UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDONIA – UNIR
Núcleo de Saúde - NUSAU
Programa de Pós-Graduação em Biologia Experimental
CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DE PEPTÍDEOS
ANTIMICROBIANOS DA SECREÇÃO CUTÂNEA DE Leptodactylus knudseni
E Leptodactylus chaquensis (ANURA: LEPTODACTYLIDAE) POR
ESPECTROMETRIA DE MASSA
José de Lima Cardozo Filho
Porto Velho
2011
José de Lima Cardozo Filho
CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E PREDIÇÃO DE ATIVIDADE
ANTIMICROBIANA DE PEPTÍDEOS DA SECREÇÃO CUTÂNEA DE
Leptodactylus knudseni E Leptodactylus chaquensis (ANURA:
LEPTODACTYLIDAE)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Biologia Experimental da Universidade Federal de
Rondônia como requisito obrigatório para a obtenção do
título de Mestre em Biologia Experimental.
Orientador: Prof. Dr. Leonardo de Azevedo Calderon
Porto Velho
2011
II FICHA CATALOGRÁFICA
BIBLIOTECA PROF. ROBERTO DUARTE PIRES C2687
Cardozo Filho, José de Lima
Caracterização estrutural e predição de atividade antimicrobiana de peptídeos d
secreção de leptodactylus knudseni e leptodactylus chaquensis (anura: leptodactylidae
José de Lima Cardozo Filho. Porto Velho, Rondônia, 2011.
78f. :il.
Dissertação (Mestrado em Biologia) Fundação Universidade Federal de Rondônia /
UNIR.
Orientador: Prof. Dr. Leonardo de Azevedo Calderon.
1. Anfíbios 2. Peptídeos 3. Antimicrobianos 4. Doenças negligenciadas I. Calde
Leonardo de Azevedo II. Título.
CDU: 597.6
Bibliotecária Responsável: Ozelina Saldanha CRB11/947
III Aos meus pais. Por mostrar aos seus o valor do conhecimento e da honestidade.
Às minhas irmãs.
IV AGRADECIMENTOS
Ao Kayano, amigo e mestre, por quem guardo profundo respeito e admiração. Agradeço-lhe pela
amizade leal e fiel nas horas inglórias, bem como nas glórias das horas.
Ao meu orientador, Professor Leonardo de Azevedo Calderon, pela belíssima oportunidade
oferecida para que eu ingressasse no mundo científico e o conhecesse como ainda não o conhecia.
Também, pela orientação prestada nesses dois anos; pelos vários momentos em que se dispôs de seu
precioso tempo para discutir sobre os experimentos.
Ao Professor Rodrigo Guerino Stábeli pelas tantas oportunidades viabilizadas. E para além das
obviedades, lhe sou muito grato pelo referencial e a influência sobre minha insipiente carreira
científica.
Ao Carlos Bloch Jr, por permitir que eu ingressasse nas dependências do Laboratório de
Espectrometria de Massa da EMBRAPA para a realização de trabalhos que constam nesta
dissertação. Agradeço-lhe também pelas conversas e pela influência filosófica em minha
caminhada.
À Ângela, por ter participado de forma direta na obtenção dos resultados que compõem esta
dissertação.
À Kaynara, Kayena, João, Tiago, Rafael e Rodrigo (Simões), pelo companheirismo nas muitas
horas laboratório e pela diversão desses momentos.
Ao CEBio (as pessoas) por ter sido minha família nestes dois anos.
V Ao Mestre Luciano, por ter colaborado com muitos dos trabalhos que geraram resultados
apresentados nesta dissertação. Mas, principalmente, por ser um exemplo palpável de grandeza de
caráter e conduta de formador. Também pela amizade e a imensa paciência que lhe é própria.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP) e
Fundação de Tecnologia do Estado do Acre (FUNTAC), pelo fomento à pesquisa desenvolvida
neste trabalho.
À Universidade Federal de Rondônia (UNIR), Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais
(IPEPATRO) e à Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária – Recursos Genéticos e
Biotecnologia (CENARGEN/ EMBRAPA) pela infraestrutura oferecida para que fosse possível
realizar as atividades aqui constadas.
Ao Senhor!
VI A rational mind does not work under compulsion; it does not
subordinate its grasp of reality to anyone’s orders,
directives, or controls; it does not sacrifice its knowledge, its
view of the truth, to anyone’s opinions, threats, wishes, plans,
or ”welfare”. Such a mind may be hampered by others, it
may be silenced, proscribed, imprisoned, or destroyed; it
cannot be forced; a gun is not an argument. (An example and
symbol of this attitude is Galileo). It is from the work and the
inviolate integrity of such minds – from the intransigent
innovators - that all of mankind’s knowledge and
achievements have come. It is to such minds that mankind
owes its survival.
Ayn Rand, “Capitalism: The Unknown Ideal”
A minha preocupação não está em ser coerente com as
minhas afirmações anteriores sobre determinado
problema, mas em ser coerente com a verdade.
Mahatma Gandhi
As verdadeiras reformas, as que têm a possibilidade de
perdurar, são o resultado de uma profunda transformação das
idéias e não de uma revolução.
Gustave Le Bon
He made his way to the border, in the shadow under the
trees; down by a stream in a hollow, turn your head feel
the breeze. And the red Queen was waiting for the news,
for the white King to move and the balance hung upon the
head of one who tried to stay within the shadows and keep
his undercover secret tight… The Red Queen Theme (Pink Floyd)
VII SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS -------------------------------------------------------------------------------------- X
LISTA DE TABELAS ------------------------------------------------------------------------------------- XI
LISTA DE ABREVIATURAS -------------------------------------------------------------------------- XII
RESUMO -------------------------------------------------------------------------------------------------- XIII
ABSTRACT ------------------------------------------------------------------------------------------------XV
1 INTRODUÇÃO ------------------------------------------------------------------------------------------ 15
1.1 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- Pe
ptídeos antimicrobianos ---------------------------------------------------------------------- 18
1.1.1 -------------------------------------------------------------------------------------------- Al
vos de ação ----------------------------------------------------------------------- 21
1.1.1.1--------------------------------------------------------------------------------- M
odelos de ação membranolítica ---------------------------------------- 21
1.1.1.2--------------------------------------------------------------------------------- M
ecanismos de ação não membranolíticos ---------------------------- 29
1.2 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- Pe
ptídeos antimicrobianos dos Leptodactilídeos -------------------------------------------- 30
1.3 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- D
oenças tropicais negligenciadas e o potencial biotecnológico dos peptídeos
antimicrobianos ------------------------------------------------------------------------------- 32
2 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ O
BJETIVOS ---------------------------------------------------------------------------------------------- 34
2.1 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- O
bjetivos gerais --------------------------------------------------------------------------------- 34
2.2 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- O
bjetivos específicos --------------------------------------------------------------------------- 34
VIII 3 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ M
ETODOLOGIA ---------------------------------------------------------------------------------------- 35
3.1 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- O
btenção da secreção de Leptodactylus knudseni e Leptodactylus chaquensis --------- 35
3.2 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- Is
olamento dos peptídeos ---------------------------------------------------------------------- 36
3.3 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- Es
pectrometria de massa e sequenciamento “de novo” ------------------------------------ 36
3.4 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- A
nálises das sequências peptídicas ----------------------------------------------------------- 37
3.5 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- Sí
ntese dos peptídeos --------------------------------------------------------------------------- 38
4 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ R
ESULTADOS ------------------------------------------------------------------------------------------ 40
4.1 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- Se
paração dos peptídeos ------------------------------------------------------------------------ 40
4.2 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- Es
pectrometria de massa e sequenciamento “de novo” ------------------------------------ 42
4.3 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- A
nálises de homologia e similaridade -------------------------------------------------------- 46
4.4 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- Pr
opriedades estruturais ------------------------------------------------------------------------ 47
4.5 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- Sí
ntese química ---------------------------------------------------------------------------------- 51
5 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ DI
SCUSSÃO ---------------------------------------------------------------------------------------------- 53
5.1 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- Pe
rfis cromatográficos da secreção de Leptodactylus knudseni e Leptodactylus chaquensis
--------------------------------------------------------------------------------------------------- 53
5.2 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- A
nálise teórica das propriedades estruturais das sequências obtidas --------------------- 54
IX 5.3 ------------------------------------------------------------------------------------------------------- Pe
rspectivas --------------------------------------------------------------------------------------- 58
6 CONCLUSÃO ------------------------------------------------------------------------------------------- 59
REFERÊNCIAS -------------------------------------------------------------------------------------------- 61
ANEXO I ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 76
ANEXO II --------------------------------------------------------------------------------------------------- 78
ANEXO III -------------------------------------------------------------------------------------------------- 81
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Distribuição das espécies de anfíbios no mundo -------------------------------------------- 16
Figura 2 – Ilustração do Pré-pro-peptídeo e os sítios de clivagem ------------------------------------- 19
X Figura 3 – Modelo mecanístico da seletividade dos peptídeos antimicrobianos --------------------- 23
Figura 4 - α-Hélice ideal do peptídeo KLAL ------------------------------------------------------------- 25
Figura 5 - Modelo barril (Barrel stave) -------------------------------------------------------------------- 26
Figura 6 – Modelo “carpet-like” ---------------------------------------------------------------------------- 27
Figura 7 - Modelo Shai-Matsuzak-Huang (SMH) ------------------------------------------------------- 29
Figura 8 - Modelo Ação de detergente (Detergent-like) ------------------------------------------------ 29
Figura 9 – Leptodactylus knudseni ------------------------------------------------------------------------- 35
Figura 10 – Leptodactylus chaquensis --------------------------------------------------------------------- 36
Figura 11 – Cromatograma do fracionamento da secreção de Leptodactylus knudseni ------------- 41
Figura 12 – Cromatograma do fracionamento da secreção de Leptodactylus chaquensis ---------- 41
Figura 13 – Espectro de fragmentação da ocellatin-K1 ------------------------------------------------- 43
Figura 14 – Espetro de fragmentação do PT1Oc-K1 ---------------------------------------------------- 43
Figura 15 – Espectro de fragmentação do PT2Oc-K1 ---------------------------------------------------- 44
Figura 16 – Espectro de fragmentação do PT3Oc-K1 --------------------------------------------------- 44
Figura 17 – Espectro de fragmentação do ocellatin-C1 ------------------------------------------------- 45
Figura 18 – Espectro de fragmentação do ocellatin-C2 ------------------------------------------------- 45
Figura 19 – Alinhamento da ocellatin-K1 com as demais ocellatins ---------------------------------- 46
Figura 20 – Alinhamento entre as estruturas primárias da ocellatin-K1, ocellatin-F1 e ocellatin-L1 45
Figura 21 – Alinhamento entre as estruturas de ocellatin-K1 e seus derivados ---------------------- 47
Figura 22 – Projeção da estrutura secundária do ocellatin-K1 utilizando como referência uma
hélice ideal ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 48
XI Figura 23 – Projeção da estrutura secundária (hélice-α) do PT2Oc-K1 utilizando como referência
uma hélice ideal ----------------------------------------------------------------------------------------------- 49
Figura 24 – Projeção da estrutura secundária (hélice-α) do PT3Oc-K1 utilizando como referência
uma hélice ideal ----------------------------------------------------------------------------------------------- 50
Figura 25 – Projeção da estrutura secundária (hélice-α) do Ocellatin-C1 utilizando como referência
uma hélice ideal ----------------------------------------------------------------------------------------------- 51
Figura 26 – Projeção da estrutura secundária (hélice-α) do Ocellatin-C2 utilizando como referência
uma hélice ideal ----------------------------------------------------------------------------------------------- 51
Figura 27 – Espectro de material bruto de síntese do ocellatin-K1 ------------------------------------ 52
Figura 28 – Cromatograma de purificação do ocellatin-K1 -------------------------------------------- 52
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Exemplos de famílias de peptídeos antimicrobianos ---------------------------------------- 21
Tabela 2 - Hidrofobicidade por resíduos de aminoácidos ----------------------------------------------- 24
XII Tabela 3 – Valores do momento hidrofóbico médio (<µH> x), hidrofobicidade média (<H>) e do
momento hidrofóbico médio relativo (<µH> x r) para as sequências possíveis para ocellatin-K1 - 47
Tabela 4 – Valores do momento hidrofóbico médio (<µH> x), hidrofobicidade média (<H>) e do
momento hidrofóbico médio relativo (<µH> x r) para as sequências possíveis para o PT2Oc-K1 48
Tabela 5 – Valores do momento hidrofóbico médio (<µH> x), hidrofobicidade média (<H>) e do
momento hidrofóbico médio relativo (<µH> x r) para as sequências possíveis para o PT3Oc-K1 49
LISTA DE ABREVIATURAS
Tm – Temperatura de transição
FC – Fosfatidilcolina
XIII EM – esfingomielina
FE – fosfatidiletanolamina
FG – fosfatidilglicerol
CL – cardiolipina
FS – fosfatidilserina
PAM – peptídeo antimicrobiano
DNA – Ácido desoxiribonucleico
RNA – Ácido ribonucleico
TFA – Ácido trifluoroacético
ACN – Acetonitrila
HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência
MALDI-TOF – Ionização por dessorção de laser assistida por matriz
Fmoc – Cloreto de fluorenilmetoxicarbonil
PT1Oc-K1 – Peptídeo truncado 1 de ocellatin-K1
PT2Oc-K1 – Peptídeo truncado 2 de ocellatin-K1
PT3Oc-K1 – Peptídeo truncado 3 de ocellatin-K1
<µH>x – Momento hidrofóbico médio
<H> – Hidrofobicidade média
<µH> x r – Momento hidrofóbico médio relativo
RESUMO
XIV Durante a evolução, os anfíbios anuros desenvolveram mecanismos eficientes de proteção contra
invasão microbiana. Sua pele, além de proporcionar uma barreira física contra a entrada de
microrganismos, possui glândulas especializadas na produção e secreção de moléculas: peptídeos,
esteróides, aminas biogênicas, entre outras, que proporcionam uma barreira química contra
infecção. A partir da década de 1960, vários estudos acerca da composição das secreções cutâneas
de anfíbios evidenciaram o papel dos peptídeos como princípios ativos responsáveis pela atividade
biológica destes venenos. De simples resíduos da degradação protéica, os peptídeos tiveram seu
status científico elevado, surgindo então a peptidômica, levando à caracterização de uma grande
variedade de novos e diferentes peptídeos bioativos com grande potencial aplicação biotecnológica.
