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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
RAQUEL FELIPE DE VASCONCELOS CARNEIRO
AVALIAÇÃO DE NEUROTOXICIDADE AUTONÔMICA
E NEUROMUSCULAR ESQUELÉTICA DE EXTRATO BRUTO
DE PHILLORHIZA PUNCTATA E TOXINA DE TITYUS
SERRULATUS
FORTALEZA – CEARÁ
2009
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RAQUEL FELIPE DE VASCONCELOS CARNEIRO
AVALIAÇÃO DE NEUROTOXICIDADE AUTONÔMICA
E NEUROMUSCULAR ESQUELÉTICA DE EXTRATO BRUTO
DE PHILLORHIZA PUNCTATA E TOXINA DE TITYUS
SERRULATUS
Dissertação apresentada ao Curso de
Mestrado
Acadêmico
em
Ciências
Fisiológicas do Centro de Ciências da Saúde
da Universidade Estadual do Ceará, como
requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Ciências Fisiológicas, sob
orientação da Dra. Cláudia Ferreira Santos e
co-orientação de Nilberto Robson Falcão do
Nascimento.
FORTALEZA – CEARÁ
2009
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E agora o fim está próximo
Então eu encaro o desafio final
Meu amigo, Eu vou falar claro
Eu irei expor meu caso do qual tenho certeza
Eu vivi uma vida que foi cheia
Eu viajei por cada e todas as rodovias
E mais, muito mais que isso
Eu fiz do meu jeito
Arrependimetos, eu tive alguns
Mas então, de novo, tão poucos para mencionar
Eu fiz, o que eu tinha que fazer
E eu vi tudo, sem exceção
Eu planejei cada caminho do mapa
Cada passo, cuidadosamente, no correr do atalho
Oh, mais, muito mais que isso
Eu fiz do meu jeito
Sim, teve horas, que eu tinha certeza
Quando eu mordi mais que eu podia mastigar
Mas, entretanto, quando havia dúvidas
Eu engoli e cuspi fora
Eu encarei e continuei grande
E fiz do meu jeito
Eu amei, eu ri e chorei
Tive minhas falhas, minha parte de derrotas
E agora como as lágrimas descem
Eu acho tudo tão divertido
De pensar que eu fiz tudo
E talvez eu diga, não de uma maneira tímida
Oh não, não eu
Eu fiz do meu jeito
E pra que é um homem, o que ele tem
Se não ele mesmo, então ele não tem nada
Para dizer as coisas que ele sente de verdade
E não as palavras que ele deveria revelar
Os registros mostram que eu recebi as desgraças
E fiz do meu jeito
My Way (tradução)
Composição: Claude François / Jacques Revaux / Paul Anka
4
A Deus, por sempre me trazer força,
serenidade e ensinamentos em todos
os momentos de minha vida;
Aos meus pais, Eloneid Felipe
e Dimas Vasconcelos, por todo
amor e dedicação,
a quem devo minha vida;
Ao meu marido, Adriano Carneiro,
que tem me ensinado, todos os dias
de nossas vidas, o verdadeiro
significado do sentimento amor.
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AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Eloneid e Dimas, por toda uma vida de dedicação e carinho e pela
indispensável presença em todos os momentos.
Ao meu marido, Adriano, por ter me erguido quando eu, por vezes, pensei em
desistir e por todo o amor, compreensão e ensinamentos dedicados a mim.
À Dra. Cláudia Ferreira Santos, por ter acreditado em minhas capacidades e a quem
sou grata pela orientação, pelos “puxões de orelha” e por sua sempre
disponibilidade em ajudar.
Ao Dr. Nilberto Robson Falcão do Nascimento, pela amizade, por ter me
contaminado com sua “curiosidade científica”, pela labuta na bancada com os
experimentos, por todas as correções e contribuições deste trabalho.
Ao Dr. Marcos Hikari Toyama, por todas as contribuições, por ter cedido as toxinas
animais e por toda a colaboração em ceder dados ainda não publicados.
À todos de minha família, especialmente meus irmãos Talita, Eduardo Augusto e
Pedro Henrique.
À família do meu marido, Dona Fátima, Dona Jandira, Dona Guiomar, Seu Izo,
Natália, Thiago, Paulo e agregados (risos!) pela alegria e convivência harmoniosa
que nos unem em uma verdadeira família.
À minha “boadrastra” Socorro, pela presença sempre alegre.
Aos queridos amigos Diana, Felipe e Diennifer pelos inesquecíveis anos de
convivência e pela inabalável amizade. Nós sempre seremos “o quarteto fantástico”.
Às amigas Clarisse Cavalcante e Angélica Fernandes que, mesmo com as
ausências, fazem parte da minha vida.
6
Aos pós-graduandos do LFCC, especialmente, Clauber, Vanessa, Denise e Pedro
pelo convívio mais próximo e enriquecedor.
Aos alunos de iniciação cientifica Léo Aguiar (LFCC) e Flávia Couto (LEF) pelos
primeiros ensinamentos sobre as técnicas de execução dos experimentos.
Aos bolsistas do LFCC, especialmente Paula Priscila, Hilana Cahina, Vítor Martins e
Norberto pelo companheirismo e importante ajuda com os animais e soluções.
Aos bolsistas do LEF e à Dra. Roseli Barbosa pela companhia nos finais de semana
e sacrifício dos animais.
Aos companheiros de turma do mestrado, por todas as horas de convívio em busca
de conhecimentos.
À coordenação do curso de Educação Física da UNIFOR, na pessoa da Liana Braid,
e á direção da EDISCA, na pessoa de Dora Andrade, por compreenderem meus
momentos de ausência dedicados ao mestrado.
À todos os pós-graduandos do CMACF.
À todos os professores do CMACF.
À todos os funcionários do ISCB.
À FUNCAP, pelo apoio financeiro.
À cada um que esteve comigo durante esta jornada e que, mesmo de longe, deixou
sua marca neste trabalho, o meu muito obrigada!
7
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
1.1 Venenos e toxinas animais
1.2 Filo Cnidária e as águas-vivas
1.2.1 Phyllorhiza punctata
1.2.2 Extrato de tentáculo da Phyllorhiza punctata
1.3 Filo Artrópode e os escorpiões
1.3.1 Tityus serrulatus
1.3.2 Toxina do Tityus serrulatus
1.4 Canal deferente de camundongo
1.4.1 Inervação do canal deferente
1.4.2 Estudos in vitro com transmissão neuromuscular simpática
1.4.2.1 Registros mecânicos da contração muscular
1.4.3 Contração neurogênica em canal deferente de roedor
1.4.3.1 Cotransmissão de NA e ATP
1.4.3.2 Contração bifásica e cinética dos neurotransmissores
1.5 Corpo cavernoso de camundongo
1.5.1 Inervação do corpo cavernoso
1.6 Músculo diafragma de camundongo
1.6.1 Inervação do músculo diafragma
1.6.1.1Junção neuromuscular frênico-diafragma
22
22
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28
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45
2. JUSTIFICATIVA
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3. OBJETIVOS
54
3.1 Objetivo geral
3.2 Objetivos específicos do extrato de Phyllorhiza punctata
3.3 Objetivos específicos da toxina de Tityus serrulatus
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Animais experimentais
4.2 Drogas e reagentes
4.3 Preparo do extrato de Phyllorhiza punctata
4.4 Isolamento da toxina gama e incubação com morina e cumarina
4.5 Canal deferente isolado de camundongo
4.6 Corpo cavernoso isolado de camundongo
4.7 Preparação do frênico-diafragma
54
54
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56
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59
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4.8 Preparação de músculo biventer-cervicis
4.9 Protocolos experimentais
4.9.1 Protocolos experimentais com o extrato Phyllorhiza punctata
4.9.2 Protocolos experimentais com a toxina gama
4.10 Análise estatística
4.11 Comitê de ética
5. RESULTADOS
5.1 Resultados do extrato de Phyllorhiza punctata
5.2 Resultados da toxina gama
60
60
61
63
65
65
66
64
92
6. DISCUSSÃO
103
7. CONCLUSÃO
116
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
118
ANEXOS
135
9
LISTA DE ABREVIATURAS
ACh
Acetilcolina
ANOVA
Análise de variância
ATP
Adenosina 5’-trifosfato
C
Cumarina
Ca2+-ATPase
Bomba de cálcio
CDV
Comportas dependentes de voltagem
CDT
Comportas dependentes do tempo
AChE
Enzima acetilcolinesterase
EC50
50% da resposta máxima
EDTA
Ácido etilenodiamino tetra-acético
EFS
Estímulo de campo elétrico
EJPs
Potencias juncionais excitatórios
EPM
Erro padrão da média
FEN
Fentolamina
GMPc
Guanosina monofosfato cíclica
GUA
Guanetidina
HPLC
Cromatografia líquida de alta performance
Hz
Hertz
LID
Lidocaína
L-NAME
NG -nitro-L-arginina-metil-éster
M
Morina
MVD
Mouse vas deferens
NA
Noradrenalina
NO
Óxido nítrico
NOS
Óxido nítrico sintetase
PHE
Fenilefrina
PHY-N
Toxina da Phyllorhiza punctata
RDHP
Receptores diidropiridínicos
RyR
Receptores rianodínicos
10
SDS
Dodecil sulfato de sódio
Ts g
Toxina gama
Tsg C
Toxina gama modificada com cumarina
Tsg M
Toxina gama modificada com morina
Tsg N
Toxina gama nativa
Ts Tx
Tityus toxina
Túbulos T
Sistema tubular transverso
V
Volts
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Distribuição da Phyllorhiza punctata ao longo da costa Pág. 24
brasileira
Figura 2 – Phyllorhiza punctata fotografada in situ por Leopoldo Pág. 25
Gerhardinger
Figura 3 – Eletroforese bidimensional do extrato de tentáculo da P. Pág. 27
punctata
Figura 4 – Escorpião Tityus serrulatus
Pág. 30
Figura 5 – Representação esquemática do sistema urogenital de Pág. 33
camundongo macho
Figura 6 – Pênis de camundongo
Pág. 40
Figura 7 – Representação esquemática da cavidade abdominal de Pág. 42
camundongo
Figura 8 – Diagrama da junção neuromuscular
Pág. 45
Figura 9 – Mecanismo de acoplamento excitação-contração
Pág. 48
Figura 10 – Figura 10 – Registro fisiográfico das contrações induzidas Pág. 65
pelo extrato de Phyllorhiza punctata (PHY-N) (117,2µg/ mL) em canais
deferentes de camundongo (MVD)
Figura 11 – Registro fisiográfico do efeito do veículo (controle) nas Pág. 66
contrações em canal deferente (MVD) (A). Registro fisiográfico das
contrações induzida pelo extrato de Phyllorhiza punctata (PHY-N)
(117,2µg/ mL) em MVD (B). Curva dose-resposta para PHY-N em MVD:
efeito de aumento das contrações nas concentrações de 0,1 a 3.000ng/
12
mL. Dados expressos como média + erro padrão da média (n=7) da
porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao grupo controle
(veículo), Test t. (C)
Figura 12 – Curva tempo-resposta para Phyllorhiza punctata (PHY-N) em Pág. 67
canal deferente (MVD): curso temporal de decaída da contração induzida
pela PHY-N após efeito máximo, comparada com o controle. Dados
expressos como média + erro padrão da média (n=7) da porcentagem da
contração inicial. *p<0,05 em relação ao grupo controle (veículo), Test t.
Figura 13 – Registro fisiográfico do efeito da guanetidina e fentolamina na Pág. 66
contração induzida por Phyllorhiza punctata (PHY-N) (A). Efeito da
guanetidina e fentolamina na contração induzida por estimulação elétrica
(EFS) e por PHY-N. Dados expressos como média + erro padrão da
média (n=4) da porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao
grupo controle (EFS), ANOVA seguido de Dunnett. #p<0,05 em relação a
contração induzida por PHY-N, ANOVA seguido de Turkey-Kramer (B)
Figura 14 – Registro fisiográfico do efeito da fentolamina na contração Pág. 70
induzida por Phyllorhiza punctata (PHY-N) (A). Efeito de 100µM de
fentolamina na contração induzida por estimulação elétrica (EFS) e por
PHY-N. Dados expressos como média + erro padrão da média (n=4) da
porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao controle (EFS),
ANOVA seguido de Dunnett. #p<0,05 em relação a contração induzida por
PHY-N, ANOVA seguido de Turkey-Kramer (B).
Figura 15 – Registro fisiográfico do efeito da NA exógena na contração Pág. 72
induzida por Phyllorhiza punctata (PHY-N) (A). Efeito de 10µM de
noradrenalina (NA) exógena na contração induzida por PHY-N. Dados
expressos como média + erro padrão da média (n=5) da porcentagem da
contração inicial. *p<0,05 em relação ao grupo controle (estimulação
elétrica - EFS), ANOVA seguido de Dunnett. #p<0,05 em relação a
contração induzida por PHY-N, ANOVA seguido de Turkey-Kramer (B).
13
Figura 16 – Registro fisiográfico do efeito da lidocaína na contração Pág. 73
induzida por Phyllorhiza punctata (PHY-N) (A). Efeito da lidocaína (1mM)
na contração induzida por estimulação elétrica (EFS) e induzida por PHYN. Dados expressos como média + erro padrão da média (n=4) da
porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao grupo controle
(EFS), ANOVA seguido de Dunnett. #p<0,05 em relação a contração
induzida por PHY-N, ANOVA seguido de Turkey-Kramer (B).
Figura 17 – Registros preliminares do relaxamento induzido por PHY-N Pág. 75
em corpo cavernoso de coelho pré contraído com 10µM de fenilefrina
(PHE) e pronta reversão induzida por 1mM de lidocaína (LID).
Figura 18 – Figura 18 – Registro fisiográfico do relaxamento em corpo Pág. 76
cavernoso pré-contraído de camundongo induzido por Phyllorhiza
punctata (PHY-N) (A). Efeito de relaxamento do corpo cavernoso de
camundongo pré contraído (1µM de fenilefrina - PHE) induzido por PHY-N
(117,2µg/mL), comparado ao controle (estimulo elétrico - EFS, 32Hz,
50V). Dados expressos como média + erro padrão da média (n=7) da
porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao grupo controle,
Teste t, teste pareado (B).
Figura 19 – Curva tempo-resposta para Phyllorhiza punctata (PHY-N) em Pág. 77
corpo cavernoso de camundongo: curso temporal de relaxamento induzido
pela PHY-N (117,2µg/mL) em corpo cavernoso de camundongo précontraído com 1µM de fenilefrina (PHE), comparada com o controle
(veículo). Dados expressos como média + erro padrão da média (n=7) da
porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao grupo controle
(veículo), Test t.
Figura 20 – Registro fisiográfico do relaxamento em corpo cavernoso de Pág. 79
camundongo pré-contraído induzido por Phyllorhiza punctata (PHY-N) na
presença de lidocaína (LID) (A). Efeito do relaxamento induzido por
117,2µg/mL PHY-N + 1mM de LID e LID (1mM) + PHY-N (117,2µg/mL)
14
em corpo cavernoso de camundongo pré-contraído (1µM de fenilefrina PHE). Dados expressos como média + erro padrão da média (n=7) da
porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao grupo controle,
ANOVA seguido de Dunnett. #p<0,05 em relação a contração induzida por
PHY-N, ANOVA seguido de Turkey-Kramer (B).
Figura 21 – Figura 21 – Registro fisiográfico do relaxamento induzido por Pág. 80
Phyllorhiza punctata (PHY-N) na presença de NG -nitro-L-arginina-metiléster (L-NAME) em corpo cavernoso de camundongo pré-contraído com
fenilefrina (PHE). Efeito do relaxamento induzido por 117,2µg/mL de PHYN na presença de 10µM L-NAME em corpo cavernoso de camundongo
pré-contraído com 1µM de PHE, comparado com controle (EFS, 32Hz,
50V) e com relaxamento induzido por PHY-N. Dados expressos como
média + erro padrão da média (n=7) da porcentagem da contração inicial.
*p<0,05 em relação ao grupo controle, ANOVA seguido de Dunnet.
#p<0,05 em relação ao relaxamento induzido por PHY-N, ANOVA seguido
de Turkey-Kramer (B).
Figura 22 – Curso temporal de relaxamento do corpo cavernoso de Pág. 82
camundongo pré-contraído por fenilefrina (PHE) (1µM) induzidos por
117,2µg/mL de Phyllorhiza punctata (PHY-N) na presença de 1mM de LID,
comparado com o relaxamento induzido apenas por PHY-N (A). Curso
temporal de relaxamento do corpo cavernoso de camundongo précontraído por PHE (1µM) induzido 117,2µg/mL de PHY-N na presença de
10µM de NG -nitro-L-arginina-metil-éster (L-NAME), comparado com o
relaxamento induzido apenas por PHY-N (B). Dados expressos como
média + erro padrão da média (n=7) da porcentagem da contração inicial.
