2012
QUALIDADE ESPERMÁTICA: UM ESTUDO INTEGRADO EM 66
Fernando Lopes
QUALIDADE ESPERMÁTICA: UM ESTUDO INTEGRADO EM 66 AMOSTRAS HUMANAS
AMOSTRAS HUMANAS
Dissertação de Mestrado
2º Ciclo em Biotecnologia para as Ciências da Saúde
Fernando Manuel Carvalho Lopes
UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO
VILA REAL, 2012
QUALIDADE ESPERMÁTICA: UM ESTUDO INTEGRADO EM 66
AMOSTRAS HUMANAS
(versão provisória)
Dissertação apresentada à Universidade Trás-os-Montes e Alto Douro para
cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em
Biotecnologia para as Ciências da Saúde, realizada sob a orientação científica
da Professora Doutora Isabel Gaivão e da Doutora Rosário Pinto Leite.
Fernando Manuel Carvalho Lopes
UNIVERSIDADE DE TRÁS-OS-MONTES E ALTO DOURO
VILA REAL, 2012
Júri de Apreciação
Presidente: ...................................................................................................................................................
1º Vogal: .......................................................................................................................................................
2º Vogal: .......................................................................................................................................................
Classificação: ...............................................................
Data: ....................................................................................
Aos meus Pais
Ao meu irmão
Ao meu sobrinho
À Daniela.
iv
AGRADECIMENTOS
Ao longo desta minha aventura muitas foram as pessoas que directa ou indirectamente,
de forma abnegada e sincera, me apoiaram. A elas o meu profundo reconhecimento e
agradecimento:
À Professora Doutora Isabel Gaivão, orientadora de tese de Mestrado, pela sua excelente
orientação marcada pela paciência, empenho e imensa disponibilidade, pela sua competência
científica, técnica e humana.
À Doutora Rosário Pinto Leite, co-orientadora da tese de Mestrado, pela sua competência
e excelência em tudo o que faz. Por ter permitido que eu crescesse científica e tecnicamente ao
meu ritmo sabendo que a exigência é o sustento do bom trabalho.
À Professora Doutora Maria Manuel Oliveira e ao Professor Doutor Francisco Peixoto que
me acolheram sem reservas, possibilitando assim a realização deste trabalho. Foram um exemplo
a todos os níveis. Um sincero muito obrigado.
Ao Pedro, Drª Marta e Regina que para além de exemplos de profissionalismo, dedicação
e altruísmo tornaram-se verdadeiros amigos. Que conseguiram fazer com que fosse fácil aprender
e estar motivado para trabalhar todos os dias.
À D. Rosa e D. Lurdes, do Laboratório de Citogenética do CHTMAD, pela amizade,
disponibilidade, simpatia e colaboração.
Ao Marco e Jaqueline companheiros de “luta” que partilharam comigo as pequenas
derrotas e vitórias do dia-a-dia, a humildade, o compromisso, a vontade de aprender e a boa
disposição.
Ao Félix, Joana, Marisa, Vera, Kelly e Beatriz pela ajuda e boa disposição com que me
receberam.
Ao pessoal do rugby.
Aos meus pais, Fernando Lopes e Maria Carvalho, que em todos os momentos, onde quer
que estivesse, me apoiam incondicionalmente, que me fazem sentir a importância das pequenas
coisas, e que possibilitam toda a minha vivência académica.
v
A toda a minha família com especial relevo para a minha Madrinha e o meu tio Carlos por
estarem ao meu lado sempre que preciso, pela amizade e carinho.
Ao meu irmão, Bruno, e à minha cunhada Gia, pela paciência e carinho, pelo estímulo e
pela presença constante e efectiva na minha caminhada.
Ao meu sobrinho Bruno, e ao Samuel, Carlota e Tomás, pela alegria e amor, e por me
mostrarem as coisas boas da vida, tornando-me todos os dias uma pessoa melhor.
À D. Amélia, Sr. Porfírio, Porfírio, Joana, Bela e Sónia pela ajuda, amizade e apoio.
Ao Nuno por ser muito mais do que amigo e primo, por ser um exemplo e um
complemento.
Aos meus amigos Quintas, Maria, Isa, Sara, Carlos, Ana Raquel, Bibi, Ricardo, Zé Carlos,
Duro, Rui, Nuno Machado, Sandra, Irene, Davide, Luís, Sérgio, Nuno, Tiago, e Jorge pela partilha,
dedicação, amizade, apoio, alegria e companheirismo.
À Daniela que atura o meu mau feitio e mesmo assim é capaz, todos os dias, de me
abraçar e só ver as coisas boas. Por tudo o que é hoje, foi ontem e há-de ser amanhã. Por me
apoiar incondicionalmente seja qual for o meu passo e acreditar em mim mais do que eu próprio.
Obrigado por me apoiares nos momentos de descrença e alegria, por me ouvires e aconselhares,
por seres calma na tempestade e agitação na calmaria.
vi
RESUMO
Infertilidade é a falha na concepção após 2 anos de relações sexuais sem a utilização de
qualquer método contraceptivo. Estima-se que aproximadamente 15% dos casais, em idade fértil,
à procura da primeira gravidez, enfrentem esta situação.
Aproximadamente 1 em cada 15 homens têm problemas de fertilidade, a infertilidade
masculina pode ter inúmeras causas como alterações anatómicas, hormonais, genéticas,
imunológicas, infecções ou estilo de vida e exposição a factores ambientais.
Dependendo da concentração, localização e tempo de exposição, as espécies reactivas a
oxigénio (ROS) podem ter efeitos benéficos ou prejudiciais sobre os espermatozóides. Níveis
baixos de ROS são essenciais para a fertilização, reacção acrossómica, hiperativação, motilidade e
capacitação. Níveis elevados podem levar a apoptose, peroxidação lipídica, dano no DNA e dano
nas proteínas.
Neste trabalho foram analisadas 66 amostras de sémen por espermograma e para cada
indivíduo realizada análise citogenética convencional. Destas foram escolhidas 25 amostras para
detecção de aneuploidias espermáticas dos cromossomas sexuais. Foram avaliadas 48 amostras
quanto à actividade da catalase (CAT) e glutationa S-transferase (GST) e 51 amostras foram
avaliadas quanto à actividade da superóxido dismutase (SOD). Determinaram-se as concentrações
de malonildialdeído (MDA) (n= 31), hidroperóxidos (n= 35) e tióis totais (n= 36) em amostras
previamente seleccionadas. O dano no DNA foi determinado pela técnica de TUNEL em 53
amostras e pelo ensaio de Cometa com e sem incubação com a enzima FPG em 49 amostras.
Encontraram-se associações entre os parâmetros da qualidade espermática, e os
resultados da concentração de MDA, hidroperóxidos e tióis totais, a actividade das enzimas
antioxidantes (SOD, CAT e GST) e o dano no DNA proveniente dos ensaios de TUNEL e Cometa.
Em conclusão, o estudo do stresse oxidativo nos espermatozóides é extremamente
importante para se perceber a etiologia da infertilidade masculina idiopática.
Palavras chave: Stresse oxidativo, peroxidação lipídica, enzimas antioxidantes, dano no DNA,
espermograma, citogenética.
vii
ABSTRACT
Infertility is a failure to conceive after at least one year of unprotected intercourse. It has
been estimated that approximately 15% of the population in industrially developed countries are
affected.
Approximately 1 in 15 men have fertility problems. Male infertility can have many causes
such as anatomic changes, hormonal changes, immune alterations, infections, genetic or lifestyle
and exposure to environmental factors.
Depending on the concentration, location and time of exposure, reactive oxygen species
(ROS) can have beneficial or harmful effects on sperm. Low levels of ROS are essential for
fertilization, acrosome reaction, hyperactivation, motility and capacitation. Elevated levels can
lead to apoptosis, lipid peroxidation, DNA damage and damage to the proteins.
We studied 66 samples of semen for semen analysis and for each case performed
conventional cytogenetic analysis. 25 were chosen for the detection of sex chromosomes
aneuploidy in sperm. 48 samples were selected for evaluation of glutathione S-transferase (GST)
and catalase (CAT) activity of 51 samples for the evaluation of superoxide dismutases (SOD)
activity. We determined the amount of malondialdehyde (MDA) (n= 31), hydroperoxides (n= 35)
and total thiols (n= 36). The DNA damage was determined by TUNEL technique in 53 samples and
comet assay with and without FPG hybridization in 49 samples.
We have found associations between the parameters of sperm quality, and the results of
MDA, hydroperoxides and total thiols concentration, the activity of antioxidant enzymes (SOD,
CAT and GST) and DNA damage coming from Comet and TUNEL assays.
In conclusion, the study of oxidative stress in spermatozoa is extremely important to
understand the etiology of idiopathic male infertility.
Keywords: Oxidative stress, lipid peroxidation, antioxidant enzymes, DNA damage, semen
analysis, cytogenetic.
viii
PUBLICAÇÕES
Este trabalho encontra-se parcialmente publicado:

Artigo “Sperm quality, oxidative stress and seminal antioxidant activity” a ser preparado para
publicação em revista científica, baseado no trabalho desenvolvido

Lopes F, Gomes Z, Moutinho O, Peixoto F, Gaivão I, Pinto Leite R (2012). “Tunel and comet
assay: usefulness of these techniques in the study of the dna fragmentation in spermatozoa”,
17th World Congress on Controversies in Obstetrics, Gynecology and Infertility (COGI), 8-11 de
Novembro, 2012, Lisboa, Portugal – Aceite para publicação em acta de encontro científico e
comunicação em painel (“poster”)

Lopes F, Botelho P, Souto M, Gaivão I, Gomes Z, Martins M, Osvaldo O, Pinto Leite R (2012).
"Human Infertility: the importance of cytogenetic analysis", European Conference of Human
Genetics 2012, 23-26 de Junho, 2012, Nuremberga, Alemanha - Publicação em acta de encontro
científico

Lopes F, Botelho P, Souto M, Gaivão I, Gomes Z, Martins M, Moutinho O, Pinto Leite R (2012). "A
importância da equipa multidisciplinar no estudo da infertilidade - Avaliação Citogenética de
162 casais", 3rd Conference on Nursing Research of Ibero-American and Portuguese-speaking
Countries, 13-15 de Junho, 2012, Coimbra, Portugal – Comunicação Oral

Lopes F, Botelho P, Souto M, Gaivão I, Gomes Z, Martins M, Moutinho O, Pinto Leite R (2012).
"Detecção de uma translocação complexa num casal com infertilidade", IV National Conference
of Genetics and Biotechnology, 1-3 de Março, 2012, Vila Real, Portugal – Comunicação Oral