Nesta dissertação, são apresentadas estruturas primárias de peptídeos homólogos da família
ocellatina a partir da secreção cutânea de leptodactilídeos amazônicos: Leptodactylus chaquensis e
Leptodactylus knudseni, coletados no município de Porto Velho, Rondônia. As estruturas primárias
foram obtidas via seqüenciamento de novo a partir de espectros de fragmentação em câmara de
colisão de um espectrômetro MALDI-TOF/TOF (Bruker Daltonics, DE). Foram parcialmente
elucidadas as estruturas de dois novos peptídeos em L. knudseni; um peptídeo homólogo a família
ocellatina de peptídeos antimicrobianos, batizado de ocellatin-K1, apresentando 25 resíduos, massa
de 2548,65 Da e amidação C-terminal, e um peptídeo homólogo aos estimuladores de agressividade
em Leptodactylus, com 25 resíduos e 1600,69 Da. Adicionalmente foram identificadas três
estruturas truncadas derivadas da ocellatin-K1, com os respectivos números de resíduos e massa: 23
e 2307,49 Da; 14 e 1495,88 Da; 7 e 818,54 Da. Os dois últimos são fragmentos C-terminais e
conservam a amidação. Em L. chaquensis foram identificados dois novos peptídeos, ocellatin-C1
com 16 resíduos e 1718,23 Da, e ocellatin-C2, com 14 resíduos e 1310,00 Da. As estruturas
primárias foram analisadas in silico para avaliação das propriedades físico-químicas relacionadas à
atividade antimicrobiana, a saber, hidrofobidicade, momento hidrofóbico, helicidade, e carga
líquida. Os parâmetros observados para ocellatin-K1, i.e., carga +3, alto momento hidrofóbico e
helicidade, se assemelham aos observados em outros antimicrobianos da família. A ocellatin-C1
possui carga líquida igual a zero, baixa hidrofobicidade média e ângulo polar praticamente
equivalente ao ângulo hidrofóbico, apresentando-se como um fraco candidato a agente
membranoativo. Já o ocellatin-C2 é potencialmente um antimicrobiano, apresentando alto índice de
momento hidrofóbico e carga + 2, semelhante a outras ocellatinas.
Palavras-chave: Anfíbios; Peptídeos antimicrobianos; Doenças negligenciadas.
XV ABSTRACT
During the evolution, the anuran amphibians developed efficient defence mechanisms against
microbial attack. Their skin, besides serving as a physical barrier to block the microbial invasion,
has specialized glands for the production and secretion of molecules, i.e. peptides, steroids,
biogenic amine, and others, that promote the chemical barrier against infection. Next to the 60’s
end, several research studies appointed to the importance of the peptides as venom’s active
principle, having central importance in the biological activity. From simple residues of the protein
degradation, the peptides had theirs scientific status elevated. Then, the peptidomic science has
beginning, leading to the characterization of a wide variety of new and different peptides with great
potential application on biotechnology. In this work, are presented primary structures of peptides
homologous to antimicrobial peptides obtained from skin secretion of Amazonian leptodatylidaes:
Leptodactylus chaquensis and Leptodactylus knudseni, collected at Porto Velho city, state of
Rondônia. The primary structures were obtained by de novo sequence from fragmentation spectra
using a collision gas in a MALDI-TOF/TOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, UK).Two new
peptides were elucidated from L. knudseni skin: a peptide homologous to the ocellatin antimicrobial
peptide family, named as ocellatin-K1, having 25 amino acid residues, 2548,65 Da and C-terminal
amidation; and one peptide homologous to the LASP family, with 25 residues and 1600,69 Da.
Additionally, were identified three structures truncated from ocellatin-K1: ocellatin-K1 (19-25),
(13-25) and (1-23) having 818,54; 1495,88; 2307,49 Da, respectively. The last two are C-terminal
fragments keep the amidation. In L. chaquensis, were identified two new peptides: ocellatin-C1,
with 16 residues and 1718,23 Da; and ocellatin-C2, with 14 residues and 1310 Da. The in silico
analyses of the peptides were performed in order to evaluate their physicochemical properties
related to antimicrobial activity i.e. helicity, hydrophobicity, hydrophobic moment, and charge. The
parameters obtained for ocellatin-K1 were similar to other antimicrobial peptides from the ocellatin
family. Ocellatin-C1 has net charge equal to zero, low hydrophobicity low and polar angle next to
hydrophobic angle, being a weak membrane-active candidate. Ocellatin-C2 shown high
hydrophobic moment, +2 charge, similar to that presented by others ocellatins.
Keywords: Amphibian; Antimicobial peptides; Neglected diseases.
15 1 INTRODUÇÃO
A Amazônia é a maior floreta tropical do mundo (Barreiro, 2009), somando uma
extensão de 5.500.000 Km2. Destes, cerca de 60% pertence ao território brasileiro e é
conhecido como Amazônia Legal, que juntamente com a Mata Atlântica, Pantanal, Cerrado,
Caatinga, Campos e Florestas Meridionais contribuem para que o Brasil seja detentor de um
dos maiores bancos genético do planeta. Aproximadamente 20% de todas as espécies animais
conhecidas do planeta encontram-se em território brasileiro. Em relação aos anfíbios, 875
espécies (SBH, 2010), o que corresponde a aproximadamente 15% das espécies estimadas no
planeta (Figura 1), estando agrupadas em três ordens: Anura (sapos, rãs e pererecas), Caudata
ou Urodela (salamandras) e Gymnophiona (cecílias ou cobras-cegas) correspondendo
respectivamente a 88%, 9% e 3% do total (AMPHIBIAWEB, 2009). Somente a Amazônia
legal abriga mais de 500 espécies, sendo relativamente comum a descrição de novas espécies
(Giareta et al., 2000; Caldwell & Lima, 2003; S. B. H., 2011; Cunha & Nascimento, 1993;
Ávila-Pires, 1995; Haddad & Abe, 1999; Silvano & Segalla, 2005).
Os anfíbios passaram por diversas adaptações comportamentais, fisiológicas e
morfológicas habitando ambientes aquáticos e terrestres ao longo da evolução (Barra &
Simaco, 1995; Nascimento et al., 2003). Os anfíbios são seres relativamente frágeis, sendo
predados especialmente por animais de maior porte. Dentre os mecanismos de defesa
elaborados pelos dos anfíbios está a secreção produzida em glândulas especializadas na pele
desses animais. Dois tipos principais de glândulas especializadas são encontrados na pele dos
anfíbios: glândulas mucosas e granulares. As glândulas mucosas são responsáveis pela
produção da secreção que mantém a superfície cutânea devidamente hidratada, recurso
necessário à respiração cutânea. As glândulas granulares (glândulas serosas ou venenosas) cosintetizam, armazenam e co-secretam diferentes compostos de natureza peptídica, aminas
16 biogênicas e alcalóides, entre outros compostos com amplo espectro de atividade (Erspamer,
1994; Rollins-Smith et al., 2005). Assim, as secreções cutâneas de anuros são ricas fontes de
moléculas bioativas que constituem não só uma barreira contra agentes infecciosos, mas
também desorganizam a homeostasia de predadores potenciais (Nizet et al., 2001; Zasloff,
2002). As glândulas granulares estão distribuídas ao longo de todo o corpo dos anfíbios,
embora, normalmente, estejam encontradas em maior número em torno da cabeça e do
pescoço. Em razão da natureza passiva desse mecanismo de defesa, a secreção do conteúdo
das glândulas granulares é usualmente deflagrada pelo contato ou por injúria ao animal.
Figura 1 – Distribuição das espécies de anfíbios no mundo.
Fonte: AMPHIBIAWEB (2009).
O sistema imune dos anfíbios é altamente desenvolvido (Carey et al., 1999; RollinsSmith, 2001; Rollins-Smith & Cohen, 2004). A pele dos anfíbios é protegida tanto pela
resposta imune inata como pela adaptativa. A última se caracteriza, principalmente, pela
produção de anticorpos e respostas mediadas por linfócitos T. Esse tipo de resposta se
desenvolve a partir do reconhecimento de algum antígeno específico pelas células
apresentadoras de antígenos (macrófagos e células dendríticas) (Du Pasquier & Flajnik, 1990;
Castell-Rodriguez et al., 2001). No caso dos vertebrados de sangue frio essas respostas são
17 elaboradas de forma bastante lenta. O sistema imune inato conta com mecanismos mediados
por células (macrófagos, neutrófilos e células “natural killers”) (Manning and Horton, 1982;
Horton et al., 1996, 1998, 2000, 2003), lise de patógenos mediada pelo sistema complemento
(Green & Cohen, 1977; Grossberger et al., 1989; Lambris et al., 1995) e peptídeos
antimicrobianos secretados (Simmaco et al., 1998; Zasloff, 2002; Rinaldi, 2002; Conlon et
al., 2004).
Há um número crescente de trabalhos dedicados à caracterização de sequências
primárias, bem como caracterização funcional de peptídeos antimicrobianos isolados da pele
de anfíbios (Calderon et al., 2010). Estes peptídeos apresentam tamanho que varia entre 10 a
46 resíduos de aminoácidos, exibindo potente atividade contra bactérias Gram positivas e
Gram negativas, fungos, protozoários e vírus (Apponyi et al., 2004; Calderon et al., 2010;
Conlon et al., 2004; Rinaldi, 2002; Simmaco et al., 1998; Zasloff, 2002.). Cada espécie possui
peculiaridades na produção de seu arsenal de peptídeos, variando a atividade contra um amplo
espectro de microorganismos (Amiche et al., 1999; Conlon et al., 2004). Alguns desses
peptídeos são constitutivos enquanto outros têm sua síntese induzida em resposta a alguma
infecção (Boman, Nilsonn & Rasmuson, 1972; Zasloff, 2002; Cunliffe & Mahida, 2004;
Izadpanah & Gallo, 2005).
Em virtude da emergência de microorganismos dotados de resistência múltipla a
antimicrobianos, alem da infecção de pacientes imunodeficientes, em que os fármacos de uso
corrente não têm apresentado sucesso, os peptídeos antimicrobianos têm surgido como
alternativa para o desenvolvimento de novas ferramentas biotecnológicas (Calderon et al.,
2010). Estes peptídeos variam consideravelmente em níveis estruturais, tamanho e espectro de
atividade, mas a maioria dos peptídeos com aplicação potencial tem pronunciado caráter
anfipático e caráter básico (Calderon et al., 2010).