*p<0,05 em relação à PHY-N, Test t.
Figura 23 – Registro fisiográfico do efeito do veículo (controle) nas Pág. 84
contrações em frênico-diafragma (A). Registro fisiográfico típico das
contrações induzida por Phyllorhiza punctata (PHY-N) em frênicodiafragma (B). Curva dose-resposta para PHY-N em frênico-diafragma:
efeito da redução da amplitude das contrações nas concentrações de 0,1
15
a 1000 ng/mL (C). Dados expressos como média + erro padrão da média
(n=4) da porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao grupo
controle (veículo), Test t.
Figura 24 – – Curva tempo-resposta para Phyllorhiza punctata (PHY-N) Pág. 85
em frênico-diafragma de camundongo: curso temporal do bloqueio
induzido por 117,2µg/ mL de PHY-N, após seu efeito máximo, comparada
com o controle (veículo). Dados expressos como média + erro padrão da
média (n=4) da porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao
grupo controle (veículo), Test t.
Figura 25 – Pinto em óbito apresentaram relaxamento muscular Pág. 87
generalizado, após receberam injeção de galamina (6mg/ Kg)
Figura 26 – Pinto em óbito, apresentaram rigidez generalizada da Pág. 87
musculatura esquelética, após receber injeção de succinilcolina (6mg/ Kg).
Figura 27 – Comparação visual das diferantes reações de cada animal Pág. 88
logo após o óbito. Á direita, pinto em óbito, apresentado relaxamento
muscular generalizado, após receberam injeção de galamina (6mg/ Kg). À
esquerda, pinto em óbito, apresentaram rigidez generalizada da
musculatura esquelética, após receber injeção de succinilcolina (6mg/ Kg).
Figura 28 – Pinto em óbito, apresentaram rigidez local da pata traseira, Pág. 89
após receber injeção de PHY-N (6mg/ Kg).
Figura 29 – Registro fisiográfico das contrações induzidas por toxina Pág. 91
nativa (Tsg N) em canal deferente (MVD) (A). Curva dose-resposta para
Tsg N, toxina modificada por cumarina (Tsg C) e por morina (Tsg M) (5
mg/mL) em MVD: efeito de aumento da amplitude das contrações nas
concentrações de 0,1 a 1.000ng/ mL (B). Curva tempo-resposta para Tsg
N e toxinas modificadas Tsg C e Tsg M (5 mg/mL) em MVD: curso
temporal de decaída do efeito após contração máxima induzido pelas
toxinas modificas, comparadas com Tsg N (C). Dados expressos como
16
média + erro padrão da média (n=4) da porcentagem da contração inicial.
*p<0,05 em relação ao grupo controle, ANOVA seguido de Turkey-Kramer.
Figura 30 – Registro fisiográfico da contração induzida por toxina Pág. 93
modificada por cumarina (Tgs C) na presença de lidocaína (LID) em MVD
(A). Efeito da contração induzida por Tgs C (300ng/mL) na presença de
LID (1mM). Dados expressos como média + erro padrão da média (n=4)
da porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao estímulo
elétrico, ANOVA seguido de Dunnett. #p<0,05 em relação a contração
induzida por Tsg N, ANOVA seguido de Turkey (B).
Figura 31 – Registro fisiográfico da contração induzida por toxina Pág. 94
modificada por morina (Tgs M) na presença de lidocaína em canal
deferente (MVD) (A). Efeito da contração induzida por Tgs M (300ng/mL)
na presença de lidocaína (1mM). Dados expressos como média + erro
padrão da média (n=4) da porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em
relação ao estímulo elétrico, ANOVA seguido de Dunnett. #p<0,05 em
relação a contração induzida por Tsg N, ANOVA seguido de Turkey (B).
Figura 32 – Registro fisiográfico da contração induzida por toxina Pág. 96
modificada por cumarina (Tgs C) na presença de fentolamina em canal
deferente (MVD) (A). Efeito da contração induzida por 300ng/mL de Tgs C
na presença de fentolamina (100µM). Dados expressos como média +
erro padrão da média (n=4) da porcentagem da contração inicial. *p<0,05
em relação ao grupo controle, ANOVA seguido de Dunnett. #p<0,05 em
relação a contração induzida por Tsg N, ANOVA seguido de Turkey (B).
Figura 33 – Registro fisiográfico da contração induzida por toxina Pág. 97
modificada por morina (Tgs M) na presença de fentolamina em canal
deferente (MVD) (A). Efeito da contração induzida por Tgs M na presença
de fentolamina (10-2; 50µL). Dados expressos como média + erro padrão
da média (n=8) da porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação
ao grupo controle, ANOVA seguido de Dunnett. #p<0,05 em relação a
contração induzida por Tsg N, ANOVA seguido de Turkey (B)
17
Figura 34 – Curva tempo-resposta para toxina nativa (Tsg N) e toxinas Pág. 99
modificadas com cumarina (Tsg C) ou morina (Tsg M) (5 mg/mL) em
biventer-cervicis de pinto: curso temporal do efeito de bloqueio induzido
pelas toxinas, após seu efeito máximo, comparada com o controle. Dados
expressos como média + erro padrão da média (n=4) da porcentagem da
contração inicial. *p<0,05 em relação ao grupo controle, ANOVA seguido
de Turkey.
Figura 35 – Massa molecular da toxina nativa (Tsg N), da toxina Pág.100
modificada com morina (Tsg M) e toxina modificada com cumarina (Tsg C)
depois da purificação em C18 HPLC (A). Resultados do CD espectro da
Ts g N, Tsg M e Tsg C mostraram dados sobre o intervalo de 185-280 nm
expressos em unidades de miligraus (B). Fluorescência mensurada para
Tsg N, Tsg M e Tsg C (C). Dados cedidos pelo Professor Doutor Marcus
Hikari Toyama.
Figura 36 – Esquema sugestivo de ação do extrato de Phyllorhiza Pág.104
punctata (PHY-N)
18
LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1: Resumo publicado no The Journal of Venomous Animals and Pág.135
Toxins including Tropical Diseases em 2007.
ANEXO 2: Artigo científico na versão inglês, oriundo dessa dissertação, Pág.137
para submissão em revista científica.
19
RESUMO
AVALIAÇÃO DE NEUROTOXICIDADE AUTONÔMICA E NEUROMUSCULAR
ESQUELÉTICA DE TOXINAS DE EXTRATO BRUTO DE Phillorhiza punctata E
TOXINA DE Tityus serrulatus
Mestrado Acadêmico em Ciências Fisiológicas/ Universidade Estadual do Ceará
Raquel Felipe de Vasconcelos Carneiro. Orientadora: Cláudia Ferreira Santos
Atualmente, tem sido intensificada a pesquisa por novas drogas em venenos e
toxinas. As águas-vivas e escorpiões são organismos de relevante importância
econômica, ecológica e médica. Esse trabalho mostra a investigação dos efeitos do
extrato de tentáculo da água-viva Phyllorhiza punctata (PHY-N) e da toxina do
escorpião Tityus serrulatus, em preparações neuromusculares para definir uma
caracterização farmacológica dessas toxinas. Esses achados são bastante
relevantes para colaborar na descoberta dos mecanismos de ação das mesmas,
fornecendo informações adicionais sobre a ação destas e auxiliando no tratamento
dos envenenamentos. Para tal, foram utilizadas preparações farmacológicas
clássicas de canal deferente (MVD) e corpo cavernoso de camundongo. As
contrações induzidas por PHY-N apresentam amplitudes de 395,71 + 42,00%, e são
bloqueadas em MVD na presença de guanetidina + fentolamina (92,19 + 2,96%,
p<0,05 vs controle) ou apenas fentolamina (79,60 + 7,83%, p<0,05 vs controle),
indicando que o efeito da PHY-N é pré-sináptico, mediado por fibras noradrenérgicas
e que há participação dos canais de sódio neuronais no mecanismo de ação contrátil
da PHY-N em MVD. Em fibras nitrérgicas, PHY-N induziu relaxamento de 84,42 +
14,20% (p<0,05 vs controle). Na presença de L-NAME, PHY-N não foi capaz de
induzir relaxamento em corpo cavernoso, indicando que a ação dessa toxina na
contração nitrérgica ocorre via liberação do óxido nítrico. PHY-N parece agir como
um bloqueador da classe despolarizante, como a succinilcolina in vivo na junção
neuromuscular esquelética. Por outro lado, a toxina de Tityus serrulatus na forma
nativa (Tsg N) induziu um rápido início de hiperexcitabilidade autonômica e as
toxinas modificadas por morina e cumarina não retiveram essa atividade
farmacológica. A toxina de Tityus serrulatus modificada com morina (Tsg M)
demonstrou ser o mais potente indutor de aumento significativo do tônus. No
entanto, não houve modificações no perfil de neurotoxicidade observados com as
toxinas de Tityus serrulatus modificada com morina (Tsg M) e com cumarina (Tsg C).
PALAVRAS-CHAVES: Phyllorhiza punctata; Tityus serrulatus; Toxicidade;
Preparações neuromusculares
20
ABSTRACT
NEUROTOXICITY
AUTONOMY
AND
NEUROMUSCULAR
SKELETON
EVALUATION OF TOXIN FROM CRUDE EXTRACT OF Phillorhiza punctata AND
TOXIN FROM Tityus serrulatus
Master Scholar in Physiological Sciences / State University of Ceará
Raquel Felipe de Vasconcelos Carneiro. Advisor: Claudia Ferreira Santos
Currently, has intensified the search for new drugs to poisons and toxins. The
jellyfish and scorpions are relevant of economic importance, ecological and medical.
This research work shows the effects of the extract of tentacle from jellyfish
Phyllorhiza punctata (PHY-N) and the toxin of the scorpion Tityus serrulatus on
neuromuscular preparations to establish a pharmacological characterization of these
toxins. These findings are very important to cooperate in the discovery of the
mechanisms of action of them, providing information about the action and helping
those in the treatment of poisoning. To this end, we used pharmacological
preparations classic channel deferens (MVD) and corpus cavernosum of mice. The
contractions induced by PHY-N were 395.71 + 42.00%, and MVD are blocked in the
presence of guanethidine + phentolamine (92.19 + 2.96%, p <0.05 vs control) or just
phentolamine (79.60 + 7.83%, p <0.05 vs control), indicating that the effect of N-PHY
is pre-synaptic, mediated by noradrenergic fibers and that there is involvement of
neuronal sodium channels in the mechanism of action of PHY-N in the MVD. In fiber
nitrergics, PHY-N induced relaxation of 84.42 + 14.20% (p <0.05 vs control). In the
presence of L-NAME, PHY-N not able to induce relaxation in corpus cavernosum,
indicating that the action of this toxin occurs via release of nitric oxide. PHY-N seems
to act as a depolarizing blocker class, such as succinylcholine in vivo in skeletal
neuromuscular junction. Furthermore, the toxin from Tityus serrulatus native (Tsg N)
induced a rapid onset of autonomic hyperexcitability and toxins modified by morin
(Tsg M) and coumarin (Tsg C) didn’t retain the pharmacological activity. The modified
toxin from Tityus serrulatus with morin has proved the most potent inducer of
significant increase in tone. However, no changes in the profile of neurotoxicity
observed withTsg M and Tsg C.
KEY WORDS: Phyllorhiza punctata; Tityus serrulatus; Toxicity; Neuromuscular
preparations
21
1. INTRODUÇÃO
1.1 Venenos e toxinas animais
As toxinas animais e seus alvos constituem um notável mundo molecular de
complementaridade e diversidade (MÉNEZ, 1998). Os animais aquáticos, por
exemplo, utilizam a produção de toxinas como uma tática importante na garantia de
sobrevivência nos ecossistemas muito competitivos (JUNQUEIRA, 2006). O veneno
de escorpiões, por sua vez, é rica fonte de neurotoxinas capazes de modificar o
funcionamento dos canais iônicos (CONCEIÇÃO et al., 2005). Essas toxinas, por
tanto, compõem-se em uma rica fonte de agentes bioquímicos ativos, aumentando a
relevância de pesquisas nessa área (JUNQUEIRA, 2006). Novas substâncias
biologicamente ativas e toxinas presentes em venenos e secreções de animais
típicos
da
biodiversidade
brasileira
ainda
precisam
de
bastante
estudos,
representando, portanto, um território rico em possíveis investigações para
pesquisadores da área de produtos naturais (MELO; HABERMEHL; OLIVEIRA,
2000).
Cerca de 25 a 50% dos produtos descritos na farmacopéia são derivados de
plantas e apenas poucas drogas derivam de venenos e toxinas animais
(BRADBURY, 2003). Essa escassez parece está relacionada ao fato de que apenas
mais recentemente tem sido intensificada a pesquisa por novas drogas em venenos
e toxinas (MÉNEZ, 1998; BRADBURY, 2003), apesar do seu constatado uso
folclórico em rituais e remédios (ERSPAMER et al., 1993).
Nas últimas décadas, as pesquisas para se descobrir e estudar receptores
(VITAL-BRAZIL; FONTANA, 1993; UCHITEL, 1997), para investigar vias fisiológicas
(HODGSON; WICKRAMARATNA, 2002; CONCEIÇÃO et al., 2005), para descobrir
moléculas com uso terapêutico potencial (HARVEY et al., 1998) ou, ainda, para
produção de novos medicamentos (KARALLIEDDE, 1995; CLARKE, 1997) vêem
apresentando as toxinas de animais, plantas e microorganismos como ferramentas
essenciais.
22
1.2 Filo Cnidária e as águas-vivas
Na história evolutiva do reino Animal, os cnidários surgiram cedo e se
difundiram no final do período Pré-cambriano. O filo Cnidária é de grande
importância evolutiva, pois os animais que compõem esse filo são os primeiros a
apresentarem tecidos verdadeiros (embora ainda não formem órgãos); uma
cavidade digestiva; e movimentos de contração e de extensão do corpo, podendo se
locomover (DAVID et al., 2008).
A principal característica dos cnidários, que são animais completamente
aquáticos (com exceção de alguns poucos, todos são marinhos) (DAVID et al.,
2008), é a presença dos tentáculos com os cnidócitos, células especializadas que
contêm estruturas urticantes, denominadas nematocistos. Essas células participam
da defesa contra predadores e também permitem a captura de presas maiores e
mais complexas. Utilizando a substância produzida, os cnidários têm a capacidade
de paralisar imediatamente pequenos animais capturados por seus tentáculos. Os
nematocistos são também responsáveis pelas queimaduras que algumas águasvivas ou mães-d’águas, e outros cnidários, causam nos banhistas e mergulhadores
(HADDAD JR et al., 2002; DAVID et al., 2008). A presença do cnidócito deu nome
ao filo Cnidária que, etimologicamente, se origina do grego knida, que significa urtiga
(DAVID et al., 2008).
Atualmente, existem cerca de 10 mil espécies de cnidários (DAVID et al.,
2008), sendo 200 as espécies de cifozoários (MIANZAN; CORNELIUS, 1999). As
águas-vivas de cifozoários, que apresentam importante papel nas cadeias
alimentares marinhas, são organismos de relevante importância econômica,
ecológica e médica, podendo afetar as atividades turísticas e pesqueiras (PURCELL;
GRAHAM; DUMONT, 2001).
A Chinorex fleckeri, por exemplo, conhecida popularmente como vespa-domar, é um cnidário marinho da classe dos cubozoários, ordem das cubomedusas e
da família Chirodropidae, que pode causar ferimentos letais em banhistas. Essa
espécie, que costuma atacar nas costas australianas, possui veneno tão poderoso
que pode matar uma pessoa adulta em dois minutos. Cada animal carrega veneno
23
suficiente para matar aproximadamente sessenta homens e seu veneno é
quinhentas vezes mais potente que o veneno da caravela portuguesa, outra espécie
de medusa (LUMLEY et al., 1988; FENNER; HARRISON, 2000).
A medusa Chinorex fleckeri vive nas águas do Oceano Pacífico, possuí
tentáculos que medem até três metros e seu corpo é do tamanho de uma bola de
basquete. Seu veneno é liberado ao mínimo contato com os tentáculos, mesmo que
estes não estejam mais ligados ao corpo da água-viva, e, nos seres humanos causa
parada cardíaca e respiratória (LUMLEY et al., 1988; FENNER; HARRISON, 2000;
TIBBALLS, 2006; KONSTANTAKOPOULOS et al., 2009). C. fleckeri foi rotulada o
"mais peçonhento animal" do mundo (TIBBALLS, 2006; KONSTANTAKOPOULOS et
al., 2009). Essa espécie de medusa está entre os dois tipos de veneno que são uma
preocupação de segurança pública e da população na Austrália (GERSHWIN;
DAWES, 2008).
