos estruturais e quantitativos na
estrutura molecular que compõe as cadeias de globina. Os primeiros, resultam na
produção de uma hemoglobina com estrutura anormal (as variantes de hemoglobina); já
as alterações quantitativas resultam em redução na síntese de uma das cadeias
globínicas, originando as talassemias, que são classificadas de acordo com a cadeia
afetada (WEATHERALL e CLEGG, 2001).
A detecção dos portadores destas alterações genéticas é de grande relevância
para a saúde pública, pois representam um problema que envolve o sistema de saúde em
todos os níveis de atenção, devido sua elevada incidência e seu caráter crônico e
agravos agudos, com ampla variação clínica (VIANA-BARACIOLI, 2001). Portanto
sua detecção permite evitar o diagnóstico tardio e oferecer informações com suporte
psicoclínico ao indivíduo e seus familiares. A partir disso, poderemos obter mais
sucesso para a realização de programas preventivos nesta área, onde há tratamentos
inadequados e/ou inexistentes (ORLANDO et al., 2000).
Os procedimentos eletroforéticos utilizados para caracterização da Hb S em
bancos de sangue têm favorecido o diagnóstico laboratorial de outras variantes de
hemoglobina de raras frequências, como a hemoglobina H. O diagnóstico das alterações
de hemoglobinas pode ser facilitado através da constante atualização das metodologias
aplicadas na caracterização destes mutantes e treinamento de pessoal para seu correto
diagnóstico laboratorial (BONINI-DOMINGOS, 1993; GUIDELINE, 1998). A
caracterização dos mutantes de hemoglobina favorece o conhecimento destas alterações
na população brasileira e permite a adequada orientação aos portadores.
Em nossa experiência, na prática clínico-laboratorial, temos observado
dificuldades no desempenho das técnicas para pesquisa e quantificação da hemoglobina
H, com elevadas frequências de diagnóstico de alfa talassemia (α-tal) nos pacientes
atendidos pelo Hospital das Clínicas da Universidade Federal do Triângulo Mineiro
(HC-UFTM) e em doadores de sangue inaptos no Hemocentro Regional de Uberaba
(HRU). Além do alto grau de miscigenação da nossa população, a elevada taxa de α-tal
encontrada poderia estar refletindo a dificuldade das técnicas empregadas no seu
diagnóstico, levando a necessidade de esclarecer a real prevalência dessa patologia, bem
como da eficácia dos métodos de triagem normalmente utilizados.
Assim, considerando que a identificação laboratorial de portadores de α
talassemia é importante por duas razões: (1) detecção de portadores de
hemoglobinopatias graves ou com risco de morte e (2) para investigação da anemia
microcítica de etiologia incerta, o objetivo do presente estudo é conhecer o perfil da alfa
talassemia mediante os métodos de triagem empregados no laboratório de
hemoglobinopatias, investigando a sua ocorrência em recém-nascidos, doadores de
sangue inaptos por anemia e crianças com anemia a esclarecer, evitando assim
tratamentos errôneos e desnecessários, tais com intervenções para deficiência de ferro.
2. EMBASAMENTO TEÓRICO
2.1. Estrutura das hemoglobinas: síntese e ontogenia
A hemoglobina é a principal proteína presente nos eritrócitos do sangue de
diversos organismos, responsável pelo transporte de oxigênio (O2) aos tecidos e dióxido
de carbônico (CO2) aos pulmões (WAYE; ENG, 2013). Sua estrutura é oligomérica
composta por quatro cadeias polipeptídicas, duas do tipo alfa (α) e duas do tipo beta (β),
denominadas de globinas. Estas subunidades possuem um sítio onde se fixa à molécula
do grupo prostético de ferro, a ferroprotoporfirina IX (heme) (Figura 1), que cofere cor
vermelha a proteína e detém a propriedade de receber ou liberar o O2 nos tecidos. É
constituída por uma parte orgânica, a protoporfirina e um átomo de ferro no estado
ferroso [Fe (II)]. Para o bom desempenho de sua função, são necessários cerca de 300
milhões de moléculas de Hb por eritrócitos (BERNARD et al., 2000; LORENZI, 2003).
Figura 18. Esquema representando uma hemoglobina tetramérica. As cadeias do tipo alfa estão
demonstradas nas cores vermelho e verde e as tipo beta em azul e roxo, ambos com o grupo
heme
inserido
em
sua
subunidade
(Adaptado
de:
www.chemistry.wustl.edu/~edudev/LabTutorials).
A produção e a síntese de hemoglobina (Hb) está sob o controle de dois genes2
distindos: o gene da α-globina localizado no cromossomo 16, e o gene da β-globina no
cromossomo 11. Existem quatro genes que codificam as cadeias α e dois genes que
codificam as cadeias β. Independente do número de genes responsáveis por controlar a
produção das cadeias α e β, ambas são síntetizadas em quantidades exatamente iguais.
2
São unidades biológicas herdadas e únicas para um organismo individual, fornecendo todas as
informações biológicas necessárias para controlar o crescimento e desenvolvimento. A parte fundamental
de cada gene é uma substância química chamada ácido desoxirribonucléico, ou DNA (Klug et al., 2010).
Os diversos tipos de hemoglobina produzidas em cada fase do desenvolvimento humano
(embrionário, fetal e pós-nascimento) surgem da combinação de diferentes cadeias
globínicas (NELSON e COX, 2004; NAOUM, 1987).
Durante o desenvolvimento embrionário, três Hbs diferentes são sintetizadas
nos eritroblastos policromáticos e ortocromáticos: Gower-1 (ζ2ε2), formada pela
combinação das cadeias zeta (ζ) e épsilon (ε); Portland (ζ2γ2) pela cadeia zeta (ζ), e
gamma (γ); Gower-2 (α2ε2) que surge quando as cadeias α começam a ser sintetizadas e
combinam com a cadeia épsilon (ε) (WEATHERALL e CLEGG, 2001; STEINBERG
et al., 2005; COUTO et al., 2006).
No decorrer do desenvolvimento, agora denominado de período fetal,
predomina a produção da Hb fetal (Hb F), principal Hb durante os dois terços terminais
da vida intrauterina, cuja composição é dada pela combinação das subunidades alfa e
gama (α2γ2), diminuindo seus índices logo após o nascimento, sendo que em adultos
normais apenas traços são encontrados (<1%) (NAOUM, 1987; WEATHERALL e
CLEGG, 2001).
Em torno da 25ª semana de gestação, inicia-se a produção das cadeias delta (δ)
em pequenas quantidades, que lentamente vão aumentando seus índices e estabilizam
por volta do sexto mês de vida. Estas cadeias ligam às cadeias α originando a Hb A2,
que corresponde < 3% da Hb em um adulto normal (NAOUM, 1987; FERNANDES,
2003).
Nos seis primeiros meses de vida, a cadeia β é expressa em poucas
quantidades, porém a partir deste período ocorre uma mudança na síntese de cadeia γ
que é substituída pela síntese de cadeia β, que se unem as cadeias α originando a Hb A,
que compreende cerca de 96% do total das Hbs de um individuo adulto normal. Assim,
as interações das diferentes subunidades de globinas determinam a capacidade da Hb de
transportar O2, CO2 e H+, atendendo às condições fisiológicas (BONINI-DOMINGOS,
1993; LEHNINGER, 1995; COUTO et al., 2006).
A Figura 2 mostra a sucessão de diferentes hemoglobinas e a sua síntese em
cadeias globínicas presentes no embrião, no feto (após a 12ª semana) e no adulto. Após
o nascimento, com a repressão da síntese da cadeia γ e aumento da síntese da cadeia β,
ocorre a troca da Hb F pela Hb A, que se completa entre o 3º e 4º mês de vida.
Figura 19. Síntese das diferentes cadeias globínicas ao longo do desenvolvimento humano
(Adaptado de Weatherall e Clegg, 1981).
Os genes que codificam as cadeias do tipo α, que são compostas por 141
aminoácidos, estão localizados no braço curto do cromossomo 16 (16p13.3). Se alojam
em um complexo denominado agrupamento gênico ou loci3 com cerca de 35Kb de
DNA. Enquanto os que codificam o complexo das cadeias do tipo β, formadas por 146
aminoácidos, estão localizados no braço curto do cromossomo 11 (11p15.5) com um
segmento maior que 60Kb, com grande homologia entre ambas as cadeias (64
aminoácidos estão em posição idênticas) (WEATHERALL e CLEGG, 2001; WAYE e
ENG, 2013).
A regulação da transcrição e expressão dos genes das globinas é controlada
pela integração de sequências regulatórias cis-atuantes4 (como elementos promotores,
reforçadores e silenciadores) reconhecidas por proteínas trans-atuantes5, representadas
pelos fatores de transcrição eritróides ou não eritróides, denominadas de região
controladora de genes (RCG). Portanto, faz parte do locus regulatório da beta globina a
região controladora do locus (LCR), e o elemento regulatório maior (MRE) também
conhecido como HS-40 da alfa globina (WAYE e ENG, 2013, HIGGS, 2013).
A RCG contém quatro locais de ligação de fatores eritróides específicos
hipersensíveis à ação da enzima DNAse (HS 1 a HS 4), necessários para manter a
3
Região específica em um cromossomo onde está localizado um determinante genético (GRIFFITHS et
al., 2008)
4
O termo cis, significa “junto de” ou “no mesmo lado” que outros grupos funcionais. Portanto sequências
ou elementos cis são partes adjacentes da mesma molécula de DNA (KLUG et al., 2010).
5
O termo trans, significa “no lado oposto”. Portanto fatores trans-atuantes, ao contrario, são moléculas
que se ligam a esses elementos (cis) do DNA (KLUG et al., 2010).
estrutura da cromatina aberta, para que os fatores de transcrição possam ter acesso aos
elementos reguladores que medeiam a expressão de cada gene no complexo globínico.
A RCG é responsável por controlar todos os outros genes dos agrupamentos α e β, que
produzem moléculas de RNA polimerases6 específicas para cada gene do agrupamento
de genes do tipo alfa ou do tipo beta. Essas moléculas de RNA polimerases fazem com
que o DNA de cada gene se duplique e uma dessas cópias dê origem ao RNA
mensageiro específico para cada gene. Todo esse processo ocorre nos eritroblastos,
principalmente nos policromáticos e ortocromáticos, na medula óssea. As sínteses de
globinas α e β são simultâneas, bem como a do grupo heme (Figura 3) (CAO e
GALANELLO, 2010; HIGGS, 2013).
Figura 20. Localização do loci do gene α-globínico no cromossomo 16 e do loci β-globínico no
cromossomo 11. As caixas coloridas representam genes funcionais. Os genes γ e α-globínicos
são duplicados; os dois genes α-globínicos têm o mesmo produto, ao passo que os produtos dos
dois genes γ-globínicos são um pouco diferentes (Adaptado de CAO e GALANELLO, 2010).
2.2. Hemoglobinopatias
Compreendem um grupo de distúrbios hereditários que afetam os genes
responsáveis pela síntese das globinas. Normalmente, estas são produzidas em
quantidades iguais mantendo um equilíbrio entre as mesmas. Qualquer perturbação na
síntese destas cadeias pode resultar em um desequilíbrio. Várias condições genéticas
podem acarretar modificações na molécula de Hb e causar hemoglobinopatia, seja por
uma mudança na estrutura de suas cadeias polipeptídicas ou uma falha na síntese de
uma cadeia específica. Elas se dividem em dois grupos principais: síndromes
6
RNA polimerases principal enzima que orienta a síntese do RNA (ácido ribonucleico) (KLUG et al.,
2010).
talassêmicas e variantes estruturais da Hbs ou Hbs anormais. Embora as
hemoglobinopatias estruturais e as talassemias sejam dois grupos geneticamente
diferentes, clinicamente apresentam as mesmas manifestações, tais como: anemia de
grau variável, com hipocromia e microcitose dos eritrócitos e morbimortalidade
considerável (LEONELI et al., 2000; SOUZA et al., 2002; LOBO et al., 2003;
LORENZI, 2003).
As hemoglobinopatias não se limitam a uma determinada região geográfica,
ocorrendo amplamente em todo o mundo, sendo um problema de saúde pública
mundial. A cada ano, milhares de crianças nascem com estes distúrbios genéticos da
hemoglobina, representando uma grande proporção de nascidos acometidos por uma
doença congênita. Apesar de sua distribuição global, segundo relatório publicado pela
Organização Mundial de Saúde (OMS), cerca de 80% das crianças afetadas nasce em
países subdesenvolvidos e em desenvolvimento e aproximadamente 70% nasce com o
gene falciforme e o restante com distúrbios talassemicos (WEATHERALL, 2010).
Nestes países, cerca de 50% a 80% das crianças com anemia falciforme e 50 a 100 mil
crianças com β talassemia major vão a óbito anualmente (AIMIUWU, et al., 2013).
Os dados disponibilizados pela OMS (2006) salientam que 270 milhões de
pessoas em todo mundo carregam genes que determinam a presença de hemoglobinas
anormais em várias combinações, com consequências que variam de quase
imperceptíveis a letais, sendo necessário, portanto, diagnóstico precoce a fim de evitar
maiores complicações (ORLANDO et al., 2000; LISOT; SILLA, 2004; BACKES et al.,
2005).
No Brasil, os distúrbios que afetam a hemoglobina têm sido objeto de estudo
em muitas pesquisas. Estas desordens hereditárias espalhadas através da migração dos
povos colonizadores se dispersarão em nosso meio. Dados descritos na literatura
nacional apontam suas distribuições e prevalências analisadas em diferentes regiões e
grupos étnicos e estimam que o país possua aproximadamente 10 milhões de portadores
destes distúrbios. No entanto, dados epidemiológicos atualizados ainda são escassos ou
até mesmo ausentes em muitos municípios brasileiros. Assim, os dados disponíveis
talvez possam estar subestimados, apesar das crescentes pesquisas (SALZANO, 2002;
LISOT; SILLA, 2004; GARANITO, 2008).
A Tabela 1 mostra a incidência aproximada de algumas hemoglobinopatias
mundialmente comuns, distribuídas por regiões, segundo classificação da OMS. De
acordo com Weatherall (2008) os dados expostos devem ser interpretados com cautela,
pois muitos foram obtidos a partir de estudos feitos com pequenas amostras da
população.
Tabela 1 - Incidência mundial de algumas hemoglobinopatias comuns
Regiões
Hb S
Hb C
Hb E
β-Tal
Tal-α0
Tal-α+
África Subsaariana
1-38
0-21
0
0-12
0
10-50
Américas
1-20
0-10
0-20
0-3
0-5
0-40
Europa
0-30
0-5
0-20
0-19
1-2
0-12
Mediterrâneo Oriental
0-60
0-3
0-2
2-18
0-2
1-60
Pacífico Ocidental
0
0
0
0-13
0
2-60
Sudeste Asiático
0-40
0
0-70
0-11
1-30
3-40
Fonte: WEATHERALL, 2008
O diagnóstico laboratorial precoce dessas doenças hereditárias, apesar de não
possibilitar a cura, promove melhoria da taxa de sobrevida e qualidade de vida dos
portadores, uma vez que, a cada ano, essas desordens afetam severamente cerca de
300.000 indivíduos em todo o mundo (FERRAZ et al., 2007; HIGGS, 2013). Sendo
assim, a associação dos testes de triagem com outros métodos complementares permite
melhor avaliação laboratorial para o diagnóstico das hemoglobinopatias (WAGNER,
2005; HIGGS, 2013).
2.3. Variantes estruturais de hemoglobinas (Hb anormais)
A estrutura molecular da Hb é muito importante para o desempenho de suas
funções, entretanto existem condições genéticas que podem desencadear modificações
na composição de sua molécula. Esse defeito pode está presente e afetar uma ou mais
cadeia globínica. Frequentemente estas alterações, conhecidas como variantes
estruturais de Hb ou Hb anormais, prejudicam a estabilidade da molécula de Hb e
podem modificar seu funcionamento (ORLANDO et al., 2000).
As desordens da hemoglobina resultam de variados defeitos moleculares
(mutações pontuais, inserções ou deleções) na sequência de nucleotídeos nos genes que
codificam as cadeias globínicas, com consequente síntese de um aminoácido diferente.
O quadro fenotípico depende do tipo de mutação e de sua localização na cadeia proteica
afetada, ainda assim, a maior parte das desordens é clínica e hematologicamente
silenciosa (WAGNER, 2005; OLIVEIRA, 2006).