18 1.1 Peptídeos antimicrobianos
Antibióticos naturais são produzidos por organismos de diversos reinos e
normalmente estocados em tecidos que estão constantemente em contato com patógenos. A
produção desses compostos é constitutiva, ou, como no caso da cecropina em mariposas,
deflagrada por infecções (Bechinger & Lohner, 2006). Estas moléculas são em sua maioria de
natureza peptídica, e constituem um sistema de defesa inato que funciona como barreira
química contra a invasão de microorganismos patogênicos e complementa o sistema imune
adaptativo mediado por células altamente específicas, funcionando assim como um sistema
secundário de defesa de rápida ação (Shai, 1999).
Dentre todos os organismos produtores de peptídeos antimicrobianos, os anfíbios
pertencentes à ordem anura constituem provavelmente a mais rica fonte de moléculas
bioativas dentre os vertebrados. Estes peptídeos são encontrados em diversas famílias de
anfíbios, sendo que espécies das famílias Ranidae e Hylidae se destacam em quantidade e
diversidade de moléculas. Há um grau elevado de semelhança estrutural entre os peptídeos
antimicrobianos de todas as espécies estudadas, indicando a possível existência de um
ancestral comum (Vanhoye et al., 2003).
Os peptídeos antimicrobianos são derivados do processamento de um precursor que
contém uma seqüência sinal e uma pró-região acídica (Figura 2). As características dos
precursores dos peptídeos de todas as espécies estudadas sugerem a conservação de um
cassete secretor como uma provável convergência para agir de maneira ótima no ambiente no
qual é produzido, contra uma ampla variedade de microorganismos locais e a um reduzido
custo metabólico. Esse fato reforça a hipótese que um exón codificador de peptídeo sinal de
vários precursores não relacionados surgiu nos primórdios da evolução dos anfíbios. Além
disso, a conservação dessa seqüência sugere que a mesma deve possuir um papel adicional
19 ainda não descoberto (Charpentier et al., 1998; Hancock & Chapple, 1999). No caso dos
anfíbios, a porção sinal do precursor direciona o peptídeo para o local apropriado na glândula.
Quando o animal é estimulado, uma segunda protease remove a região ácida, liberando o
peptídeo, o qual, após alguns minutos, é desativado por proteases, evitando a toxicidade para
o animal. Modificações pós-traducionais podem ocorrer nos peptídeos sintetizados. Amidação
C-terminal é um tipo de modificação pós-traducional bastante comum. No entanto, outras
modificações acontecem com menor freqüência, como por exemplo, a isomerização de
aminoácidos (Charpentier et al., 1998; Rinaldi, 2002; Pukala et al., 2006). Algumas dessas
modificações possuem importância biológica já comprovada, como por exemplo, o papel
determinante da amidação C-terminal sobre o mecanismo de ação de muitos peptídeos
antimicrobianos (Nascimento et al., 2003).
Figura 2 – Ilustração do Pré-pro-peptídeo e os sítios de clivagem. C – Cisteína; K – Lisina; R – Arginina.
Fonte: Retirado e adaptado de Brand et al. (2007).
A elevada variabilidade de peptídeos encontrados na secreção de anfíbios está
provavelmente relacionada à diversidade dos patógenos com os quais estes animais entram
em contato frequentemente. É importante lembrar que membros da família de peptídeos
antimicrobianos são muitas vezes ativos contra microorganismos diferentes, implicando na
sugestão de que o contato diferenciado com microorganismos exerceu um direcionamento
seletivo que atuou na diferenciação desse grupo de moléculas durante a adaptação dos
anfíbios aos diversos ambientes (Mor & Nicolas, 1994; Bechinger & Lohner, 2006).
Os peptídeos antimicrobianos podem ser classificados de acordo com suas estruturas,
20 sendo distribuídos em três grupos principais, a saber:
(1) peptídeos lineares que adotam conformação em α-hélice anfipática, mas
estão ausentes resíduos de cisteínas (ex: magainins e dermaseptins);
(2) peptídeos com ponte dissulfeto formando um loop C-terminal (ex:
brevinins e esculetins) e;
(3) peptídeos de 10-13 resíduos de aminoácidos (temporins), primeiramente
isolados da Rana temporaria.
Essa é uma classificação simplificada e generalista para ordenar os peptídeos
antimicrobianos segundo informações estruturais. A cada ano são descobertos novos
peptídeos com características estruturais únicas que acabam por constituir novas famílias
(Tabela 1).
Os peptídeos antimicrobianos produzidos na secreção de anuros possuem algumas
características gerais, que são compartilhadas normalmente por um grande número de
moléculas. Dentre estas características comuns aos peptídeos antimicrobianos estão:
constituição por resíduos de L-aminoácidos; grande número de resíduos hidrofóbicos;
presença de resíduos catiônicos que proporcionam carga positiva; conformação em α-hélice
anfipática; 10–50 resíduos de aminoácidos; momento hidrofóbico alto e uma ampla face
apolar em contraste com uma pequena face polar (Hancock & Chapple, 1999; Brogden, 2005;
Conlon et al., 2005 e 2007). Entretanto, algumas estruturas seguem padrões diferenciados. Os
bombinins, por exemplo, são pequenos peptídeos antibióticos que possuem diasteroisômeros,
isto é, a posição do segundo aminoácido pode ser preenchida por uma D-Aloisoleucina. Essa
conversão de quiralidade (L-Isoleucina para D-Aloisoleucina) acontece em virtude da
existência de uma enzima identificada na secreção cutânea de Bombina sp. (Mignogna et al.,
1993; Mollay et al. 2005).
21 Tabela 1: Exemplos de famílias de peptídeos antimicrobianos.
Família
Nome
Plasticininas
Sequência
GLVNGLLSSVLGGGQGGGGLLGGIL
Espécie
Leptodactylus
Referência
Colon et al., 2009
laticeps
Ocelatinas
GVVDILKGAAKDLAGHLATKVMDKLL
Leptodactylus
Colon et al., 2009
laticeps
Buforinas
TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK
Bufo
Choet al., 2009
bufogargarizans
Nigrocina-2
GLLGSLFGAGKKVACALSGLC
Hylarana picturata
Colon et al., 2008
Japocina-1
FFPLALLCKVFKKC
Rana dybowskii
Jin et al., 2009
Palustrina
GLWDNIKNFGKTFALNAIEKLKCKITGGCPP
Rana ornativentris
Ohnuma et al., 2010
Dermatoxinas
SLGGFLKGVGKALAGVGKVVADQFGNLLQAGQ
Phasmahyla
Rates et al., 2010
jandaia
1.1.1 Alvos de ação
Muitos estudos têm sido realizados no intento de elucidar os mecanismos pelos quais
os peptídeos antimicrobianos atuam em seus alvos. Atualmente há duas propostas de alvos
para este grupo de peptídeos; a membrana, onde interagem desencadeando a desestabilização
crítica de sua integridade física; e alvos intracelulares, onde exercem seus efeitos por
eliciarem respostas específicas, tal que, levem o organismo alvo ao fenecimento.
1.1.1.1 Modelos de ação membranolítica
Um grande número de moléculas interage com membranas biológicas provocando
alterações estruturais detectáveis por metodologias específicas. Uma das principais grandezas
passível de ser avaliada é o efeito decorrente da adsorção de moléculas na transição de fase
entre os estados de gel e líquido cristalino de membranas (Sturtevant, 1982). Dado que as
22 interações entre as cadeias de ácidos graxos constituintes da membrana são do tipo “ordemdesordem” de longa distância, a interação com compostos exógenos e a inserção destes na
membrana provoca alterações na ordem da estrutura organizacional das cadeias de
hidrocarbonetos (Jain &Wu, 1977). Foi verificado, através das alterações no “Tm”
(temperatura de transição), que a incorporação de moléculas em membranas pode aumentar
ou diminuir a estabilidade de vesículas fosfolipídicas (Epand & Sturtevante, 1981). Além
disso, a inserção de moléculas exógenas pode originar outros fenômenos, tais qual a indução
da formação de subdomínios ou a abolição da transição de fase (Jain & Wu, 1977).
A constituição da membrana dos microorganismos favorece a seletividade dos
peptídeos antimicrobianos por organismos procarióticos. A diferença de composição na
estrutura da membrana resulta na diferenciação das características físico-químicas da
membrana dos procariotos em relação aos eucariotos. A membrana dos eucariotos é
constituída principalmente pelos fosfolipídios: fosfatidilcolina (FC); esfingomielina (EM);
fosfatidiletanolamina (FE); e esteróis, em que estes últimos são moléculas de carga neutra.
Em contrapartida, a membrana dos microorganismos é composta por moléculas de carga
negativa, tais como: fosfatidilglicerol (FG); cardiolipina (CL); e fosfatidilserina (FS), que
atraem os peptídeos catiônicos. Além desse fator de seletividade, outras características como a
distribuição e saturação de fosfolipídios e o potencial mais negativo das membranas interna e
externa também contribuem com a interação com peptídeos antimicrobianos (PAMs)
(Yeaman & Yount, 2003).
Há um conjunto de propriedades relacionadas à estrutura dos peptídeos
antimicrobianos que, integradas de modo bastante complexo, são determinantes para a
atividade biológica desse grupo de peptídeos. São elas: cationicidade; α-helicidade;
anfipaticidade; hidrofobicidade; e polaridade angular (Powers & Hancock, 2003).
23 Figura 3 – Modelo mecanístico da seletividade dos peptídeos antimicrobianos.
Fonte: Zasloff, 2002.
A cationicidade é uma propriedade fundamental na seletividade dos peptídeos
antimicrobianos
direcionando-os
a
uma
interação
com
fosfolipídios
carregados
negativamente, como mostrado na Figura 3. A cationicidade é caracterizada por um elevado
número de aminoácidos positivamente carregados distribuídos ao longo da face hidrofílica da
hélice, que varia normalmente entre as cargas +2 a +9 nos peptídeos antimicrobianos.
Contudo, há evidências de que o incremento excessivo da cationicidade pode reduzir a
atividade antimicrobiana e aumentar atividade hemolítica (Dathe & Wieprecht, 1999).
O momento hidrofóbico é representado pelo somatório dos vetores de
hidrofobicidade de cada resíduo de aminoácidos perpendicular ao eixo de uma α-hélice ideal,
em que o ângulo entre as cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos está próximo de 100°,
como mostrado na Figura 4. A helicidade descreve a propensão do peptídeo à estruturação em
hélice anfipática e é determinada pela magnitude do momento hidrofóbico, resultando em
cadeias polares alinhadas em uma face da hélice e resíduos hidrofóbicos dispostos na face
oposta mantendo uma relação direta com o aumento do índice de momento hidrofóbico. Já o
ângulo polar é uma medida da proporção relativa entre facetas polares e não-polares de um
24 peptídeo em α-hélice. Quanto maior o índice de ângulo polar menor é a superfície hidrofóbica
do peptídeo. Estudos mostram que este tipo de estruturação dos peptídeos antimicrobianos
ocorre quando há interação destes com a membrana devido a alterações no momento
hidrofóbico e no ângulo polar (Conlon et al., 2007). Este tipo de estruturação favorece a
interação entre os peptídeos e a estrutura anfifílica das membranas biológicas (Dathe &
Wieprecht, 1999). O grau de helicidade e o momento hidrofóbico estão correlacionados
também à toxicidade para células compostas por fosfolipídios neutros, sendo que o aumento
dessas grandezas corresponde ao aumento da toxicidade (Yeaman & Yount, 2003). O
momento hidrofóbico é uma propriedade pouco importante na permeabilização de membranas
carregada, porém, no caso de membranas neutras é determinante (Dathe & Wieprecht, 1999).
No estudo de Wieprecht et al. (1997) o aumento do momento hidrofóbico de análogos de
magainin promoveu maior interação do peptídeo com a membrana em conseqüência da
maximização das interações hidrofóbicas entre as cadeias acil dos lipídios e a porção
hidrofóbica da hélice (Dathe et al., 1997; Blondelle et al., 1999; Dathe & Wieprecht, 1999).
Conforme estudos realizados quanto menor o ângulo polar (e então uma grande superfície
hidrofóbica) maior é a capacidade do peptídeo permeabilizar membrana e maior é a
estabilidade dos poros formados na membrana (Yeaman & Yount, 2003).