Botelho P, Lopes F, Souto M, Gaivão I, Gomes Z, Martins M, Moutinho O, Pinto Leite R (2012).
"Human Infertility: Cytogenetic analysis really matter", 2nd Congress of maternal and obstetric
health, Centro Hospitalar de Trás-os-Montes e Alto Douro, 14-15 de Outubro, Vila Real, Portugal
- Comunicação em painel (“poster”)
ix
ÍNDICE
INTRODUÇÃO .............................................................................................................. 1
1.
2.
3.
ANATOMIA E FISIOLOGIA DO SISTEMA REPRODUTOR MASCULINO ........................................2
1.1.
Regulação da secreção das hormonas sexuais no homem ..............................3
1.2.
Espermatogénese............................................................................................4
1.3.
Apoptose .........................................................................................................8
ESPERMATOZÓIDE ........................................................................................................9
2.1.
Fisiologia e morfologia ....................................................................................9
2.2.
Plasma Seminal .............................................................................................11
FECUNDAÇÃO ............................................................................................................11
3.1.
4.
Processos conferentes de capacidade de fertilização ....................................12
3.1.1.
Maturação no epidídimo .......................................................................................................... 13
3.1.2.
Capacitação e hiperativação .................................................................................................... 14
INFERTILIDADE ...........................................................................................................14
4.1.
Infertilidade masculina .................................................................................15
4.1.1.
Causas anatómicas e fisiológicas.............................................................................................. 15
4.1.2.
Estilo de vida e exposição a factores ambientais .................................................................... 16
4.1.3.
Anomalias genéticas e bioquímicas ......................................................................................... 18
OBJECTIVOS ............................................................................................................... 26
MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 28
1.
MATERIAL BIOLÓGICO ................................................................................................29
2.
AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS ESPERMÁTICOS ................................................................29
3.
2.1.
Liquefacção ...................................................................................................29
2.2.
Viscosidade ...................................................................................................29
2.3.
Cheiro ............................................................................................................30
2.4.
Cor ................................................................................................................30
2.5.
Volume ..........................................................................................................30
2.6.
pH .................................................................................................................30
2.7.
Motilidade.....................................................................................................30
2.8.
Vitalidade ......................................................................................................30
2.9.
Teste Hipoosmótico.......................................................................................31
2.10.
Concentração ................................................................................................31
2.11.
Morfologia ....................................................................................................33
2.12.
Classificação..................................................................................................34
ANÁLISE CITOGENÉTICA...............................................................................................34
x
3.1.
Método de bandeamento GTL ......................................................................35
3.2.
Método de bandeamento CBL .......................................................................35
4.
PREPARAÇÃO DO ESPERMATOZÓIDES .............................................................................36
5.
ANEUPLOIDIAS ESPERMÁTICAS .....................................................................................36
6.
STRESSE OXIDATIVO ...................................................................................................37
7.
6.1.
Quantificação de proteína ............................................................................37
6.2.
Actividade das enzimas antioxidants ............................................................38
6.2.1.
Superóxido dismutase (SOD) .................................................................................................... 38
6.2.2.
Glutationa S-transferase (GST) ................................................................................................. 38
6.2.3.
Catalase (CAT) ........................................................................................................................... 38
6.3.
Determinação da peroxidação lipídica pelo método de Fox ..........................39
6.4.
Determinação da peroxidação lipídica avaliada pelo método dos TBARS .....39
6.5.
Determinação do conteúdo em tióis totais ...................................................40
MÉTODO DE ADIÇÃO DE NUCLEÓTIDOS MARCADOS COM FLUORESCEÍNA MEDIADA PELA ENZIMA
DEOXINUCLEOTIDIL TRANSFERASE TERMINAL (TUNEL) ...........................................................................41
8.
ENSAIO DE COMETA....................................................................................................42
9.
ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................................................43
RESULTADOS ............................................................................................................. 44
1.
ANÁLISE CITOGENÉTICA E ESPERMOGRAMA ....................................................................45
2.
ANEUPLOIDIAS ESPERMÁTICAS DOS CROMOSSOMAS SEXUAIS ............................................47
3.
TIÓIS TOTAIS .............................................................................................................48
4.
HIDROPERÓXIDOS ......................................................................................................49
5.
TBARS ....................................................................................................................50
6.
ACTIVIDADE ENZIMÁTICA DAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES ...................................................50
6.1.
Superóxido Dismutase ...................................................................................51
6.2.
Glutationa S-transferase ...............................................................................51
6.3.
Catalase ........................................................................................................52
7.
ENSAIO DE TUNEL.....................................................................................................53
8.
ENSAIO DE COMETA ...................................................................................................54
9.
AVALIAÇÃO DE CORRELAÇÃO ENTRE AS DIFERENTES VARIÁVEIS ...........................................55
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS .................................................................................... 62
CONCLUSÕES ............................................................................................................. 69
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................... 71
ANEXOS ..................................................................................................................... 84
ANEXO 1 – CULTURA CELULAR, MANIPULAÇÃO E ESPALHAMENTO................................................85
xi
ABREVIATURAS
GnRH
LH
FSH
DNA
Hormona libertadora da gonadotrofina
Hormona luteinizante
Hormona foliculostimulante
Ácido desoxirribonucleico
SFC
Factor estaminal
ATP
Adenosina trifosfato
mtDNA
Ácido desoxirribonucleico mitocondrial
ZP
Zona pelúcida
RA
Reacção acrossómica
AMPc
OMS
Adenosina 3’,5’-monofosfato cíclico
Organização Mundial de Saúde
ROS
Espécies reactivas a oxigénio
HHT
Hipotálamo-hipófise-testículo
ASA
Anticorpos anti-espermatozóides
SHBG
MSY
AZF
SCSA
TUNEL
SCGE
FPG
PUFA
Globulina ligadora às hormonas sexuais
Male-specific Y
Factor de azoospermia
Ensaio de estrutura da cromatina do espermatozóide
Método de adição de nucleótidos marcados com fluoresceína mediada pela
enzima deoxinucleotidil transferase terminal
Single cell gel electrophoresis
Formamido pirimidina DNA glicosilase
Ácidos gordos polinsaturados
SOD
Superóxido dismutase
LPO
Peroxidação lipídica
MDA
Malonildialdeído
CAT
Catalase
GPX
Glutatião peroxidase
GST
Glutatião S-transferase
GR
Glutatião redutase
GSH
Glutatião reduzido
GSSG
Glutationa dissulfeto
xii
EPE
PR
Entidade pública empresarial
Progressivos rápidos
FISH
Hibridação in situ por fluorescência
BSA
Soro fetal de bovino
SDS
Dodecil sulfato de sódio
NBT
Cloreto de azul de nitrotetrazólio
CDNB
BHT
TBARS
DTNB
SH
1-cloro-2,4-dinitrobenzeno
Hidroxitolueno butilado
Método de quantificação de substâncias reactivas ao ácido tiobarbitúrico
5,5’-ditiobis- (2-ácido nitrobenzóico)
Grupos sulfidrilo
SSA
Ácido Sulfossalicílico
PBS
Tampão fosfato-salino
DAPI
SPZ
4'6-diamino-2-fenilindol
Espermatozóide
LMP
Baixo ponto de fusão
DTT
Ditiotreitol
UA
Unidades arbitrárias
xiii
Introdução
INTRODUÇÃO
1
Introdução
1. ANATOMIA E FISIOLOGIA DO SISTEMA REPRODUTOR MASCULINO
Os órgãos genitais masculinos são testículos, epidídimo, canais deferentes, vesículas
seminais, canal ejaculador e uretra, sendo considerados anexos as bolsas, as glândulas, os
músculos e as aponevroses (Seeley et al., 2011).
Figura 1. Anatomia do aparelho reprodutor masculino. Adaptado de Seeley et al., 2011
No aspecto anatómico o testículo divide-se em medula e córtex (albugínea), tendo este
prolongamentos conjuntivos que dividem o testículo em lobos. Os lobos testiculares apresentam
no seu interior os túbulos seminíferos (onde se dá o desenvolvimento dos espermatozóides,
espermatogénese e espermiogénese), tecido conjuntivo laxo (que envolve os túbulos) que
contém aglomerados de células endócrinas chamadas células intersticiais ou células de Leydig que
segregam testosterona. Os túbulos seminíferos têm um trajecto tortuoso com um comprimento
de 800m e terminam num conjunto de tubos rectos chamado rede testicular (rete testis). A rede
testicular esvazia-se para os canais eferentes que levam as células espermáticas do testículo para
o epidídimo (Seeley et al., 2011). Os testículos encontram-se fora da cavidade corporal no
escroto, isto é vital para que estes se mantenham a uma temperatura entre a 4-7°C inferior à
temperatura corporal (37°C), o que é determinante para uma óptima produção de
espermatozóides (Meniru, 2001).
O epidídimo tem uma forma alongada e encontra-se sobre o bordo postero-superior do
testículo, dividindo-se anatomicamente em cabeça, corpo e cauda, continuando-se esta com o
canal deferente. É responsável pela maturação final dos espermatozóides (Seeley et al., 2011).
2
Introdução
Os canais deferentes são revestidos por epitélio cilíndrico pseudoestratificado rodeado
por músculo liso cujas contracções peristálticas ajudam o movimento dos espermatozóides ao
longo deste. A extremidade de cada canal deferente alarga-se formando a ampola do canal
deferente. Contíguas a estes existem glândulas em forma de saco para onde os espermatozóides
maduros são encaminhados – vesículas seminais. Estas estruturas são reservatórios de esperma
nos intervalos das ejaculações, tendo no seu interior inúmeras câmaras que comunicam umas
com as outras. Ao canal excretor destas dá-se o nome de canal ejaculador (Seeley et al., 2011).
A uretra masculina é uma via comum para a urina e para o esperma. Esta divide-se em
uretra prostática, uretra membranosa e uretra esponjosa ou peniana (Seeley et al., 2011).
1.1. Regulação da secreção das hormonas sexuais no homem
Os mecanismos hormonais que condicionam o sistema reprodutor masculino são o
hipotálamo, a hipófise e os testículos (Seeley et al., 2011).
A hormona libertadora da gonadotrofina (GnRH), um péptido que comporta 10
aminoácidos, é produzida pelo hipotálamo e libertada no sistema porta hipotálamo-hipofisário,
sendo posteriormente transportada para a hipófise anterior e condiciona a libertação de duas
gonadotrofinas, a hormona luteinizante (LH) e a hormona foliculostimulante (FSH). A GnRH é
produzida intervaladamente a cada 1 a 3 horas. A intensidade do estímulo varia de duas formas:
pelo número de ciclos de secreção ou pela quantidade de GnRH produzida em cada uma. A
secreção de LH na adeno-hipófise é também cíclica com esta a ser determinada pelo estímulo
provocado por GnRH. A libertação de FSH aumenta e diminui muito ligeiramente a cada flutuação
de GnRH, em vez disso, a sua libertação é mais lenta, demorando horas, em resposta aos níveis de
GnRH (Holdcraft and Braun, 2004, Hall and Guyton, 2011).
A LH liga-se às células de Leydig nos testículos e determina o aumento do ritmo de síntese
e de secreção de testosterona. Esta é classificada como androgénio pois estimula o
desenvolvimento dos órgãos sexuais e das características sexuais secundárias. A testosterona
promove ainda a diferenciação sexual no embrião, a masculinização do hipotálamo, acções
metabólicas proteicas e lipídicas e tem ainda acção sobre as secreções (acne) e eritropoiese (Hall
and Guyton, 2011, Seeley et al., 2011).
A FSH liga-se a receptores específicos de FSH nas células de Sertoli nos túbulos
seminíferos induzindo o seu crescimento e a segregação de substâncias espermatogénicas (tais
como a inibina). Simultaneamente a testosterona e a dihidrotestosterona encontram-se
3
Introdução
difundidas nos túbulos seminíferos a partir das células de Leydig exercendo igualmente um factor
determinante na espermatogénese (Holdcraft and Braun, 2004, Hall and Guyton, 2011).
A testosterona, no normal desenvolvimento fisiológico, despoleta um mecanismo de
feedback negativo sobre o hipotálamo e hipófise para produzir uma diminuição da secreção de LH
e FSH, a inibina inibe também a secreção de FSH (Seeley et al., 2011). Este mecanismo é essencial
não só no desenvolvimento da linha celular germinativa masculina, mas também para a
proliferação e funcionamento de tipos específicos de células somáticas necessárias para o normal
desenvolvimento dos testículos (Holdcraft and Braun, 2004).
Figura 2. Regulação hormonal do sistema reprodutor masculino. Adaptado de Kamischke e Nieschlag, 2004
1.2. Espermatogénese
A espermatogénese é o total da soma de eventos que ocorrem no testículo e que levam à
produção de espermatozóides. Esta ocorre nos túbulos seminíferos durante a vida sexual activa
como resultado da estimulação da hipófise por hormonas gonadotróficas (LH e FSH) (Figura 2),
4
Introdução
começando aproximadamente aos 13 anos continuando durante toda a vida, mas diminuindo
acentuadamente em idades avançadas (Hall and Guyton, 2011).
Apresenta-se como um processo com baixa eficiência, principalmente quando comparado
com outros mamíferos. A título de exemplo por grama de parênquima testicular um homem
produz em média 4-6x106 espermatozóides enquanto os touros produzem 12 x106, os macacos
23x106 ou os coelhos 25x106. Esta menor eficiência pode-se dever a uma maior duração da
espermatogénese e/ou a uma menor densidade das células germinativas (Johnson et al., 2000).
É um processo lento em que uma célula estaminal (espermatogónia) se divide por mitose
para ciclicamente produzir espermatócitos primários que através de meiose levam à produção de
espermátides haplóides que se vão diferenciar, sem mais divisões, em espermatozóides (Johnson
et al., 2000).
Durante o desenvolvimento embrionário as células germinativas parentais migram para
os testículos e transformam-se em células germinativas imaturas chamadas espermatogónias, que
se estratificam em 2 ou 3 camadas na camada interna dos túbulos seminíferos. Após a puberdade
a espermatogónia migra entre as células de Sertoli para o lúmen central dos túbulos seminíferos.
As células de Sertoli envolvem as espematogónias com excisões citoplasmáticas (Hall and Guyton,
2011). Espermatogónias tipo A “brancas” (mitoticamente activas) entram em divisões mitóticas
sucessivas das quais resultam A1, A2, A3, A4, formas intermediárias culminando em
espermatogónias tipo B. Mas nem todas se diferenciam, pois mantem-se um reservatório de
espermatogónias designadas por tipo A “escuras” (Fauser, 1999).
A este evento sucede-se a meiose que é o processo pelo qual uma célula diplóide origina
uma descendência haplóide (Figura 3. B).
5
Introdução
B
A
Figura 3. Espermatogénese. A- Diferenciação celular, Adaptado de Seeley et al., 2011; B- Meiose, Adaptado
de Hall e Guyton et al., 2011
Na espermiogénese as espermátides desenvolvem-se por acção das células de Sertoli,
sendo que o seu núcleo fica mais individualizado e a cromatina mais condensada, a cauda formase a partir do centríolo distal e as mitocôndrias dirigem-se para a peça intermédia (Johnson et al.,
2008). Dentro da espermiogénese considera-se ainda um evento muito importante chamado de
espermiação que consiste no último passo, no finalizar da célula germinativa no lúmen do túbulo
e na remoção dos últimos vestígios de citoplasma e na passagem para o epidídimo (Lipshultz et
al., 2009). Além da espermiação podem-se considerar fases como a formação do acrossoma a
partir do complexo de Golgi. A biogénese desta estrutura, uma complexa vesícula secretora, não
depende de uma configuração diplóide para a sua transcrição. No seu conteúdo encontram-se
essencialmente enzimas hidrolíticas como protéases, hidroglicosilases e esterases (Moreno and
Alvarado, 2006). Seguem-se mudanças nucleares e na compactação do DNA, mais propriamente,
o DNA deixa de estar a rodear os nucleossomas composto por octâmeros de histonas e passa a
ser organizado em loops toroidais com protaminas em substituição das histonas, isto confere
6
Introdução
maior condensação e menor probabilidade de desnaturação. E ainda a formação da cauda
(Lipshultz et al., 2009).
Estima-se que a espermatogénese em humanos dure aproximadamente 64 dias (Misell et
al., 2006).
Figura 4. Espermiogénese Adaptado de Gilbert, 2010
Em suma, a espermatogénese consiste em 3 fases, a fase proliferativa ou mitótica, em
que existe a proliferação das espermatogónias; a meiose, que dá origem a células haplóides
chamadas de espermátides e a transformação citológica ou espermiogénese, em que há a
diferenciação que resulta em espermatozóides maduros (Figura 4) (Johnson et al., 2000, Misell et
al., 2006).
A função testicular normal depende da actuação de hormonas que actuam através de vias
endócrinas. As células de Sertoli providenciam factores essenciais para que a espermatogónia se
diferencie em espermatozóide. Estas têm ainda receptores para FSH e testosterona que são os
principais reguladores da espermatogénese. Vários trabalhos neste âmbito conseguiram
determinar que estas hormonas, com especial relevo para FSH, têm um papel determinante para
o destino celular, pois parecem estar associadas à prevenção da apoptose das células
germinativas (Dunkel et al., 1997, Erkkila et al., 1997, Tesarik et al., 2001). Mas também proteínas
como as da família Bcl-2 parecem ser fundamentais para a homeostasia das células germinais.
Parecem existir ainda factores parácrinos provenientes das células de Sertoli das quais as células
7
Introdução
germinativas necessitam para o processo fisiológico. Ainda a Activina A e a folistatina têm um
importante papel na maturação celular (Sofikitis et al., 2008).
1.3. Apoptose
Tão importante quanto a proliferação e a diferenciação é a morte celular, que no caso da
espermatogénese ocorre maioritariamente via apoptose (Blanco-Rodriguez and Martinez-Garcia,
1998).
A apoptose é a morte celular programada de uma célula, activado de dentro da célula, em
que existe fragmentação do DNA, vacuolização do citoplasma, alterações da membrana e
consequente morte da célula sem implicações para as vizinhas (Alberts, 2008).
Nas células germinativas a apoptose pode acontecer de duas formas através da ausência
da ligação do factor estaminal (SFC) (também conhecido como factor de Steel, produzido pelas
células de Sertoli) ao receptor c-kit presente nas espermatogónias tipo A, que inicia as vias de
sinalização que promovem a apoptose celular (Yan et al., 2000); ou através da via clássica com o
FAS ligante a ser produzido pelas células de Sertoli que se liga ao receptor FAS das células
germinativas, que vai induzir a tridimerização dos receptores FAS e o recrutamento de FADD. Este
complexo FAS/FADD liga-se às caspases iniciadoras 8 e 10 que por sua vez vão activar as caspases
3, 6 e 7 que levam à apoptose (Tesarik et al., 2004).
A expressão anormal de proteínas pro- e anti-apoptóticas pode levar a uma alteração da
espermatogénese e à infertilidade.
8
Introdução
2. ESPERMATOZÓIDE
2.1. Fisiologia e morfologia
Figura 5. Espermatozóide. Adaptado de Gilbert, 2010
Os espermatozóides são células altamente diferenciadas e especializadas com diferenças
morfológicas, funcionais e de composição, quando comparadas com células somáticas.
Apresentam, por exemplo, um núcleo altamente condensado com protaminas numa cabeça
extremamente compacta e hidrodinâmica (que lhe garante mobilidade optimizada e uma melhor
penetração no oócito) e têm ainda um longo flagelo, cauda, que lhes confere motilidade
(Martinez-Heredia et al., 2006, Lishko et al., 2012). O espermatozóide divide-se em três partes
distintas, a cabeça, o colo e a cauda (Figura 5).
A cabeça é uma estrutura achatada ovóide com 4 a 5 µm de comprimento e 2,5 a 3,5 µm
de diâmetro, nesta identificam-se essencialmente dois componentes, o núcleo e o acrossoma. O
acrossoma ocupa cerca de dois terços da cabeça e situa-se na região mais distal da cabeça. Este
contém um aparelho enzimático semelhante ao encontrado nos lisossomas das células somáticas,
incluindo hialurodinases (que têm a capacidade de digerir filamentos de proteoglicanos de
tecidos) e potentes enzimas proteolíticas (Hall and Guyton, 2011). Além das características e
componentes já apresentados a cabeça tem ainda o envelope nuclear que envolve o núcleo e teca
perinuclear que lhe confere protecção (pois é uma amálgama de proteínas e pontes de dissulfito)
(Jonge and Barratt, 2006).
9
Introdução
O colo é um local de articulação entre a cabeça e a cauda, pelo que alterações nesta
estrutura podem levar a ciliopatias (que provocam imobilidade) ou acefalia nos espermatozóides.
Compreende o centríolo, estrutura extremamente importante pois após a fecundação levará à
formação do centrossoma do zigoto, que por sua vez dará origem ao primeiro fuso mitótico; e a
peça de conecção (Chemes and Alvarez Sedo, 2012).
A cauda é uma estrutura flagelar com 40 a 50 µm de comprimento que apresenta um
axonema central que está rodeado por estruturas especializadas, e pode dividir-se genericamente
em 3 partes distintas, a peça intermédia (a qual diferenciamos na figura 5 devido à sua
importância), que contém as mitocôndrias numa configuração espiral em torno do axonema; a
peça principal, que é a responsável pela motilidade; e o segmento terminal, que contém alguns
elementos estruturais. O axonema é composto por nove dobletos de microtúbulos que envolvem
2 singuletos de microtúbulos e está associado a proteínas motor como a dineína.
Projecção externa de dineína
Projecção interna de dineína
Mitocôndria
Microtúbulos externos
Projecção Radial
Microtúbulo central
Nexina
Bainha interna
Figura 6. Axonema espermático. Adaptado de Shetty et al., 2007.
O movimento da cauda depende da capacidade do axonema dobrar o qual acontece pelo
deslizamento das duas estruturas de microtúbulos, que obtêm energia a partir da hidrólise de ATP
na cadeia pesada da dineína (Lishko et al., 2012). A peça intermédia contém aproximadamente
75-100 mitocôndrias que geram ATP que possibilita a motilidade flagelar. Cada espermatozóide
transporta cópias de mtDNA paterno que parece ser eliminado por proteólise no ovo (Jonge and
Barratt, 2006).
10
Introdução
2.2. Plasma Seminal
O plasma seminal, que é ejaculado durante o acto sexual, é uma mistura de
espermatozóides (aproximadamente 20x106/mL) e secreções das glândulas do aparelho
reprodutor masculino, que, no conjunto total, resulta num fluido viscoso. De referir que no
plasma seminal 10% do total provém dos canais deferentes, 30% da próstata, 60% das vesículas
seminais, 5% dos testículos e 5% das glândulas bulbo-uretrais (Hall and Guyton, 2011, Seeley et
al., 2011). O fluído prostático (que tem um pH bastante alto) confere ao plasma seminal a
aparência leitosa, já o fluido vindo das vesículas seminais (rico em frutose, fibrinogénio e
prostaglandinas) dá-lhe um aspecto mucoso e ajudam a neutralizar o pH ácido proveniente da
uretra e das secreções testiculares, sendo que o pH combinado do plasma seminal é de 7,5. As
secreções provenientes da próstata são ricas em factores de coagulação que convertem o
fibrinogénio em fibrina o que resulta na coagulação parcial do plasma seminal. 15-30min são
normalmente o suficiente para que o coágulo se dissolva por acção da fibrinolisina (formado a
partir da profibrinolisina prostática) (Hall and Guyton, 2011, Seeley et al., 2011).
O plasma seminal foi considerado durante muito tempo como o meio de transporte e
sobrevivência dos espermatozóides humanos. Mas, a evidência científica tem mostrado que a
introdução do plasma seminal no tracto genital feminino tem um papel importante na
fertilização, sendo que este efeito parece estar relacionado com altas concentrações de agentes
de sinalização como prostaglandinas, citocinas e factores de crescimento (Robertson, 2005, von
Wolff et al., 2007).
O tempo de vida dos espermatozóides fora dos ductos genitais à temperatura corporal é
de 24-48 horas (Hall and Guyton, 2011).
3. FECUNDAÇÃO
A fertilização é um processo altamente regulado e sincronizado que envolve uma série de
interacções extremamente complexas, e ainda pouco claras, entre o espermatozóide e o oócito,
que terminam com a junção de ambos (Gupta and Bhandari, 2011, Vigil et al., 2011).
O sucesso do processo de fertilização depende de diversos factores físicos/mecânicos,
bioquímicos, endócrinos, comportamentais e ambientais, em suma, o microambiente confere ao
espermatozóide protecção e garante as condições necessárias à sua sobrevivência, capacitação e
migração para a subsequente fusão com o oócito (Vigil et al., 2011).
11
Introdução
A fecundação tem duas etapas, a ligação do espermatozóide à zona pelúcida (ZP) que
circunda o oócito, seguida da reacção acrossómica (RA). Diversos agentes fisiológicos têm sido
envolvidos na indução da RA, tais como: progesterona, albumina, fluido folicular, hormonas,
enzimas hidrolíticas, ácido hialurónico e glicoproteínas da ZP (Gupta and Bhandari, 2011).
A RA envolve a fusão da membrana plasmática do espermatozóide com a membrana
acrossómica externa, resultando na perda de continuidade e estabilidade das membranas e
subsequente libertação do conteúdo acrossómico para o meio externo que leva à exposição da
membrana acrossómica interna (Moreno and Alvarado, 2006, Gupta and Bhandari, 2011). O
conteúdo acrossómico compreende várias enzimas como acrosina, acrogranina, hialuronidases e
outras enzimas encontradas em organelos clássicos como peroxissomas e lisossomas (Moreno
and Alvarado, 2006, Zhao et al., 2007, Vigil et al., 2011).
Em cerca de 30 minutos as enzimas abrem um canal que permite a passagem do
espermatozóide desde a zona pelúcida até ao oócito, as membranas da cabeça do
espermatozóide e do fuso do oócito para formarem uma célula única e o material genético fundese dando origem a um novo genoma (Hall and Guyton, 2011).
Quando o espermatozóide penetra o oócito (em metáfase II), este estimula-o a completar
a segunda divisão meiótica, resultando num oócito maduro e num segundo corpo polar, em
seguida dá-se a condensação dos cromossomas maternos e o núcleo do oócito evolui para
pronúcleo (feminino). O núcleo do espermatozóide aumenta no interior do citoplasma do oócito,
e irá compor o pronúcleo masculino e a cauda sofre degeneração. Posteriormente os pronúcleos
juntam-se num conjunto único e diplóide, um zigoto. Os cromossomas presentes no zigoto
rearranjam-se num fuso de clivagem, preparando-se para a divisão celular. Esta estrutura é
geneticamente distinta, tratando-se obviamente da junção (metade de cada) de cromossomas
materno e paternos, formando assim uma nova combinação cromossómica (Gardner, 2007,
Moore et al., 2008).
3.1. Processos conferentes de capacidade de fertilização
