Sementes da Demência
Uma reação em cadeia de proteínas tóxicas pode ajudar
a explicar Azheimer, Parkinson e outras doenças mortais que
levariam a novas e promissoras opções de tratamento
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AO ANALISAR NO MICROSCÓPIO CÉLULAS NERVOSAS doentes em amostras
de tecido cerebral de um paciente que morreu vítima de Alzheimer, um patologista pode
identificar grânulos anormais de material. Eles são formados por proteínas ausentes em
células sadias. De onde viriam, e por que existem tantos deles? E, mais importante, qual
a relação entre essas proteínas e a doença devastadora e incurável? Durante a busca por
respostas ocorreu uma descoberta surpreendente: as proteínas que se acumulam nos
neurônios de pacientes com Alzheimer e outras doenças neurodegenerativas têm
comportamento muito parecido com o de príons, proteínas tóxicas que destroem o
cérebro na doença da vaca louca.
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Os príons são proteínas deformadas, mas persistentes, e provocam alteração e
posterior aglutinação de proteínas semelhantes, iniciando uma reação em cadeia que leva
à destruição de regiões inteiras do cérebro. Ao longo dos últimos dez anos cientistas
descobriram que processo semelhante pode estar envolvido em doenças não tão raras
como a da vaca louca e outras enfermidades exóticas. Processos dessa natureza podem
também ocorrer nas principais doenças neurodegenerativas, incluindo Alzheimer,
Parkinson, esclerose lateral amiotrófica (também conhecida como ELA ou doença de Lou
Gehrig) e demência relacionada a concussão, comum em jogadores de futebol
[americano] e pugilistas. De acordo com as evidências, Alzheimer e Parkinson não são
contagiosas como a doença da vaca louca ou a gripe. Essas descobertas recentes
indicam o principal suspeito de uma série de doenças devastadoras do cérebro - e
apontam caminhos para tratamentos.
Medicamentos desenvolvidos para tratar a doença de Alzheimer poderiam ser usados
diretamente - ou estimular uma nova farmacologia - para Parkinson, lesão cerebral
traumática e outras enfermidades terríveis que alienam os pacientes da sua condição de
ser. Boa notícia para milhões de pessoas que sofrem de doenças neurodegenerativas em
todo o mundo.
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As novas concepções devem muito aos pesquisadores que descobriram os príons,
Tudo começou no início do século 18, com relatos de uma doença curiosa e fatal de
ovelhas - a scrapie -, assim chamada porque os animais afetados raspavam a lã de sua
pele ao se esfregarem compulsivamente [scrape, raspar em inglês]. Posteriormente,
quando os cientistas começaram a investigar a doença, notaram que o sistema nervoso
dos animais apresentava diversos orifícios quando observado ao microscópio. Na década
de 30 do século passado pesquisadores franceses e britânicos descobriram que scrapie
pode ser transmitida de uma ovelha a outra, mas o agente infeccioso era elusivo e se
comportava de modo incomum: o intervalo de tempo entre exposição e sintomas era
muito mais longo que nas doenças provocadas por agentes convencionais, como
bactérias e vírus. Além disso, a resposta imune normalmente acionada para eliminar
esses invasores parecia ausente.
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Essas particularidades indicavam que a doença não era provocada pelos suspeitos
de costume, mas por mais de 20 anos os resultados sobre scrapie permaneceram como
uma obscura doença veterinária. Na década de 50, porém, William Hadlow, então na
British Agricultural Research Council Field Station em Compton, notou a grande
semelhança da patologia cerebral entre scrapie e uma misteriosa doença humana
chamada kuru. Kuru é uma doença neurodegenerativa progressiva, praticamente restrita
ao povo fore da Nova Guiné. O declínio constante na coordenação e função mental de
pessoas afetadas leva invariavelmente à morte. Algum tempo depois, verificou-se que
kuru entre os fore estava associado à prática de canibalismo ritual de parentes que tinham
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morrido da doença. O fato sugeria um agente infeccioso que de alguma forma chegava ao
cérebro vindo de algum outro ponto do organismo.
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Na década de 60, D. Carleton Gajdusek, do National Institutes of Health dos
Estados Unidos, e colaboradores confirmaram que a doença era transmissível ao
demonstrar que ela poderia ser induzida pela injeção direta de extrato cerebral de vítimas
de kuru no cérebro de primatas não humanos. A equipe de Gajdusek também reconheceu
semelhanças importantes na patologia cerebral entre kuru e uma enfermidade cerebral
neurodegenerativa mais comum: a doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD, na sigla em
inglês). A CJD é um tipo de demência de progressão rápida e afeta aproximadamente
uma em 1 milhão de pessoas em todo o mundo. Gajdusek demonstrou que a doença de
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Creutzfeldt-Jakob pode ser transmitida a primatas como a kuru. Na maioria das vezes, no
entanto, a doença se manifesta espontaneamente.