A hidrofobicidade corresponde à média dos índices de hidrofobicidade por resíduo,
conforme a Tabela 2. A hidrofobicidade é uma grandeza que avalia a capacidade de um dado
composto mover-se da fase aquosa para a fase hidrofóbica (Zhao, 2003). Logo, trata-se de
uma grandeza de grande importância para a interação entre peptídeos e membranas biológicas
(Yeaman & Yount, 2003).
25 Figura 4 - α-Hélice ideal do peptídeo KLAL. Ângulo de δ-100° entre os resíduos 1 e 2
Fonte: COSTA, 2006
Tabela 2. Hidrofobicidade por resíduos de aminoácidos. Em azul estão os resíduos carregados positivamente,
em vermelho os resíduos carregados negativamente, em verde os resíduos polares e em preto os hidrofóbicos
Fonte: Eisenberg et al., 1984.
Aminoácidos
Arg
Lys
Asp
Glu
Asn
Gln
His
Ser
Thr
Pro
Tyr
Cys
Gly
Ala
Met
Trp
Leu
Val
Phe
Ile
Hidrofobicidade
-2,53
-1,50
-0,90
-0,85
-0,78
-0,74
-0,40
-0,18
-0,05
0,12
0,26
0,29
0,48
0,62
0,64
0,81
1,06
1,08
1,19
1,38
26 A seguir serão apresentados modelos específicos, atualmente propostos para explicar
a atividade membranolítica dos peptídeos antimicrobianos:
a)
Modelo de “Barrel-Stave”;
Este modelo propõe a formação de poros transmembrânicos a partir das moléculas de
peptídeo. De acordo com este modelo (Figura 5), num primeiro momento há uma interação
eletrostática entre o peptídeo e a membrana. Ao interagir com a membrana, as moléculas dos
peptídeos se estruturam em α-hélice e se inserem através da membrana. Esses monômeros
estruturados se organizam para a formação de poros. À medida que monômeros do peptídeo
se agrupam há um aumento do tamanho do poro. A etapa crítica na formação do poro é a
inserção do monômero do peptídeo na membrana, pois sua estruturação transmembrânica é
normalmente desfavorável energeticamente (Shai, 2002).
Figura 5 - Modelo barril (Barrel stave). Neste modelo, os peptídeos se inserem na bicamada de modo
que as regiões hidrofóbicas do peptídeo se alinhem com as regiões do núcleo lipídico, onde as regiões
hidrofílicas do peptídeo formem a face interior do barril. Regiões hidrofílicas do peptídeos são mostrados em
vermelho, e as regiões hidrofóbicas em azul.
Fonte: BROGDEN, 2005.
27 b)
Modelo “Carpet-Like”
Na explicação mecanística “Carpet-Like” (Figura 6), determinados peptídeos
membranoativos são adsorvidos perpendicularmente sobre a membrana quando em altas
concentrações formando uma estrutura assemelhada a um carpete. Assim como nos demais
modelos, o primeiro contato entre peptídeos e membrana é mediado por interação
eletrostática. Após essa interação inicial, os peptídeos se organizam de forma que a face
hidrofílica da hélice-α fiquem em contato com a cabeça hidrofílica dos fosfolipídios enquanto
a face hidrofóbica se orienta em direção à região hidrofóbica da membrana. Por fim, a
formação da estrutura carpete, há o rompimento da curvatura da membrana, levando-a à
desintegração. Isso não exclui a formação de poros transientes antes da desintegração da
membrana (Shai, 2002).
Figura 6 – Modelo “carpet-like”. Neste modelo, os peptídeos se ligam aos fosfolipídios da membrana e
ocorre o alinhamento dos peptídeos de forma que os resíduos hidrofóbicos fiquem em contato com as cabeças
dos fosfolipídios e reorientação dos peptídeos para o centro hidrofóbico da membrana. O resultado final é a
desintegração da membrana em virtude da modificação da curvatura da mesma.
Fonte: BROGDEN, 2005.
28 c)
Modelo Shai-Matsuzak-Huang (SMH)
Neste modelo (Figura 7), propõe-se que a membrana sofre alterações decorrentes da
interação com peptídeos membranoativos. Assim, ao interagir com a membrana, os peptídeos
deslocariam os fosfolipídios, possibilitando assim a entrada do peptídeo para o interior da
célula. Da adsorção de peptídeos na face externa da membrana decorre a expansão desta e a
aproximação dos fosfolipídios da face interna, fenômeno denominado de achatamento de
membrana. Após a adsorção de um dado número crítico de moléculas numa posição
perpendicular à membrana, ocorre a estruturação dos peptídeos em poros, sendo que essa
mudança de conformação é direcionada energeticamente (Zasloff, 2002; Chen, 2002; Chen,
2003; Huang, 2006).
Figura 7 - Modelo Shai-Matsuzak-Huang (SMH). Este modelo envolve a formação de um carpete de
peptídeos na camada externa da membrana, integração do peptídeo à membrana e afinamento da camada externa
e subsequentemente a formação de poros transientes. O próximo passo corresponde ao transporte de lipídios e
peptídeos para a camada interna, implicando na difusão dos peptídeos para alvos intracelulares e finalmente no
colapso da estrutura da membrana.
Fonte: ZASLOFF, 2002.
29 d)
Modelo de ação detergente
Proposto por Bechinger & Lohner (Figura 8), considera que a atividade dos
peptídeos antimicrobianos se deve a ação detergente dessas moléculas anfipáticas. É
importante ressaltar que este modelo não exclui nenhum dos citados acima, contudo os
engloba de forma pragmática (Bechinger & Lohner, 2006).
Figura 8 - Modelo Ação de detergente (Detergent-like). Esse modelo propõe que os peptídeos
intercalam entre os grupos fosfolipídicos da bicamada causando tensão, curvatura e micelização. Regiões
hidrofílicas são mostradas em vermelho e hidrofóbicas em azul.
Fonte: BROGDEN, 2002.
1.1.1.2 Modelos de ação não-membranolíticos
Independentemente do mecanismo de ação, todos os peptídeos antimicrobianos
interagem com a membrana nos primeiros instantes de contato. A partir desta etapa, ocorre ou
o mecanismo desestabilização da estrutura da membrana, ou os peptídeos penetram na célula
30 onde podem deflagrar qualquer via de morte celular. Os alvos intracelulares podem ser os
mais diversos possíveis, tais quais ligação ao DNA, inibição da síntese da parede celular,
inibição da síntese de DNA, RNA e proteínas, inibição enzimática, ativação de autolisina, etc.
1.2 Peptídeos antimicrobianos dos Leptodactilídeos
A família Leptodactlidae, composta por 95 espécies (FROST, 2008), é ainda pouco
explorada quanto à investigação de peptídeos da secreção cutânea. Somente cinco classes de
peptídeos foram descritas: ocellatins (Leptodactylus ocellatus - Nascimento et al., 2004);
fallaxin (Leptodactylus fallax - Rollins-Smith et al., 2004); laticeptin (Leptodactylus laticeps
– Conlon et al., 2006); pentadactylin (Leptodactylus pentadactylus – King et al., 2005);
syphaxins (Leptodactylus syphax - Dourado et al., 2007) e ocellatin-V (Leptodactylus validus
– King et al., 2008).
Ocellatinas
As ocelatinas constituem um grupo de moléculas catiônicas de tamanho aproximado,
cerca de 20 a 25 aminoácidos, apresentando alto índice de similaridade entre si. Além disso,
uma busca nos banco de dados de proteínas aponta para similaridade entre estas moléculas e
outros peptídeos antimicrobianos, como as brevenins, dermaseptins e uperins. (Nascimento et
al., 2004).
Ocellatin-F1 (Fallaxin)
O fallaxin, peptídeo de 25 aminoácidos, foi isolado em Leptodactylus fallax. O
31 fallaxin exibe atividade inibitória sobre o crescimento de bactérias Gram-negativas. Também
apresentou atividade antibacteriana em Gram-positivas, no entanto, tal atividade somente foi
demonstrada a partir de concentrações acima de 200 mM. Fallaxin demonstrou-se um agente
dotado de baixa atividade hemolítica (Rollins-Smith et al., 2005).
Ocellatin-L1 (Laticeptin)
Encontrado na secreção de Leptodactylus laticeps, o peptídeo ocellatin-L1
(laticeptin) teve sua estrutura primária elucidada por Conlon et al (2006). (Gly-Val-Val-AspIle-Leu-Lys-Gly-Ala-Ala-Lys-Asp-Leu-Ala-Gly-His-Leu-Ala-Thr-Lys-Val-Met-Asn-LysLeu.NH(2). Laticeptin possui atividade antimicrobiana contra Gram-negativas e baixa
atividade hemolítica. Contra bactérias Gram-positivas não apresentou atividade. Suas
propriedades funcionais são decorrentes do baixo índice de anfipacidade na sua conformação
hélice-α. Ocellatin-P1 (Pentadactilin)
Pentadactylin é um peptídeo amidado de 25 aminoácidos isolado em Leptodactylus
pentadactylus. O pentadactylin possui atividade antimicrobiana contra colônias de referência
de bactérias Gram-negativas e Gram-positivas, mas a potência antimicrobiana é relativamente
baixa, bem como sua atividade hemolítica (King et al.,2005).
Ocellatin-S1 (Siphaxin)
Cao et al. (2005) isolou e caracterizou peptídeos antimicrobianos da secreção de
32 Leptodactylus syphax. Foram estudados 3 peptídeos, sendo que 2 deles eram fragmentos da
syphaxin, peptídeo amidado com 25 resíduos de aminoácidos.
Ocellatin-V1
As ocellatins da secreção cutânea de Leptodactylus validus estão associadas com
uma baixa atividade antimicrobiana ou com nenhuma atividade contra cepas bacterianas de E.
coli e S. aureus. A análise da estrutura primária da ocellatin-V1 pelo método de Rost e Sander
demonstra que o peptídeo também possui uma forte propensão a adotar estrutura
conformacional em alfa hélice.
1.3 Doenças tropicais negligenciadas e o potencial biotecnológico dos peptídeos
antimicrobianos
As doenças tropicais negligenciadas arruínam a vida de cerca de 1 bilhão de pessoas
no mundo e ameaçam a saúde de outros milhões mais. Estes antigos companheiros da pobreza
acometem sociedades já enfraquecidas, frustrando o alcance das metas de desenvolvimento do
milênio, bem como de resultados de desenvolvimento. A importância dessas patologias tem
provocado uma moção de vários setores da sociedade através de investimentos na prevenção e
controle deste grupo diverso de doenças (WHO, 2010).
A malária é uma patologia causada por parasitas do gênero Plasmodium, que são
transmitidos através da picada da fêmea do mosquito Anopheles. Estima-se que o número de
casos de malária aumentou de 233 milhões em 2000 para 244 milhões em 2005, mas em 2009
esse número caiu para 225 milhões em 2009. O número de mortes em decorrência da malária
decresceu de 985.000 em 2000 para 781.000 em 2009 (WHO, 2010).
33 A leishmaniose é causada por parasitas pertencentes ao gênero Leishmania. Os
flebotomíneos são os vetores, sendo que as fêmeas infectadas transmitem os parasitas durante
o repasto sanguíneo. Esta patologia ameaça a saúde de cerca de 350 milhões de pessoas,
sendo que, cerca de 12 milhões de pessoas são frequentemente infectadas, constando da
ocorrência de 1 a 2 milhões de novos casos por ano. A patologia pode assumir várias formas
clínicas, porém a leishmaniose visceral é a forma mais severa em virtude de acometer órgãos
vitais nas vítimas afetadas (WHO, 2010).
Em vista desse quadro, os peptídeos antimicrobianos surgem como uma fonte
alternativa na busca por candidatos a fármacos no combate a doenças causadas por
microorganismos em virtude, principalmente, da diversidade verificada para esta classe de
compostos. Na seara do combate às doenças negligenciadas, muitos AMPs prospectados na
secreção cutânea de anuros possuem atividade contra diferente espécies de Leishmania, como
é o caso do polipeptídio YY de Phyllomedusa bicolor e da Dermaseptin Hypo 01 de
Phyllomedusa hypochondrialis. Ainda, a Dermasepetina S4 e seus derivados possuem
comprovada ação contra Plasmodium falciparum (revisado por Calderon et al., 2009). Estes
fatos corroboram com a ideia de prospecção molecular na secreção de leptodactilídeos em
busca de moléculas que possam servir de modelo farmacológico no tratamento dessas
doenças.