1.2.1 Phyllorhiza punctata
A Phyllorhiza punctata é uma água-viva, ou mãe-d’água, do filo Cnidária,
ordem Rhizostomeae e família Magistiidae (VON LENDENFELD, 1884; MORANDINI
et al., 2005; HADDAD; NOGUEIRA, 2006). Essa espécie é nativa da fauna marinha
do Oceano Indo-Pacífico (GRAHAM; PERRY; FELDER, 2001; SOUZA et al., 2007),
mas também pode ser encontrada em grande número ao longo da costa brasileira
(MORANDINI et al., 2005; HADDAD; NOGUEIRA, 2006; SOUZA et al., 2007).
A primeira descrição da Phyllorhiza punctata foi realizada por Port Jackson,
ao leste da Austrália com uma distribuição para o Indo-Pacífico (HADDAD;
NOGUEIRA, 2006; RIPPINGALE; KELLY, 1995). A última invasão massiva da P.
punctata descrita na literatura ocorreu no verão do ano 2000, através do nordeste do
Golfo do México, quando cerca de 10 milhões de medusas ocuparam a região do
Mississipi (Estados Unidos da América) e se propagaram para o leste da Flórida
(GRAHAM; PERRY; FELDER, 2001). Atualmente, a Phyllorhiza punctata pode ser
encontrada no Indo-Pacífico (Austrália, Filipinas, Japão), Atlântico norte (Golfo do
24
México), Atlântico sul (Brasil) e Mediterrâneo (costa de Israel) (MORANDINI et al.,
2005; SOUZA et al., 2007).
Em águas brasileiras, esta água-viva foi primeiro vista em meados de 1950
(HADDAD; NOGUEIRA, 2006). Mais recentemente, uma bem estabelecida
população de P. punctata foi encontrada no nordeste da Bahia (SILVEIRA;
CORNELIUS, 2000; MORANDINI et al., 2005), sendo também descrito na literatura
aparição dessa espécie, no ano de 2001, na costa sudeste (Canal de São
Sebastião, no estado de São Paulo) e sul (estados do Paraná e Santa Catarina) do
Brasil (Figura 1) (HADDAD; NOGUEIRA, 2006). Durante a primavera, altas
concentrações desta água-viva podem ser encontradas ao longo da costa brasileira
(SILVEIRA; CORNELIUS, 2000; HADDAD; NOGUEIRA, 2006). No Ceará, foi
observada a presença da P. punctata desde 2003, na cidade de Fortaleza
(HADDAD; NOGUEIRA, 2006).
A Phyllorhiza punctata (Figura 2) é uma grande água-viva, que pode alcançar
de 50 a 60 centímetros de diâmetro (VON LENDENFELD, 1884; HADDAD;
NOGUEIRA, 2006). A coloração marrom-amarelada, com algumas manchas brancas
distribuídas equilibradamente, é também uma característica marcante dessa espécie
(VON LENDENFELD, 1984; MORANDINI et al., 2005; HADDAD; NOGUEIRA, 2006).
A P. punctata, que apresenta o corpo em formato de sombrinha ou guarda-chuva
(umbrela), com uma superfície convexa (superior) e outra côncava (inferior), possuí
oito braços orais em forma de “J” (MORANDINI et al., 2005; HADDAD; NOGUEIRA,
2006). Estas estruturas tentaculiformes, localizadas ao redor da boca dessa águaviva, possuem, em suas terminações, grandes pacotes marrons de cnidócitos (VON
LENDENFELD, 1884; MORANDINI et al., 2005).
O ciclo de vida da P. punctata abrange duas fases distintas, o estágio séssil
de pólipo e o estado de livre-nadador da medusa (SOUZA et al., 2007). A medusa
adulta, que tipicamente flutua com a boca e os tentáculos virados para baixo, é
comumente referida como água-viva (VON LENDENFELD, 1884).
25
Figura 1 - Distribuição da Phyllorhiza Punctata ao longo da costa brasileira.
FONTE: HADDAD; NOGUEIRA, 2006
26
Figura 2 - Phyllorhiza punctata fotografada in situ por Leopoldo Gerhardinger.
FONTE: HADDAD; NOGUEIRA, 2006
27
A reprodução da P. punctata envolve uma estratégia reprodutiva denominada
alternância de gerações, cuja reprodução assexuada do estágio de pólipo é
alternada com a reprodução sexuada do estágio medusóide. O ciclo de reprodução
dos cifozoários, de uma forma geral, é determinado pelo estágio medusóide. Essa
espécie gelatinosa e natante apresenta alimentação composta por crustáceos
planctônicos, ovos de peixes e larvas (VON LENDENFELD, 1884).
1.2.2 Extrato de tentáculo da Phyllorhiza punctata
Espécies de venenos têm sido identificadas em vários filos do reino animal;
entre eles os Cnidários, Platelmintos, Ecnodermatas, Molusco, Anelídeos,
Artrópodes e Cordatos. Grande variedade de toxinas animais, como por exemplo de
serpentes, escorpiões, caracóis, aranhas, anêmonas-do-mar, entre outros, tem sido
isolada e extensivamente estudada no concernente as suas propriedades estruturais
e funcionais (MÉNEZ,1998). Comparações toxinológicas de outros cifozoários
medusóides (Cassiopea andromeda, Cassiopea xamachana e Aurelia aurita) são
relatadas na literatura (RADWAN et al., 2001). No entanto, pouco existe na literatura
sobre o veneno da água-viva da espécie Phyllorhiza punctata.
Resultados de eletroforese bidimensional realizados pelo professor Doutor
Marcos Hikari Toyama, da Universidade Estadual Paulista (UNESP), mostram a
presença de dois grupos predominantes de proteínas, um com uma massa
molecular ao redor de 15kDa e a outra ao redor de 35kDa (Figura 3). A análise da
eletroforese bidimensional mostra também a presença abundante de proteínas
ácidas.
1.3 Filo Artrópode e os escorpiões
O filo Artrópode é composto pela maior quantidade de espécies do Reino
Animal, compreendendo aproximadamente ¾ do total das espécies conhecidas. A
presença dos artrópodes pode ser verificada nos mais diversificados ambientes:
desde grandes altitudes até grandes profundidades nos oceanos. A característica
28
Figura 3 – Eletroforese bidimensional do extrato de tentáculo da P. punctata
FONTE: Cedida pelo professor Doutor Marcos Hikari Toyama (UNESP)
29
mais marcante dos artrópodes é a presença de um exoesqueleto quitinoso que
reveste todo o corpo do animal. Esta característica foi de extrema importância para o
sucesso ecológico deste grupo. Esse exoesqueleto é constituído por placas que se
articulam e propiciam movimentos no corpo e apêndices do animal. A presença de
pernas articuladas deu origem ao nome deste grupo, já que, etimologicamente, arthro
significa articulação e poda, pés. As classes Insecta, Crustacea, Arachnida,
Chilopoda e Diplopoda compõem o Filo Artrópode. Dessa forma, moscas, baratas,
siris, camarões, aranhas, carrapatos, escorpiões, entre outros, são exemplos de
animais pertencentes a esse filo (MINEO; FRANCO-ASSIS; DEL-CLARO; 2003).
A ordem Scorpiones é composta por 1.189 espécies conhecidas, distribuídas
em 13 famílias. Os escorpiões são animais vivíparos de hábitos noturnos.
Geralmente, vivem sob troncos e pedras, em solo úmido das matas ou em areia de
regiões secas, podendo adentrar residências humanas (MINEO; FRANCO-ASSIS;
DEL-CLARO; 2003; LOURENÇO, 2008).
Os escorpiões podem causar perigo para os seres humanos. Estes animais
possuem uma quilha longitudinal ao longo do corpo e um espinho sob o ferrão do
aguilhão. Algumas espécies de escorpião podem erguer suas caudas em posição de
ataque e inocular veneno pelo ferrão para capturar presas e/ou como mecanismo de
defesa (MINEO; FRANCO-ASSIS; DEL-CLARO, 2003; PLESSIS; ELGAR; PLESSIS,
2008).
As manifestações de envenenamento em seres humanos incluem dor local,
hipersalivação, vômitos, diarréias, sudorese, agitação psicomotora e diferentes
sintomas cardiorrespiratórios, como hipertensão, arritmias cardíacas e edema
pulmonar, podendo causar a morte (BORGES et al., 2000; ALVES et al., 2005;
BARÃO; BELLOT; DORCE, 2008; CÂNDIDO, 2008). Em seres humanos, esses
sinais e sintomas do envenenamento por escorpião se devem a presença de
proteínas de baixo peso molecular no veneno destes animais. As mais reativas
dessas proteínas são as α e β toxinas que são capazes de se ligarem aos domínios
extracelulares dos receptores nicotínicos, nos sitos três e quatro, respectivamente,
dos canais de sódio voltagem-dependente (CASTELE; CATTERALL, 2000).
30
Das treze famílias existentes de escorpião, somente a família Buthidae pode
provocar acidentes de maior gravidade (ANDRADE FILHO et al., 2001). Os
escorpiões de interesse da comunidade médica brasileira estão agrupados no gênero
Tityus e entre as mais importantes espécies deste grupo estão T. bahiensis, T.
stigmurus e a T. serrulatus (BARÃO; BELLOT; DORCE, 2008). Dentre elas, a
espécie Tityus serrulatus é uma das principais envolvidas nesse tipo de acidente
(ANDRADE FILHO et al., 2001). No Brasil, a espécie T. serrulatus é responsável por
muitos casos de envenenamento (CONCEIÇÃO et al., 2005; CÂNDIDO, 2008).
1.3.1 Tityus serrulatus
O escorpião brasileiro Tityus serrulatus (Figura 4), popularmente conhecido
como escorpião amarelo, pertence ao filo Artrópode, classe Arachnidea e ordem
Scorpionidae (ANDRADE FILHO et al., 2001). Este animal apresenta cor amarelo
claro, com manchas escuras sobre o tronco e possuí uma cauda que pode medir
sete centímetros de comprimento. A espécie recebe este nome devido à presença
de uma serrilha no quarto segmento do abdome (MINEO; FRANCO-ASSIS; DELCLARO; 2003).
O gênero Tityus, primitivamente, habita o cerrado e campos abertos, porém
tornou-se bem adaptado à vida em domicílios humanos (SOARES; AZEVEDO; DEMARIA, 2002). O escorpião T. serrulatus tornou-se uma das mais estudadas
espécies de escorpião tanto pela ampla distribuição em centros urbanos populosos
quanto pela alta toxicidade do seu veneno, o que caracteriza esta espécie como a
mais perigosa do Brasil (ALVES et al., 2005; BARÃO; BELLOT; DORCE, 2008).
O T. serrulatus é uma das espécies predominantes do sudeste do Brasil
(BARÃO; BELLOT; DORCE, 2008), principalmente nos estados de Minas Gerais,
Espírito Santo, Rio de Janeiro e São Paulo, estando presente em estados como
Bahia e Ceará (região nordeste), Goiânia e Distrito Federal (região centro-oeste) e
Paraná e Rio Grande do Sul (região sul) (INSTITUTO BUTANTAN, s/d). Esta
espécie se caracteriza também por reproduzir-se partenogeneticamente, ou seja, o
óvulo se desenvolve sem a necessidade de fecundação, sendo, conhecidas apenas
31
Figura 4 – Escorpião Tityus serrulatus
FONTE: INSTITUTO BUTANTAN, s/d
http://www.butantan.gov.br/materialdidatico/numero4/imagens/Tityus-serrulatus.jpg
32
os animais fêmeas (ANDRADE FILHO et al., 2001; MINEO; FRANCO-ASSIS; DELCLARO; 2003; LOURENÇO, 2008).
A vida média do escorpião T. serrulatus varia de três a cinco anos,
apresentando apenas uma ninhada por ano. A expansão desta espécie ocorre de
forma contínua devido ao transporte desses animais via estradas e ferrovias até se
estabelecerem em regiões habitadas pelos seres humanos (LOURENÇO, 2008).
Este escorpião, que possui hábitos noturnos, é capaz de sobreviver até dois anos
sem alimentação. Quando molestado, ele ataca com intensa ferroada sendo capaz
de matar crianças e pequenos animais. Mesmo para adultos, sua picada pode ser
fatal (INSTITUTO BUTANTAN, s/d).
1.3.2 Toxina do Tityus serrulatus
O veneno do escorpião Tityus serrulatus é formado por uma mistura complexa
de peptídeos tóxicos e não tóxicos, além de outros constituintes, como os
aminoácidos, nucleotídeos, serotonina, enzimas, entre outros (PLESSIS; ELGAR;
PLESSIS, 2008). Os sintomas e sinais observados no envenenamento desse
escorpião têm sido atribuídos a ativação dos canais de sódio através da liberação de
neurotransmissores nas terminações nervosas autonômicas. As picadas também
podem produzir lesões que podem induzir uma resposta inflamatória sistêmica com
consequente liberação de citocinas e também pode estimular a liberação de
catecolaminas, bradicininas e prostaglandinas (ALVES et al, 2005).
As neurotoxinas presentes no veneno de T. serrulatus podem alterar
especificamente a função de canais de sódio, potássio, cloreto e cálcio (PLESSIS;
ELGAR; PLESSIS, 2008). A consequente desordem desses canais gera a liberação
de muitos neurotransmissores no sistema nervoso central ou autonômico (PESSINI
et al., 2003; CONCEIÇÃO et al., 2005). Essas frações tóxicas do veneno podem ser
separadas através do processo de cromatografia líquida de filtração molecular e
troca iônica, obtendo-se duas frações principais: a Ts g (toxina gama) e a TsTx
(tityus toxina) (GOMES; DINIZ, 1996), sendo esta última composta por um pool de
33
diversos peptídeos (ARANTES et al., 1992). Essas toxinas isoladas podem ser
ordenadas em α e β toxinas (PLESSIS; ELGAR; PLESSIS, 2008).
As α-toxinas retardam a inativação dos canais de sódio e, portanto, induzem o
prolongamento da fase de despolarização do potencial de ação (CASTELE;
CATTERALL, 2000; CONCEIÇÃO et al., 2005). As β-toxinas, por sua vez, deixam o
potencial de membrana mais eletronegativo, através da inativação dos canais de
sódio voltagem-dependentes (CASTELE; CATTERALL, 2000). Um dos elementos
mais abundantes da toxina do escorpião T. serrulatus é uma β-toxina (CONCEIÇÃO
et al., 2005). A ação sobre os canais iônicos, mais especificamente sobre os canais
de sódio, leva a uma despolarização nervosa e a consequente ação do veneno de T.
serrulatus sobre os receptores pós-juncional (TEIXEIRA et al., 2003).
1.4 Canal deferente de camundongo
Os canais deferentes, constituintes do aparelho reprodutor masculino, são
tubos com inervação predominantemente simpática (STÄRNE, 1989; CONCEIÇÃO
et al., 2005), cuja função é contrair-se fortemente durante a ejaculação para expelir,
de modo unidirecional, o esperma através da uretra (Figura 5).
O canal deferente de roedores (cobaios, ratos e camundongos) é constituído
por três camadas de músculo liso: interna, externa e circular; esta localizada entre
as duas primeiras. Esse arranjo morfológico se desfaz em alguns pontos e é menor
nas regiões epididimais (BURNSTOCK, 1986).
Através da estimulação elétrica da inervação de preparações isoladas, a
neurotransmissão no canal deferente de roedores é estudada; por meio da aplicação
de estímulos em pulsos simples ou trens de estímulo (VENTURA, 1998). As
contrações musculares são mensuradas pela liberação de noradrenalina (NA) e
adenosina 5’-trifosfato (ATP), agindo como cotransmissores (WITT; KRAMER;
BURKS, 1991; CONCEIÇÃO et al., 2005).
34
Figura 5 – Representação esquemática do sistema urogenital de camundongo macho
FONTE: NATIONAL INSTITUTE OF ALLERGY AND INFECTIOUS DISEASES.
Disponível
em
http://www3.niaid.nih.gov/labs/aboutlabs/cmb/InfectiousDisease
Pathogenesis Section/mouseNecropsy/step5Urogenital.htm
35
1.4.1 Inervação do canal deferente
Os canais deferentes são possuidores de densa inervação simpática. A
camada longitudinal muscular do canal deferente de camundongo (mouse vas
deferens – MVD) é inervada por nervos simpáticos pós-ganglionares (SJÖSTRAND,
1965), cujos corpos estão situados nos gânglios pélvicos, que, por sua vez, recebem
aferências
derivadas
dos
nervos
pré-ganglionares
hipogástricos
(BROCK;
CUNNANE, 1992).
