UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
POLIMORFISMO DO GENE TP53 (CÓDON 72) EM INDIVÍDUOS PORTADORES
DE GLAUCOMA PRIMÁRIO DE ÂNGULO FECHADO
MARCELO JORDÃO LOPES DA SILVA
RIBEIRÃO PRETO
2011
MARCELO JORDÃO LOPES DA SILVA
POLIMORFISMO DO GENE TP53 (CÓDON 72) EM INDIVÍDUOS PORTADORES
DE GLAUCOMA PRIMÁRIO DE ÂNGULO FECHADO
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto de São Paulo, para obtenção do
Titulo de Doutor em Ciências Médicas.
Área
de
Concentração:
Mecanismos
Fisiopatológicos no Sistema Visual e ÁudioVestibular.
Orientadora: Profa. Dra. Maria de Lourdes Veronese Rodrigues
Ribeirão Preto
2011
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL E PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA
Silva, Marcelo Jordão Lopes da
Polimorfismo do gene TP53 (CÓDON 72) em indivíduos
portadores de Glaucoma Primário de Ângulo Fechado. Marcelo Jordão
Lopes da Silva, Ribeirão Preto, SP.
118p. ; 30 cm
Tese de Doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão
Preto/USP.
Área
de
concentração:
Mecanismos
Fisiopatológicos nos Sistemas Visual e Áudio-Vestibular.
Orientador: Rodrigues, Maria de Lourdes Veronese
1. Gene TP53; 2. Genética; 3. Glaucoma Primário de Ângulo Fechado;
4. Apoptose; 5. Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto. Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e
Cirurgia de Cabeça e Pescoço.
BANCA EXAMINADORA DA TESE DE DOUTORADO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
Presidente da Banca: Prof. Dr. ........................................................................
Prof. Dr. ............................................................................................................
Prof. Dr. ...........................................................................................................
Prof. Dr. ...........................................................................................................
Prof. Dr. ...........................................................................................................
Curso de Pós-graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo.
Aprovada em: ____/____/____
iv
Dedicatória
A minha amada esposa Iara, pelo
apoio incessante e companheirismo.
As minhas amadas filhas Julia e
Lara, pelo carinho e amor.
Aos meus amados pais, Nelson e
Arlene, pela dedicação abnegada à
minha formação.
À minha família, pelo apoio.
v
A Professora Dra. Maria de Lourdes
Veronese Rodrigues
Orientadora desta Tese, amiga e
mestre, por seu apoio, incentivo e
ensinamentos.
vi
Agradecimentos
Ao
Prof.
Dr.
Remo
Susanna
Junior,
meu
professor,
por
me
ensinar
apaixonadamente o caminho das atividades acadêmica e profissional.
Ao Prof. Dr. Jorge Alberto F. Caldeira, pelo ingresso no Hospital das Clínicas da
FMUSP. e pelo exemplo profissional.
Ao Prof. Dr. Newton Kara José, que me orientou, com seus exemplos, para o
caminho das atividades acadêmica e profissional.
Aos Profs. Drs. Roberto F. S. Malta, Marcelo Nicolela, Alberto Jorge Betinjane, por
seus ensinamentos e amizade.
Aos colegas e funcionários do Departamento de Oftalmologia do Hospital das
Clínicas do FMRP, pela amizade e apoio.
À Biomédica Dra. Neifi H. S. Dhegaide e Dra. Márcia Abelin Vargas por sua
importante ajuda, em todas as fases deste Trabalho.
Ao Prof. Dr. Eduardo Antonio Donadi, por autorizar a utilização do Laboratório de
Imunologia Molecular do HCFMRP-USP, sem o qual este Trabalho não seria
realizado.
Ao Prof. Dr. Carlos Akira Omi, meu amigo, por seus ensinamentos e exemplo
profissional.
Ao Prof. Dr. Vital Paulino Costa, meu amigo, que me orientou, com seus exemplos,
para o caminho das atividades acadêmica e profissional.
Ao Prof. Dr. Jayter Silva de Paula, meu amigo, por seus ensinamentos, apoio nesta
Tese e exemplo profissional.
vii
Sumário
DEDICATÓRIA ..........................................................................................................iv
AGRADECIMENTOS.................................................................................................vi
LISTA DE QUADROS E TABELAS ..........................................................................ix
LISTA DE FIGURAS...................................................................................................x
LISTA DE ABREVIATURAS......................................................................................xi
RESUMO...................................................................................................................xii
ABSTRACT..............................................................................................................xiii
1. INTRODUÇÃO.....................................................................................................14
1.1
Revisão Bibliográfica sobre Glaucoma Primário de Ângulo Fechado............... 15
1.1.1
Aspectos Gerais............................................................................................ 15
1.1.2
Histórico ........................................................................................................ 15
1.1.3
Prevalência ................................................................................................... 17
1.1.4
Aspectos gonioscópicos................................................................................ 20
1.1.5
Mecanismos de fechamento angular ............................................................ 21
1.1.6
Classificação................................................................................................. 25
1.1.7
Fatores de risco ............................................................................................ 29
1.1.7.1
Fatores ecobiométricos ............................................................................. 29
1.1.7.2
Fatores demográficos................................................................................ 30
1.1.7.3
Outros fatores de risco .............................................................................. 32
1.1.8
Evolução ....................................................................................................... 34
1.1.9
Tratamento.................................................................................................... 38
1.2
Genética e Glaucoma ....................................................................................... 39
1.3
Gene TP53 ....................................................................................................... 44
1.3.1
Aspectos gerais............................................................................................. 44
1.3.1.1
Localização e estrutura do gene TP53...................................................... 45
1.3.1.2
Proteína p53.............................................................................................. 45
1.3.2
Polimorfismo do gene TP53.......................................................................... 46
1.3.3
Glaucoma e a expressão do gene TP53....................................................... 47
viii
2. OBJETIVOS ........................................................................................................ 49
3. MÉTODO ............................................................................................................. 51
3.1
Casuística......................................................................................................... 52
3.2
Critérios de Inclusão ......................................................................................... 52
3.3
Critérios de Exclusão........................................................................................ 54
3.4
Controle populacional ....................................................................................... 54
3.5
Método.............................................................................................................. 54
3.5.1
Coleta de sangue e extração do DNA........................................................... 55
3.5.2
Amplificação do DNA e restrição enzimática ................................................ 55
3.6
Análise Estatística ............................................................................................ 60
4. RESULTADOS .................................................................................................... 61
5. DISCUSSÃO........................................................................................................ 72
6. CONCLUSÕES.................................................................................................... 80
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................82
8. ANEXOS.............................................................................................................. 97
Anexo 1 - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ..................... 98
Anexo 2 - Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa................................................. 99
Artigo para Publicação (portugues) ......................................................................... 100
Artigo para Publicação (ingles)................................................................................ 110
ix
Lista de quadros e tabelas
Quadro 1.
Loci genéticos descritos para o glaucoma primário de ângulo aberto .....43
Tabela 1.
Distribuição dos genótipos Pro/Pro, Arg/Arg e Arg/Pro nos pacientes
com GPAF .......................................................................................... 63
Tabela 2.
Distribuição dos genótipos Pro/Pro, Arg/Arg e Arg/Pro nos 72
controles ............................................................................................. 65
Tabela 3.
Freqüência genotípica dos grupos com GPAF e do grupo- controle,
de acordo com o polimorfismo (PRO/PRO, ARG/ARG e ARG/PRO)
do gene TP53 (códon 72) ................................................................... 68
Tabela 4.
Freqüência alélica dos grupos com GPAF e do grupo- controle, de
acordo com o polimorfismo do gene TP53 (códon 72) ....................... 68
Tabela 5. Freqüência alélica dos grupos com GPAF, com história de crise e do
grupo-controle, de acordo com o polimorfismo do gene TP53
(códon 72) .......................................................................................... 69
Tabela 6.
Freqüência alélica dos grupos com GPAF, sem história de crise e
do grupo-controle, de acordo com o polimorfismo do gene TP53
(códon72) ............................................................................................ 69
Tabela 7.
Freqüência alélica dos grupos com GPAF, sem história de crise, de
acordo com o polimorfismo do gene TP53 (códon 72) ........................ 70
Tabela 8.
Freqüência alélica nos pacientes com GPAF, considerando-se o
dano do nervo óptico, de acordo com o polimorfismo do gene TP53
(códon 72) .......................................................................................... 70
Tabela 9.
Freqüência alélica dos grupos com GPAF com crise, considerandose o dano do nervo óptico, de acordo com o polimorfismo do gene
TP53 (códon 72) ................................................................................. 71
Tabela 10.
Freqüência alélica dos grupos com GPAF sem crise, considerandose o dano do nervo óptico, de acordo com o polimorfismo do gene
TP53 (códon 72) ................................................................................. 71
x
Lista de figuras
Figura 1.
Eletroforese em gel de poliacrilamida, seguida de coloração com
nitrato de prata ................................................................................... 62
xi
Lista de abreviaturas
ARG
arginina
CGR
células ganglionares da retina
CAX
comprimento axial
DNA
ácido desoxirribonucléico
DPAC
diâmetro ântero-posterior do cristalino
FMRP – USP
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de São
Paulo
GPAA
glaucoma primário de ângulo aberto
GPAF
glaucoma primário de ângulo fechado
HCFMRP – USP Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo
HSPE
Hospital dos Servidores Público Estadual
kDa
KiloDalton
MYOC
gene miocilina
NO
nervo óptico
OPTN
gene optineurina
OR
Odds Ratio
pb
pares de base
PCR
Polymerase Chain Reaction
PIO
pressão intra-ocular
Pro
prolina
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
SNP
Single Nucleotide Polymorphism
‫א‬2
qui-quadrado
xii
Resumo
Os objetivos deste Estudo são: determinar as distribuições alélicas e genotípicas do
polimorfismo do gene TP53 (códon 72), em pacientes brasileiros com glaucoma
primário de ângulo fechado (GPAF), em comparação a controles sadios e verificar a
associação alélica (Prolina e Arginina) do gene TP53 (códon 72) com GPAF, sem e
com história de crise aguda por bloqueio pupilar. O diagnóstico de GPAF foi
baseado na biomicroscopia, gonioscopia, tonometria, biomicroscopia de fundo do
olho e perimetria visual computadorizada. O ácido desoxirribonucléico (DNA) foi
amplificado, através da reação em cadeia catalisada pela polimerase. A região do
éxon 4, do gene TP53, foi amplificada e digerida através da enzima de restrição
BseDI. A análise estatística foi realizada pelo teste do Qui-Quadrado (‫א‬2), com
correção de Yates, ou pelo teste exato de Fisher Bicaudal, quando necessário (p <
0,05). Foram avaliados 66 pacientes com GPAF e 72 controles normais para este
estudo. A média de idade dos indivíduos foi de 65,64 ± 10,33 anos; nos 47
pacientes, no grupo com GPAF, com história de crise aguda, a idade foi de 66,2 ±
8,7 anos e nos 19 pacientes com GPAF, sem história de crise aguda, foi de 63,9 ±
14,1 anos; 43 pacientes (65,1%) eram do sexo feminino; 64 pacientes (97,2%) eram
brancos. Nesse estudo concluiu-se que não houve diferença significativa na
freqüência genotípica para o polimorfismo (PRO/PRO, ARG/ARG e ARG/PRO) do
gene TP53 (códon 72), entre grupo com GPAF e do grupo controle (p = 0,3984) e,
para os alelos (PRO e ARG), houve diferença significativa entre o grupo com GPAF,
com crise aguda, em comparação ao grupo com GPAF, sem crise (p = 0,0251). Os
resultados indicam associação dos genótipos do polimorfismo do gene TP53 (códon
72) nos pacientes com GPAF, com história de crise aguda de glaucoma.
Palavras-chave: gene TP53, glaucoma primário de ângulo fechado, genética,
apoptose.
xiii
Abstract
The objectives of this study are: to determine the allelic and genotypic polymorphism
of the TP53 gene (codon 72) in Brazilian patients with GPAF and in healthy controls
and verify the allelic association (Proline and Arginine) TP53 (codon 72) with primary
angle closure glaucoma (PACG) with and without history of acute crisis for pupillary
block. Sixty-six patients with GPAF for this study and 72 normal controls were
consecutively recruited. The mean age of subjects was 65.6 ± 10.3 years; 47 patients
in the GPAF with a history of acute crisis age was 66.2 ± 8.7 years and 19 patients
with no history of crisis GPAF acute was 63.9 ± 14.1 years; 43 patients (65.1%) were
female; 64 (97.2%) were white. The diagnosis was based on the observation of
typical fundings of GPAF biomicroscopy, gonioscopy, tonometry, ophthalmoscopy
and perimetry. Desoxirribonucleico acid (DNA) was amplified through the chain
reaction catalyzed by polymerase. The region of exon 4 of TP53 was amplified and
digested by restriction enzyme BseDI. Statistical analysis was performed by chisquare (‫ א‬2) with Yates correction or by two-tailed Fisher exact test when necessary
(p <0.05). This study funded that: there was no significant difference in genotype
frequency for the polymorphism (PRO / PRO, ARG / ARG and ARG / PRO) of the
TP53 gene among GPAF group and control group (p = p = 0.3984) and the alleles
(ARG and PRO) were significant differences between the groups with GPAF with
acute compared with the group without GPAF crisis (p = 0.0251). The results indicate
that the genotype of the TP53 polymorphism (codon 72) in patients with GPAF with a
history of acute glaucoma.
Keywords: TP53, angle closure glaucoma, genetics, apoptosis.
1.
INTRODUÇÃO
Introdução | 15
1.1
Revisão Bibliográfica sobre Glaucoma Primário de Ângulo Fechado
1.1.1 Aspectos Gerais
O glaucoma primário de ângulo fechado (GPAF) é uma doença que apresenta
como característica comum a aposição mecânica da malha trabecular pela periferia
da íris. Por mecanismos ainda desconhecidos, esta aposição leva a goniosinéquias,
resultando na obstrução do trabeculado filtrante e conseqüente aumento da pressão
intra-ocular (PIO). Dessa forma, o processo de fechamento angular, com
conseqüente aumento da PIO, pode ocasionar dano glaucomatoso do nervo óptico
(RITCH, R. E LOWE, R., 1996b).
1.1.2 Histórico
O primeiro relato associando o aumento da PIO com o glaucoma foi descrito
na literatura por AT TABARI* (século X), citado por DUKE-ELDER (1969). Esse
autor descreveu um quadro clínico com processo inflamatório crônico, associado a
aumento da pressão intra-ocular.
Em 1969, DUKE-ELDER (1969) relatou que, nos livros de aforismo
hipocrático (460 a.C. e 397 a.C.), o termo glaucoma era utilizado para descrever a
cegueira advinda da cor da pupila opaca e esverdeada. Nesta época, o glaucoma e
a catarata ainda eram considerados como uma única doença.
Sams-ad-Din** (1348) citado por DUKE-ELDER (1969), descreveu um quadro
clínico caracterizado por dor ocular, cefaléia hemicraniana e opacidade dos
humores, seguida por dilatação pupilar e catarata. Esta condição foi definida pelo
autor como “enxaqueca ocular” ou “cefaléia pupilar”.
* Duke-Elder S. Disease of the lens and vitreous; glaucoma and hypotony. In: System of
Ophthalmology, London, v.XI, 1969.p.380-381.11
** Sams-ad-Din. Duke-Elder S. Disease of the lens and vitreous; glaucoma and hypotony. In: System
of Ophthalmology, London, v.XI, 1969.p.380-381.
Introdução | 16
O reconhecimento do glaucoma como uma doença específica aconteceu em
1622, quando Banister*, citado em DUKE-ELDER (1969), descreveu um quadro
clínico caracterizado por aumento crônico da pressão intra-ocular, ausência de
percepção luminosa e pupila fixa.
Entretanto, o conceito de glaucoma como uma patologia caracterizada pelo
aumento da pressão intra-ocular, somente foi aceito, na Europa, em 1818 com a
publicação do livro “Traité des Maladies des Yeux”, escrito por Antoine–Pierre
Demours** (1818), citado por DUKE-ELDER (1969).
Lawrence*** (1829) citado por RITCH, R. E LOWE, R. (1996b), utilizou o
termo glaucoma agudo, pela primeira vez, para descrever um quadro de inflamação
ocular severa.
O processo de reconhecimento do glaucoma de ângulo fechado como uma
forma distinta de glaucoma aconteceu de maneira lenta e gradativa (Ritch, R. e
Lowe, R., 1996b).
O conceito da obstrução fisiológica da passagem do humor aquoso pela
pupila (bloqueio pupilar) foi introduzido por Curran**** (1920), citado por RITCH, R. E
LOWE, R. (1996b).
Em 1923, Raeder*****, citado por RITCH, R. E LOWE, R. (1996b), diferenciou
casos de glaucoma com profundidade da câmara anterior rasa dos casos com
câmara anterior com profundidade normal ou aumentada.
* Banister R. Duke-Elder S. Disease of the lens and vitreous; glaucoma and hypotony. In: System of
Ophthalmology, London, v.XI,1969.p.380-381.
** Demours, AP. Duke-Elder S. Disease of the lens and vitreous; glaucoma and hypotony. In: System
of Ophthalmology, London, v.XI,1969.p.380-381.
*** Lawrence W. Lectures on surgery: medical and operative, lectures LXX-LXXII. Lancet 1829;1:705.
**** Curran EJ. A new operation for glaucoma involving a new principle in the aetiology and treatment
of chronic primary glaucoma. Arch Ophthalmol 1920;49:131,
***** Raeder J. Untersuchungen der lage und Dicke der Linse im menschlichen Augen bei
physiologischen und pathologischen Zustanden nach einer neuen methode gemessen. Arch of
Ophthalmol 1923;112:44.
Introdução | 17
Em 1931, Curran*, citado por RITCH, R. E LOWE, R. (1996b), relatou a
eficácia da iridectomia periférica em casos de glaucoma com câmara anterior rasa,
mas não nos casos com câmara anterior normal.
Foi somente em 1938 que Barkan**, citado por RITCH, R. E LOWE, R.
(1996b), descreveu a abertura do seio camerular, após a realização da iridectomia
periférica e introduziu o termo glaucoma de ângulo fechado.
1.1.3 Prevalência
QUIGLEY (1996) estimou que o número de pessoas afetadas por glaucoma,
em todo o mundo, seria de aproximadamente 66,8 milhões. Isso se confirmou no
estudo de QUIGLEY, FRIEDMAN et al. (2003) em que se constatou que a
prevalência de glaucoma, em todo o mundo, era de mais de 50 milhões de pessoas.
Aproximadamente um terço destes pacientes eram portadores de GPAF QUIGLEY,
FRIEDMAN et al. (2003), principalmente devido às altas taxas de prevalência
relatadas na população dos países asiáticos (FOSTER, BAASANHU et al., 1996;
DANDONA, DANDONA et al., 2000; FOSTER, OEN et al., 2000; FOSTER E
JOHNSON, 2001; FOSTER, BUHRMANN et al., 2002).
A maioria dos estudos epidemiológicos utilizou diferentes critérios para o
diagnóstico do GPAF (FOSTER, BUHRMANN et al., 2002). Apesar desta falta de
uniformidade nas definições utilizadas, a prevalência do glaucoma de ângulo
fechado parece variar consideravelmente entre os grupos étnicos avaliados. Assim,
acredita-se que a prevalência desta doença seja bem maior em esquimós e
asiáticos, quando comparados com populações da Europa e dos Estados Unidos
(SALMON, 1999a; FOSTER, BUHRMANN et al., 2002).
* Curran, EJ. Peripheral iridotomy in acute and chronic glaucoma: some results after 10 years
duration: anatomical classification of glaucoma. Trans Ophthalmol Soc UK 1931;51:520.
** Barkan O. Glaucoma: classification, causes, and surgical control. Am J Ophthalmol 1938;21:1099.
Introdução | 18
As populações da África e as de origem latina apresentariam uma taxa de
prevalência intermediária, quando comparados aos Asiáticos e Europeus (ALSBIRK,
1975b; QUIGLEY, 1996; SALMON, 1999b; FOSTER, 2002; WANG, WU et al.,
2002).