Nesse contexto, a investigação sobre a presença de moléculas peptídicas
antimicrobianas na secreção de Leptodactylus knudseni e Leptodactylus chaquensis
apresentada neste trabalho representa uma etapa significativa no processo de descoberta de
novos peptídeos bioativos que futuramente poderão ser usufruídos como ferramenta
biotecnológica para o tratamento de patologias endêmicas negligenciadas ou, ainda, no
tratamento de infecções causadas por cepas de microorganismos resistentes à terapêutica
convencional.
34 2 OBJETIVOS
2.1 Objetivos gerais:
Purificar e caracterizar a estrutura primária de peptídeos antimicrobianos presentes
na secreção cutânea de Leptodactylídeos da Amazônia. 2.2 Objetivos específicos:
 Extrair a secreção cutânea de Leptodactylus knudseni e Leptodactylus
chaquensis;
 Purificar peptídeos antimicrobianos por cromatografia de fase reversa em
sistema HPLC;
 Realizar o sequenciamento “de novo” dos peptídeos;
 Analisar as sequências dos peptídeos caracterizados utilizando ferramentas de
bioinformática;
 Sintetizar peptídeos quimicamente visando a caracterização de atividade
biológica.
35 3 METODOLOGIA
3.1 Obtenção da secreção de Leptodactylus knudseni e Leptodactylus chaquensis
Foram capturados 2 espécimes de Leptodactylus knudseni (Figura 9) e 3 espécimes
de Leptodactylus chaquensis (Figura 10) no município de Porto Velho – RO, sob autorização
para atividade com finalidade científica nº: 17983-2, emitida em 18 de setembro de 2009 pelo
Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis – IBAMA. Os
animais foram identificados de acordo com as chaves taxonômicas e descrições disponíveis
para cada grupo na Amazônia: Duellman, 1989, 1990; Rodrigues & Duellman, 1994; DE LA
Riva et al., 2000. A secreção dos espécimes foi obtida mediante estimulação manual da pele
dos animais seguida de lavagem com água Milli-Q. A secreção obtida foi filtrada em
membrana com poros de 0,45 mm e imediatamente congelada em –86 °C. Após o
congelamento, a amostra foi liofilizada e acondicionada em –20 ºC.
36 Figura 9 – Leptodactylus knudseni. Foto por: Leonardo de Azevedo Calderon.
Figura 10 – Leptodactylus chaquensis. Foto por: Leonardo de Azevedo Calderon.
3.2 Isolamento dos peptídeos
Uma alíquota de 2 mg do extrato da secreção de Leptodactylus knudseni foi
ressuspendida em 500 µL de solução de ácido trifluoroacético (TFA Sigma Aldrich-USA)
0,1% + acetonitrila (ACN Sigma Aldrich- USA) 5% e centrifugada a 46,56 x g durante 30
minutos a 25 °C. Com o objetivo de separar os componentes da amostra foi procedida
cromatografia de fase reversa em HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência),
cromatógrafo Akta System (Amersham Bioscience- USA), usando uma coluna Phenomenex
Júpiter Proteo C12 90 Ǻ, 250 x 4.6 mm, 4 µm. A corrida foi configurada para executar um
gradiente segmentado de 2 passos. O primeiro passo do gradiente foi de 5% a 70% de ACN
em 35 minutos. O segundo passo foi de 70% a 95% em 10 minutos. As frações eluídas foram
coletadas manualmente, congeladas e liofilizadas em Speed Vac.
3.3 Espectrometria de massa e sequenciamento “de novo”
A análise da pureza, massa molecular e identidade dos componentes presentes nas
amostras foram conduzidas mediante a utilização de espectrômetro de massa do tipo MALDI-
37 TOF/TOF modelo Ultraflex III (Bruker Daltonics, Alemanha) equipado com laser
SmartBeamTM, controlado pelo software FlexControl 3.0. Para análise por MALDI (Matrix
Assisted Laser Desorption Ionization), as frações obtidas em cromatografia foram
ressuspendidas em 30 µl de TFA 0,1% e em seguida homogeneizadas em solução saturada de
Ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico, numa proporção de 1 parte de amostra para 3 partes de
matriz e distribuídas em placa do tipo Anchorchip 600 μm (384 poços) e secas à temperatura
ambiente. Os espectros de MS e MS/MS foram obtidos no modo refletor com calibração
externa com padrões de peptídeos. Espectros obtidos nas análises de MS/MS sob modo de
operação LIFTTM foram manualmente interpretados utilizando os softwares FlexAnalysis
(versão 3.0, Bruker Daltonics, Alemanha) e PepSeq (versão 3.3, MassLynx, USA).
3.4 Análises das sequências peptídicas
A análise teórica das seqüências foram realizadas utilizando-se ferramentas
disponíveis no Expasy Proteomics Server (http://expasy.org/tools/). A ferramenta BLAST foi
utilizada na busca por similaridades da sequência determinada experimentalmente com os
bancos de dados de estruturas primárias. A predição da estrutura secundária teórica dos
peptídeos foi realizada através do uso do algoritmo HeliQuest (http://heliquest.ipmc.cnrs.fr/cgibin/ComputParams.py). O cálculo dos valores teóricos de hidrofobicidade e momento
hidrofóbico
foi
executado
pelo
algoritmo
(http://www.bbcm.univ.trieste.it/~tossi/HydroCalc/HydroMCalc.html).
No
HydroMCalc
alinhamento
das
estruturas primárias dos peptídeos será utilizado o software Geneious.
As estruturas primárias dos peptídeos apresentados nesta dissertação foram obtidas
por sequenciamento de novo utilizando espectrometria de massa usando a técnica MALDI.
Esta técnica apresenta vantagens de importância factível na caracterização estrutural de
38 compostos protéicos. No entanto, a tecnologia disponível em alguns equipamentos, inclusive
o equipamento utilizado para a realização deste trabalho, ainda não é suficiente para permitir
o discernimento entre massas de compostos distintos que se diferenciam por pequenos índices
de massa. Este evento ocorre entre alguns aminoácidos isobáricos, a saber, entre Isoleucina (I)
e Leucina (L), e entre Lisina (K) e Glutamina (Q). Então, quando da determinação da
sequência por espectrometria de massa verifica-se a presença desses aminoácidos, há
indefinição sobre o aminoácido que ocupa determinada posição. Nestes casos recorre-se a
técnicas complementares para dirimir os possíveis equívocos na sequência. Neste trabalho,
devido a problemas com a disponibilização de tais técnicas em tempo hábil, são apresentadas
as sequências equívocas obtidas por espectrometria de massa. Portanto, as análises dos dados
referentes às sequências considerarão a homologia entre outros peptídeos relacionados para
destacar os motivos conservados dessas estruturas e determinar arbitrariamente quais
aminoácidos equívocos podem ser supridos por homologia. No caso dos peptídeos cujos
aminoácidos equívocos não puderem ser determinados por homologia, as análises das
propriedades físico-químicas serão executadas para todas as possíveis sequências para um
peptídeo.
3.5 Síntese dos peptídeos
A síntese da ocellatin-K1 e de seus derivados foi realizada em colaboração com o
grupo do professor Mário Sérgio Palma (UNESP-Rio Claro), utilizando a estratégia Fmoc de
síntese linear em suporte sólido. Neste método, o primeiro α-aminoácido do peptídeo a ser
introduzido, protegido em seu grupamento α-amino terminal e na sua cadeia lateral, quando
necessário, foi acoplado quimicamente à resina. Em seguida foi procedida a reação de
desproteção do grupo amino do aminoácido adicionado, e a síntese peptídica continua por
39 quantos ciclos forem necessários para completar a síntese. Concluída a síntese, foi realizada a
clivagem por acidólise e o material foi purificado em coluna de fase reversa Phenomenex
Júpiter C18, como descrito anteriormente (Barany & Merrifield, 1980).
40 4 RESULTADOS
4.1 Separação dos peptídeos
A cromatografia do material de Leptodactylus knudseni em fase reversa resultou em
49 frações eluídas. Quando das análises em espectrometria no modo MS/MS, as frações 22,
32, 42, 43 e 49 (Figura 11) apresentaram peptídeos que mostraram padrão satisfatório de
fragmentação do tipo b/y durante a etapa de sequenciamento “de novo”. Estas frações
apresentaram tempos de retenção (em minutos) 18,8 (fração 22), 22,8 (fração 32), 26,5
(fração 42) e 26,8 (fração 43), sendo eluídas com 38%, 45%, 53%, 54% e 59% de ACN,
respectivamente.
A cromatografia referente ao material de L. chaquensis (Figura 12) gerou 21 frações.
Somente nas frações 14 (Oc-C1) e 15 (Oc-2) (Figura 12) foram verificados peptídeos
passíveis de sequenciamento. A fração 14 eluiu em 46% de ACN, enquanto a fração 15 eluiu
em 48%.
41 Figura 11 – Cromatograma do fracionamento da secreção de Leptodactylus knudseni.
Figura 12 – Cromatograma do fracionamento da secreção de Leptodactylus chaquensis.
42 4.2 Espectrometria de massa e sequenciamento de novo
A análise por espectrometria de massa foi executada para todas as frações obtidas
durante as cromatografias. Os peptídeos das frações que apresentaram sinal intenso no
espectro obtido no modo MS foram submetidos à fragmentação em câmara de fragmentação
LIFT. São apresentados aqui apenas os espectros de fragmentação dos peptídeos com padrão
satisfatório de cisão das ligações peptídicas (gerando íons das séries b/y) e passíveis
interpretação. Na fração 43 da cromatografia da secreção de L. knudseni foi identificada a
ocellatin-K1,
apresentando
massa
de
2547,65
Da
e
sequência
GVVDILKGAAKDL/IAGHLASKVMNKI/L-NH2 (Figura 13). A perda de 17 Da no Cterminal indica a presença de amidação. Nas frações 22, 32 e 42 desta mesma cromatografia
foram identificados fragmentos da ocellatin-K1 com sequências e massas monoisotópicas
respectivas dadas a seguir: peptídeo truncado 1 de ocellatin-K1 (PT1Oc-K1) SKVMNKI/LNH2 (817,66 Da) (Figura 14); peptídeo truncado 2 de ocellatin-K1 (PT2Oc-K1)
DL/IAGHLASKVMNKI/L-NH2 (1494,89 Da) (Figura 15) e
peptídeo truncado 3 de
ocellatin-K1 (PT3Oc-K1) GVVDILKGAAKDL/IAGHLASKVMN (2306,49 Da) (Figura
16). Na fração 49 foi identificado um peptídeo análogo de LASP (peptídeo estimulador de
agressividade
em
Leptodactylus)
de
massa
1600,69
Da
e
sequência
GI/LWDDI/LK/QAAAK/QK/QVVSSL/IASAAMEK/QL-NH2 (não mostrado). As frações
14 e 15 da cromatografia referente à secreção de L. chaquensis apresentaram os peptídeos
ocellatin-C1 (1718,23 Da) (Figura 17) e ocellatin-C2 (1310,00 Da) (Figura 18), cujas
sequências são GILDFFKGPVKNALAE e GLLGKGGLLAKVLA, respectivamente.
43 Figura 13 – Espectro de massa da fragmentação da ocellatin-K1, 2547,65 Da. Sequência:
GVVDILKGAAKDL/IAGHLASKVMNKI/L-NH2
Figura 14 – Espetro de massa da fragmentação do PT1Oc-K1, 817,66 Da. Sequência: SKVMNKI/L-NH2
44 Figura 15 – Espectro de massa da fragmentação do PT2Oc-K1, 1494,89 Da. Sequência:
DL/IAGHLASKVMNKI/L-NH2
Figura 16 – Espectro de massa da fragmentação do PT3Oc-K1, 2306,49. Sequência:
GVVDILKGAAKDL/IAGHLASKVMN
45 Figura 17 – Espectro de massa da fragmentação do ocellatin-C1. Sequência: GILDFFKGPVKNALAE
Figura 18 – Espectro de massa da fragmentação do ocellatin-C2. Sequência: GLLGKGGLLAKVLA
46 4.3 Análises de Homologia e Similaridade
Para a elucidação da estrutura primária da ocellatin-K1, ocellatin-C1 e ocellatin-C2
recorreu-se a avaliação da homologia ente as ocellatins, e as posições equívocas das
sequências foram preenchidas de acordo com o grau de similaridade entre as estruturas de
ocellatins disponíveis na literatura. A primeira etapa da análise consistiu do alinhamento da
ocellatin-K1, ocellatin-C1 e ocellatin-C2 com as estruturas das demais ocellatins e edição dos
aminoácidos equívocos de acordo com o grau de homologia (Figura 19).