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Na década de 80, Stanley Prusiner, da University of California em São Francisco,
identificou o agente responsável pelo scrapie e distúrbios relacionados à doença As
enfermidades ficaram conhecidas coletivamente como encefalopatias espongiformes
porque, nestes casos, o cérebro dos afetados assume a aparência de queijo suíço,
repleta de orifícios. Em uma série de experimentos, ele e seus colegas acumular~
evidências convincentes de que o agente infeccioso consiste unicamente em uma versão
alterada de uma proteína chamada PrP, inócua em sua forma íntegra Prusiner naquele
momento também cunhou o termo "príon”- nome que designa ''partículas proteicas
infecciosas" - para distinguir os agentes transmissíveis proteicos de agentes patogênicos
conhecidos, como vírus, bactérias, fungos e outros. (Atualmente o termo inclui proteínas
que impõem sua própria forma a proteínas semelhantes sem, necessariamente, implicar
infecção.) Prusiner provocou enorme polêmica quando propôs a ideia da proteína como
agente capaz de transmitir a doença, mas em 1997 ganhou o Prêmio Nobel por esse
trabalho.
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Recentemente, pesquisas detalhadas sobre o mal de Alzheimer e outras doenças
neurodegenerativas indicam que esses distúrbios, apesar de carentes da infectividade, ou
infecciosidade, das doenças priônicas clássicas, podem surgir e se propagar de maneira
semelhante no cérebro, ou seja, através de um processo que chamamos de semeadura
de proteína patogênica. Assim como os príons responsáveis pela vaca louca e doenças
correlatas, as sementes proteicas podem ser liberadas, absorvidas e transportadas pelas
células. Essas características comuns podem explicar como a doença se alastra As
semelhanças sugerem, assim, que o paradigma do príon pode, em breve, unificar nossa
compreensão sobre a manifestação e danos provocados por doenças aparentemente
diversas.
PROTEíNAS RETORCIDAS NO ALZHEIMER?
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O primeiro indício da associação de príons com Alzheimer foi detectado nos anos
60. Nessa época, pesquisadores envolvidos no esforço de compreender os mistérios de
doenças produzidas por príons notaram semelhanças sugestivas com as alterações
cerebrais que ocorrem em outras moléstias neurodegenerativas, especialmente
Alzheimer. Causa mais comum de demência durante o envelhecimento de humanos, a
doença aparece furtivamente e avança de modo implacável ao longo de anos, subtraindo
a memória, a personalidade e, por fim, a própria vida da vítima. A incidência da doença de
Alzheimer duplica a cada cinco anos depois dos 65 anos de idade, até que, por volta dos
85 anos, quase um em cada três adultos está afetado.
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Na mesma época, os pesquisadores notaram o envolvimento da aglutinação da
proteína na progressão da doença Em 1906, Alais Alzheimer, que dá o nome à doença,
pela primeira vez associou a demência a duas alterações microscópicas peculiares no
cérebro: placas senis (atualmente identificadas como aglomerados de fragmentos de
proteínas retorcidas chamadas beta-amiloide, ou Aß), localizados fora das células, e
emaranhados neurofibrilares (filamentos compostos de agregados de uma proteína
chamada tau), localizados no interior da célula. Quando esses agregados são ampliados
por microscopia eletrônica as proteínas podem ser vistas formando longas fibras
constituídas de Aß) ou tau. Além disso, as proteínas formam agrupamentos menores,
conhecidos como oligômeros ou protofibrilas, que também interferem no funcionamento
normal dos neurônios.
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No final dos anos 60, a equipe de Gajdusek testou a hipótese de que a doença de
Alzheimer, como scrapie, kuru e a doença de Creutzfeldt-Jakob, pudesse ser
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transmissível, Para isso injetaram extrato de cérebro de pacientes com Alzheimer no
cérebro de primatas não humanos. De modo independente o grupo de pesquisadores
liderado por Rosalind RidIey e Harry Baker, naquele momento no Clinical Research
Center, in Harrow, na Inglaterra, fizeram experimentos semelhantes. Os resultados dos
estudos de Gajdusek foram inconclusivos e nenhum dos grupos reportou o
desenvolvimento completo de Alzheimer. Os pesquisadores britânicos encontraram, no
entanto, a indicação de um efeito: depois de um período de incubação de pelo menos
cinco anos, placas de Aß eram mais abundantes em saguís que receberam a injeção do
extra to que no grupo de controle.