ALSBIRK (1975b), avaliando uma população de esquimós da Groenlândia,
observou uma das maiores taxas de prevalência de glaucoma de ângulo fechado em
todos : 5,1% em mulheres e 1,6% em homens acima de 40 anos de idade.
Uma pesquisa, realizada em sete cidades do Japão, avaliou 8.126 indivíduos
e observou a prevalência de 0,4% em mulheres e 0,2% em homens. Nesse estudo,
os casos diagnosticados como glaucoma de ângulo fechado incluíam indivíduos que
apresentavam elevação da PIO e seio camerular estreito, independente da presença
de goniosinéquias e lesão glaucomatosa estrutural e/ou funcional (SHIOSE,
KITAZAWA et al., 1991).
Na África do Sul, foram estudados 987 indivíduos com mais de 40 anos de
idade: metade da amostra era originária das regiões do Sudeste da Ásia e a outra
metade apresentava ascendência africana. A prevalência do glaucoma de ângulo
fechado, nessa população, foi de 2,3% (23/987) e os critérios diagnósticos exigiam a
presença de ângulo oclusível, associado a várias combinações de outros achados
clínicos relacionados com PIO, oftalmoscopia direta e resultados de perimetria
automatizada. Contudo, apenas oito dos 23 pacientes diagnosticados como casos
de glaucoma de ângulo fechado apresentavam neuropatia óptica glaucomatosa
(SALMON, MERMOUD et al., 1993).
Estudos epidemiológicos, realizados no Continente Asiático, vêm observando
altas taxas de prevalência do GPAF (FOSTER, BAASANHU et al., 1996; DANDONA,
DANDONA et al., 2000; FOSTER, OEN et al., 2000; FOSTER E JOHNSON, 2001).
Introdução | 19
Utilizando a classificação de FOSTER, OEN et al., 2000; FOSTER e
JOHNSON, 2001 para fechamento angular primário, foram avaliadas duas
populações, acima de 40 anos de idade do Sudeste asiático.
Na população proveniente da área rural da Mongólia, observou-se que 2%
dos indivíduos apresentavam fechamento angular primário e 0,8% apresentavam
GPAF (fechamento angular primário associado à neuropatia óptica glaucomatosa)
(FOSTER, BAASANHU et al., 1996). Na população, proveniente da área urbana de
Singapura, foram observados resultados praticamente idênticos, ou seja, 2,2%
apresentavam fechamento angular primário, e 0,8% apresentavam GPAF (FOSTER,
OEN et al., 2000; Foster e Johnson, 2001).
Nos países da Europa, de modo geral, a prevalência do glaucoma de ângulo
fechado se encontra ao redor de 0,1%, em indivíduos acima de 40 anos (FOSTER,
2002).
No Brasil, um estudo epidemiológico avaliou um total de 1772 indivíduos, que
representavam 83% da população com mais de 40 anos de idade, em dois bairros
da cidade de Piraquara (PR) (SAKATA, SAKATA et al., 2007). O diagnóstico do
GPAF exigia a presença de sinais de fechamento angular prévio, associado a um
dos seguintes critérios: lesão estrutural tipicamente glaucomatosa avançada (razão:
escavação-disco maior que 0,8 com afinamento localizado da rima neural) ou lesão
estrutural tipicamente glaucomatosa, associada a defeitos de campo visual
(SAKATA, SAKATA et al., 2007). A prevalência do GPAF foi de 0,65% (11 casos) e
representou 16% de todos os casos de glaucoma diagnosticados nessa população
(SAKATA, SAKATA et al., 2007).
Introdução | 20
1.1.4 Aspectos gonioscópicos
A avaliação gonioscópica é o exame mais importante para a detecção dos
olhos com ângulos oclusíveis (WILENSKY, RITCH et al., 1996). A gonioscopia de
indentação é praticamente indispensável na diferenciação do fechamento angular
aposicional do fechamento angular por sinéquias anteriores periféricas (WILENSKY,
RITCH et al., 1996). Entretanto, esse exame demanda uma técnica apurada e a
correta interpretação dos seus resultados depende da experiência do examinador.
Segundo WILENSKY, RITCH et al. (1996), os sinais gonioscópicos mais
importantes, na identificação de um olho sob alto risco de oclusão angular, são as
goniosinéquias e o “sinal da impressão” de pigmentos irianos na parede do seio
camerular. Esses sinais não só indicam que o ângulo é oclusível como, de fato,
representam seqüelas de um episódio de fechamento angular prévio.
O grande desafio ao oftalmologista é identificar ângulos oclusíveis em olhos
que não apresentam goniosinéquias, mas apresentam um ângulo estreito à
gonioscopia.
Na população geral, existem muito mais indivíduos que apresentam seio
camerular estreito do que pacientes que realmente desenvolvem uma crise de GPAF
assintomático (WILENSKY, RITCH et al., 1996). Acredita-se que, aproximadamente,
2% da população caucasiana apresentem olhos com ângulo estreito e apenas 0,1%
irá apresentar episódio de fechamento angular(WILENSKY, RITCH et al., 1996).
WILENSKY, KAUFMAN et al. (1993) realizaram um estudo prospectivo em
127 olhos considerados sob risco de apresentarem episódio de fechamento angular,
por meio do exame de gonioscopia. Esses casos foram seguidos, sem tratamento,
por um período médio de 2,7 anos. Durante este período, 20% (25/127) desses
Introdução | 21
olhos desenvolveram episódios de fechamento angular, sendo que 17 apresentaram
episódios assintomáticos (WILENSKY, RITCH et al., 1996).
MAPSTONE (1981) avaliou prospectivamente 202 olhos contralaterais de
pacientes que apresentaram glaucoma agudo unilateral. Esse autor observou que,
mesmo sem tratamento, 34% dos olhos contralaterais não apresentaram glaucoma
agudo, durante um período de seguimento de 10 anos.
1.1.5 Mecanismos de fechamento angular
O
GPAF
ocorre
em
olhos
anatomicamente
predispostos,
em
que
determinadas estruturas apresentam alterações no seu tamanho absoluto ou
relativo, como também, na sua posição dentro do globo ocular (RITCH, R. e LOWE,
R., 1996a; TELLO, TRAN et al., 2002).
Essas relações anatômicas anormais levam a um complexo conjunto de
forças, no segmento anterior do olho, que apresentam, como resultado final, a
aposição da periferia da íris sobre a malha trabecular (RITCH, R. E LOWE, R.,
1996a). Por mecanismos ainda desconhecidos, esta aposição pode se tornar
permanente, sendo então denominada de goniosinéquia (RITCH, R. e LOWE, R.,
1996b; SAKUMA, SAWADA et al., 1997).
A aposição da periferia da íris sobre a parede do seio camerular, quer seja
temporária quer permanente, leva a um bloqueio mecânico do trabeculado filtrante
(SAKUMA, SAWADA et al., 1997).
Este obstáculo na drenagem do humor aquoso pode resultar em um aumento
da PIO que, por sua vez, pode ocasionar a lesão glaucomatosa do nervo óptico
(dano estrutural) e seus característicos defeitos no campo visual (dano funcional)
(RITCH, R. E LOWE, R., 1996b).
Introdução | 22
Segundo RITCH, R. E LOWE, R. (1996b), os mecanismos de fechamento
angular podem ser divididos em quatro categorias: devido ao bloqueio pupilar, pela
íris em plateau, induzidos pelo cristalino e por causas retro-cristalinianas. O
fechamento angular pode ocorrer exclusivamente por qualquer um desses
mecanismos, como também pela associação de dois ou mais (RITCH, R. e LOWE,
R., 1996b; AUNG, ANG et al., 2001).
O componente de bloqueio pupilar representa a causa mais comum de
fechamento angular e pode ser classificado como absoluto (quando a íris se
encontra aderida na cápsula anterior do cristalino por sinéquias posteriores) ou
relativo (quando ocorre um bloqueio funcional) (RITCH, R. E LOWE, R., 1996b).
A passagem do humor aquoso da câmara posterior para a câmara anterior
ocorre, principalmente, através da pupila. Um bloqueio pupilar relativo irá provocar uma
dificuldade de fluxo do humor aquoso, levando a aumento da pressão, na câmara
posterior. A maior pressão na câmara posterior, em relação à câmara anterior,
provocará o abaulamento anterior da íris, empurrando-a contra o trabeculado e
desencadeando o fechamento angular (RITCH, R. E LOWE, R., 1996b).
A iridotomia periférica é um procedimento que produz uma passagem de
humor aquoso entre a câmara posterior e anterior, através da íris, proporcionando
um equilíbrio pressórico entre estas duas câmaras, eliminando o componente de
bloqueio pupilar e retificando o perfil iriano (RITCH, R. E LOWE, R., 1996b).
A configuração da íris em plateau é definida por um conjunto de
características anatômicas do segmento anterior do olho. A íris apresenta uma
angulação anterior em sua base e, depois, assume uma angulação na direção
central, formando o aspecto de uma íris plana, em plateau (PAVLIN, RITCH et al.,
1992; RITCH, R. e LOWE, R., 1996b; a). Dessa maneira, a profundidade da câmara
Introdução | 23
anterior central é relativamente ampla (MANDELL, PAVLIN et al., 2003). Apesar
disso, a característica angulação da periferia da íris resulta em uma repentina queda
na sua parte mais próxima ao ângulo irido-corneano, caracterizando a típica
configuração em plateau (AUNG, FRIEDMAN et al., 2004).
Segundo PAVLIN, RITCH et al. (1992), os casos de íris em plateau
apresentam processos ciliares suficientemente anteriorizados,
para sustentar a
periferia da íris contra o trabeculado córneo-escleral.
A síndrome da íris em plateau representa a condição patológica, em que o
fechamento angular ocorre a despeito da presença de uma iridotomia ou iridectomia
patente (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). Essa síndrome pode ter duas formas de
apresentação clinica: a completa e a incompleta (RITCH, R. e LOWE, R., 1996c).
A forma completa compreende a situação clássica e rara, quando o paciente
apresenta uma crise congestiva recorrente, mesmo após a eliminação do
componente de bloqueio pupilar (RITCH, R. E LOWE, R., 1996c). Nesse caso, a íris
periférica obstrui todo o trabeculado filtrante, levando ao fechamento angular
completo e ao aumento agudo da PIO (RITCH, R. E LOWE, R., 1996c).
Na forma incompleta, não se observa o aumento agudo da PIO e o paciente não
apresenta episódio de glaucoma agudo recorrente. Contudo, esses casos podem levar
à formação de goniosinéquias progressivas, em 360° do ângulo irido-corneano,
iniciando-se nas regiões mais posteriores, evoluindo para as mais anteriores e
acarretando uma inserção da íris progressivamente mais anterior (RITCH, R. E LOWE,
R., 1996c). LOWE (1964) definiu esta forma de fechamento angular em zíper.
Assim, a principal característica que diferencia a síndrome completa da
incompleta é o nível que o estroma da íris alcança, em relação às estruturas do
ângulo ou, em outras palavras, a altura em que o “plateau” se forma. Quando a íris
Introdução | 24
periférica ocasiona a oclusão do ângulo acima da malha trabecular, a PIO se eleva
de maneira aguda, desencadeando a crise congestiva. Se o ângulo se fecha apenas
parcialmente, poupando a porção superior do trabeculado filtrante, a PIO não se
eleva de maneira aguda, mas pode haver o desenvolvimento de um processo de
fechamento angular crônico e silencioso (AUNG, NOLAN et al., 2005).
Em muitos casos, o mecanismo da íris em plateau pode estar associado ao
mecanismo do bloqueio pupilar (WANG, WU et al., 2002). Nesses casos, o
diagnóstico da íris em plateau não pode ser confirmado até que o bloqueio pupilar
relativo seja eliminado, por meio da realização de uma iridotomia (RITCH, R. e
LOWE, R., 1996a).
Cabe ainda ressaltar que a presença de cistos de íris ou do corpo ciliar pode
levar ao fechamento angular e à configuração do seio camerular semelhantemente
aos casos da íris em plateau. Entretanto, esses casos são facilmente identificados
pela gonioscopia, que demonstra o fechamento angular em apenas algumas partes
do seio camerular e não em 360°. (RITCH, R. e LOWE, R., 1996b).
Os episódios de fechamento angular, induzidos pelo cristalino, abrangem um
grupo diverso de anormalidades, como a intumescência do cristalino (glaucoma
facomórfico), a subluxação e/ou deslocamento do cristalino, assim como o aumento
do diâmetro ântero-posterior do cristalino e a pequena anteriorização dessa
estrutura, que surgem com o decorrer da idade (LOWE, 1970).
O aumento fisiológico do diâmetro do cristalino altera as relações anatômicas
das estruturas do segmento anterior, levando a uma diminuição gradual da
profundidade da câmara anterior (RITCH, R. e LOWE, R., 1996b).
Apesar
de
o
componente de bloqueio pupilar não ser considerado como uma desordem relacionada
ao aumento do cristalino, a alteração da posição da superfície anterior dessa estrutura
Introdução | 25
ocasionará uma alteração da relação da extremidade da íris com a face anterior do
cristalino (ao nível da pupila), predispondo ao aparecimento do bloqueio pupilar relativo
(RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). Além disso, a íris e o corpo ciliar são deslocados
anteriormente, provocando um estreitamento do seio camerular (RITCH, R. e LOWE,
R., 1996a). Desta maneira, esse mecanismo, induzido pelo cristalino, pode colaborar
com o mecanismo de bloqueio pupilar (antes da iridotomia) e/ou com o mecanismo da
íris em plateau (após a iridotomia) (RITCH, R. e LOWE, R., 1996c).
Entretanto, o papel do cristalino, na fisiopatologia do fechamento angular,
apresenta algumas controvérsias. As causas retro-cristalinianas de fechamento
angular representam os casos de glaucoma maligno ou glaucoma por bloqueio ciliar.
Nesses casos, forças provenientes da região posterior à lente provocam a
anteriorização de todo o diafragma irido-cristaliniano, levando à oclusão do seio
camerular (RITCH, R. e LOWE, R., 1996b). Acredita-se que esse mecanismo seja
desencadeado pelo direcionamento anômalo do humor aquoso para a cavidade
vítrea (RITCH, R. e LOWE, R., 1996b).
No entanto, a exata etiopatogenia dessa agressiva forma de fechamento
angular ainda permanece obscura (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a; QUIGLEY,
FRIEDMAN et al., 2003).
Apesar de essa classificação proposta por RITCH, R. e LOWE, R., 1996b ser
considerada adequada para diferenciar os vários mecanismos de fechamento
angular, ela apresenta alguns conceitos mal definidos.
1.1.6 Classificação
O GPAF é classificado segundo os sinais e sintomas presentes no momento
do diagnóstico (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). Os pacientes com fechamento
Introdução | 26
angular podem se apresentar com um amplo espectro de sintomas, variando desde
a ausência de queixa até um exuberante quadro clínico com dor severa, náuseas e
diminuição súbita da acuidade visual (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). Assim, esta
classificação subdivide o GPAF em: fechamento angular intermitente ou glaucoma
subagudo, glaucoma agudo ou congestivo e glaucoma crônico de ângulo fechado
(RITCH, R. e LOWE, R., 1996a).
O glaucoma subagudo apresenta episódios de fechamento angular de curta
duração e com sintomatologia moderada (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). Nesses
casos, o aumento da PIO é suficiente para provocar sintomas, mas não para
desencadear todo o exuberante quadro clínico de uma crise congestiva (RITCH, R. e
LOWE, R., 1996a). Em geral, sintomas de diminuição da acuidade visual, dor e visão
de halos duram em média 30 minutos e tendem a apresentar resolução espontânea
(RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). Esses episódios de fechamento angular podem
recorrer durante meses ou anos até que, eventualmente, ocorra uma crise
congestiva (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a).
O glaucoma agudo representa o fechamento do ângulo em toda a sua
extensão, resultando em súbita elevação da PIO. Essas crises geralmente ocorrem
durante o período noturno, iniciando com sintomas moderados, e evoluindo
rapidamente para os sintomas mais severos (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a).
Aproximadamente um terço dos pacientes com crise de glaucoma agudo
relatam sintomas de crises intermitentes ou subagudas prévias (RITCH, R. e LOWE,
R., 1996a). No momento da crise congestiva, os pacientes relatam dor ocular e/ou
periorbitária intensa, diminuição da acuidade visual, náuseas e vômitos. Ao exame,
os olhos apresentam uma córnea edemaciada, midríase média não fotorreagente e
câmara anterior rasa (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a).
Introdução | 27
O termo GPAF descreve um olho em que parte do seio camerular se encontra
permanentemente obstruído pela presença de goniosinéquias (RITCH, R. e LOWE,
R., 1996b). Segundo RITCH, R. e LOWE, R. (1996b), a evolução para esta forma de
GPAF pode ocorrer de modo sintomático ou assintomático.
De uma maneira geral, os olhos com GPAF apresentam câmara anterior mais
profunda do que os olhos com glaucoma agudo e a elevação gradual da PIO não
provoca edema da córnea. Estes olhos podem eventualmente desenvolver crise
congestiva, porém, na maioria dos casos, o aumento da PIO e o conseqüente
processo da lesão glaucomatosa do nervo óptico ocorre de maneira assintomática
(RITCH, R. e LOWE, R., 1996b).
Entretanto, apesar de esta classificação tradicional do fechamento angular
primário estar sendo utilizada há várias décadas (RITCH, R. e LOWE, R., 1996b), seu
uso vem sendo considerado inadequado e sistematicamente criticado (QUIGLEY, 1996;
BONOMI, MARCHINI, MARRAFFA, BERNARDI, DE FRANCO et al., 2000; FOSTER,
2002). Seus principais pontos negativos são atribuídos à falta de uniformidade nos
conceitos utilizados e à inerente subjetividade em abordar e interpretar os sintomas
relatados pelos pacientes (FOSTER, BAASANHU et al., 1996; FOSTER, 2002).
Inúmeros trabalhos publicados sobre glaucoma de ângulo fechado utilizaram
critérios próprios para a definição de cada tipo de glaucoma. Dessa maneira, a
comparação dos resultados entre diferentes trabalhos fica bastante prejudicada
(FOSTER, 2002).
Atualmente, a definição de glaucoma primário, utilizada pelas pesquisas
epidemiológicas, adota o conceito de lesão do órgão alvo. Segundo esse conceito,
esta doença seria caracterizada pela neuropatia óptica glaucomatosa, identificada
por meio de uma combinação de anormalidades estruturais, associada à perda
Introdução | 28
visual funcional, detectada através do exame de campo visual (FOSTER, 2002;
FOSTER, BUHRMANN et al., 2002).
Em contrapartida, a presença da neuropatia óptica glaucomatosa não está
incluída como um dos critérios da classificação do glaucoma de ângulo fechado
baseada em sintomas. Os termos “glaucoma agudo” ou “glaucoma subagudo” são
utilizados independentemente do aspecto do disco óptico. Assim, segundo o
conceito de lesão do órgão alvo, pacientes que apresentam uma crise congestiva,
mas não possuem sinais de glaucoma no nervo óptico, não poderiam ser definidos
como casos de glaucoma agudo (FOSTER, 2002).
Apesar de esta situação parecer um contra-senso, na verdade a presença ou
ausência de sintomas parece não se correlacionar com o prognóstico do dano
glaucomatoso (FOSTER, 2002). Tanto é que (Douglas, Drance et al., 1975) e Dhillon
et al* (1975), citado por FOSTER (2002), relataram que 60-75% dos pacientes
caucasianos, que apresentaram crises congestivas, evoluíram sem neuropatia óptica
glaucomatosa ou lesão de campo visual.
Por todos esses motivos, uma nova classificação de glaucoma de ângulo
fechado foi adotada pela Academia Americana de Oftalmologia no ano de 2000
(BONOMI, MARCHINI, MARRAFFA, BERNARDI, DE FRANCO et al., 2000;
FOSTER, 2002). Nessa nova proposta, os pacientes são classificados conforme o
estágio da lesão glaucomatosa em que se encontram, em associação com os seus
respectivos achados gonioscópicos. Assim, os pacientes com fechamento angular
primário podem ser classificados em: suspeitos de fechamento angular primário,
com fechamento angular primário e com GPAF (FOSTER, 2002).