Apesar de ser uma célula morfologicamente bem diferenciada, o espermatozóide é uma
célula imatura encontrando-se em fase de espermatozoa até ao ponto em que se dá a sua
maturação no epidídimo, sendo este um processo pré-ejaculatório (Visconti et al., 2002, Aitken et
al., 2007). Assim, a célula espermática necessita posteriormente da ocorrência de outros
processos pós-ejaculatórios também conferentes da capacidade de fertilidade assim como o
processo denominado de capacitação, bem como o de hiperativação (Visconti et al., 2002, Lishko
et al., 2012).
12
Introdução
3.1.1. Maturação no epidídimo
Ao longo da migração dos espermatozóides das regiões proximais para as regiões distais
do epidídimo após serem libertados pelos túbulos seminíferos, ocorrem uma série de alterações
morfológicas,
bioquímicas
e
fisiológicas
nos
espermatozóides
morfologicamente
e
metabolicamente imaturos, com motilidade deficiente e sem capacidade fecundante (Cornwall,
2009, Cooper, 2011).
O epidídimo é um órgão muito importante para a fertilidade, uma vez que funciona não
só como condutor de esperma entre os testículos e o canal deferente, mas também contribui para
a formação de um ejaculado fértil, uma vez que este é responsável pela concentração, maturação
e armazenamento de esperma (Turner, 2008, Cornwall, 2009). Estudos têm vindo a demonstrar
que a célula imatura apenas completa o seu processo de maturação quando atinge a cauda do
epidídimo (Turner, 2008, 2011). Este facto é devido à diferente expressão genética e secreção
proteica que ocorre ao longo do ducto epididimal, bem como alterações nos padrões
característicos de electrólitos e pequenas moléculas orgânicas (Turner, 1995, Dacheux et al.,
2006, Dubé et al., 2007, Turner, 2008). Turner, 2011 sugere que novos estudos deverão ser
efectuados nas áreas de toxicologia e imunobiologia do epidídimo, uma vez que os
espermatozóides armazenados na cauda ficam susceptíveis à exposição de agentes tóxicos e de
stresse oxidativo (Turner, 2011).
Vários trabalhos foram realizados com o intuito de clarificar o papel deste órgão na
maturação dos espermatozóides e estudos pioneiros em suínos postularam que apenas o tempo
seria um factor importante para a ocorrência do processo de maturação, no entanto mais tarde
outros trabalhos viriam a refutar esta hipótese, demonstrando que para a maturação do esperma
são necessários factores extrínsecos do microambiente epididimal (Turner, 2008).
O processo de maturação do espermatozóide ocorre após a permanência de um ou vários
dias do espermatozóide no epidídimo e consiste na remodelação da membrana plasmática da
célula espermática (Dubé et al., 2007), na migração da gota citoplasmática ao longo da cauda, em
alterações nos organelos citoplasmáticos, alterações no desenvolvimento do axonema e no
desenvolvimento da capacidade de resposta ao Ca2+ e AMP cíclico (AMPc), bem como a vias de
sinalização (Aitken et al., 2007, Cooper, 2011). Estas são alterações que conferem ao
espermatozóide alguma capacidade de motilidade no entanto no epidídimo a célula tem um pH
acídico e é essencialmente quiescente, estes associados ao facto de a célula espermática estar
sob acção de proteínas inibitórias presentes no fluido do epidídimo constituem um obstáculo para
a obtenção da motilidade total (Hall and Guyton, 2011, Lishko et al., 2012).
13
Introdução
3.1.2. Capacitação e hiperativação
Com a alcalinização do citoplasma dos espermatozóides, evento que lhes confere
motilidade, estes ainda são pouco capazes ou incapazes de fertilizarem um oócito, para que estes
se tornem capazes eles têm que passar por um fenómeno chamado de capacitação (Lishko et al.,
2012).
Sumariamente a capacitação é caracterizada como sendo um conjunto de alterações
estruturais e funcionais nos espermatozóides, que se inicia com a remoção de factores
estabilizadores adquiridos no plasma seminal, que continua com a travessia do tracto genital
feminino e culmina com o espermatozóide plenamente capaz de responder aos ligandos da zona
pelúcida do oócito através da reacção acrossómica (De Jonge, 2005). A capacitação aumenta a
fluidez da membrana plasmática e sensibiliza os espermatozóides aos sinais de fertilização. Para
que isto aconteça existe um aumento de Ca2+, pH e AMPc (Fraser, 2010, Lishko et al., 2012).
A motilidade é hiperativada durante a capacitação. A hiperativação é definida por um
aumento do ângulo da curvatura flagelar o que resulta em movimentos mais assimétricos e
consequentemente numa maior capacidade de mobilização. A hiperativação é um ponto crítico
na fertilização, pois é necessária para que o espermatozóide penetre na zona pelúcida (Suarez,
2008, Lishko et al., 2012).
4. INFERTILIDADE
A capacidade de casais conceberem e terem filhos – fecundidade – depende de inúmeros
processos biológicos que incluem espermatogénese, oogénese, transporte de gâmetas,
fertilização do oócito, implantação do embrião e desenvolvimento subsequente do feto até ao
nascimento do nado (te Velde et al., 2010). Tão complexa e vasta rede de interacções, onde são
envolvidos um grande número de vias e centenas de genes, leva a um igualmente elevado
número de oportunidades de que algo corra mal, levando assim à infertilidade (Hann et al., 2011).
A Organização Mundial de Saúde (OMS) define infertilidade como a doença do sistema
reprodutor traduzida pela falha da concepção após um ano de relações sexuais sem o uso de
qualquer método contraceptivo, tal definição é corroborada pela Sociedade Americana de
Medicina Reprodutiva (ASRM, 2008, Zegers-Hochschild et al., 2009).
A OMS assume ainda a infertilidade como sendo um problema de saúde pública à escala
planetária. Isto deve-se ao facto de que aproximadamente 15% dos casais em idade fértil (que
14
Introdução
representam entre 60 e 80 milhões de casais), em todo mundo, padecerem desta situação
(Templeton, 2000, Akgul et al., 2009, Dey, 2010).
Um trabalho de revisão relativamente recente de Boivin et al., 2007, tendo por base a
população mundial, concluiu que existem aproximadamente 72,4 milhões de pessoas inférteis e
que destas cerca de 40,5 milhões procuraram ajuda médica.
Durante muitos anos pensou-se que a infertilidade dependeria exclusivamente da
incapacidade da mulher de conceber, mas a evidência científica veio mostrar que o factor
masculino tem uma importância determinante para a infertilidade. Apesar de não existir consenso
quanto ao peso do factor masculino na infertilidade, na literatura encontram-se valores entre os
30 e os 50% (Martin, 2008, Poongothai et al., 2009, Song et al., 2010, Pacey, 2012).
4.1. Infertilidade masculina
Aproximadamente 1 em cada 15 homens têm problemas de fertilidade. A infertilidade
masculina pode ter inúmeras causas como alterações anatómicas, hormonais, genéticas,
bioquímicas, imunológicas, infecções ou estilo de vida e exposição a factores ambientais (Curi et
al., 2003, Lipshultz et al., 2009).
Vários factores podem contribuir para a disfunção dos espermatozóides como a produção
de espécies reactivas a oxigénio (ROS), mutações genéticas, dano no DNA e defeitos nas enzimas
metabólicas (Host et al., 1999a).
4.1.1. Causas anatómicas e fisiológicas
É aqui que se encontra a causa mais frequente de infertilidade – varicocele (dilatação das
veias espermáticas) – que ocorre em cerca 40% dos homens inférteis enquanto só se encontra em
20% dos homens sem alteração da qualidade espermática. Apesar da sua incidência e dos
diferentes trabalhos já realizados, o promotor exacto desta patologia ainda não foi isolado (pode
tratar-se também de uma combinação de factores), pode estar relacionado com o aumento da
temperatura testicular ou pela acção de substâncias que provocam o regurgitamento sanguíneo e
levam ao detrimento da espermatogénese, outros mecanismos postulados é que devido à estase
sanguínea não se dá a drenagem das gonadotoxinas e ainda a possibilidade de existir hipoxia e um
aumento do stresse oxidativo (Lipshultz et al., 2009, Abdel Raheem et al., 2012).
A obstrução dos túbulos seminíferos, causada por vasectomia, infecções repetitivas,
inflamação (orquite) ou problemas de desenvolvimento é também muito comum perfazendo
cerca de 14% dos casos (Lipshultz et al., 2009).
15
Introdução
A criptorquidia (que é uma falha no desenvolvimento em que não se dá a descida
completa dos testículos para a bolsa escrotal) afecta cerca de 3% dos recém nascidos sendo que é
encontrada em 10% dos homens inférteis. Quando se trata de unilateral 13% dos homens têm
azoospermia, já se for bilateral 98% dos homens apresentam azoospermia (Abdel Raheem et al.,
2012).
Também lesões mecânicas como a torção testicular (que leva à necrose isquémica do
tecido testicular e pode levar ainda à produção de anticorpos anti-espermatozóides que podem
afectar o outro testículo) e o trauma testicular podem levar à infertilidade (Abdel Raheem et al.,
2012).
O eixo hipotálamo-hipófise-testículo (HHT) é altamente complexo e deste depende a
evolução normal do testículo e a produção de hormonas sexuais. Deficiências em qualquer ponto
deste eixo levam a hipogonadismo.
O hipogonadismo masculino é definido como a produção inadequada de testosterona
associada a uma também inadequada espermatogénese na presença de uma elevada ou reduzida
quantidade de gonadotrofinas (Giannetta et al., 2012). Quando consideradas alterações ao nível
do hipotálamo ou da hipófise estamos perante a forma hipogonadotrófica, quando as alterações
são devidas à disfunção testicular estamos perante a forma hipergonadotrófica (Zitzmann and
Nieschlag, 2000, Giannetta et al., 2012).
Níveis significativos de anticorpos anti-espermatozóides (ASA) foram detectados em 12%
de amostras provenientes de homens inférteis e foram associadas a situações específicas como
trauma testicular, cirurgias ou torsão testicular. Acredita-se que eles têm impacto na infertilidade
de duas formas distintas, ou interferindo directamente com as acções da superfície dos
espermatozóides (como a fertilização); ou indirectamente pela mediação de libertação de
citocinas o que pode levar a alterações nas funções dos espermatozóides, podendo até levar ao
dano no DNA (Bohring et al., 2001, Zini et al., 2010).
4.1.2. Estilo de vida e exposição a factores ambientais
O estilo de vida tem um peso importante na qualidade de vida, e como exemplo temos o
tabagismo que aumenta o risco de doença cardiovascular ou a obesidade que leva a uma maior
risco de doença cardiovascular, diabetes e alguns tipos de cancro; mas estes também têm um
peso importante na capacidade reprodutiva (Homan et al., 2007).
Usando o supracitado exemplo do tabagismo como mote e reportando-nos à revisão feita
por Pasqualotto et al. em 2004 este afirma que existem inúmeras substâncias que afectam a
fertilidade masculina, entre elas drogas e medicamentos. Neste trabalho são apresentadas 4
16
Introdução
formas destes provocarem alterações na fertilidade, concretizando: pela acção de gonadotoxinas
directamente sobre os testículos, por alteração do eixo HHT, por dificuldades na ejaculação ou
disfunção eréctil ou ainda pela diminuição da líbido (Pasqualotto et al., 2004).
Destas substâncias o tabaco ganha especial relevância pelo número de consumidores, nos
homens ele afecta negativamente a produção de espermatozóides, motilidade e morfologia bem
como tem sido associado a um aumento no dano do DNA pela alteração do equilíbrio das
espécies reactivas de oxigénio (Homan et al., 2007, Gaur et al., 2010), que se repercute numa
menor capacidade de fertilização e em menores rácios de implantação (Mostafa, 2010). No caso
do consumo do álcool, também ele muito vulgarizado, este parece não ter influência quando
tomado “socialmente”, mas o uso crónico pode levar a alterações do eixo HHT (Pasqualotto et al.,
2004). O consumo destas duas substâncias tem uma proporção directa com a deterioração dos
parâmetros espermáticos (Gaur et al., 2010).
Também o consumo de outras substâncias como drogas ilícitas ou medicamentos têm
impacto na fertilidade. Por exemplo os canabióides têm sido associados à diminuição da
concentração e motilidade espermática, já os opiáceos além de provocarem a diminuição da
líbido e disfunção eréctil também levam à supressão de libertação de LH levando a uma
diminuição da produção de testosterona (Pasqualotto et al., 2004).
A obesidade e se no que concerne às mulheres esta tem um impacto determinante, nos
homens ela não é tão mensurável mas pode provocar uma diminuição plasmática de SHBG,
testosterona e FSH (Magnusdottir et al., 2005). Além da obesidade, também a alimentação tem
um peso importante na fertilidade, sendo que frutas cereais e vegetais estão positivamente
associados à qualidade espermática (Braga et al., 2012), as isoflavonas (presentes em derivados
de soja) levam à falha no desenvolvimento dos órgãos reprodutivos (Chavarro et al., 2008) e a
cafeína (mais de 3 cafés) leva a dano no DNA dos espermatozóides (Schmid et al., 2007).
Outro factor importante para a fertilidade tem que ver com a temperatura da bolsa
escrotal, e também esta está muito dependente do nosso estilo de vida. A temperatura normal do
escroto são 34°C e pensa-se que a temperatura nos testículos seja entre 0,1 e 0,6°C mais elevada.
Se é controverso se o tipo de roupa que utilizamos, bem como banhos quentes ou saunas,
tenham qualquer tipo de contributo para a infertilidade, vários estudos mostram
inequivocamente que homens com um estilo de vida predominantemente sedentário, que
passam muito tempo a dirigir ou ainda que trabalham com fontes de calor (como padeiros ou
soldadores) têm uma temperatura escrotal mais elevada e como tal uma menor produção de
espermatozóides e maior percentagem de anomalias morfológicas, levando a uma menor taxa de
fertilização (Sharpe, 2000, Ivell, 2007, Paul et al., 2008).
17
Introdução
Também o factor ambiental tem um peso importante na fertilidade. De entre os
poluentes identificados como capazes de provocar alterações na fertilidade temos os
organocloretos que podem ser utilizados em pesticidas ou químicos industriais. Muitos destes
têm propriedades de disrupção hormonal o que pode levar a alterações no eixo HHT
(Magnusdottir et al., 2005), o que pode vir a provocar alteração dos parâmetros espermáticos,
elevada incidência de criptorquidia e hipospadia (Queiroz and Waissmann, 2006).
Ao contrário do que se pensava até à relativamente pouco tempo também a idade
paterna tem influência na fertilidade. Verificou-se que em homens com mais de 45 anos existe
uma diminuição do volume de sémen, da motilidade dos espermatozóides e ainda de
espermatozóides morfologicamente típicos (Hellstrom et al., 2006). Além disso homens mais
velhos tendem a apresentar espermatozóides mais vacuolizados e com maior dano no DNA (Silva
et al., 2012).
4.1.3. Anomalias genéticas e bioquímicas
Os factores genéticos relacionados com infertilidade são alterações cromossómicas,
alterações monogénicas e deleções submicroscópicas do cromossoma Y (Griffin and Finch, 2005,
Jonge and Barratt, 2006, Poongothai et al., 2009).
Alterações cromossómicas
As anomalias cromossómicas são uma das mais importantes causas de infertilidade. A
incidência varia entre 2 e 8% com uma média de 5% (Foresta et al., 2002). Estas podem ser
somáticas ou ligadas aos cromossomas sexuais, podem ser estruturais ou numéricas (Griffin and
Finch, 2005, Martin, 2008, Poongothai et al., 2009). As anomalias estruturais incluem inversões
(paracêntricas ou pericêntricas) e translocações equilibradas (Robertsonianas, reciprocas, dos
autossomas ou dos cromossomas sexuais). As alterações numéricas incluem trissomias
constitucionais como Síndrome de Down (trissomia 21) e as trissomias dos cromossomas sexuais
(Síndrome de Klinefelter (XXY) ou Síndrome de Jacobs (XYY)). Um outro tipo de alteração
numérica é aquela confinada aos espermatozóides (Griffin and Finch, 2005).
As alterações estruturais mais frequentes são as translocações Robertsonianas, estas em
homens inférteis apresentam uma incidência de 0,7%, ou seja, 8,5 vezes superior à encontrada na
população masculina em geral (Van Assche et al., 1996). Destas as mais comuns são entre os
cromossomas 13-14 e 14-21, sendo que raramente estas afectam o fenótipo do indivíduo, mas
que normalmente afectam a fertilidade devido a uma gametogénese errada ou devido a um
rearranjo parental não equilibrado, estes problemas têm diferentes níveis e estão directamente
18
Introdução
ligados ao distúrbio no processo meiótico (Ferlin et al., 2007). Van Assche e colaboradores, 1996,
concluíram que também as translocações recíprocas têm um peso mensurável sendo que têm
uma incidência de 0,5% dos homens com infertilidade e de apenas 0,1% na população masculina
em geral (Van Assche et al., 1996). Aparentemente estas também não afectam, normalmente, o
fenótipo do portador, mas a evidência tem demostrado que alteram o processo espermatogénico
(Ferlin et al., 2007).
Das alterações numéricas a mais frequente é o Síndrome de Klinefelter, esta é também a
mais frequente de todas as anomalias cromossómicas nos casos de infertilidade, sendo que se
encontra em aproximadamente em 5% dos homens com oligozoospermia severa e em 10% dos
casos dos homens com azoospermia em contraponto com os 0,1-0,2% da população masculina
em geral (Foresta et al., 2005). O cromossoma X extra pode ser originado de uma não disjunção
de XY na meiose I paterna (em aproximadamente 50% dos casos), através da meiose materna I ou
II (cerca de 40%) e os restantes serem pós zigóticos (Hirsh et al., 1996). Nos indivíduos XXY a
espermatogénese pára no espermatócito primário mas, ocasionalmente, fases mais tardias
podem ser observadas (O'Flynn O'Brien et al., 2010). Estes indivíduos podem tentar técnicas de
fertilização in vitro, mas existe o risco da sua prole apresentar também anomalias cromossómicas,
este medo foi consubstanciado por diversos estudos que mostravam que os indivíduos que
padeciam da síndrome tinham vários gâmetas aneuplóides (Georgiou et al., 2006). Isto acontece
quando a segregação anormal escapa aos checkpoints meióticos (Hassold et al., 1992).
Um espermatozóide normal tem 23 cromossomas, sendo que é monossómico para todos
os autossomas e tem apenas um X ou um Y. Os espermatozóides anormais podem ser
nulissómicos, em que um cromossoma é perdido; dissómico, tem um par de cromossomas; ou
mesmo diplóide, em que todos os cromossomas estão em duplicado apresentando 46
cromossomas (Jamar et al., 2000). Na revisão feita por Martin em 2008 este encontrou uma taxa
de aneuploidia para os cromossomas sexuais que variava entre 0,3 e 15% (Martin, 2008), valores
bem diferentes dos que Gordeeva et al., 2011, apresentava no que concerne a homens sem
patologia (1-2% de aneuploidias) (Gordeeva et al., 2011).
Alterações monogénicas
São poucos os genes não ligados ao cromossoma Y identificados como passíveis de
alterarem a fertilidade mas temos alguns exemplos bem descritos como caso do locus da fibrose
cística (gene CFTR) presente no braço longo do cromossoma 7, isto porque alterações neste gene
são encontradas em 60-90% dos doentes com aplasia bilateral congénita dos canais deferentes
19
Introdução
(CBAVD) o que leva a azoospermia obstrutiva (Georgiou et al., 2006, Jonge and Barratt, 2006,
Ferlin et al., 2007).
Também o gene da globulina ligadora às hormonas sexuais (SHBG), localizado no
cromossoma 17 tem sido estudado por poder ter influência na espermatogénese, sendo que este
tem influência no transporte das hormonas sexuais controlando a concentração dos androgénios
(O'Flynn O'Brien et al., 2010).
Temos também distúrbios ligados ao cromossoma X como o syndrome Kallmann (o mais
frequente) em que existe uma mutação no gene Kal-1 no braço curto do cromossoma X e que se
caracteriza por uma associação entre hipogonadismo hipogonadotrófico e anosmia (Jonge and
Barratt, 2006).
Existem outras síndromes de base genética que afectam a fertilidade como síndrome de
Noonan, distrofia miotónica, hemoglobinopatias, síndrome de Prader-Willi ou a doença de
Kennedy. Mas segundo Raheem et al., num trabalho recente (2012), a influência genética poderá
ser muito maior com diversos genes responsáveis pela regulação da produção de
espermatozóides, produção hormonal e receptores hormonais, que ainda não foram
identificados, a serem a causa da infertilidade idiopática (Abdel Raheem et al., 2012).
Deleções submicroscópicas do cromossoma Y
O cromossoma Y é o mais implicado nos casos de infertilidade masculina. O gene SRY e
um gene com ele relacionado, Sox9, levam à diferenciação das células de Sertoli na gónada
bivalente, e à formação dos testículos (Kashimada and Koopman, 2010). Mutações nestes genes
levam, respectivamente, a disgenesia gonadal e a displasia campomélica (Hanley et al., 2000).
Além do gene SRY, o cromossoma Y tem também uma região chamada de male-specific Y
(MSY) cujos genes são indispensáveis à espermatogénese. Assim se parte do material se perder
durante a mitose ou meiose, e como esta região não tem uma contraparte de material, pode
haver alteração na espermatogénese (Abdel Raheem et al., 2012).
As regiões tipicamente envolvidas na infertilidade foram chamadas de factor de
azoospermia ou AZF (onde se encontram AZFa, AZFb, AZFc e AZFd), localizam-se na região
Yq11.23 e controlam a espermatogénese (Griffin and Finch, 2005, Navarro-Costa et al., 2010).
Microdeleções (não se conseguem observar na citogenética convencional) nesta região são a mais
importante causa de oligozoospermia severa e azoospermia não obstrutiva (Ferlin et al., 2007).
As deleções críticas podem-se dar em três regiões distintas AZFa, AZFb e AZFc. Deleções
na região AZFa têm sido associadas à ausência de células germinativas ou síndrome das células de
Sertoli; AZFb tem sido implicada na paragem da espermatogénese; já as deleções ao nível de AZFc
20
Introdução
originam uma maturação anormal dos espermatozóides (Navarro-Costa et al., 2010). Destas
deleções as mais frequentes são as deleções em AZFc (cerca de 60% do total) seguidas das
deleções em AZFb sozinhas ou com outras regiões AFZ (35% do total) e finalmente as deleções em
AZFa (cerca de 5% do total) (Krausz et al., 2003).
Dano no DNA dos Espermatozóides
Durante a espermatogénese o núcleo dos espermatozóides sofre inúmeras alterações
para que este fique num estado tipo cristalino e fique bioquimicamente inacessível. Esta
inacessibilidade serve para que a informação genética fique protegida de factores ambientais
como o stresse oxidativo ou alterações de pH no tracto genital masculino ou feminino (Ward,
2010).
O dano no DNA dos espermatozóides tem sido associado a alterações morfológicas
(Nicopoullos et al., 2008), baixos níveis de implantação, elevada incidência de abortos, elevados
níveis de morbilidade nos recém-nascidos e fertilidade diminuída quer in vivo como in vitro
(Benchaib et al., 2007, De Iuliis et al., 2009, Ghazi and Abdelfattah, 2011).
Os factores responsáveis pela indução do dano no DNA continuam por ser descobertos,
mas parecem existir tanto estímulos extrínsecos como factores físicos (como o calor e a radiação
electromagnética), anomalias no metabolismo lipídico, leucócitos e idade; como intrínsecos,
apoptose ou produção de radicais livres pelos espermatozóides (Benchaib et al., 2007, De Iuliis et
al., 2009).
Aitken et al. em 2009 propôs um modelo passível de explicar os eventos que levariam ao
dano no DNA, em que durante a espermatogénese acontecem erros na remodelação da
cromatina que levam à produção de espermatozóides com o DNA nuclear pobre em protaminas,
o que confere à célula um estado de susceptibilidade a ataques de ROS (Aitken et al., 2009).
Apesar de existirem vários estudos que demonstram a presença de DNA fragmentado em
espermatozóides maduros, continua a não ser consensual se se tratam de células apoptóticas
residuais que por alguma razão conseguiram chegar até ao evento ejaculatório, ou se se trata de
apoptose tardia que ocorre já no espermatozóide maturo, ou ainda se esta fragmentação de DNA
ocorre por um outro mecanismo (Evenson and Wixon, 2006). Para a detecção da fragmentação de
DNA, têm vindo a ser usados diferentes ensaios como, dispersão de cromatina, estrutura da
cromatina do espermatozóide (SCSA), ensaios cometa e método de adição de nucleótidos
marcados com fluoresceína mediada pela enzima deoxinucleotidil transferase terminal (TUNEL)
(Evenson et al., 2007, Lewis et al., 2008, Mitchell et al., 2011).
21
Introdução
O ensaio de TUNEL é um ensaio que foi desenvolvido para células somáticas, vindo mais
tarde a ser adaptado para células espermáticas (Sailer et al., 1995). Este ensaio detecta
fragmentações de DNA de cadeia simples e dupla, medida por um ponto terminal específico
caracterizado pela presença de grupos hidroxilo livres 3’ (Sharma et al., 2010). O princípio deste
ensaio assenta na transferência de um nucleótido marcado para o grupo 3OOH da cadeia de DNA
fragmentado pela acção da enzima deoxinucleotidil transferase. Isto permite-nos definir se aquela
célula apresenta ou não fragmentação do seu DNA (Evenson and Wixon, 2006).
Um defeito desta técnica é que ela depende da actividade da transferase terminal em
aceder às quebras nas cadeias de DNA e catalisar a inserção das bases marcadas. E, se isto não é
um problema nas células somáticas pode-o ser para os espermatozóides, visto estes serem
extremamente especializados e terem uma cromatina altamente compacta que restringe este
acesso (Mitchell et al., 2011).
O ensaio de cometa ou single cell gel electrophoresis (SCGE) é uma técnica em que os
espermatozóides são suspensos em agarose de baixo ponto de fusão, em estado líquido, e
posteriormente colocada numa lâmina de microscópio onde o gel solidifica. As células são lisadas
e posteriormente sujeitas a electroforese horizontal (Evenson and Wixon, 2006). Esta técnica
permite-nos (a pH> 12,6) detectar, em células individuais, rupturas em cadeias de DNA duplas e
simples, sítios alquali-lábeis e ligações cruzadas (Collins, 2004, Kumaravel and Jha, 2006).
Considera-se uma técnica sensível e rápida (Collins, 2004).
O DNA não fragmentado e com maior peso molecular permanece compacto enquanto as
restantes partes, referidas anteriormente, migram formando uma espécie de cauda, daí o nome
de cometa. Apesar dos diferentes protocolos utilizados a técnica tem passos comuns como
preparação da suspensão, colocação no gel, lise celular, electroforese, neutralização, marcação e
análise. A grande diferença dos protocolos para os espermatozóides e as células somáticas
assenta na lise celular e descondensação do DNA, que como já foi referido é mais difícil nos
espermatozóides. Então, torna-se necessária a incubação dos espermatozóides com proteínase K
e detergentes (Shen et al., 1999).
É possível ainda detectar danos oxidativos pela incubação, após as lises celulares, com a
enzima formamido pirimidina DNA glicosilase (FPG), que detecta guaninas 8-OH e outras purinas
danificadas oxidativamente; quando incubado com FPG o ensaio torna-se mais sensíveis ao dano
por alquilação que o ensaio de cometa convencional (Speit et al., 2004). Os danos oxidativos são
determinados pela diferença de resultados entre o ensaio com incubação com a enzima FPG e o o
ensaio sem incubação com a enzima FPG.
22
Introdução
Espécies reactivas de oxigénio (ROS) e stresse oxidativo
Os ROS são radicais livres e peróxidos que derivam do metabolismo do oxigénio e estão
presentes em todos os organismos aeróbicos (Agarwal and Prabakaran, 2005). Eles são altamente
instáveis e podem reagir com inúmeras substâncias como lípidos, aminoácidos, hidratos de
carbono, proteínas ou DNA (Venkatesh et al., 2009). Elevados níveis de ROS são encontrados em
25-40% de homens inférteis (Linschooten et al., 2011).
Os três grandes tipos de ROS são o radical superóxido (02•-), que é formado quando existe
uma fuga da cadeia de transporte de electrões; o peróxido de hidrogénio (H2O2), que resulta da
dismutação de superóxidos ou pode ser gerado pela acção de algumas enzimas; e o radical
hidroxilo (OH•), é formado a partir do peróxido de hidrogénio numa reacção catalisada por iões
metálicos (Fe++ ou Cu+), é altamente reactivo e pode levar à modificação de purinas em
pirimidinas e provocar quebras nas cadeias de DNA (Agarwal et al., 2005). Pode também levar à
peroxidação de ácidos gordos polinsaturados (PUFA) e membranas celulares (peroxidação lipídica)
(Lanzafame et al., 2009). Destes, o mais produzido pelos espermatozóides parece ser o radical
superóxido, que pode gerar peróxido de hidrogénio pela acção da superóxido dismutase (SOD) ou
espontaneamente (Lanzafame et al., 2009). O peróxido de hidrogénio parece estar intimamente
associado à perda de motilidade pelos espermatozóides (Aitken and Baker, 2006).
Os ROS existentes no plasma seminal provêm essencialmente de leucócitos e de
espermatozóides imaturos e morfologicamente anormais (Agarwal and Prabakaran, 2005, Makker
et al., 2009).
Dependendo da concentração, localização e tempo de exposição, os ROS podem ter
efeitos benéficos ou prejudiciais sobre os espermatozóides (Agarwal and Prabakaran, 2005).
Níveis baixos de ROS são essenciais para a fertilização, reacção acrossómica, hiperativação,
motilidade, capacitação (Agarwal and Prabakaran, 2005, Lanzafame et al., 2009, Saalu, 2010).
Níveis elevados de ROS podem levar a:

Apoptose, num processo em que os ROS levam à disrupção da membrana
mitocondrial, que leva à libertação de citocromo c, que leva à cascata de caspases (Agarwal and
Prabakaran, 2005);

Peroxidação lipídica (LPO), que é definida como a oxidação de PUFA, sendo que as
membranas dos espermatozóides são muito sensíveis à LPO pois são ricas em PUFA. Em
espermatozóides tem sido verificado o malonildialdeído (MDA), que é um produto final de LPO
(Saalu, 2010);
23
Introdução

Alteração na motilidade, apesar de existir uma correlação clara a etiologia não se
mostra assim tão clara, sendo que existem algumas teorias para este facto, como por exemplo: o
H2O2 conseguir difundir-se através da membrana e inactivar algumas enzimas vitais; outra é que
existe o desencadear de eventos que levam à diminuição da fosforilação proteica do axonema e
consequente imobilização, apesar disto ambas carecem de confirmação (Makker et al., 2009);

Dano no DNA, apesar dos espermatozóides terem sistemas de defesa contra o
dano (o empacotamento do DNA e o sistema antioxidante) o stresse oxidativo tem sido associado
a quebras duplas e simples nas cadeias de DNA. Os ROS são também capazes de causar vários
tipos de mutações pontuais e polimorfismos (Makker et al., 2009, Saalu, 2010);

Dano nas proteínas, os aminoácidos sulfurados, especificamente os que contêm o
grupo tiol, são altamente susceptíveis ao stresse oxidativo. Muitos aminoácidos sofrem
modificações irreversíveis quando oxidados. O dano oxidativo pode levar à clivagem da cadeia
polipeptídica e por consequência à formação de agregados proteicos (Agarwal and Prabakaran,
2005).
Visto os ROS terem tanto um papel fisiológico como patológico, os organismos aeróbios
desenvolveram uma série de mecanismos de defesa que foram apelidados de antioxidantes. Estes
podem ser enzimáticos, sendo que as enzimas mais importantes são a superóxido dismutase
(SOD), a catalase (CAT), as glutatião peroxidase (GPX), a glutatião S-transferase (GST) e a glutatião
redutase (GR); ou antioxidantes com pequena massa molecular, como as vitaminas A, E e C, a
coenzima Q, o zinco, o ácido úrico, a melatonina, o citocromo c e o glutatião reduzido (GSH)
(Aitken and Roman, 2008, Lanzafame et al., 2009).
A SOD elimina o anião superóxido quer este seja intracelular quer seja extracelular e
previne a peroxidação lipídica da membrana plasmática. Para actuar sobre o H2O2 deve ser
conjugado com a CAT e a GPX (Lanzafame et al., 2009). A SOD previne a capacitação e
hiperativação prematuras induzida pelos radicais superóxidos antes da ejaculação (de Lamirande
and Gagnon, 1995a). Dada a importância da SOD para os espermatozóides os testículos têm não
só as formas convencionais citoplasmáticas (Cu/Zn) e mitocondriais (Fe/Mn) como também uma
forma extracelular pouco convencional, SOD-Ex que são produzidas nas células de Sertoli (Aitken
and Roman, 2008).
O sistema GPX/GR oferece uma excelente protecção contra a peroxidação lipídica da
membrana. A GR estimula a redução de glutationa dissulfeto (GSSG) em GSH (Aitken and Roman,
2008).
24
Introdução
A CAT catalisa a dismutação de H2O2 em água e oxigénio. Além disso a catalase activa a
capacitação induzida por óxido nítrico que é um complexo mecanismo que envolve H 2O2 (de
Lamirande et al., 1997).
A GST é uma enzima essencial à desintoxicação celular de substâncias como
carcinogéneos químicos, poluentes ambientais e agentes quimioterápicos, estas transferases
inactivam ainda aldeídos insaturados α e β, quinonas, epóxidos e hidroperóxidos formados como
metabolitos secundários do stresse oxidativo (Hayes and Strange, 2000), catalisando a conjugação
de GSH com várias substâncias, protegendo assim componentes celulares como DNA, proteínas e
lípidos (Andonian and Hermo, 2003).
Alterações no rácio oxidante/antioxidante no plasma seminal podem causar stresse
oxidativo provocando as supracitadas alterações nos espermatozóides. Os espermatozóides são
mais sensíveis ao stresse oxidativo que as células somáticas o que poderá estar relacionado com a
menor quantidade de citoplasma presente nestes o que pode ser associado a uma menor
capacidade antioxidante (Agarwal et al., 2004, Agarwal and Sekhon, 2010). Esta deficiência na
capacidade antioxidante enzimática torna-se mais evidente com a idade, pois os espermatozóides
de homens mais velhos apresentaram menor actividade de glutationa peroxidase e de SOD. Além
disto, também a membrana plasmática dos espermatozóides, especialmente rica em PUFA, tornaos especialmente sensíveis à peroxidação lipídica (Agarwal et al., 2004, Weir and Robaire, 2007,
Lanzafame et al., 2009, Agarwal and Sekhon, 2010).
25
Objectivos
OBJECTIVOS
26
Objectivos
O objectivo deste trabalho é avaliar parâmetros biológicos espermáticos que poderão
condicionar a fertilidade masculina. Como complemento a este objectivo foram propostos
objectivos parciais nas 66 amostras em estudo:

Realizar espermograma nas 66 amostras;

Realizar culturas celulares, manipulação, bandeamento e análise citogenética nas
66 amostras;

Verificar a presença de aneuploidias espermáticas dos cromossomas sexuais por
FISH em 25 amostras;

Avaliar o estado oxidativo através da quantificação de MDA, hidroperóxidos e
tióis totais em pelo menos 30 amostras;

Avaliar a actividade de enzimas antioxidantes (SOD GST e CAT) em pelo menos 45
amostras;

Analisar o dano no DNA nos espermatozóides, em pelo menos 50 amostras, pelas
técnicas de TUNEL e cometa;

Estabelecer correlações entre as variáveis em estudo.
27
Material e Métodos
MATERIAL E MÉTODOS
28
Material e Métodos
1. MATERIAL BIOLÓGICO
As amostras utilizadas provêm do laboratório de andrologia, do serviço de Genética, do
Centro Hospitalar de Trás-os-Montes e Alto Douro, EPE, tratando-se de amostras anonimizadas. A
amostra é constituída por 66 homens, com idades compreendidas entre os 22 e os 48 anos.
A obtenção das mesmas foi feita por masturbação entre, preferencialmente, 3 a 5 dias de
abstinência, para um recipiente esterilizado. Já no laboratório, as amostras eram colocadas entre
30 a 60 minutos numa estufa a 37°C até à completa liquefacção do sémen.
As amostras eram submetidas a avaliação dos parâmetros espermáticos, bem como
processadas para ensaio de TUNEL, ensaio de cometa, stresse oxidativo e aneuploidias
espermáticas.
2. AVALIAÇÃO DOS PARÂMETROS ESPERMÁTICOS
O processamento e análise das amostras foram efectuados segundo o Manual de
Laboratório da OMS (2010).
Foram avaliados liquefacção, viscosidade, cheiro, cor, volume, pH, vitalidade, teste
hipoosmótico, motilidade e concentração.
A análise dos parâmetros espermáticos foi realizada com recurso a um microscópio de
contraste de fase da marca Leica DM750 (Leica, Alemanha) e com a ajuda de um contador manual
marca Assistent Counter AC-12 (De Bruyne Instruments, Bélgica).
2.1.
Liquefacção
Imediatamente após ejaculação, o fluido seminal é composto por um coágulo que
desaparece espontaneamente por acção enzimática após 30-60 minutos na estufa a 37°C. No caso
da liquefacção ocorrer a amostra apresentava um aspecto homogéneo; caso esta não ocorresse a
amostra apresentaria um aspecto heterogéneo com grumos gelatinosos no fluido.
2.2.
Viscosidade
A viscosidade é determinada observando-se a filância de uma gota de esperma. Se a
amostra é expulsa da pipeta em pequenas gotas trata-se de uma viscosidade normal; se a
amostra ao ser expulsa forma um filamento de cerca de 2 cm estamos na presença de viscosidade
aumentada; e se se encontrar completamente líquida esta possui viscosidade diminuída.
29
Material e Métodos
2.3.
Cheiro
Apesar de ser o mais subjectivo dos parâmetros as amostras podem apresentar cheiro
“sui generis” ou característico, cheiro putrefacto ou fétido ou ainda não ter qualquer cheiro.
2.4.
Cor
A amostra normal é caracterizada por uma cor cinzento-esbranquiçado opaca. No entanto
podem existir alterações como cor amarelo claro, avermelhada ou amarelo brilhante.
2.5.
Volume
O volume da amostra deve ser medido com uma pipeta graduada de 5 a 10 mL, podendo
variar entre 2 e 6 mL.
2.6.
pH
O pH é avaliado com uma fita reactiva indicadora de pH. Esta é mergulhada por 10
segundos na amostra, retirada e a cor resultante é posteriormente comparada com a escala
calibrada de pH. O valor normal varia entre 7,2 e 8,0.
2.7.
Motilidade
A motilidade é o primeiro parâmetro a ser avaliado dado que após a liquefacção do
sémen os espermatozóides vão, progressivamente, perdendo a sua motilidade.
Começa-se por pipetar 10 µL da amostra para uma lâmina que é coberta por uma lamela,
sendo que se espera 60 segundos para que a amostra estabilize. Observa-se no microscópio de
contraste de fase com a objectiva de 40x e procede-se ao cálculo da percentagem de
espermatozóides por categoria de movimento, contando-se 200 células com auxílio do contador
manual. Estas categorias utilizadas são Imóvel quando existe a ausência de movimento; Móvel in
situ, quando o movimento não é progressivo ou existe apenas movimento da cauda; Progressivo
lento quando o espermatozóide apresenta movimento progressivo mas não muito rápido ou sem
trajectória bem definida; e ainda Progressivo rápido se se trata de um espermatozóide com
movimento progressivo rápido e com trajectória bem definida.
2.8.
Vitalidade
A vitalidade é o segundo parâmetro a ser avaliado, pois, assim como a motilidade, ela
também pode ser afectada com o passar do tempo.
30
Material e Métodos
O princípio subjacente a esta técnica baseia-se é que caso a membrana celular da cabeça
do espermatozóide estiver intacta (supostamente vivo) o espermatozóide não é corado, ficando
corado se o espermatozóide não tiver a membrana intacta (Bjorndahl et al., 2004).
Num tubo devidamente identificado colocam-se 10 µL da amostra de esperma e 10 µL de
Eosina Y a 0,5 %. Aguardam-se 5 minutos. Retiram-se 10 µL da solução, colocam-se sobre uma
lâmina e com a ajuda de outra lâmina, faz-se um esfregaço. Depois de seco observa-se ao
microscópio de campo brilhante com a objectiva de 40x. Com o auxílio do contador manual faz-se
a contagem do número de espermatozóides corados de vermelho e verde até um total de 200
espermatozóides. No fim regista-se a percentagem de espermatozóides verdes.
2.9.
Teste Hipoosmótico
A realização do teste hipoosmótico fornece-nos uma informação complementar à
vitalidade.
Retiram-se 10 µL da amostra que são adicionados a 90 µL de solução hipoosmótica e
deixa-se a mistura a incubar por 30 minutos. Em contexto hipoosmótico acontece um
desequilíbrio osmótico entre o meio extracelular e intracelular que a célula, caso tenha a
membrana plasmática intacta, compensa deixando entrar água para o compartimento intracelular
e como consequência o espermatozóide aumenta o seu volume e as caudas dilatam e enrolam-se
(World Health Organization., 2010). Após este tempo retiram-se 10 µL da mistura e cobre-se com
uma lamela. Observa-se no microscópio de contraste de fase com a objectiva de 40x. Contam-se
200 espermatozóides, distinguindo os espermatozóides de cauda enrolada dos espermatozóides
com a cauda intacta e procede-se ao cálculo de percentagem dos espermatozóides com cauda
enrolada.
2.10. Concentração
A avaliação da concentração de espermatozóides foi feita por contagem celular com um
hemocitómetro ou câmara de Neubauer. Fez-se uma primeira observação a fresco ao microscópio
de contraste de fase para fazer uma avaliação rápida da concentração de espermatozóides de
forma a prever a diluição a utilizar. A diluição é feita de acordo com o Tabela 1.
31
Material e Métodos
Tabela 1. Diluições usadas no cálculo da concentração de espermatozóides. Adaptado de World Health
Organization (2010)
Nº espermatozóides/campo
Volume a adicionar
Diluição
(objectiva 40x)
Sémen (µL)
Fixador (µL)
100
100
100
400
50
450
50
950
50
2450
1+1
(1:2)
1+4
(1:5)
1+9
(1:10)
1+19
(1:20)
1+49
(1:50)
Swim up
<15
15-40
40-200
>200
Preparou-se um tubo com o diluente correspondente e pipetou-se e transferiu-se o
volume exacto de sémen, bem homogeneizado, para o tubo com o diluente, com uma
micropipeta de deslocamento positivo. Posteriormente agitou-se no vórtex durante, pelo menos,
15 segundos. Em seguida transferiu-se 10 µL da diluição para uma das câmaras do hemocitómetro
e repetiu-se para a segunda câmara, deixou-se a câmara de Neubauer em câmara húmida durante
15-20 minutos. A contagem foi realizada no microscópio de contraste de fase com a objectiva de
40x, contando-se apenas os espermatozóides íntegros, ou seja, que apresentam cabeça e cauda.
Para a contagem utiliza-se apenas os compartimentos central da câmara, que se encontra dividido
em 25 quadrados grandes. A contagem é feita segundo a Tabela 2.
Tabela 2. Valores do factor de conversão para a câmara de contagem Neubauer. Adaptado de World Health
Organization (2010)
Nº de quadrados grandes contados
Diluição
1:2
1:5
1:10
1:20
1:50
25
10
5
100
40
20
10
4
40
16
8
4
1.6
20
8
4
2
1.8
A concentração de espermatozóides é calculada segundo a fórmula:
Número de spz/mL = nº de spz contados em “X” quadrados grandes x 106
Factor de conversão (Tabela 2)
32
Material e Métodos
Quando no exame a fresco se observa um número muito reduzido de espermatozóides,
para determinar a concentração, coloca-se uma gota de esperma directamente na câmara de
Neubauer, contam-se os espermatozóides observados em 5 dos 9 compartimentos e multiplica-se
o número obtido por 2000.
2.11. Morfologia
A morfologia é o último dos parâmetros a ser avaliado, sendo que esta pode ser
efectuada num dia diferente do da colheita.
Coloca-se uma gota de 10 µL de sémen bem misturado e não diluído numa lâmina e faz-se
um esfregaço deixando-se secar. Posteriormente mergulha-se a lâmina em metanol, por
aproximadamente 10 segundos com o intuito de fixar as células e deixa-se secar. Em seguida
mergulha-se a lâmina no corante de Papanicolau durante 15 minutos e no final passa-se a mesma
por água corrente para se retirar o excesso de corante. Após este passo mergulha-se a lâmina no
corante Shorr durante 5 minutos e passa-se por água corrente para se retirar o excesso de
corante. Realiza-se nova fixação com metanol durante 10 segundos e deixa-se secar.
A análise das lâminas realizou-se com auxílio do microscópio de campo brilhante na
ampliação de 100x com a objectiva de imersão. Contam-se 200 espermatozóides e calcula-se a
percentagem de cada classe morfológica de acordo com a supracitada classificação da OMS de
2010. Essa classificação divide as anomalias em três tipos: anomalia da cabeça, da peça
intermédia e da cauda.
A coloração das várias estruturas do espermatozóide está descrita na Tabela 3.
Tabela 3. Coloração das diferentes estruturas dos espermatozóides
Região do espermatozóide corada
Coloração
Acrossoma
Região pós acrossómica
Peça intermédia
Cauda
Restos citoplasmáticos
Azul claro
Azul escuro
Azul escuro
Azul escuro
Avermelhados
Posteriormente seria calculado do Índice Teratozoopérmico que consiste no somatório
das percentagens das diferentes alterações a dividir pela percentagem de células
morfologicamente anormais.
33
Material e Métodos
2.12. Classificação
Feita a avaliação das amostras foram classificadas de acordo com os critérios da
Organização Mundial da Saúde (World Health Organization., 2010).