Atualmente mais de 1.160 mutações7 nos genes globínicos foram identificadas,
a maioria produzida pela troca de apenas um único aminoácido em sua cadeia
polipeptídica. Dentre as variantes estruturais de Hb, as clinicamente importantes e
encontradas no mundo todo, são Hb S, Hb C, Hb E, Hb DPunjab, e Hb OArab,
caracterizadas pela presença de uma Hb estruturalmente anômala no interior das
hemácias (BUNN e FORGET, 1986; ROCHETTE et al., 1994, CLARK e THEIN,
2004; ZAGO et al., 2004; STEINBERG, 2006; SONATI e COSTA, 2006).
Nos muitos tipos e subtipos combinados em cada grupo dessas variantes
estruturais, destacam-se as Hb S e Hb C devido à gravidade das manifestações clínicas
(NAOUM, 2004). A formação da Hb S ocorre devido à troca do ácido glutâmico
(GAG) pela valina (GTG) no sexto códon do gene β. Em baixa tensão de O2 essa Hb
altera a sua configuração adquirindo forma de foice. O acúmulo dessas hemácias
falcizadas provoca obstrução dos vasos sanguíneos desencadeando lesão tecidual. A
forma heterozigota8 (AS ou FS) é conhecida como traço falciforme, que geralmente não
exibe sintomatologia, ou seja, seus portadores são assintomáticos, enquanto que a forma
homozigota (SS) também designada anemia falciforme, os portadores evoluem com
manifestações clínicas graves, nas quais estão inclusas anemia hemolítica, crises de dor,
necrose de órgãos entre outras (DUCATTI, 2001). Além dessas variações, pode ocorrer
associação com outras hemoglobinas ou dupla heterozigose, como por exemplo, a
Hemoglobinopatia SC, Hemoglobinopatia SD e S/talassemia, as quais cursam com
sintomas clínicos laboratoriais significativos (GARANITO, 2008).
Assim como na Hb S, a substituição do ácido glutâmico (GAG) pela lisina
(AAG) na sexta posição no gene da β globina determina a síntese da Hb C, que pode ser
evidenciada pela formação de cristais rígidos alongados (tactóides), no interior dos
eritrócitos sendo capazes de deformá-los, evento denominado de cristalização. Os
heterozigotos (AC ou FC) apresentam-se assintomáticos. Já os indivíduos homozigotos
(CC) e heterozigotos em interação (SC, C/talassemia) evidenciam uma anemia
7
Descritas no banco de dados de Hb variantes (Hbvar) no Globin Gene Server disponível no endereço
eletrônico http://globin.bx.psu.edu/hbvar/menu.html/2013 até junho de 2013.
8
Quando um indivíduo apresenta um par de alelos diferentes, o indivíduo é dito heterozigoto ou
possuidor de genótipo heterozigoto, em relação ao locus desses genes. Se os alelos de um par forem
idênticos ele será dito homozigoto, em relação ao loco desses alelos (GRIFFITHS et al., 2008).
hemolítica de diferentes graus (BONINI-DOMINGOS et al., 2003; STEINBERG, 2006;
GARANITO, 2008).
Estima-se que em todo o mundo existam aproximadamente 30 milhões de
indivíduos heterozigotos para gene da Hb S (βs), dos quais mais de 6.000.000 somente
no continente africano, onde a prevalência varia entre 2% a 40% em determinadas
regiões (WEATHERALL, 2010). Pesquisas demonstram incidências significativas em
outras partes do globo, como por exemplo, nas Américas, onde a frequência chega
atingir 15% dos afro-americanos, e em torno de 2%-23% dos indivíduos com
ascendência africana, em alguns países caribenhos. Além da África e das Américas,
hoje, o gene βs globínico é encontrado em toda a Europa e em grandes regiões da Ásia.
(SERJEANT; HAMBLETON; THAME, 2004; WHO, 2013).
Na população brasileira a prevalência de indivíduos heterozigotos para as
hemoglobinopatias C e S é significativa, variando de 1 a 3% e 2% a 10%,
respectivamente (NAOUM, 2004). Em geral, esses indivíduos não desenvolvem a
doença, sendo então classificados como portadores assintomáticos, entretanto, podem
passar o gene anormal para seus descendentes e assim contribuir com a propagação
dessas anomalias (RAMALHO; MAGNA; SILVA, 2003). Dados recentemente
divulgados mostraram que cerca 30.000 pessoas são acometidas pelas formas graves
dessas doenças, com destaque para anemia falciforme (Hb SS), a doença falciforme Hb
SC e a forma associada da Hb S e β talassemia (S/β-tal) (HOLSBACH et al., 2010).
Em Minas Gerais, segundo estimativas disponíveis, a doença falciforme afeta
72 em cada 100.000 nascimentos, e em torno de 1 para cada 30 nascimentos de portador
com traço. Estima-se que, a cada ano, ocorram no país cerca de 3.200 novos casos de
pacientes com doença falciforme (RAMALHO; MAGNA; SILVA, 2003; NAOUM,
2004, CEHMOB-MG, 2007). A incidência para esta doença é muito significativa em
diversas regiões de Minas Gerais, principalmente a região Norte e Nordeste, cuja
relação está ligada à migração dos povos africanos oriundos do tráfico de escravos,
durante o período de colonização do Brasil. Nas demais regiões de Minas, a ocorrência
da doença falciforme também evidencia o fato desta doença ser um dos principais
problemas de saúde pública enfrentados pelo estado (CEHMOB-MG, 2007). Portanto, a
triagem desses portadores é importante para fornecer triagem neonatal, pré-natal para
mulheres em risco, aconselhamento genético, quando apropriado, e para estimar com
precisão a verdadeira prevalência e impacto na saúde pública desses transtornos
(WEATHERALL, 2012).
2.4. Talassemia
A história da talassemia na literatura científica surgiu com o primeiro relato
clínico dos pediatras Thomas B. Cooley e Pearl Lee, em 1925, quando diagnosticaram a
doença em quatro crianças descendentes de italianos e gregos, que apresentavam anemia
grave, hepatoesplenomegalia, alterações ósseas faciais e cranianas, resistência osmótica
dos eritrócitos aumentada e leucocitose, por essa razão ficou conhecida como anemia de
Cooley. No entanto, a aplicação real da palavra “talassemia”, que se origina do
vocábulo grego tálassa e significa mar, é atribuída a George Whipple e William
Bradford que em 1932, utilizaram o termo, hoje adotado universalmente, para
caracterizar uma anemia altamente incidente na região do Mar Mediterrâneo
(WHIPPLE e BRADFORD, 1936; NAOUM, 2004; WEATHERALL e CLEGG 2001).
Atualmente, as síndromes talassêmicas fazem parte de uma das doenças mais
pesquisadas entre as hemoglobinopatias. Mais de 200 mutações que causam β
talassemia foram descritas (o maior número são mutações pontuais) e mais de 100
mutações que causam α talassemia foram relatadas, a maioria envolvendo deleções
dentro do agrupamento gênico da α-globina. (VICHINSKY, 2013, HIGGS, 2013). Sua
distribuição inclui as áreas que margeiam o mar Mediterrâneo, continente Africano,
Oriente Médio, Índia e Sudeste Asiático (FORGET e COHEN, 2005; WEATHERALL
e PROVAN, 2000; GALANELLO e CAO, 2011; WAYE e ENG, 2013).
O gene da β talassemia está presente em 3 a 8% dos norte-americanos de
origem italiana ou grega e em 0,5% dos negros norte-americanos. Na população
brasileira oscila entre 0,5% e 1,5% (NAOUM, 1987, 2004; LINKER et al., 2005; CAO
e GALANELLO, 2010). Estima-se que, no mundo, aproximadamente 15 milhões de
pessoas sejam portadoras de alguma forma da doença (CLARKE e HIGGINS, 2000;
WAYE e ENG, 2013). Em algumas regiões a frequência de portadores pode atingir de
80% a 90% da população, ou seja, quase todos os indivíduos possuem um ou mais
genes da talassemia. As áreas geográficas nas quais prevalece a talassemia relacionamse estreitamente com as regiões em que a malária por Plasmodium falciparum era ou é
endêmica (Figura 4). A resistência à infecção por malária, entre os portadores de
distúrbios da Hb, aparentemente, evidencia-se através dos mecanismos envolvidos na
seleção natural que contribuíram para a sobrevida desses indivíduos em áreas de
endemia da doença (HENDRICKS, 2003; CAO e GALANELLO, 2010; WILLIAMS e
WEATHERALL, 2012; YAP et al., 2013).
Figura 21- Distribuição mundial das talassemias e hemoglobinas anormais. A disseminação
dessas hemoglobinopatias sobrepõe à distribuição geográfica da malária. A doença da Hb H é
predominantemente vista no sudeste da Ásia, Oriente Médio, África e Mediterrâneo (área
laranja). A prevalência tem aumentado previamente nas áreas não endêmicas (áreas laranja com
pontilhados azul) como consequência dos fluxos migratórios históricos e recentes, tráfico de
escravos, as atividades comerciais e de colonização. Em todas essas regiões há uma alta
prevalência de talassemia. Acredita-se que os portadores de talassemia α são protegidos contra a
malária e que a seleção natural é responsável por elevar e manter as suas frequências de genes
(HARTEVELD e HIGGS, 2010; KRAUSE et al., 2012; WILLIAMS e WEATHERALL, 2012).
Assim, elas são classificadas como distúrbio genético, de ampla distribuição
mundial, cujas manifestações clínicas resultam de um desequilíbrio total ou parcial na
síntese das cadeias de globina que formam as Hbs. Como consequência, ocorre uma
hemoglobinização deficiente das hemácias, que por sua vez, resulta em eritrócitos
microcíticos e hipocrômicos, com dano em sua membrana celular e seus precursores
eritróides (culminando com sua remoção precoce da circulação pelo sistema
fagocitário), devido ao excesso das subunidades de globina despareadas (FORGET e
COHEN, 2005; WEATHERALL, 2006; KRAUSE et al., 2012). Pode se evidenciar
índice de anisocitose (RDW9) normal ou pouco aumentado, reticulocitose e severidade
clínica variável (TANEJA, 2005).
9
Red Cell Distribution Width - RDW (Distribuição da Largura das Células Vermelhas).
Do ponto de vista clínico as talassemias são classificadas de acordo com o tipo
de cadeia cuja produção está afetada em: α, β, δ, δβ e γδβ. Este defeito de sínteses pode
envolver qualquer cadeia de globina, as talassemias α e β são as que apresentam maior
frequência e importância clínica em todo o mundo (BUNN e FORGET, 1986;
WEATHERALL, 2001; VICHINSKY, 2012).
Na maioria das vezes as α talassemias derivam de deleções totais ou parciais do
gene α globina, enquanto que os principais defeitos moleculares responsáveis pela
maioria das β talassemias são devido a polimorfismos (mutações pontuais e pequenas
deleções ou inserções) na sequência do gene β globina. (WEATHERALL e CLEGG
2001; CAO e GALANELLO, 2010; GALANELLO e CAO, 2011; WAYE e ENG,
2013).
As diversas manifestações clínicas da α-tal estão relacionadas à intensidade do
bloqueio ou do gene que sintetiza a cadeia α, que vão desde casos assintomáticos, com
resultados clínicos hematológicos normais até a síndrome incompatível com a vida
(hidropsia fetal por Hb Bart) (Tabela 2) (TANEJA, 2005; GALANELLO e CAO, 2011;
VICHINSKY, 2012).
Tabela 2- Classificação clínica e laboratorial da α talassemia
Fenótipo/
Nº de genes
Características
Genótipo
α afetados
Clínicas
Clínica e hematologicamente
1
Portador Silêncioso1
normal
Traço talassêmico2
Doença da Hb H3
Hidropsia fetal por Hb
Bart’s4
2
Microcitose, hipocromia e anemia
leve
3
Microcitose moderada à severa,
hipocromia, anemia hemolítica,
Icterícia, hepatoesplenomegalia
moderada
4
Anemia severa, edema
generalizado, ascite,
hepatoesplenomegalia marcada,
manifestações esqueléticas e
cardiovasculares, geralmente
ocasiona em morte fetal.
% Síntese de
cadeia α
75%
50%
25%
0%
Fonte: Adaptado de GALLENO e CAO, 2011.
Nota: 1. Supressão ou inativação de um dos gene da α-globina (-α/αα), também conhecido
como talassemia α+; 2. Supressão ou inativação de duas cadeias da α-globina, ou em cis de
configuração (--/αα) ou em trans de configuração (-α/-α), também conhecido como talassemia
αº; 3. Supressão ou inativação de três cadeias da α-globina; 4. Supressão ou inativação de todos
os quatro genes da α-globina (- -/- -) impossibilitando a síntese das Hb F e Hb A, com isto, o
sangue fetal em sua maior parte é composto por Hb Bart’s (γ4) e de 10-15% da hemoglobina
embrionária Portland (ζ2γ2).
Os pacientes β talassêmicos apresentam quadros fenotípicos mais heterogêneos
quando comparados aos portadores da α talassemia. Nas alterações do gene que levam à
talassemia beta menor (β+) ou forma heterozigótica, os portadores geralmente são
assintomáticos já nos heterozigotos compostos (associado à Hb variante), a gravidade é
variável e alguns podem ser tão graves quanto os homozigotos. Já na forma homozigota
(βº) conhecida como Talassemia β Maior, os portadores são clinicamente caracterizados
por anemia hemolítica grave, icterícia, hepatoesplenomegalia e alterações ósseas
generalizadas, que decorrem da intensa hiperplasia eritróide na medula óssea, em
resposta ao processo hemolítico (LIMA, 2001; OLIVEIRA, 2003; VICHINSKY, 2012).
Em alguns pacientes a herança concomitante da talassemia α e aumento da
produção de Hb F são responsáveis por leves fenótipos clínicos. No entanto, existem
ainda alguns fatores desconhecidos que podem modular a gravidade da doença em
ambas as talassemias α e β (NAOUM, 1987, 2004; WEATHERALL, 2010).
As alterações no ritmo de síntese das cadeias polipeptídicas leva à um
desequilíbrio entre as globinas α e β, e dessa forma, o excesso de uma das cadeias forma
homotetrâmeros que se precipitam no interior dos eritrócitos danificando suas
membranas e de suas células precursoras, levando a destruição prematura de eritrócitos.
Sendo assim, quanto maior for o bloqueio da síntese de uma das globinas, maior será o
desequilíbrio, mais intensa será a quantidade de globinas precipitadas, e mais extensas
serão as lesões nos eritrócitos que serão retirados precocemente da circulação causando
anemias hemolíticas de graus variados (LINKER, et al., 2005; WEATHERALL, 2010).
De um modo geral, a sintomatologia exibida pelo portador de talassemia
depende do grau de deficiência da cadeia afetada, podendo apresentar anemia, fraqueza,
cansaço, dores nas pernas, palidez, icterícia, e dependendo da gravidade da doença,
ocorrem alterações esqueléticas, hepatomegalia, esplenomegalia, cálculos biliares,
insuficiência cardíaca e disfunções hormonais, ou ainda manifestar sinais e sintomas de
infecção, que é a causa mais comum de morte em crianças com talassemia (NAOUM,
1987, 2004; LINKER, et al., 2005; CAO e GALANELLO, 2010; HIGGS et al.,2012).
Analisando o conjunto de afecções acima mencionadas, a OMS e a
Organização Pan-americana de Saúde (OPAS) salientam a importância de definir
estratégias para a prevenção e controle das talassemias, que incluem serviços de triagem
populacional dos heterozigotos (pois os homozigotos são facilmente identificados)
atuando principalmente no diagnóstico neonatal (teste do pezinho) e informações sobre
aconselhamento genético, entretanto a aplicação deste último é muito difícil, pois requer
a inclusão de um geneticista no sistema de saúde (MODELL e DARLISON, 2008;
WEATHERALL, 2010).
No Brasil, os tipos de talassemia mais prevalentes são as talassemias α e β que
se manifestam em heterozigose, homozigose e formas interativas. O número de
indivíduos afetados varia de acordo com a origem racial do grupo populacional
analisado (LINKER, et al., 2005). A tabela 3 mostra a distribuição regional da
população brasileira com β talassemia nas formas minor, intermédia, major e S/β
talassemia, conforme dados disponibilizados pela Associação Brasileira de Talassemia
(ABRASTA, 2013).