* Dhillon B, Chew PT, Lim ASM. Field loss in primary angle closure glaucoma. Asia-Pac J Ophthalmol
1990;2:85-87.
Introdução | 29
Os pacientes ditos “suspeitos de fechamento angular primário” não
apresentam nenhum dano glaucomatoso estrutural ou funcional e, também, não
apresentam nenhuma sinéquia anterior periférica. Esse termo se aplica aos olhos
dos pacientes que são considerados anatomicamente predispostos a apresentar
episódios de fechamento angular, em outras palavras, olhos que apresentam
ângulos potencialmente oclusíveis (FOSTER, 2002).
Os pacientes com fechamento angular primário também não apresentam sinais da
lesão glaucomatosa no disco óptico e no exame de campo visual, entretanto, já
apresentam sinais de fechamento angular como goniosinéquias e isquemia da íris
(FOSTER, 2002). Os pacientes sem neuropatia óptica glaucomatosa, que apresentam
um quadro de glaucoma agudo, são incluídos nesta classificação. Portanto, o termo
apropriado, nesses casos, seria “fechamento angular primário agudo”.
Por sua vez, os pacientes com glaucoma primário de ângulo fechado
apresentam não somente sinais de fechamento angular prévio, como também já
apresentam neuropatia óptica glaucomatosa (FOSTER, 2002). Assim, esse termo é
utilizado a despeito da presença dos sintomas relacionados aos episódios de
fechamento angular prévio.
1.1.7 Fatores de risco
1.1.7.1 Fatores ecobiométricos
Vários estudos avaliaram as características dos parâmetros ecobiométricos
nos olhos com fechamento angular primário (CHEUNG, LIU et al.; MALTA,
CARVALHO et al., 1982; MALTA, CARVALHO et al., 1983; CALIXTO E
CRONEMBERGER, 1986; SALMON, SWANEVELDER et al., 1994; SUN, JI et al.,
Introdução | 30
1994; RITCH, R. e LOWE, R., 1996b; CONGDON, YOULIN et al., 1997; SIHOTA,
GUPTA et al., 2000; SIHOTA, LAKSHMAIAH et al., 2000; FOSTER, 2002;
FRIEDMAN, GAZZARD et al., 2003; GAZZARD, FRIEDMAN et al., 2003; LAN,
HSIEH et al., 2007; LAVANYA, WONG et al., 2008; JONAS, XU et al., 2009; MELLO,
MEIRELLES et al., 2009). De maneira geral, essas pesquisas relatam que esses
olhos apresentam menor comprimento axial (CAX), menor profundidade da câmara
anterior, maior diâmetro ântero-posterior do cristalino (DAPC), curvatura e espessura
da íris, maior razão DAPC/CAX e posição relativa do cristalino mais anterior que os
olhos normais (CHEUNG, LIU et al. em pub).
CALIXTO e CRONEMBERGER (1986) verificaram que os olhos, em que se
constatou glaucoma agudo, apresentavam diâmetro axial e profundidade da câmara
anterior menores que os dos olhos com glaucoma primário de ângulo aberto, porém,
nenhuma diferença foi observada com relação à espessura do cristalino. Esses
autores ainda verificaram que os olhos que apresentaram crise congestiva tinham
menor profundidade da câmara anterior que seus olhos contralaterais. Assim, olhos
que apresentam essas anormalidades anatômicas estão predispostos à oclusão do
ângulo irido-corneano, por terem um segmento anterior mais compactado, o que se
reflete no seio camerular mais estreito.
1.1.7.2 Fatores demográficos
Dados da prevalência e incidência demonstram que o glaucoma de ângulo
fechado apresenta uma nítida tendência de acometer mulheres, pacientes mais
idosos e de origem asiática (FOSTER, BUHRMANN et al., 2002).
As mulheres de todas as raças estão mais suscetíveis ao glaucoma de ângulo
fechado (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a; SALMON, 1999a). Esta maior
Introdução | 31
predisposição, provavelmente, está relacionada com os parâmetros ecobiométricos
(RITCH, R. e LOWE, R., 1996a; SALMON, 1999a; FOSTER, BUHRMANN et al.,
2002). Considerando-se os olhos normais (sem fechamento angular), as mulheres
apresentam comprimento axial e câmara anterior significativamente menor que os
homens (OH, MINELLI et al., 1994; RITCH, R. e LOWE, R., 1996a; FOSTER,
ALSBIRK et al., 1997; QUIGLEY, FRIEDMAN et al., 2003).
QUIGLEY, FRIEDMAN et al. (2003) acrescentam que esta maior prevalência
pode também estar relacionada com o fato de que as mulheres têm uma maior
predisposição de apresentar alterações da permeabilidade vascular e/ou vasoespasmos.
Com o decorrer da idade, existe um aumento no diâmetro ântero- posterior do
cristalino e um pequeno movimento anterior desta estrutura, devido à perda da
tensão zonular (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a; RITCH, R. e LOWE, R. F., 1996). A
câmara anterior também diminui em profundidade e em volume (RITCH, R. e LOWE,
R., 1996a; FOSTER, 2002). Dessa maneira, a prevalência do fechamento angular
agudo aumenta com a idade, sendo mais freqüente entre os 55 e 70 anos (RITCH,
R. e LOWE, R., 1996a).
Conforme já citado, a prevalência do glaucoma de ângulo fechado varia
consideravelmente entre diferentes grupos étnicos. Entretanto, CONGDON,
FOSTER et al. (2002) compararam os parâmetros ecobiométricos de 170 pacientes
brancos, 188 negros e 531 chineses. Esses autores não observaram nenhuma
diferença significativa na profundidade da câmara anterior e no comprimento axial
nos três grupos avaliados. Esses resultados sugerem que devem existir outros
fatores de risco relacionados com a maior prevalência do glaucoma de ângulo
fechado em pacientes asiáticos.
Introdução | 32
OH, MINELLI et al. (1994) avaliaram 291 indivíduos normais de origem afroamericana, caucasiana e asiática. Esses autores relataram que os olhos estudados
não demonstraram, através da gonioscopia, diferenças no grau da abertura angular.
Entretanto, os pacientes asiáticos apresentaram inserção da íris no corpo ciliar cuja
localização anatômica está situada em posição mais anteriorizada.
1.1.7.3 Outros fatores de risco
A herança do GPAF é, provavelmente, multifatorial (TORNQUIST, 1953;
SARFARAZI, 1997). As características oculares relativas aos GPAF são mais
comuns entre parentes próximos dos portadores do que na população geral; essas
características incluem uma posição anteriorizada do cristalino, espessura
aumentada do cristalino e uma câmara anterior mais estreita (LOWE, 1972a;
SPAETH, 1978; ALSBIRK, 1982). Estima-se que a prevalência do GPAF entre os
parentes de primeiro grau, em uma população branca afetada, esteja entre 1 e 12%,
o que é maior que os 0,1% de prevalência na população geral (PATERSON, 1961;
LOWE, 1972b; ALSBIRK, 1975a).
A
história
familiar
parece
representar
um
fator
de
risco
para
o
desenvolvimento do fechamento angular primário (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a).
ALSBIRK (1976) relatou que parentes de primeiro grau de um paciente afetado
apresentam um risco de fechamento angular 3,5 vezes maior que pacientes sem
história familiar positiva.
Alguns fatores ambientais também parecem estar relacionados com o
desencadeamento do fechamento angular (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a;
FOSTER, 2002). A incidência de crises congestivas demonstra uma variação
Introdução | 33
sazonal, sendo mais comum nos períodos de temperaturas extremas. (FOSTER,
2002).
Há também diferenças raciais, com uma alta prevalência entre os esquimós (2
a 8%), asiáticos (0,3 a 1,4%) e ameríndios (4,2%), se comparadas com os
caucasianos (0,1%), o que é sugestivo de uma predisposição genética para esta
afecção (CONGDON, WANG et al., 1992; CARVALHO, 1999).
Segundo TEIKARI (1988), doença de herança monogênica tem 100% de
concordância em gêmeos monozigóticos. Em um estudo de coorte com gêmeos, 2
pares de irmãos monozigóticos foram concordantes para GPAF, 5 pares foram
discordantes, e 13 pares de irmãos dizigóticos foram discordantes, o que apóia a
hipótese de herança poligênica ou multifatorial do GPAF.
Estudos procuram correlacionar o GPAF com alguns lócus gênico ou marcador
genético como os grupos sanguíneos ABO, RH, Duffy e com antígenos e alelos de
HLA, em várias populações, porém os dados ainda não são conclusivos (GIESER e
WILENSKY, 1979; WANG, GUO et al., 1986; SALMON e MARTELL, 1994)
Há mais de 15 loci e sete genes identificados em pacientes com
GPAF(CRAIG e MACKEY, 1999), entre eles, dois genes foram identificados em
mutações causando GPAA: MYOC myocilin e OPTN optineurin(SHEFFIELD,
STONE et al., 1993; STONE, FINGERT et al., 1997; REZAIE, CHILD et al., 2002).
Nanoftalmia é uma desordem autossômica dominante com associação
significativa com GPAF, identificada especificamente em dois loci (OTHMAN,
SULLIVAN et al., 1998); no entanto, a Nanoftalmia é muito diferente do fechamento
primário de ângulo (OTHMAN, SULLIVAN et al., 1998).
WANG, CHIANG et al. (2006) estudaram a relação entre polimorfismo simples de
nucleotídeos (SNPs) da matrix extracelular, matrix metaloprotease (MMPs), inibidores
Introdução | 34
tissulares da MMPs e outros genes associados a glaucoma e GPAF. Foram extraídos
DNAs de 78 pacientes com GPAF, com história de crise aguda e 86 sujeitos-controles.
Encontrou-se associação do SNP rs2664538, localizado no gene MMP9, com GPAF.
AYUB, KHAN et al. (em pub) em estudo de coorte, na população
paquistanesa, investigaram o envolvimento da sintetase endotelial oxido nítrico
(eNOS) e heat shock proteína 70 (HSP70) com GPAA e GAAF. Encontrou-se
associação significativa com o polimorfismo G+190C do HSP70 (p < 0,05).
1.1.8 Evolução
Conforme já citado, o GPAF é uma doença provocada por várias
anormalidades que apresentam, como característica comum, a aposição mecânica
da malha trabecular pela periferia da íris. Esta aposição pode levar à formação de
goniosinéquias que resultam na obstrução do trabeculado filtrante, com conseqüente
aumento da PIO (RITCH, R. e LOWE, R., 1996b). Dessa maneira, o processo de
fechamento angular pode ocasionar o dano glaucomatoso do nervo óptico. Com este
conceito em mente, pode-se admitir que, se o mecanismo responsável pelo bloqueio
mecânico do trabeculado for eliminado de maneira precoce, antes de ocorrerem
lesões no sistema de drenagem do humor aquoso, existe a possibilidade teórica da
interrupção do processo da doença (RITCH, R. e LOWE, R., 1996b).
Assim, o diagnóstico precoce do ângulo irido-corneano oclusível representa
um fator fundamental para o bom prognóstico visual do paciente, principalmente
quando se considera a possibilidade do desenvolvimento de uma crise aguda, em
que os níveis muito elevados da PIO podem acarretar graves seqüelas visuais em
um curto período de tempo (WILENSKY, RITCH et al., 1996). Entretanto, a despeito
da eliminação do mecanismo de bloqueio pupilar, o processo de lesão à malha
Introdução | 35
trabecular pode continuar ocorrendo. Teoricamente, a lesão ao sistema de
drenagem do aquoso, mesmo após a realização da iridotomia, pode ocorrer ou pela
manutenção do processo de fechamento angular (mecanismos de não bloqueio
pupilar) ou pela lesão ultra-estrutural da matrix extracelular da malha trabecular
(mecanismo do dano trabecular, observado nos casos de glaucoma primário de
ângulo aberto) (WILENSKY, RITCH et al., 1996).
Além do mais, o processo glaucomatoso pode continuar progredindo em
virtude de outros mecanismos, que podem lesar diretamente o nervo óptico, como
as anormalidades na sua perfusão sanguínea e/ou anormalidades nas suas
propriedades biomecânicas (BURGOYNE, QUIGLEY et al., 1995).
A realização da iridotomia periférica é o tratamento de escolha na maioria dos
casos com ângulos oclusíveis (RITCH, R. e LOWE, R., 1996c). Esse procedimento
elimina o bloqueio pupilar relativo, que é o mecanismo de fechamento angular mais
comum. Após a realização da iridotomia, podemos teoricamente pensar e tentar
descrever pelo menos quatro evoluções clínicas (RITCH, R. e LOWE, R., 1996c).
Como primeiro quadro clínico possível, o diagnóstico do ângulo oclusível foi
realizado de maneira precoce, no momento em que o dano ao trabeculado ainda não
era extenso o suficiente para comprometer a sua função. O bloqueio pupilar relativo era
o único mecanismo do fechamento angular e não existia nenhuma outra condição
associada que pudesse levar ao aumento da PIO ou à neuropatia óptica glaucomatosa.
Portanto, nesses casos, a realização da iridotomia poderia, teoricamente, bloquear todo
o processo glaucomatoso (RITCH, R. e LOWE, R., 1996c).
Em uma segunda hipotética situação, o diagnóstico do ângulo oclusível foi feito
de maneira precoce, no momento em que o dano ao trabeculado ainda não era extenso
o suficiente para comprometer a sua função. O bloqueio pupilar relativo era o único
Introdução | 36
mecanismo de fechamento angular (RITCH, R. e LOWE, R., 1996c). Entretanto,
existiam outras condições associadas, que poderiam elevar a PIO ou causar a
neuropatia óptica glaucomatosa. Assim, a iridotomia bloqueou o processo de
fechamento angular, porém outras condições associadas podem levar ao aparecimento
ou progressão da lesão glaucomatosa, tais como lesões ultra-estruturais da malha
trabecular (DRECOLL e ROHEN, 1996) e anormalidades nas propriedades
biomecânicas da cabeça do nervo óptico (BURGOYNE, QUIGLEY et al., 1995).
Em uma terceira situação, da mesma forma o diagnóstico do ângulo oclusível
foi realizado de maneira precoce, no momento em que o dano ao trabeculado ainda
não era extenso o suficiente para comprometer sua função. Entretanto, o bloqueio
pupilar relativo não representava o único mecanismo de fechamento angular. Assim,
mesmo após a eliminação do bloqueio pupilar, o processo do fechamento angular e
o conseqüente dano progressivo à malha trabecular pode continuar ocorrendo em
virtude de mecanismos de não bloqueio pupilar, tais como a síndrome da íris em
plateau completa ou incompleta (RITCH, R. e LOWE, R., 1996c).
Finalmente, o diagnóstico do ângulo oclusível foi feito tardiamente, em um
momento no qual a extensão das goniosinéquias já comprometia a função do
trabeculado filtrante. A despeito da presença de outros mecanismos de fechamento
angular ou outras condições, associadas com o desenvolvimento da neuropatia
óptica
glaucomatosa,
este
paciente
já
apresenta
lesão
no
trabeculado
suficientemente extensa para comprometer a drenagem do aquoso. A PIO pósiridotomia se encontra elevada, assim como os riscos de desenvolvimento da
neuropatia óptica glaucomatosa (RITCH, R. e LOWE, R., 1996c).
Encerrada esta breve revisão das complexas associações entre as diferentes
etiopatogenias do glaucoma de ângulo fechado, será iniciada a revisão da literatura
Introdução | 37
sobre a evolução dessa doença. Todos os trabalhos revisados a seguir foram
realizados em pacientes asiáticos, com exceção do primeiro, que envolveu pacientes
caucasianos, negros, hispânicos e asiáticos.
ROSMAN, AUNG et al. (2002) avaliaram, retrospectivamente, casos de
glaucoma crônico de ângulo fechado (com neuropatia óptica glaucomatosa e
defeitos de campo visual) já submetidos à iridotomia e que apresentavam um
acompanhamento mínimo de nove meses. Esses autores compararam 80 olhos de
pacientes atendidos em Nova Iorque com 83 olhos de pacientes atendidos em
Singapura. Foi observado que 100% (80/80) dos olhos avaliados em Nova Iorque e
94% (78/83) dos olhos avaliados em Singapura necessitaram de tratamento
adicional para controle da PIO, mesmo após a eliminação do componente de
bloqueio pupilar. Entretanto, não foi descrita a extensão de goniosinéquias, na
população estudada.
ANG, AUNG et al. (2000) observaram que 89% (71/80) dos olhos contralaterais de pacientes que apresentaram crise congestiva não necessitaram de
nenhuma medicação para controlar a PIO, por um tempo médio de 50 meses, pósiridotomia. Apesar das altas taxas de controle da PIO, os autores ressaltaram que
9% (7/80) desses olhos apresentaram descontrole da PIO e formação de novas
goniosinéquias (análise retrospectiva), após a eliminação do componente de
bloqueio pupilar. No entanto, a presença de mecanismos de não bloqueio pupilar
não foram investigados, nesses casos.
LIM, AUNG et al. (2004) acompanharam, prospectivamente, 44 pacientes que
apresentaram glaucoma agudo unilateral, por um tempo médio de 12 meses, após a
realização da iridotomia. Estes autores observaram uma abertura significativa do
ângulo irido-corneano, após a eliminação do bloqueio pupilar e não detectaram a
Introdução | 38
formação de goniosinéquias nos olhos que apresentaram a crise e nos respectivos
olhos contra-laterais. No entanto, 41% (19/44) dos pacientes apresentaram
descontrole da PIO e necessitaram de tratamento adicional. Esse estudo apresentou
duas importantes limitações. A primeira diz respeito ao fato de que os pacientes não
foram avaliados quanto à presença da neuropatia óptica glaucomatosa. A segunda
limitação se refere à simples exclusão de todos os casos que necessitaram de
intervenção cirúrgica, durante a pesquisa, selecionando-se, assim, os casos com
melhor evolução clínica.
Aung, Friedman et al. (2004) realizaram um estudo observacional transversal,
no qual 90 pacientes foram avaliados por um período de 4 a 10 anos, após
glaucoma agudo. Esses autores notaram que, após um tempo médio de 6,3 anos da
crise congestiva, 18% (16/90) dos olhos que apresentaram glaucoma agudo
estavam cegos. A presença de glaucoma primário de ângulo fechado (dano
estrutural e funcional) foi observada em 48% (43/90) dos olhos. Verificou-se, ainda,
que 49% (44/90) desses olhos apresentavam ângulo estreito à gonioscopia.
(classificação de Shaffer). No entanto, como limitação do estudo, nem todos os
pacientes, na época da crise congestiva, realizaram perimetria automatizada e
avaliação do disco óptico.
1.1.9 Tratamento
O tratamento do fechamento angular primário é realizado de acordo com o
mecanismo etiopatogênico envolvido. Na grande maioria dos casos, a terapia de
escolha é a realização da iridotomia periférica. Após a realização da iridotomia, a
eventual necessidade de tratamento adicional é determinada segundo as causas do
aumento da PIO e/ou segundo o processo de fechamento angular persistente.
Introdução | 39
Dessa maneira, se não houver nenhum mecanismo de fechamento angular adicional
após a iridotomia (mecanismos de não bloqueio pupilar), o tratamento deve envolver
o uso de colírios ou drogas sistêmicas antiglaucomatosas, e, eventualmente, a
realização da trabeculectomia (SUSANNA e MALTA, 1981; SUSANNA, MALTA et
al., 1981; HOH, AUNG et al., 2002; LAI, THAM et al., 2002).
Nos casos em que existe um mecanismo de não bloqueio pupilar, levando ao
dano progressivo do trabeculado (formação de novas goniosinéquias), o tratamento
pode envolver o uso de crônico da pilocarpina, a realização da iridoplastia periférica
ou até mesmo a controvertida realização da remoção do cristalino(HOH, AUNG et
al., 2002; LAI, THAM et al., 2002; WANG, WU et al., 2002; NONAKA, KONDO et al.,
2005).