Normozoospermia – amostras com os parâmetros espermáticos normais;

Astenozoospermia – amostras com baixa motilidade;

Teratozoospermia – amostras com SPZ com morfologia normal inferior a 4%;

Oligozoospermia – amostras com baixa concentração de SPZ;

Astenoteratozoospermia – amostras com baixa motilidade e morfologia;

Oligoastenozoospermia – amostras com baixa concentração e motilidade

Oligoteratozoospermia – amostras com baixa concentração e morfologia

Oligoastenoteratozoospermia – amostras com número total de espermatozóides baixo,
baixa motilidade e morfologia;

Necrozoospermia – amostras com baixa motilidade e elevada percentagem de imóveis.
Tabela 4. Valores normais dos parâmetros espermáticos (World Health Organization., 2010).
Liquefacção
Completa aos 60
minutos
Concentração
≥ 20 x 106 < 250 x 106
≥ 60%
pH
7,2 – 8
Vitalidade
Volume do ejaculado
2 – 6 mL
Motilidade
Teste hipoosmótico
≥ 60%
Morfologia
Concentração
≥ 40 x 10
Móveis Progressivos ≥ 50%
ou PR ≥ 25%
Típicos ≥ 4%
6
3. ANÁLISE CITOGENÉTICA
A análise cromossómica foi realizada em linfócitos T estimulados por fitohemaglutinina,
provenientes de sangue periférico, utilizando métodos citogenéticos convencionais (bandagem
GTL e CBL). Realizou-se uma cultura celular de 72h procedendo-se de seguida à sua manipulação
até à obtenção de cromossomas, de acordo com os protocolo estabelecido no laboratório. O
protocolo utilizado encontra-se no Anexo 1.
34
Material e Métodos
3.1.
Método de bandeamento GTL
As bandas GTL (usando como corante o corante de Leishman) são obtidas após
tratamento das lâminas (que contêm as metáfases) com uma solução de Tripsina (enzima
proteolítica) à temperatura ambiente. O tempo de exposição a esta enzima é crucial, devendo ser
rigorosamente controlado e testado antes de ser aplicado.
Com o intuito de interromper a acção da Tripsina as lâminas foram sujeitas a lavagens
rápidas em solução salina e tampão Gurr, respectivamente, e à temperatura ambiente.
As lâminas foram coradas com o já referido corante de Leishman (solução de trabalho)
durante 5 minutos, protegido da luz, pois esta degrada o corante.
Seguiram-se lavagens em tampão Gurr e água destilada à temperatura ambiente.
Posteriormente as lâminas secaram ao ar.
A observação das lâminas fez-se com auxílio do microscópio óptico Leica DM4000B (Leica,
Alemanha), e a cariotipagem executou-se através da examinação e captação de imagens de, pelo
menos, 20 metafases diferentes com o programa Leica- CW 4000 Kario (Leica, Alemanha).
3.2.
Método de bandeamento CBL
Todas as amostras foram ainda sujeitas a bandeamento CBL, que resultam na coloração
da heterocromatina constitutiva. As bandas C são obtidas através da exposição a hidróxido de
bário e são coradas com corante de Leishman. Os cromossomas metafásicos são sujeitos a
condições ácidas, alcalinas e salinas e a altas temperaturas. Este bandeamento foi realizado para
excluir a inclusão de material cromossómico no cromossoma Y que é marcadamente
heterocromático, principalmente na porção distal do seu ramo longo.
Após descoloração em fixador, as lâminas foram mergulhadas em HCl à temperatura
ambiente durante 1 hora. A aproximadamente 5 minutos antes de acabar esta hora adicionou-se
10 mL de Ba(OH)2 pré-aquecido a 40 mL de água destila (pré-aquecida a 60°C), obtendo-se uma
solução de Ba(OH)2 a 1% e deixou-se arrefecer até os 55°C.
Em seguidas as lâminas foram lavadas em água destilada à temperatura ambiente e
colocadas na solução de Ba(OH)2 a 1% a 55°C durante 3 a 5 segundos. O tempo de exposição a
Ba(OH)2 deve ser rigoroso.
Posteriormente, procederam-se 2 lavagens em água destilada previamente aquecida a
60°C com leve agitação, para remover o precipitado das lâminas e foram colocadas em 2x SSC a
60°C durante 1 hora.
35
Material e Métodos
Foi de seguida feita uma nova lavagem em água destilada à temperatura ambiente,
seguida de coloração em corante de Leishman durante 1 hora (protegido pela luz, pois o corante é
fotodegradável). Finalmente executou-se uma última lavagem em água destilada à temperatura
ambiente e deixaram-se a secar ao ar.
A observação das lâminas fez-se com auxílio do microscópio óptico Leica DM4000B (Leica,
Alemanha), e a cariotipagem executou-se através da examinação e captação de imagens com o
programa Leica- CW 4000 Kario (Leica, Alemanha).
4. PREPARAÇÃO DO ESPERMATOZÓIDES
Pela impossibilidade realizar todas as técnicas em fresco as amostras tinham que ser
devidamente preparadas.
Após a colheita retirou-se, quando possível, pelo menos 600µL de amostra total para um
tubo eppendorf devidamente identificado que era posteriormente guardado a -20°C e que viria a
ser usado para as técnicas de actividade enzimática, TBARS, Fox e Tióis totais.
Retirou-se também 200µL, para dois tubos eppendorf devidamente identificados, que
eram sujeitos a 3 lavagens com 1 mL de 1X PBS, sendo efectuadas centrifugações de 10 minutos a
1200rpm. Após estas lavagens adicionou-se 1mL de solução fixadora (metanol/ácido acético 3:1
no caso do FISH; 4% paraformaldeído para TUNEL). As amostras eram posteriormente
armazenadas a -20°C até serem utilizadas.
Retirou-se 200 µL de amostra, total para um tubo eppendorf devidamente identificado,
colocou-se durante 10 minutos em vapor de azoto líquido e foi armazenado em azoto líquido até
ser utilizado para o ensaio de cometa.
5. ANEUPLOIDIAS ESPERMÁTICAS
Para a detecção de aneuploidias espermáticas foi utilizada a técnica de hibridação in situ
por fluorescência (FISH). Foi utilizada sonda alfa-satélite (região centromérica) para os
cromossomas X (DXZ1) / Y (DYZ3) da Kreatech, Holanda.
A descondensação do DNA foi realizada por intermédio de uma lavagem com solução de
NaOH 1mol/L por 2 minutos à temperatura ambiente, seguida de duas lavagens numa solução de
2x SSC a 37°C durante 2 minutos. A desidratação foi feita através de uma sequência de banhos de
etanol a 70%, 85% e 96%, respectivamente, à temperatura ambiente durante 2 minutos cada.
36
Material e Métodos
A sonda foi preparada adicionando-se 4,5 µL de solução de hibridação e 0,5 µL de sonda.
Esta mistura foi posteriormente homogeneizada e realizado spin down. Colocaram-se 5 µL de
mistura na área pretendida, cobriu-se com uma lamela e colocaram-se as lâminas numa placa de
aquecimento a 75°C durante 5 minutos para que ocorresse a desnaturação da sonda e da
amostra.
A hibridação da sonda foi realizada durante a noite (± 16 horas), tendo-se incubado as
lâminas a 37°C numa caixa húmida previamente aquecida. Posteriormente, retiraram-se as
lamelas e procederam-se duas lavagens, a primeira em 0,4x SSC com 0,3% Igepal (Sigma, EUA) a
72°C durante 2 minutos e a segunda em 2x SSC à temperatura ambiente durante 1 minuto. De
seguida colocaram-se as lâminas em ambiente escuro e deixaram-se secar.
As lâminas foram contrastadas com 4 µL de VECTASHIELD (Mounting Medium With Dapi,
Vector Laboratories, Inglaterra), cobertas com uma lamela e guardadas a 4°C até serem
observadas.
6. STRESSE OXIDATIVO
6.1.
Quantificação de proteína
A quantificação da proteína foi determinada pelo método colorimétrico do Biureto
(Gornall et al., 1949). Este método baseia-se na reacção de CuSO em solução alcalina (reagente de
Biureto) com as ligações peptídicas das proteínas, originando um complexo de cor violeta. As
amostras de suspensão mitocondrial (20 e 40L) foram solubilizadas pela adição de 100L de
dodecilsulfato de sódio (SDS) a 10% (p/v). Adicionou-se água desmineralizada até perfazer 2mL e,
em seguida, 2mL de reagente alcalino de cobre (reagente de “biureto”: CuSO 4.5H2O a 0,15 %
(p/v), tartarato de sódio e potássio (NaKC4H4O6.4H2O) a 0,6% (p/v), NaOH a 3% (p/v) e KI a 0,1%
(p/v)). Prepararam-se padrões de BSA (0-2,4mg) em condições idênticas às das amostras,
contendo 50 L de meio de lavagem. As absorvências das amostras e dos padrões foram lidas ao
fim de 15min de reacção, a 540nm num espectrofotómetro UV-Vis (Spectronic® GenesysTM 2PC),
contra um branco que continha todos os reagentes excepto a proteína.
37
Material e Métodos
6.2.
Actividade das enzimas antioxidants
6.2.1. Superóxido dismutase (SOD)
A actividade da enzima superóxido dismutase foi determinada espectrofotometricamente
(Varian Cary 50 – UV-Vis) de acordo com o método descrito por McCord e Fridovich (1968),
utilizando o sistema xantina-xantina oxidase. A molécula que utilizamos para a detecção em
substituição do citocromo c foi o cloreto de azul de nitrotetrazólio (NBT). O meio de reacção para
a determinação da actividade desta enzima contém tampão fosfato (KH2PO4 50 mM e EDTA 1 mM
a pH=7,4) (930 µL), NBT 10 mM (10 µL), hipoxantina 10 mM (10 µL) e 40 µL de amostra.
Colocamos o meio de reacção a incubar durante dois minutos a 25°C e a 20 segundos de
completar o tempo de incubação adicionamos xantina oxidase (10 µL), perfazendo um volume
total de 1 mL, homogeneizamos o meio de reacção e procedemos à leitura espectrofotométrica a
560 nm. A cinética da reacção foi acompanhada ao longo de 3 minutos a 25°C.
A análise da cinética obtida fez-se através de unidades de actividade de SOD que
corresponde à quantidade de SOD que inibe 50% da redução de NBT. As unidades desta
actividade foram expressas em U min-1 mg proteína-1.
6.2.2. Glutationa S-transferase (GST)
A
actividade
da
enzima
glutationa
S-transferase
foi
determinada
espectrofotometricamente (Varian Cary 50 – UV-Vis) usando um método descrito por Chikezie e
colaboradores em 2009. O meio de reacção utilizado para a avaliação da actividade enzimática é
composto por tampão fosfato (KH2 PO4 100 mM a pH=7) (1840 µL), 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno
(CDNB) 100 mM (20 µL), GSH 100 mM (40 µL) e 100 µL de amostra, perfazendo um volume final
de 2 mL. A mistura reaccional foi incubada durante dois minutos a 25°C e a reacção inicia-se com
a adição de GSH um minuto após a incubação. A cinética da reacção foi acompanhada a 340 nm a
25°C durante 3 minutos, sendo a actividade enzimática expressa em µM de CDNB conjugado min-1
mg proteína-1, recorrendo-se ao seu coeficiente de extinção molar de 9,6 x 103 M-1 cm-1.
6.2.3. Catalase (CAT)
A actividade da catalase, por sua vez, foi medida com um eléctrodo de oxigénio
(Hansatech, Norfolk, Inglaterra) tipo Clark (Del Rio et al., 1977). O meio de reacção utilizado para
esta medição é constituído por tampão fosfato (KH2PO4 50 mM a pH=7) (1 mL) e peróxido de
hidrogénio 1M (17 µL). Na câmara de reacção foram colocados 15 µL de amostra, e foram
incubados durante 5 minutos a 25°C. No final do tempo de incubação foi adicionado o peróxido
38
Material e Métodos
de hidrogénio dando-se início à reacção. A cinética da reacção foi acompanhada ao longo de 3
minutos e meio e a actividade da catalase foi expressa em nmol H2O2min-1mg proteína-1.
6.3.
Determinação da peroxidação lipídica pelo método de Fox
O método utilizado para a quantificação lipídica foi baseado no método descrito por
Devasagayam e colaboradores (2003).
Este método é vastamente utilizado para a quantificação de hidroperóxidos lipídicos uma
vez que é um método barato, não sensível ao ambiente com O2 ou níveis de luz e gera
rapidamente hidroperóxidos lipídicos (LOOH) (DeLong et al., 2002). É utilizado para a
determinação de LOOH formados devido à acção dos radicais livres sobre os lípidos insaturados
nas membranas lipídicas que leva a um estado de stresse membranar. Baseia-se na oxidação do
ião ferroso (Fe2+) a ião férrico (Fe3+), em meio acídico, utilizando um corante laranja de xilenol que
vai ser oxidado a um complexo azul-púrpura com um máximo de absorção entre 550-600 nm
(Dobarganes and Velasco, 2002). O meio de reacção é constituído por amostra (50 µL) e tampão
(KCl a 100 mM, Hepes a 5 mM e a pH=7,12) perfazendo um volume total de 1 mL. A mistura
reacional foi incubada durante 30 minutos, a 30°C, com agitação ocasional. De seguida,
adicionaram-se 2 mL de metanol, com agitação, até visualização da rotura das membranas para
posteriormente centrifugar durante 10 minutos (Hettich Zentrifugen EBA 8S). Após centrifugação
retiraram-se 2 mL do sobrenadante e adicionaram-se 2,25 mL de reagente de Fox deixando a
reagir durante 30 minutos para posterior leitura espectrofotométrica a 570 nm (Spectronic®
Genesys™ 2PC). A solução do reagente de Fox, preparada previamente, consiste em corante
laranja de xilenol 1 mM, H2SO4 25 mM, solução etanólica de BHT 4 mM e sulfato ferroso
amoniacal 250 mM. Os valores obtidos por este método foram expressos em equivalentes de
H2O2 mg proteína-1.
6.4.
Determinação da peroxidação lipídica avaliada pelo método dos
TBARS
O método utilizado foi baseado no descrito por Ottolenghi em 1959. O método de
quantificação de substâncias reactivas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) é, provavelmente, o
método mais utilizado para a quantificação da peroxidação lipídica in vitro. Este método
quantifica o malonildialdeído (MDA) formado, um produto final da peroxidação de ácidos gordos
da membrana, e baseia-se na reacção deste biomarcador de stresse oxidativo com o ácido
39
Material e Métodos
tiobarbitúrico. Da reacção entre ambos resulta um composto de cor amarela, mensurável por
análise espectrofotométrica, o qual é directamente proporcional à concentração de MDA
resultante da peroxidação lipídica. Apresenta como vantagens: o baixo custo e a facilidade de
execução, é sensível para a quantificação da peroxidação lipídica, porém, não é muito específico.
O meio de reacção é constituído por 100 µL de amostra, 500 µL de tampão – Tris-HCl (10
mM) em KCl (175 mM) e 100 µL de uma solução contendo 0,38% TBA (p/v), 37,5% TCA (v/v) e
0,015% BHT (p/v). Após agitação vigorosa, os tubos tapados com esferas de vidro, foram
colocados num banho de água a ferver durante cerca de 15 minutos e arrefecidos por imersão em
gelo. Foram posteriormente centrifugados durante 10 minutos a 3000r.p.m. para sedimentação
de proteínas e membranas. De cada tubo foram retirados 200µL de sobrenadante para uma
microplaca de 96 poços e a absorvância foi lida a 530nm num leitor de microplacas (Power Wave
XS2 BioTek). O resultado foi expresso em µM MDA/mg de proteína utilizando o coeficiente de
extinção molar de 1,56 x 105 M-1 cm-1.
6.5.
Determinação do conteúdo em tióis totais
O conteúdo em tióis totais pode ser determinado de acordo com o método original de
Ellman, (1959) e segundo modificações descritas posteriormente (Sedlak and Lindsay, 1968,
Suzuki et al., 1990). Este método é baseado na reacção entre o 5,5’-ditiobis- (2-ácido
nitrobenzóico) (DTNB) e os grupos sulfidrilo (SH), que origina um composto de cor amarela que
numa análise espectrofotométrica apresenta um máximo de absorção num comprimento de onda
de 412 nm, sendo para este comprimento de onda o valor do coeficiente de absorção molar igual
a 13600 M-1 cm-1 (Ellman, 1959).
Realiza-se incubação de 50µL de amostra numa solução de ácido sulfossalicílico (SSA) a 4%
(p/v) de modo a obter-se uma concentração final de 1mg/mL. Centrifuga-se a 1500g durante 10
minutos a 4°C e lava-se com 3mL de tampão fosfato 100mM, pH 8,0. Por fim adiciona-se 1,5mL de
tampão fosfato, pH 8,0, e submete-se a amostra a ultra-sons a 60W, durante aproximadamente
15 segundos. A extracção ácida, seguida de ultra-sons, permite a determinação tanto dos grupos
sulfridilos livres como os intramembranares. Retiram-se 0,7mL desta suspensão, adicionando-se
4,3mL de tampão fosfato (100 mM, pH 8,0) e 100µL de uma solução de DTNB a 10mM e
homogeneizando-se por agitação em vórtice.
A mistura é incubada no escuro durante 15 minutos e as absorvâncias são lidas a 412 nm.
A determinação da concentração dos grupos sufridilo na amostra é calculada por extrapolação
40
Material e Métodos
numa curva padrão de cisteína solubilizada em tampão fosfato 100 mM, pH 8,0 (Suzuki et al.,
1990).
7. MÉTODO DE ADIÇÃO DE NUCLEÓTIDOS MARCADOS COM FLUORESCEÍNA MEDIADA PELA
ENZIMA DEOXINUCLEOTIDIL TRANSFERASE TERMINAL (TUNEL)
As amostras de foram processadas pelo ensaio de TUNEL como descrito por Muratori et
al. (2000). Com este intuito utilizou-se o Kit In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein (Roche
Diagnostics, Alemanha).
Depois de fixados os espermatozóides são submetidos a uma centrifugação de 10 minutos
a 500 x g, com intuito de remover o fixador, posteriormente sofrem duas lavagens consecutivas
em 200 µL 1x PBS suplementado com 1% de soro fetal de bovino (BSA, Biological Industries,
Israel). De seguida os espermatozóides foram permeabilizados por acção de 100 µL de solução
permeabilizadora (0,1% Triton X-100 em 0,1% de citrato de sódio) durante 5 minutos à
temperatura de 2-8°C. Seguidamente os espermatozóides foram lavados duas vezes em 200µL 1x
PBS suplementado com 1% de BSA e centrifugadas durante 10 minutos a 500g e divididas em
duas alíquotas. Ambas as alíquotas foram incubadas com 12,5 µL de solução de reacção TUNEL
(Roche Diagnostics, Germany) com a enzima deoxinucleotidil transferase terminal, no caso da
amostra, ou sem esta, no caso do controlo negativo e depois colocadas a 37°C no escuro por uma
hora. Após decorrida a reacção foram realizadas duas lavagens em 200 µL 1x PBS suplementado
com 1% de BSA e centrifugadas durante 10 minutos a 500 x g, para remover a fluorescência
inespecífica. Em seguida os espermatozóides foram suspensos em 25 µL de 1x PBS, colocou-se
uma gota na lâmina e deixou-se secar. Posteriormente as lâminas foram coradas com 5 µL de
DAPI (VECTASHIELD – Mounting Medium With DAPI, Vector Laboratories), cobertas com uma
lamela e incubadas a 4°C pelo menos durante 15 minutos. Para algumas amostras foram ainda
preparados controlos positivos, tendo por base o protocolo descrito, mas com um tratamento
adicional com 50µL de DNase I recombinante (DNase I livre de RNase 1u/µL, 1000u, Fermentas,
União Europeia) durante 20 minutos a 37°C antes da reacção de TUNEL.
As lâminas foram guardadas a 4°C e após a estabilização da fluorescência foram
observadas ao microscópio de epifluorescência (Nikon Eclipse E400). Foram avaliadas 400 células
em e classificadas como TUNEL-negativo (sem fragmentação) quando apresentavam fluorescência
azul e TUNEL-positivo (com fragmentação) quando apresentavam fluorescência verde. As
percentagens de fragmentação foram calculadas da seguinte forma:
41
Material e Métodos
Nº de espermatozóides fragmentados x 100
200
8. ENSAIO DE COMETA
Para a realização deste ensaio seguimos o protocolo sugerido e optimizado por Sipinen et
al. (2010).
Previamente à realização do ensaio realizava-se o revestimento das lâminas a utilizar com
agarose de ponto de fusão normal a 1% em água.
As amostras são descongeladas colocando-as na estufa a 37°C durante 5 minutos. Após o
descongelamento retira-se a quantidade necessária de forma a ter 12 x 10 4 SPZ. Procede-se a uma
centrifugação a 420 x g durante 10 minutos e rejeita-se o sobrenadante. Adiciona-se 140µL de 1X
PBS refrigerado. Adiciona-se 140µL de 2% de agarose de baixo ponto de fusão (LMP) dividindo-se
o total por 4 géis em 2 lâminas que são cobertos por lamelas 18x18 mm. As lâminas são colocadas
a 4°C durante 5 minutos. Posteriormente as lâminas são sujeitas a duas lises (com o intuito de se
obterem nucleóides) de uma hora, a primeira com 1% de Triton X e 12,5 mg de DTT em 50 mL de
solução de lise; e a segunda com 1% de Triton X e 2,5mg de Proteínase K em 50mL de solução de
lise, ambas a 4°C.
Após as lises são realizadas 3 lavagens em Buffer F (40mM HEPES, 0.1M KCl, 0.5mM EDTA
0.2mg/ml BSA e a pH 8) e incuba-se 1 lâmina de cada amostra com a enzima FPG (50 µL) e as
restantes com Buffer F (50 µL) durante 30 minutos a 37°C.
No final da incubação as lâminas são colocadas na tina de electroforese e incubadas em
tampão de electroforese a 4°C durante 30 minutos para que ocorre-se a alcalinização dos géis e
consequente desnaturação do DNA.
Procedeu-se à electroforese a 25V (0,8V/cm e 300mA), durante 30 minutos a 4°C.
No final da corrida electroforética procedeu-se à neutralização das lâminas com 1X PBS
durante 10 minutos a 4°C e uma lavagem com água destilada durante 10 minutos à temperatura
ambiente.
Posteriormente as lâminas foram coradas com 5 µL (em cada gel) de DAPI (VECTASHIELD –
Mounting Medium With DAPI, Vector Laboratories), cobertas com uma lamela e incubadas a 4°C
durante a noite.
As lâminas foram avaliadas segundo o padrão visual com o auxílio do microscópio de
epifluorescência (Nikon Eclipse E400) e segundo a classificação de Andrew R. Collins (2004), em
42
Material e Métodos
que o dano é quantificado numa escala que varia de 0 a 4 mediante a quantidade de DNA
presente na cauda. Foram contabilizadas 100 células por amostra.
Figura 7. Classificação do ensaio de cometa por padrão visual. Adaptado de Collins, A. R. (2004)
9. ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística dos resultados foi realizada utilizando o programa GraphPad Prism5,
onde recorremos aos testes ANOVA, student’s t-test e Newman-Keuls Multiple Comparison Test.
Os valores são apresentados como médias com o respectivo desvio padrão.
No que concerne às correlações, utilizou-se o programa IBM® SPSS® Statistics,
recorrendo-se ao coeficiente de correlação de Spearman, sendo que se considerou P≤0,05 como
estatisticamente significativo.
43
Resultados
RESULTADOS
44
Resultados
1. ANÁLISE CITOGENÉTICA E ESPERMOGRAMA
Dos 66 indivíduos incluídos neste estudo todos apresentavam cariótipo normal. Os
resultados gerais da citogenética e espermograma, bem como a idade dos indivíduos são
apresentados na Tabela 5.