As fibras varicosas terminais se subdividem repetidamente e compõem um
denso plexo tridimensional (SJÖSTRAND, 1965). Cerca de dois milhões de
varicosidade por milímetro cúbico, cujo tamanho e distância entre elas são de
aproximadamente 1µm e 4 a 5µm, respectivamente (BENNETT; LAVIDIS, 1993;
BENNET, 1997), formam esse plexo ao redor de todas as células musculares. Cada
célula muscular, em MVD, apresenta de 1 a 5 varicosidades juncionais (separação
neuromuscular
<
20nm)
e
80
varicosidades
não-juncionais
(separação
neuromuscular > 100nm) (MERRILLEES, 1968; BENNET, 1972; BENNET;
BARDEN, 2001). As unidades funcionais, no entanto, são grupos formados por 15
células musculares eletricamente acopladas, que são inervadas por 15 a 75
varicosidades
juncionais
e
1.200
varicosidade
não-juncionais
(FURNESS;
IWAYAMA, 1972).
Cada impulso nervoso de baixa freqüência alastra-se por todas as regiões
dos terminais, liberando um quanta de neurotransmissor em aproximadamente 1%
das varicosidades (CUNNANE; STJÄRNE, 1984).
1.4.2 Estudos in vitro com transmissão neuromuscular simpática
O canal deferente de roedor é considerado uma preparação clássica para
elucidar a transmissão neuromuscular autonômica. Esta preparação tem sido
utilizada em estudos que visam à estrutura da junção formada entre varicosidades
nervosas simpáticas e o músculo liso (RICHARDSON, 1958), assim como na
36
identificação de zonas ativas nessas varicosidades terminais (BRAIN; COTTEE;
BENNETT, 1997).
Estudos estruturais e funcionais têm contribuído muito no esclarecimento do
mecanismo
de
transmissão
neuromuscular
autonômica.
A
liberação
do
neurotransmissor das terminações nervosas autonômicas, seguida da estimulação
nervosa, tem sido estudada pela mensuração da contração muscular (STJÄRNE;
ÄSTRAND, 1984; AMOBI; SUGDEN; SMITH, 1999), do fluxo de transmissores e
seus metabólitos (TODOROV et al., 1999), do registro intracelular ou extracelular de
potenciais/correntes
juncionais
(BURNSTOCK;
HOLMAN,
1961;
BROCK;
CUNNANE, 1987, 1988; LAVIDIS; BENNET, 1992) e medições de íons cálcio nas
varicosidades (BRAIN; COTTEE; BENNET, 1997; BRAIN et al., 2002) e no músculo
(BRAIN et al., 2002; BRAIN et al., 2003). Todavia, há discrepâncias entre valores
mensurados que podem ocorrer devido ao uso de diferentes metodologias.
1.4.2.1 Registros mecânicos da contração muscular
A resposta da musculatura lisa à liberação do neurotransmissor pode ser
registrada
pela
mensuração
das
contrações
neurogênicas.
Essa
resposta
neurogênica é bifásica e consiste em uma inicial e rápida contração muscular
(componente rápido), mediada por ATP, e uma seguida contração mantida
(componente lento), mediada por NA (KÜGELGEN; STARKE, 1991; SNEDDON;
WESTFALL; KENNEDY, 1996; CONCEIÇÃO et al., 2005).
Os
componentes
farmacologicamente
isolados
“purinérgicos”
e
“noradrenérgicos” da contração muscular induzida por estimulação nervosa são, por
vezes, utilizadas para acessar a liberação de ATP e NA (WITT; KRAMER; BURKS,
1991).
A existência de diversos tipos e subtipos de receptores purinérgicos
(BARDEN; COTTEE; BENNETT, 1999) e adrenérgicos (AMOBI; SUGDEN; SMITH,
1999; DOCHERTY, 1998) na junção neuromuscular é uma dessas variáveis. A
ativação de diferentes receptores pelo mesmo neurotransmissor ocasiona diversos
37
efeitos, em qualidade e intensidade, de origem pré e/ou pós-sináptica, na contração
muscular mensurada. Outra variável são os diferentes valores de freqüência do
estímulo elétrico utilizado que conduzem a diferentes cinéticas para os
neurotransmissores
envolvidos,
pois
as
quantidades
e
proporções
dos
neurotransmissores liberados nas varicosidades estão relacionadas aos parâmetros
elétricos utilizados (TODOROV et al., 1999). Além disso, as diferentes vidas médias
dos neurotransmissores e, consequentemente, seus tempos de ativação dos
receptores
são
determinados
pelos
diversos
tipos
de
metabolização
dos
neurotransmissores (STJÄRNE et al., 1994; STJÄRNE; STJÄRNE, 1995).
1.4.3 Contração neurogênica em canal deferente de roedor
1.4.3.1 Cotransmissão de NA e ATP
Hermann Blaschko, nos anos 50, foi um dos primeiros pesquisadores a propor
a co-estocagem de ATP e catecolaminas nas células cromafins da medula adrenal
(BLASCHKO et al., 1956). A partir destas células, a co-liberação de ATP e NA foi
demonstrada nessa mesma década (CARLSSON; HILLARD; HOKFELT, 1957).
Burnstock, inspirado nos trabalhos de Blaschko e de outros autores da época,
propôs a existência de nervos não-adrenérgicos não-colinérgicos no intestino
(BURNSTOCK et al., 1970). Resultados mais evidentes foram obtidos no trabalho de
Burnstock, Che Su e John Bevan que estimularam eletricamente os nervos
simpáticos periarteriais entéricos de cobaios pré-incubados com [3H]adenosina e
observaram a liberação de trítio e NA, e a possibilidade de bloqueio por guanetidina
(SU; BEVAN; BURNSTOCK, 1971). Desde então, originou-se o termo “nervos
purinérgicos” (BURNSTOCK, 1972).
A teoria predominante até então era a de que cada nervo liberava apenas um
neurotransmissor. Burnstock (1976) introduziu, então, a hipótese da cotransmissão
que incluía a sugestão de que NA e ATP podiam ser cotransmissores em nervos
simpáticos. As evidências mais consistentes para a cotransmissão simpática foram
38
obtidas através de estudos com canal deferente; inicialmente realizadas por Westfall
e colaboradores (1978).
No início da década de 60, Burnstock e Holman (1961, 1966) realizaram os
primeiros registros de potenciais juncionais excitatórios (EJPs) em canal deferente
de cobaio. Nessa época, tendo em vista a ampla inervação simpática desse tecido e,
devido ao fato que esses potenciais podiam ser abolidos por agentes bloqueadores
neuronais, como butílio e guanetidina, acreditava-se que a noradrenalina fosse o
mediador responsável pelos EJPs (BURNSTOCK; HOLMAN, 1966). Todavia, com o
estabelecimento do ATP como neurotransmissor, nas décadas de 80 e 90, e com a
ampla aceitação de que os nervos poderiam liberar vários neurotransmissores, o
canal deferente ressurge como um bom exemplo para essas idéias. Os estudos com
EJPs nesse tecido ganharam novas evidências e interpretações.
Estudos com EJPs de canal deferente e de tecidos arteriais obtiveram alguns
resultados que foram marcantes no estabelecimento definitivo do ATP na
cotransmissão simpática. Um desses resultados foi que os EJPs eram resistentes a
agonistas α-adrenérgicos (por exemplo, fentolamina e prazosina) ou persistiam em
animais tratados com reserpina, que eliminava aproximadamente 99% dos estoques
de NA nos nervos (SNEDDON; WESTFALL; FEDAN, 1982; SNEDDON; WESTFALL,
1984).
Outro resultado importante foi que os EJPs podiam ser abolidos por
antagonistas P2x-purinérgicos (por exemplo, arilazido-aminopropionil-ATP) (FEDAN
et al., 1981; SNEDDON; WESTFALL; FEDAN, 1982) ou após dessensibilização dos
receptores P2-purinérgicos com a,β-metileno ATP (KASAKOV; BURNSTOCK, 1982;
MELDRUM; BURNSTOCK, 1983; SNEDDON; BURNSTOCK, 1984; STJÄRNE;
ÄSTRAND, 1984). O fato de o ATP de origem exógena produzir EJPs semelhante
aos de origem neuronal, enquanto que a NA exógena não produzia, também foi um
achado importante (SNEDDON; WESTFALL, 1984). Dessa forma, os componentes
purinérgicos e adrenérgicos da cotransmissão simpática em canal deferente de
roedores, responsáveis pelos acoplamentos eletromecânico e farmacomecânico,
respectivamente, são amplamente aceitos (WITT; KRAMER; BURKS, 1991; AMOBI;
39
SUGDEN; SMITH, 1999; BRAIN et al., 2002; BURNSTOCK, 2004; CONCEIÇÃO et
al., 2005).
1.4.3.2 Contração bifásica e cinética dos neurotransmissores
A contração neurogênica em canal deferente de roedor é mediada,
principalmente, por NA e ATP (VENTURA, 1998; CONCEIÇÃO et al., 2005). Os
efeitos pós-sinápticos de ATP são mediados via receptores ionotrópicos P2xpurinoceptores, e os efeitos de NA são mediados por receptores metabotrópicos α1adrenérgicos, acoplados a proteína G (BURNSTOCK, 1990).
A contração muscular, resposta mecânica ao estímulo elétrico, como afirmado
anteriormente, é bifásica (VENTURA, 1998; CONCEIÇÃO et al., 2005). A primeira
fase da contração é rápida e mediada primariamente por ATP, enquanto a segunda
fase é lenta e mediada por NA (TODOROV et al., 1999; CONCEIÇÃO et al., 2005).
Os mecanismos de clearence dos neurotransmissores (ATP e NA) são diferentes. O
ATP é inativado por uma ATP-ase (KENNEDY et al., 1996) e sua vida média na
varicosidade, junto aos receptores P2x-purinérgicos, é de 50 a 100 milissegundos
(CUNNANE; MANCHANDA, 1988). O componente NA, por sua vez, é relativamente
mais estável ao metabolismo no meio extracelular, sendo eliminado por captação
neuronal ou extraneuronal e por difusão (STÄRNE, 1989). A vida média da NA é
estimada em 1500 a 5000 milissegundos (GONON; MSGHINA; STJÄRNE, 1993).
Há algum tempo, era amplamente aceito que ambos os neurotransmissores,
ATP e NA, seriam estocados nas mesmas vesículas sinápticas, liberados e
apresentados aos receptores simultaneamente e em proporções constantes
(STJÄRNE et al., 1994; TODOROV et al., 1996). Todavia, em canais deferentes, e
em outros nervos simpáticos, ATP e NA podem ser estocados em vesículas
sinápticas separadas e podem ser liberados via mecanismos distintos (BROCK;
CUNNANE, 1999; TODOROV et al., 1996; STJÄRNE, 2001). Stjärne (2001) sugere
a existência de duas classes de vesículas pequenas que contém diferentes quanta
de neurotransmissores e que os receptores em suas membranas possuem
diferentes afinidades por cálcio.
40
1.5 Corpo cavernoso de camundongo
O pênis, outro componente do aparelho reprodutor masculino, é constituindo,
entre outros, por dois corpos cavernosos paralelos que oferecem estrutura para o
esse órgão e, ainda, agem como reservatório de sangue no estado erétil (Figura 6).
Esses corpos cavernosos são envoltos em uma camada fibrosa, denominada túnica
albugínea (MURAKAMI, 1987; ANDERSSON; WAGNER, 1995). No estado flácido,
as trabéculas do músculo liso dos corpos cavernosos estão contraídas, permitindo
apenas pequeno fluxo arterial. Todavia, a liberação de neurotransmissores, em
resposta a estimulação sexual, gera o relaxamento do músculo liso do corpo
cavernoso, aumento do fluxo sangüíneo para estes tecidos, e consequente ereção
peniana (BURNETT et al., 1992; HEDLUND et al., 2000).
A ereção peniana é, portanto, um evento hemodinâmico que ocorre em
resposta à liberação de óxido nítrico (NO) dos nervos parassimpáticos nãoadrenérgicos e não-colinérgicos e do endotélio vascular (ANDERSSON; WAGNER,
1995). Durante a ereção, principalmente através da estimulação parassimpática, o
músculo liso do corpo cavernoso relaxa, por meio dos neurotransmissores NO e, em
seguida, guanosina monofosfato cíclica (GMPc). Após a ejaculação ou cessação do
estímulo, a dominância parassimpática decai e a descarga simpática gera contração
do músculo liso, através da liberação do neurotransmissor NA, gerando a fase de
detumescência peniana (LUE, 2002; WERNER et al., 2005).
1.5.1 Inervação do corpo cavernoso
A inervação autonômica do sistema reprodutor masculino é caracterizada pela
presença de fibras parassimpáticas e simpáticas (LUE, 2001).
A inervação autonômica parassimpática localiza-se na medula sacral e é
responsável pela liberação do NO nas terminações nervosas no corpo cavernoso.
Estes neurotransmissores irão provocar relaxamento da musculatura lisa cavernosa,
vasodilatação arteriolar e ereção peniana (LUE, 2001; WERNER et al., 2005).
41
Figura 6 – Pênis de camundongo
FONTE: MIZUSAWA et al., 2001
42
Em camundongos, a enzima produtora de NO, a NO-sintetase (NOS),
localiza-se no nervo peniano dorsal e seus ramos estendem-se para o pênis do
camundongo (BURNETT et al., 1992). Após a liberação, NO ativa a guanilil ciclase
solúvel nas células musculares lisas adjacentes, resultando em um aumento da
produção de GMP cíclico, que, por sua vez, transmite sinais que modificam canais
iônicos, fosfodiesterases e proteínas quinases (LINCOLN; CORNWELL, 1993).
Na década de 80, as ações biológicas do óxido nítrico foram descobertas.
Sugeriu-se, então, que este poderia ser o mediador inibitório liberado a partir dos
nervos não-adrenérgicos e não-colinérgicos. Essa descoberta já é amplamente
aceita e a transmissão mediada por NO pelos nervos não-adrenérgicos e nãocolinérgicos é conhecida como transmissão nitrérgica. (CELLEK; MONCADA, 1997;
MONCADA; HIGGS; FURCHGOTT, 1997). O termo “nitrérgico” é aplicado, então,
aos nervos cuja transmissão é dependente da liberação de NO ou aos mecanismos
de transmissão que são trazidas pelo NO (MONCADA; HIGGS; FURCHGOTT,
1997).
A inervação autonômica simpática, por sua vez, tem origem na décima
primeira vértebra torácica estendendo-se até a segunda vértebra lombar. Essas
fibras, que se unem no plexo hipogástrico, liberam a NA como neurotransmissor e
são responsáveis pela detumescência peniana (LUE, 2001).
1.6 Músculo diafragma de camundongo
O diafragma é um músculo estriado esquelético em forma de cúpula (Figura 7). Este
músculo, que separa as cavidades torácica e abdominal, apresenta contrações
contínuas e rítmicas devido aos padrões de atividade motora associada à
respiração, tornando essa musculatura uma das mais ativas do corpo humano
(BERNE; LEVY, 2000; ROWLEY; MANTILLA; SIECK, 2005).
Como
outros
músculos
esqueléticos,
o
diafragma
desenvolve
força
dependente de seu comprimento inicial e da força que se opõe ao encurtamento,
43
1. Glândulas Salivares
2. Caixa torácica
3. Músculo Diafragma
4. Fígado
5. Intestinos
6. Glândula Bulbouretral
7. Testículo com Epidídimo
Figura 7 – Representação esquemática da cavidade abdominal de camundongo macho
FONTE: NATIONAL INSTITUTE OF ALLERGY AND INFECTIOUS DISEASES.
Disponível
em
http://www3.niaid.nih.gov/labs/aboutlabs/cmb/InfectiousDisease
PathogenesisSection/mouseNecropsy/step4Abdominal.htm
44
que variam com a postura e com os esforços necessários exigidos pela expansão da
parede torácica e pela resistência ao fluxo de ar, respectivamente. O fornecimento
de sangue ao diafragma ocorre através dos ramos das artérias intercostais e as
veias drenam para veia cava inferior (BERNE; LEVY, 2000).