Entretanto, é importante ressaltar que a eficácia de cada uma dessas
modalidades terapêuticas citadas não foi comprovada em estudos longitudinais
controlados (SAW, GAZZARD et al., 2003). Além disso, cada uma destas
modalidades terapêuticas, cirúrgicas ou clínicas, apresentam uma série de
potenciais efeitos colaterais. Assim, a conduta a ser adotada deve ser decidida
criteriosamente para cada caso de glaucoma de ângulo fechado.
1.2
Genética e Glaucoma
A Genética é a ciência da diversidade biológica. Nos últimos 45 anos, a
Genética Humana evoluiu da diversidade fenotípica até chegar à variação do DNA
propriamente dito.
A Genética Médica é um ramo da Genética Humana que estuda a relação
entre a diversidade biológica em humanos, saúde e doença. Dedica-se à
investigação de doenças que acometem pacientes e seus familiares, seu
Introdução | 40
diagnóstico, prevenção e tratamento (MCKUSICK, 1992). A evolução da Genética
Médica permitiu determinar que as doenças podem apresentar um padrão
monogênico de hereditariedade, que inclui os tipos autossômico dominante (AD),
autossômico recessivo (AR), ligado ao sexo (ligado ao X) e mitocondrial ou
apresentar um padrão complexo de hereditariedade, que envolve mais de um gene e
possíveis fatores ambientais, na determinação etiológica da doença (herança
poligênica multifatorial) (TEIKARI, 1987; 1990).
A determinação exata do padrão de herança é dificultada pela variabilidade
da penetrância e expressividade da doença. Penetrância é um conceito que,
geralmente, se refere à expressão de um genótipo mutante, aplicado a caracteres
dominantes em heterozigose.
A penetrância de um alelo mutante pode variar de acordo com a porcentagem
de indivíduos portadores, desde que manifestem seu fenótipo correspondente. Por
exemplo: se uma condição se expressar em 100% dos indivíduos que possuam o
alelo responsável, este alelo apresentaria uma penetrância de 100%; ao passo que,
se esta mesma condição estiver presente em 70% das pessoas portadoras do alelo
mutante, isso corresponderia a uma penetrância de 70% para este alelo. A
expressividade corresponde ao grau de severidade de uma moléstia associada a
uma alteração genética. Se uma condição apresentar uma expressividade variável, o
fenótipo (manifestação clínica), determinado por esta alteração genética, variará em
grau de intensidade (leve a intenso), mas sempre presente entre os indivíduos que
possuírem o genótipo correspondente (MUSARELLA, 1992; DAMJI e ALLINGHAM,
1997).
A Genética e a Oftalmologia estão historicamente associadas, desde o início
do século XX. Em 1911, Wilson deduziu que a deficiência da visão de cores estava
Introdução | 41
localizada no cromossomo X. Em 1947, observou-se a ligação no padrão de
transmissão hereditária entre duas moléstias (hemofilia e deficiência de visão de
cores) (DAMJI e ALLINGHAM, 1997). Em 1963, identificou-se a primeira doença
humana ligada a um cromossomo autossomo: catarata pulverulenta, com grupo
sangüíneo Duffy no cromosomo 1 (DAMJI e ALLINGHAM, 1997).
Recentemente, com o desenvolvimento da Biologia Molecular, vários
pesquisadores têm procurado identificar genes associados aos mais diversos tipos
de moléstias humanas. Assim, um grande número de afecções oculares já têm seu
locus (posição no cromossomo) e gene determinados por meio do mapeamento
genético e da análise de ligação.
A classificação proposta pela Organização Mundial do Genoma Humano
designa, para os genes associados ao glaucoma, a sigla “GLC” (RAYMOND, 1997).
Os números “1”, “2” e “3” que seguem a sigla geral (“GLC”) para os glaucomas
representam ângulo aberto, ângulo estreito e glaucoma congênito, respectivamente.
Finalmente, as letras “A”, “B”, “C” ,e assim por diante, indicam o primeiro e os
subseqüentes loci identificados para determinado tipo de glaucoma (RAYMOND,
1997). Assim, o primeiro locus identificado, em associação com o GPAA, recebeu o
nome de GLC1A, enquanto o primeiro lócus, relacionado ao glaucoma congênito, foi
denominado GLC3A.
Apesar de vários trabalhos, na literatura, sugerirem que o GPAA seja herdado
segundo padrões de herança Mendeliana, a grande maioria dos pacientes não
apresenta esse padrão de transmissão hereditária (ADAM, BELMOUDEN et al.,
1997). Estudos com pares de gêmeos dizigóticos e monozigóticos, avaliando o
componente genético para o GPAA sugerem a ocorrência de padrão poligênico
multifatorial para a doença (TEIKARI, 1987; 1990). Essa teoria já havia sido
Introdução | 42
postulada por ARMALY (1967b; a; 1968) e JAY e PATERSON (1970) e poderia
justificar a baixa prevalência da moléstia, de 2,5% a 13,5%, entre os parentes de
pacientes com GPAA (NETLAND, WIGGS et al., 1993).
Até o momento temos a descrição de onze loci e três genes relacionados ao
glaucoma primário de ângulo aberto (Tabela 1). O primeiro gene, situado no locus
GLC1A (cromossomo 1q21-q31), foi o gene “Trabecular Meshwork-Induced
Glucocorticoid Response Gene/ Myocilin Gene” (TIGR/MYOC), descrito em 1997 por
(STONE, FINGERT et al., 1997). Mutações no gene TIGR/MYOC são a causa mais
freqüente de cegueira com base molecular conhecida. O segundo gene identificado
foi o gene “Optineurin” (“Optic Neuropathy Induced Protein” – OPTN), situado no
locus GLC1E (cromossomo 10p14-p15) e o terceiro gene associado ao GPAA, o
“WD40-repeat 36” (WDR36), situado no locus GLC1G (cromossomo 5q22.1), foi
identificado por (MONEMI, SPAETH et al., 2005).
Introdução | 43
Quadro 1: Loci genéticos descritos para o glaucoma primário de ângulo aberto
Localização no
cromossomo
Nome do
Gene
identificado
Autor
1q21-q31
GLC1A
MYOC
Stone, Fingert et al., 1997
2p4
-
-
Wiggs, Allingham et al., 2000
2p16.3-p15
GLC1H
-
www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature
2cen-q13
GLC1B
-
Stoilova, Child et al., 1998
2q33-q34
-
-
Nemesure, Jiao et al., 2003
3p21-p22
-
-
Baird, Foote et al., 2005
3q21-q24
GLC1C
-
Wirtz, Samples et al., 1997
5q22.1
GLC1G
WDR36
Monemi, Spaeth et al., 2005
7q35-q36
GLC1F
-
Wirtz, Samples et al., 1999
8q23
GLC1D
-
Trifan, Traboulsi et al., 1998
9q22
GLC1J
-
Wiggs, Lynch et al., 2004
10p12-p13
-
-
Nemesure, Jiao et al., 2003
10p15-p14
GLC1E
OPTN
Rezaie, Child et al., 2002
14q11
-
-
Wiggs, Allingham et al., 2000
14q21-q22
-
-
Wiggs, Allingham et al., 2000
15q11-q13
GLC1I
-
Allingham, Wiggs et al., 2005
17p13
-
-
Wiggs, Allingham et al., 2000
17q25
-
-
Wiggs, Allingham et al., 2000
19q12-q14
-
-
Wiggs, Allingham et al., 2000
20p12
GLC1K
-
Wiggs, Lynch et al., 2004
locus
Introdução | 44
1.3
Gene TP53
1.3.1 Aspectos gerais
As origens da descoberta do gene TP53 são provenientes de estudos
bioquímicos realizados em 1979, nos quais foi observado que uma proteína de 53kD
(p53) poderia ser imunoprecipitada juntamente com um antígeno tumorigênico viral,
o antígeno T SV 40. Posteriormente, mostrou-se que a p53, localizada em grande
parte no núcleo celular, também era capaz de ligação com outras proteínas virais,
como o antígeno E1B do adenovírus tipo 5, o antígeno 5 nuclear do vírus EpsteinBarr e o antígeno E6 do vírus papiloma humano (LANE e CRAWFORD, 1979;
LINZER e LEVINE, 1979). A ligação da p53 a proteínas virais forneceu a primeira
pista sobre sua importância, pois a inativação pela ligação a essas proteínas,
permitiria que a célula entrasse em uma via que levaria à tumorigênese, induzida
por vírus. Subseqüentemente, vários clones de DNA do gene TP53 foram isolados e
observou-se que os mesmos eram capazes de imortalizar células de curta duração
(JENKINS, RUDGE et al., 1984) e de cooperar com o oncogene rãs na
transformação de células em cultura (PARADA, LAND et al., 1984).
Esses fatos levaram o gene p53 a ser considerado um oncogene. Somente
em 1989, descobriu-se que todos os clones do TP53 analisados eram mutantes,
além de se observar que sua forma normal era capaz de suprimir a transformação
celular iniciada por outros oncogenes. A partir de então, o gene TP53 foi
denominado um gene supressor de tumores. Mutações de ponto e/ou deleções no
mesmo são comuns em mais de 50% das neoplasias humanas (FUNG e FISHER,
1995).
Introdução | 45
1.3.1.1 Localização e estrutura do gene TP53
O gene TP53 humano está localizado no cromossomo 17p13 e é um dos
alvos mais freqüentes para alterações em tumores humanos (HOLLSTEIN,
SIDRANSKY et al., 1991). É extremamente conservado em diversos organismos
como Xenopus laevis, aves, camundongos e humanos, sugerindo que a proteína
codificada desempenhe um papel critico na célula (PROKOCIMER e ROTTER,
1994). O gene compreende 20 Kb de DNA, consistindo de 11 exons, sendo que o
primeiro não é codificado e encontra-se separado do grupo de 10 exons 2, 4, 5, 7 e
8 codificam 5 grupos de seqüências de aminoácidos muito conservados durante a
evolução (domínios conservados I – V), localizados entre os resíduos 13 e 19, 117 e
142, 171 e 181, 236 e 258 e 270 e 288, respectivamente. O RNA mensageiro tem
2,6 Kb e contém uma grande região não codificada 3’ que provavelmente está
envolvida na estabilização da molécula (PROKOCIMER e ROTTER, 1994).
1.3.1.2 Proteína p53
Um dos principais genes envolvidos na apoptose é o TP53 que expressa a
proteína p53. Está localizada no braço curto do cromossomo 17p13.1, codificando
uma fosfoproteína de 53 kDa e 393 aminoácidos;
tem a característica de ser
expressa quando o DNA sofre algum tipo de dano, sendo sua principal função a
manutenção da integridade do código genético em cada célula (LANE, 1992;
PINHO, 2000).
A p53 é uma proteína supressora tumoral que pertence a uma pequena
família de proteínas relacionadas, que incluem dois outros membros – p63 e p73.
Essa proteína parece estar envolvida na prevenção de desenvolvimento de tumores,
sendo ativada em resposta a vários sinais de estresse associados à malignidade,
Introdução | 46
resultando na inibição do crescimento das células tumorais, incluindo a suspensão
do ciclo celular, envelhecimento celular, diferenciação celular e apoptose,
dependendo de muitos fatores que são intrínsecos e extrínsecos à célula, tais como
o tipo celular, ambiente celular e outras alterações oncogênicas, que são
experimentadas pela célula (BALINT e VOUSDEN, 2001; VOUSDEN e LU, 2002).
Em geral, esses sinais de estresse celular provocam uma estabilização da
proteína p53, o que leva a um aumento nos níveis de p53 na célula. Em algumas
circunstâncias, a p53 também contribui para reparar o dano genotóxico, mas, na
maioria dos casos, a indução da p53 leva a uma inibição irreversível do crescimento
celular, através da ativação da apoptose (BALINT e VOUSDEN, 2001; VOUSDEN e
LU, 2002). Como a p53 seleciona uma dessas conseqüências celulares (reparação
celular ou apoptose) ainda permanece obscuro e é uma área de intensa pesquisa.
O acesso da p53 aos sítios nucleares é regulado, primariamente, pelo
transporte citoplasmático-nuclear. Nas células normais, a p53 é mantida ativa em
baixos níveis no citoplasma, através da degradação proteasoma-dependente. Em
resposta aos estímulos, ela é transportada rapidamente para o núcleo, onde
permanece até a tarefa de vigilância ter sido completada (SHAULSKY, BEN-ZE'EV
et al., 1990).
1.3.2 Polimorfismo do gene TP53
Os polimorfismos genéticos são alterações naturais, na seqüência do DNA,
que ocorrem em uma freqüência maior que 1% na população normal. A forma mais
comum de polimorfismo é a que envolve a substituição de uma única base em uma
seqüência de nucleotídeos (SNP – Single Nucleotide Polymorphism) e é usualmente
bialélica, isto é, há somente dois alelos, que são definidos pela presença de uma ou
Introdução | 47
de outra base, em uma determinada posição (BALASUBRAMANIAN, COX et al.,
2004).
Algumas dessas alterações ocorrerão em seqüências não codificadoras do
gene e, na maioria dos casos, não terão efeito em suas funções; outras ocorrerão
em seqüência codificadoras, podendo levar à produção de proteínas defeituosas.
Desse modo, em alguns casos, o polimorfismo genético pode aumentar a
susceptibilidade ao câncer (LODISH, BERK et al., 2002).
O polimorfismo do gene supressor de um tumor TP53, no códon 72, tem sido
investigado extensamente para verificação de sua associação com vários cânceres
em todo o mundo (KIETTHUBTHEW, SRIPLUNG et al., 2003). O códon 72 codifica
um aminoácido arginina (CGC; Arg 72) ou um prolina (CCC, Pro72), correspondendo
aos genótipos em homozigose arginina/arginina (Arg/Arg) ou prolina/prolina
(Pro/Pro) e em heterozigose arginina/prolina (Arg/Pro) (ARA, LEE et al., 1990;
TADA, FURUUCHI et al., 2001). O polimorfismo ocorre por simples substituição de
uma base no códon, de guanina (G) para citosina (C), que resulta em alteração
estrutural, bioquímica e biológica da proteína p53 (THOMAS, KALITA et al., 1999).
A ocorrência de polimorfismos genéticos pode ser detectada pela técnica da
reação em cadeia pela polimerase (PCR – Polymerase Chain Reaction), combinada
com
técnica
de
restrição
enzimática
RFLP
(Restriction
Fragment
Lenght
Polymorphism – polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição)(IZZOTTI,
2003).
1.3.3 Glaucoma e a expressão do gene TP53
Geralmente, a célula recebe um estímulo para morrer. Para as células
glanglionares retinianas, no glaucoma, esse estímulo pode estar na forma de perda do
Introdução | 48
suporte neurotrófico, durante os períodos de PIO elevada (OPPENHEIM, 1991) e/ou
exposição a um excesso de aminoácidos excitatórios (excitotoxinas), tais como
glutamato liberado quando ocorre a isquemia do nervo óptico e das células
glanglionares retinianas (LIPTON e ROSENBERG, 1994; NASKAR e DREYER, 2001).
O dano celular se inicia e é detectado por alguma forma de sensor protéico
que ainda não está caracterizado, cuja função crítica parece ser ativar a proteína
supressora tumoral p53. A ação da p53 aumenta a expressão do gene antiapoptótico bax e diminui a expressão do gene anti-apoptótico bcl-2 (e,
possivelmente, o bcl-x), cujos produtos agem como antagonistas na célula
(NICKELLS, 1999).
Embora a exata função desses produtos não seja conhecida, evidências
indicam que eles afetam a liberação do citocromo c da mitocôndria, resultando na
ativação de uma família de cisteína-proteases, denominadas caspases, que digerem
os componentes celulares. Os fragmentos celulares são acondicionados em
pequenas vesículas (corpos apoptóticos) que são fagocitados pelos macrófagos.
Esse processo resulta na perda somente da célula ganglionar afetada e é
freqüentemente considerado um “suicídio celular” (NICKELLS, 1999).
Partindo-se do pressuposto de que o gene TP53 teria papel importante na
apoptose que ocorre na neuropatia óptica glaucomatosa, o polimorfismo da proteína
p53, no códon 72, foi estudado em pacientes com GPAA e comparado com o
polimorfismo em indivíduos normais, em populações distintas. (LIN, CHEN et al.,
2002; SENA, 2003; RESSINIOTIS, GRIFFITHS et al., 2004; DIMASI, HEWITT et al.,
2005; DAUGHERTY, CURTIS et al., 2009). Este estudo se justifica, pois não há na
literatura mundial qualquer publicação médica que avalie a associação do gene
TP53 no GPAF.
2.
OBJETIVOS
Objetivos | 50
Os objetivos do presente estudo são:
1 – Determinar as distribuições genotípicas do polimorfismo (Prolina/Prolina,
Arginina/Arginina e Arginina/Prolina) do gene TP53 (códon 72) em pacientes
brasileiros com Glaucoma Primário de Ângulo Fechado, comparando-se
com a
distribuição em controles sadios.
2 – Verificar a associação alélica (Prolina e Arginina) do gene TP53 (códon 72) com
Glaucoma Primário de Ângulo Fechado, independentemente da presença ou não de
história de crise aguda por bloqueio pupilar.
3 – Verificar se a freqüência alélica (Prolina e Arginina) do gene TP53 (códon 72) em
pacientes com Glaucoma Primário de Ângulo Fechado, sem história de crise aguda
por bloqueio pupilar, difere daquela da população normal.
4 - Verificar se a freqüência alélica (Prolina e Arginina) do gene TP53 (códon 72) em
pacientes com Glaucoma Primário de Ângulo Fechado, com história de crise aguda
por bloqueio pupilar, difere daquela da população normal.
5 - Verificar se a freqüência alélica (Prolina e Arginina) do gene TP53 (códon 72) em
pacientes com Glaucoma Primário de Ângulo Fechado, com história de crise aguda
por bloqueio pupilar, difere daquela dos pacientes com Glaucoma Primário de
Ângulo Fechado, sem história de crise aguda por bloqueio pupilar.
3.
MÉTODO
Método | 52
Este foi um Estudo observacional, tipo caso-controle, que incluiu cento e
quarenta e cinco pacientes do Ambulatório de Glaucoma do Setor de Oftalmologia
do HCFMRP-USP e do Ambulatório de Glaucoma do Setor de Oftalmologia do
Hospital do Servidor Público Estadual.
O projeto desta pesquisa foi aprovado pela Comissão de Ética do HCFMRPUSP, tendo constituído o Processo número 8991/2001 e pela Comissão Nacional de
Ética em Pesquisa- CONEP Parecer 476/2002.
Consentimento Informado Escrito foi obtido de todos os participantes.
3.1
Casuística
Foram selecionados, consecutivamente, 73 pacientes portadores de GPAF,
60 pacientes do Ambulatório de Glaucoma do Setor de Oftalmologia do HCFMRPUSP e 13 pacientes do Ambulatório de Glaucoma do Setor de Oftalmologia do
Hospital do Servidor Público Estadual. Desses 60 pacientes do Ambulatório de
Glaucoma do Setor de Oftalmologia do HCFMRP - USP, 38 haviam participado de
estudo anterior (GOMES, 2002) e seus materiais genéticos (DNA) estavam
armazenados no Hemocentro da FMRP-USP. Entre os pacientes com GPAF, 53
pacientes tinham história de crise aguda por bloqueio pupilar e 20 pacientes tinham
história de GPAF, com aumento crônico da pressão ocular. Foram excluídos seis
pacientes do grupo com GPAF, pois não era possível visualização adequada das
características do nervo óptico.