Tabela 3 - Incidência da talassemias beta (intermediária, major e associada)
Regiões do Brasil
nº de casos
% do total de casos
Norte
17
2,31
Nordeste
187
25,55
Centro-Oeste
39
5,33
Sudeste
418
57,11
Sul
71
9,7
Nº total de Casos
732
100
Fonte: ABRASTA, 2013
2.4.1 Alfa Talassemia
A alfa talassemia (α-tal) constitui um grupo de doenças genéticas monogênicas
autossômicas recessivas, que estão entre as mais comuns no mundo, causadas pela
deficiência da síntese de cadeias α da Hb (OLIVEIRA; MENDIBURU; BONINIDOMINGOS, 2006; DIAS-PENNA et al, 2010; WAYE e ENG, 2013). Isso leva a uma
produção excessiva de cadeias β que se unem e formam a Hb H (tetrameros β4), em
adultos e crianças. Já em recém-nascidos o excesso de cadeias γ produzem a Hb Bart’s.
Existem quatro genes da α globina localizados no cromossomo 16. Os fenótipos
da α talassemia são determinados na maioria das vezes pela deleção de 1, 2, 3 ou 4
desses genes, ou ainda por pequenas mutações pontuais (VICHINSKY, 2012; WAYE e
ENG, 2013). A expressão clínica e hematológica é diretamente proporcional ao número
de genes α deletados. Portanto conforme o número de genes deficientes, os fenótipos
observados são: portador silencioso, traço α talassêmico, doença da Hb H e hidropsia
fetal por Hb Bart's, respectivamente (LINKER, et al., 2005; LIMA et al., 2006;
OLIVEIRA et al., 2006).
Figura 22 - Genótipos da alfa talassemia. As caixas azuis representam a presença do gene alfa e
as vermelhas sua ausência (Adaptado de WEATHERALL e PROVAN, 2000).
A distribuição das α talassemias é comum em todas as partes do mundo onde a
malária é endêmica. Estudos têm sugerido que esta evidência confirma que a malária é
de fato a principal força seletiva por trás das altas frequências das hemoglobinopatias
hereditárias, como demonstrado em muitos países endemicos. As provas que sustentam
esta afirmação vem de quatro fontes principais: a similaridade entre as distribuições da
malária e das hemoglobinopatias específicas em determinados locais, regiões, e países;
as predições históricas e genéticas da população, a partir de estudos clínicos realizados
em áreas endêmicas da malária, e a partir de pesquisas realizadas tanto in vitro quanto in
vivo. Tais evidências são mais fortes para a Hb S e para as talassemias, que têm sido o
foco da maioria das pesquisas, e com base nisso, não há dúvida de que a malária é
responsável
pelas
atuais
distribuições
das
principais
hemoglobinopatias
(WEATHERALL e CLEGG 2001; WILLIAMS e WEATHERALL, 2012). Abaixo
estão listados os percentuais aproximados de várias populações com algumas formas de
α talassemia:
• Europa - 4-12%
• Oriente Médio e Ásia ocidental - 12-55%
• Sudeste da Ásia - 6-75%
• África - 11-50%
• América do Sul e Caribe - 7% (WEATHERALL e CLEGG 2001; CAO e
GALANELLO, 2010; GALANELLO e CAO, 2011; HIGGS et al., 2012; KRAUSE et
al., 2012).
A deleção -α3.7 é a forma mais comum de α talassemia observada mundialmente,
seguida de outras como α-4.2, --MED, α-20.5, --SEA, --FIL e --THAI. Atualmente, estão
descritas mais de 20 deleções, sendo que algumas podem remover ambos os genes α in
cis/trans ou até mesmo todo o locus (Globin Gene Server, 2013). Essas deleções
abrangem regiões de 100 a 300 kb (HIGGS et al., 2001) ou segmentos maiores de até 2
Mb, em casos de pacientes com Síndrome do Retardo Mental associado à α talassemia
(ATR-16) (LEWIS, 2006; HARTEVELD et al., 2007; DIAS-PENNA et al., 2010;
SIMÕES et al., 2010; LORENZZI, 2011).
Além disso, existem deleções raras que suprimem a expressão do gene α por
eliminar o elemento regulatório principal HS-40 ou α-MRE (Major Regulatory
Element) localizado a 40 Kb upstream ao agrupamento de genes α (HIGGS et al., 1998,
HIGGS et al., 2001, VIPRAKASIT et al., 2006). Deleções ocorridas nesse local levam a
uma importante redução na expressão dos genes α, podendo chegar a níveis abaixo de
5% (VOON e VADOLAS, 2008). Até o momento, mais de 20 deleções comprometendo
o sítio HS-40 foram descritas, que em geral, ocasionaram a remoção de 3,3 a 160 kb da
região. Nesses casos, os pacientes acometidos apresentavam uma diminuição dos
valores do volume corpuscular médio (VCM < 80fl) e da hemoglobina corpuscular
média (HCM < 25pg), quadro semelhante ao observado nos portadores que possuem
dois genes α afetados (--/αα ou -α/-) (HATTON et al., 1990; LIEBHABER et al., 1990;
WILKIE et al., 1990; ROMAO et al., 1991, 1992; FLINT et al., 1994, 1996; HIGGS et
al., 1998; WENNING et al., 2002; VIPRAKASIT et al., 2006; HARTEVELD et al.,
2005; SONATI e COSTA, 2006; PHYLIPSEN et al., 2010; HIGGS, 2013;
PHYLIPSEN, 2013; WAYE e ENG, 2013).
Dados da OMS estimam que existam no mundo 270 milhões de portadores de
hemoglobinas anormais e aproximadamente 10 milhões no Brasil, indicando que as
hemoglobinopatias são um problema de saúde pública no país (FERRAZ et al., 2007;
GARANITO, 2008). O Brasil possui notável miscigenação genética, resultante da
mistura de ameríndios nativos do país, portugueses colonizadores, africanos trazidos
para o trabalho escravo e europeus, principalmente da Itália, Alemanha e Espanha
(BONINI-DOMINGOS, 2004; PIMENTA et al., 2006; WAGNER et al., 2010). Desse
modo, o país conta com elevadas frequências de hemoglobinopatias decorrente de genes
anormais que se dispersaram nestes processos migratórios, provocando distúrbios
relacionados, principalmente à anemia falciforme e talassemias (BONINI-DOMINGOS,
2004; LISOT e SILLA, 2004; ZAMARO et al., 2008).
A α talassemia é considerada uma das alterações de hemoglobina mais comum
na população brasileira, chegando a atingir índices acima de 20% (WAGNER et al.,
2010) da população afrodescendente. Em indivíduos com microcitose e hipocromia, a
frequência aproximada é de 50% (SONATI et al., 1996; OLIVEIRA, 2003; MELO
REIS et al., 2006; WAGNER et al., 2010; MESQUITA et al., 2010).
2.4.2 Diagnóstico laboratorial: testes de triagem para alfa talassemia
Em 1975, especialistas em Hbs anormal e talassemias do Comitê Internacional
de Normalização em Hematologia, fizeram recomendações de diagnóstico sobre a
investigação laboratorial dessas condições. Os testes iniciais recomendados incluem um
hemograma completo, eletroforese em acetato de celulose em pH alcalino (8,6), testes
de solubilidade e falcização, quantificação de Hb A2 e Hb F. Se alguma Hb anormal for
identificada nesses ensaios preliminares, técnicas adicionais são recomendadas para sua
identificação. Essas técnicas incluem eletroforese em pH ácido 6,0-6,2, separação das
cadeias de globinas, e focalização isoelétrica. Testes suplementares, incluindo testes
para detecção de Hbs instáveis ou com alteração da afinidade por oxigênio também são
recomendados (CLARKE e HIGGINS, 2000).
O diagnóstico laboratorial precoce dessas doenças hereditárias, apesar de não
possibilitar a cura da doença, promove melhoria da taxa de sobrevida e qualidade de
vida dos pacientes (LIMA, 2001; OLIVEIRA et al., 2006). A identificação laboratorial
de portadores de α talassemia é importante por duas razões: (1) detecção de portadores
de hemoglobinopatias graves ou com risco de morte e (2) para investigação da anemia
microcítica de etiologia incerta, evitando assim tratamentos errôneos e desnecessários
tais com intervenções para deficiência de ferro.
Em geral, o diagnóstico é realizado por meio de achados no hemograma
(análise dos índices e morfologia eritrocitária), métodos eletroforéticos e pesquisa
intraeritrocitária dos corpos de inclusão Hb H, estes definidos como testes de triagem ou
seletivos.
Frequentemente esses portadores são detectados em análises rotineiras ou em
participações em estudos populacionais. Para o rastreamento e identificação sugere-se
incluir a combinação dos testes de triagem e confirmatórios que utilizam técnicas
moleculares. No entanto este último geralmente requerem equipamentos caros que
muitas vezes não são acessíveis a todos os laboratórios, principalmente nos de pequeno
porte, tornando-os economicamente inviáveis, devido aos elevados custos gerados aos
serviços de saúde (WEATHERALL, 2010).
Laboratorialmente nas α talassemias ocorre uma diminuição na concentração
de Hb, que se mostra como uma redução nos índices hematimétricos (SKOGERBOE et
al., 1992). A microcitose (VCM<80fl) e a hipocromia (HCM<27pg) são os mais
importantes critérios de diagnóstico para detectar os portadores de talassemias (CHUI e
WAYE, 1998; WAYE e ENG, 2013), ambos apresentam sensibilidade e especificidade
equivalente, independente da população avaliada. Medidas estratégicas recentes
aplicadas na triagem estabelecem unicamente esses índices como método de escolha na
identificação de indivíduos com mutações clinicamente significativas (CHAN et al.,
2001).
Isoladamente, a aplicação dos testes de triagem não é confiável e nem
recomendada para quaisquer hemoglobinopatias; por isso, a maior parte dos protocolos
recomenda a utilização de mais de uma metodologia na triagem inicial, aumentando a
especificidade auxiliando no diagnóstico das alterações e no direcionamento das
próximas condutas (CHINELATO-FERNANDES e DOMINGOS, 2006).
Portanto, além do hemograma completo e análise da morfologia eritrocitária, a
triagem inicial para talassemia e variantes de Hb é composta pela associação de vários
testes com princípios diferentes (RYAN et al., 2010) que incluem dosagens de Hb A2 e
Hb F, contagem de reticulócitos, dosagens de ferro e ferritina sérica, eletroforese em pH
alcalino (8.0 a 9.0) em acetato de celulose ou gel de agarose (BONINI-DOMINGOS e
MENDES-SIQUEIRA, 2000).
A interação destes testes também permite a identificação das alterações físicoquímicas, morfológicas e funcionais dessas hemoglobinas e auxiliam no diagnóstico,
além de favorecer o entendimento dos mecanismos fisiopatológicos da doença. Como se
sabe, o conhecimento da origem étnica e racial e também do histórico de anemia do
paciente é imprescindível para o estudo das desordens genéticas hereditárias (BONINIDOMINGOS, 2006; LIMA et al., 2010).
A eletroforese é o método de fracionamento mais usado em laboratórios
para identificação de frações de Hb normais e anormais, permitindo ainda quantificálas, através de suas diferentes migrações eletroforéticas, causadas pela troca de
aminoácidos na molécula de Hb (CHINELATO-FERNANDES e DOMINGOS,
2006). Com essas substituições, em pH alcalino a Hb produzida apresentará mobilidade
similar a outras Hb com cargas elétrica equivalentes, tal como, as Hb A2, Hb C, Hb O e
Hb E, e Hb S, Hb D e Hb G (NAOUM, 1999; BONINI-DOMINGOS; MENDESSIQUEIRA, 2000; ORLANDO et al., 2000), tornando-se necessário para algumas Hb
anormais o emprego de técnicas complementares no auxílio diagnóstico, por exemplo, a
confirmação das Hb S e Hb C que é feita em eletroforese ácida pH 6,2 (Agar fosfato),
onde nesta a Hb S separa da Hb D e a Hb C da Hb E, que, em pH alcalino, migram para
mesma região (NAOUM, 1999).
Além disso, as dosagens de Hb A2 e Hb F, pesquisa de corpos de Heinz e
agregados intraeritrocitários de Hb H e Bart’s tem sido extensivamente propagados
como métodos de investigação para talassemias α, e em geral são exames que permitem
uma avaliação adequada das hemoglobinopatias (NAOUM, 1999; ORLANDO, 2000).
A concentração de Hb F acima de 1% na eletroforese sugere a dosagem bioquímica pelo
método da resistência alcalina. Já para a Hb A2 aparentemente com concentrações
aumentadas (> 4%), deve-se dosá-la quantitativamente. As Hb instáveis são constatadas
por teste de desnaturação térmica e pesquisa de corpos de Heinz (NAOUM, 1999).
A presença de Hb H pode ser verificada por eletroforese neutra (pH 7,0) em
acetato de celulose e/ou por pesquisa citológica intraeritrocitária de Hb H com azul de
cresil brilhante 1%. No entanto, diversos estudos relatam e qualificam os testes
citológicos como laboriosos, observador-dependente e com baixa sensibilidade para
detectar as formas talassêmicas afetadas pela disfunção de um ou dois genes α
(SKOGERBOE et al., 1992; CLARKE e HIGGINS, 2000; CHAN et al., 2001; DIASPENNA et al., 2010; RYAN et al., 2010). Porém, existem outros estudos sobre o tema
na literatura científica que afirmam exatamente o contrário, sugerindo ainda que para
aqueles que queiram aumentar a sensibilidade e confiabilidade do método, outras
possíveis causas de microcitose devem ser excluídas, como por exemplo, a deficiência
de ferro, traço β talassêmico ou as variantes de Hb (THOMPSON et al.,1989; SABATH
et al., 2003; NAOUM, 1987, 2004; PAN et al., 2005; REPAPINOU et al., 2007;
HARTEVELD e HIGGS, 2010; WAYE e ENG, 2013).
Nos últimos anos, com o avanço das ferramentas de análises moleculares novas
linhas de investigação estão surgindo, com isso a quantidade de Hbs variantes descritas
na literatura tem elevado significativamente. Até o momento, cerca de 1.160 já foram
relacionadas e expostas no banco de dados de Hbs variantes (Hemoglobin Variant
Database) (CHINELATO-FERNANDES e BONINI-DOMINGOS, 2006). Apesar do
custo oneroso, a análise do DNA é o método laboratorial definitivo para confirmar a
presença de uma mutação e diferenciar o tipo de deleção que a causa (BELISÁRIO e
VIANA, 2010).
O uso de técnicas apropriadas para o diagnóstico é útil e de grande importância
principalmente para as formas interativas de Hb, especialmente no Brasil, tendo em
vista os inúmeros casos de associação de hemoglobinopatias, além de variantes que
apresentam co-migração. A ocorrência de tais associações exige, portanto, que todos os
recursos disponíveis, em nível laboratorial, sejam utilizados em benefício do paciente e
seus familiares. O esclarecimento diagnóstico destes casos é fundamental, tanto para o
correto aconselhamento genético quanto para evitar tratamentos inadequados ou
desnecessários dos seus portadores (ORLANDO et al., 2000).
Hipótese
3. HIPÓTESE
Diante do alto grau e miscigenação da população brasileira, na qual o processo
de colonização teve grande influência na dispersão dos genes anormais principalmente
relacionados às talassemias e falcemias, acreditamos que deve existir uma alta
prevalência na região do Triângulo Mineiro, assim como evidenciado nas demais
regiões de Minas Gerais, onde a incidência destas doenças é significativa,
principalmente nas regiões Norte e Nordeste de Minas Gerais, cuja relação está
associada à migração da população negra oriunda do tráfico de escravos, trazidos da
África no processo de colonização do Brasil.
Objetivos
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo geral
Conhecer o perfil da alfa talassemia em recém-nascidos, doadores de sangue
inaptos por anemia e crianças com anemia a esclarecer atendidos no Hospital de
Clínicas da Universidade Federal do Triângulo Mineiro mediante a realização de testes
laboratoriais de triagem.
4.2. Objetivos específicos
1. Verificar a incidência da alfa talassemia e sua associação com o perfil clínico
epidemiológico em recém-nascidos.
2. Verificar a ocorrência da alfa talassemia e sua associação com o perfil clínico
epidemiológico em doadores de sangue inaptos por anemia.
3. Verificar a ocorrência da alfa talassemia e sua associação com o perfil clínico
epidemiológico em crianças com anemia a esclarecer.
4. Verificar a concordância entre os testes utilizados na triagem para alfa
talassemia.
Casuística e Método
5. CASUÍSTICA E MÉTODO
5.1. Casuística
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro e da Fundação Hemominas, com número de
protocolo 1836 intitulado: “Prevalência de talassemia alfa em recém-nascidos, doadores
de sangue inaptos por anemia e crianças com anemia a esclarecer” (Anexo I), a fim de
seguir as normas de ética em pesquisa.