1.6.1 Inervação do músculo diafragma
O plexo cervical é constituído pelos ramos ventrais dos quatro nervos
cervicais superiores e inerva alguns músculos do pescoço, o diafragma e áreas da
pele na cabeça, pescoço e tórax. Os nervos cervicais emergem da coluna e cada
nervo se reúne a um ramo comunicante cinzento do tronco simpático, através do
qual recebe fibras vasomotoras. Esse plexo é constituído em duas partes principais:
superficial e profunda. A parte superficial é constituída por fibras essencialmente
sensitivas, que inervam o músculo esternocleidomastóideo, a pele na região
circunvizinha, o pavilhão da orelha, a pele do pescoço e a região próxima à
clavícula. A parte profunda do plexo, por sua vez, é constituída por fibras motoras,
destinando-se à musculatura ântero-lateral do pescoço e ao diafragma. Para isso,
encontram-se duas formações importantes que são a alça cervical e o nervo frênico
(KINGSLEY, 2001).
O diafragma, portanto, é inervado pelos nervos frênico direito e esquerdo,
que, por sua vez, são formados por fibras motoras que se originam nos terceiro a
quinto segmentos cervicais da medula espinhal e descendem lateralmente no
mediastino para as folhas direita e esquerda do diafragma (BERNE; LEVY, 2000).
1.6.1.1 Junção neuromuscular frênico-diafragma
O ponto de comunicação entre o nervo e músculo, denominado junção
neuromuscular, tem a função de traduzir um impulso elétrico, potenciais de ação
resultantes da ação dos canais iônicos regulados por voltagem, em outro impulso
químico, potenciais pós-sinápticos resultantes da fixação de ligantes químicos a
receptores específicos, e, em seguida, em um novo estímulo elétrico, propagação do
45
potencial, que desencadeia a contração muscular (KINGSLEY, 2001). Os canais de
sódio e potássio são os principais responsáveis pela condução do potencial de ação,
portanto, a amplitude e duração do potencial de ação nos nervos terminais são
controladas por esses canais (BOONYAPISIT; KAMINSKY; RUFF, 1999).
A junção neuromuscular (Figura 8) é uma estrutura complexa composta pelo
nervo
motor
terminal,
superfície
pós-sináptica
do
músculo,
lâmina
basal
especializada e células de Schwann associadas (BOONYAPISIT et al., 1999). O
nervo motor terminal possui botões sinápticos que contém grande número de
vesículas sinápticas. Acetilcolina (ACh) é armazenada nessas vesículas, que ficam
alinhadas próximas aos sítios de liberação no nervo terminal. O primeiro passo para
a geração de potencial de placa motora no músculo é a fusão de vesículas
sinápticas com a membrana do nervo terminal , causando à liberação de ACh. Com
a condução do potencial de ação ao longo do axônio do neurônio motor, influxo de
cálcio (Ca2+) através de canais de cálcio voltagem-dependente no nervo terminal
inicia a fusão das vesículas sinápticas. Essas vesículas, então, se fundem à
membrana plasmática para libertar os seus conteúdos na direção da membrana
muscular pós-sináptica (BOONYAPISIT; KAMINSKY; RUFF, 1999; KINGSLEY,
2001).
Cada vesícula sináptica libera cerca de 10.000 moléculas de ACh para a
fenda sináptica, espaço entre o botão sináptico e a célula pós-sináptica. ATP
também é liberado por vesículas sinápticas e pode agir modulando a sensibilidade
do transmissor. A difusão de ACh na fenda sináptica é muito rápido devido à
pequena distância a ser percorrida e a relativamente alta difusão constante da
acetilcolina (BOONYAPISIT; KAMINSKY; RUFF, 1999; BERNE; LEVY, 2000;
KINGSLEY, 2001).
Após difusão da ACh pela fenda sináptica, há a consequente ligação desse
neurotransmissor com as proteínas receptoras específicas, denominadas receptores
nicotínicos, localizadas na superfície externa da membrana plasmática da célula
muscular (HILLE, 1992; BOONYAPISIT; KAMINSKY; RUFF, 1999). A concentração
de receptores de ACh na placa terminal é de cerca de 15.000 a 20.000
receptores/mm2. Fora da região da placa motora essa concentração é 1.000 vezes
46
Figura 8 – Diagrama da junção neuromuscular
FONTE: MARIEB; HOEHN, 2008
47
menor (BOONYAPISIT; KAMINSKY; RUFF, 1999). Essas proteínas apresentam uma
distribuição topográfica na membrana pós-sináptica, agindo como um canal operado
por ligante, ou seja, operado pelo neurotransmissor (HILLE, 1992).
A ligação do neurotransmissor ao receptor aumenta a condutância dessa
membrana pós-juncional ao sódio (Na+) e ao potássio (K+), permitindo o influxo de
Na+ a favor do seu gradiente eletroquímico e efluxo de íons K+. O influxo de íons Na+
será maior que o efluxo de íons K+ porque o gradiente eletroquímico do Na+ é maior
do que para o K+. Como resultado desses eventos, ocorre a despolarização
transitória da membrana pós-sináptica (HILLE, 1992; BOONYAPISIT; KAMINSKY;
RUFF, 1999; BERNE; LEVY, 2000).
Com a despolarização da placa motora, as regiões da membrana da célula
muscular adjacentes a junção neuromuscular, consequentemente, se despolarizam
por condutância eletrotônica. À medida que essas regiões atingem seus limiares são
gerados potenciais de ação que se propagam pela célula muscular. Esses potenciais
se propagarão com grande velocidade, tanto longitudinalmente quanto radialmente,
por toda a fibra muscular, desencadeando a sequencia de eventos que gera a
contração muscular (HILLE, 1992; BOONYAPISIT; KAMINSKY; RUFF, 1999;
BERNE; LEVY, 2000).
A enzima acetilcolinesterase (AChE) termina a ação da ACh na célula
muscular e impede os receptores de acetilcolina de serem repetidamente ativados.
AChE remove esse neurotransmissor da fenda sináptica por hidrólise. ACh também
pode ser removida por difusão (BOONYAPISIT; KAMINSKY; RUFF, 1999; BERNE;
LEVY, 2000; KINGSLEY, 2001).
Com a propagação do potencial de ação pela célula muscular, a onda de
despolarização, que percorre o sarcolema, atinge as regiões mais internas da célula
muscular por conta do sistema tubular transverso (túbulo T). Esse sistema é
constituído pelas invaginações do sarcolema das fibras musculares esqueléticas que
se projetam perpendicularmente ao eixo longitudinal da fibra (MOSS; HOFMANN,
1992; BERNE; LEVY, 2000).
48
Existem proteínas localizadas na membrana do sistema tubular transverso
que são sensíveis à variação do potencial transmembrana. Essas proteínas são
denominadas receptores diidropiridínicos (RDHP) porque drogas do grupo das
diidropiridinas se ligam especificamente a elas. Esses RDHP agem também como
canais lentos de cálcio (canais do tipo L) (RIOS; BRUM, 1987) e estão intimamente
associados às proteínas localizadas na membrana da cisterna terminal do retículo
sarcoplasmático, denominadas receptores rianodínicos (RyR). Estas proteínas,
assim denominadas devido à grande afinidade do alcalóide rianodina por elas,
funcionam como canais libertadores de Ca2+ do reticulo sarcoplasmático para o
sarcoplasma (FRANZINI-ARMSTRONG; PROTASI, 1997; RANGE; DALE; RITTER,
2001; FIIL; COPELLO, 2002).
Ao percorrer o sarcolema e alcançar o sistema tubular transverso, a onda de
despolarização gera modificações na conformação dos RDHP. Essas modificações,
por
sua
vez,
alteram
a
condutância
dos
receptores
rianodínicos
que,
consequentemente, promovem a liberação de Ca2+ das cisternas terminais do
retículo sarcoplasmático da fibra muscular (DULHUNTY et al., 2002).
Após o mecanismo de acoplamento excitação-contração supracitado (Figura
9), o Ca2+ se liga aos sítios de baixa afinidade da molécula de troponina C
(constituinte dos filamentos finos da miofibrila da célula muscular) promovendo
mudanças conformacionais de sua estrutura. Essas mudanças provocam a alteração
de posição do complexo troponina-tropomiosina, permitindo as interações entre a
cadeia pesada da miosina (constituinte dos filamentos grossos) com os filamentos
finos de actina, através das pontes cruzadas. Essa interação resulta na produção de
força e/ou encurtamento dos sarcômeros (unidade básica contrátil da célula
muscular estriada) (RÜEGG, 1988; BERNE; LEVY, 2000).
O relaxamento muscular, por sua vez, ocorre quando a liberação de Ca2+ é
interrompida pela repolarização da membrana do túbulo T e/ou quando esses íons
são recaptados para o retículo sarcoplasmático, através da Ca2+-ATPase (bomba de
cálcio), onde permanece,
em sua maior
parte,
ligado a calsequestrina, uma
49
Figura 9 – Mecanismo de acoplamento excitação-contração
FONTE: MARIEB; HOEHN, 2008
50
glicoprotéina que se liga fracamente a esses íons e participa da estocagem dos
mesmos (FRANZINI-ARMSTRONG; JORGENSEN, 1994; BERNE; LEVY, 2000;
RANGE; DALE; RITTER, 2001)
51
2. JUSTIFICATIVA
As toxinas animais vêm apresentando importante papel nos estudos
fármacos-fisiológicos devido à alta afinidade e especificidade de interação dessas
com importantes receptores ou sistemas dos mamíferos.
Os estudos dessas toxinas isoladas em preparações neuromusculares in vitro
tornam-se ferramentas de investigação de valor incalculável que podem exercer
importante função na elucidação de mecanismo de ação das mesmas (HODGSON;
WICKRAMARATNA, 2002).
A água-viva Phyllorhiza punctata, apesar de ser uma espécie presente no
litoral brasileiro, inclusive em Fortaleza, não é alvo de muitas investigações. Embora
haja relatos na literatura de estudos quanto à descrição desta espécie (VON
LENDENFELD, 1984), sua ocorrência em águas brasileiras (MORANDINI et al.,
2005; HADDAD; NOGUEIRA, 2006) e sua composição lipídica (SOUZA et al., 2007);
nenhum relato há sobre os mecanismos de ação das toxinas. Por tanto, o estudo
apresentado trata-se de uma investigação pioneira com essa espécie de água-viva.
O estudo de venenos de escorpião, por sua vez, têm se intensificado nos
últimos anos (GONÇALVES et al., 2003; MINEO; FRANCO-ASSIS; DEL-CLARO;
2003; ALVES et al., 2005; CECCHINI et al., 2006; PESSINI et al., 2006; MENDES et
al., 2008; SEVERINO et al., 2009) e tem adquirido importância médico-sanitária, não
só pela incidência, mas também pela potencialidade do veneno de algumas
espécies em determinar quadros clínicos graves, às vezes fatais, principalmente em
crianças (BÜCHERL, 1968).
O escorpião Tityus serrulatus é, atualmente, uma das mais estudadas
espécies de escorpião. Isso ocorre devido ao fato da ampla distribuição dessa
espécie em centros urbanos e pela alta toxicidade do seu veneno (ALVES et al.,
2005; BARÃO; BELLOT; DORCE, 2008), o que torna mais relevante esses estudos
e evidencia a importância do retorno dos achados científicos à população de uma
forma geral.
52
Apesar do advento de novas tecnologias, as preparações clássicas de tecido
isolado, como o canal deferente de camundongo, o corpo cavernoso de
camundongo,
preparação
frênico-diafragma
e
biventer-cervicis
ainda
são
amplamente utilizadas em pesquisas, com a vantagem de fornecer dados sobre a
seletividade (LAZARUS et al., 1999) e de serem considerados modelos simples e
acessíveis. A preparação de nervo frênico-diafragma, por exemplo, tem sido
tradicionalmente utilizada na determinação das ações de drogas e toxinas na junção
neuromuscular (KERR, 2002) porque, dentre outras características, essa preparação
é um sistema relativamente simples que consiste de aproximadamente 220
motoneurônios e um músculo. Em contraste, quando se compara a estrutura da
pata, por exemplo, tem-se um conjunto de cerca de 20.000 motoneurônios que
inervam aproximadamente 40 músculos (GREER et al., 1999). Essa preparação, por
tanto, apresenta característica que a tornam particularmente propícia e valiosa.
Portanto, o estudo da neurotoxicidade dessas toxinas animais nesses
modelos farmacológicos clássicos são bastante úteis para a investigação da
dinâmica dessas toxinas, podendo auxiliar na descoberta dos mecanismos de ação
das mesmas, fornecendo uma observação adicional na ação destas e no tratamento
de pacientes envenenados, e, ainda, na descoberta de ferramentas importantes para
se descobrir e estudar receptores, investigar vias fisiológicas, descobrir moléculas
com uso terapêutico potencial ou, ainda, para produção de novos medicamentos.
53
3. OBJETIVOS
3.1 Geral
Este trabalho tem como objetivo investigar os efeitos de um extrato protéico
de tentáculo da água-viva Phyllorhiza punctata e de toxinas do escorpião Tityus
serrulatus, em preparações neuromusculares para fornecer uma caracterização
farmacológica dessas toxinas.
3.2 Específicos do extrato de Phyllorhiza punctata
•
Estabelecer a dose efetiva média do extrato de tentáculo da P. punctata,
através da curva dose-resposta e da EC50 em canal deferente de camundongo
(MVD);
• averiguar se os efeitos do extrato de P. punctata são mediados por fibras
noradrenérgicas ou por ação pós-juncional em MVD;
• investigar o envolvimento de receptores α-adrenérgicos pós-juncionais no
mecanismo de contração neurogênica em MVD, induzidos pelo extrato da P.
punctata;
• verificar a participação dos canais de sódio neuronais nos efeitos deste
extrato em MVD;
• avaliar o efeito do extrato de tentáculo da P. punctata na fibra nitrérgica em
corpo cavernoso de camundongo;
• investigar a participação do óxido nítrico no efeito do extrato de P. punctata
em corpo cavernoso de camundongo;
• averiguar a participação dos canais de sódio neuronais nos efeitos do
extrato de P. punctata na transmissão nitrérgica;
54
• avaliar o efeito deste extrato na transmissão neuromuscular esquelética;
• avaliar qualitativamente os efeitos do extrato de tentáculo de P. Punctata
como um bloqueador da transmissão neuromuscular esquelética;
3.3 Específicos da toxina de Tityus serrulatus
• comparar o perfil toxicodinâmico das toxinas modificadas (com cumarina e
morina) com a toxina nativa em MVD,
• investigar o efeito de morina e de uma nova cumarina sintética (7-hidroxi-2oxo-2H-cromeno-3-ácido
carboxílico)
sobre
a
atividade
neurotóxica
autonômica da toxina gama do veneno de Tityus serrulatus;
• analisar os efeitos neurotóxicos das toxinas modificadas (com cumarina e
morina) no ensaio de músculo biventer-cervicis.
55
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Animais experimentais
Foram utilizados camundongos Swiss albinos (mus musculus), pesando entre
30 e 40g, mantidos com água e alimentação ad libitum, oriundos do biotério do
Instituto Superior de Ciências Biomédicas (ISCB) da Universidade Estadual do
Ceará (UECE).
Também foram utilizados pintos Gallus gallus domesticus da raça Isa brown
label, de 8 a 10 dias de nascimento, mantidos com água e alimentação a vontade.
4.2 Drogas e reagentes
Fentolamina (FEN), morfina, noradrenalina (NA) foram advindos do
Sigma/Aldrich Chemical Company (St. Louis, MO, EUA). Guanetidina (GUA) foi
oriunda do Fischer (New Jersey, NJ, USA), assim como, lidocaína (LID), fenilefrina
(PHE) e L-NAME. A Morina foi obtida a partir da Sigma Co., Ltda. (EUA) e a
cumarina
(7-hidroxi-2-oxo-2H-cromeno-3-carboxílico),
foi
sintetizada
no
Departamento de Química da Universidade Federal de São Carlos, de acordo com o
descrito por Alvin Jr e colaboradores (2005). Solventes, produtos químicos e outros
reagentes utilizados para a purificação, modificação e caracterização das proteínas
utilizados na cromatografia líquida de alta perfomance (HPLC) foram adquiridos da
Sigma-Aldrich químicos (EUA), Merk (EUA) e Bio-Rad (EUA). Trifosfato de
adenosina (ATP), fentolamina (FEN), e carbamilcolina também foram adquiridos da
Sigma/Aldrich Chemical Company (St. Louis, MO, EUA).
4.3 Preparo do extrato de Phyllorhiza punctata
O extrato de tentáculo da água-viva Phyllorhiza punctata foi gentilmente
cedido pelo Professor Doutor Marcos Hikari Toyama, do Campus do Litoral Paulista
da Universidade Estadual Paulista (UNESP).