3.2
Critérios de Inclusão
Todos os pacientes foram examinados por médicos assistentes do
Ambulatório de Glaucoma do Setor de Oftalmologia do HCFMRP – USP tanto nos
Método | 53
pacientes quanto nos controles. Os critérios de inclusão foram: pacientes com GPAF
- aqueles com ângulo da câmara anterior ocular fechado (verificado em gonioscopia
realizada com lente de Goldmann - 3 espelhos ou lente de Zeiss); níveis de PIO
iguais ou superiores a 21 mmHg, com história de crise hipertensiva aguda por
bloqueio pupilar ou não, sendo as medidas realizadas com tonômetro de aplanação,
tipo Goldmann, acoplado à Lâmpada de Fenda TOPCON® (Modelo SL-D2, New
Jersey, EUA), acompanhados de alterações sugestivas de glaucoma na cabeça do
NO (observáveis na oftalmoscopia direta) e no campo visual (realizado com o
perímetro computadorizado de Humphrey®, Marca Zeiss®).
A alteração do NO avançada foi caracterizada pela presença de pelo menos dois
dos seguintes critérios: escavação do nervo óptico maior ou igual a 0,7, perda de rima
neural localizada, hemorragia de disco ou assimetria da escavação do NO maior que 0,2.
Definiu-se defeito de campo visual compatível com glaucoma, de acordo com
um dos seguintes critérios: GHT anormal, PSD menor que 5%, escotoma
paracentral, defeito arqueado típico (Bjerrum), degrau nasal, defeito em cunha
temporal, defeito difuso, escotoma denso e ilha de visão. Todos os campos visuais
foram avaliados por um glaucomatólogo experiente em campimetria visual e os
resultados dessa avaliação foram aceitos pelo investigador.
Foram incluídos, no estudo, os pacientes portadores de GPAF que não
tivessem história de hipertensão arterial sistêmica, diabete melito e/ou doença de
Chagas, na ocasião da coleta do sangue para extração do DNA.
Utilizando-se os prontuários dos pacientes, foram colhidos os dados relativos
ao exame físico (biomicroscopia, fundoscopia direta, gonioscopia e tonometria),
dados de identificação (nome, registro, idade e sexo), bem como registro das
alterações campimétricas.
Método | 54
Foi definida crise congestiva: os pacientes relatam dor ocular e/ou
periorbitária intensa, diminuição da acuidade visual, náuseas e vômitos. Ao exame,
os olhos apresentam uma córnea edemaciada, midríase média não fotorreagente e
câmara anterior rasa (RITCH, R. e LOWE, R., 1996a). Na gonioscopia, foram
observados goniosinéquias e o “sinal da impressão” de pigmentos irianos na parede
do seio camerular.
3.3
Critérios de Exclusão
Pacientes, com ângulo da câmara anterior ocular aberto (verificado em
gonioscopia realizada com lente de Goldmann - 3 espelhos ou lente de Zeiss), que
apresentassem cirurgia intra-ocular, refrativa ou conjuntival prévias, inflamação intraocular ou história de trauma ocular foram excluídos. Pacientes em que não era
possível visualização adequada do fundo do olho.
3.4
Controle populacional
Foram utilizados, como controles, 72 indivíduos caucasóides que não
apresentavam qualquer doença sistêmica ou ocular, doadores de medula óssea do
Hemocentro da USP de Ribeirão Preto, sendo 54 indivíduos do sexo masculino e 18
do sexo feminino. A idade dos controles variou de 22 a 52 anos de idade (mediana
38).
3.5
Método
A análise das amostras foi realizada no Laboratório de Imunologia Molecular
do HCFMRP-USP, com as etapas abaixo relacionadas:
Método | 55
3.5.1 Coleta de sangue e extração do DNA
O DNA de ambos os grupos foi extraído após a colheita, em veia periférica,
de 10 ml de sangue total, em tubos de vidro (Vácuo II-Labnew) estéreis, contendo
EDTA a 15% - 54 microlitros / tubo. Em seguida, o sangue foi transferido para um
tubo de 50 ml, sendo adicionado 40 ml de tampão de lise de hemácias gelado
(sacarose 0,3 M, Tris-HCl 10 mM – pH 7,5; MgCl2 5 mM e Triton X -100 1%). Após a
homogeneização e a centrifugação a 2400 x g a 4o C por 10 minutos, o
sobrenadante foi retirado e o precipitado novamente suspenso em 4,5 ml de tampão
de lise de leucócitos (NaCl 0,075M e Na2EDTA 0,024M), adicionando-se 125
microlitros de SDS 10% e 1,1 ml de perclorato de sódio 5M, agitando-se por 10
segundos na temperatura ambiente. Para extração das proteínas foram acrescidos 2
ml de NaCl saturado (6M), seguido de agitação por 15 segundos e centrifugação a
2400 x g na temperatura ambiente, durante 10 minutos. O sobrenadante foi
transferido para um tubo de 50 ml, adicionando-se 7 ml de isopropanol absoluto.
Após a inversão manual lenta do tubo, ocorreu a precipitação do DNA que, em
seguida foi retirado com o uso da pipeta de Pasteur selada e colocado em tubo tipo
Eppendorf, estéril, de 1,7 ml. Realizada a lavagem por uma vez em 1,5 ml de etanol
70% gelado, o DNA foi re-dissolvido em 250 microlitros de água autoclavada. O DNA
foi homogeneizado e a sua concentração determinada por espectrofotometria, com
leituras feitas em 260 e 280 nm (CASTALDELLI, 2000; MILLER, DYKES; POLESKY,
1988), sendo posteriormente estocado em freezer a -20oC.
3.5.2 Amplificação do DNA e restrição enzimática
As amostras de DNA obtidas de ambos os grupos foram amplificadas por
PCR, utilizando-se uma combinação de oligonucleotídeos previamente preparados.
Em seguida, o produto obtido foi submetido a RFLP com uma enzima de restrição
Método | 56
específica, para que os principais grupos alélicos fossem distinguidos de acordo com
o tamanho dos fragmentos gerados.
Para amplificar a região do éxon 4 do gene TP53, que contêm o DNA
polimórfico, foram utilizados dois iniciadores distintos, um para prolina e outro para
arginina, descritos em estudo semelhante (SENA, 2003), cujas seqüências foram:
Senso 5’3’:
- Pro – (5’ CGT GCA AGT CAC AGA CTT -3’, com 94 pb) para o polimorfismo
do gene TP53 (códon 72) na forma de prolina (XXIDT 119).
Anti-senso 5’3’:
- Arg + (5’ TCC CCC TTG CCG TCC CAA -3’, com 138 pb) para o
polimorfismo do gene TP53 (códon 72) na forma de arginina (XXIDT 119).
Foi padronizada a condição da PCR para cada amostra de DNA conforme
segue:
- 21,92 microlitros de água estéril
- 3,0 microlitros de tampão 10x Taq (Invitrogen)
- 1,2 microlitros de cloreto de magnésio (MgCl2) (Invitrogen)
- 0,38 microlitro de desoxirribonucleotídeos fosfatados (dNTPs) (Invitrogen)
- 0,9 microlitros de cada oligonucleotídeo iniciador (senso e anti-senso)
(Invitrogen)
- 0,2 microlitro de enzima Taq DNA polimerase (5U/microlitro) (Invitrogen)
- 1,5 microlitros de DNA purificado
Todos os reagentes estavam estocados à -20o C.
Método | 57
Procedimento:
1 - Todos os reagentes foram reunidos formando uma mistura com volume de
28,5 microlitros, ao qual foram adicionados os 1,5 microlitros de DNA purificado,
totalizando um volume de 30 microlitros. A enzima Taq polimerase foi adicionada
imediatamente antes de se colocar a preparação no termociclador. Como controle
negativo, foram utilizados todos os reagentes acima citados, exceto o DNA, com o
intuito de assegurar que não houve contaminação das amostras. Cada amostra foi
aliquotada em um microtubo de 500 microlitros devidamente numerado.
2 - A amplificação da região do éxon 4 do gene TP53 foi realizada através de
um programa de ciclo térmico no termociclador (Biocycler MJ96G-Biosystems), com
duração aproximada de 2 horas e 15 minutos e consistiu de três etapas:
- 1 ciclo a 94o C durante 5 minutos, aquecendo a amostra para que haja a
desnaturação do DNA, ou seja, a separação das fitas complementares (dupla hélice);
- 35 ciclos: 94o C por 45 segundos, 60o C por 45 segundos e 72o C por 45
segundos. Nesta etapa os iniciadores de oligonucleotídeos, complementares à
região a ser amplificada, hibridizam-se com as respectivas extremidades das fitas
despareadas de DNA.
- 1 ciclo final a 72o C durante 4 minutos, que é quando a Taq polimerase
acrescenta
nucleotídeos
em
seqüência
aos
iniciadores,
formando
a
fita
complementar.
Assim, duas novas fitas são sintetizadas nos moldes das duas originais,
completando o ciclo da PCR. Para cada ciclo da PCR, o número de cópias da
seqüência
do
DNA
exponencialmente.
nos
locais
do
iniciador
é
duplicado
e
acumulado
Método | 58
3 - Cinco microlitros do produto final da PCR, corados com 5 microlitros de
Azul de Bromofenol 0,025%, foram analisados através da eletroforese em gel de
poliacrilamida 10%, não desnaturante, corado com nitrato de prata 2%, verificandose se houve a correta amplificação (produto final com 279 pb).
Foi padronizada a condição da RFLP para cada amostra de DNA conforme
segue:
- 1,5 microlitros de água estéril
- 1,0 microlitro de tampão 10x Tango TN com BSA (Fermentas,U.S.A)
- 0,5 microlitro da enzima de restrição BseDI (10 U/microlitro) (Fermentas,
U.S.A)
- 7,0 microlitros de DNA amplificado
- Banho-Maria (BM-100, FANEM® - São Paulo-Brasil)
Procedimento:
1 - Sete microlitros do produto da PCR foram submetidos à RFLP em uma
solução de 3,0 microlitros (total da mistura dos reagentes), totalizando 10 microlitros.
Cada amostra foi aliquotada em um microtubo de 500 microlitros devidamente
numerado.
2 - A amostra foi colocada no banho-maria durante 12 horas a 55o C.
3 - Os fragmentos de DNA resultantes dessa restrição enzimática (5
microlitros da amostra corados com 5 microlitros de Azul de Bromofenol 0,025%),
foram analisados em gel de poliacrilamida 10%, corado com nitrato de prata 2%,
analisando-se o padrão de bandeamento do DNA para se distinguirem os principais
grupos alélicos, de acordo com o tamanho dos fragmentos gerados.
Método | 59
A presença do fragmento com 138 pb representa o alelo Arg, e do fragmento
com 94 pb, o alelo Pro. O genótipo da amostra poderia ser homozigoto Arg/Arg ou
homozigoto Pro/Pro ou heterozigoto Arg/Pro.
Material utilizado para a preparação do gel de poliacrilamida 10% e eletroforese :
- 2 placas de vidro de tamanho médio,espaçadores e pente
- 20 ml de “Mix” gel não desnaturante a 10%
- 20 microlitros TEMED (C6H16N2)
- 350 microlitros de perssulfato de potássio (K2O8S2)
-marcador de DNA de peso molecular de 100 pb (Promega-Madison, U.S.A)
- amostras de DNA coradas com Azul de Bromofenol 0,025%
- TBE 1x (Tris Boric Acid) - condutor
- cuba de eletroforese
- fonte de eletroforese fixada em 200 V
- 100 ml de solução fixadora alcoólica 10% com ácido acético
- 1 ml nitrato de prata 2%
- 100 ml de solução reveladora com 1 ml formaldeído
- 100 ml de solução fixadora
Após a preparação, o gel foi imediatamente aplicado a um cassete de
tamanho determinado, previamente montado. Este cassete é composto por duas
placas de vidro colocadas sobre um suporte, separadas por espaçadores de teflon e
presas com grampos de aço. Logo em seguida da aplicação do gel entre as placas,
colocou-se um pente de teflon na borda superior, este tem por função formar os
sulcos
onde,
posteriormente,serão
aplicadas
polimerização foi de aproximadamente 15 minutos.
as
amostras.
O
tempo
de
Método | 60
Com o gel polimerizado, o pente foi retirado e este montado em uma cuba de
eletroforese vertical contendo tampão TBE em ambos os pólos.
As amostras, misturadas ao corante, foram aplicadas no gel, assim como o
marcador de migração, e o equipamento ligado a uma fonte de alta voltagem e submetido
à voltagem constante, pelo tempo aproximado de 1 hora e 30 minutos. Retirado da placa,
o gel foi colocado na solução fixadora por 5 minutos e, em seguida, adicionou-se à
solução fixadora 1 ml de solução de nitrato de prata. O gel foi agitado por 5 minutos
nessa solução. Depois de descartada a solução fixadora com prata, o gel foi lavado 1 vez
em água. Desprezada a água, foi colocada a solução reveladora com formaldeído sobre
o gel, que foi agitado até o aparecimento das bandas.
Realizada a leitura dos géis, estes foram secos para serem arquivados. A
secagem foi feita colocando-se os mesmos entre duas folhas de papel celofane
embebidas em água, sobre uma placa de vidro, à temperatura ambiente por 2 ou 3 dias.
3.6
Análise Estatística
A freqüência do polimorfismo do gene TP53 foi calculada para a amostra total
de 67 pacientes e para os 72 indivíduos-controle. A análise estatística foi realizada
pelo teste do Qui-Quadrado (‫א‬2), com correção de Yates, ou pelo teste exato de
Fisher Bicaudal, quando necessário. O mesmo foi aplicado para verificar a
significância estatística das associações, quando comparadas com as freqüências
de cada genótipo, alelos e antígenos estudados na amostra total de pacientes e
controles. Os valores iguais ou inferiores a 0,05 (Intervalo de Confiança=95%) foram
considerados significantes(HENNEKENS e BURING, 1987).
Todas as análises foram realizadas utilizando-se o software StatCal (Epi
Info,versão 6.0).
4.
RESULTADOS
Resultados | 62
Foram selecionados 73 pacientes com GPAF para este Estudo, sendo que
seis pacientes foram excluídos, pois não era possível visualização adequada das
características do nervo óptico. Para análise dos resultados foram escolhidos um
olho de cada paciente, que apresentavam maior alteração no nervo óptico.
A média de idade dos indivíduos foi de 65,64 ± 10,33 anos (variando de 34 a
84 anos), sendo 48 pacientes, no grupo com GPAF, com história de crise aguda, a
idade foi de 66,25 ± 8,72 anos (variando de 46 a 81 anos) e 19 pacientes com
GPAF, sem história de crise aguda, foi de 63,95 ± 14,04 anos (variando de 34 a 84
anos). 43 pacientes (65,1%) eram do sexo feminino, 2 (2,8%) eram pardos, 64
(97,2%) eram brancos. A proporção de pacientes do sexo feminino e do sexo
masculino, no grupo com GPAF, foi estatisticamente diferente da do grupo-controle
(p < 0,05).
A sensibilidade da eletroforese em gel de poliacrilamida, seguida de coloração
com nitrato de prata, permitiu a visualização bem definida dos alelos no loci
analisados (Figura 1).
Figura 1. Eletroforese em gel de poliacrilamida seguida de coloração com nitrato de
prata.
Resultados | 63
PCR–RFLC para a detecção do polimorfismo Arg72Pro no exon 4 do gene
TP53, digeridos com a enzima de BseDI. Gel de poliacrilamida 10% não
desnaturante, corado com nitrato de prata.
Tabela 1 e 2 apresentam os resultados da tipificação dos subtipos Pro/Pro,
Arg/Arg e Arg/Pro do polimorfismo do gene TP53 (códon 72), nos 73 pacientes com
GPAF e 72 nos pacientes controles.
Tabela 1. Distribuição dos genótipos Pro/Pro, Arg/Arg e Arg/Pro nos pacientes com
GPAF.