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Nesse ponto, nossa equipe iniciou estudos para verificar se pequenos agregados
de Aß retorcidas atuam como sementes que promovem a reação em cadeia de
adulteração e aglomeração de proteínas e provocam depósitos de proteínas que
sobrecarregam o cérebro na doença de Alzheimer. O longo período de incubação para a
formação das placas nos macacos, porém, nos desencorajava.
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Nossa perspectiva mudou consideravelmente em meados da década de 90, com o
advento de camundongos transgênicos geneticamente modificados para produzir a
proteína precursora do fragmento Aß humano, a APP (proteína precursora de amiloide).
Iniciamos uma série de experimentos para explorar a hipótese da Aß-semente nesses
camundongos com um grupo de talentosos colaboradores e estudantes. Os animais
transgênicos não incorporam todas as características do mal de Alzheimer (que parece
uma exclusividade dos humanos), mas oferecem vantagens consideráveis para nossos
experimentos. São pequenos, fáceis de manter, têm vida curta e desenvolvem depósitos
Aß no cérebro espontaneamente em uma idade relativamente consistente.
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Nós nos concentramos no estudo de Aß em vez de tau porque, apesar de placas e
emaranhados de ambas contribuírem para a neurodegeneração que provoca demência
na doença de Alzheimer, a maior parte das evidências indicava que Aß retorcida é
catalisador essencial para o desenvolvimento da doença. Na verdade, muitos dos fatores
de risco genético conhecidos para a doença de Alzheimer influenciam processos celulares
envolvidos com a produção, dobramento, agregação ou remoção de Aß. As mutações
genéticas que levam ao aparecimento da doença em idades muito precoces alteram APP
ou as enzimas que separam Aß desse precursor.
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Os cientistas atualmente sabem que o cérebro começa a mostrar sinais de
Alzheimer pelo menos uma década antes de os sintomas aparecerem e que o acúmulo
anormal de proteínas ocorre muito cedo no processo da doença. Ciente de que o acúmulo
de Aß retorcida é um importante catalisador para o desenvolvimento do mal de Alzheimer,
queríamos saber o que iniciava a agregação das proteínas.
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Em nossos primeiros experimentos nos propusemos a determinar se extratos de
tecido cerebral de pacientes que morreram de Alzheimer deflagrariam a agregação de Aß
no cérebro de camundongos transgênicos APP. Em outras palavras, poderíamos induzir e
propagar a agregação de Aß imitando a ação dos príons nas encefalopatias
espongiformes? Usando metodologias desenvolvidas para o estudo desses príons,
tomamos pequenas amostras de cérebro de pessoas que morreram tanto com Alzheimer
quanto outras causas. Fragmentamos o tecido e removemos os componentes maiores por
breve centrifugação. Injetamos uma pequena quantidade do extrato resultante diluído no
cérebro de jovens camundongos transgênicos.
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Os resultados foram positivos. Três a cinco meses depois, antes que os
camundongos gerassem suas próprias placas Aß, observamos uma quantidade
substancial de agregados Aß no cérebro dos animais que receberam extra tos de
cérebros com Alzheimer. O grau de formação de placas de Aß era proporcional à
quantidade de Aß no extra to injetado e ao tempo de incubação - resultados compatíveis
com a hipótese de os extra tos terem provocado o acúmulo de placas. E o que foi crucial:
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extratos que não continham agregados de Aß não provocaram a formação de placas nos
camundongos transgênicos.
DEFININDO A Aß-SEMENTE
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Apesar de as experiências mostrarem que a deposição de Aß pode ser iniciada por
extratos de cérebro com Alzheimer, elas não certificam que Aß dos extratos são
responsáveis pela formação das placas.
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Essa incerteza nos obrigou a abordar várias questões adicionais. Primeiro,
perguntamos se os depósitos de Aß que vimos nos ratos foram apenas do material
injetado. A resposta foi não: uma semana após a injeção, não havia qualquer evidência de
agregado Aß no cérebro. Ao contrário, as placas só se tornaram evidentes apenas após
um intervalo de um mês ou mais.