5.1.2 População/caracterização da amostra
Trata-se de um estudo observacional transversal de abordagem quantitativa. A
amostra foi determinada pelo cálculo do tamanho amostral para uma população finita
(até 100.000 habitantes), baseia-se na fórmula →
onde:
n = Tamanho da Amostra
σ = Nível de confiança escolhido, expresso em números de desvio padrão*
p = Percentagem com a qual o fenômeno se verifica
q = Percentagem complementar (100-p)
e = Erro máximo permitido
N = Tamanho da população
*95,5 % de nível de confiança (σ) equivale a 2 desvios padrão
*99,7 % de nível de confiança (σ) equivale a 3 desvios padrão
Usualmente trabalha-se com uma estimativa de erro máximo permitido (e) de 3 e 5%.
Quando não é possível estabelecer previamente a percentagem com o qual o fenômeno
se verifica, adota-se o valor máximo de 50 para p.
Considerando uma frequência de 4% para hemoglobinopatias na população
geral, sem considerar a alfa talassemia, originada por um ou dois genes afetados
(VIANA-BARACIOLI; PAGLIUSI; NAOUM, 2001) e 10% para alfa talassemia em
neonatos (NAOUM, 2004; MENDEZ-SIQUEIRA, 2000). O nível de significância foi
de 3%, com o poder do teste de 95% o tamanho mínimo da amostra para recémnascidos foi de 889. O setor de obstetrícia do HC-UFTM, atente em cerca de 110
gestantes/mês, com uma média de 1320 procedimentos obstétricos/ano. Este serviço é
considerado referência no atendimento às Gestantes de Alto Risco de todo o Triângulo
Mineiro, Alto Paranaíba e Sudoeste Goiano.
Nos grupos específicos, como por exemplo, os indivíduos com anemia não
ferropriva, foi considerado uma frequência de 50% (SONATI et al., 1996; BONINIDOMINGOS, 2003) nestes grupos, onde o tamanho mínimo das amostras foram 169
para doadores e 19 crianças.
O estudo envolveu 1.238 amostras, no período de setembro de 2011 a dezembro
de 2012, das quais 1004 foram de recém-nascidos do berçário do Hospital de Clínicas
da Universidade Federal do Triângulo Mineiro- HC-UFTM, 214 de doadores de sangue
inaptos por anemia do Hemocentro Regional de Uberaba (HRU) e 20 crianças com
anemia a esclarecer atendidas no Ambulatório de Hematologia Pediátrica do HCUFTM, ambos sem distinção de gêneros e etnia, com procedências variadas.
A coleta da amostra dos recém-nascidos foi realizada após o parto (vaginal ou
cesariano) pela punção do cordão umbilical, depois de ligado e seccionado pelo
obstetra, ou subsequente a triagem clinica e hematológica dos doadores inaptos por
anemia e das crianças com anemia a esclarecer, por punção venosa periférica. Foram
colhidos cerca de 4 mL de sangue em tubos contendo anticoagulante (EDTA) as
amostras foram refrigeradas até o momento das análises no laboratório de
hemoglobinopatias do Hemocentro Regional de Uberaba (HRU) após a obtenção do
consentimento informado dos participantes.
Foram realizadas entrevistas com os participantes e/ou responsáveis, nesse
momento foi preenchido uma ficha contendo dados demográficos de identificação,
como gênero, idade, etnia, naturalidade, clínicos como histórico e tratamento de anemia
e lacunas para anotar os resultados dos exames laboratoriais realizados, tais como
eritrograma, ferritina, eletroforese de hemoglobina, dosagem de hemoglobina A2 e fetal,
pesquisa de hemoglobina H (Anexo II).
O grupo étnico foi atribuído pelo entrevistador (heteroclassificação), e definido
em caucasoides e não caucasoides considerando critérios como cor da pele, textura do
cabelo e formato do nariz e lábios, critérios estabelecidos pelo IBGE (Instituto
Brasileiro de Geografia e Estatística) (DAUDT, 2002; ARAÚJO et al., 2004), além da
origem étnica familiar incluindo avôs/avós maternos e paternos.
Todos os participantes e/ou responsáveis foram previamente esclarecidos quanto
aos procedimentos adotados e a finalidade do trabalho, sendo que as amostras de sangue
foram obtidas somente após a concordância e assinatura do Termo de Consentimento
Livre e Esclarecido, conforme resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde
(Anexo III, IV e V).
Todas as amostras foram submetidas à eletroforese em pH alcalino, neutro e
ácido, dosagem das hemoglobinas A2 e fetal, além de testes citológicos com coloração
pelo azul de cresil brilhante. O diagnóstico de talassemia α foi feito quando tanto a
eletroforese de hemoglobina em pH alcalino quanto na pesquisa citológica dos
corpúsculos de inclusão foram considerados positivos para tetrâmeros de hemoglobina β
e/ou γ.
Esses exames fazem parte da triagem para talassemia alfa.
As análises
hematológicas foram realizadas no laboratório de Hemoglobinopatias do HRU, como
parte da rotina laboratorial.
5.1.3 Critérios de inclusão para ambos os grupos
Nesse estudo foram incluídas amostras de sangue dos participantes e/ou
responsável cujos, foi obtida autorização para participar desse estudo mediante a
assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexos I, II e III).
5.1.3.1 Critérios de inclusão para os doadores
Foram inclusos todos doadores inaptos por anemia, ou seja, aqueles
apresentarem baixo hematócrito na triagem hematológica, isto é 38 e 39% para
mulheres e homens, respectivamente.
5.1.3.2 Critérios de inclusão para as crianças
Foram inclusos todas as crianças que apresentaram microcitose e/ou hipocromia,
estabelecidos pelos índices hematimétricos VCM (Volume Corpuscular Médio)
e HCM (Hemoglobina Corpuscular Média), com valores iguais ou inferiores a
82 fL e 27 pg, respectivamente, com anemia não ferropênica a esclarecer e em
estavam em acompanhamento ambulatorial no HC-UFTM.
5.1.4
Critérios de exclusão para ambos os grupos
Foram excluídas da pesquisa amostras em quantidade insuficiente para a
realização dos exames laboratoriais de triagem (inferior a 2 mL).
5.1.4.1 Critérios de exclusão para as crianças
Foram excluídos crianças com idade inferior a 4 anos, portadores de anemias de
outras
etiologias
(anemia
megaloblástica,
autoimune
e
doenças
oncohematológicas),
Crianças com histórico de hemotransfusões nos últimos três meses, que
antecederam à pesquisa,
Portadoras de doenças crônicas (diarreias, patologias renais, imunodeficiências,
paralisias cerebrais e cardiopatias congênitas cianóticas),
5.2. Métodos
5.2.1. Eritrograma
A determinação do número de hemácias, da concentração de hemoglobina, do
hematócrito e dos índices hematimétricos VCM, HCM, CHCM e RDW foram
determinados por método automático, em equipamento modelo Coulter T – 890 (Flórida
– USA), exame realizado somente para as amostras de doadores e crianças.
5.2.2. Ferritina sérica
A determinação da ferritina sérica foi realizada (exceto nos RNs) através de
ensaio imunométrico quimioluminescente em fase sólida, por técnica automatizada,
utilizando equipamento modelo Immulite Cobas cujos valores de normalidade são: 12 a
120 ng/dL para mulheres e 20 a 300 ng/dL para homens.
5.2.3. Estudo das Hemoglobinas/Perfil Eletroforético
5.2.3.1.1.
Preparação dos hemolisados
Para que os procedimentos eletroforéticos e bioquímicos, fossem realizados,
para identificação e quantificação das frações de hemoglobinas, foram necessários
preparar um hemolisado cuidadosamente limpo de proteínas do plasma e células do
estroma. Os eritrócitos foram lavados com solução fisiológica 0,9% (NaCl) respeitando
a proporção de 1/5 (1 mL de sangue e 4 mL NaCl), a mistura foi homogeneizada por
inversão, foi centrifugado a 3000 rotações/minuto (rpm), durante 10 minutos, em
seguida o sobrenadante e a camada leucocitária (células brancas) foram removidos,
permanecendo as hemácias, esse procedimento foi repetido até obtermos um
sobrenadante claro e límpido (em torno de 3 vezes). Depois de lavadas as hemácias
foram hemolisadas para a obtenção da solução de hemoglobinas, conforme o modo
descrito abaixo:
5.2.3.1.2.
Hemolisado rápido com saponina (NAOUM, 1987)
Em uma placa de plástico, foram colocados 50 µL de hemácias lavadas e 100 µL
do reativo hemolisante (Água destilada e Saponina). Em seguida, procedeu-se à
homogeneização da mistura por 30 segundos, até completa hemólise (Figura 6). Este
hemolisado foi utilizado na eletroforese de hemoglobina em pH alcalino
(reconhecimento do perfil eletroforético) e neutro para identificação das Hbs Bart’s, H e
Instáveis, é recomendado usar esse hemolisado pois, outros agentes hemolisantes
podem destruir essas Hbs.
Figura 23- Preparação do hemolisado com Saponina. A: lavagem dos eritrócitos com solução
fisiológica a 0,9%; B: Eritrócitos hemolisados.
5.2.3.1.3.
Hemolisado com clorofórmio
Ao volume de eritrócitos lavados, adicionamos outro de água destilada.
Homogeneizamos, e em seguida adicionamos um volume de clorofórmio, idêntico ao do
hemolisado formado, então agitamos vigorosamente e centrifugamos a 3.000 rpm, por
10 minutos. A solução de hemoglobina sobrenadante, ou hemolisado, foi retirada por
meio de pipeta Pasteur e transferida para um tubo limpo previamente identificado. A
obtenção deste hemolisado de hemoglobina, geralmente tem concentração entre 10 e 15
g/dL, foi usada para a dosagem de Hb Fetal, Hb A2. (Figura 7) (BETKE et al., 1959;
NAOUM, 1987).
Figura 24- Preparação do hemolisado com clorofórmio. A: lavagem dos eritrócitos com solução
fisiológica a 0,9%; B: Hemilise dos eritrócitos com água; C e D: Solução de Hb e clorofórmio
após agitação; E: Solução de Hb após centrifugação; F: Hemolisado pronto para uso (tubo as
direita da foto).
5.2.4. Eletroforese de Hemoglobina
Todas as amostras foram submetidas à eletroforese em pH alcalino
(MARENGO-ROWE,1965), utilizamos fitas de acetato de celulose de 2,7 x 14 cm e
tampão Tris-EDTA-Borato pH 8,4. Acorrida eletroforética foi efetuada sob a diferença
de potencial de 300 volts durante 30 minutos. O reconhecimento das hemoglobinas foi
feitos mediante o emprego de padrões eletroforéticos conhecidos (Figura 8)
(BARTLETT, 1963).
Figura 25- A: Hemolisado com clorofórmio; B: hemolisado com saponina; C: inicio da corrida
eletroforética; D: Fracionamento das hemoglobinas, após cerca de 30 min, 1ª fita utilizada para
dosagem de Hb A2 e 2ª Controle (SC) com padrão normal de Hb (AA).
A figura 9 abaixo mostra o perfil eletroforético de algumas hemoglobinas
normais e alteradas, sendo este método de separação considerado como primeira linha
na investigação das alterações da hemoglobina.
Figura 26- Eletroforese em acetato de celulose em pH 8,4, foto tirada antes da coloração com
corante de proteínas (Ponceau S). C: controle SC; 1: AS; 2-4: FA; 5: FA com Hb Bart’s.
Praticar apenas uma única técnica (eletroforese a pH alcalino) não é
recomendado e, novamente, um perfil normal, qualquer que seja o sistema utilizado, não
elimina a presença de uma hemoglobina alterada. Assim, por exemplo, as hemoglobinas
S/D; C/O-Arab/E/A2 e H/I têm a mesma migração em eletroforese em acetato de
celulose (Figura 8), mas são separadas por outros métodos, levando em conta a idade do
paciente, de fato, antes da idade de 3 meses, a presença predominante de Hb F diminui
muito a sensibilidade da eletroforese em pH alcalino no entanto nesse estudo está
técnica foi suplementada com a eletroforese em pH ácido (Figura 10) que foi usada
para diferenciar alguns tipos de hemoglobinas variantes mais lentas que a Hb A,
diferenciando a Hb S da Hb D, e a Hb C da Hb E, uma vez que essas migram na mesma
posição em eletroforese alcalina. (NAOUM, 1987).
A eletroforese em pH ácido (VELLA, 1968) foi realizada em Agar e solução
tampão fosfato em pH 6,2. Nessa última, o tempo de corrida foi de 30 a 40 minutos na
voltagem de 100 a 150 v. Após as corridas, as fitas e lâminas de gel foram coradas por
Ponceau S e descoradas com ácido acético 5%. A identificação de hemoglobinas
anormais foi feita por comparação de padrões eletroforéticos conhecidos (NAOUM,
1987).
Figura 27 - Eletroforese em Agar fosfato pH 6,2. C: controle AS; 1,2,4 e 5: FA; 3 e 6: FS.
Na eletroforese de hemoglobina em pH Neutro (DACIE e LEWIS, 1985)
realizada em acetato de celulose foram separadas a maioria das hemoglobinas variantes
e as talassemias. Particularmente a hemoglobina Bart’s e H, presente nos portadores de
talassemia alfa, foi pesquisada entre 5 a 15 minutos do início da corrida eletroforética,
pois ao passar desse tempo essa é desnaturada pelo processo termodinâmico da técnica.
5.2.5. Dosagem de Hemoglobina A2
A hemoglobina A2 foi quantificada após eletroforese em acetato de celulose em
tampão Tris-EDTA-Borato pH 8,4, em seguida as frações corespondente a Hb A2 e a Hb
X que compreende todas as outras Hbs presentes, foram eluídas em solução de NaCl
0,9%, em dois tubos identificados como Hb A2 e Hb X. A leitura das absorbâncias das
frações de hemoglobina foi feita em comprimento de onda de 415 nm, utilizando o
espectrofotômetro (Figura 11) (BEZERRA, 1984; NAOUM, 1987) e aplicando a
seguinte formula:
% Hb A2 =
Absorbância Hb A2 x 100
(Absorbância Hb X x 5) + Absorbância Hb A2
Os resultados observados com valores de Hb A2 entre 1,5 a 3,7%, foram
considerados normais (NAOUM, 1987).
Figura 28- Procedimento da quantificação da Hb A2. A: Fracionamento das Hbs A 2 e X; B:
Eluição das frações das Hbs A2 e X, deixado em repouso por cerca de duas horas; C: Leitura das
absorbâncias dos tubos com a Hbs A2 e X.
5.2.6. Dosagem de Hemoglobina Fetal
Para a quantificação da hemoglobina Fetal foi utilizado o método da
desnaturação alcalina (Método de Singer) que consiste na adição de uma solução de
NAOH ao hemolisado e após exatamente um minutos, a desnaturação será interrompida
pela adição de solução saturada de sulfato de amônio que reduz o pH e precipita a
hemoglobina desnaturada. Após filtração em papel de filtro Whatman nº 42, a
quantidade de hemoglobina não desnaturada foi medida em comprimento de onda de
540 nm, utilizando o espectrofotômetro (Figura 12). A proporção da hemoglobina
álcali-resistente foi então calculada como uma percentagem da quantidade total de
hemoglobina presente (BETKE et al., 1959; NAOUM, 1987), usando a formula:
% Hb F =
Absorbância fetal
Absorbância padrão
Foram consideradas normais as amostras com percentual de Hb F menor que 3%
para as crianças e doadores. Nos recém-nascidos (sangue do cordão umbilical) foram
considerados normais amostras com níveis de 60 a 90% de Hb F (NAOUM, 1987).
Figura 29- Procedimento de desnaturação alcalina pelo método de Singer para quantificação da
Hb Fetal. A: Tubos com reagentes utilizados na técnica; B: Desnaturação da Hb Fetal (tubo 1);
C: Precipitação das Hbs após adição de sulfato de amônio (tubo 1), tubo 3: diluição da solução
total de Hb; D: Filtração da Hb Fetal (tubo F) e rediluição da solução total de Hbs do tubo 3 no
tubo P, usado como Padrão.
5.2.7. Pesquisa da Hemoglobina H
A pesquisa da hemoglobina H (tetrâmeros de cadeias beta-globina desnaturados)
nos eritrócitos foi feita com 50 µL de sangue total adicionados a 50 µL do corante azul
de Crezil brilhante 1%, que após incubação o material a 37º por 60 minutos, foi
realizado esfregaços finos e examinados no microscópio em objetiva de imersão (100x).