REGISTRO
GENÓTIPO
SEXO
IDADE
COR
AV OD
AV OE
AMETROPIA
FO OD
FO OE
CRISE
0373275I
ARG/ARG
F
51
B
CD
0,9
Hipermetrope
1,0/1,0
0,9/1,0
SIM
0190674K
PRO/PRO
M
57
B
1
0,4
Míope
0,6/0,6
0,9/0,9
SIM
0305824K
ARG/ARG
F
65
B
SPL
CD
Hipermetrope
inviável
0,6/0,7
SIM
0504867I
ARG/PRO
M
65
B
0,7
0,8
Míope
0,8/0,8
0,8/0,8
SIM
0458877G
ARG/ARG
M
65
B
0,8
PL
Hipermetrope
0,4/0,4
1,0/1,0
SIM
0358397F
ARG/PRO
F
66
B
0,3
0,5
Míope
0,1/0,1
0,2/0,1
SIM
0401127E
ARG/ARG
M
66
B
1
CD
Hipermetrope
0,9/0,8
1,0/1,0
SIM
0478547E
ARG/PRO
M
66
B
MM
SPL
Hipermetrope
0,9/1,0
1,0/1,0
SIM
0181286A
ARG/PRO
F
67
B
SPL
0,7
Míope
inviável
1,0/0,9
SIM
0160441E
ARG/ARG
F
68
B
CD
0,4
Míope
0,5/0,5
0,5/0,5
SIM
0361236C
ARG/ARG
M
74
B
SPL
0,4
Hipermetrope
inviável
0,2/0,2
SIM
0460663A
ARG/PRO
M
76
B
0,8
0,1
Míope
1,0/0,8
0,9/0,7
SIM
0491343G
ARG/ARG
M
78
B
CD
0,05
Hipermetrope
1,0/0,9
0,9/0,8
SIM
0370419H
ARG/ARG
F
80
B
MM
CD
Míope
inviavel
0,8/0,8
SIM
0392099K
ARG/PRO
F
81
B
0,3
SPL
Hipermetrope
0,5/0,4
1,0/1,0
SIM
0404478F
ARG/ARG
F
81
B
1
CD
Míope
0,4/0,4
0,6/0,6
SIM
0462268B
ARG/ARG
F
75
P
SPL
SPL
Hipermetrope
inviavel
inviavel
SIM
0156H
ARG/PRO
F
65
N
SPL
CD
Míope
1,0/1,0
0,9/0,9
SIM
0121969A
ARG/ARG
F
50
B
0,8
0,9
Hiperm
0,4/0,4
0,8/0,8
SIM
0734268K
ARG/ARG
M
64
B
MM
0,8
Hiperm
0,9/0,9
0,7/0,7
SIM
0635623C
ARG/PRO
M
67
B
0,2
0,2
Hiperm
0,4/0,4
0,4/0,4
SIM
Resultados | 64
REGISTRO
GENÓTIPO
SEXO
IDADE
COR
AV OD
AV OE
AMETROPIA
FO OD
FO OE
CRISE
0558851A
PRO/PRO
M
80
B
1
0,8
Hiperm
0,9/0,9
0,8/0,8
SIM
0483694H
ARG/ARG
F
64
B
0,8
0,4
Hiperm
0,9/0,9
0,9/0,9
SIM
0874894J
ARG/PRO
M
68
B
0,8
0,8
Hiperm
0,9/0,9
0,9/0,9
SIM
0776419E
ARG/ARG
F
76
B
0,3
MM
Hiperm
0,9/0,8
0,9/0,8
SIM
1560143
PRO/PRO
F
71
B
0,4
0,4
Hiperm
08/0,8
08/0,8
SIM
1043162
ARG/PRO
F
56
B
0,2
0,2
Hiperm
0,9/0,9
0,9/0,9
SIM
1292702
ARG/ARG
F
59
B
0,4
0,8
Hiperm
0,8/0,8
0,4/0,5
SIM
1067615
ARG/PRO
F
81
B
1
1
Hiperm
0,3/0,4
0,3/0,4
SIM
349320B
ARG/PRO
F
76
B
0,2
0,1
Hiperm
0,9/0,9
0,9/0,8
SIM
1092555I
ARG/PRO
F
71
B
0,7
0,5
Hiperm
0,7/0,7
0,7/0,6
SIM
1395129
ARG/PRO
F
69
B
0,6
0,5
Hiperm
0,7/0,7
0,8/0,7
SIM
1416895G
ARG/PRO
F
53
B
0,8
0,8
Hiperm
0,4/0,5
0,5/0,4
SIM
1405615F
ARG/PRO
F
54
B
0,7
0,8
Hiperm
0,7/0,6
0,7/0,8
SIM
1234515A
ARG/PRO
F
55
B
0,5
0,7
Hiperm
0,7/0,8
0,8/0,8
SIM
1112518
PRO/PRO
F
67
B
0,1
0,2
Hiperm
0,9/0,8
0,9/0,9
SIM
1417632
ARG/ARG
F
62
B
0,9
0,8
Hiperm
0,7/0,8
0,7/0,8
SIM
0850076H
ARG/ARG
M
46
B
0,84
0,84
Hiperm
0,5/0,6
0,5/0,6
SIM
0222011A
ARG/PRO
F
72
B
0,84
0,84
Hiperm
0,8/0,8
0,8/0,8
SIM
0273556I
ARG/PRO
F
60
B
0,84
0,5
Hiperm
0,5/0,6
0,7/0,6
SIM
0508577I
ARG/ARG
F
65
B
0,9
0,9
Hiperm
0,4/0,4
0,4/0,4
SIM
0482309C
ARG/PRO
F
68
B
0,2
0,84
Hiperm
0,8/0,8
0,4/0,4
SIM
0905654A
ARG/PRO
M
72
B
0,28
0,84
Hiperm
0,8/0,8
0,2/0,2
SIM
0835079C
PRO/PRO
F
63
B
CD
0,84
Hiperm
0,8/0,8
0,4/0,5
SIM
0791591I
ARG/ARG
F
63
B
CD
0,84
Hiperm
0,8/0,8
0,4/0,5
SIM
0775926A
PRO/PRO
M
53
B
CD
0,7
Hiperm
0,9/0,8
0,9/0,8
SIM
0614056J
ARG/ARG
F
78
N
0,2
0,2
Hiperm
0,9/0,9
0,9/0,9
SIM
0420578J
ARG/PRO
F
60
B
0,4
CD
Hiperm
0,7/0,7
0,9/0,9
SIM
0673134E
ARG/PRO
F
69
B
0,9
0,9
Hiperm
0,4/0,4
0,4/0,4
SIM
0898962C
ARG/PRO
F
56
B
0,9
0,1
Hiperm
0,3/0,3
0,9/0,9
SIM
0717220F
ARG/PRO
F
72
B
0,6
0,4
Míope
0,9/0,9
0,9/,9
SIM
0890030B
ARG/ARG
F
61
B
0,9
0,9
Hiperm
0,7/0,7
0,7/0,7
SIM
0822255D
ARG/PRO
M
64
B
0,8
0,4
Hiperm
0,6/0,6
0,7/0,7
SIM
Resultados | 65
REGISTRO
GENÓTIPO
SEXO
IDADE
COR
AV OD
AV OE
AMETROPIA
FO OD
FO OE
CRISE
0377664I
ARG/ARG
M
34
B
0,6
1
Míope
0,9/1,0
0,9/1,0
NÃO
0498171F
ARG/ARG
F
40
B
1
1
Hipermetrope
0,4/0,4
0,6/0,5
NÃO
0115314I
ARG/PRO
F
41
B
1
1
Míope
0,7/0,6
0,5/0,5
NÃO
0129155K
ARG/ARG
M
50
B
0,7
0,8
Míope
0,2/0,3
0,2/0,3
NÃO
0508577I
ARG/ARG
F
57
B
0,9
1
Hipermetrope
0,4/0,4
0,3/0,4
NÃO
0422342A
ARG/ARG
F
65
B
1
0,9
Hipermetrope
0,4/0,3
0,4/0,4
NÃO
0145951B
ARG/ARG
F
66
B
0,3
0,1
Hipermetrope
0,5/0,6
0,2/0,3
NÃO
0478552G
ARG/ARG
M
66
B
0,8
0,8
Míope
0,9/0,8
0,9/0,8
NÃO
0172435J
ARG/PRO
F
67
B
0,8
0,4
Míope
0,3/0,3
0,4/0,5
NÃO
0488224I
ARG/PRO
M
69
B
CD
CD
Hipermetrope
0,9/0,9
0,9/0,9
NÃO
0228404B
ARG/ARG
M
69
B
1
CD
Hipermetrope
0,5/0,5
0,5/0,5
NÃO
0120108C
ARG/ARG
F
70
B
0,7
SPL
Hipermetrope
0,7/0,6
1,0/1,0
NÃO
0242482I
ARG/ARG
M
71
B
0,8
0,1
Míope
0,3/0,3
0,6/0,6
NÃO
0305966D
ARG/PRO
M
73
B
1
1
Míope
0,1/0,2
0,2/0,2
NÃO
0475820J
ARG/ARG
F
76
B
0,7
0,7
Hipermetrope
0,5/0,5
0,4/0,4
NÃO
0308158K
ARG/ARG
M
78
B
0,3
0,1
Míope
0,8/0,8
0,5/0,6
NÃO
0337220K
ARG/PRO
F
81
B
0,2
0,3
Míope
0,3/0,3
0,3/0,3
NÃO
0539986A
ARG/PRO
F
84
B
0,1
0,1
Míope
0,5/0,5
0,6/0,6
NÃO
0363195B
ARG/PRO
F
58
P
0,9
0,6
Míope
0,7/0,6
0,8/0,7
NÃO
0485282K
PRO/PRO
F
55
N
1
SPL
Míope
0,5/0,5
inviavel
NÃO
Tabela 2. Distribuição dos genótipos Pro/Pro, Arg/Arg e Arg/Pro nos 72 controles.
REGISTRO
GENÓTIPO
SEXO
IDADE
616
ARG/ARG
Fem
29
628
ARG/ARG
Fem
44
751
ARG/ARG
Fem
36
754
ARG/PRO
Masc
38
760
ARG/ARG
Fem
46
772
PRO/PRO
Masc
51
774
ARG/PRO
Masc
43
775
ARG/PRO
Fem
30
Resultados | 66
REGISTRO
GENÓTIPO
SEXO
IDADE
784
ARG/ARG
Fem
36
788
ARG/ARG
Fem
49
791
ARG/ARG
Masc
42
800
ARG/ARG
Fem
46
810
ARG/PRO
Masc
42
813
ARG/ARG
Masc
31
815
ARG/ARG
Masc
41
823
ARG/ARG
Masc
47
825
ARG/ARG
Masc
44
830
ARG/ARG
Fem
22
840
ARG/PRO
Fem
31
842
ARG/PRO
Masc
51
843
ARG/PRO
Masc
39
844
ARG/ARG
Masc
40
845
ARG/PRO
Masc
37
847
ARG/ARG
Fem
39
857
ARG/ARG
Masc
43
861
ARG/ARG
Masc
37
862
ARG/PRO
Fem
52
865
ARG/ARG
Masc
42
867
ARG/PRO
Fem
24
868
ARG/ARG
Masc
30
869
ARG/PRO
Masc
38
870
ARG/ARG
Fem
35
872
ARG/ARG
Masc
36
877
ARG/PRO
Masc
28
878
ARG/PRO
Fem
43
883
ARG/PRO
Masc
33
885
ARG/PRO
Masc
34
886
ARG/PRO
Masc
33
887
ARG/PRO
Masc
41
888
ARG/ARG
Masc
30
892
ARG/ARG
Fem
43
Resultados | 67
REGISTRO
GENÓTIPO
SEXO
IDADE
898
ARG/ARG
Masc
41
899
ARG/ARG
Fem
30
904
ARG/PRO
Masc
26
906
ARG/PRO
Masc
30
907
ARG/PRO
Masc
47
911
ARG/ARG
Masc
38
915
PRO/PRO
Masc
29
918
ARG/ARG
Masc
34
919
ARG/ARG
Masc
37
920
ARG/PRO
Masc
39
932
ARG/PRO
Masc
23
949
ARG/PRO
Masc
42
950
ARG/ARG
Masc
47
952
PRO/PRO
Masc
38
964
PRO/PRO
Masc
35
968
ARG/PRO
Masc
27
980
ARG/ARG
Masc
39
998
ARG/ARG
Masc
34
1006
ARG/PRO
Masc
40
1007
ARG/PRO
Masc
40
1011
ARG/ARG
Masc
34
1012
ARG/ARG
Masc
30
1013
ARG/PRO
Masc
32
1020
ARG/PRO
Masc
42
1021
ARG/PRO
Masc
41
1040
ARG/ARG
Masc
33
1052
ARG/ARG
Masc
49
1057
ARG/ARG
Masc
51
1058
ARG/ARG
Fem
32
1064
ARG/ARG
Masc
40
1066
ARG/ARG
Masc
34
Resultados | 68
No cálculo dos valores de probabilidade (p), não houve diferença significativa
na freqüência genotípica para o polimorfismo (PRO/PRO, ARG/ARG e ARG/PRO)
do gene p53, entre grupo com GPAF e do grupo- controle; obteve-se p = 0,3984
(Tabela 3)
Tabela 3. Freqüência genotípica absoluta e relativa dos grupos com GPAF e do
grupo-controle, de acordo com o polimorfismo (PRO/PRO, ARG/ARG e ARG/PRO)
do gene TP53 (códon 72).
Grupo
Genótipo
PRO/PRO N(%)
ARG/ARG N(%)
ARG/PRO N(%)
GPAF
6 (8,9%)
29 (43,3%)
32(47,8%)
Controles
4 (5,5%)
39 (54,2%)
29 (40,3%)
No cálculo dos valores de probabilidade (p) para os alelos, não houve
diferença significativa entre os alelos do grupo com GPAF e do grupo- controle;
obteve-se p = 0,2345. (Tabela 4)
Tabela 4. Freqüência alélica absoluta e relativa dos grupos com GPAF e do grupocontrole, de acordo com o polimorfismo do gene TP53 (códon 72).
Prolina
Arginina
Total
GPAF
44 (32,8%)
90 (67,2%)
134
Controles
37 (25,7%)
107 (74,3%)
144
Total
81
197
278
Resultados | 69
No cálculo dos valores de probabilidade (p) para os alelos, houve diferença
significativa entre o grupo com GPAF, com crise aguda, quando comparado ao
grupo-controle; obteve-se p = 0,0455. (Tabela 5)
Tabela 5. Freqüência alélica absoluta e relativa dos grupos com GPAF, com história
de crise, e do grupo-controle de acordo com o polimorfismo do gene TP53 (códon
72).
Prolina
Arginina
Total
GPAF com crise
37 (38,5%)
59 (62,5%)
88
Controle
37 (25,7%)
107 (74,3%)
144
Total
74
166
240
No cálculo dos valores de probabilidade (p) para os alelos, não houve
diferença significativa entre o grupo com GPAF, sem crise aguda, quando
comparado ao grupo-controle; obteve-se p = 0,4017 (tabela 6).
Tabela 6. Mostra a freqüência alélica absoluta e relativa dos grupos com GPAF, sem
história de crise, e do grupo-controle, de acordo com o polimorfismo do gene TP53
(códon 72).
Prolina
Arginina
Total
GPAF sem crise
7 (18,4%)
31 (81,6%)
38
Controle
37 (25,7%)
107 (74,3%)
144
Total
44
136
180
Resultados | 70
No cálculo dos valores de probabilidade (p) para os alelos, houve diferença
significativa entre o grupo com GPAF, com crise aguda, quando comparado ao
grupo com GPAF sem crise; obteve-se p = 0,0251 OR: 2,9 (Tabela 7).
Tabela 7. Freqüência alélica absoluta e relativa dos grupos com GPAF, sem história
de crise, de acordo com o polimorfismo do gene TP53 (códon 72).
Prolina
Arginina
Total
GPAF com crise
38 (39,6%)
58 (60,4%)
96
GPAF sem crise
7 (18,4%)
31 (81,6%)
38
Total
45
89
134
No grupo com GPAF, classificou-se “grave” aqueles que tinham escavação do
nervo óptico maior ou igual a 0,7 e “leve” aqueles que tinham escavação do nervo
óptico menor que 0,6.
No cálculo dos valores de probabilidade (p) para os alelos, não houve
diferença significativa entre os grupos com GPAF, considerando-se a escavação do
nervo óptico; obteve-se p = 0,0744 (tabela 8).
Tabela 8. Freqüência alélica absoluta e relativa nos pacientes com GPAF,
considerando-se o dano do nervo óptico, de acordo com o polimorfismo do gene
TP53 (códon 72).
Prolina
Arginina
Total
GPAF graves
35 (38,0%)
57 (62%)
92
GPAF leves
9 (16,7%)
33 (83,3%)
42
Total
44
90
134
Resultados | 71
No cálculo dos valores de probabilidade (p) para os alelos, não houve
diferença significativa entre os grupos com GPAF com crise, considerando-se a
escavação do nervo óptico; obteve-se p = 0,4217 (Tabela 9).
Tabela 9. Freqüência alélica absoluta e relativa dos grupos com GPAF com crise,
considerando-se o dano do nervo óptico, de acordo com o polimorfismo do gene
TP53 (códon 72).
Prolina
Arginina
Total
GPAF graves
32 (41%)
46 (59%)
78
GPAF leves
5 (24,5%)
13 (75,5%)
18
Total
37
59
96
No cálculo dos valores de probabilidade (p) para os alelos, não houve
diferença significativa entre os grupos com GPAF sem crise, considerando-se a
escavação do nervo óptico; obteve-se p = 1,000 (Tabela 10).
Tabela 10. Freqüência alélica absoluta e relativa dos grupos com GPAF sem crise,
considerando-se o dano do nervo óptico, de acordo com o polimorfismo do gene
TP53 (códon 72).
Prolina
Arginina
Total
GPAF graves
3 (21,4%)
11 (78,6%)
14
GPAF leves
4 (16,7%)
20 (83,3%)
24
Total
7
31
38
5.
DISCUSSÃO
Discussão | 73
Desde a descrição da estrutura do DNA, por WATSON e CRICK (1953), e o
desenvolvimento do Projeto Genoma Humano, a extensão de informações contida
nessa molécula ainda é uma incógnita para muitas doenças. Sabe-se, hoje, que
existem por volta de 35 mil genes, muitos com função conhecida e que codificam um
número muito maior de proteínas do que se supunha (FINISHING THE
EUCHROMATIC SEQUENCE OF THE HUMAN GENOME, 2004).
O rápido avanço tecnológico, na análise dos genes, informações do genoma
humano e a viabilidade da bioinformática, têm levado à indicação de muitos genes
candidatos às doenças oculares, como o glaucoma(FAN, WANG et al., 2006). A
análise molecular desses genes candidatos às doenças tem fornecido informações
para o estabelecimento de marcadores genéticos úteis ao diagnóstico. Há muitas
vantagens no diagnóstico molecular como, por exemplo: (a) providenciar um teste
inequívoco de alta especificidade; (b) possibilitar a identificação de portadores
assintomáticos, mais susceptíveis de desenvolverem a doença do que os nãoportadores, predizendo o risco de doença ocular genética intratável e efetiva
prevenção das tratáveis; (c) providenciar informações para consulta genética; (d)
instituir serviços de diagnóstico pré-natal(FAN, WANG et al., 2006).
O GPAA é uma doença neurodegenerativa que reduz a visão à medida que
as células ganglionares morrem(HARRIS, 1965; STONE, FINGERT et al., 1997;
REZAIE, CHILD et al., 2002, MELLO, MANDIA et al., 2006). A pressão intra-ocular
(JONAS, XU et al., 2009), hereditariedade(LIBBY, GOULD et al., 2005), idade
(JONAS, XU et al., 2009), miopia(LAM, THAM et al., 2002), diabetes (ARMALY e
BALOGLOU, 1967), hipotensão arterial (BONOMI, MARCHINI, MARRAFFA,
BERNARDI, MORBIO et al., 2000), entre outros, são citados como fatores de risco
para desenvolvimento e progressão do glaucoma.
Discussão | 74
A apoptose pode ser a via final comum da morte das células ganglionares no
glaucoma, pois marcadores de apoptose têm sido observados na retina de pacientes
glaucomatosos e em glaucoma experimental (QUIGLEY, NICKELLS et al., 1995). O
processo apoptótico requer a expressão de genes específicos e pode ser
identificado usando-se métodos histoquímicos e bioquímicos (QUIGLEY, NICKELLS
et al., 1995; KERRIGAN, ZACK et al., 1997; OKISAKA, MURAKAMI et al., 1997).
Um dos principais genes envolvidos na apoptose é o TP53, que expressa a
proteína p53 (LANE, 1992; PINHO, 2000). Essa é uma proteína supressora tumoral
que parece estar envolvida na prevenção de desenvolvimento de tumores, sendo
ativada em resposta a vários sinais de estresse, associados à malignidade,
resultando na inibição do crescimento das células tumorais, incluindo-se a
suspensão do ciclo celular, envelhecimento celular, diferenciação celular e apoptose,
dependendo de muitos fatores que são intrínsecos e extrínsecos à célula, tais como
o tipo celular, ambiente celular e outras alterações oncogênicas que são
experimentais pela célula (BALINT e VOUSDEN, 2001; VOUSDEN e LU, 2002).
Geralmente, a célula recebe o estímulo para morrer. Para as células
ganglionares retinianas, no glaucoma, esse estímulo pode ser na forma de perda do
suporte neurotrófico, durante os períodos de PIO elevada (OPPENHEIM, 1991) e/ou
exposição a um excesso de aminoácidos excitatórios (excitotoxinas), tais como
glutamato liberado quando ocorre a isquemia do nervo óptico e das células
glanglionares retinianas (LIPTON e ROSENBERG, 1994; NASKAR e DREYER,
2001).
O dano celular se inicia e é detectado por alguma forma de sensor protéico
que ainda não está caracterizado, cuja função crítica parece ser ativar a proteína
supressora tumoral p53, que desencadeia a apoptose (NICKELLS, 1999),
Discussão | 75
Partindo-se da hipótese de que o gene TP53 poderia ter algum papel na
neuropatia glaucomatosa, foram desenvolvidos vários estudos em pacientes com
GPAA como os de LIN, CHEN et al. (2002) que encontraram predominância da
forma Pro/Pro, porém ACHARYA, MITRA et al. (2002) não encontraram nenhuma
associação.
O presente Estudo investigou o polimorfismo do gene TP53 (códon 72) em
pacientes com GPAF, recrutados no ambulatório de Glaucoma do Setor de
Oftalmologia do HCFMRP-USP e do HSPE e em controles sadios, através da
técnica PCR-RFLP, em virtude de ser uma técnica de realização simples e de baixo
custo, ao contrário da técnica de seqüência direta do DNA.
Segundo o Consenso da Sociedade Brasileira de Glaucoma, o GPAF é uma
entidade clínica caracterizada pelo fechamento parcial ou completo do ângulo da
câmara anterior, decorrente de condições anatômicas que propiciam formações de
goniossinéquias, com conseqüente elevação da PIO de forma aguda, intermitente ou
crônica, com eventual lesão do disco óptico (MELLO, MANDIA et al., 2006).
Na população geral, existem muito mais indivíduos que apresentam seio
camerular estreito do que pacientes que realmente desenvolvem uma crise
congestiva ou GPAF assintomático (WILENSKY, RITCH et al., 1996). Admite-se
que, se o mecanismo responsável pelo bloqueio mecânico do trabeculado for
eliminado de maneira precoce, antes de ocorrerem lesões no sistema de drenagem
do humor aquoso, existe a possibilidade teórica da interrupção do processo da
doença (RITCH, R. e LOWE, R., 1996b).
Na população desse estudo de GPAF, comparada aos controles, não houve
diferença significativa: na distribuição gênica com 47,8%, Arg Homozigótica, 43,3%
heterozigótica e 8,9% Pro homozigótica 47,8% Arg Homozigótica, 43,3% heterozigótica
Discussão | 76
e 8,9% Pro homozigótica, enquanto nos normais foi de 40,3% Arg Homozigótica, 54,2%
heterozigótica e 5,5% Pro homozigótica (p = 0,3984). Também SILVA, ARRUDA et al.
(2009) avaliaram a ocorrência do polimorfismo da proteína p53 (códon 72) Arg-Pro
(CGC to CCC) na população brasileira. Foram avaliados 104 pacientes com GPAA e 58
normais, não havendo diferença significativa entre os dois grupos (p = 0,3311). A
distribuição gênica, nos pacientes com GPAA, foi 23,07% Arg homozigótica, 75%
heterozigótica e 1,93% Pro homozigótica, enquanto que, para os normais, encontrou-se
31,04% Arg homozigótica, 68,96% heterozigótica e 0% Pro homozigótica.