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Em segundo lugar, consideramos a possibilidade de que a formação de placa
tenha sido estimulada por algum componente do extrato de cérebro humano que não Aß,
talvez um vírus humano. Descartamos essa possibilidade confirmando que os extratos
provenientes de cérebro idoso, mas livre de patógenos, de camundongos transgênicas
APP possa promover o acúmulo de placas de forma tão eficaz quanto extratos de cérebro
humano, desde que as amostras contenham agregados de Aß. Além disso, como extratos
de cérebro sem Alzheimer não produziram agregação de Aß, podemos eliminar a
possibilidade de que as placas fossem apenas uma resposta à lesão cerebral decorrente
da injeção do extrato.
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Os resultados apontavam fortemente Aß como o agente, mas queríamos uma
prova mais direta, Nosso terceiro passo foi remover seletivamente Aß dos extratos
cerebrais usando anticorpos específicos. Esse procedimento simples suprimiu a
capacidade de amostras de cérebro com Alzheimer induzirem a formação de placas.
Finalmente, quando usamos um ácido forte para desdobrar as proteínas deformadas o
extra to não induziu a formação de placa. Confirmamos, assim, que a forma da proteína
regula a sua capacidade de induzir a deformação e a agregação de outras moléculas.
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Estávamos então razoavelmente convencidos do papel de semente ativa da Aß
retorcida nas amostras de cérebro, mas uma parte do problema permanecia elusiva, Se o
agregado de Aß sozinho atua como semente, deveria ser possível induzir a formação de
placas com Aß sintetizada e colocada para se aglutinar em um tubo de ensaio, sem todas
as outras substâncias presentes no cérebro. Sabíamos que a semeadura com proteínas
sintéticas poderia ser desafiadora, pois estudos com príons haviam mostrado que material
de laboratório pode diferir de forma sutil, mas aparentemente importante, do que é isolado
diretamente do cérebro.
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Com essa restrição em mente injetamos várias formas de agregados sintéticos Aß
em camundongos transgênicos APP e aguardamos o período de incubação habitual de
três a cinco meses. Os resultados foram desapontadores. Não havia evidências de início
de formação durante o período. Recentemente, entretanto, Prusiner, Jan Stõhr, Kurt Giles
e seus colaboradores na University of California em São Francisco injetaram fibras
sintéticas Aß no cérebro de camundongos transgênicos APP. Após um prolongado período
de incubação de mais de seis meses os animais mostraram evidência clara de deposição
de Aß semeada na cérebro. Apesar de as sementes sintéticas terem se revelada menos
patentes que as naturalmente produzidas, os resultadas são uma demonstração
convincente da capacidade de agregadas de Aß isolados, sem qualquer outro fator,
estimular a formação de depositadas de Aß na cérebro.
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Mais recentemente passamos a investigar as propriedades das semente Aß que
promovem a aglomeração de proteínas na cérebro. Esperávamos que fibras longas e
insolúveis nas quais aAß está contida fossem as sementes mais eficazes. Os resultadas
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nas surpreenderam. Ao fracionar extratos cerebrais ricos em Aß por ultracentrifugação,
obtivemos duas fases: um pellet insolúvel contendo a maior parte das fibras Aß na parte
inferior da tuba e um sobrenadante líquida clara contendo formas muito pequenas e
solúveis da proteína Aß. A maior parte de Aß se depositou no fundo e, conforme
antecipamos, essa porção foi capaz de induzir agregação de Aß na cérebro de
camundongos transgênicos de forma tão eficiente quanta os extratos cerebrais.
Inesperadamente, no entanto, a porção solúvel também induziu forte agregação e
formação de placas, apesar de conter menos de 1 milésimo da quantidade de Aß da
pellet. E mais: as sementes solúveis foram prontamente degradadas por uma enzima, a
proteinase K, o que não ocorreu com as sementes insolúveis,
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A variabilidade da tamanha e da fragilidade de sementes Aß é, ao mesmo tempo,
uma notícia boa e má. A má é que pequenas agregados solúveis, capazes de se
movimentar pela cérebro com mais facilidade que as fibras maiores, são sementes
particularmente potentes. Em contraposição, sua sensibilidade à ação da enzima
proteinase K indica que sementes solúveis podem ser especialmente vulneráveis a
tratamentos programadas para eliminá-las da cérebro. A solubilidade das pequenas
sementes ainda pode torná-las rapidamente detectáveis nas fluidos corporais e, assim,
funcionar cama sentinelas moleculares para a diagnóstico precoce de Alzheimer,
possivelmente bem antes da manifestação da demência.
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Como a semeadura por proteína está aparentemente relacionada aos primeiros
estágios da doença, descobrir formas para detectar e neutralizar as sementes poderia
evitar danos cerebrais e demência.