A presença de Hb H nos eritrócitos aparecerá como fina granulação distribuída
homogeneamente caracterizando um portador de talassemia alfa, conforme está
ilustrada na figura 13 (PAPAYANNOPOULOS; STAMATAYANNOPOULOS, 1974;
NAOUM, 1987).
Figura 30- A: Preparação da solução azul de crezil brilhante com sangue total; B: Preparo da
lâmina; C,D,E e F: Visualização de um esfregaços sanguíneos (objetiva de 100 x) com amostras
suspeitas de talassemia alfa identificados pela presença de Hb H (setas), formadas pela
precipitação das cadeias beta globina, em excesso, no interior das hemácias, visualizadas
somente após coloração com azul de Crezil.
5.2.8. Análise dos dados
Os resultados dos testes foram tabulados em planilha eletrônica no software
Excel. A análise dos dados foi realizada por meio de estatística descritiva (média e
desvio padrão) e o Student- t teste para comparar as médias das variáveis hematológicas
dos grupos. Teste do qui-quadrado (χ2), foi usado para variáveis não paramétricas.
ANOVA teste foi utilizada para testar a igualdade de Hb entre as principais etnias. A
concordância entre os testes eletroforéticos e citológicos para pesquisa de Hb H foi
avaliada pelo teste do índice de Kappa e McNermar’s.
Resultados
6. Resultados
6.1 Incidência da alfa talassemia e sua associação com o perfil clínico
epidemiológico em recém-nascidos
Dentre as 1.004 amostras analisadas, observamos que a incidência da α-tal foi de
10,46% (105), destas 92 (9,16%) isoladamente e 13 (1,30%) em associação com a Hb S
(Figura 13). A presença da α-tal foi determinada por eletroforese em pH alcalino, neutro
e pesquisa citológica da Hb H. As metodologias foram avaliadas comparando-se a
presença de Hb H nas duas técnicas.
Figura 31-Incidência da α-tal nos 1.004 recém-nascidos analisados
Quanto ao sexo, 50,1% eram do gênero feminino e 49,9% do masculino, sem
diferença estatisticamente significante na incidência de hemoglobinopatias (p=0, 7732).
Com relação à procedência, 9,95% (81) dos RNs sugestivos de α-tal são de Uberaba,
13,39% (15) de municípios vizinhos ou limítrofes e 11,54% (9) de outros estados e
regiões (p=0,5089). A avaliação da etnia segundo a presença da α-tal nos três grupos,
não mostrou diferença significativa (p=0,8860). Entretanto, quando comparamos os
RNs brancos com ascendência branca em relação aos afrodescendentes dos outros dois
grupos, encontramos associação significativa da hemoglobinopatia com a etnia negra
(p<0,001) (Tabela 4).
Tabela 4 - Distribuição absoluta e percentual dos recém-nascidos para cada característica
epidemiológica segundo a presença ou ausência da α-tal
α talassemia
Presente
(n=105)
Ausente (n=899)
Total
(n=1.004)
nº
%
nº
%
nº
%
Valorp#/$
51
54
5,08
5,38
450
449
44,82
44,72
501
503
49,9
50,1
0,7732
81
Uberaba
Municípios
15
vizinhos*
Procedência
Outros estados
9
e regiões
Total
105
8,07
733
73,01
814
81,08
1,49
97
9,66
112
11,15
0,9
69
6,87
78
7,77
10,46
899
89,54
1004
100
7
40
58
0,7
3,98
5,78
68
354
475
6,77
35,26
47,31
75
394
533
7,47
39,24
53,09
0
0
2
0,2
2
0,2
Gênero
Etnia
Percentuais
das Hb
( ±S')
Masculino
Feminino
BB
BNP€
NP€
Indígenas/
Asiáticos
Hb A
25,95±11,33
28,99±11,23
28,69±11,33
0,5089
0,8860
0,0089
0,0477
0,78±0,60
0,90±0,61
0,89±0,59
Hb A2
0,0238
72,10±11,14
69,51±11,08
69,81±11,14
Hb Fetal
0,1265
7,18±3,82
9,45±4,88
8,88±4,79
Hb S
Notas: #:Teste qui-quadrado; $: teste t-Student para comparar as médias das Hb; : média; S':
desvio padrão; Hb: Hemoglobina; *Água Comprida, Aramina, Araxá, Campo Florido,
Conceição das Alagoas, Conquista, Delta, Frutal, Igarapava, Ituverava, Nova Ponte,
Sacramento, Santa Juliana, Uberlândia, Veríssimo; BB=branco com antecedentes branco;
BNP=brancos com antecedentes negros ou pardos; NP=negro/pardos; €: BNP+NP; BBx€
(p<0,0001); Eletroforese: Hb A (96 a 98%); Hb A2 (2,5 a 3,7%); Hb Fetal (até 2%); Hb S (0%)
Comparando as médias da concentração das hemoglobinas entre os RNs com
presença e ausência da α-tal, foi possível perceber comportamento estatisticamente
diferentes quanto à Hb A e Hb A2 e Fetal, sendo a Hb A (p=0,0089) e Hb A2 (p=0,0477)
significativamente superior nos RNs sem α-tal e a Hb Fetal superior nos RNs sugestivos
de α-tal (p=0,0238) (Tabela 4).
A figura 15 mostra uma avaliação comparativa entre a incidência de α-tal nos
RNs estudados e a demonstrada nas diferentes regiões do Brasil. Nesta avaliação foi
possível observar que em Uberaba e municípios vizinhos, a incidência da α-tal foi
semelhante à encontrada nos estados de Minas Gerais, São Paulo e Rio Grande do
Norte. À vista disso, as informações adquiridas apontam uma alta incidência da α-tal no
nosso meio, estando relacionada diretamente com a etnia.
Figura 32- Comparação dos achados do presente estudo com a incidência de algumas
hemoglobinopatias nas diferentes regiões do Brasil
6.2 Ocorrência da alfa talassemia e sua associação com o perfil clínico
epidemiológico em doadores de sangue inaptos por anemia
Das 214 amostras investigadas, identificamos que a ocorrência da α-tal foi de
7,94% (17), destas, 6,54% (14) isoladamente e 1,4% (3) em associação com a Hb S
(Figura 16). A presença da α-tal foi determinada por eletroforese em pH alcalino, neutro
e pesquisa citológica da Hb H. As metodologias foram avaliadas comparando-se a
presença de Hb H nas duas técnicas.
Figura 33- Ocorrência da α-tal nos 214 doadores estudados
Segundo o gênero, 91,59% eram feminino e 8,41% masculino, sem diferença
estatisticamente significante na ocorrência da α-tal (p=0,1928). A idade variou de 17 a
64 anos (média 36 anos), quanto à presença da α-tal a média de idade foi semelhante aos
comparados com doadores sem a presença da α-tal (p=0,6473). Com relação à
procedência dos doadores sugestivos de α-tal, 6,07% (13) são de Uberaba, 1,40% (3) de
municípios vizinhos ou limítrofes e 0,47% (1) de outros estados e regiões (p=0,4896).
Quanto à avaliação da etnia segundo a presença da α-tal nos grupos BB, BNP e
NP, não mostrou diferença significativa entre os doadores (p=0,7153). No entanto,
quando correlacionamos os indivíduos brancos com ascendência branca com os
afrodescendentes dos outros grupos BNP e NP, observamos associação significativa da
α-tal com a origem étnica negra (p<0,01) (Tabela 5).
Para a análise do perfil hematológico foram estudados históricos de anemia,
tratamento e tipo de tratamento para anemia, dados do hemograma e dosagens de
ferritina e das frações hemoglobínicas dos doadores com e sem α-tal. A tabela 5 resume
os parâmetros hematológicos e perfis de Hbs observados nos sugestivos de α-tal em
comparação com os sem α-tal.
Dentre os doadores, o histórico de anemia, tipo e tratamento não apresentaram
significância estatística (p=0,6499 e p=2118). Embora tenhamos encontrado entre os
doadores que realizaram tratamento para anemia menor percentual com perfil
compatível com α-tal (6,11%) comparado aos sem tratamento (10,84%) esta diferença
também não se mostrou significativa (p=0,8081), foi observado também que não houve
associação estatisticamente significativa quanto às médias da contagem das hemácias,
hematócrito, os índices hematimétricos (VCM e RDW) e dosagem de ferritina.
Entretanto, uma diminuição significante da concentração da hemoglobina (p =0,0059),
HCM (p=0,0455) e CHCM (p<0,0001) foi identificada nos doadores sugestivos de α-tal.
Nenhuma diferença significativa foi observada nos resultados obtidos pelas dosagens
das hemoglobinas A, A2 e Fetal. Portanto, os dados apanhados, indicam uma alta
ocorrência da α-tal no nosso meio, estando relacionada diretamente com a etnia e com a
presença de anemia.
Tabela 5 - Ocorrência e características clínicas epidemiológicas segundo a presença ou
ausência da α talassemia, observadas nas 214 amostras de doadores.
Doadores* (n=214)
α-talassemia&
ValorPresente
Ausente
Total
p#/$
nº
%
nº
%
nº
%
0
0
18
8,41
18
8,41
Masculino
0,1928
Gênero
17
7,94
179 83,65 196
91,6
Feminino
35,00±11,84
36,31±10,85
36,27±10,93
6,07
142
66,36
155
72,4
3
1,4
24
11,21
27
12,6
1
0,47
31
14,49
32
15
BB
BNP€
NP€
Indígenas/
Asiáticos
7
4
6
3,27
1,87
2,8
62
58
75
28,97
27,1
35,05
69
62
81
32,2
29
37,9
0
0
2
0,94
2
0,94
Histórico
de anemia
Sim
Não
9
8
4,21
3,73
93
104
43,46
48,6
102
112
47,7
52,3
0,6499
Tratamento
de anemia
Sim
Não
8
9
3,74
4,1
123
74
57,48
34,58
131
83
61,2
38,8
0,2118
Total
17
7,94
197
92,06
214
100
0
8
0
8
0
10,67
0
10,67
21
43
3
67
28
57,33
4
89,33
21
51
3
75
28
68
4
100
Idade ( ±S')
Anos
13
Procedência
Uberaba
Municípios
limítrofes**
Outros estados e
regiões
Etnia
Alimentar
Tipo de
Medicamentoso
tratamento para
Transfusão
anemia
Total
Parâmetros
Hematológicos
( ±S')
Hc ( x1012/l)
Hb (g/dl)
Ht (%)
VCM (fl)
HCM (pg)
CHCM (g/dl)
RDW (%)
Ferritina
Hb A (%)
4,09±0,26
10,37±1,35
34,05±3,63
84,50±7,62
25,36±3,24
29,96±2,31
14,75±1,27
58,66±55,54
96,09±0,86
4,41±2,85
11,45±1,49
34,31±3,49
82,36±7,76
27,39±3,89
33,13±2,86
15,08±2,02
64,73±72,80
93,74±9,74
4,38±2,75
11,36±1,51
34,28±3,5
82,5±7,76
27,23±3,89
32,89±2,94
15,07±1,97
67,50±85,19
93,95±9,4
0,6473
0,4896
0,7153
0,1803
0,6674
0,0059
0,8396
0,2919
0,0455
<0,0001
0,5259
0,8565
0,3395
3,16±0,66
2,91±0,62
2,92±0,53
0,066
Hb A2 (%)
0,75±0,26
0,81±0,59
0,8±0,58
0,7126
Hb Fetal (%)
...
38,20±6,0
38,20±6,0
...
Hb S (%)
Notas: *Doadores inaptos por anemia/hematócrito baixo na triagem hematológica; Hb:
Hemoglobina; #:Teste qui-quadrado; $: teste t-Student para comparar as médias das Hb; :
média; S': desvio padrão; &: Incluídos neste grupo três casos com associação da beta
talassemia; BB=branco com antecedentes branco; BNP=brancos com antecedentes negros ou
pardos; NP=negro/pardos; €: BNP+NP; BBx€ (p<0,01); : média; S': desvio padrão. **Água
Comprida, Aramina, Araxá, Campo Florido, Conceição das Alagoas, Conquista, Delta, Frutal,
Igarapava, Ituverava, Nova Ponte, Sacramento, Santa Juliana, Uberlândia, Veríssimo. Valores
de referência (RF): HC - Contagem de hemácias ( x1012/l) (RF: F/M: 4.0-5.2); Hb Hemoglobina (g/dl) (RF: F/M: 11.5-15.5); Ht - Hematócrito (%) (RF: F/M: 35-45); VCM Volume corpuscular médio (fl) RF: Homem (81 a 99); Mulher ( 80 a 98); HCM - Hemoglobina
corpuscular média (pg) (RF: F/M: 25-33); CHCM - Concentração de hemoglobina corpuscular
média (g/dl) (RF: 31-37); RDW-Red blood cell Distribution Width (%) (RF: 11.6 -14); Ferritina
(ng/dl) RF: Homem (23,9 a 335,2); Mulher ( 11 a 306,8); Eletroforese: HbA (96 a 98%); Hb A2
(2,5 a 3,7%); Hb Fetal (até 2%); Hbs S (0%).
6.3 Ocorrência da alfa talassemia e sua associação com o perfil clínico
epidemiológico em crianças com anemia a esclarecer
No total das 20 amostras pesquisadas, verificamos que a ocorrência da α-tal foi de
25% (5), sendo que esta foi identificada somente em associação com a β talassemia
(Figura 17).
Figura 34- Ocorrência da α-tal nas 20 crianças investigadas
Quanto ao sexo, 35% eram do gênero feminino e 65% do masculino, também
sem diferença estatística na ocorrência desta hemoglobinopatias (p=0,7870). A variação
da idade foi de 3 a 14 anos (média 7 anos), também sem diferenças entre a presença e
ausência da α-tal (p=0,898). Com relação à procedência, 20% (4) das crianças
sugestivas de α-tal são de Uberaba e 5,0% (1) de outros estados e regiões (p=0,5472).
A avaliação da etnia segundo a presença da α-tal nos três grupos (BB; BNP e
NP) não mostrou diferença significativa entre as crianças (p=0,1767). Porem, quando
associamos as crianças afrodescendentes e comparamos com os brancos com
ascendência branca, evidenciou-se associação significativa da α-tal com a etnia negra
(p<0,05) nas crianças (Tabela 6).
A análise do perfil hematológico constou do histórico de anemia, tratamento e
tipo de tratamento para anemia, dados do hemograma, dosagens de ferritina e das
frações hemoglobínicas das crianças. A tabela 6 sintetiza os parâmetros hematológicos e
perfis de Hbs observados nas crianças sugestivas de α-tal em comparação com as sem αtal, percebe-se que o histórico de anemia foi significantemente maior nas crianças sem
α-tal (p<0,0001). Com relação ao tipo de tratamento para anemia não houve diferença
do padrão entre as crianças com a presença ou ausência de α-tal, não sendo encontrada
nenhuma criança com perfil sugestivo de α-tal com tratamento alimentar e transfusão
(Tabela 7).
A tabela 6 aponta ainda que, estatisticamente não há diferença significante entre
as médias da concentração de hemácias, hemoglobina, hematócrito, os índices
hematimétricos (VCM, HCM, CHCM e RDW), dosagem de ferritina e as dosagens das
hemoglobinas A e Fetal nas crianças sugestivas de α-tal em relação às sem α-tal, no
entanto entre as médias da concentração da Hb A2 nota-se que esta aumentou
significantemente nas crianças sugestivas de α-tal (p=0,0328). Os resultados obtidos,
portanto, demonstram uma alta ocorrência da α-tal no nosso meio, estando relacionada
diretamente com a etnia e com a presença de anemia.
Tabela 6 - Ocorrência e características clínicas epidemiológicas segundo a presença ou ausência
da α talassemia, observadas nas 20 amostras.