Tabela 5. Resultados gerais (idade, cariótipo e espermograma) das amostras em estudo.
Amostra
Idade
Cariótipo
Espermograma
Amostra
Idade
Cariótipo
Espermograma
1
31
46, XY
Normozoospermia
34
30
46, XY
Normozoospermia
2
35
46, XY
Normozoospermia
35
28
46, XY
Astenoteratozoospermia
3
31
46, XY
Normozoospermia
36
38
46, XY
Normozoospermia
4
27
46, XY
Normozoospermia
37
25
46, XY
Normozoospermia
5
30
46, XY
Oligoteratozoospermia
38
26
46, XY
Astenozoospermia
6
34
46, XY
Teratozoospermia
39
28
46, XY
Normozoospermia
7
33
46, XY
Normozoospermia
40
31
46, XY
Normozoospermia
8
31
46, XY
Normozoospermia
41
33
46, XY
Teratozoospermia
9
26
46, XY
Normozoospermia
42
40
46, XY
Normozoospermia
10
30
46, XY
Astenozoospermia
43
48
46, XY
Normozoospermia
11
22
46, XY
Normozoospermia
44
42
46, XY
Normozoospermia
12
29
46, XY
Normozoospermia
45
34
46, XY
Oligoastenoteratozoospermia
13
37
46, XY
Oligoastenozoospermia
46
29
46, XY
Normozoospermia
14
35
46, XY
Azoospermia
47
31
46, XY
Normozoospermia
15
33
46, XY
Teratozoospermia
48
26
46, XY
Oligoastenoteratozoospermia
16
37
46, XY
Normozoospermia
49
27
46, XY
Normozoospermia
17
34
46, XY
Oligoastenozoospermia
50
31
46, XY
Oligoastenozoospermia
18
22
46, XY
Astenozoospermia
51
30
46, XY
Oligoastenoteratozoospermia
19
35
46, XY
Normozoospermia
52
27
46, XY
Normozoospermia
20
48
46, XY
Normozoospermia
53
32
46, XY
Normozoospermia
21
32
46, XY
Normozoospermia
54
31
46, XY
Normozoospermia
22
31
46, XY
Normozoospermia
55
34
46, XY
Normozoospermia
23
25
46, XY
Terarozoospermia
56
56
46, XY
Astenozoospermia
24
39
46, XY
Azoospermia
57
26
46, XY
Oligoteratozoospermia
25
30
46, XY
Astenozoospermia
58
35
46, XY
Teratozoospermia
26
37
46, XY
Normozoospermia
59
31
46, XY
Normozoospermia
27
34
46, XY
Normozoospermia
60
27
46, XY
Normozoospermia
28
30
46, XY
Normozoospermia
61
36
46, XY
Astenozoospermia
29
24
46, XY
Oligoastenoteratozoospermia
62
39
46, XY
Normozoospermia
30
43
46, XY
Astenoteratozoospermia
63
25
46, XY
Oligoteratozoospermia
31
29
46, XY
Normozoospermia
64
34
46, XY
Normozoospermia
32
34
46, XY
Teratozoospermia
65
35
46, XY
Normozoospermia
33
40
46, XY
Oligoteratozoospermia
66
36
46, XY
Normozoospermia
45
Resultados
Figura 8. Metafase e correspondente cariograma. Obtidas por bandeamento GTL.
Figura 9. Metafase parcial (A) bandeamento GTL; (B) bandeamento CBL; pode-se verificar a
heterocromatina constitucional no ramo longo do cromossoma Y.
Tabela 6. Resultados obtidos pelo espermograma.
N
T
A
AT
(n=39)
(n=10)
(n=9)
(n=6)
Idade
32,69 ± 0,98
27,50 ± 3,27
36,67 ± 2,74
28,67 ± 2,74
Volume do ejaculado (mL)
2,71 ± 0,26
3,06 ± 0,39
2,97 ± 0,25
3,61 ± 0,76
Tempo de abstinência
3,65 ± 0,22
4,75 ± 0,59
3,44 ± 0,24
3,00 ± 0,52
pH
8,08 ± 0,06
7,98 ± 0,09
8,10 ± 0,18
7,87 ± 0,19
Concentração (SPZ/mL)
100,77 ± 11,78
59,75 ± 26,62
27,97 ± 9,69
182,09 ± 165,43
% de SPZ Imóveis
16,36 ± 1,47
23,60 ± 2,02
47,33 ± 3,80
50,33 ± 4,78
17,74 ± 2,72
12,00 ± 3,25
4,67 ± 1,40
4,17 ± 2,02
Vitalidade
82,84 ± 1,31
78,30 ± 1,61
56,22 ± 5,23
55,83 ± 8,03
Teste hipoosmótico
82,28 ± 1,31
78,10 ± 1,59
51,44 ± 3,76
54,00 ± 8,47
% de SPZ típicos
7,26 ± 0,52
2,80 ± 0,88
5,44 ± 0,58
2,67 ± 0,33
Alterações na Cabeça
89,51 ± 1,11
94,40 ± 1,18
91,67 ± 0,97
95,17 ± 0,98
36,72 ± 2,46
52,10 ± 5,36
53,56 ± 5,18
62,17 ± 3,11
Alterações na Cauda
11,44 ± 1,20
18,80 ± 2,39
22,89 ± 3,89
26,67 ± 5,60
Índice Teratozoospérmico
1,49 ± 0,03
1,72 ± 0,07
1,57 ± 0,08
1,84 ± 0,03
% de SPZ Progressivos
Rápidos
Alterações na Peça
Intermédia
46
Resultados
As 64 amostras (excluídas as amostras com azoospermia) foram divididas pelos grupos NNormozoospermia e oligozoospermia; T- Teratozoospermia e Oligoteratozoospermia; AAstenozoospermia
e
Oligoastenozoospermia;
AT-
Astenoteratozoospermia
e
Oligoastenoteratozoospermia. Os resultados são apresentados sob a forma de média ± desvio
padrão da média na Tabela 6.
2. ANEUPLOIDIAS ESPERMÁTICAS DOS CROMOSSOMAS SEXUAIS
Figura 10. Aneuploidias espermáticas dos cromossomas sexuais. Cromossoma X- marcação verde,
Cromossoma Y- marcação vermelha. Ampliação 100x.
Em 9 das 25 amostras processadas não foram encontradas células com aneuploidias. Em
média estas encontravam-se em 1,7% das células. A Tabela 7 sumaria as aneuploidias dos
cromossomas sexuais encontradas.
47
Resultados
Tabela 7. Aneuploidias dos cromossomas sexuais das células espermáticas.
Amostra
X
Y
XY0
XY
XX
YY
10
11
12
83
98
106
117
100
87
0
0
3
0
2
3
0
0
1
0
0
0
% de células portadoras de
aneuploidias
0
1
3,5
14
15
16
17
18
19
20
90
84
113
84
101
112
85
105
101
86
116
99
86
111
3
6
1
0
0
1
3
0
2
0
0
0
1
0
2
4
0
0
0
0
0
0
3
0
0
0
0
1
2,5
7,5
0,5
0
0
1
2
21
22
23
107
97
91
92
102
107
1
0
1
0
1
1
0
0
0
0
0
0
0,5
0,5
1
24
25
26
27
28
87
107
100
129
100
113
89
100
71
95
0
2
0
0
4
0
2
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2
0
0
2,5
29
80
120
0
0
0
0
0
30
105
94
1
0
0
0
0,5
31
95
104
0
0
0
1
0,5
32
98
102
0
33
96
104
0
0
0
0
0
34
80
119
1
0
0
0
0,5
35
107
91
2
0
0
0
1
X- células portadoras do cromossoma X; Y- células portadoras do cromossoma Y; XY0- células sem
cromossomas sexuais; XY- células com ambos cromossomas sexuais; XX- diploidia do cromossoma X; YYdiploidia do cromossoma Y.
3. TIÓIS TOTAIS
Por termos um n=36 tivemos que dividir as amostras não em 4 mas em 2 grupos no caso
N que inclui normozoospermia e oligozoospermia e P que inclui teratozoospermia,
oligoteratozoospermia, astenozoospermia, oligoastenozoospermia, astenoteratozoospermia e
oligoastenoteratozoospermia. Podemos verificar que não existem diferenças estatísticas entre os
dois grupos (P= 0,6073) apesar de o grupo P apresentar um ligeiro aumento (8,3%) (N- 6,67 mM
mg-1; P- 7,22 mM mg-1) (Figura 11).
48
Resultados
10
mM mg-1
8
6
4
2
0
N
P
Figura 11. Quantificação dos tióis totais. N- Normozoospermia e Oligozoospermia (n=26); PTeratozoospermia,
Oligoteratozoospermia,
Astenozoospermia,
Oligoastenozoospermia,
Astenoteratozoospermia e Oligoastenoteratozoospermia (n=10). A unidade apresentada é definida por mM
de tióis mg-1 de proteína.
4. HIDROPERÓXIDOS
Devido ao pequeno número de amostras (n=35) tivemos que dividir as amostras não em 4
mas em 2 grupos no caso N que inclui normozoospermia e oligozoospermia e P que inclui
teratozoospermia,
oligoteratozoospermia,
astenozoospermia,
oligoastenozoospermia,
astenoteratozoospermia e oligoastenoteratozoospermia. É possível verificar uma diferença
estatisticamente significativa (P= 0,0145) entre N (6,51 Eq. H2O2 10-7 cél) e P (7,99 Eq. H2O2 10-7
cél) sendo que os hidroperóxidos presentes no grupo P apresentam-se superiores, em média,
22,7%.
10
Eq. H2 O2 10-7 células
a
8
6
4
2
0
N
P
Figura 12. Quantificação dos hidroperóxidos. N- Normozoospermia e Oligozoospermia (n=26); PTeratozoospermia,
Oligoteratozoospermia,
Astenozoospermia,
Oligoastenozoospermia,
Astenoteratozoospermia e Oligoastenoteratozoospermia (n=9). (a) é estatisticamente significativa
relativamente a N. A unidade apresentada é definida por equivalentes de H2O2 por 107 espermatozóides.
49
Resultados
5. TBARS
Devido ao pequeno número de amostras (n=31) tivemos que dividir as amostras não em 4
mas em 2 grupos no caso N que inclui normozoospermia e oligozoospermia e P que inclui
teratozoospermia,
oligoteratozoospermia,
astenozoospermia,
oligoastenozoospermia,
astenoteratozoospermia e oligoastenoteratozoospermia. Pela Figura 13 podemos verificar que
não existem diferenças estatisticamente significativas entre os dois grupos, mas o grupo que
apresenta maior conteúdo em MDA é o grupo P (mais 12,2%) (N- 16,66 µmol (MDA) 10-9; P- 18,70
µmol (MDA) 10-9) (P= 0,1157)
mol(MDA) 10-9 células
25
20
15
10
5
0
N
P
Figura 13. Método dos TBARS em µmol de MDA por 10-9 espermatozóides. N- Normozoospermia e
Oligozoospermia
(n=23);
PTeratozoospermia,
Oligoteratozoospermia,
Astenozoospermia,
Oligoastenozoospermia, Astenoteratozoospermia e Oligoastenoteratozoospermia (n=8). .
6. ACTIVIDADE ENZIMÁTICA DAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES
Para facilitar o tratamento dos dados e consequentemente melhor visualizar os mesmos
as amostras foram divididas em 4 grupos, o grupo N ou Normozoospérmico, que corresponde às
amostras que não apresentavam alterações no espermograma e inclui também amostras
Oligozoospérmicas; o grupo T ou Teratozoospérmico que inclui as amostras teratozoospérmicas e
oligoteratozoospérmicas; o grupo A ou Astenozoospérmico que inclui as amostras
astenozoospérmicas
e
Astenoteratozoospérmico
oligoastenozoospérmicas;
que
inclui
as
e
amostras
ainda
o
grupo
AT
ou
astenoteratozoospérmicas
e
oligoastenoteratozoospérmicas.
50
Resultados
6.1.
Superóxido Dismutase
Na figura 14 estão representados os valores de actividade desta enzima nas amostras em
estudo (n=51). Apesar de não se encontrarem diferenças estatisticamente significativas entre os
grupos (P=0,6634) os grupos com astenozoospermia (A- 0,3971 U mg-1 proteína; AT- 0,4000 U mg1
proteína) apresentam uma menor actividade quando comparados os outros dois grupos (N-
0,4344 U mg-1 proteína; T- 0,4600 U mg-1 proteína).
U mg-1 protein
0.6
0.4
0.2
0.0
N
T
A
AT
Figura 14. Actividade da SOD em 51 amostras. N- Normozoospermia e oligozoospermia (n=28); TTeratozoospermia e Oligoteratozoospermia (n=10); A- Astenozoospermia e Oligoastenozoospermia (n=8);
AT- Astenoteratozoospermia e Oligoastenoteratozoospermia (n=5). A unidade de actividade da SOD foi
definida como a quantidade de SOD que inibe 50% da redução do NBT.
6.2.
Glutationa S-transferase
Na figura 15 estão representados os valores da actividade da GST (n=48). Neste caso
podemos constatar que diferenças estatisticamente significativas (P=0,0017) entre o grupo N
(1,1254 µM min-1 µg-1) e os grupos A (0,5796 µM min-1 µg-1) e AT (0,4519 µM min-1 µg-1). As
diferenças são ainda significativas entre o grupo T (1,2034 µM min-1 µg-1) e os grupos A e AT.
51
Resultados
1.0
-1
µM min µg
-1
1.5
a,b
a,b
0.5
0.0
N
T
A
AT
Figura 15. Actividade da GST em 48 amostras. N- Normozoospermia e oligozoospermia (n=25); TTeratozoospermia e Oligoteratozoospermia (n=10); A- Astenozoospermia e Oligoastenozoospermia (n=8);
AT- Astenoteratozoospermia e Oligoastenoteratozoospermia (n=5). (a) é estatisticamente significativa
relativamente a N; (b) é estatisticamente significativa relativamente a T. A unidade de actividade da GST foi
definida em µM de CDNB min-1 µg-1.
6.3.
Catalase
Na Figura 16 podemos verificar os valores relativos à actividade da enzima catalase nas
amostras de espermatozóides analisadas (n= 48). Conclui-se na análise à referida figura que a
actividade nos grupos N (0,4352 µmol H2O2 min-1 mg-1) e T (0,4140 µmol H2O2 min-1 mg-1) são
ligeiramente maiores quando comparadas com os grupos A (0,4000 µmol H2O2 min-1 mg-1) e,
principalmente, AT (0,3175 µmol H2O2 min-1 mg-1) (diminuição de 27% em relação a N e de 23,3%
em relação a T), pese embora não se encontrem diferenças estatisticamente significativas (P=
0,7415).
µmol H2 O2 min-1 mg-1
0.6
0.4
0.2
0.0
N
T
A
AT
Figura 16. Actividade da CAT em 48 amostras. N- Normozoospermia e oligozoospermia (n=25); TTeratozoospermia e Oligoteratozoospermia (n=10); A- Astenozoospermia e Oligoastenozoospermia (n=8);
AT- Astenoteratozoospermia e Oligoastenoteratozoospermia (n=5). A unidade de actividade da CAT foi
definida em µM de H2O2 min-1 mg-1 de proteína.
52
Resultados
7. ENSAIO DE TUNEL
Figura 17. Ensaio de TUNEL. Marcação azul- espermatozóide sem dano; marcação verde- espermatozóides
com dano. Ampliação 100x
Na Figura 18 podemos verificar que os grupos com alterações dos parâmetros
espermáticos (T- 15,9%; A- 16,0%; AT- 17,4%) apresentam mais células com dano no DNA quando
comparado com o grupo normozoospérmico (9,6%), sendo que são variações estatisticamente
significativas (n=53; P=0,0443). No entanto, entre os grupos com alterações dos parâmetros
espermáticos não existem diferenças estatisticamente significativas.
% de células com dano no DNA
25
a
20
a
a
15
10
5
0
N
T
A
AT
Figura 18. Percentagem de células com dano no DNA. N- Normozoospermia e oligozoospermia (n=31); TTeratozoospermia e Oligoteratozoospermia (n=8); A- Astenozoospermia e Oligoastenozoospermia (n=9);
AT- Astenoteratozoospermia e Oligoastenoteratozoospermia (n=5). (a) é estatisticamente significativa
relativamente a N.
53
Resultados
8. ENSAIO DE COMETA
Figura 19. Ensaio Cometa. Ampliação 100x.
Na Figura 20 podemos verificar o dano basal no DNA presente nos diferentes grupos, com
uma amostragem de n=49. Todos os grupos com alterações dos parâmetros espermáticos
apresentam valores médios superiores ao grupo normal. No entanto, concluímos que nos grupos
com alterações dos parâmetros espermáticos (T- 234UA; A- 211UA; AT- 251UA) existe mais dano
basal que no grupo sem alterações (N- 171 UA), sendo que a comparação de T e AT com N são
estatisticamente significativas. Já quando utilizada a enzima FPG parece existir menor dano total e
apesar de não existirem relações estatisticamente significativas e a diferença entre grupos ser
menor a tendência observada na Figura 20 parece ser seguida na Figura 21.
Dano no DNA em UA
300
a
a
200
100
0
N
T
A
AT
Figura 20. Dano no DNA em unidades arbitrárias. N- Normozoospermia e oligozoospermia (n=29); TTeratozoospermia e Oligoteratozoospermia (n=7); A- Astenozoospermia e Oligoastenozoospermia (n=8);
AT- Astenoteratozoospermia e Oligoastenoteratozoospermia (n=5). (a) é estatisticamente significativa
relativamente a N.
54
Resultados
Dano no DNA em UA
250
200
150
100
50
0
N
T
A
AT
Figura 21. Dano no DNA em unidades arbitrárias após incubação com enzima FPG. N- Normozoospermia e
oligozoospermia (n=29); T- Teratozoospermia e Oligoteratozoospermia (n=7); A- Astenozoospermia e
Oligoastenozoospermia (n=8); AT- Astenoteratozoospermia e Oligoastenoteratozoospermia (n=5).
9. AVALIAÇÃO DE CORRELAÇÃO ENTRE AS DIFERENTES VARIÁVEIS
Foi igualmente objectivo no presente trabalho verificar se existia alguma relação entre os
resultados típicos de um espermograma e os diferentes ensaios utilizados, bem como possíveis
relações entre estes. Encontraram-se correlações positivas e estatisticamente significativas entre
SOD e a GST (P<0,001) e a CAT (P<0,001). Foram encontradas correlações positivas
(estatisticamente significativas) com o volume ejaculado (P=0,0037) e os tióis totais (P=0,015).
Foram também encontradas correlações negativas com o pH do ejaculado (P=0,010) e com os
resultados do ensaio de cometa em que houve incubação com a enzima FPG (P=0,043). No que
concerne à GST além da correlação já citada com a SOD encontramos também correlações
positivas (estatisticamente significativas) com a CAT (P<0,001), volume do ejaculado (P=0,003) e
com o tempo de abstinência (P=0,004); constatamos ainda uma correlação negativa e
estatisticamente significativa com o pH do ejaculado (P=0,003). Relativamente à CAT não foram
encontradas outras correlações além das anteriormente apresentadas. Estas estão resumidas na
Tabela 8.
55
Resultados
Tabela 8. Correlação entre SOD, GST e CAT e os restantes resultados.
SOD
GST
CAT
n
P
n
P
n
P
Idade
65
0,498
65
0,404
65
0,509
Volume de ejaculado
65
0,037* (+)
65
0,003** (+)
65
0,060
Tempo de abstinência
61
0,139
61
0,004** (+)
61
0,334
pH
65
0,010** (-)
65
0,003** (-)
65
0,152
Concentração (SPZ/mL)
65
0,788
65
0,335
65
0,550
Imóveis
65
0,237
65
0,149
65
0,315
Progressivos Rápidos
65
0,373
65
0,254
65
0,383
Vitalidade
65
0,847
65
0,563
65
0,676
Teste hipoosmótico
65
0,803
65
0,777
65
0,961
SPZ típicos
65
0,765
65
0,743
65
0,857
Alterações na Cabeça
65
0,745
65
0,886
65
0,607
Alterações na Peça Intermédia
65
0,477
65
0,074
65
0,318
Alterações na Cauda
65
0,761
65
0,565
65
0,804
Índice Teratozoospérmico
65
0,544
65
0,126
65
0,438
Aneuploidias Espermáticas
25
0,414
25
0,492
25
0,456
Ensaio de TUNEL
56
0,716
56
0,993
56
0,965
Ensaio de Cometa
48
0,162
48
0,658
48
0,428
Ensaio de Cometa FPG
49
0,043* (-)
49
0,098
49
0,191
65
<0,001** (+)
65
<0,001** (+)
65
<0,001** (+)
SOD
GST
65
<0,001** (+)
CAT
65
<0,001** (+)
65
<0,001** (+)
TBARS
31
0,690
31
0,385
31
0,353
Hidroperóxidos
35
0,750
35
0,467
35
0,170
Tióis Totais
35
0,015* (+)
35
0,085
35
0,217
*- significância superior a 95%; **- significância superior a 99%; (+)- correlação de cariz positivo; (-)correlação de cariz negativo.
56
0,80
0,70
0,60
0,50
0,40
0,30
0,20
0,10
0,00
0,00
Tióis Totais
(mM mg-1)
Actividade da SOD
(U mg-1 proteína)
Resultados
1,00
2,00
3,00
4,00
(B)
Actividade da GST
(µM min-1 µg-1)
1,20
Actividade da CAT
(µmol H2O2 min-1 mg-1)
Actividade da CAT
(µmol H2O2 min-1 mg-1)
(A)
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
0,00
14
12
10
8
6
4
2
0
0,00
1,00
(C)
2,00
Actividade da GST
(µM min-1 µg-1)
3,00
4,00
(D)
0,20
0,40
0,60
0,80
Actividade da SOD
(U mg-1 proteína)
1,20
1,00
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
Actividade da SOD
(U mg-1 proteína)
Figura 22. Gráficos de dispersão correspondente às correlações entre: (A)- SOD e GST; (B)- Tióis totais e
SOD; (C)- CAT e GST; (D)- CAT e SOD.
No que diz respeito ao ensaio de cometa verificou-se a existência de correlações positivas
e estatisticamente significativas com o número de espermatozóides imóveis (P=0,021) e com os
resultados do ensaio de cometa em que houve incubação com a enzima FPG (P=0,002). Em
relação ao ensaio de cometa em que houve incubação com a enzima FPG encontraram-se as
relações estatisticamente significativas já referidas com a SOD e ensaio de Cometa. Já no que
concerne ao ensaio de TUNEL encontrou-se uma correlação positiva e estatisticamente
significativa com o número de espermatozóides imóveis (P=0,009) e correlações negativas e
estatisticamente significativas com a concentração de espermatozóides (P=0,015) e com a
vitalidade (P=0,019).
57
Resultados
Tabela 9. Correlação entre Ensaio de Cometa, Ensaio de Cometa FPG e Ensaio de TUNEL e os restantes
resultados.
Ensaio Cometa
Ensaio Cometa FPG
Ensaio TUNEL
n
P
n
P
n
P
Idade
48
0,677
49
0,321
56
0,496
Volume de ejaculado
48
0,616
49
0,555
56
0,250
Tempo de abstinência
47
0,778
48
0,295
53
0,635
pH
48
0,614
49
0,113
56
0,280
Concentração (SPZ/mL)
48
0,525
49
0,212
56
0,015* (-)
Imóveis
48
0,021* (+)
49
0,226
56
0,009** (+)
Progressivos Rápidos
48
0,593
49
0,517
56
0,657
Vitalidade
48
0,241
49
0,108
56
0,019* (-)
Teste hipoosmótico
48
0,106
49
0,254
56
0,075
SPZ típicos
48
0,192
49
0,515
56
0,808
Alterações na Cabeça
48
0,488
49
0,814
56
0,710
Alterações na Peça Intermédia
48
0,130
49
0,556
56
0,184
Alterações na Cauda
48
0,453
49
0,512
56
0,294
Índice Teratozoospérmico
48
0,246
49
0,609
56
0,194
Aneuploidias Espermáticas
20
0,643
20
0,922
25
0,992
Ensaio de TUNEL
48
0,135
49
0,845
48
0,002** (+)
48
0,135
49
0,845
Ensaio de Cometa
Ensaio de Cometa FPG
48
0,002** (+)
SOD
48
0,162
49
0,043* (-)
56
0,716
GST
48
0,658
49
0,098
56
0,993
CAT
48
0,428
49
0,191
56
0,965
TBARS
21
0,089
22
0,923
23
0,674
Hidroperóxidos
23
0,587
24
0,613
26
0,424
Tióis Totais
20
0,274
24
0,552
26
0,948
*- significância superior a 95%; **- significância superior a 99%; (+)- correlação de cariz positivo; (-)correlação de cariz negativo.
58
350
300
300
250
Concentração
(SPZ/mL)
Cometa
(Dano em UA)
Resultados
250
200
150
100
200
150
100
50
50
0
0
0
(C)
20
30
40
50
0
(B)
10
80
70
60
50
40
30
20
10
0
20
30
40
30
40
TUNEL
(% células com dano)
% de SPZ imóveis
120
Vitalidade
(% de SPZ vivos)
% SPZ imóveis
(A)
10
100
80
60
40
20
0
0
10
20
TUNEL
(% células com dano)
30
40
(D)
0
10
20
TUNEL
(% células com dano)
Figura 23. Gráficos de dispersão correspondente às correlações entre: (A)- Cometa e % de SPZ imóveis; (B)TUNEL e concentração; (C)- TUNEL e % SPZ imóveis; (D)- TUNEL e vitalidade.
Com o presente trabalho verificaram-se inúmeras correlações estatisticamente
significativas positivas entre os TBARS e os restantes resultados, concretizando, alterações
morfológicas da cabeça (P=0,013), alterações morfológicas da peça intermédia (P<0,001), índice
teratozoospérmico (P<0,001) e hidroperóxidos (P=0,026) encontrou-se ainda uma correlação
negativa e estatisticamente significativa com o número de espermatozóides morfologicamente
típicos (P=0,024).
Em relação aos hidroperóxidos verificou-se somente a correlação com os TBARS,
anteriormente referida.
Para os tióis totais encontraram-se 3 correlações positivas e estatisticamente significativas
com o volume do ejaculado (P=0,046), a concentração de espermatozóides por mililitro (P<0,001)
e com a SOD (P=0,015).
59
Resultados
Tabela 10. Correlação entre quantidade de MDA, hidroperóxidos e tióis totais e os restantes resultados.
TBARS
Hidroperóxidos
Tióis Totais
n
P
n
P
n
P
Idade
31
0,684
35
0,910
35
0,691
Volume de ejaculado
31
0,345
35
0,987
35
0,046* (-)
Tempo de abstinência
29
0,650
33
0,142
33
0,117
pH
31
0,640
35
0,111
35
0,123
Concentração (SPZ/mL)
31
0,433
35
0,086
35
<0,001** (+)
Imóveis
31
0,747
35
0,388
35
0,863
Progressivos Rápidos
31
0,437
35
0,965
35
0,488
Vitalidade
31
0,532
35
0,887
35
0,712
Teste hipoosmótico
31
0,514
35
0,936
35
0,861
SPZ típicos
31
0,024* (-)
35
0,252
35
0,924
Alterações na Cabeça
31
0,013* (+)
35
0,134
35
0,606
Alterações na Peça Intermédia
31
<0,001** (+)
35
0,435
35
0,064
Alterações na Cauda
31
0,981
35
0,463
35
0,617
Índice Teratozoospérmico
31
<0,001** (+)
35
0,519
35
0,085
Aneuploidias Espermáticas
8
0,332
10
0,526
10
0,538
Ensaio de TUNEL
23
0,674
26
0,424
26
0,948
Ensaio de Cometa
21
0,089
23
0,587
23
0,274
Ensaio de Cometa FPG
22
0,923
24
0,613
24
0,552
SOD
31
0,690
35
0,750
35
0,015* (+)
GST
31
0,385
35
0,467
35
0,085
CAT
31
0,353
35
0,170
35
0,217
31
0,026* (+)
31
0,850
35
0,155
TBARS
Hidroperóxidos
31