ALÉM DO ALZHEIMER
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A Natureza raramente perde oportunidade de explorar um mecanismo para
múltiplas finalidades e a agregação de proteína por semeadura não é exceção. Ocorre
não só em doenças mas também em processos benéficos. Na década de 90, por
exemplo, Reed Wickner, do Natíonal Institutes of Health, propôs que algumas proteínas
fúngicas utilizam a estratégia para ajudar na sobrevivência celular, postulado que tem sido
confirmado em várias laboratórios, Além disso, Susan Lindquist.do Massachusetts
Institute of Technolagy, e Eric R. Kandel, da Columbia University, têm defendido a
hipótese intrigante de que a propagação de proteínas específicas semelhante à
provocada par príons ajuda a estabilizar os circuitos cerebrais, atuando para preservar
memórias de longo praza.
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Até agora, no entanto, a maior parte da pesquisa descreve a papel da agregação
semeada de proteínas em doenças. Proteínas cuja agregação par semente tem sido
implicada em doenças cerebrais incluem ∂-sinucleína (em Parkinson), superóxido
dismutase-l (na esclerose lateral amiotrófica ou ALS, na sigla em inglês), proteinopatia
TDP-43 (em ALS e demência frontotemporal), huntingtina (na doença de Huntington), e
tau (em doenças neurodegenerativas). Diversas outras doenças neurodegenerativas
envolvem agregação de proteínas e será importante verificar se o princípio da semeadura
também se aplica a elas.
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Novos estudos mostram que algumas proteínas envolvidas na regulação dos
genes incluem um mecanismo semelhante ao desencadeado por príon, isto é, uma
sequência de aminoácidos que confere a uma proteína a capacidade de induzir outra
molécula a assumir forma semelhante à sua. Pela sua natureza essas proteínas tendem a
se agregar, propensão que pode ser potencializada por certas mutações. E, uma equipe
de pesquisa liderada por J. Paul Taylor, do St. Jude Children's Research Hospital, e
James Shorter, da University of Pennsylvania, relatou que mutações nos domínios
semelhantes a príons das proteínas que se ligam a ácidos nucleicos, chamadas
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hnRNPA2Bl e hnRNPAl, provocam proteinopatia mutissistêmica, doença complexa que
afeta o sistema nervoso, músculos e ossos. A agregação por semeadura também vem
sendo demonstrada experimentalmente em proteínas que levam a distúrbios fora do
sistema nervoso, como amiloidose - e o espectro de patologias que envolvem a
propagação de proteínas de modo semelhante ao príon pode continuar a crescer.
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Se pretendemos fazer com que a nossa crescente compreensão do conceito de
semeadura resulte em terapias precisamos estabelecer como as proteínas retorcidas
provocam danos às células e aos tecidos. Essas informações podem ajudar a bloquear os
prejuízos mesmo que seja difícil impedir a própria agregação da proteína. As pesquisas
mostram que os agregados de proteínas podem debilitar as células de diversos modos de interações tóxicas entre os agre. gados e os componentes celulares a bloqueio de
proteínas normais -, impedindo que cheguem aos lugares onde são funcionais. Ao mesmo
tempo, temos de compreender mais detalhadamente como as proteínas patogênicas
surgem, se degradam e em que condições elas se contorcem e formam sementes.
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O esclarecimento dos mecanismos pelos quais as células adquirem, transportam e
secretam proteínas-semente certamente possibilitará novas interpretações sobre o
desenvolvimento da doença. Finalmente, uma questão crítica ainda sem resposta é por
que o envelhecimento aumenta tão significativamente o risco de doença
neurodegenerativa. As respostas a essas perguntas podem sugerir novas formas de
desvendar proteínas patogênicas,
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O peso da evidência favorece a noção considerada heterodoxa tempos atrás: uma
simples mudança de forma pode transformar uma proteína de amiga em inimiga.
Enquanto descrevia a descoberta do príon durante sua conferência como premiado com o
Nobel, Prusiner previu que o processo básico pelo qual os príons envolvidos na vaca
louca e doenças relacionadas impõem suas características tóxicas a proteínas normais
seria encontrado em outras doenças degenerativas. A última década testemunhou a
confirmação experimental dessa previsão. De fato, a agregação da proteína de modo
semelhante ao príon pode explicar a origem de algumas das doenças mais temidas da
velhice e dar um quadro conceitual convincente que um dia pode se traduzir em
tratamentos que alterem a progressão inexorável de doenças neurodegenerativas.