Crianças* (n=20)
α-talassemia&
ValorPresente
Ausente
Total (n=20)
p#/$
%
%
%
nº
nº
nº
0,787
3
15
10
50
13
65
Masculino
Gênero
2
10
5
25
7
35
Feminino
Idade ( ±S')
Anos
Procedência
Uberaba
Municípios
vizinhos e
limítrofes**
Outros estados e
regiões
7,21±1,61
7,40±3,09
7,35±2,85
0,898
4
20
10
50
14
70
0
0
3
15
3
15
1
5
2
10
3
15
Etnia
BB
BNP€
NP€
2
0
3
10
0
15
2
6
7
10
30
35
4
6
10
20
30
50
0,1767
Histórico de
anemia
Sim
Não
5
0
25
0
15
0
75
0
20
0
100
0
<0,0001
Tratamento de
anemia
Sim
Não
4
1
20
5
15
0
75
0
19
1
95
5
0,0756
Total
5
25
15
75
20
100
Tipo de
tratamento para
anemia
Alimentar
Medicamentoso
Transfusão
Total
0
4
0
4
0
20
0
21
0
15
0
15
0
75
0
79
0
19
0
19
0
100
0
100
Parâmetros
Hematológicos
( ±S')
Hc ( x1012/l)
Hb (g/dl)
Ht (%)
4,96±0,67
12,42±1,45
38,25±4,20
4,94±0,63
11,89±1,11
35,99±2,81
4,95±0,64
11,84±1,19
35,99±3,17
0,5472
0,0856
0,9577
0,4077
0,1729
78,83±16,33
74,25±9,33 74,02±11,18 0,475
VCM (fl)
25,63±5,50
24,52±3,86
24,35±4,26 0,6571
HCM (pg)
32,46±0,44
33,00±1,19
32,86±1,11 0,4268
CHCM (g/dl)
14,5±2,17
14,00±1,51
14,3±1,75
0,598
RDW (%)
39,62±4,74
40,81±20,14 42,10±18,04 0,9121
Ferritina
93,96±1,33
95,50±1,45
95,11±1,66 0,0872
Hb A (%)
4,70±0,99
3,42±1,05
3,78±1,32
0,0328
Hb A2 (%)
1,32±1,03
1,08±0,93
1,11±0,96
0,6769
Hb Fetal (%)
Notas: Hb: Hemoglobina; #:Teste qui-quadrado; $: teste t-Student para comparar as médias das
Hb; : média; S': desvio padrão; *Crianças com anemia não ferropênica a esclarecer; &:Todos
os 5 casos com associação da beta talassemia; BB=branco com antecedentes branco;
BNP=brancos com antecedentes negros ou pardos; NP=negro/pardos; €: BNP+NP; BBx€
(p<0,05); **Água Comprida, Aramina, Araxá, Campo Florido, Conceição das Alagoas,
Conquista, Delta, Frutal, Igarapava, Ituverava, Nova Ponte, Sacramento, Santa Juliana,
Uberlândia, Veríssimo. Valores de referência (RF): HC: Contagem de hemácias ( x1012/l) (RF:
F/M: 4.0-5.2); Hb: Hemoglobina (g/dl) (RF: F/M: 11.5-15.5); Ht: Hematócrito (%) (RF: F/M:
35-45); VCM: Volume corpuscular médio (fl) RF: Homem (81 a 99); Mulher ( 80 a 98); HCM:
Hemoglobina corpuscular média (pg) (RF: F/M: 25-33); CHCM: Concentração de hemoglobina
corpuscular média (g/dl) (RF: 31-37); RDW: Red blood cell Distribution Width (%) (RF: 11.6 14); Ferritina (ng/dl) RF: Homem (23,9 a 335,2); Mulher ( 11 a 306,8); Eletroforese: HbA (96 a
98%); Hb A2 (2,5 a 3,7%); Hb Fetal (até 2%).
6.4 Concordância entre os testes de triagem utilizados para identificação da alfa
talassemia nos três diferentes grupos analisados
Os resultados laboratoriais obtidos através das alterações hematológicas,
presença da Hb H na eletroforese em pH alcalino e neutro e dos corpúsculos de inclusão
de Hb H e Bart’s nos testes citológicos, foram considerados sugestivos de α-tal
(fenótipo AH/AFH), deste modo, todas as amostras que apresentaram essas alterações
foram classificados como prováveis portadores de α-tal. Contudo a positividade para Hb
H, identificada nessas técnicas, foi observada em 127 amostras (10,26%), sendo 109
isoladamente (8,81%), cinco (0,40%) em associação com a β talassemia e 13 (1,05%)
em associação com a Hb S (Figura 18). Sendo a hemoglobinopatia mais prevalente
neste estudo.
Figura 35- Distribuição das formas isoladas e associadas identificadas neste estudo
As Figuras 19, 20 e 21, aponta a Hb H identificada pelos métodos eletroforéticos
e citológicos, revelando eritrócitos com precipitados em seu interior, denominados de
corpúsculos de inclusão de Hb H, evidenciados após a coloração com azul de cresil
brilhante 1%, de amostras que apresentaram resultados laboratoriais marcantes,
definidos como prováveis portadores de alguma forma de α-tal. No entanto, na maioria
dos casos, esses achados foram menos evidentes; nos testes eletroforéticos foram
observados bandas tênues e sutis, de Hb H e, os corpúsculos de inclusão de Hb H,
quando visualizados, estiveram presentes em um número reduzido de eritrócitos, sendo
difícil confirmar sua presença, considerando se a análise inconclusiva para esse teste,
pois a ausência de inclusões não exclui a α-tal.
Figura 36- Disposição eletroforética das frações algumas de hemoglobinas em acetato de
celulose, tampão Tris-EDTA-Borato pH 8,6. A amostra (1) Hb SC (doença falciforme); (2) Hb
Hb AS (traço falciforme); (3, 4 e 5) Hb AF (amostras normais de recém-nascidos); (6 e 7) Hb
AF + H, amostras de recém-nascidos sugestivos de talassemia alfa, devido a presença da banda
da Hb H, no entanto, em recém-nascidos esta banda é denominada de Hb Bart’s)
Figura 37- Visão parcial de fitas de acetato de celulose em pH alcalino contendo a fração da Hb
H . A- Macro aplicação. B- Micro aplicação.
Figura 38- Visualização de esfregaços sanguíneos (objetiva de 100 x) com amostras suspeitas
de alfa talassemia identificados pela presença de Hb H (setas), formadas pelo desequilíbrio da
relação de síntese entre as cadeias α/γ e α/β acarretando sua tetramerização, formado a Hb H
(β4) e Bart’s (γ4), visualizadas somente após coloração com azul de Cresil (A, B, C e D).
Analisando os resultados dos testes eletroforéticos em relação ao da lâmina, é
possível observar uma elevada concordância de resultados positivos, no entanto, dentre
as amostras com resultado negativo na fita, somente 68,23% (758) foram negativos na
lâmina, demonstrando uma baixa concordância pelo coeficiente Kappa (k=0,3054). Na
análise do teste de McNemar’s, houve 353 pares discordantes (negativo na eletroforese
e positivo na lâmina), diferença considerada extremamente significativa (p<0,0001)
evidenciando que existe uma baixa associação entre os dois testes (Tabela 7).
Tabela 7- Comparação entre os testes eletroforéticos e citológicos para a identificação e
pesquisa de Hb H na triagem das amostras com diagnóstico sugestivas de α-tal.
%
Valor – P
Lâmina
Mc
Positivo
Negativo
Total
Concordância Kappa
Nermar’s
Eletroforese No.
Positivo
Negativo
Total
%
No.
%
No.
%
A-D
71,49
127
100
0
353 31,77 758
0,00
127
68,23 1.111
100
100
480 38,77 758
61,23 1.238
100
0,3054
<0,0001
Analisando o desempenho dos testes de triagem foi possível perceber que a
eletroforese é capaz de detectar 44,4% das amostras sugestivas de α-tal (Se=0,444) e
96,2% das amostras normais (Sp=0,962). A lâmina se demonstrou desempenho
discretamente melhor para detectar sugestivos de α-tal (Se=0,669) contudo, para
detectar amostras normais sua performance foi bem inferior (Sp=0,447) quando
comparado com a eletroforese. Considerando o resultado da triagem que normalmente é
realizado no serviço (Triagem final: associação da eletroforese + lâmina) verifica-se
melhora no desempenho para detectar os sugestivos de α-tal (Se=0,667). Considerando
a positividade da amostra se pelo menos um dos testes de triagem for positivo (esquema
em paralelo) a sensibilidade aumenta para 77,8% (Se=0,778), no entanto apresenta uma
especificidade de 66,9% (Sp=0,669) (Figura 22).
Figura 39-Desempenho dos testes de triagem isoladamente, a triagem final, a partir do esquema
em paralelo e em série frente ao teste molecular realizado em 353 amostras.
Discussão
7. Discussão
A α talassemia é considerada o distúrbio hereditário de síntese da hemoglobina
mais comumente observada no mundo, atingindo altas prevalências em algumas
populações da África, bacia do Mediterrâneo, Oriente Médio e Sudeste Asiático. Sua
epidemiologia reflete esse padrão de disseminação global (HIGGS e WEATHERALL,
2009).
Pesquisas realizadas em alguns países das Américas como Estados Unidos,
Caribe e Jamaica, demonstraram significativas frequências desse distúrbio, podendo
atingir até 40% da população (WEATHERALL e CLEGG, 2001). Dentre os poucos
estudos realizados no Brasil a α-tal predomina entre todas hemoglobinopatias, podendo
acometer até 20% dos brasileiros, e está diretamente relacionada com a etnia negra,
visto que, nesses indivíduos a frequência varia entre 20 e 25% (SONATI et al., 1996;
BORGES et al., 2001; ADORNO et al., 2005; SOUZA et al., 2009). Embora alguns
autores afirmem que esses dados podem estar subestimados, devido ao fato de que
poucos tem se empenhado em identificar α-tal na população em geral, na grande
maioria são utilizadas amostras e/ou indivíduos pré-definidos como grupos com
microcitose e hipocromia, ou com ancestralidade africana, onde a possibilidade de
encontrar α-tal é maior (SONATI et al, 1996; NAOUM, 1987; BORGES et al.,
2001; SOUZA et al., 2009; BEZERRA e MEISSNER, 2010).
O presente estudo analisou a frequência da α-tal em três diferentes grupos,
constituídos por recém-nascidos (105/1004), doadores de sangue inaptos por anemia
(17/214) e em crianças com anemia a esclarecer (5/20).
A incidência de α-tal nos recém-nascidos observada (10,46%) se assemelha a
outros estudos realizados em regiões onde há predominância de afrodescendentes
(ORLANDO et al., 2000; DUCATTI et al., 2001; VIANA-BARACIOLI, et al., 2001;
SIQUEIRA et al., 2002; ADORNO et al., 2005; NOGUEIRA, 2009; ALCOFORADO
et al., 2012; SILVA et al., 2013). Diferindo basicamente apenas dos estados do Rio
Grande do Sul e Paraná, onde a proporção destes é menor (SEIXAS et al., 2008). Sabese que o genótipo mais comum da α-tal na população brasileira é a deleção α-3.7, que se
relaciona diretamente com a etnia negra. Verificamos que os RNs sugestivos de α-tal
são na grande maioria afrodescendentes (93,33%), o que justificaria a alta incidência
encontrada.
Na população dos doadores, a ocorrência de α-tal foi de 7,94%. O interesse em
investigar a ocorrência de α-tal em doadores de sangue inaptos por anemia em Uberaba
se deve ao fato de que além de ser uma questão relevante para a Saúde Pública, um
melhor conhecimento da atual condição desses doadores de sangue torna-se
fundamental, em razão do dever de assegurar que o hemocomponente esteja de acordo
com as diretrizes de controle de qualidade, ou seja, sem riscos para o doador e/ou
receptor. A partir do ano de 1976, inicio-se nos hemocentros brasileiros, a
regulamentação e a padronização de procedimentos para investigação de Hbs anormais
(Hb S e Hb C), sendo um procedimento duplamente útil, beneficiando tanto o doador
quanto o receptor de sangue. Assim, enquanto o receptor estaria sendo protegido do
recebimento de hemácias anômalas, o doador, se identificado como portador de alguma
hemoglobinopatia, poderia ser devidamente orientado sobre a sua condição
(RAMALHO, 1976).
Como esperado, as análises realizadas no grupo das crianças possibilitaram
identificar uma ocorrência de 25% de prováveis portadores de α-tal, uma vez que nesse
grupo a deficiência de ferro já havia sido excluída, pois, as crianças estavam com os
exames de ferro sérico, ferritina e capacidade total de ligação do ferro normais. Portanto
a chance de encontrar portadores de α-tal é maior.
No sudeste do Brasil, Orlando et al., (2000) estudaram a incidência de α-tal em
populações diferenciadas e observaram maior incidência nos portadores de anemia
(26%), estudantes (12,5%) e Rns (10%) do que nos doadores (1,90%) (ORLANDO et
al., 2000).
Em outras pesquisas, realizadas também na região Sudeste (Campinas, SP) foi
encontrado α-tal em 23,4% dos doadores com descendência africana (SONATI et al.,
1996). Em outro estudo, na mesma cidade, realizado com pacientes adultos
apresentando microcitose e hipocromia foi observado que 49,9% eram portadores de αtal (BORGES et al., 2001). Em Salvador, BA α-tal foi identificada em 22,2% dos
recém-nascidos (ADORNO et al., 2005). Dados da ocorrência de α-tal, no norte do
Brasil mostraram que 19,4% dos pacientes com anemia microcítica hipocrômica
portavam essa alteração (SOUZA et al., 2009). Na região Sul, a prevalência de α-tal
estudada em vários grupos étnicos e divididos em descendentes de europeus e africanos,
revelou uma maior prevalência entre os afrodescendentes (23,1%) do que entre os
europeus (4,5%) (WAGNER et al., 2010).
Estes resultados são semelhantes ao nosso estudo, corroborando assim, a alta
incidência da α-tal, que oscilam entre 10 e 20% da população geral e até 50% entre
portadores de anemia, apontando também sua forte correlação com o grupo de etnia
africana. Sobretudo, a migração dos povos do mediterrâneo, principalmente da África,
contribuíram na formação da população, principalmente na região Sudeste do Brasil, o
que também explica a elevada incidência de alfa talassemia na população analisada
(NAOUM, 1987; AIGNER, 2006; OLIVEIRA; MENDIBURU; BONINI-DOMINGOS,
2006; BELISÁRIO e VIANA, 2012).
Como esperado, não foi observado diferenças estatísticas quanto ao gênero em
nenhum dos três grupos analisados, pois não há na literatura descrição de relações entre
a incidência de hemoglobinopatias e o gênero, uma vez que o gene responsável por essa
alteração não está ligado ao sexo e sim a genes autossômicos recessivos que estão
localizados nos cromossomos 11 e 16 e que determinam a síntese das cadeias
polipeptídicas das globinas (TRAEGER-SYNODINOS; VRETTOU; KANAVAKIS,
2011; WEATHERALL, 2013).
Segundo os grupos étnicos, registros do IBGE (2010), mostra que a população
de Minas Gerais é composta por 45,4% brancos, 44,3% pardos, 9,9% negros e 1,1% de
amarelos e/ou indígenas, entre 19.597.330 habitantes. De acordo com a distribuição
étnica, os brancos e pardos são maioria no Estado. A grande maioria da população de
Minas Gerais é descendente de colonos portugueses e de escravos africanos, que
povoaram a região na época da mineração e, após, com o desenvolvimento agrícola.
Além destes, contribuíram também para a diversidade da população mineira italianos e
indígenas. Um estudo genético, realizado com marcadores de ancestralidade em
indivíduos de Belo Horizonte (Minas Gerais), revelou que 66% eram da ancestralidade
europeia, 32% africana e 2% ameríndio. De forma geral, as análises mostram alto grau
da ancestralidade europeia (principalmente portuguesa) e africana nos mineiros.
No presente estudo, com relação à etnia, embora não tenha sido observada
diferença significativa entre os três grupos avaliados separadamente, ao comparar a
incidência de α-tal no grupo branco com ascendência branca em relação aos outros dois
grupos com afro-descendência, observou-se diferença significativa (p<0,05). Assim
como em outros estudos, a incidência de α-tal mostrou-se maior no grupo dos
indivíduos afrodescendentes (87,40%) englobando os RNs, doadores e crianças. No
entanto devido a alta diversidade étnica, dos brasileiros, verificou-se que mesmo na
população sem descendência africana, sua frequência é elevada (12,60%) (BEZERRA e
ANDRADE, 1991; NAOUM, 2004; AIGNER et al, 2006; CAMPOS; DIAS; MENDES,
2006; WAGNER et al., 2010).