O alelo mais comum, nos pacientes com GPAF e nos controles, foi a Arg72
(67,2% e 74,3%, respectivamente); também não houve diferença significativa (p =
0,2345).
Em pacientes com GPAA, LIN, CHEN et al. (2002) estudaram pacientes
chineses e encontraram diferenças significativas na distribuição do polimorfismo do
gene p53 no códon 72 (p = 0,00782). Também demonstraram que o alelo Pro foi
fator de risco para os pacientes com GPAA (odds ratio 2.389, 95% confidence
interval: 1.14 to 5.01).
Com SENA (2003), em seu estudo, a forma Pro/Pro, embora menos freqüente
nos pacientes americanos com GPAA e com GPN, apareceu em proporção maior
nesses pacientes do que nos indivíduos controle e foi associada à presença de
alterações no campo visual atribuíveis ao glaucoma.
RESSINIOTIS,
GRIFFITHS
et
al.
(2004)
estudaram
esse
mesmo
polimorfismo, bem como uma duplicação de 16 pares de base (pb) no ítron 3 do
gene TP53, em uma população britânica, e observaram diferença significativa na
distribuição do haplóide p53, que tinha a inserção de 16pb em conjunção com o
polimorfismo do alelo Arg, no códon 72, em pacientes com GPAA.
Discussão | 77
DAUGHERTY, CURTIS et al. (2009) estudaram, na população caucasiana, a
incidência do polimorfismo da proteína p53 (códon 72). Foram estudados 191
pacientes caucasianos com GPAA e 167 controles caucasianos. Foi encontrada
significativa diferença na freqüência da Arg72Pro entre o grupo de GPAA e controle
(p = 0,008). Pacientes, com homozigóticos para Arg, tinham risco 1,9 maior no
desenvolvimento de glaucoma (p = 0,01). Foi encontrada, também, maior freqüência
desse alelo nos pacientes com glaucoma de pressão normal do que com GPAA
(0,81 versus 0,76).
Diferentemente dos anteriores, ACHARYA, MITRA et al. (2002) também
avaliaram a ocorrência do polimorfismo da proteína p53 (códon 72) mais o
polimorfismo de uma duplicação no íntron 3 de 16 db. Na população indiana com
GPAA, não foi encontrada diferença significativa em relação à população controle (p
= 0,5627)
DIMASI, HEWITT et al. (2005) também estudaram a ocorrência do
polimorfismo da proteína p53 (códon 72) e da inserção 16dp no íntron 3 do gene
TP53, em australianos com GPAA, comparando-os com um grupo- controle e
concluíram que o polimorfismo da proteína p53, na forma Arg/Pro, não está
associado com a presença de GPAA.
MABUCHI, SAKURADA et al. (2009) avaliaram, na população japonesa, a
ocorrência do polimorfismo da proteína p53 (códon 72) do exon 4 e da inserção
16dp no íntron 3. Avaliaram-se 425 pacientes com GPAA, incluindo 213 com
pressão elevada e 212 com pressão normal, comparando-os com 189 normais. Não
foram encontradas diferenças significativa entre os grupos e ainda não foi
encontrada 16dp, no íntron 3.
Discussão | 78
SAGLAR, YUCEL et al. (2009), em estudo de cohort, investigaram, na
população turca, a associação entre a Apoliprotein E (APOE), proteína supressora
tumoral (p53) e do inibidor 1A da quinase ciclina dependente (p21), em pacientes
com GPAA. Foram avaliados 75 pacientes com GPAA e 119 normais. Não foi
encontrada diferença significativa na distribuição de APOE, p53 e p21, entre os
pacientes normais e GPAA (p = 0,38, p = 0,12 e p = 0,2 respectivamente).
Em outro trabalho, realizado pelo grupo de pesquisa da FMRP-USP VARGAS
(2009), verificou-se que, em GPAA, o genótipo mais freqüente nos pacientes com
GPAA foi o Arg/Pro (49%) e o alelo mais freqüente é a Arginina ( 67,6% ).
Neste Estudo, o alelo Pro72 ocorreu em maior freqüência e a diferença foi
significativa, no grupo com GPAF com história de crise aguda, quando comparado
ao grupo controle (p = 0,0455),
enquanto que, nos pacientes com GPAF, sem
história de crise aguda, não houve diferença estatística (p = 0,4017). Quando se
compararam os grupos com GPAF, com e sem história de crise aguda, houve
diferença estatisticamente significativa para o alelo Pro72 (p = 0,0251/OR 2,9);
assim, os indivíduos que apresentam o alelo Pro72 têm chance 2,9% maior de ter
crise aguda do que os que têm GPAF, mas não apresentam esse alelo.
Não se encontrou, na literatura, explicação para o fato, pois a hipótese era a
de que, em todas as formas de glaucoma, a Arginina estivesse mais freqüente, uma
vez que o alelo Arg72 tem se mostrado com maior capacidade para provocar
apoptose (DUMONT, LEU et al., 2003).
Assim, apesar de não fazer parte dos objetivos iniciais, decidiu-se verificar se
participantes do estudo não desenvolveram co-morbidades que pudessem estar
causando vieses nos resultados. Apenas um indivíduo apresentou tumor maligno e a
sua retirada do estudo não modificaria os resultados.
Discussão | 79
Considerou-se, também, a hipótese de que o gene TP53 poderia estar
envolvido em mecanismos determinantes das condições anatômicas dos olhos com
fechamento angular, mas nem o método utilizado para inclusão dos pacientes no
estudo, nem a revisão da literatura permitiram a confirmação dessa hipótese. Por
isso, pretende-se continuar com a linha de pesquisa, para esclarecer melhor os
achados.
Neste Estudo, dividiram-se os indivíduos em dois grupos: GPAF graveaqueles olhos com nervos ópticos com escavação maior ou igual a 0,7 e não gravecom nervos ópticos com escavação menor que 0,6. Quando avaliada a freqüência
alélica do grupo com GPAF e do grupo-controle, não foi encontrada diferença
significativa (p = 0,0744), tanto para o grupo com história de crise ou sem (p =
0,4217 e 1,000, respectivamente), o que
sugere que, apesar da presença
significativa do alelo Pro72 nos pacientes com crise, a evolução foi a mesma.
A presente pesquisa tem limitações, tanto no tamanho da amostra, quanto na
dificuldade de encontrar alguma explicação lógica para a maior freqüência do alelo
Pro72, em pacientes com crise aguda. Apesar do fato de a população brasileira ser
multirracial, o que dificulta a comparação adequada com os achados dos diferentes
estudos aqui citados, julga-se que o estudo contribuiu para apontar que existem
diferenças entre o polimorfismo desse gene maior em pacientes com GPAF e crise
aguda e a população normal.
6.
CONCLUSÕES
Conclusões | 81
O presente estudo permite concluir que:
1 - A distribuição genotípica no grupo com Glaucoma Primário de Ângulo Fechado
revelou que o polimorfismo não difere estatisticamente daquela do grupo-controle,
composto por indivíduos sadios.
2 - Considerando-se pacientes com Glaucoma Primário de Ângulo Fechado,
independentemente da presença ou não de história de crise aguda por bloqueio
pupilar, não há associação entre essa doença e os alelos do gene TP53.
3 - Não existem diferenças significativas entre as freqüências do polimorfismo do
gene TP53 em pacientes com Glaucoma Primário de Ângulo Fechado, sem história
de crise aguda por bloqueio pupilar, e nos controles sadios.
4 - O alelo Prolina do gene TP53 (códon 72) é significantemente mais freqüente em
pacientes com Glaucoma Primário de Ângulo Fechado com história de crise aguda
por bloqueio pupilar, do que em controles sadios.
5 - Não existem diferenças significativas entre as freqüências do polimorfismo do
gene TP53, em pacientes com Glaucoma Primário de Ângulo Fechado com e sem
história de crise aguda por bloqueio pupilar.
7.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Referências Bibliográficas | 83
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1999.
8.
ANEXOS
Anexos | 98
Anexo 1
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Estamos convidando-o (a) para participar do projeto de pesquisa ANÁLISE DO
POLIMORFISMO DO GENE TP53 (CODON 72) EM PACIENTES BRASILEIROS COM
GLAUCOMA.
Esta pesquisa tem por objetivo estudar a predisposição genética para desenvolver Glaucoma.
Para isso, uma pequena quantidade de sangue será colhida, como amostra, no dia de hoje, ou se
preferir no próximo retorno, para podermos estudar fatores genéticos presentes ou não em seu
organismo, associados a essa doença.
O único desconforto é o da picada da agulha, para uma coleta de 15 ml de sangue (mais ou
menos uma colher de sopa). Outro pequeno problema, que raramente ocorre, seria o aparecimento
de mancha escura no local da coleta, que desaparece em poucos dias.
Das células desse sangue, extrairemos o material necessário para pesquisa das
características de um dos genes que podem explicar o desenvolvimento do Glaucoma.
Esse estudo trará benefícios para você (ou paciente sob sua responsabilidade), assim como
para seus familiares e a população em geral, pois se espera, com este estudo, conhecer melhor as
alterações genéticas associadas ao glaucoma, que nos auxiliarão no diagnóstico precoce e no
aconselhamento genético familiar.
A participação nesta pesquisa é VOLUNTÁRIA e seu nome (nome do paciente) vai ficar em
segredo (com codificação numérica) e não aparecerá nos resultados da pesquisa, não havendo,
assim, possibilidade de ser identificado (mantendo-se total privacidade). O(A) senhor(a) (ou paciente
sob sua responsabilidade legal) não é obrigado(a) a participar desta pesquisa e o seu tratamento será
feito da mesma maneira, mesmo se não concordar em participar.
Além disso, se for de sua vontade, nos comprometemos a prestar informações ou
esclarecimentos atualizados, durante todas as fases do estudo, mesmo que esses possam afetar a
sua vontade de continuar participando. Caso concorde em participar, poderá também desistir em
qualquer momento, sem qualquer prejuízo para o seu tratamento ou para o acompanhamento clínico,
durante e após a conclusão do trabalho.
Paciente/ Responsável legal : ____________________________________
Ribeirão Preto, _____ de __________________ de 20___.
Pesquisadora responsável: Profa. Dra. Maria de Lourdes V. Rodrigues
(contato: 16-36022426)
Anexos | 99
Anexo 2
Anexos | 100
ARTIGO PARA PUBLICAÇÃO (portugues)
POLIMORFISMO DO GENE TP53 (CÓDON 72) EM PACIENTES BRASILEIROS
PORTADORES DE GLAUCOMA PRIMÁRIO DE ÂNGULO FECHADO
Marcelo Jordão L da Silva, Márcia Abelin Vargas, Neife H. S. Dhegaide, Eduardo A
Donadi, Maria de Lourdes Veronese Rodrigues
* Departamento de Oftalmologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo
Resumo
Objetivos: (1) determinar as distribuições alélicas e genotípicas do polimorfismo do
gene TP53 (códon 72) em pacientes brasileiros com glaucoma primário de ângulo
fechado (GPAF) comparados a controles sadios e (2) verificar a associação alélica
(Prolina e Arginina) do gene TP53 (códon 72) com GPAF, sem e com história de
crise aguda por bloqueio pupilar. Método: O diagnóstico de GPAF foi baseado na
biomicroscopia, gonioscopia, tonometria, biomicroscopia de fundo e perimetria
computadorizada. O DNA foi amplificado através da reação em cadeia catalisada
pela polimerase. A região do éxon 4 do gene TP53 foi amplificada e digerida através
da enzima de restrição BseDI. A análise estatística foi realizada pelo teste do QuiQuadrado (‫א‬2), com correção de Yates, ou pelo teste exato de Fisher Bicaudal,
quando necessário (p < 0,05). Resultados: Foram avaliados 66 pacientes com
GPAF para este estudo e 72 controles normais. A média de idade dos indivíduos foi
de 65,64 ± 10,33 anos; nos 47 pacientes no grupo com GPAF, com história de crise
aguda, a idade foi de 66,25 ± 8,72 anos e nos 19 pacientes com GPAF, sem historia
de crise aguda, foi de 63,95 ± 14,04 anos; 43 pacientes (65,1%) eram do sexo
feminino; 64 pacientes (97,2%) eram brancos. (1) Não houve diferença significativa
na freqüência genotípica para o polimorfismo (PRO/PRO, ARG/ARG e ARG/PRO)
do gene p53 entre grupo com GPAF e do grupo- controle (p = 0, p = 0,3984) e (2)
para os alelos (PRO e ARG) houve diferença significativa entre o grupo com GPAF,
com crise aguda, quando comparado ao grupo com GPAF sem crise (p = 0,0251).
Conclusões: Os resultados indicam associação dos genótipos do polimorfismo do
Anexos | 101
gene TP53 (códon 72) nos pacientes com GPAF, com historia de crise aguda de
glaucoma.
Palavras-chave: gene TP53, glaucoma primário de ângulo fechado, genética
do glaucoma, apoptose.
Introdução:
O GPAF é uma doença que apresenta como característica comum a aposição
mecânica da malha trabecular pela periferia da íris. Por mecanismos ainda
desconhecidos, esta aposição leva a goniosinéquias, resultando na obstrução do
trabeculado filtrante e conseqüente aumento da pressão intra-ocular (PIO). Dessa
forma, o processo de fechamento angular, com conseqüente aumento da PIO, pode
ocasionar dano glaucomatoso do nervo óptico1.
Em 2003, Quigley et al, 20032 estimaram que a prevalência de glaucoma em
todo o mundo era de mais de 50 milhões de pessoas. Aproximadamente um terço
destes pacientes eram portadores de glaucoma primário de ângulo fechado 2,
principalmente devido às altas taxas de prevalência relatadas na população dos
países asiáticos
3-7
. No Brasil, um estudo epidemiológico avaliou um total de 1772
indivíduos; a prevalência do GPAF foi de 0,65% (11 casos) e representou 16% de
todos os casos de glaucoma diagnosticados nessa população 8.
No Glaucoma Primário de Ângulo Aberto (GPAA), a morte das células
glanglionares retinianas, recebe estímulo que pode ser na forma de perda do
suporte neurotrófico, durante os períodos de PIO elevada
9
e/ou exposição a um
excesso de aminoácidos excitatórios (excitotoxinas), tais como glutamato liberado
quando ocorre a isquemia do nervo óptico e das células glanglionares retinianas
11
10,
.
O dano celular se inicia e é detectado por alguma forma de sensor proteico
que ainda não está caracterizado, cuja função crítica parece ser ativar a proteína
supressora tumoral p5312.
Partindo-se do pressuposto de que o gene TP53 teria papel importante na
apoptose, que ocorre na neuropatia óptica glaucomatosa, o polimorfismo da proteína
p53, no códon 72, foi estudada em pacientes com GPAA e comparado com o
polimorfismo em indivíduos normais, em populações distintas13-17. Este estudo
Anexos | 102
justifica-se, pois não há na literatura mundial qualquer publicação médica que avalie
a associação do gene TP53 ao GPAF.
Método:
Este foi um estudo observacional, tipo caso-controle, no
qual foram
selecionados, consecutivamente, 67 pacientes portadores de GPAF do Ambulatório
de Glaucoma do Setor de Oftalmologia do HCFMRP-USP e do Ambulatório de
Glaucoma do Setor de Oftalmologia do Hospital do Servidor Público Estadual e 72
indivíduos que não apresentavam qualquer doença sistêmica ou ocular, doadores de
medula óssea do Hemocentro da USP de Ribeirão Preto.
O projeto desta Pesquisa foi aprovado pela Comissão de Ética do HCFMRPUSP, tendo constituído o processo número 8991/2001 e pela Comissão Nacional de
Ética em Pesquisa- CONEP - Parecer 476/2002. Consentimento informado escrito
foi obtido de todos os participantes.
Os pacientes com GPAF foram divididos em dois grupos: grupo 1, 48 pacientes
com história de crise aguda por bloqueio pupilar ou congestiva e grupo 2, 19
pacientes sem história de crise aguda por bloqueio pupilar.
Foram incluídos pacientes com ângulo fechado à gonioscopia com ou sem história
de crise aguda por bloqueio pupilar, alterações típicas do nervo óptico e do campo
visual. Foi definida crise congestiva: os pacientes relatam dor ocular e/ou
periorbitária intensa, diminuição da acuidade visual, náuseas e vômitos. Ao exame,
os olhos apresentam uma córnea edemaciada, midríase média não fotorreagente e
câmara anterior rasa
1, 18
. Na gonioscopia foram observados goniosinéquias e o
“sinal da impressão” de pigmentos irianos na parede do seio camerular.
A reação de polimerase em cadeia (PCR): a região do exon 4 do gene TP53,
que contém a seqüência de DNA polimórfico foi amplificado em todas as amostras
de DNA extraídas de pacientes e controles. PCR foi realizada em um volume de 30 l
contendo 1,5 µl de DNA purificado, 3,0 µl 10 x tampão de Taq, MgCl2 1,2 microlitro,
0,38 nucleotídeos microlitro, 0,2 µl de Taq DNA polimerase, 21,92 µl de água estéril,
e 0,9 L de cada primer: Pro - (5 'CGT ACG AGT CTT AGA CAC -3' l) e Arg + (5 'TTG
TCC CCC CCG CAA TCC -3'). O procedimento foi realizado da seguinte forma: um
Anexos | 103
ciclo a 94° C por 5 minutos com a amostra aquecida para desnaturação do DNA,
seguidos por 35 ciclos a 94° C por 45 segundos, 60° C por 45 segundos, e 72° C por
45 segundos para a hibridização de primers e um ciclo final a 72° C por 4 minutos.
O produto da PCR final consistiu de um fragmento de DNA de 279 pb,
conforme determinado por eletroforese em gel de poliacrilamida 10% corado com
nitrato de prata a 2%. Enzima de restrição: o produto da PCR (7,0 mL) foi digerido
com a enzima de restrição específica BseDI (Fermentas, EUA), polimorfismo de
fragmento de restrição (RFLP) em uma mistura de reação 3,0 µl em banho-maria,
durante 12 horas a 55° C. A digestão produto foi separado em gel de poliacrilamida
10% corado com nitrato de prata a 2%. Fragmentos contendo TP53 códon 72
polimorfismos apresentaram 94 pb na forma de prolina e 138 pb, sob a forma de
arginina.
A freqüência do polimorfismo do gene TP53 foi calculada para a amostra total
de 67 pacientes e para os 72 indivíduos controle. A análise estatística foi realizada
pelo teste do Qui-Quadrado (‫א‬2), com correção de Yates, ou pelo teste exato de
Fisher Bicaudal, quando necessário. O mesmo foi aplicado para verificar a
significância estatística das associações, quando comparadas com as freqüências
de cada genótipo, alelos e antígenos estudados na amostra total de pacientes e
controles. Os valores iguais ou inferiores a 0,05 (Intervalo de Confiança=95%) foram
considerados significantes19.
Todas as análises foram realizadas utilizando-se o software StatCal (Epi
Info,versão 6.0).
Resultados:
A média de idade dos indivíduos foi de 65,64 ± 10,33 anos (variando de 34 a
84 anos), sendo 48 pacientes, no grupo com GPA, com história de crise aguda, a
idade foi de 66,25 ± 8,72 anos (variando de 46 a 81 anos) e 19 pacientes com
GPAF, sem história de crise aguda, foi de 63,95 ± 14,04 anos (variando de 34 a 84
anos); 43 pacientes (65,1%) eram do sexo feminino, 2 (2,8%) eram pardos, 64
(97,2%) eram brancos. A proporção de pacientes do sexo feminino e do sexo
masculino, no grupo com GPAF, foi estatisticamente diferente da do grupo controle
(p < 0,05).