56
A Phyllorhiza punctata foi coletada durante períodos de maré baixa, através
de mergulho livre, na costa rochosa do Canal de São Vicente no sul de São Paulo
(Brasil). Os tentáculos dos animais foram removidos do corpo, utilizando-se uma
pinça e foram, então, estressados para liberação do nematocisto que, por sua vez,
foi imediatamente, imerso em uma solução aquosa de gelo de 0,1%TFA.
Em seguida, a substância urticante foi submetida a três ciclos de
congelamento e descongelamento. Após o último ciclo, a solução foi centrifugada
em 20.000xg por 30 minutos. O sobrenadante foi recuperado através de um filtro de
0,45 µm, seguido por uma segunda ultrafiltração, por meio de um filtro de 0,22 µm,
centrifugado em 4.500 xg por 10 minutos, e, finalmente, aplicado em uma coluna
preparativa de C5 Biodiscovery Supelco (Sigma Aldrich) para dessalinizar a amostra
e executar a limpeza final.
Finalmente, o extrato total obtido neste procedimento, nomeado de PHY-N, foi
concentrado por liofilização e armazenado a -20oC.
4.4 Isolamento da toxina gama (Ts g) e incubação com morina e cumarina
O veneno do escorpião Tityus serrulatus foi gentilmente doada pelo Instituto
Butantan (São Paulo, Brasil). A toxina gama (Ts g) foi isolada como descrito por
Marangoni e colaboradores (1995) e por Polikarpov e colaboradores (1999),
utilizando a cromatografia de troca iônica (SP5PW, 0,78 x 8cm) HPLC de fase
reversa. A homogeneidade da Ts g foi confirmada por eletroforese em gel de
poliacrilamida-SDS (dodecil sulfato de sódio) e por espectrômetro de massa MALDTOF.
A incubação de Ts g com morina (M) e com cumarina (7-hidroxi-2-oxo-2Hcromeno-3-carboxílico, C), seguiu os procedimentos descritos por Iglesias e
colaboradores (2005). Morina e cumarina foram dissolvidas em dimetilsulfóxido
(DMSO). A concentração durante a incubação nunca excedeu 1%. 10µL da solução
de morina ou cumarina (100nM) foram adicionados a 1000µL de solução
homogeneizada de Ts g purificada (1,5mg, 250µM). A solução misturada foi
57
incubada por 60 minutos, em um banho de água a 37˚C. 200µL da amostra dessa
mistura foram carregados em uma coluna preparativa HPLC de fase reversa para
separar os tratados da toxina Tsg M (toxina gama após incubação com morina) ou
Tsg C (toxina gama após incubação com cumarina). Utilizando a mesma condição
cromatográfica, 200µL de toxina gama nativa (Tsg N) foram analisadas.
Após equilíbrio da coluna HPLC com um tampão A (solução aquosa de 0,1%
TFA), as amostras foram eluídos com um gradiente descontínuo de HPLC tampão B
(66,6% de acetonitrila em 0,1% TFA) em um fluxo constante de 2,0 mL/ min, a
corrida cromatográfica foi monitorada em A214nm para a detecção de Tsg N, Tsg C
e Tsg M. Cada corrida cromatográfica foi monitorada usando o detector PDA HPLC.
A toxina gama nativa resultante foi denominada Ts g e seu grau de pureza foi
avaliado em Tricine SDS-PAGE e espectrômetro de massa MALDI-TOF, como
descrito anteriormente (TOYAMA et al., 2003; TOYAMA et al., 2005).
4.5 Canal deferente isolado de camundongo
Os camundongos foram sacrificados por deslocamento cervical e os dois
canais deferentes foram removidos. Um segmento de aproximadamente 1cm de
comprimento, livre de tecido adiposo e conjuntivo aderentes e de vasos sanguíneos,
foi retirado da porção prostática de cada um dos canais e colocado em banho de
órgãos contendo solução de Krebs diferenciada para canal deferente.
O tecido foi montado verticalmente sob tensão de repouso de 0,5g, em cada
banho de 5mL, contendo solução de Krebs livre de Mg2+, pH 7,4, com a seguinte
composição: NaCl 118mM, KCl 4,75mM, CaCl2 2,54mM, KH2PO4 0,93mM, NaHCO3
24mM, glicose 11mM, EDTA 0,027mM, ácido ascórbico 0,1mM. O meio foi mantido a
37°C e aerado com mistura carbogênica (95% O2 e 5% CO2). Os nervos intramurais
foram indiretamente estimulados com estimulador Grass S6 (voltagem de 30V,
duração de 0,5ms, freqüência de 0,2 Hz) entre dois eletrodos de platina em forma de
anéis, situados acima e a baixo do tecido isolado (BURNSTOCK; HOLMAN, 1966).
58
As contrações longitudinais foram registradas através da fixação da
extremidade superior do tecido a um transdutor de força isométrico (Narco
Biosystems 4DM, Houston, Texas, EUA), que, por sua vez, foi conectado a um
registrador (Gould RS 3400).
Após período inicial de repouso de 30 minutos, com lavagens sucessivas, a
resposta contrátil foi induzida por estimulação elétrica (EFS). O efeito das toxinas
(PHY-N e Ts g) e das drogas controle foram expressos como percentual das
amplitudes de contrações antes da adição dos componentes dos testes.
4.6 Corpo cavernoso isolado de camundongo
Após serem sacrificados por deslocamento cervical, os corpos cavernosos
dos camundongos foram removidos e dissecados, para retirada dos tecidos
circunvizinhos e da túnica albugínea, segundo o descrito por Hedlund e
colaboradores (1999). Em seguida, os corpos cavernosos foram montados em
banhos de 5mL em solução de Krebs-Henseleit (NaCl 126,4, KCl 4,6, KH2PO4 1,2,
MgSO4 1,2, NaHCO3 13,6, Glicose 11,11), mantidos a 37º, pH 7,4 e oxigenados com
mistura carbogênica (95% O2 e 5% CO2), de forma semelhante ao descrito
anteriormente para montagem dos canais deferentes. Os tecidos foram mantidos
sob tensão de 0,5g e conservaram-se em repouso por período de uma hora,
sofrendo sucessivas lavagens de 15 em 15 minutos.
As alterações na tensão foram registradas através do polígrafo com
transdutor de força isométrico já citado anteriormente. Após período inicial de
repouso, os corpos cavernosos serão contraídos com 1µM fenilefrina (PHE). O
protocolo experimental será realizado no platô da contração.
4.7 Preparação do frênico-diafragma
Após serem sacrificados por sangria por secção dos vasos do pescoço, os
camundongos tiveram os hemidiafragmas, com os nervos frênicos correspondentes,
59
retirados e fixados em cuba contendo 5mL de solução nutritiva de Krebs-Henseleit
(NaCl 126,4, KCl 4,6, KH2PO4 1,2, MgSO4 1,2, NaHCO3 13,6, Glicose 11,11), de
acordo com a técnica de Bulbring (1946). A solução foi aerada constantemente com
carbogênio (95% O2 e 5% CO2) e mantida a 37°C. O nervo foi colocado sobre
eletrodos de platina ligados a um estimulador Grass S6.
O diafragma foi mantido por sua porção tendinosa sob tensão constante (2g)
através de um fio ligado a um transdutor isométrico (já descrito), sendo submetido à
estimulação direta de 0,25Hz, duração de 5ms e 30V. As variações de tensão
produzidas pelas contrações do diafragma foram registradas através da ligação da
preparação em um transdutor de força (Narco Biosystems Inc) acoplado a um
gravador Gould RS 3400 (BULBRING, 1946).
4.8 Preparação de músculo biventer-cervicis
Pintos machos foram sacrificados com éter e o músculo biventer-cervicis foi
removido, de acordo com a metodologia descrita por Ginsborg e Warriner (1960). O
tecido foi montado sob uma tensão de 1g e descansou em um banho de órgãos de 4
mL preenchido com solução de Krebs (pH 7,4; 37ºC) com a seguinte composição
(mM): 118,7 NaCl, 4,7 KCl, 1,88 CaCl2, 1,17 KH2PO4, 1,17 MgSO4, 25,0 e 11,65
NaHCO glicose, constantemente aerada (95% de O2 e 5 % de CO2).
Um eletrodo bipolar de platina em forma de anel foi colocado ao redor do
tendão, que decorreu o tronco do nervo que inervava o músculo. Estimulação
indireta foi aplicada com um estimulador Grass S6 (0,1Hz, 0,2ms, 3-4mV).
Contrações musculares e contraturas foram registradas através de fisiógrafo
(anteriormente citado).
4.9 Protocolos experimentais
Os protocolos experimentais foram divididos em duas etapas subseqüentes. A
primeira composta pelos experimentos com extrato de P. punctata (PHY-N) e a
60
segunda constituída com experimentos com a toxina de T. serrulatus (Ts g nativa e
modificadas).
4.9.1 Protocolos experimentais com o extrato PHY-N
Os experimentos com PHY-N foram divididos em quatro conjuntos: 1) canal
deferente de camundongo; 2) corpo cavernoso de camundongo; 3) preparação de
nervo-frênico e diafragma; e, por fim, 4) experimentos qualitativos com galináceos.
Em um primeiro conjunto de experimentos, foram estudados os efeitos de
PHY-N em canal deferente de camundongo. Para investigação do efeito da PHY-N
foram realizadas, primordialmente, curvas concentração-resposta e EC50 em MVD.
Cada preparação foi precedida apenas da adição de 10µM morfina e 10µM
naloxona para padronizar a sensibilidade do ensaio. Foram testadas onze
concentrações distintas: 0,1 a 3.000 ng/mL, adicionadas de maneira cumulativa à
preparação (com intervalo de tempo suficiente para que a amplitude de contração
formasse platô entre cada concentração). Cada ponto da curva foi traçado a partir da
média de quatro ou cinco repetições para cada concentração testada. A curva
concentração-resposta foi obtida através das respectivas contrações para o cálculo
dos valores da EC50 (dose efetiva média – em µg/mL ou µM). O tempo de resposta
das curvas também foi registrado.
Para investigar se o efeito de PHY-N sobre MVD é mediado por fibras
noradrenérgicas ou é diretamente pós-sináptico, foram registradas as contrações
induzidas por PHY-N, na presença e ausência de 10µM de guanetidina (GUA), que
inibe seletivamente a neurotransmissão adrenérgica nos nervos pós-ganglionares,
prevenindo a liberação e causando depleção de NA das terminações nervosas,
somados a 100µM de fentolamina (FEN), que é um bloqueador α-adrenérgico,
realizando o bloqueio competitivo de receptores α-1 e α-2. A fentolamina (100µM)
também será administrada isoladamente na presença e ausência de PHY-N.
61
Para investigar o envolvimento de receptores α-adrenérgicos no mecanismo
de contração neurogênica em MVD, induzidas por PHY-N, foi administrado, na
ausência de EFS, 10µM de noradrenalina (NA). Após efeito máximo, o tecido sofreu
sucessivas lavagens durante 15 minutos. Em seguida, foi administrada dose da EC50
calculada para PHY-N adicionando-se, em seguida, 10µM de NA. A força de
contração média produzida por PHY-N na presença de NA foi comparada com seu
respectivo controle (pré-contração com noradrenalina, sem EFS). Após sucessivas
lavagens, a responsividade da preparação foi testada através da contração induzida
por PHY-N.
Para verificar a participação dos canais de sódio nos efeitos dessa toxina em
MVD, foram feitos registros das contrações produzidas por PHY-N com a adição de
1mM de lidocaína (LID), um bloqueador rápido dos canais de sódio.
Foi realizado também, um segundo conjunto de experimentos com PHY-N em
corpos cavernosos de camundongos, para avaliar o efeito desse extrato em fibras
nitrérgicas.
Foram registrados os efeitos da contração induzida por PHY-N na ausência e
presença da 100µM lidocaína, com o objetivo de averiguar a participação dos canais
de sódio no efeito dessa toxina. As contrações induzidas por PHY-N adicionada à
lidocaína e por PHY-N precedida da administração de lidocaína foram comparadas à
contração induzida apenas por PHY-N. O tempo de resposta de ação de PHY-N na
presença de lidocaína também foi registrado.
Para investigar a participação do óxido nítrico (NO) no efeito do extrato de P.
punctata em corpo cavernoso de camundongo, foram registradas as contrações
induzidas por PHY-N na presença de 10µM de L-NAME, inibidor da óxido nítrico
sintetase. O tempo de ação de PHY-N na presença de L-NAME também foi
registrado.
Em um terceiro conjunto de experimentos, os efeitos de PHY-N foram
testados, na preparação frênico-diafragma, para avaliar a ação desse extrato na
transmissão neuromuscular esquelética. Para tanto, foi estabelecido a curva
62
concentração-resposta. Foram testadas onze concentrações distintas: 0,1 ng/mL a
10000 ng/mL, adicionadas de maneira cumulativa à preparação (com intervalo de
tempo suficiente para que a amplitude de contração formasse platô entre cada
concentração). Cada ponto da curva foi traçado a partir da média de quatro ou cinco
repetições para cada concentração testada. O tempo de resposta das curvas
também foi registrado.
Por fim, o quarto conjunto de experimentos objetivou avaliar qualitativamente
os efeitos toxina de P. punctata como um bloqueador da transmissão
neuromuscular. Dessa forma, foi administrada na pata traseira de cada animal uma
única injeção intramuscular de bloqueador neuromuscular ou PHY-N.
Após ministrar as drogas, foram observadas as reações, flacidez ou rigidez,
de cada animal sendo registradas, por meio de fotografias, o estado muscular em
que esses animais se encontravam logo após o óbito. Tais registros foram
comparados aos registros realizados das reações do pinto após receber injeção
contendo PHY-N (6mg/Kg).
4.9.2 Protocolos experimentais com a toxina gama (Ts g)
Os experimentos com Ts g foram divididos em dois conjuntos: 1) canal
deferente de camundongo; e, 2) músculo biventer-cervicis de pintos.
No primeiro conjunto com Ts g, foram realizados dois grupos de
experimentos, que visavam comparar as alterações induzidas pela toxina gama
nativa (Tsg N) com as frações modificadas do veneno de T. serrulatus (Tsg C e Tsg
M) em modelo neurogênico de canal deferente de camundongo. Através das toxinas
modificadas, busca-se verificar se modificações estruturais, como as realizadas com
morina e cumarina, também causariam mudanças na atividade destas quando
comparadas a toxina nativa (Tsg N).
63
A princípio, foram realizadas as curvas concentração-resposta e tempo
resposta para toxina nativa (Tsg N), toxina modificada com cumarina (Tsg C) e
toxina modificada com morina (Tsg M) em MVD.
Foram testadas onze concentrações distintas: 0,1 ng/mL a 10000 ng/mL,
adicionadas de maneira cumulativa à preparação (com intervalo de tempo suficiente
para que a amplitude de contração formasse platô entre cada concentração). Cada
ponto da curva foi traçado a partir da média de quatro ou cinco repetições para cada
concentração testada. O tempo de resposta das curvas também foi registrado.
Em seguida, no primeiro experimento, para verificar a participação dos canais
de sódio nos efeitos dessa toxina em MVD, foram feitos registros das contrações
produzidas pela Tsg C (300ng/mL) ou Tsg M (300ng/mL) com a adição de 1mM de
lidocaína. As contrações induzidas por Tsg C ou Tsg M, na presença da lidocaína,
foram comparadas com as contrações induzidas pela toxina nativa (Tsg N).
O segundo experimento, por sua vez, visava avaliar a participação αadrenérgica nos efeitos das contrações induzidas pelas frações modificadas Tsg C e
Tsg M. Para tal, foram registrados os efeitos das contrações induzidas por Tsg C
(300ng/mL) ou Tsg M (300ng/mL) com a adição de 100µM de fentolamina. As
contrações na presença da fentolamina, que é um inibidor competitivo dos
receptores adrenérgicos α-1 e α-2, bloqueando localmente os neurotransmissores
adrenalina e noradrenalina, foram comparadas às contrações induzidas por Tsg N.
O segundo conjunto, que foi composto por experimentos com a preparação
de músculo biventer-cervicis de pintos, buscou analisar os efeitos neurotóxicos do
ensaio. Para isso, contraturas através da aplicação exógena de acetilcolina (ACh, 55
ou 110µM por 60s) e KCl (5mM para 120-130s) foram obtidos na ausência de
estimulação nervosa antes da adição de toxinas modificadas e não-modificadas. Os
preparativos foram estabilizados por pelo menos 20 minutos antes da adição de KCl
e ACh ou uma única concentração (5 µg/mL) dos compostos.
64
4.10 Análise estatística
Cada experimento foi repetido pelo menos quatro vezes e o percentual (%)
das contrações induzidas pela PHY-N foram expressos como média + erro padrão
da média (EPM).