O diagnóstico laboratorial da α-tal se faz através da identificação laboratorial da
Hb H e/ou Bart’s, que é apontada como a hemoglobinopatia de mais difícil diagnóstico,
devido a erros na interpretação dos exames laboratoriais. No nosso trabalho todas as
amostras as quais a Hb H foi detectada na eletroforese em pH alcalino e neutro foram
confirmadas na pesquisa intraeritrocitária, caracterizando os sugestivos de α-tal. As
amostras que apresentaram resultado inconclusivo, com a não detecção de Hb H na
eletroforese associada à presença de corpos de inclusão intraeritrocitária, revelam a
dificuldade na identificação visual eletroforética dessa hemoglobina quando bandas
tênues são formadas. Além disso, hemoglobinas instáveis também apresentam
inclusões, denominadas inclusões de Heinz. As técnicas moleculares se fazem
necessárias especialmente nesses casos discordantes entre as metodologias iniciais de
rastreamento para o diagnóstico da α-tal.
Ao contrário das outras Hbs, a Hb A2 tem de ser medida por métodos analíticos
que propiciem maior precisão e exatidão, pois a β talassemia menor depende destes
valores, que em média estão entre 1 a 2% acima do valor da referência (OLIVEIRA et
al, 2003). O comportamento das hemoglobinas (Hb A, A2 e Fetal) nos grupos analisados
segundo as faixas etárias, estava na maioria dentro do padrão da normalidade. No
entanto, em relação aos recém-nascidos que apresentaram α-tal, a média percentual da
Hb A foi significativamente maior, enquanto que a Hb Fetal teve comportamento
contrário. Nas crianças identificadas com α-tal, houve um aumento significante da Hb
A2. Esses achados foram compatíveis com a pesquisa de β talassemia empregando
diferentes métodos diagnósticos (MELO et al., 2008), chamando a atenção para a
necessidade de se buscar testes complementares diante de uma suspeita não confirmada.
Para o diagnóstico dessa hemoglobinopatia, além da análise completa do
hemograma e do status de ferro, são essenciais a análise da morfologia eritrocitária
incluindo a pesquisa de Hb H e a eletroforese de Hbs em pH alcalino e neutro, já que
direcionam e auxiliam no diagnostico da α-tal. O reconhecimento dos portadores das
formas leves de α-tal (portador silencioso e traço α talassêmico) é de extrema
importância, embora sejam clinicamente normais, dispensando assim tratamento, ajuda
a elucidar a etiologia da microcitose e/ou hipocromia, que muitas vezes é confundida e
tratada como anemia ferropriva.
A presença de microcitose e hipocromia leve, diminuição dos níveis de
hemoglobina e elevação do número de eritrócitos são características dos portadores de
α-tal, quando equiparado com os parâmetros de indivíduos normais. Estas alterações são
mais pronunciadas em indivíduos homozigotos para α-tal, do que nos heterozigotos
(HARTEVELD e HIGGS, 2010).
Nessa pesquisa analisamos esses parâmetros nos portadores de anemia.
Observamos uma diminuição significante da hemoglobina (p =0,0059), HCM
(p=0,0455) e CHCM (p<0,0001) nos doadores sugestivos de α-tal. Enquanto que nas
crianças essas diferenças significativas não foram observadas, apesar de que, no grupo
com α-tal o número de hemácias, Hb, VCM, HCM e CHCM estarem levemente
aumentadas.
Em alguns trabalhos os autores evidenciaram uma diferença estatisticamente
significativa (p<0,05) no número de hemácias, VCM, HCM e Hb A2 em portadores de
α-tal (α -3.7/αα), em comparação com indivíduos normais (αα/αα) (ADORNO et al.,
2005; SOUZA et al., 2009). Como esperado, uma vez que a síntese desequilibrada das
cadeias globínicas na α-tal é o princípio do déficit da produção de Hb nas células
vermelhas e consequentemente no tamanho das hemácias (formada de 30% -35% de
Hb), levando assim à formação de células hipocrômica e microcíticas (HIGGS, 2009).
Enquanto que na β talassemia a concentração de Hb A2 normalmente está
aumentada, na α-tal ocorre uma diminuição dos níveis de Hb A2 que pode ser explicado
pela predileção de síntese da Hb A em comparação com a Hb A2. Em circunstâncias
normais ou até mesmo com os níveis elevados, as cadeias α globínicas tendem a formar
dímeros αβ mais rapidamente do que os dímeros αδ. Situações como na α-tal, em que a
síntese de cadeias alfa está deficiente, ocorre um aumento na produção do dímero
correspondente, as cadeias β disputam de maneira mais eficiente, quando comparadas
com as cadeias δ, pelas cadeias α que estão insuficientes (WEATHERALL, 2010;
HIGGS, 2013).
A elevada ocorrência da α-tal em indivíduos portadores de anemia já foi relatada
(BORGES et al., 2001; BEZERRA e MEISSNER, 2010; WAGNER et al., 2010). Em
nosso estudo, 32,94% dos indivíduos com anemia teve α-tal, comparando dados
similares, um outro estudo que investigou uma população semelhante, identificou que
28% dos indivíduos eram portadores de α-tal (ORLANDO et al., 2000). As elevadas
taxas de α-tal encontradas em pessoas com estas condições dão destaque à influência
dessa hemoglobinopatia como o provável motivo das variações hematológicas.
Contudo, as alterações identificadas em alguns dos parâmetros hematológicos, por
serem mínimas e às vezes imperceptíveis, dificultam sua detecção mediante somente às
análises desses índices, pois, na maior parte os portadores de α-tal sem clínica evidente,
apresentam seus parâmetros hematológicos dentro dos valores de referência
estabelecidos nos testes de triagem.
Comparando os resultados laboratoriais obtidos através dos testes de triagem
(eletroforéticos e citológicos para a pesquisa de Hb H) utilizados para identificar os
sugestivos de α-tal, observamos que, 71,49% apresentaram boa concordância, o que
revela um bom preparo da analista para a detecção dessa Hb, apesar da dificuldade
diagnóstica, permitindo ainda considerar que a associação da eletroforese com a
pesquisa citológica de Hb H apresentam bons resultados de triagem para a alfa
talassemia. Todas as amostras as quais a Hb H foi detectada na eletroforese em pH
alcalino e neutro foram confirmadas na pesquisa intraeritrocitária, caracterizando a αtal. O teste eletroforético demonstrou ser mais especifico (92,20%) do que sensível
(44,40%).
Os resultados inconclusivos (negativos na eletroforese e positivo na pesquisa
citológica dos corpúsculos de inclusão de Hb H) para a pesquisa de Hb H (31,77%)
revelam a dificuldade na identificação visual dessa hemoglobina quando está em baixa
concentração. Alguns autores relatam e qualificam os testes citológicos como
laboriosos, observador-dependente e com baixa sensibilidade para detectar as formas
talassêmicas afetadas pela disfunção de um ou dois genes α (SKOGERBOE et al., 1992;
CLARKE e HIGGINS, 2000; CHAN et al., 2001; DIAS-PENNA et al., 2010; RYAN et
al., 2010). No entanto, existem outros estudos sobre o tema na literatura científica que
afirmam exatamente o contrário, sugerindo ainda que para aqueles que queiram
aumentar a sensibilidade e confiabilidade do método, outras possíveis causas de
microcitose devem ser excluídas, como por exemplo, a deficiência de ferro, traço β
talassêmico ou as variantes de Hb (THOMPSON et al.,1989; SABATH et al., 2003;
NAOUM, 2004; PAN et al., 2005; REPAPINOU et al., 2007; HARTEVELD e HIGGS,
2010; WAYE e ENG, 2013).
Além disso, alguns autores apontam dificuldades no diagnóstico das formas de
α-tal mais prevalentes, devido à ausência de manifestações clínicas e leves alterações
laboratoriais (HIGGS e BOWDEN,2001; WEATHERALL, 2001; NERI et al., 2005).
Naoum e colaboradores (2007) ressaltam, como motivos de falha diagnóstica,
principalmente, a imperícia técnica e as baixas concentrações de hemoglobina H, como
é o caso da interação das talassemias alfa e beta (NAOUM e BONINI-DOMINGOS,
2007). Contudo, em nosso estudo assim como em diversos outros (VIANABARACIOLI et al., 2001; VIANA e OLIVEIRA, 2011) os casos sugestivos de α-tal
foram os de maior ocorrência, superando a forma heterozigota da Hb S, característico de
descendentes de africanos, demonstrando a eficiência dos métodos empregados.
Em síntese, evidenciamos que pela alta incidência, a α-tal caracteriza-se também
em nosso meio, como um problema de saúde pública; que as diferentes técnicas
eletroforéticas associadas à pesquisa citológica da Hb H se mostraram úteis para a
detecção dos portadores dessa hemoglobinopatia e que os métodos de triagem são
fáceis, de baixo custo e reprodutíveis nos laboratórios de rotina, podendo ser utilizadas
na detecção e pesquisa da α-tal, não incluída na rotina do Programa Nacional de
Triagem Neonatal oferecido pela rede pública, nem nos hemocentros brasileiros.
Contudo, torna-se evidente a necessidade do uso de técnicas moleculares,
principalmente nos casos de investigação da α-tal em associação e naqueles cuja
triagem tenha sido inconclusiva.
Conclusão
8. Conclusão
Com base nos dados obtidos nesse estudo concluímos que:
1. A incidência de α-tal nos recém-nascidos foi de 10,46%. Este resultado foi
semelhante ao encontrado nos estados de Minas Gerais e no Sudeste do país.
Demonstramos que existe uma associação entre a presença de α-tal com a
etnia negra, com a diminuição dos níveis das Hb A e Hb A2 e com a elevação
dos níveis de Hb Fetal.
2. A ocorrência de α-tal nos doadores de 7,94% foi similar aos relatados em
pesquisas com doadores anêmicos. Houve uma associação quanto à etnia e a
presença da α-tal. Na análise do perfil hematológico concluímos que não
houve associação do histórico de anemia, tratamento e tipo de tratamento
para anemia, contagem das HC, HT, VCM, RDW, dosagem de ferritina e
hemoglobinas A, A2 e Fetal, com portadores de α-tal. Observamos uma
correlação entre os índices HCM e CHCM e os portadores de α-tal.
3. A ocorrência de alfa talassemia nas crianças de 25%. Ocorreu uma
associação entre a presença de α-tal com a etnia negra e histórico de anemia.
Com relação ao tratamento e tipo de tratamento para anemia, as médias de
hemácias, Hb, HT, os índices hematimétricos (VCM, HCM, CHCM e
RDW), dosagem de ferritina e as dosagens das hemoglobinas A e Fetal,
nenhuma associação foi identificada. No entanto observamos associação
entre as médias da Hb A2 e os sugestivos de α-tal
4. Analisando os resultados dos testes utilizados na triagem para α-tal
(eletroforéticos e pesquisa citológica da Hb H), foi possível observar uma
elevada concordância (71,49%) entre os testes.
Os resultados obtidos, portanto, demonstram uma alta ocorrência da α-tal no
nosso meio, estando relacionada diretamente com a etnia e com a presença de
microcitose e hipocromia. Assim as informações desse trabalho contribuem para um
melhor entendimento da α-tal.
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98. WEATHERALL, D. J. Thalassemia: the long road from the bedside through the
laboratory to the community. Nature medicine. v. 16, n.10, 2010.
99. WEATHERALL, D. J. The Role of the Inherited Disorders of Hemoglobin, the
First" Molecular Diseases," in the Future of Human Genetics. Annual review of
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100.
WEATHERALL, D. J., CLEGG, J. B. Inherited haemoglobin disorders:
an increasing gobal health problem. Bulletin of the World Health Organ.,
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101.
WEATHERALL, D. J.; PROVAN, A.B. Read cell I: inherited anaemias.
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102.
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In: LICHTMAN, M. A.; BEUTLER, E.; KIPPS, T.J.; SELIGSOHN, V.:
KAVSHANSKY, K.; PRCHAL, J.T. (Ed.). Williams Hematology, 7.ed.
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WENNING, M. R. S. C.; KIMURA, E. M.; COSTA, F. F.; SAAD, S. T.
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107.
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108.
ZAGO, M.A; FALCAO, R.P.; PASQUINI, R. editors. Hematologia:
fundamentos e pratica. Sao Paulo: Atheneu; 2004.
Anexos
10. Anexos
ANEXO I
Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa-CEP
N°____________
ANEXO II
FICHA DE IDENTIFICAÇÃO
DATA_____/_____/________
NOME:_______________________________________N°REGISTRO____________
NOME DA MÃE (no caso de menores)______________________________________
ENDEREÇO:__________________________________________________________
TELEFONES:(____)____________D.NASC:_____/_____/_______GÊNERO:_______
NATURALIDADE_________________GRUPO ÉTNICO:_______________________
ETNIA DOS ANTECEDENTES: AVÓ MATERNA (
AVÔ MATERNO (
(
)P (
PAI (
)A (
)B (
)B (
)N (
)P (
)A (
)I
)B (
)N
)P (
)A (
) I , AVÓ PATERNA (
) I AVÔ PATERNO (
)B (
)N (
)N (
)P (
)N (
)B (
)A (
) I MÃE(
)B (
)P (
)N (
)A (
)P (
)I
)A (
)I
MÉDICO:_____________________________________________________________
MEDICAMENTOS EM USO:______________________________________________
TRANSFUSÃO SANGUÍNEA: (
HISTÓRICO DE ANEMIA: (
)SIM (
)SIM (
)NÃO; QUANDO?____________________
) NÃO;
HISTÓRICO DE TRATAMENTO PARA ANEMIA: (
)SIM (
)NÃO; QUAL?________
HISTÓRICO DE USO MEDICAMENTOS NOS ÚLTIMOS 12 MESES:_____________
____________________________________________________________________
MANIFEST.
CLÍNICAS:____________________________________________________
==================================================================
==
EXAMES LABORATORIAIS:
Hct:____________% VCM:___________fL RDW:______% Hb____________g/dL
HCM:___________pg He____________x 1012/L CHCM:__________g/dL
Morfologia eritrocitária:__________________________________________________
Ferritina sérica:___________ Pesquisa HbH:______________Eletroforese de
Hb:_______________Hb A: _________%Hb Fetal:___________ %HbA2:
_____________%
ANÁLISE MOLECULAR
ANEXO III
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Hemocentro Regional de Uberaba/Fundação Hemominas
Serviço de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro
MODELO DO TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
PARTICIPANTES DO GRUPO 1 (Doadores de sangue)
Título do Projeto:
Prevalência de talassemia alfa em recém-nascidos sadios e pacientes pediátricos com
anemia à esclarecer, atendidos pelo Hospital de Clínicas da Universidade Federal do
Triângulo Mineiro e doadores de sangue inaptos por anemia do Hemocentro Regional de
Uberaba.
Você é portador de anemia e como já foi orientado pelo profissional que te atendeu aqui
do Hemocentro, você será encaminhado ao clínico hematologista do Pronto Atendimento do
Hemocentro Regional de Uberaba, para atendimento médico e realização de exames
laboratoriais que esclareçam a causa de sua anemia.
Existem vários tipos de anemia cujas causas principais são por falta de nutrientes
alimentares como o ferro ou de origem genética hereditária. Este último é causado por mutações
(mudanças) na formação dos nossos genes e que são passadas durante a formação do feto pelos
genes dos pais, como é o caso da anemia falciforme e a talassemia. Considerando que a
talassemia alfa é um dos mais prevalentes tipos em nosso meio, mas que ainda tem o
diagnóstico controverso, requerendo padronização de técnicas e utilização de exames mais
sensíveis para sua confirmação que não são disponíveis na rotina, nós estamos convidando você
a participar desta pesquisa.
Trata-se de um estudo com título “Prevalência de talassemia alfa em recém-nascidos
sadios e pacientes pediátricos com anemia à esclarecer, atendidos pelo Hospital de Clínicas da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro e doadores de sangue inaptos por anemia do
Hemocentro Regional de Uberaba”.
O seu objetivo é determinar a prevalência da talassemia alfa e identificar os tipos de
mutações mais comuns em pacientes e doadores de sangue atendidos pelo HRU e Ambulatório
de Hematologia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, tendo como justificativa, a
importância de gerar dados regionais sobre o perfil hematológico e molecular da talassemia alfa
na região, os quais poderão servir de auxílio no diagnóstico clínico dessa alteração.
Portanto nesta pesquisa, faremos exames que podem confirmar com certeza a presença
desse tipo de anemia. Os avanços na área da saúde ocorrem através de estudos como este, por
isso a sua participação é importante. Caso você concorde em participar, nós aproveitaremos a
amostra de sangue que você for colher para a realização dos exames de identificação da causa
de sua anemia, não sendo necessário colher mais sangue. Além disso, você só terá que
responder a algumas perguntas para preenchimento de uma ficha de identificação com seus
dados pessoais (endereço, telefone, data de nascimento, cidade onde nasceu, origem racial)
antecedentes de transfusão sanguínea, medicamentos usados, história de anemia na família e
com espaço para colocar posteriormente os resultados dos exames laboratoriais que você
realizará.