Anexos | 104
No cálculo dos valores de probabilidade (p), não houve diferença significativa
na freqüência genotípica para o polimorfismo (PRO/PRO, ARG/ARG e ARG/PRO)
do gene p53, entre grupo com GPAF e do grupo controle (p = 0,3984) (Tabela 1)
Tabela 1. Mostra a freqüência genotípica absoluta e relativa dos grupos com
GPAF e do grupo-controle, de acordo com o polimorfismo (PRO/PRO, ARG/ARG e
ARG/PRO) do gene TP53 (códon 72).
Grupo
Genótipo
PRO/PRO N(%)
ARG/ARG N(%)
ARG/PRO N(%)
GPAF
6 (8,9%)
29 (43,3%)
32 (47,8%)
Controles
4 (5,5%)
39 (54,2%)
29 (40,3%)
No cálculo dos valores de probabilidade (p) para os alelos, não houve
diferença significativa entre os alelos do grupo com GPAF e do grupo- controle (p =
0,1406).
No cálculo dos valores de probabilidade (p) para os alelos, houve diferença
significativa entre o grupo com GPAF, com crise aguda, quando comparado ao
grupo com GPAF, sem crise (p = 0,0251) (Tabela 2).
Tabela 2. Mostra a freqüência alélica, absoluta e relativa, dos grupos com
GPAF, sem história de crise, de acordo com o polimorfismo do gene TP53 (códon
72).
Prolina
Arginina
Total
GPAF grupo 1
38 (39,6%)
58 (60,4%)
96
GPAF grupo 2
7 (18,4%)
31 (81,6%)
38
Total
45
89
134
Anexos | 105
Discussão:
O rápido avanço tecnológico na análise dos genes, informações do genoma
humano e a viabilidade da bioinformática têm levado à indicação de muitos genes
candidatos às doenças oculares como o glaucoma20. A análise molecular desses
genes candidatos às doenças tem fornecido informações para o estabelecimento de
marcadores genéticos úteis ao diagnóstico.
O GPAA é uma doença neurodegenerativa que reduz a visão, à medida que
as células ganglionares morrem21-23. A pressão intra-ocular24, hereditariedade25,
idade24, miopia26, diabetes27, hipotensão arterial,28 entre outros, são citados como
fatores de risco para desenvolvimento e progressão do glaucoma.
A apoptose pode ser a via final comum da morte das células ganglionares no
glaucoma, pois marcadores de apoptose têm sido observados na retina de pacientes
glaucomatosos e em glaucoma experimental29. O processo apoptótico requer a
expressão de genes específicos e pode ser identificado usando-se métodos
histoquímicos e bioquímicos29-31. Um dos principais genes envolvidos na apoptose é
o TP53 que expressa a proteína p5332, 33.
O dano celular se inicia e é detectado por alguma forma de sensor proteico
que ainda não está caracterizado, cuja função crítica parece ser ativar a proteína
supressora tumoral p53 que desencadeia um processo de “suicídio” celular 12,
Toda a estrutura do gene TP53, no códon 72, tem sido exaustivamente
estudada o que tem sido reconhecido como um polimorfismo de uma arginina (Arg)
para uma prolina (Pro). A simples mudança, de uma base nitrogenada do códon
CGC para CCC, causa a alteração no aminoácido de arginina para prolina34.
Para a hipótese de que o gene TP53 poderia ter algum papel na neuropatia
glaucomatosa, foram desenvolvidos vários estudos como Lin et al.13 que realizaram
um estudo em pacientes chineses e encontraram predominância da forma Pro/Pro
nos pacientes com GPAA, porém Acharya et al.35 não encontraram nenhuma
associação do polimorfismo da p53 (códon 72) em pacientes asiáticos.
Anexos | 106
O GPAF é uma doença provocada por várias anormalidades que apresentam
como característica comum a aposição mecânica da malha trabecular pela periferia
da íris1.
Neste Estudo, o polimorfismo ocorreu, tanto em pacientes normais quanto
nos pacientes com GPAF, não havendo diferença significativa (p = 04563).
Na população deste Estudo de GPAF, comparada aos controles, não houve
diferença significativa na distribuição gênica com 47,8% Arg Homozigótica, 43,3%
heterozigótica e 8,9% Pro homozigótica 47,8% Arg Homozigótica, 43,3%
heterozigótica e 8,9% Pro homozigótica, enquanto nos normais foi de 40,3% Arg
Homozigótica, 54,2% heterozigótica e 5,5% Pro homozigótica (p = 0,3984). Silva et
al.36 avaliaram a ocorrência do polimorfismo da proteína p53 (códon 72) Arg-Pro
(CGC to CCC) em 104 pacientes com GPAA e 58 normais, não havendo diferença
significativa entre os dois grupos (p = 0,3311). A distribuição gênica, nos pacientes
com GPAA, foi 23,07% Arg homozigótica, 75% heterozigótica e 1,93% Pro
homozigótica,
enquanto
que
para
os
normais
encontrou-se
31,04%
Arg
homozigótica, 68,96% heterozigótica e 0% Pro homozigótica.
O alelo mais freqüente, nos pacientes com GPAF e nos controles, foi o Arg72
(67,2% e 74,3%, respectivamente) não havendo diferença significativa entre ambos
(p = 0,2345), o que ocorreu da mesma forma nos pacientes com GPAA17. O alelo
Arg72 tem se mostrado com maior capacidade para provocar apoptose37.
Neste Estudo, o alelo Pro72 ocorreu em maior freqüência e a diferença foi
significativa entre o grupo com GPAF, com história de crise aguda, quando
comparado ao grupo-controle (p = 0,0196), enquanto que nos pacientes com GPAF,
sem história de crise aguda, não houve diferença estatística (p = 0,4017). Quando
comparados os grupos com GPAF, com e sem história de crise aguda, houve
diferença estatisticamente significativa para o alelo Pro72 (p = 0,0251).
Neste Estudo, foi considerado GPAF, com dano grave, aqueles olhos com
nervos ópticos com escavação maior ou igual a 0,7. Quando avaliada a freqüência
alélica do grupo com GPAF e do grupo-controle foi encontrada diferença significativa
(p = 0,0744), tanto para o grupo com história de crise ou sem (p = 0,4217 e 1,000,
respectivamente).
Anexos | 107
A diferença de resultado, entre os estudos sobre o polimorfismo do TP53
(códon 72) no GPAA, não pode ser explicada ainda e nem a maior freqüência do
alelo Pro72, no grupo de GPAF com crise. A presente pesquisa tem limitações, tanto
no tamanho da amostra, quanto na dificuldade de encontrar alguma explicação
lógica para a maior freqüência do alelo Pro72 em pacientes com crise aguda. Apesar
disso, o fato de a população brasileira ser multirracial, dificulta a comparação
adequada com os achados dos diferentes estudos aqui citados. Julga-se, ainda
assim, que o Estudo contribuiu para apontar que existem diferenças entre o
polimorfismo desse gene, em pacientes com GPAF e crise aguda, e a população
normal.
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ângulo aberto e no glaucoma de pressão normal. Ribeirão Preto: Universidade de
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Anexos | 109
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Dumont P, Leu JI, Della Pietra AC, 3rd, et al. The codon 72 polymorphic
variants
of
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2003;33(3):357-65.
have
markedly
different
apoptotic
potential.
Nat
Genet
Anexos | 110
ARTIGO PARA PUBLICAÇÃO (ingles)
TP53 POLYMORPHISM (CODON 72) IN BRASILIAN PATIENTS WITH PRIMARY
ANGLE-CLOSURE GLAUCOMA.
Marcelo Jordão L da Silva, Márcia Abelin Vargas, H. Neifer S. Dhegaide, Eduardo
The Donadi, Maria de Lourdes Veronese Rodrigues
* Department of Ophthalmology, Faculty of Medicine of Ribeirão Preto, University of
São Paulo
Abstract:
The objectives of this study are: to determine the allelic and genotypic polymorphism
of the TP53 gene (codon 72) in Brazilian patients with primary angle-closure
glaucoma (PACG) and in healthy controls and verify the allelic association (Proline
and Arginine) TP53 (codon 72) with PACG with and without history of acute crisis for
pupillary block. Sixty-six patients with PACG for this study and 72 normal controls
were consecutively recruited. The mean age of subjects was 65.6 ± 10.3 years; 47
patients in the PACG with a history of acute crisis age was 66.2 ± 8.7 years and 19
patients with no history of crisis GPAF acute was 63.9 ± 14.1 years; 43 patients
(65.1%) were female; 64 (97.2%) were white. The diagnosis was based on the
observation of typical fundings of PACG biomicroscopy, gonioscopy, tonometry,
ophthalmoscopy and perimetry. Desoxirribonucleico acid (DNA) was amplified
through the chain reaction catalyzed by polymerase. The region of exon 4 of TP53
was amplified and digested by restriction enzyme BseDI. Statistical analysis was
performed by chi-square (‫ א‬2) with Yates correction or by two-tailed Fisher exact test
when necessary (p <0.05). This study funded that: there was no significant
Anexos | 111
difference in genotype frequency for the polymorphism (PRO / PRO, ARG / ARG
and ARG / PRO) of the TP53 gene among PACG group and control group (p = p =
0.3984) and the alleles (ARG and PRO) were significant differences between the
groups with GPAF with acute compared with the group without PACG crisis (p =
0.0251). The results indicate that the genotype of the TP53 polymorphism (codon
72) in patients with PACG with a history of acute glaucoma.
Keywords: TP53, angle closure glaucoma, genetics, apoptosis.
Introduction:
The PACG is a disease that presents as a common feature of mechanical
apposition of the trabecular meshwork at the periphery of the iris. For still unknown
mechanisms, this leads to affix goniosynechiae, resulting in the obstruction of
trabecular filtering and consequent increase in intraocular pressure (IOP). Thus, the
process of angle closure, with consequent increase in IOP may cause glaucomatous
nerve óptico1.
In 2003, Quigley et al, 20032 have estimated that the prevalence of glaucoma
worldwide was more than 50 million people. Approximately one third of these patients
had angle-closure glaucoma2, mainly due to high prevalence rates reported in
population of Asian countries3-7. In Brazil, an epidemiological study evaluated a total
of 1772 individuals; PACG prevalence was 0.65% (11 cases) and represented 16%
of all diagnosed cases of glaucoma in this population8.
In primary open angle glaucoma (POAG), the retinal ganglion cell death,
receives stimulation that may be in the form of loss of neurotrophic support during
periods of elevated IOP9 and / or exposure to an excess of excitatory amino acids
Anexos | 112
(excitotoxins) such as glutamate released when ischemia of the optic nerve and
retinal ganglion cells10, 11.
The cellular damage begins and is detected by some form of sensor proteins
that are not yet characterized, whose function seems to be critical to activate the
tumor suppressor protein p5312.
Starting from the assumption that the TP53 gene have an important role in
apoptosis, which occurs in glaucomatous optic neuropathy, the polymorphism of p53
at codon 72 was studied in POAG patients and compared with the polymorphism in
normal individuals, in others populations13-17. This study was justified because there
is no literature in any medical journal to assess the association between TP53 and
PACG.
Methods:
This was an observational, case-control study in which they were selected
consecutively 67 patients with PACG of the Glaucoma Service of the Department of
Ophthalmology HCFMRP-USP and the Glaucoma Service of the Department of
Ophthalmology, HSPE – SP and 72 individuals without any systemic or ocular
disease, bone marrow donors from the Blood Center of Ribeirão Preto, USP.
The design of this research was approved by the Ethics Committee of
HCFMRP-USP, having been the case number 8991/2001 and the National
Commission of Ethics in Research-CONEP - Opinion 476/2002. Written informed
consent was obtained from all participants.
PACG patients were divided into two groups: group 1, 48 patients with a
history of acute crisis or failure, and pupillary block group 2, 19 patients without a
history of acute crisis for pupillary block.
Anexos | 113
Patients with a closed angle on gonioscopy with or without a history of acute
pupillary block, the typical changes of the optic nerve and visual field. Failure was
defined crisis: patients report ocular pain and / or periorbital intense, decreased
visual acuity, nausea and vomiting. On examination, the eyes have a corneal edema,
mydriasis and a shallow anterior chamber, 18. On
gonioscopy
were
observed
goniosinéquias and "sign printing of pigment in the iris camerular sinus wall.
Before collection of peripheral blood for DNA extraction, the patients gave
written informed consent to participate in the study, approved by Ethical Committee
of the Medical School of Ribeirão Preto University Hospital (Pr. HCRP 8991/2001
and 9346/2007).
Polymerase chain reaction (PCR): the region of exon 4 of gene TP53 which
contains the sequence of polymorphic DNA was amplified in all DNA samples
extracted from patients and controls. PCR was performed in a volume of 30 µl
containing 1.5 µl purified DNA, 3.0 µl 10 x Taq buffer, 1.2 µl
MgCl2, 0.38 µl
nucleotides, 0.2 µl Taq DNA polymerase, 21.92 µl sterile water, and 0.9 µl of each
primer: Pro – (5’ CGT GCA AGT CAC AGA CTT -3’l) e Arg + (5’ TCC CCC TTG CCG
TCC CAA -3’). The procedure was carried out as follows: one cycle at 94o C for 5
minutes with the sample heated for DNA denaturation, followed by 35 cycles at 94o C
for 45 seconds, 60o C for 45 seconds, and 72o C for 45 seconds for primer
hybridization, and a final cycle at 72o C for 4 minutes.
The final PCR product consisted of a 279 bp DNA fragment as determined by
10% polyacrylamide gel electrophoresis stained with 2% silver nitrate.
Enzyme restriction: the PCR product (7.0 µl) was digested with the specific
restriction enzyme BseDI (Fermentas, USA) by restriction fragment length
Anexos | 114
polymorphism (RFLP) in a 3.0 µl reaction mixture in a water bath for 12 hours at 55o
C. The digestion product was separated on 10% polyacrylamide gel stained with 2%
silver nitrate. Fragments containing TP53 codon 72 polymorphisms presented 94 bp
in the proline form and 138 bp in the arginine form.
Probability (p) values were obtained by calculating the chi-square (‫א‬2) with
Yates correction or by the two-tailed Fisher exact test when a box with a value of less
than 5 was present in the 2 x 2 table. Values of 0.05 (95% confidence interval) or
less were considered to be significant. All tests were performed using the software
StatCal (Epi Info, version 6.0).
Results:
The mean age of subjects was 65.64 ± 10.33 years (range 34-84 years), and
48 patients in the group with PACG, with a history of acute crisis, the age was 66.25
± 8, 72 years (ranging from 46 to 81 years) and 19 patients with GPAF no history of
acute crisis, was 63.95 ± 14.04 years (range 34-84 years), 43 patients (65.1%) were
female, 2 (2.8%) were of mixed race, 64 (97.2%) were white. The proportion of
females and males in the group with PACG was statistically different from the control
group (p <0.05).
In the calculation of probability values (p), no significant difference in genotype
frequency for the polymorphism (PRO / PRO, ARG / ARG and ARG / PRO) of the
p53 gene, among GPAF group and control group (p = 0, 3984) (Table 1)
Anexos | 115
Table 1. Shows the absolute and relative genotype frequency of GPAF groups
and the control group, according to the polymorphism (PRO / PRO, ARG / ARG and
ARG / PRO) TP53 (codon 72).
Group
Genotype
PRO/PRO N(%)
ARG/ARG N(%)
ARG/PRO N(%)
PACG
6 (8,9%)
29 (43,3%)
32 (47,8%)
Controls
4 (5,5%)
39 (54,2%)
29 (40,3%)
In the calculation of probability values (p) for the alleles, no significant
difference between the alleles of the group with GPAF and the control group (p =
0.1406).
In the calculation of probability values (p) for the alleles, significant difference
between the group with GPAF with acute crisis, when compared with the group
GPAF without crisis (p = 0.0251) (Table 2).
Table 2. Shows the allele frequency, absolute and relative GPAF groups with
no history of crisis, according to the TP53 polymorphism (codon 72).
Prolina
Arginina
Total
PACG group 1
38 (39,6%)
58 (60,4%)
96
PACG group 2
7 (18,4%)
31 (81,6%)
38
Total
45
89
134
Anexos | 116
Discussion:
The rapid technological advancement in the analysis of genes, human
genome information and the feasibility of bioinformatics have led to the appointment
of many candidate genes for eye diseases such as glaucoma20. Molecular analysis
of candidate genes for diseases has provided information to establish genetic
markers useful for diagnosis.
The OAG is a neurodegenerative disease that reduces the vision, as the
ganglion cells died
21-23
. Intraocular pressure ocular24, hereditariedade25, age24,
miopia26, diabetes27, hypotension, and 28 among others, are cited as risk factors for
the development and progression of glaucoma.
Apoptosis may be the final common pathway of death of ganglion cells in
glaucoma, as markers of apoptosis have been observed in the retina of glaucoma
patients and glaucoma experimental29. The apoptotic process requires the
expression of specific genes and can be identified using histochemistry and
bioquímicos29-31. One of the key genes involved in apoptosis is the TP5332 that
expresses the protein p53 33.
The cellular damage begins and is detected by some form of sensor proteins
that are not yet characterized, whose function seems to be critical to activate the p53
tumor suppressor protein that triggers a process of "suicide" cell12.
The whole structure of TP53 codon 72, have been thoroughly studied what
has been recognized as a polymorphism of an arginine (Arg) to a proline (Pro). A
simple change of a nitrogenous base codon CGC to CCC, causes amino acid
change from arginine to prolina34.
For the hypothesis that TP53 might play a role in glaucomatous neuropathy,
as there have been several studies Lin et al.13 in a study in Chinese patients and
Anexos | 117
found a predominance of the Pro / Pro in patients with POAG, but Acharya et al .35
found no association between p53 polymorphism (codon 72) in Asian patients.
The PACG is a disease caused by various abnormalities which have the
common characteristic of mechanical apposition of the trabecular meshwork at the
periphery of íris1.
In this study, the polymorphism occurred both in normal subjects and in
patients with GPAF, no significant difference (p = 0.4563).
In this study GPAF population, compared to controls, no significant differences
in gene distribution with Homozygous Arg 47.8%, 43.3% heterozygous and
homozygous Pro 8.9% 47.8% Homozygous Arg, 43.3% heterozygous Pro
homozygous and 8.9%, while in normal was 40.3% Homozygous Arg, 54.2%
heterozygous and homozygous Pro 5.5% (p = 0.3984). Silva et al.36 evaluated the
occurrence of polymorphism of p53 (codon 72) Pro-Arg (CGC to CCC) in 104
patients with POAG and 58 normal, with no significant difference between the two
groups (p = 0.3311). The gene distribution in patients with POAG, was 23.07% Arg
homozygous, 75% heterozygous and homozygous Pro 1.93%, while for the normal
was found 31.04% Arg homozygous, heterozygous and 68.96% 0 % Pro
homozygous.
The most frequent allele in patients with GPAF and controls, was the Arg72
(67.2% and 74.3%, respectively) with no significant difference between them (p =
0.2345), which occurred in the same way GPAA17 patients. The Arg72 allele has
shown a greater ability to cause apoptose37.
In this study, the Pro72 allele occurred more frequently and the difference was
significant between the group with PACG with a history of acute crisis, when
compared with the control group (p = 0.0196), while in patients with PACG no history
Anexos | 118
of acute crisis, there was no statistical difference (p = 0.4017). When comparing the
groups with GPAF, with and without a history of acute crisis, there were statistically
significant for the Pro72 allele (p = 0.0251).
In this study, it was considered PACG with serious injury, those eyes with
optic nerves with a cup larger than or equal to 0.7. When evaluated the allelic
frequency of PACG group and control group was significant difference (p = 0.0744)
for both the group with a history of crises or without (p = 0.4217 and 1.000,
respectively).
The difference in results between studies on the polymorphism of TP53
(codon 72) in POAG, can not be explained nor even a higher frequency of Pro72
allele in the group with PACG crisis. This study has limitations, both in sample size,
and the difficulty of finding a logical explanation for the higher frequency of the Pro72
allele in patients with acute crisis. Nevertheless, the fact that the Brazilian population
is multiracial, hinders proper comparison with the findings of various studies cited
here. It is believed, nevertheless, that the study helped to point out that differences
exist between this gene polymorphism in patients with acute and PACG, and the
normal population.
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Nat
Genet