Figura 19 – Alinhamento da ocellatin-K1 com as demais ocellatins. Retirado e modificado de Leite Jr. et al.
(2010).
Ao fim das primeiras análises, verificou-se a estreita relação estrutural existente entre
as sequências de ocellatin-K1, ocellatin-F1 e ocellatin-L1 de Leptodactylus knudseni, L.
fallax e L. laticeps (Figura 20), respectivamente.
Figura 20 – Alinhamento entre as estruturas primárias da ocellatin-K1, ocellatin-F1 e ocellatin-L1
47 Na figura 21 está representado o alinhamento entre ocellatin-K1 e os fragmentos que
dele se originaram (peptídeos truncados) e foram identificados e caracterizados.
Figura 21 – Alinhamento entre as estruturas de ocellatin-K1 e de seus derivados
4.4 Propriedades estruturais
A Tabela 3 mostra os valores do momento hidrofóbico médio (<µH> x),
hidrofobicidade (<H>) e do momento hidrofóbico médio relativo (<µH> x r) para as
sequências possíveis para ocellatin-K1.
Tabela 3 – Valores do momento hidrofóbico médio (<µH> x), hidrofobicidade média (<H>) e do momento
hidrofóbico médio relativo (<µH> x r) para as sequências possíveis para ocellatin-K1. Na linha em destaque por
sombreamento encontra-se a sequência determinada por homologia.
ID
Sequência
<µH> x
<H>
<µH> x r
Ocelltin-K1 Leu-13/Leu25
GVVDILKGAAKDLAGHLASKVMNKL (NH2)
1.74
-0.74
0.27
Ocelltin-K1 Iso-13/Leu25
GVVDILKGAAKDIAGHLASKVMNKL (NH2)
1.71
-0.78
0.27
Ocelltin-K1 Leu-13/Iso25
GVVDILKGAAKDLAGHLASKVMNKI (NH2)
1.73
-0.78
0.27
Ocelltin-K1 Iso-13/Iso25
GVVDILKGAAKDIAGHLASKVMNKI (NH2)
1.7
-0.82
0.27
Para o ocellatin-K1 foi verificado que o número de aminoácidos hidrofóbicos perfaz
52% da sequência, independente da sequência. A carga líquida estimada para o peptídeo foi
+3. A predição da estrutura secundária indica forte tendência para a formação de uma alfa
hélice com ângulo polar bastante pronunciado (Figura 22).
48 Figura 22 – Projeção da estrutura secundária do ocellatin-K1 utilizando como referência uma hélice ideal.
O peptídeo truncado de ocellatin-K1 de 817,66 Da (PT1Oc-K1) foi avaliado em
mais de um algoritmo para computação de suas grandezas físico-químicas e verificação de
estruturação secundária. Nessas investidas constatou-se que este peptídeo não é capaz de se
estruturar em alfa hélice por possuir apenas 7 aminoácidos, portanto, demasiadamente curto
para assumir conformação em hélice-α. Já sobre fragmento de 1494,89 Da (PT2Oc-K1) foi
observado que 50% dos resíduos de aminoácidos da sequência são hidrofóbicos. A carga
líquida estimada para o peptídeo foi +2. Os valores de momento hidrofóbico <µH>,
hidrofobicidade <H> e momento hidrofóbico médio relativo para as sequências possíveis para
ocellatin-K1 são mostrados no Tabela 4. A predição da estrutura secundária aponta para a
formação de uma hélice-α (Figura 23).
Tabela 4 – Valores do momento hidrofóbico médio (<µH> x), hidrofobicidade média (<H>) e do momento
hidrofóbico médio relativo (<µH> x r) para as sequências possíveis para o PT2Oc-K1. Na linha em destaque por
sombreamento encontra-se a sequência determinada por homologia e utilizada na análise de projeção de
estrutura secundária.
ID
Sequência
<µH> x
<H>
<µH> x r
PT2Oc-K1 Leu-2/Leu14
DLAGHLASKVMNKL (NH2)
2.88
-0.72
0.46
PT2Oc-K1 Iso-2/Leu14
DIAGHLASKVMNKL (NH2)
2.89
-0.79
0.46
PT2Oc-K1 Leu-2/Iso14
DLAGHLASKVMNKI (NH2)
2.81
-0.79
0.44
PT2Oc-K1 Iso-2/Iso14
DIAGHLASKVMNKI (NH2)
2.83
-0.86
0.45
49 Figura 23 – Projeção da estrutura secundária (hélice-α) do PT2Oc-K1 utilizando como referência
uma hélice ideal.
O PT3Oc-K1, maior fragmento de ocellatin-K1 (2306,49 Da) não apresentou
amidação no C-terminal e a sua carga líquida estimada foi +1. A sequência é constituída por
52% de resíduos de aminoácidos hidrofóbicos e os valores computados de algumas grandezas
físico-químicas das sequências possíveis para PT3Oc-K1 são apresentados no Tabela 5. Além
disso, foi prevista a estruturação da molécula em hélice-α (Figura 24).
Tabela 5 – Valores do momento hidrofóbico médio (<µH> x), hidrofobicidade média (<H>) e do momento
hidrofóbico médio relativo (<µH> x r) para as sequências possíveis para o PT3Oc-K1. Na linha em destaque por
sombreamento encontra-se a sequência determinada por homologia e utilizada na análise de projeção de
estrutura secundária.
ID
Sequência
<µH> x
<H>
<µH> x r
PT3Oc-K1 Leu-13
GVVDILKGAAKDLAGHLASKVMN
2.29
-0.8
0.36
PT3Oc-K1 Iso-13
GVVDILKGAAKDIAGHLASKVMNK
1.74
-1.22
0.27
50 Figura 24 – Projeção da estrutura secundária (hélice-α) do PT3Oc-K1 utilizando como referência uma
hélice ideal.
Para o ocellatin-C1 foi verificado alto índice de hidrofobicidade média de (<H>)
0,09 e a carga líquida do peptídeo foi estimada em 0. A predição da estrutura secundária
indica forte tendência para a formação de uma hélice-α com ângulo polar bastante
pronunciado (Figura 25), em acordo com o valor do momento hidrofóbico médio (<µH> x)
2.99. Já o ocellatin-C2 apresentou hidrofobicidade média de (<H>) 1.49 e carga líquida +2.
Um índice de 2.16 foi verificado para o momento hidrofóbico médio, bem com a predição da
estruturação em hélice-α (Figura 26).
51 Figura 25 – Projeção da estrutura secundária (hélice-α) do Ocellatin-C1 utilizando como referência
uma hélice ideal.
Figura 26 – Projeção da estrutura secundária (hélice-α) do Ocellatin-C2 utilizando como referência
uma hélice ideal.
4.5 Síntese química
Depois de sintetizada, a ocellatin-K1 foi analisada para verificação do rendimento da
síntese e pureza (Figura 27). Em seguida o material foi submetido à cromatografia para
52 purificação do ocellatin-K1 (Figura 28), sendo verificada a pureza desta por espectrometria de
massa (dado não mostrado).
Figura 27 – Espectro do material bruto de síntese do ocellatin-K1. As massas 850,159 Da e 637,86 Da
correspondem à tripla e quádrupla cargas do ocellatin-K1 (2547,65 Da).
Figura 28 – Cromatograma de purificação do ocellatin-K1 sintético.
53 5 DISCUSSÃO
5.1 Perfis cromatográficos da secreção de Leptodactylus knudseni e Leptodactylus
chaquensis
O gênero Leptodactylus tem sido reconhecido como rica fonte de moléculas com
atividade antimicrobiana. O cromatograma de L. knudseni se mostrou um exemplo clássico
dessa diversidade molecular apresentada pelos leptodactilídeos. Quando comparado a dados
presentes em literatura, o perfil cromatográfico mostra alta similaridade na eluição dos
compostos (Nascimento et al., 2004; Rollins-Smith et al., 2004; Conlon et al., 2006; King et
al., 2005; Dourado et al., 2007; King et al., 2008). Nas análises posteriores verificou-se que
na maioria das frações eluídas podem ser encontrados peptídeos que, infelizmente, não
puderam ser seqüenciados neste trabalho, mostrando as potencialidades da química
combinatorial natural proveniente da pele desses anuros. Sob a ótica de bioprospecção de
ativos potencialmente utilizáveis no combate a doenças tropicais, isto abre precedentes para
outras investidas sobre a secreção de L. knudseni com o propósito de caracterizar a vastidão
peptídica ali existente através de outras técnicas que viabilizem os trabalhos de elucidação da
estrutura primária desses peptídeos.
No caso da secreção de L. chaquensis, através do cromatograma observa-se uma
relativa “pobreza” molecular, sendo especulada a possibilidade de degradação do material,
visto que perfil cromatográfico apresentado se distingue completamente daquele verificado
para a secreção de outros leptodactilídeos, inclusive de L. knudseni, que é encontrado na
mesma área geográfica que os espécimes de L. chaquensis utilizados neste estudo.
54 5.2 Análise teórica das propriedades estruturais das sequências obtidas
A busca em banco de dados demonstrou que o peptídeo caracterizado neste trabalho
(ocellatin-K1, 25047,65 Da) possui grande similaridade estrutural com as ocellatins, classe de
peptídeos antimicrobianos caracterizados a partir da secreção de espécies do gênero
Leptodactylus. Através do grau de homologia determinou-se a estrutura da ocellatin-K1:
GVVDILKGAAKDLAGHLASKVMNKL(NH2).
O ocellatin-K1 apresentou variação do índice de hidrofobicidade média (<H>)
calculada entre -0,74 e -0,82 (Quadro 3), índice desejável do ponto de vista funcional dos
peptídeos antimicrobianos demonstrando propensão à atividade membranoativa da molécula
quando comparada com os índices de ocellatin-1(<H> -0,29), ocellatin-V1(<H> -0,71),
ocellatin-F1 (<H> -0,78) e ocellatin-S1 (<H> -0,6). Entre 4 possíveis estruturas para o
ocellatin-K1 aquela determinada por homologia apresenta o menor índice, enquanto aquela
em que a isoleucina é substituinte nas posições 13 e 25 possui o menor índice de
hidrofobicidade média (-0,82), refletindo a alta hidrofobicidade da isoleucina em relação à
leucina. Estudos acerca da influência da hidrofobicidade sobre a membranoatividade
comprovam que o aumento da hidrofobicidade correlaciona-se com o aumento da
permeabilização de bicamadas “zwiteriônicas”, implicando, desta feita, em elevação da
atividade hemolítica (Zhao, 2003; Yeaman et al., 2003). Isto demonstra que a hidrofobicidade
pode ser um parâmetro avaliador da atividade de determinado peptídeo sobre membranas
neutras nos casos de predição de atividade antimicrobiana (Kwon et al.,1998). Além disso, o
estudo de Wieprecht et al. (1997) mostra ainda uma pequena redução da propriedade
antimicrobiana com o aumento da hidrofobicidade.
O momento hidrofóbico médio (<µH>x) computado para ocellatin-K1 variou entre
<µH>x 1,70 e <µH>x 1,74, de acordo com a possível sequência (Quadro 3). Como a
magnitude de µH mede a anfipaticidade dos peptídeos há uma estreita relação entre o
55 momento hidrofóbico e a helicidade, fatores determinantes para a membranoatividade, de tal
forma que o aumento destas grandezas representa um respectivo aumento da
atividade/toxicidade do peptídeo (Yeaman & Yount, 2003). A estrutura primária do ocellatinK1 apresentou <µH>x 1,74. Isto indica um equilíbrio na razão atividade/toxicidade, posto
que, da família de peptídeos ocellatins, o ocellatin-1 apresenta o maior índice (<µH>x 2,23) e
o ocellatin-S1 o menor (<µH>x 1,56), enquanto a ocellatin-F1 <µH>x 1,71.