No que se refere à coleta do sangue necessário para o exame mencionado acima, esta
será realizada pelo mesmo profissional que colherá seu sangue para a realização dos exames que
serão solicitados pelo médico hematologista, aproveitando assim essa amostra para a realização
dos exames laboratoriais dessa pesquisa. Durante esse processo de coleta não será acrescentado
nenhum risco a você além daqueles que já fazem parte de uma coleta de sangue, como a
formação de pequenos hematomas (manchas arroxeadas levemente doloridas no local da coleta)
no caso de dificuldades encontradas em veias mais finas e sensíveis. Entretanto, isso não deverá
preocupá-lo caso venha ocorrer, pois estes desaparecem dentro de poucos dias. Quanto ao
preenchimento da ficha de identificação, pode-se afirmar que esse não trará a você também
nenhum risco, pois não possui perguntas que possam constranger ou ferir sua integridade. Você
poderá obter todas as informações que quiser e poderá não participar da pesquisa ou retirar seu
consentimento a qualquer momento, sem prejuízo no seu atendimento. Pela sua participação no
estudo, você não receberá qualquer valor em dinheiro, mas terá a garantia de que todas as
despesas necessárias para a realização da pesquisa não serão de sua responsabilidade. Seu nome
não aparecerá em qualquer momento do estudo, pois você será identificado com um número.
Quanto aos resultados dos exames realizados, quando apresentarem positividade para talassemia
alfa, estes serão repassados para você pelo médico hematologista que lhe atenderá durante sua
consulta de retorno.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE, APÓS ESCLARECIMENTO
Título do Projeto:
Prevalência de talassemia alfa em recém-nascidos sadios e pacientes pediátricos com
anemia à esclarecer, atendidos pelo Hospital de Clínicas da Universidade Federal do
Triângulo Mineiro e doadores de sangue inaptos por anemia do Hemocentro Regional de
Uberaba.
Eu,_______________________________________________________________, li e/ou ouvi
o esclarecimento acima e compreendi para que serve o estudo e qual procedimento a que serei
submetido. A explicação que recebi esclarece os benefícios do estudo. Eu entendi que sou livre
para interromper minha participação a qualquer momento, sem justificar minha decisão e que
isso não afetará meu tratamento. Sei que meu nome não será divulgado, que não terei despesas e
não receberei dinheiro por participar do estudo. Eu concordo em participar do estudo.
Banco de amostras: caso você autorize, o material genético (DNA) recolhido para este estudo
poderá ser usado por pesquisadores da Fundação Hemominas e da UFTM em estudos com os
mesmos objetivos: investigar mutações genéticas da talassemia alfa. Neste caso, a sua amostra
será conservada sem prazo para descarte. Entretanto, o uso futuro deste material nunca será
ligado a nenhum dado pessoal do participante. Você pode negar a permissão para o uso da
amostra em estudos futuros, e ainda participar deste projeto. Se você autorizar o uso futuro da
sua amostra, qualquer novo estudo utilizando esta amostra deverá ser avaliado e autorizado pelo
Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação. Portanto, marque com um x no quadrado abaixo sua
decisão.
Aceito que os pesquisadores guardem a amostra coletada para uso em estudos futuros.
Não aceito que os pesquisadores guardem a amostra coletada para uso em estudos futuros.
Uberaba, ............./ ................../................
________________________________
Assinatura do voluntário
____________________________________
Assinatura do pesquisador responsável
____________________________
Documento de Identidade
_______________________
Assinatura pesquisador orientador
Telefone de contato dos pesquisadores:
Renata (34) 9935-9502; Aline: (34) 8832-0401; Dr. Hélio (34) 3312-5077
ANEXO IV
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Serviço de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro
Hemocentro Regional de Uberaba/Fundação Hemominas
MODELO DO TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
PARTICIPANTES DO GRUPO 2 (Recém-nascidos)
Título do Projeto:
Prevalência de talassemia alfa em recém-nascidos sadios e pacientes pediátricos com
anemia à esclarecer, atendidos pelo Hospital de Clínicas da Universidade Federal do
Triângulo Mineiro e doadores de sangue inaptos por anemia do Hemocentro Regional de
Uberaba.
Existem vários tipos de anemia cujas causas principais são por falta de nutrientes
alimentares como o ferro ou de origem genética hereditária. Este último é causado por mutações
(mudanças) nos nossos genes e que são passadas durante a formação do feto pelos genes dos
pais, como é o caso da anemia falciforme e a talassemia. Considerando que a talassemia alfa é
um dos mais prevalentes tipos em nosso meio, mas que ainda tem o diagnóstico controverso,
requerendo padronização de técnicas e utilização de exames mais sensíveis para sua
confirmação que não são disponíveis na rotina, nós estamos convidando seu filho a participar
desta pesquisa.
Trata-se de um estudo com título “Prevalência de talassemia alfa em recém-nascidos
sadios e pacientes pediátricos com anemia à esclarecer, atendidos pelo Hospital de Clínicas da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro e doadores de sangue inaptos por anemia do
Hemocentro Regional de Uberaba.
O seu objetivo é determinar a prevalência da talassemia alfa e identificar os tipos de
mutações mais comuns em pacientes e doadores de sangue atendidos pelo Ambulatório de
Hematologia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, tendo como justificativa, a
importância de gerar dados regionais sobre o perfil hematológico e molecular da talassemia alfa
na região, os quais poderão servir de auxílio no diagnóstico clínico dessa alteração.
Portanto nesta pesquisa, faremos exames laboratoriais que podem confirmar com
certeza a presença desse tipo de anemia. Os avanços na área da saúde ocorrem através de
estudos como este, por isso a sua participação é importante. Caso você concorde em participar,
será aproveitada a mesma amostra de sangue do cordão umbilical do seu filho(a) que será
coletada para a realização dos exames de rotina dos recém-nascidos após o parto. Além disso,
você só terá que responder a algumas perguntas para preenchimento de uma ficha de
identificação com os dados pessoais seus e de seu filho (endereço, telefone, data de nascimento,
origem racial), antecedentes de transfusão sanguínea, medicamentos usados, história de anemia
na família e com espaço para colocar posteriormente os resultados dos exames laboratoriais
realizados.
No que se refere à coleta do material necessário para a pesquisa, podemos afirmar que
este processo não ocasiona nenhum risco para você ou seu filho(a), uma vez que o sangue
colhido é do cordão umbilical, o qual é normalmente descartado juntamente com a placenta
após a coleta de sangue para os exames de rotina dos recém-nascidos. Quanto ao preenchimento
da ficha de identificação, pode-se afirmar que esse também não trará a você ou a seu filho(a)
nenhum risco, pois não possui perguntas que possam constranger ou ferir suas integridades.
Você poderá obter todas as informações que quiser e poderá não participar da pesquisa
ou retirar seu consentimento a qualquer momento, sem prejuízo no seu atendimento. Pela
participação de seu filho(a) no estudo, vocês não receberão qualquer valor em dinheiro, mas
terão a garantia de que todas as despesas necessárias para a realização da pesquisa não serão de
suas responsabilidades. Seu nome ou de seu filho(a) não aparecerão em qualquer momento do
estudo, pois vocês serão identificados com um número. Quanto aos resultados dos exames
realizados por seu filho(a), quando apresentarem positividade para talassemia alfa, estes serão
repassados para você pelo médico pediatra que lhe atenderá durante sua consulta de retorno.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE, APÓS ESCLARECIMENTO
Título do Projeto:
Prevalência de talassemia alfa em recém-nascidos sadios e pacientes pediátricos com
anemia à esclarecer, atendidos pelo Hospital de Clínicas da Universidade Federal do
Triângulo Mineiro e doadores de sangue inaptos por anemia do Hemocentro Regional de
Uberaba.
Eu, ______________________________________________________________, li e/ou ouvi o
esclarecimento acima e compreendi para que serve o estudo e qual procedimento ao qual o
menor sob minha responsabilidade será submetido. A explicação que recebi esclarece os
benefícios do estudo. Eu entendi que eu e o menor sob minha responsabilidade somos livres
para interromper a participação dele na pesquisa a qualquer momento, sem justificar a decisão
tomada e que isso não afetará o tratamento dele. Sei que o nome do menor não será divulgado,
que não teremos despesas e não receberemos dinheiro por participar do estudo. Eu concordo
com a participação de meu filho(a) no estudo.
Banco de amostras: caso você autorize, o material genético (DNA) recolhido para este estudo
poderá ser usado por pesquisadores da Fundação Hemominas e da UFTM em estudos com os
mesmos objetivos: investigar mutações genéticas da talassemia alfa. Neste caso, a sua amostra
será conservada sem prazo para descarte. Entretanto, o uso futuro deste material nunca será
ligado a nenhum dado pessoal do participante. Você pode negar a permissão para o uso da
amostra em estudos futuros, e ainda participar deste projeto. Se você autorizar o uso futuro da
sua amostra, qualquer novo estudo utilizando esta amostra deverá ser avaliado e autorizado pelo
Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação. Portanto, marque com um x no quadrado abaixo sua
decisão.
Aceito que os pesquisadores guardem a amostra coletada para uso em estudos futuros.
Não aceito que os pesquisadores guardem a amostra coletada para uso em estudos futuros.
Uberaba, ................../ ................../................
_______________________________
Assinatura do responsável legal
_______________________________
Documento de identidad
_______________________________
Assinatura do pesquisador responsável
_____________________________________
Assinatura do pesquisador orientador
Telefone de contato dos pesquisadores:
Renata (34) 9935-9502; Aline: (34) 8832-0401; Dr. Hélio (34) 3312-507
ANEXO V
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Serviço de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal do Triângulo Mineiro
Hemocentro Regional de Uberaba/Fundação Hemominas
MODELO DO TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
PARTICIPANTES DO GRUPO 3 (Pacientes pediátricos)
Título do Projeto:
Prevalência de talassemia alfa em recém-nascidos sadios e pacientes pediátricos com
anemia à esclarecer, atendidos pelo Hospital das Clínicas da Universidade Federal do
Triângulo Mineiro e doadores de sangue inaptos por anemia do Hemocentro Regional de
Uberaba.
Seu filho(a) é portador de anemia e como você já foi orientado pelo clínico
hematologista do pronto atendimento do Hospital de Clínicas de Uberaba, deverá realizar
exames laboratoriais que esclareçam a causa dessa anemia.
Existem vários tipos de anemia cujas causas principais são por falta de nutrientes
alimentares como o ferro ou de origem genética hereditária. Este último é causado por mutações
(mudanças) na formação dos nossos genes e que são passadas durante a formação do feto pelos
genes dos pais, como é o caso da anemia falciforme e a talassemia. Considerando que a
talassemia alfa é um dos mais prevalentes tipos em nosso meio, mas que ainda tem o
diagnóstico controverso, requerendo padronização de técnicas e utilização de exames mais
sensíveis para sua confirmação que não são disponíveis na rotina, nós estamos convidando seu
filho a participar desta pesquisa.
Trata-se de um estudo com título “Prevalência de talassemia alfa em recém-nascidos
sadios e pacientes pediátricos com anemia à esclarecer, atendidos pelo Hospital de Clínicas da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro e doadores de sangue inaptos por anemia do
Hemocentro Regional de Uberaba”.
O seu objetivo é determinar a prevalência da talassemia alfa e identificar os tipos de mutações
mais comuns em pacientes e doadores de sangue atendidos pelo Ambulatório de Hematologia
da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, tendo como justificativa, a importância de gerar
dados regionais sobre o perfil hematológico e molecular da talassemia alfa na região, os quais
poderão servir de auxílio no diagnóstico clínico dessa alteração.
Portanto nesta pesquisa, faremos exames laboratoriais que pode confirmar com certeza a
presença desse tipo de anemia. Os avanços na área da saúde ocorrem através de estudos como
este, por isso a participação de seu filho(a) é importante. Caso você e/ou seu filho(a) concordem
em participar, nós utilizaremos a mesma amostra de sangue colhida de seu filho(a) for colher os
exames para a identificação da causa de sua anemia. Ademais, você e/ou seu filho terão que
responder a algumas perguntas para preenchimento de uma ficha de identificação com os dados
pessoais da criança (endereço, telefone, data de nascimento, cidade onde nasceu, origem racial),
antecedentes de transfusão sanguínea, medicamentos usados, história de anemia na família e
com espaço para colocar posteriormente os resultados dos exames laboratoriais realizados.
No que se refere à coleta do sangue necessário para a pesquisa, esta será feita pelo
mesmo profissional que colherá o sangue de seu filho(a) para a realização dos exames que serão
solicitados pelo médico hematologista. Durante este processo não será acrescentado nenhum
risco à criança além daqueles que já fazem parte de uma coleta de sangue, como a formação de
pequenos hematomas (manchas arroxeadas levemente doloridas no local da coleta) que ocorrem
no caso de dificuldades durante a punção de veias mais finas e sensíveis. Entretanto, isso não
deverá preocupá-los caso venha ocorrer, pois estes desaparecem dentro de poucos dias. Quanto
ao preenchimento da ficha de identificação, pode-se afirmar que esse também não trará a você
nem a seu filho(a) nenhum risco, pois não possui perguntas que possam constranger ou ferir
suas integridades. Você e/ou seu filho(a) poderão obter todas as informações que quiserem e
poderão não participar da pesquisa ou retirar seus consentimentos a qualquer momento, sem
prejuízo no atendimento de seu filho(a). Pela participação de seu filho(a) no estudo, vocês não
receberão qualquer valor em dinheiro, mas terão a garantia de que todas as despesas necessárias
para a realização da pesquisa não serão de suas responsabilidades. Seu nome ou de seu filho(a)
não aparecerão em qualquer momento do estudo, pois vocês serão identificados com um
número. Quanto aos resultados dos exames realizados, quando apresentarem positividade para
talassemia alfa, estes serão repassados para você e/ou para seu filho(a) pelo médico
hematologista que lhe atenderá durante sua consulta de retorno.
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE, APÓS ESCLARECIMENTO
Título do Projeto:
Prevalência de talassemia alfa em recém-nascidos sadios e pacientes pediátricos com
anemia à esclarecer, atendidos pelo Hospital de Clínicas da Universidade Federal do
Triângulo Mineiro e doadores de sangue inaptos por anemia do Hemocentro Regional de
Uberaba.
Eu, ______________________________________________________________, li e/ou ouvi o
esclarecimento acima e compreendi para que serve o estudo e qual procedimento ao qual o
menor sob minha responsabilidade será submetido. A explicação que recebi esclarece os
benefícios do estudo. Eu entendi que eu e o menor sob minha responsabilidade somos livres
para interromper a participação dele na pesquisa a qualquer momento, sem justificar a decisão
tomada e que isso não afetará o tratamento dele. Sei que o nome do menor não será divulgado,
que não teremos despesas e não receberemos dinheiro por participar do estudo. Eu concordo
com a participação do menor no estudo, desde que ele também concorde. Por isso ele assina
(caso seja possível) junto comigo este Termo de Consentimento.
Banco de amostras: caso você autorize, o material genético (DNA) recolhido para este estudo
poderá ser usado por pesquisadores da Fundação Hemominas e da UFTM em estudos com os
mesmos objetivos: investigar mutações genéticas da talassemia alfa. Neste caso, a sua amostra
será conservada sem prazo para descarte. Entretanto, o uso futuro deste material nunca será
ligado a nenhum dado pessoal do participante. Você pode negar a permissão para o uso da
amostra em estudos futuros, e ainda participar deste projeto. Se você autorizar o uso futuro da
sua amostra, qualquer novo estudo utilizando esta amostra deverá ser avaliado e autorizado pelo
Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação. Portanto, marque com um x no quadrado abaixo sua
decisão.
Aceito que os pesquisadores guardem a amostra coletada para uso em estudos futuros.
Não aceito que os pesquisadores guardem a amostra coletada para uso em estudos futuros.
Uberaba, ................../ ................../...............
___________________________________
Assinatura do voluntário
_______________________________________
Assinatura do menor (caso ele possa assinar)
__________________________________
Assinatura do pesquisador responsável
_____________________________
Documento de Identidade
__________________________________
Documento (se possuir)
__________________________________
Assinatura do pesquisador orientador
Telefone de contato dos pesquisadores: Renata (34) 9935-9502; Aline: (34) 88320401; Dr. Hélio (34) 3312-5077.