O logaritmo negativo das concentrações necessárias para induzir 50% da
resposta máxima (EC50) e seu respectivo intervalo de confiança (IC 95%) foram
determinadas a partir das regressões não-lineares das curvas cumulativas
concentração-resposta em MVD, utilizando o software GraphPad Pris 5.0.
As diferenças estatísticas entre os grupos foram avaliadas por intermédio do
teste t de Student ou da análise de variância (ANOVA) seguida do teste de Dunnett,
quando vários grupos experimentais foram comparados com o grupo controle ou do
teste de Tukey-Kramer, quando os grupos foram comparados entre si. O limite de
confiança de significância foi de 5%, com valores de p< 0,05 indicando significância
estatística.
4.11 Comitê de ética
Esse estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética para Uso de Animais da
Universidade Estadual do Ceará, sob número de protocolo 08623084-0.
65
5. RESULTADOS
5.1 Resultados do extrato de Phyllorhiza punctata
Em experimentos preliminares, o extrato de Phyllorhiza punctata (PHY-N)
induziu contração dos canais deferentes de camundongo (MVD) (Figura 10).
Uma curva cumulativa dose-resposta (0,1 a 3.000ng/ mL) foi realizada com
adição cumulativa das doses à preparação (Figuras 11 – A e B). As respostas foram
mensuradas em relação ao percentual das amplitudes de contrações antes da
adição dos componentes dos testes. A Figura 11 – C mostra que PHY-N aumentou a
amplitude das contrações a partir da concentração de 300 ng/ mL. A resposta de
contração máxima encontrada para PHY-N foi de 395,71 + 42,00%, na concentração
de 3.000 ng/ mL.
A EC50 foi determinada pela regressão não-linear e o resultado mostrou o
valor de 117,2 µg/mL.
A curva tempo-resposta (Figura 12) exibe o curso temporal de decaída da
contração induzida pela PHY-N após efeito máximo, comparada com o controle
(veículo). As contrações induzidas por PHY-N apresentaram decaída inicial rápida,
ou seja, após 5 minutos do efeito máximo, a decaída das contrações era de 45,63 +
8,67%. Decorridos 20 minutos, as contrações já haviam reduzido em 87,95 + 2,56%
e após 30 minutos observou-se a decaída praticamente total do efeito máximo, de
95,30 + 1,72% em relação ao veículo.
66
Figura 14 – Registro fisiográfico típico das contrações induzidas por PHY-N em MVD
PHY-N (117,2µg/mL)
Figura 10 – Registro fisiográfico das contrações induzidas pelo extrato de Phyllorhiza
punctata (PHY-N) (117,2µg/ mL) em canais deferentes de camundongo (MVD)
67
A
B
C
Contração (% Controle)
Curva dose-resposta
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
10 -1
*
Veículo
PHY-N
*
10 0
10 1
10 2
10 3
10 4
PHY-N (ng/mL)
Figura 11 – Registro fisiográfico do efeito do veículo (controle) nas contrações em canal
deferente (MVD) (A). Registro fisiográfico das contrações induzida pelo extrato de
Phyllorhiza punctata (PHY-N) (117,2µg/ mL) em MVD (B). Curva dose-resposta para PHYN em MVD: efeito de aumento das contrações nas concentrações de 0,1 a 3.000ng/ mL.
Dados expressos como média + erro padrão da média (n=7) da porcentagem da contração
inicial. *p<0,05 em relação ao grupo controle (veículo), Test t. (C)
68
Contração (% Controle)
Curva tempo-resposta
100
Veículo
PHY-N
80
*
60
*
40
*
20
* *
* *
0
0
5
10 15 20 25 30 35 40 45 50
Tempo (Min)
Figura 12 – Curva tempo-resposta para Phyllorhiza punctata (PHY-N) em canal deferente
(MVD): curso temporal de decaída da contração induzida pela PHY-N após efeito máximo,
comparada com o controle. Dados expressos como média + erro padrão da média (n=7)
da porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao grupo controle (veículo), Test
t.
69
As figuras 13 – A e B mostram que guanetidina somada a fentolamina
bloqueou a contração induzida por estimulação elétrica (EFS) (90,36 + 4,91% de
bloqueio). De forma semelhante, guanetidina somada a fentolamina bloqueou
significativamente a contração induzida por PHY-N em 92,19 + 2,96%.
Este achado foi reforçado com os experimentos com a administração de
fentolamina sozinha que também bloqueou parcialmente a contração induzida por
EFS (84,15 + 3,27% de bloqueio). Por sua vez, a fentolamina bloqueou
significativamente a contração induzida por PHY-N em 79,60 + 7,83% (Figura 14 – A
e B).
70
A
B
Contração (% Controle)
Data 1
150
EFS
GUA+FEN
GUA+FEN+PHY-N
100
PHY-N
50
#
*
#
*
PH
YN
U
A
G
+F
U
EN
A
+F
EN
+P
H
YN
G
EF
S
0
Figura 13 – Registro fisiográfico do efeito da guanetidina e fentolamina na contração
induzida por Phyllorhiza punctata (PHY-N) (A). Efeito da guanetidina e fentolamina na
contração induzida por estimulação elétrica (EFS) e por PHY-N. Dados expressos como
média + erro padrão da média (n=4) da porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em
relação ao grupo controle (EFS), ANOVA seguido de Dunnett. #p<0,05 em relação a
contração induzida por PHY-N, ANOVA seguido de Turkey-Kramer (B)
71
A
Contração (% Controle)
B
150
EFS
FEN
FEN+PHY-N
PHY-N
100
#
*
50
#
*
YN
PH
YN
FE
N
+P
H
FE
N
EF
S
0
Figura 14 – Registro fisiográfico do efeito da fentolamina na contração induzida por
Phyllorhiza punctata (PHY-N) (A). Efeito de 100µM de fentolamina na contração induzida
por estimulação elétrica (EFS) e por PHY-N. Dados expressos como média + erro padrão
da média (n=4) da porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao controle
(EFS), ANOVA seguido de Dunnett. #p<0,05 em relação a contração induzida por PHY-N,
ANOVA seguido de Turkey-Kramer (B).
72
Na investigação do envolvimento de receptores α-adrenérgicos no mecanismo
de contração induzidas por PHY-N em MVD, NA foi administrada, na ausência de
EFS. Essa pré-contração com NA foi o controle deste experimento. Após efeito
máximo, o tecido sofreu sucessivas lavagens. Em seguida, foi administrada dose da
117,2 µg/ mL de PHY-N. Na presença da PHY-N, houve contração com efeito
máximo de 78,08 + 45,88% (não diferentemente significativo em relação ao
controle). Em seguida, 10µM de NA foi administrada, apresentado pico de contração
de 95,96 + 57,26% (não diferentemente significativo em relação ao controle) (Figura
15 – A e B).
As figuras 16 – A e B mostram que a lidocaína (1mM) bloqueou a contração
induzida por EFS (90,61 + 2,11% de bloqueio). A mesma concentração de lidocaína,
por sua vez, também bloqueou significativamente a contração induzida por PHY-N
em 93,83 + 1,31% em relação ao controle.
73
A
B
Contração (% Controle)
Data 1
200
EFS
NA
PHY-N
PHY-N+NA
150
100
50
A
PH
Y-
N
+N
N
PH
Y-
A
N
EF
S
0
Figura 15 – Registro fisiográfico do efeito da NA exógena na contração induzida por
Phyllorhiza punctata (PHY-N) (A). Efeito de 10µM de noradrenalina (NA) exógena na
contração induzida por PHY-N. Dados expressos como média + erro padrão da média
(n=5) da porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao grupo controle
(estimulação elétrica - EFS), ANOVA seguido de Dunnett. #p<0,05 em relação a contração
induzida por PHY-N, ANOVA seguido de Turkey-Kramer (B).
74
A
200
EFS
PHY-N
LID
PHY-N+LID
*
150
100
50
+L
ID
PH
YN
EF
S
0
#
*
PH
YN
#
*
LI
D
Contração (% Controle)
B
Figura 16 – Registro fisiográfico do efeito da lidocaína na contração induzida por
Phyllorhiza punctata (PHY-N) (A). Efeito da lidocaína (1mM) na contração induzida por
estimulação elétrica (EFS) e induzida por PHY-N. Dados expressos como média + erro
padrão da média (n=4) da porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao grupo
controle (EFS), ANOVA seguido de Dunnett. #p<0,05 em relação a contração induzida por
PHY-N, ANOVA seguido de Turkey-Kramer (B).
75
Em experimentos preliminares com corpo cavernoso de coelho pré-contraído
com 10µM de PHE, PHY-N mostrou o efeito de relaxamento neste tecido (Figura
17).
Em corpo cavernoso de camundongo também pré-contraído com 1µM de
PHE, PHY-N induziu relaxamento de 130, 55 + 14,20% em relação ao controle (EFS,
32Hz, 50V) (Figura 18 – A e B).
A curva tempo-resposta (Figura 19) exibe o curso temporal de relaxamento
induzido pela PHY-N em corpo cavernoso de camundongo pré-contraído com PHE,
comparada ao controle (veículo). O relaxamento induzido por 117,2µg/mL de PHY-N
apresentou rápida ação inicial, ou seja, em cerca de 10 minutos, o tecido apresentou
relaxamento de 69,47 + 12,25%. Após 20 minutos, o tecido apresentou relaxamento
de 82,61 + 12,37%.
76
Figura 17 – Registros preliminares do relaxamento induzido por PHY-N em corpo
cavernoso de coelho pré contraído com 10µM de fenilefrina (PHE) e pronta reversão
induzida por 1mM de lidocaína (LID)
77
A
B
100
80
60
40
20
0
-20
-40
-60
-80
-100
-120
-140
PH
Y-
2H
EF
S
(3
EFS (32Hz)
PHY-N
N
*
z)
RELAXAMENTO (%)
Data 1
Figura 18 – Registro fisiográfico do relaxamento em corpo cavernoso pré-contraído de
camundongo induzido por Phyllorhiza punctata (PHY-N) (A). Efeito de relaxamento do
corpo cavernoso de camundongo pré contraído (1µM de fenilefrina - PHE) induzido por
PHY-N (117,2µg/mL), comparado ao controle (estimulo elétrico - EFS, 32Hz, 50V). Dados
expressos como média + erro padrão da média (n=7) da porcentagem da contração inicial.
*p<0,05 em relação ao grupo controle, Teste t, teste pareado (B).
78
Figura 19 – Curva tempo-resposta para Phyllorhiza punctata (PHY-N) em corpo cavernoso
de camundongo: curso temporal de relaxamento induzido pela PHY-N (117,2µg/mL) em
corpo cavernoso de camundongo pré-contraído com 1µM de fenilefrina (PHE), comparada
com o controle (veículo). Dados expressos como média + erro padrão da média (n=7) da
porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao grupo controle (veículo), Test t.
79
A adição de 1mM de lidocaína após adição de 117,2µg/mL de PHY-N reverteu
a ação de relaxamento da PHY-N, aumentando momentaneamente a amplitude das
contrações e, posteriormente, causando relaxamento de 101, 61 + 25,13%, não
diferentemente significativo do relaxamento induzido por PHY-N que foi de 130,55 +
12,54%. (Figura 20 – A e B). Na presença prévia da mesma concentração de
lidocaína, PHY-N não induziu relaxamento significativo.
Para investigar a participação do NO no efeito do extrato de P. punctata em
corpo cavernoso de camundongo pré-contraído com PHE, foram registradas os
efeitos induzidos por 117,2µg/mL de PHY-N na presença de 10µM L-NAME. Desta
forma, PHY-N não foi capaz de induzir o relaxamento. Na presença de L-NAME,
todavia,
PHY-N
induziu
contrações
de
100,92
+
98,76%,
diferentemente
significativas do relaxamento induzido por PHY-N que foi de 130,55 + 12,54%
(Figura 21 – A e B).
80
A
B
B
RELAXAMENTO (%)
0
-50
EFS (32Hz)
PHY-N+LID
LID+PHY-N
PHY-N
#
-100
*
-150
*
YN
PH
YN
LI
D
+P
H
PH
YN
+L
ID
EF
S
(3
2H
z)
-200
Figura 20 – Registro fisiográfico do relaxamento em corpo cavernoso de camundongo précontraído induzido por Phyllorhiza punctata (PHY-N) na presença de lidocaína (LID) (A).
Efeito do relaxamento induzido por 117,2µg/mL PHY-N + 1mM de LID e LID (1mM) + PHYN (117,2µg/mL) em corpo cavernoso de camundongo pré-contraído (1µM de fenilefrina PHE). Dados expressos como média + erro padrão da média (n=7) da porcentagem da
contração inicial. *p<0,05 em relação ao grupo controle, ANOVA seguido de Dunnett.
#p<0,05 em relação a contração induzida por PHY-N, ANOVA seguido de Turkey-Kramer
(B).
81
A
B
YN
L-
N
A
M
E
+
PH
EFS (32Hz)
L-NAME + PHY-N
PHY-N
PH
YN
z)
#
*
(3
2H
300
250
200
150
100
50
0
-50
-100
-150
-200
EF
S
RELAXAMENTO (%)
Data 1
Figura 21 – Registro fisiográfico do relaxamento induzido por Phyllorhiza punctata (PHY-N)
na presença de NG -nitro-L-arginina-metil-éster (L-NAME) em corpo cavernoso de
camundongo pré-contraído com fenilefrina (PHE). Efeito do relaxamento induzido por
117,2µg/mL de PHY-N na presença de 10µM L-NAME em corpo cavernoso de
camundongo pré-contraído com 1µM de PHE, comparado com controle (EFS, 32Hz, 50V)
e com relaxamento induzido por PHY-N. Dados expressos como média + erro padrão da
média (n=7) da porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao grupo controle,
ANOVA seguido de Dunnet. #p<0,05 em relação ao relaxamento induzido por PHY-N,
ANOVA seguido de Turkey-Kramer (B).
82
A Figura 22 exibe o curso temporal de relaxamento do corpo cavernoso de
camundongo pré-contraído com PHE (1µM) induzido por 117,2µg/mL de PHY-N na
presença de 1mM de lidocaína ou de 10µM de L-NAME, comparados com o
relaxamento induzido apenas por PHY-N.
Na presença prévia de lidocaína, PHY-N não foi capaz de induzir relaxamento
significativo e esse comportamento foi mantido transcorrido 30 minutos (Figura 23 –
A).
Na presença de L-NAME, PHY-N também não foi capaz de induzir
relaxamento significativo no tecido mesmo após 30 minutos de ação (Figura 23 – B).
83
Relaxamento (% Controle)
A
120
100
80
60
40
20
0
-20
-40
-60
-80
-100
-120
-140
*
CONTROLE
PHY-N
LID+PHY-N
*
*
5
10
15
*
*
*
20
25
30
35
40
Tempo (min)
Relaxamento (% Controle)
B
120
100
80
60
40
20
0
-20
-40
-60
-80
-100
-120
-140
*
CONTROLE
PHY-N
L-NAME+PHY-N
*
*
5
10
15
*
*
*
20
25
30
35
40
Tempo (min)
Figura 22 - Curso temporal de relaxamento do corpo cavernoso de camundongo précontraído por fenilefrina (PHE) (1µM) induzidos por 117,2µg/mL de Phyllorhiza punctata
(PHY-N) na presença de 1mM de LID, comparado com o relaxamento induzido apenas por
PHY-N (A). Curso temporal de relaxamento do corpo cavernoso de camundongo précontraído por PHE (1µM) induzido 117,2µg/mL de PHY-N na presença de 10µM de NG nitro-L-arginina-metil-éster (L-NAME), comparado com o relaxamento induzido apenas por
PHY-N (B). Dados expressos como média + erro padrão da média (n=7) da porcentagem
da contração inicial *p<0 05 em relação à PHY-N Test t
84
A curva cumulativa dose-resposta (0,1 a 1.000 ng/ mL) da PHY-N na
preparação frênico-diafragma, observada na Figura 23 – A e B, foi realizada com
adição cumulativa das doses à preparação. As respostas foram mensuradas em
relação ao percentual das amplitudes de contrações antes da adição dos
componentes dos testes. A Figura 23 – C mostra que 117,2µg/ mL de PHY-N
diminuiu a amplitude das contrações de forma dose-dependente, porém de forma
não significativa em relação ao controle. A resposta de bloqueio máxima encontrada
para PHY-N foi de 93,40 + 2,06%, na dose de 3.000 ng/ mL. A dose de 1.000 ng/
mL, no entanto, demonstrou ser o mais potente bloqueador significativo das
contrações.