Pragmaticamente, estes dados podem ser melhor observados ao analisar visualmente a figura
21, verificando-se a disposição dos aminoácidos na projeção da estrutura secundária do
ocellatin-K1 e o grau de anfipaticidade estrutural dela decorrente. A variação de
hidrofobicidade e momento hidrofóbico calculados para o ocellatin-K1 decorre da alteração
da sequência nos pontos definidos (nas posições 13 e 25. Isso mostra o grau de influência das
modificações sobre a estrutura primária sobre importantes grandezas determinantes para a
atividade
antimicrobiana.
Outros
importantes
indícios
estruturais
da
propriedade
antimicrobiana da ocellatin-K1, é a carga líquida estimada de +2, e a amidação C-terminal e
independente da modificação dos aminoácidos Leucina-13 e Isoleucina-25 por Isoleucina e
Leucina, nas 4 combinações possíveis. A cationicidade é um elemento determinante no
direcionamento da interação com os fosfolipídios carregados negativamente, ou mesmo, na
repulsão daqueles carregados positivamente, sendo, portanto, um fator seletivo para a atuação
dos peptídeos. Como nos peptídeos antimicrobianos essa grandeza varia ente +2 e +9 (Dathe
& Wieprecht, 1999), no caso específico do ocellatin-K1 é possível prever sua a forte
tendência seletiva para membranas carregadas negativamente.
A análise teórica a respeito da atividade antimicrobiana do menor peptídeo truncado
do ocellatin-K1 (PT1Oc-K1, 817,66 Da) indica uma tendência negativa por ser
demasiadamente curto, a saber, 7 resíduos de aminoácidos. Os peptídeos antimicrobianos
caracterizados em secreções de anfíbios possuem em média 10-50 resíduos (Hanckock &
56 Chapple, 1999; Brogden, 2005). A ausência de atividade antimicrobiana, caso confirmada por
modelos experimentais práticos, deve-se possivelmente à incapacidade do PT1Oc-K1
estruturar-se em hélice, propriedade essencial para a interação com membranas biológicas
(Dathe & Wieprecht, 1999). O alinhamento entre PT1Oc-K1 e ocellatin-K1 (Fig. 12) mostra
que a fragmentação ocorreu na posição 18-19 do peptídeo original (ocellatin-K1), sendo que o
fragmento encontrado e caracterizado (PT1Oc-K1) encontra-se na região C-terminal, e a
porção complementar na extremidade contrária.
A avaliação teórica de algumas propriedades físico-químicas de PT2Oc-K1 (peptídeo
truncado 2 da ocellatin-K1, 1494,89 Da) aponta para uma provável atividade antimicrobiana.
O PT2Oc-K1 corresponde ao fragmento da região C-terminal compreendendo os aminoácidos
da posição 12 à 25, apresentando uma amidação em sua extremidade C-terminal. A carga
líquída calculada para o peptídeo foi +2, um elemento determinante na produção do efeito
membranolítico (Strandberg et al., 2007). O PT2Oc-K1 apresentou hidrofobicidade média
(<H>) calculada variando entre -0,72 e -0,86 (Quadro 4), demonstrando um elevada tendência
membranoativa, visto que a hidrofobicidade pode ser um parâmetro avaliador da atividade de
determinado peptídeo sobre membranas neutras nos casos de predição de atividade
antimicrobiana (Kwon et al.,1998). A hidrofobicidade média apresentada pelas possíveis
sequências foi bastante semelhante ao índice verificado nas respectivas sequências do
peptídeo inteiro dos quais se originaram. O momento hidrofóbico médio (<µH>x) computado
para PT2Oc-K1 variou entre <µH>x 2,81 e <µH>x 2,89, de acordo com a possível sequência.
Isto indica que a modificação estrutural gerada pela quebra do ocellatin-K1 no sítio 12/13
provocou um aumento teórico da atividade e toxicidade em relação ao peptídeo inteiro, que
apresenta momento hidrofóbico médio (<µH>x) avaliado entre <µH>x 1,70 e <µH>x 1,74.
O PT3Oc-K1 (peptídeo truncado 2 da ocellatin-K1) (2306,49 Da) corresponde ao
fragmento N-terminal gerado por cisão entre os resíduos 23 e 24 da ocellatin-K1. O PT3Oc-
57 K1 possui carga líquida calculada +1, contudo não apresenta amidação C-terminal. A maioria
dos estudos com peptídeos antimicrobianos naturais mostram que a presença da amidação Cterminal, apesar de aumentar atividade membranolítica, não necessariamente representa uma
condição exigida para o efeito antimicrobiano. O PT3Oc-K1 apresentou hidrofobicidade
média (<H>) calculada variando entre <H> -0,8 e <H> -1,22 (Quadro 5), valores
considerados bons indicadores para a atividade sobre membranas biológicas. Índices de
hidrofobicidade altos estão relacionados com um respectivo aumento da permeabilização de
bicamadas zwiteriônicas, implicando, desta feita, em elevação da atividade hemolítica (Zhao,
2003; Yeaman et al., 2003). O contrário, a redução da hidrofobicidade, leva à redução da
propriedade antimicrobiana com o aumento da hidrofobicidade (Wieprecht et al.,1997). O
momento hidrofóbico médio (<µH>x) computado para PT3Oc-K1 variou entre <µH>x 1,74 e
<µH>x 2,29, de acordo com a possível sequência, valores que demonstram um alto
coeficiente teórico de atividade e toxicidade.
Para o ocellatin-C1, apesar de apresentar em sua estrutura elevado número de
resíduos hidrofóbicos apresentou baixa hidrofobicidade (índice calculado: (<H>) 0,09). Isto
ocorreu em virtude da presença de um alto número de resíduos de aminoácidos carregados,
fazendo com que a hidrofobicidade média caísse. Como foi dito anteriormente, a
hidrofobicidade é um agente determinante na atividade antimicrobiana de peptídeos
membranolíticos, de forma que quanto maior é a hidrofobicidade tanto maior será a atividade
ou a toxicidade do peptídeo. No caso específico do ocellatin-C1, além de apresentar baixa
hidrofobicidade, a carga líquida computada para o peptídeo foi 0. Todos estes dados tornam o
ocellatin-C1 um fraco candidato a peptídeo antimicrobiano, embora não possa ser descartada
a possibilidade desse peptídeo agir de modo membranolítico, visto que sua estruturação em
hélice-α foi predita e corroborada por um elevado índice de momento hidrofóbico médio
(<µH> x) 2,99. Já o ocellatin-C2 apresentou valores animadores. Sua hidrofobicidade média
58 foi consideravelmente alta (<H>) 1,49), assim como sua carga líquida +2 é interessante do
ponto de vista da seletividade desejada para peptídeos antimicrobianos. Um índice
hidrofóbico médio de 2,16 contribui definitivamente com a candidatura do ocellatin-C2 a
peptídeo antimicrobiano, a que soma-se a predição de estruturação em hélice-α.
5.3 Perspectivas
A ocellatin-K1 foi sintetizada e purificada. A partir de agora deverão ser realizados
os testes biológicos para averiguação de suas atividades antibacteriana, leishmanicida e
plamosdicida. Em vista das análises in silico, são esperados resultados positivos nas análises
das propriedades funcionais que se seguirão ao presente momento. Espera-se que, pelo menos
acerca das propriedades antibacterianas, o ocellatin-K1 apresente atividade considerável,
seguindo o exemplo das demais ocelatinas. Em relação às atividades antileishmania e
antiplasmódio, será necessário realizar uma averiguação prática, pois nenhuma da ocelatinas
descritas na literatura consultada foi testada contra estes parasitas.
59 6 CONCLUSÃO
A busca de moléculas funcionalmente ativas contra bactérias resistentes aos
antimicrobianos disponíveis e outros microorganismos responsáveis por patologias de grande
importância para a saúde pública têm sido um dos focos dos holofotes da pesquisa básica para
o desenvolvimento de novos fármacos. O empreendimento de esforços à procura de novas
drogas para o tratamento dos males remonta aos tempos imemoriais da humanidade. No
ínterim do final do século IXX e início do século XXI, essa empreitada ganhou um novo viés
com a era em que os conceitos de preservação e sustentabilidade têm sido constantemente
incutidos no seio ético-moral da sociedade.
Neste contexto, este trabalho presta sua contribuição através do registro do
isolamento e caracterização inéditos do peptídeo ocellatin-K1 do gênero Leptodactylus
(Leptodactylus knudseni), marco importante para o setor de pesquisas com peptídeos
antimicrobianos na Amazônia, região norte do Brasil. A sequência deste peptídeo foi
depositada em banco de dados UniProtKB/Swiss-Prot sob o número P86711. Os peptídeos
truncados de ocellatin-K1 foram, também, identificados e caracterizados. Além disso, os
peptídeos ocellatin-C1 e ocellatin-C2 de Leptodactylus chaquensis tiveram suas estruturas
primárias elucidadas. Como pode ser verificado no desenvolver do estudo apresentado, esses
peptídeos são moléculas potencialmente empregáveis nos estudos de estratégias no combate a
microorganismos causadores de doenças diversas, em específico, aqueles causadores de
patologias tropicais negligenciadas.
A partir de agora, são necessários ensaios biológicos para a confirmação de suas
propriedades funcionais previstas. Em relação à atividade antiparasitária dos peptídeos
identificados no estudo, caberá uma investigação prática acerca da existência ou não da
atividade contra alguns parasitas, como por exemplo, Leishmania e Plasmodium. Após
60 verificação dos aspectos funcionais do ocellatin-K1 e de seus derivados, em especial a
atividade antiparasitária, serão implementados estudos dos mecanismos de ação envolvidos
com as possíveis atividades detectadas.
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76 RESUMO
Durante a evolução, os anfíbios anuros desenvolveram mecanismos eficientes de proteção
contra invasão microbiana. Sua pele, além de proporcionar uma barreira física contra a
entrada de microrganismos, possui glândulas especializadas na produção e secreção de
moléculas: peptídeos, esteróides, aminas biogênicas, entre outras, que proporcionam uma
barreira química contra infecção. A partir da década de 1960, vários estudos acerca da
composição das secreções cutâneas de anfíbios evidenciaram o papel dos peptídeos como
princípios ativos responsáveis pela atividade biológica destes venenos. De simples resíduos da
degradação protéica, os peptídeos tiveram seu status científico elevado, surgindo então a
peptidômica, levando à caracterização de uma grande variedade de novos e diferentes
peptídeos bioativos com grande potencial aplicação nanobiotecnológica. Nesta dissertação,
são apresentadas estruturas primárias de peptídeos homólogos da família ocellatina a partir da
secreção cutânea de leptodactilídeos amazônicos: Leptodactylus chaquensis e Leptodactylus
knudseni, coletados no município de Porto Velho, Rondônia. As estruturas primárias foram
obtidas via seqüenciamento de novo a partir de espectros de fragmentação em câmara de
colisão de um espectrômetro MALDI-TOF/TOF (Bruker Daltonics, DE). Foram parcialmente
elucidadas as estruturas de dois novos peptídeos em L. knudseni; um peptídeo homólogo a
família ocellatina de peptídeos antimicrobianos, batizado de ocellatin-K1, apresentando 25
resíduos, massa de 2548,65 Da e amidação C-terminal, e um peptídeo homólogo aos
estimuladores de agressividade em Leptodactylus, com 25 resíduos e 1600,69 Da.
Adicionalmente foram identificadas três estruturas truncadas derivadas da ocellatin-K1, com
os respectivos números de resíduos e massa: 23 e 2307,49 Da; 14 e 1495,88 Da; 7 e 818,54
Da. Os dois últimos são fragmentos C-terminais e conservam a amidação. Em L. chaquensis
foram identificados dois novos peptídeos, ocellatin-C1 com 16 resíduos e 1718,23 Da, e
ocellatin-C2, com 14 resíduos e 1310,00 Da. As estruturas primárias foram analisadas in
silico para avaliação das propriedades físico-químicas relacionadas à atividade
antimicrobiana, a saber, hidrofobidicade, momento hidrofóbico, helicidade, e carga líquida.
Os parâmetros observados para ocellatin-K1, i.e., carga +3, alto momento hidrofóbico e
helicidade, se assemelham aos observados em outros antimicrobianos da família. A ocellatinC1 possui carga líquida igual a zero, baixa hidrofobicidade média e ângulo polar praticamente
equivalente ao ângulo hidrofóbico, apresentando-se como um fraco candidato a agente
membranoativo. Já o ocellatin-C2 é potencialmente um antimicrobiano, apresentando alto
índice de momento hidrofóbico e carga + 2, semelhante a outras ocellatinas.