0,026* (+)
Tióis Totais
31
0,850
35
0,155
*- significância superior a 95%; **- significância superior a 99%; (+)- correlação de cariz positivo; (-)correlação de cariz negativo.
60
Hidroperóxidos
(Eq. H2O2 10-7 SPZ)
12
10
8
6
4
2
0
0
(A)
10
20
30
40
TBARS
(µmol (MDA) 10-9)
Índice Teratozoospérmico
Resultados
2,5
2
1,5
1
0,5
0
(B)
15
Concentração
(SPZ/mL)
% SPZ típicos
20
10
5
0
(C)
0
10
20
TBARS
(µmol (MDA) 10-9)
30
40
0
10
20
30
40
TBARS
(µmol (MDA) 10-9)
350
300
250
200
150
100
50
0
(D)
0
5
10
15
20
Tióis Totais
(mM mg-1 proteína)
Figura 24. Gráficos de dispersão correspondente às correlações entre: (A)- TBARS e Hidroperóxidos; (B)TBARS e Índice Teratozoospérmico; (C)- TBARS e % SPZ típicos; (D)- Tióis totais e Concentração.
.
61
25
Discussão dos Resultados
DISCUSSÃO DOS RESULTADOS
62
Discussão dos Resultados
A análise citogenética foi importante para eliminar uma possível anomalia citogenética
como problema de fundo para as alterações nos parâmetros espermáticos. Seria ainda uma maisvalia, caso encontrássemos anomalias citogenéticas, perceber qual a influência destas no stresse
oxidativo e dano no DNA.
Nos últimos anos a evidência científica tem apontado para que os ROS tenham um papel
determinante na etiologia da função defeituosa dos espermatozóides. A produção dos mesmos
no tracto genital masculino tem vindo a tornar-se especial objecto de interesse visto o seu
potencial tóxico, quando em níveis elevados, para a qualidade e função espermáticas.
Os espermatozóides são especialmente sensíveis aos ROS pois a sua membrana
plasmática é rica em PUFA (Lanzafame et al., 2009) e também porque o seu citoplasma contém
baixas concentrações de enzimas antioxidantes (de Lamirande and Gagnon, 1995b). Isto
associado a uma produção excessiva de ROS no plasma seminal parece estar associada com
potenciais de fertilização reduzidos, alterações no metabolismo, motilidade e morfologia dos
espermatozóides (Shiva et al., 2011).
Para avaliar o estado de stresse oxidativo, neste trabalho, utilizaram essencialmente 3
indicadores, no caso, formação de espécies reactivas ao ácido tiobarbitúrico (ex. MDA), formação
de hidroperóxidos e o conteúdo em tióis totais, resultantes, respectivamente, da peroxidação
lipídica e oxidação de proteínas.
No que concerne à quantidade de MDA podemos verificar que o grupo que incluía as
alterações
dos
astenozoospermia,
parâmetros
espermáticos
(teratozoospermia,
oligoastenozoospermia,
oligoteratozoospermia,
astenoteratozoospermia
e
oligoastenoteratozoospermia) apresentava uma quantidade de MDA na ordem dos 18,69 µmol de
MDA por 10-9 células enquanto o grupo que incluía os normozoospérmicos e oligozoospérmicos
apresentava 16,66 µmol de MDA por 10-9 células, ainda que as diferenças não fossem
estatisticamente significativas. Diversos trabalhos encontraram maiores quantidades de MDA nos
grupos astenozoospérmico e oligoastenozoospérmico tendo por isso sido concluído que a
quantidade de MDA poderia ser um bom indicador para a motilidade e concentração de
espermatozóides, sendo que os nossos resultados se encontram de acordo com o descrito.
(Huang et al., 2000, Keskes-Ammar et al., 2003, Ben Abdallah et al., 2009). Trabalhos semelhantes
foram realizados com apenas 2 grupos, normozoospérmicos e astenozoospérmicos, mas com
resultados semelhantes aos anteriores (Griveau et al., 1995, Tavilani et al., 2005). Estas
conclusões não são no entanto consensuais pois outros autores mostraram que os níveis de MDA
não estavam correlacionados com a motilidade ou concentração (Suleiman et al., 1996).
63
Discussão dos Resultados
Encontramos ainda correlações positivas e estatisticamente significativas com as
alterações na cabeça, alterações na peça intermédia e índice teratozoospérmico e uma correlação
negativa e estatisticamente significativa com os espermatozóides morfologicamente típicos, o que
é consistente com os resultados obtidos por outros autores que encontraram relações
estatisticamente significativas entre o nível de MDA e a morfologia (Zabludovsky et al., 1999,
Ollero et al., 2001, Colagar et al., 2009).
Encontrou-se ainda correlação positiva e estatisticamente significativa com os
hidroperóxidos o que vem validar os resultados obtidos no presente trabalho. Os hidroperóxidos
são largamente utilizados como indicação de dano precoce por radicais livres e outras espécies
reactivas de oxigénio (ROS) em lípidos (Gay and Gebicki, 2003, Rahmanto et al., 2010, Grintzalis et
al., 2012). Para a sua avaliação, as amostras foram divididas em dois grupos de modo semelhante
ao utilizado para a avaliação das espécies reactivas ao ácido tiobarbitúrico. Observaram-se
diferenças estatisticamente significativas entre os dois grupos com valores na ordem dos 6,51
equivalentes de H2O2 por cada 107 células para o grupo N e de 7,99 equivalentes de H2O2 por cada
107 células para o grupo P. Apesar disto nenhuma correlação estatisticamente significativa foi
estabelecida, no entanto verifica-se uma tendência negativa relativamente à concentração de
espermatozóides (P=0,086) que vai de encontro aos resultados obtidos noutros trabalhos (já
referidos) com a concentração de MDA, mas que necessitaria de um aumento do número de
amostras para que fosse possível obter uma conclusão definitiva. De acordo com a pesquisa
bibliográfica efectuada não foi encontrada bibliografia, relativa à concentração de hidroperóxidos,
não tendo sido possível comparar os resultados obtidos no presente trabalho.
O aumento da peroxidação lipídica da membrana plasmática dos espermatozóides pode
provocar uma alteração na fluidez da mesma que pode levar a alterações no metabolismo, na
reactividade da reacção acrossómica, na capacidade do espermatozóide para fecundar o oócito,
na concentração, na motilidade e na morfologia (Ebisch et al., 2006), o que pode explicar os
nossos resultados.
Outro dos indicadores de stresse oxidativo avaliado foi o conteúdo de proteínas não
oxidadas com base na variação do conteúdo em tióis totais. A manutenção dos grupos sulfridilos
proteicos são essenciais para um folding e uma actividade proteica correctos. A glutationa
reduzida (GSH) presente no espaço extracelular reage com os aldeídos provenientes da
peroxidação lipídica da membrana, protegendo os grupos sulfridilos livres da membrana
plasmática dos espermatozóides (Eskiocak et al., 2005, Shiva et al., 2011). A exemplo do que
aconteceu com os TBARS e com os hidroperóxidos também aqui se dividiram os sujeitos por dois
64
Discussão dos Resultados
grupos, N e P, e também aqui o grupo P tem um valor médio mais elevado, sendo que as
diferenças entre eles não são estatisticamente significativas.
Além disto encontraram-se correlações positivas e estatisticamente significativas com a
concentração de espermatozóides e com a actividade da SOD e correlações negativas
estatisticamente significativas com o volume do ejaculado, e parecem existir tendências para
alterações da peça intermédia (P=0,064), índice teratozoospérmico (P=0,085) e actividade da GST
(P=0,085). Shiva et al. em 2011 apesar de não encontrar correlações estatisticamente
significativas, verificou no entanto a existência de uma tendência quando comparou a motilidade
(P=0,068) (comparando astenozoospérmicos com progressivos) e concentração (P=0,057)
(comparando oligozoospérmicos com normozoospérmicos). Zini et al. (2001) verificou diferenças
estatisticamente significativas entre homens férteis e inférteis e ainda correlação positiva com a
desnaturação do DNA e negativa com a concentração, motilidade e morfologia. Lewis et al. em
1997 encontrou diferenças estatisticamente significativas entre amostras astenozoospérmicas e
normozoospérmicas. Correlações estatisticamente significativas negativas entre os tióis totais e
motilidade e morfologia foram referidas por diversos autores (Sun et al., 1997, Irvine et al., 2000,
Zini et al., 2001).
O DNA espermático encontra-se altamente compactado, devido à substituição de
histonas por protaminas ricas em cisteína. A oxidação dos grupos tióis nestas ocorre
fisiologicamente para que ocorra a estabilização da cauda e consequentemente os
espermatozóides adquiram motilidade e a estabilização do DNA. Assim, um aumento nesta
oxidação pode levar a uma maior susceptibilidade ao dano do DNA. Zini et al. (2001) não
encontrou qualquer correlação ou diferenças estatisticamente significativas no dano no DNA
entre homens com níveis diferentes de concentração de tióis à semelhança do nosso trabalho.
Fisiologicamente existe um equilíbrio entre a produção de ROS e os antioxidantes. O dano
celular apenas ocorre quando este equilíbrio é descompensado, especialmente quando os
sistemas antioxidantes não conseguem compensar o aumento dos ROS, sendo que no fluido
seminal níveis adequados de SOD e CAT desempenham um papel fundamental neste equilíbrio
(Kobayashi et al., 1991, Khosrowbeygi and Zarghami, 2007, Ben Abdallah et al., 2009).
Em relação à SOD não se encontraram diferenças estatisticamente significativas entre os 4
grupos apesar dos dois grupos que apresentam astenozoospermia apresentarem valor médio
ligeiramente inferior. Hsie et al. em 2002 não encontrou diferenças estatisticamente significativas
entre oligoastenozoospérmicos e normozoospérmicos no plasma seminal, a exemplo deste,
muitos outros autores, utilizando diferentes divisões, foram incapazes de estabelecer diferenças
65
Discussão dos Resultados
estatisticamente significativas (Sanocka et al., 1996, Tkaczuk-Wlach et al., 2002, Khosrowbeygi
and Zarghami, 2007, Tavilani et al., 2008), só Ben Abdallah et al. (2009) encontrou diferenças
estatisticamente significativas entre oligoastenozoospérmicos e astenozoospérmicos (maior
actividade) em relação a normozoospérmicos, sendo no entanto necessário a obtenção de mais
resultados para que se possa perceber efectivamente a relevância da SOD neste tipo de
alterações.
Encontramos correlações positivas e estatisticamente significativas entre a SOD e a CAT, a
GST, os tióis totais e o volume do ejaculado; e negativas com o pH e com o resultado do ensaio de
Cometa quando existia incubação com a enzima FPG. Shiva et al. em 2010 encontrou também
correlações positivas com a CAT, GST e tióis totais, Tavilani et al. em 2008 também encontrou
correlação entre a SOD e a CAT. Na bibliografia podem-se encontrar correlações positivas com a
concentração de MDA (Tavilani et al., 2008, Ben Abdallah et al., 2009); e negativas com a
concentração de espermatozóides e morfologia normal (Ben Abdallah et al., 2009).
Em relação à CAT não se encontraram diferenças estatisticamente significativas entre os 4
grupos apesar de A e AT apresentarem uma redução significativa na sua actividade, mais evidente
em relação ao que a acontece com a SOD apesar de apresentar a mesma tendência. Estes
resultados estão de acordo com alguns dos resultados descritos na literatura (Khosrowbeygi and
Zarghami, 2007, Tavilani et al., 2008, Ben Abdallah et al., 2009, Shiva et al., 2011), chamamos a
atenção para o facto de Bem Abdallah et al. (2009) encontrar menor actividade de CAT nos grupos
astenozoospérmico e oligoastenozoospérmico e de Khosrowbeygi e Zarghami (2007) encontrar
uma
menor
actividade
de
CAT
astenozoospérmico,
astenoteratozoospérmico
e
oligosastenoteratozoospérmico.
Verificaram-se existir ainda correlações positivas e estatisticamente significativas com a
SOD e a GST. Como já havíamos referido Shiva et al. em 2010 encontrou também correlações
positivas com a SOD e a GST e Tavilani et al. em 2008 também encontrou correlação entre CAT e a
SOD.
Analisamos ainda a actividade de GST pois esta mostrou-se ser muito importante visto os
espermatozóides usarem GSH exógena por intermédio da actividade catalítica da GST para
manter a competência funcional ao nível da motilidade, vitalidade, estado mitocondrial,
capacidade de ligação ao oócito e capacidade de fertilização durante a exposição a H 2O2 ou a
produtos da peroxidação lipídica (Hemachand and Shaha, 2003).
Os resultados provenientes da análise de actividade da GST mostraram-se muito
interessantes pois pode-se verificar uma diferença estatisticamente significativa entre os grupos N
e T e os grupos A e AT o que parece indicar mais uma vez que também a GST está altamente
66
Discussão dos Resultados
relacionada com alterações na mobilidade. Infelizmente não é possível comparar estes resultados
com os descritos na literatura visto não se terem encontrado trabalhos semelhantes.
Além disto encontraram-se correlações positivas e estatisticamente significativas com a
SOD, a CAT, o volume de ejaculado e o tempo de abstinência antes da colheita e negativa com o
pH. Parecem ainda existir tendências, positiva em relação ao conteúdo total de tióis (p=0,085); e
negativa em relação às alterações da peça intermédia (p=0,074). Infelizmente pela escassez de
resultados não é possível que estes sejam comparados com a bibliografia.
As alterações encontradas no presente trabalho podem ser importantes na protecção dos
espermatozóides contra o dano oxidativo durante a espermiogénese, visto os espermatozóides
maduros serem incapazes de sintetizar proteínas (Shiva et al., 2011).
Na etiologia da infertilidade, além do estudo do stress oxidativo com avaliação do
peroxidação lipídica, oxidação proteica e alterações no sistema de defesa antioxidante, também o
dano do DNA desempenha um papel importante (Shen and Ong, 2000).
O dano no DNA na linha germinativa masculina tem sido implicado na etiologia de
diversas patologias, que incluem infertilidade, aborto, doenças genéticas dominantes, e um
conjunto complexo de alterações neurológicas como a esquizofrenia, epilepsia e autismo (De Iuliis
et al., 2009).
Para o estudo do dano no DNA nas nossas amostras decidiu-se utilizar duas técnicas
diferentes, a técnica de TUNEL e o ensaio de Cometa.
Em relação ao ensaio de TUNEL podemos verificar diferenças estatisticamente
significativas entre os grupos T, A e AT em relação a N. Estes resultados estão assim de acordo
com alguns dos resultados obtidos por outros autores. Brahem et al. (2011) encontrou diferenças
estatisticamente
significativas
entre
homens
férteis
normozoospérmicos
e
homens
teratozoospérmicos; Host et al. (1999) encontrou diferenças estatisticamente significativas entre
homens oligozoospérmicos e normozoospérmicos; já Mehdi et al. (2009) não encontrou
diferenças
estatisticamente
significativas
entre
homens
normozoospérmicos
e
astenozoospérmicos mas encontrou entre normozoospérmicos e teratozoospérmicos. Outros
trabalhos relacionam o dano no DNA (analisado por TUNEL) e a alteração dos parâmetros
espermáticos (Sun et al., 1997, Muratori et al., 2000, Benchaib et al., 2003, Sergerie et al., 2005a,
Sergerie et al., 2005b). Apesar da similitude entre estudos os valores de percentagem de dano
diferem muito de autor para autor sendo que os nossos resultados são ligeiramente mais baixos
daqueles apresentados na bibliografia, o que talvez se deva à utilização por parte destes de
citometria de fluxo para analisar os resultados. Sharma et al. (2010) tentou definir um limite de
67
Discussão dos Resultados
dano que seria considerado normal para que pudesse ser utilizado nos laboratórios de diagnóstico
e estabeleceu o patamar de 19,25% de células com dano, o que excluiria da anormalidade quase
todos os indivíduos presentes neste trabalho, o que nos parece manifestamente exagerado. Pelo
que mais estudos são necessários para que se possa estabelecer um cutt-of.
Encontraram-se ainda correlações positivas e estatisticamente significativas no resultado
do ensaio de TUNEL com o número de espermatozóides imóveis e negativas com a concentração
e a vitalidade. Resultados também eles já descritos na bibliografia, encontram-se correlações
negativas entre o dano no DNA e a motilidade (Sun et al., 1997, Muratori et al., 2000), morfologia
(Sun et al., 1997, Muratori et al., 2000, Mehdi et al., 2009, Brahem et al., 2011), concentração
(Sun et al., 1997) e vitalidade (Mitchell et al., 2011).
Para analisar o dano no DNA foi utilizado ainda o ensaio de Cometa com e sem incubação
com a enzima FPG.
Podemos observar existirem diferenças estatisticamente significativas entre os grupos em
estudo T e AT em relação a N e que existe uma diferença considerável entre o grupo A em relação
a N. Apesar de não termos encontrado trabalhos com a mesma divisão de grupos que o nosso,
verificamos, existirem vários trabalhos que comparam homens normozoospérmicos férteis com
homens com problemas de reprodução e em que os últimos apresentam maior dano (Ahmad et
al., 2007, Sheikh et al., 2008). Já Kumar et al. (2011) verificou diferenças estatisticamente
significativas entre normozoospérmicos e astenoszoospérmicos e teratozoospérmicos. Shamsi et
al. (2010) encontrou maior dano nos grupos oligozoospérmicos, astenozoospérmicos e
oligoastenozoospérmicos.
Além disto encontramos uma correlação positiva e estatisticamente significativa com os
espermatozóides imóveis o que vai de encontro ao descrito na bibliografia (Lu et al., 2002, Morris
et al., 2002, Silver et al., 2005, Sheikh et al., 2008).
Infelizmente, e talvez por algum problema relacionado com a enzima FPG, os resultados
do ensaio de Cometa com incubação com a referida enzima não corresponderam ao esperado,
sendo que o dano médio para todos os grupos são significativamente inferiores aqueles obtidos
pelo ensaio de cometa.
Os resultados (dos ensaios de TUNEL e Cometa) mostram inequivocamente uma relação
muito próxima entre dano no DNA e os parâmetros avaliados pelo espermograma. Sendo que os
normozoospérmicos apresentam muito menor dano que os que apresentam uma qualquer
alteração nos parâmetros espermáticos convencionais.
68
Conclusões
CONCLUSÕES
69
Conclusões
O presente estudo leva-nos a concluir que na causa da infertilidade idiopática, uma
abordagem mais abrangente, envolvendo as diferentes técnicas utilizadas no presente trabalho,
poderá esclarecer o diagnóstico. Esta conclusão geral deve ser complementada com as conclusões
particulares:
i.
A avaliação citogenética é importante, como avaliação de primeira linha, no
estudo da infertilidade masculina;
ii.
A peroxidação lipídica (MDA e hidroperóxidos) foi maior no grupo com alterações
dos parâmetros de qualidade espermática. Com correlação estatisticamente
significativa entre si e com a morfologia;
iii.
A actividade das enzimas antioxidantes encontrava-se aumentada no grupo T o
que sugere que este aumento não foi eficaz para anular o efeito dos ROS;
iv.
A diminuição da actividade de GST parece estar intimamente ligada a alterações
na mobilidade dos espermatozóides;
v.
O ensaio de TUNEL parece estar associado com a morte celular (pois apresenta
correlações estatisticamente significativas positiva com a % de espermatozóides
imóveis; e negativa com a vitalidade) ao contrário do descrito na bibliografia;
vi.
O dano no DNA parece estar intimamente associado aos parâmetros de qualidade
espermática. A associação dos resultados obtidos nas duas técnicas utilizadas
(Cometa e TUNEL) confere uma informação mais completa sobre o dano no DNA
e o seu significado biológico na infertilidade masculina.
Trabalhos futuros podem incluir o estudo de marcadores de stresse oxidativo, sistema
antioxidante e dano no DNA em mais amostras, sempre em relação à qualidade espermática.
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83
Anexos
ANEXOS
84
Anexos
ANEXO 1 – CULTURA CELULAR, MANIPULAÇÃO E ESPALHAMENTO
Soluções:
Meio: KarioMax
Fitohemaglutinina liofilizada: Rehidratar com 10 mL de água destilada estéril; distribuir
em alíquotas de 0,2 mL (para 2 tubos) e de 0,4 mL (para 4 tubos); congelar e guardar a -21°C.
Metotrexato: Para obter a solução pretendida efectuar as seguintes diluições:
Solução A: pesar 5 mg de metotrexato e adicionar 2 mL de água destilada estéril.
Guardar no frigorífico.
Solução B: 0,1 mL da solução A + 9,9 mL de água destilada estéril.
Solução C: 1 mL de solução B + 9 mL de água destilada estéril.
Timidina: Para a concentração final de 0,3 µg/mL. Pesar 2,4 mg de timidina e adicionar 5
mL de meio completo. Agitar suavemente.
Colcemide: concentração final de 10 µg/mL.
Solução hipotónica: cloreto de potássio a 0,0075M. Dissolver 5,6 g de KCl em 1 L de água
destilada; guardar no frigorífico.
Fixador 3:1: 3 volumes de metanol para 1 volume de ácido acético. Usar fresco.
Brometo de Etídeo: pesar 10 mg de brometo de etídeo e dissolver em 1 mL de água.
Filtrar em filtro milipore e congelar em alíquotas. Envolver em papel de alumínio.
Sementeira:
Distribuição de 5 mL de meio de cultura por cada tubo e adição de 2 gotas de
fitohemaglutinina para a estimulação dos linfócitos T. Homogeneizar os sangues e colocar oito
gotas em cada tubo, incubando a 37°C durante 48 a 72 horas, com cuidado de manter as culturas
a uma inclinação aproximada de 30°, para aumentar a área de superfície de contacto com o meio.
Em seguida, adicionar 2 gotas de solução de metotrexato C e incubar os tubos durante 17
horas a 37°C mantendo a inclinação a 30°.
Segue-se uma centrifugação durante 10 minutos a 1200 rpm e rejeição do sobrenadante.
Ressuspensão do pellet com 5 mL de novo meio de cultura e adição de 1 gota de timidina,
incubando durante 4 horas a 37°C e mantendo a inclinação.
Adição de 5,7 µL de brometo de etídio e incubar durante 1 hora e 30 minutos a 37°C.
85
Anexos
Para terminar, adicionar a cada tubo 5 gotas de colcemide e agitar suavemente. Incubar a
37°C durante 30 minutos com inclinação de 30°.
Manipulação:

Centrifugar os tubos durante 4 minutos a 2000rpm;

Rejeitar o sobrenadante (deixar cerca de 0,5 mL) e ressuspender;

Adicionar, lentamente, a cada tubo com agitação moderada, 10 mL da solução
hipotónica, previamente aquecida a 37°C;

Incubar durante 15 minutos a 37°C;

Centrifugar durante 4 minutos a 2000rpm;

Rejeitar o sobrenadante (deixar cerca de 0,5 mL) e ressuspender;

Adicionar, lentamente, e sob agitação o fixador 3:1, previamente refrigerado;

Centrifugar durante 4 minutos a 2000rpm;

Rejeitar o sobrenadante (deixar cerca de 0,5 mL) e ressuspender;

Adicionar, lentamente, e sob agitação o fixador 3:1, previamente refrigerado;

Rejeitar o sobrenadante (deixar cerca de 0,5 mL) e ressuspender;

Adicionar, lentamente, e sob agitação o fixador 3:1, previamente refrigerado;

Após a 3 lavagem, decantar o sobrenadante, e adicionar algumas gotas de fixador
(recentemente preparado, para fazer o espalhamento.
Espalhamento:

Agitar a suspensão celular;

Colocar aproximadamente 2 gotas de suspensão celular sobre a lâmina;

Secar as lâminas sobre uma placa de aquecimento à temperatura de 60°C;

Para envelhecer as lâminas, conservá-las durante 30 minutos, sobre a placa
de aquecimento.
86