77 ABSTRACT
During the evolution, the anuran amphibians developed efficient defence mechanisms against
microbial attack. Their skin, besides serving as a physical barrier to block the microbial
invasion, has specialized glands for the production and secretion of molecules, i.e. peptides,
steroids, biogenic amine, and others, that promote the chemical barrier against infection. Next
to the 60’s end, several research studies appointed to the importance of the peptides as
venom’s active principle, having central importance in the biological activity. From simple
residues of the protein degradation, the peptides had theirs scientific status elevated. Then, the
peptidomic science has beginning, leading to the characterization of a wide variety of new
and different peptides with great potential application on nanobiotechnology. In this work, are
presented primary structures of peptides homologous to antimicrobial peptides obtained from
skin secretion of Amazonian leptodatylidaes: Leptodactylus chaquensis and Leptodactylus
knudseni, collected at Porto Velho city, state of Rondônia. The primary structures were
obtained by de novo sequence from fragmentation spectra using a collision gas in a MALDITOF/TOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, UK).Two new peptides were elucidated from
L. knudseni skin: a peptide homologous to the ocellatin antimicrobial peptide family, named
as ocellatin-K1, having 25 amino acid residues, 2548,65 Da and C-terminal amidation; and
one peptide homologous to the LASP family, with 25 residues and 1600,69 Da. Additionally,
were identified three structures truncated from ocellatin-K1: ocellatin-K1 (19-25), (13-25)
and (1-23) having 818,54; 1495,88; 2307,49 Da, respectively. The last two are C-terminal
fragments keep the amidation. In L. chaquensis, were identified two new peptides: ocellatinC1, with 16 residues and 1718,23 Da; and ocellatin-C2, with 14 residues and 1310 Da. The in
silico analyses of the peptides were performed in order to evaluate their physicochemical
properties related to antimicrobial activity i.e. helicity, hydrophobicity, hydrophobic moment,
and charge. The parameters obtained for ocellatin-K1 were similar to other antimicrobial
peptides from the ocellatin family. Ocellatin-C1 has net charge equal to zero, low
hydrophobicity low and polar angle next to hydrophobic angle, being a weak membraneactive candidate. Ocellatin-C2 shown high hydrophobic moment, +2 charge, similar to that
presented by others ocellatins.
Check List 5(3): 425–427, 2009.
ISSN: 1809-127X
NOTES ON GEOGRAPHIC DISTRIBUTION
Amphibia, Anura, Leptodactylidae, Leptodactylus chaquensis:
Distribution extension and geographic distribution map
Leonardo de Azevedo Calderon 1, 2
Kaynara Delaix-Zaqueo 1
Kayena Delaix Zaqueo 1
Rodrigo Perea Serrano 3
Mariluce Rezende Messias 4
José de Lima Cardozo-Filho 1
Rafaela Diniz-Sousa 1
Rafael de Jesus Holanda 1
Tiago Bispo Rego 1
Rodrigo Guerino Stabeli 1, 2
1
Universidade Federal de Rondônia, Núcleo de Saúde, Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas a Medicina Prof.
Dr. José R. Giglio.BR 364, Km 9,5. CEP 76800-000. Porto Velho, RO, Brazil. E-mail: [email protected]
2
Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais de Rondônia.,
Rua da Beira 7671, BR364, Km 3,5. CEP 76812-245. Porto Velho, RO, Brazil.
3
4
Universidade Federal do Acre, Centro Multidisciplinar, Laboratório de Geoprocessamento.
Gleba Formoso 245, Colônia São Francisco. CEP 69980-000. Cruzeiro do Sul, AC, Brazil.
Universidade Federal de Rondônia, Núcleo de Tecnologia, Laboratório de Mastozoologia.
BR364, Km 9,5. CEP 76800-000. Porto Velho, RO, Brazil.
The frog Leptodactylus chaquensis Cei, 1950
(Figure 1) belongs to the L. ocellatus group (Frost
2007). The geographic distribution of this species
extends over several biomes, including Amazonia,
Chaco, Cerrado, Pampa and Pantanal in
Argentina, Bolivia, Brazil, Paraguay and Uruguay
(Duellman 1999, De la Riva and Maldonado
1999, Heyer et al. 2004). In Brazil, this species
was reported to occur in Acre (Heyer et al. 2004),
Mato Grosso (NIEFA 1998, Filho 2009), Mato
Grosso do Sul (Ávila and Ferreira 2004, Prado et
al. 2000 and 2005, Strüssmann et al. 2000), Minas
Gerais (Silveira 2006), Rio Grande do Sul (Santos
and Cechin 2008, Santos et al. 2008) and São
Paulo states (Santos et al. 2007, Vasconcelos and
Rossa-Feres 2005) (Figure 2).
In this note we report the first record of
L. chaquensis for the state of Rondônia, in
southwestern Brazil, in a transitional region
between the Cerrado and the Amazonian forest
biomes. Three males and one female of
L. chaquensis were collected at Porto Velho,
Rondônia, in anthropized area near Governador
Jorge Teixeira de Oliveira International Airport
(08°43'51" S, 63°53'31" W), Porto Velho on 04
October 2008 by LAC. Another female was
collected in the same area on 6 January 2009 by
KDZ. A male was found on 22 November 2008 at
Cujubim (Manoa farm, 08°56'05'' S, 62°34' 17'',
KDZ), and a female was collected at the
Universidad Federal de Rondônia on 10 February
2009 (08°49'59" S, 63°56'21" W, LAC).
Specimens were identified according to Santos
and Cechin (2008).
These new records extends the geographic
distribution of L. chaquensis about 350 Km
eastwards from closest records in Beni, Bolivia
(De la Riva and Maldonado 1999) (Figure 2).
Voucher specimens were deposited in the
anuran collection of the Centro de Estudos
de Biomoléculas Aplicadas a Medicina,
Universidade Federal de Rondônia, Porto Velho,
Rondônia, Brazil (CEBio 090220-010409, CEBio
090227-010449, CEBio 090330-010486, CEBio
090416-010495, CEBio 090615-0104124, CEBio
090615-0104125, CEBio 090615-0104126).
425
Check List 5(3): 425–427, 2009.
ISSN: 1809-127X
NOTES ON GEOGRAPHIC DISTRIBUTION
Figure 1. Leptodactylus chaquensis showing the brownish dorsal coloration and posterior surface of the thighs
with an uniform dark green coloration.
Figure 2. Distribution map for Leptodactylus chaquensis with the new records for the state of Rondônia, Brazil
(red circles): 1: municipality of Porto Velho at the margins of the international airport access highway;
2: municipality of Cujubim area, Manoa farm; 3: Federal University of Rondônia, Campus area. The blue squares
correspond to records areas for L. chaquensis obtained from the literature cited. The green area represents the
distribution area for L. chaquensis in the IUCN Red List of Threatened Species site (Heyer et al. 2004).
426
Check List 5(3): 425–427, 2009.
ISSN: 1809-127X
NOTES ON GEOGRAPHIC DISTRIBUTION
Acknowledgements
The authors are grateful to Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) for de
license expedition (17983-1), Fundação de Tecnologia do Acre (FUNTAC) and Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) for financial support.
————————————————
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Received March 2009
Accepted July 2009
Published online August 2009
427
Check List 5(2): 317–319, 2009.
ISSN: 1809-127X
NOTES ON GEOGRAPHIC DISTRIBUTION
Amphibia, Anura, Hylidae, Phyllomedusinae, Phyllomedusa azurea:
Distribution extension and geographic distribution map
Leonardo de Azevedo Calderon 1, 3
Mariluce R. Messias 2
Rodrigo P. Serrano 4
Kayena D. Zaqueo 1
Eduardo S. de Souza 2
Samuel dos S. Nienow 2
José de L. Cardozo-Filho 1
Rafaela Diniz-Sousa 1
Kaynara Delaix-Zaqueo 1
Rodrigo G. Stabeli 1, 3
1
Universidade Federal de Rondônia, Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas a Medicina Prof. Dr. José Roberto
Giglio, Núcleo de Saúde. BR 364, Km 9,5. CEP 78900-000. Porto Velho, RO, Brazil.
E-mail: [email protected]
2
Universidade Federal de Rondônia, Núcleo de Tecnologia, Laboratório de Mastozoologia.
BR 364, Km 9,5. CEP 78900-000. Porto Velho, RO, Brazil.
3
Instituto de Pesquisas em Patologias Tropicais (IPEPATRO).
Rua da Beira 7671, BR 364, Km 3,5. CEP 78912-000. Porto Velho, RO, Brazil.
4
Universidade Federal do Acre, Campus Floresta, Centro Multidisciplinar, Laboratório de Geoprocessamento.
Gleba Formoso, Lote 245, Colônia São Francisco. CEP 69980-000. Cruzeiro do Sul, AC, Brazil.
Phyllomedusa azurea Cope, 1862 (Figure 1)
was recently revalidated by Caramaschi (2006)
who included it in the P. hypochondrialis
species group, along with P. ayeaye, P. centralis,
P.
hypochondrialis,
P.
megacephala,
P. nordestina, P. oreades, P. palliata and P.
rohdei.
The known distribution range of Phyllomedusa
azurea include mainly Chacoan regions of
Bolivia, Paraguay, Northern Argentina, and the
Pantanal and Cerrado regions of Central Brazil
(Caramaschi 2006, Frost 2007, Prado et al. 2008).
In this work we report the first record of P. azurea
for the state of Rondônia, in southwestern Brazil,
in a transitional region between the Cerrado and
the Amazonian forest biomes.
Two specimens of this species were collected
at Porto Velho, Rondônia, in anthropized areas
near Governador Jorge Teixeira de Oliveira
International Airport (08°43'60'' S, 63°53'60'' W,
LAC, 5 October 2008) and in the Santo Antônio
Furnas hydroelectric power plant area (08°48'35''
S, 63°57'13'' W, MRM, 11 November 2008,
Figure 2). Specimens were identified according
to the diagnosis presented by Caramaschi
(2006), and are deposited in the anuran collection
of the Centro de Estudos de Biomoléculas
Aplicadas a Medicina, Universidade Federal
de Rondônia, Porto Velho, Rondônia, Brazil
(CEBIO 090123-010314, CEBIO 090129010329).
These localities are the northernmost known
records of P. azurea, and are about 980 km from
the nearest locality previously reported for this
species, Porto Esperidião, Mato Grosso, Brazil.
The records of P. azurea in the northern Rondônia
are the first for the Amazonian biome, in a
transitional area with the Cerrado.
317
Check List 5(2): 317–319, 2009.
ISSN: 1809-127X
NOTES ON GEOGRAPHIC DISTRIBUTION
Figure 1. Phyllomedusa azurea from Porto Velho, state of Rondônia, Brazil.
Figure 2. Distribution map of Phyllomedusa azurea with new records for Porto Velho, state of Rondônia, Brazil
(red circles). The blue squares correspond to records areas obtained from Caramaschi 2006 and Prado et al. 2008.
318
Check List 5(2): 317–319, 2009.
ISSN: 1809-127X
NOTES ON GEOGRAPHIC DISTRIBUTION
Acknowledgements
The authors are grateful to Ulisses Caramaschi for his help in the identification of the specimens and to Luciano Paulino
da Silva for manuscript revision. We also thank the Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais
Renováveis (IBAMA) for de license expedition (# 17983-1). This work was supported by Fundação de Tecnologia do
Acre (FUNTAC), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Financiadora de Estudos e
Projetos (FINEP) and Madeira Energia S.A. (MESA).
————————————————
Literature cited
Caramaschi, U. 2006. Redefinição do grupo de
Phyllomedusa hypochondrialis, com redescrição de P.
megacephala (Miranda-Ribeiro, 1926), revalidação
de P. azurea Cope, 1862 e descrição de uma nova
espécie (Amphibia, Anura, Hylidae). Arquivos do
Museu Nacional 64: 159-179.
Frost, D. R. 2007. Amphibian Species of the World.
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herpetology/amphibia/index.php. American Museum
of Natural History, New York, USA. Captured on
October 2008.
Prado, V. H. M., R. E. Borges, F. R. Silva, T. T.
Tognolo, and D. de C. Rossa-Feres. 2008. Amphibia,
Anura, Hylidae, Phyllomedusa azurea: Distribution
extension. Check List 4(1): 55-56.
Received March 2009
Accepted April 2009
Published June 2009
319