A curva tempo-resposta na preparação frênico-diafragma de camundongo
(Figura 24) exibe o curso temporal de bloqueio neuromuscular induzido pela PHY-N
comparada com o controle. Em cerca de 10 minutos, PHY-N foi capaz de bloquear a
significativamente a contração em 86,33 + 1,51%. Transcorridos 20 minutos, esse
bloqueio se manteve.
85
A
B
C
Contração (% Controle)
Curva dose-resposta
Veículo
PHY-N
100
80
60
40
20
0
10-1
*
100
101
102
103
104
PHY-N (ng/mL)
Figura 23 – Registro fisiográfico do efeito do veículo (controle) nas contrações em frênicodiafragma (A). Registro fisiográfico típico das contrações induzida por Phyllorhiza punctata
(PHY-N) em frênico-diafragma (B). Curva dose-resposta para PHY-N em frênicodiafragma: efeito da redução da amplitude das contrações nas concentrações de 0,1 a
1000 ng/mL (C). Dados expressos como média + erro padrão da média (n=4) da
porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao grupo controle (veículo), Test t.
Contração (% Controle)
86
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
Veículo
PHY-N
0
5
*
*
*
10
15
20
25
TEMPO (MIN)
Figura 24 – Curva tempo-resposta para Phyllorhiza punctata (PHY-N) em frênicodiafragma de camundongo: curso temporal do bloqueio induzido por 117,2µg/ mL de
PHY-N, após seu efeito máximo, comparada com o controle (veículo). Dados
expressos como média + erro padrão da média (n=4) da porcentagem da contração
inicial. *p<0,05 em relação ao grupo controle (veículo), Test t.
87
Na análise qualitativa da PHY-N como um bloqueador da transmissão
neuromuscular, o pinto apresentou relaxamento muscular generalizado, após óbito,
quando receberam injeção intramuscular de galamina (6mg/Kg) (Figura 25). Ao
receber injeção intramuscular de succinilcolina (6mg/Kg), animal apresentou
contração espástica da musculatura, após óbito, apresentaram rigidez generalizada
da musculatura esquelética (Figura 26). Na figura 27, pode-se observar a
comparação visual das diferantes reações, flacidez e rigidez, de cada animal logo
após o óbito.
Na figura 28, observa-se animal em óbito, apresentando rigidez local da pata
traseira, após receber injeção de PHY-N (6mg/Kg).
88
Figura 25 – Pinto em óbito apresentaram relaxamento muscular generalizado, após
receberam injeção de galamina (6mg/ Kg)
Figura 26 – Pinto em óbito, apresentaram rigidez generalizada da musculatura esquelética,
após receber injeção de succinilcolina (6mg/ Kg).
89
Figura 27 – Comparação visual das diferantes reações de cada animal logo após o
óbito. Á direita, pinto em óbito, apresentado relaxamento muscular generalizado,
após receberam injeção de galamina (6mg/ Kg). À esquerda, pinto em óbito,
apresentaram rigidez generalizada da musculatura esquelética, após receber injeção
de succinilcolina (6mg/ Kg).
90
Figura 28 – Pinto em óbito, apresentaram rigidez local da pata traseira, após receber
injeção de PHY-N (6mg/ Kg).
91
5.2 Resultados da toxina gama
Foram realizados dois experimentos que visavam verificar as alterações
induzidas pela toxina nativa (Tsg N) e pelas frações modificadas do veneno de T.
serrulatus por cumarina (Tsg C) e por morina (Tsg M) em modelo neurogênico de
canal deferente de camundongo.
A Ts g nativa (Tsg N) induziu hiperexcitabilidade autonômica, induzindo
"spikes" e, após o disparo aberrante, as contrações neurogênicas foram abolidas
(em aproximadamente 20min após o pico de atividade) (Figura 29 – A).
A amplitude máxima de contração tônica evocados por 300 ng/ mL de Tsg N
foi de 200 ± 33,3% em comparação com 408 ± 50,7% (p <0,05 em comparação com
Ts g sozinho), atingida com Tsg M ou 296 ± 92,2% com Tsg C (Figura 29 – B).
O
bloqueio
da
neurotransmissão
cinética
após
um
período
de
hiperexcitabilidade é ilustrado na Figura 29 – C. O tempo de queda do efeito da
toxina nativa foi entre 15 e 10 minutos. Não houve significativas alterações induzidas
por tratamento com morina ou cumarina em tempo necessário para completar o
bloqueio da neurotransmissão pela toxina gama.
92
A
B
TOXINA (ng/mL)
C
TEMPO (min)
Figura 29 – Registro fisiográfico das contrações induzidas por toxina nativa (Tsg N)
em canal deferente (MVD) (A). Curva dose-resposta para Tsg N, toxina modificada
por cumarina (Tsg C) e por morina (Tsg M) (5 mg/mL) em MVD: efeito de aumento
da amplitude das contrações nas concentrações de 0,1 a 1.000ng/ mL (B). Curva
tempo-resposta para Tsg N e toxinas modificadas Tsg C e Tsg M (5 mg/mL) em
MVD: curso temporal de decaída do efeito após contração máxima induzido pelas
toxinas modificas, comparadas com Tsg N (C). Dados expressos como média + erro
padrão da média (n=4) da porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao
grupo controle, ANOVA seguido de Turkey-Kramer.
93
Para verificar a participação dos canais de sódio nos efeitos dessas toxinas
modificadas em MVD comparadas as Tsg N, foram feitos registros das contrações
induzidas pela Tsg C (300ng/mL) ou Tsg M (300ng/mL), na ausência de estimulação
nervosa, e na presença de 1mM de lidocaína. As contrações induzidas por Tsg C ou
Tsg M, na presença da lidocaína foram comparadas às contrações induzidas por
Tsg N.
Na presença de 1mM lidocaína a contração induzida por EFS foi bloqueada.
De forma semelhante, 1mM de lidocaína bloqueou significativamente as contrações
induzidas por Tsg C em 95,12 + 1,64%, quando comparados às contrações
induzidas por Tsg N (Figura 30 – A e B).
Nos experimentos com Tsg M, a lidocaína bloqueou as contrações induzidas
por EFS e bloqueou também as contrações induzidas por Tsg M em 93,48 + 1,71%,
quando comparado às contrações induzidas por Tsg N (Figura 31 – A e B).
94
A
B
% CONTRAÇÃO
150
EFS
LID
LID+Tsg C
Tsg N
100
50
#
*
#
*
N
Ts
g
C
LI
D
+T
sg
LI
D
EF
S
0
Figura 30 – Registro fisiográfico da contração induzida por toxina modificada por cumarina
(Tgs C) na presença de lidocaína (LID) em MVD (A). Efeito da contração induzida por Tgs
C (300ng/mL) na presença de LID (1mM). Dados expressos como média + erro padrão da
média (n=4) da porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao estímulo elétrico,
ANOVA seguido de Dunnett. #p<0,05 em relação a contração induzida por Tsg N, ANOVA
seguido de Turkey (B).
95
A
A
B
% CONTRAÇÃO
150
EFS
LID
LID+Tsg M
Tsg N
100
50
#
*
#
*
g
+T
s
N
LI
D
Ts
g
M
D
LI
EF
S
0
Figura 31 – Registro fisiográfico da contração induzida por toxina modificada por morina
(Tgs M) na presença de lidocaína em canal deferente (MVD) (A). Efeito da contração
induzida por Tgs M (300ng/mL) na presença de lidocaína (1mM). Dados expressos como
média + erro padrão da média (n=4) da porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em
relação ao estímulo elétrico, ANOVA seguido de Dunnett. #p<0,05 em relação a contração
induzida por Tsg N, ANOVA seguido de Turkey (B).
96
Avaliou-se, também, a participação dos receptores α-adrenérgicos nos efeitos
das contrações induzidas pelas toxinas modificadas Tsg C e Tsg M. Para tal, foram
obtidos, na ausência de estimulação nervosa, os efeitos das contrações induzidas
por Tsg C ou Tsg M na presença de 100µM de fentolamina.
Nas figuras 32 – A e B mostram que a fentolamina bloqueou as contrações
induzidas por EFS. Por sua vez, 100µM de fentolamina também bloqueou
significativamente as contrações induzidas por Tsg C em 89,02 + 1,40% quando
comparado às contrações induzidas por Tsg N.
100µM de fentolamina também bloqueou as contrações induzidas por EFS.
Essa mesma concentração de fentolamina bloqueou significativamente as
contrações induzidas por Tsg M em 92,43 + 1,62% quando comparado às
contrações induzidas por Tsg N (Figura 33 – A e B).
97
A
B
% CONTRAÇÃO
150
EFS
FEN
FEN+Tsg C
Tsg N
100
#
*
50
#
*
N
Ts
g
C
N
+T
sg
FE
FE
N
EF
S
0
Figura 32 – Registro fisiográfico da contração induzida por toxina modificada por cumarina
(Tgs C) na presença de fentolamina em canal deferente (MVD) (A). Efeito da contração
induzida por 300ng/mL de Tgs C na presença de fentolamina (100µM). Dados expressos
como média + erro padrão da média (n=4) da porcentagem da contração inicial. *p<0,05
em relação ao grupo controle, ANOVA seguido de Dunnett. #p<0,05 em relação a
contração induzida por Tsg N, ANOVA seguido de Turkey (B)
98
A
B
% CONTRAÇÃO
150
EFS
FEN
FEN+Tsg M
Tsg N
100
50
#
*
#
*
N
Ts
g
M
FE
N
+T
sg
FE
N
EF
S
0
Figura 33 – Registro fisiográfico da contração induzida por toxina modificada por morina
(Tgs M) na presença de fentolamina em canal deferente (MVD) (A). Efeito da contração
induzida por Tgs M na presença de fentolamina (10-2; 50µL). Dados expressos como média
+ erro padrão da média (n=8) da porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao
grupo controle, ANOVA seguido de Dunnett. #p<0,05 em relação a contração induzida por
Tsg N, ANOVA seguido de Turkey (B)
99
No segundo conjunto de experimentos com a toxina de Tityus serrulatus foi
realizada em preparação de músculo biventer-cervicis de pinto, buscando-se
analisar os efeitos neurotóxicos deste ensaio. Dessa forma, foram registradas as
contrações através da aplicação exógena de acetilcolina (ACh, 55 ou 110µM por
60s) e KCl (5mM para 120-130s) na ausência de estimulação nervosa antes da
adição de toxinas modificadas e não modificadas (5mg/ mL).
Na Figura 35 observa-se os resultados cedidos pelo Professor Doutor Marcus
Hikari Toyama para toxina de Tityus serrulatus. Tanto Tsg N quanto a Tsg C e Tsg M
foram analisadas por fase reversa HPLC. Como mostrado na Figura 35 - A,
observou-se um claro aumento do caráter hidrofóbico da toxina gama Tsg após o
tratamento com morina ou cumarina. Além disso, a cromatografia da Tsg N em
comparação com Ts g M ou Ts g C, apresentou também uma discreta mudança de
280nm UV por região a partir da digitalização de 200 a 300 Nm. Uma vez que ambos
os compostos, morina e cumarina, apresentaram um discreto caráter hidrofóbico,
que foi verificado pela análise espectroscópica usando um espectrômetro de massa,
um aumento relativo da massa molecular daTsg N foi verificado após o tratamento
com morina ou cumarina.
100
TEMPO (min)
Figura 34 – Curva tempo-resposta para toxina nativa (Tsg N) e toxinas modificadas com
cumarina (Tsg C) ou morina (Tsg M) (5 mg/mL) em biventer-cervicis de pinto: curso
temporal do efeito de bloqueio induzido pelas toxinas, após seu efeito máximo, comparada
com o controle. Dados expressos como média + erro padrão da média (n=4) da
porcentagem da contração inicial. *p<0,05 em relação ao grupo controle, ANOVA seguido
de Turkey.
A
101
C
Figura 35 – Massa molecular da toxina nativa (Tsg N), da toxina modificada com
morina (Tsg M) e toxina modificada com cumarina (Tsg C) depois da purificação em
C18 HPLC (A). Resultados do CD espectro da Ts g N, Tsg M e Tsg C mostraram
dados sobre o intervalo de 185-280 nm expressos em unidades de miligraus (B).
Fluorescência mensurada para Tsg N, Tsg M e Tsg C (C). Dados cedidos pelo
Professor Doutor Marcus Hikari Toyama
102
6. DISCUSSÃO
Esse trabalho mostra a investigação dos efeitos do extrato de tentáculo da
água-viva Phyllorhiza punctata e da toxina do escorpião Tityus serrulatus, em
preparações neuromusculares para fornecer uma caracterização farmacológica
dessas toxinas. Esses efeitos são bastante relevantes, pois são úteis para auxiliar
na descoberta dos mecanismos de ação das mesmas, fornecendo informações
adicionais sobre a ação destas e auxiliando no tratamento de pacientes
envenenados, e, ainda, podem ser importantes na descoberta de ferramentas
farmacológicas para se descobrir e estudar receptores, para investigar vias
fisiológicas, para descobrir moléculas com uso terapêutico potencial ou, ainda, para
produção de novos medicamentos. Para tal, foram utilizadas preparações
farmacológicas clássicas de canal deferente de camundongo, corpo cavernoso de
camundongo, frênico-diafragma de camundongo e biventer-cervicis de pintos.
O extrato de tentáculo da água-viva Phyllorhiza punctata (PHY-N) induziu
contração em canal deferente de camundongo, relaxamento em corpo cavernoso de
coelho e camundongo pré-contraído com PHE e agiu como bloqueador da contração
neuromuscular na preparação frênico-diafragma de camundongo; tratando-se da
primeira demonstração dos efeitos deste extrato em preparações neuromusculares.
Os prováveis mecanismos pelos quais a PHY-N promove esses efeitos serão
discutidos a seguir.
PHY-N foi avaliada para sua atividade biológica na junção neuromuscular
autonômica usando os canais deferentes de camundongo (MVD) estimulados
eletricamente como modelo. Experimentos preliminares demonstraram efeito da
contração de MVD induzidos pela PHY-N. A curva cumulativa dose-resposta
mostrou que esse aumento das contrações. A EC50 foi determinada pela regressão
não-linear e o resultado mostrou o valor de 117,2µg/mL.
Esse efeito de contração em MVD foi similar ao demonstrado por Endean
(1987) e Endean e Sizemore (1987) com a espécie C. fleckeri. O veneno bruto da
espécie de medusa Chiropsalmus quadrigatus, também apresentou aumento da
103
contração de músculo liso in vitro (SAKANASHI et al., 2002), corroborando com os
resultados encontrados por nós.
O curso temporal de decaída da contração induzida pela PHY-N após efeito
máximo, apresentou decaída inicial rápida, decaindo quase 50% do seu efeito em 5
minutos, todavia, o bloqueio total do efeito só ocorreu após 30 minutos. Tal resultado
sugere uma interação relativamente longa entre este extrato e seus sítios de ação.
Buscando investigar o mecanismo de ação dessas contrações induzidas por
PHY-N em MVD, o extrato PHY-N foi analisado na presença de guanetidina e
fentolamina ou apenas fentolamina, para avaliar se este efeito é mediado por fibras
noradrenérgicas ou por ação pós-sináptica Os resultados de ambos sugerem que o
efeito da PHY-N é pré-sináptico e mediado por fibras noradrenérgicas.
A guanetidina é inibidor seletivo da neurotransmissão adrenérgica nos nervos
pós-ganglionares, pois previne a liberação de noradrenalina das terminações
nervosas, causando a depleção periférica deste neurotransmissor nas terminações
nervosas (BROCK; CUNNANE, 1988). O músculo liso de canal deferente de
camundongo possuí receptores adrenérgicos tanto α1 quanto α2, porém os
receptores α envolvidos na contração da musculatura lisa são principalmente do tipo
α1. A fentolamina, por sua vez, é um bloqueador α-adrenérgico, realizando bloqueio
competitivo de receptores α-1 e α-2 (BEXIS et al., 2008). Na presença de
guanetidina somada à fentolamina, PHY-N não foi capaz de induzir contrações. Tais
dados indicam que o efeito contrátil do extrato de PHY-N é mediado por fibras
noradrenérgicas. Este achado provavelmente revela também que o mecanismo de
ação deste extrato protéico é noradrenérgico. Esta hipótese foi reforçada com os
experimentos com a administração de fentolamina sozinha que também bloqueou
significativamente a contração induzida por PHY-N. Clemente e colaboradores
(2002), em tecido de glândulas salivares, afirmam que o veneno do escorpião Tityus
serrulatus age sobre o sistema nervoso autônomo, demonstrando participação
adrenérgica, reforçando os nossos resultados.
A sugestão é que o efeito contrátil deste extrato em MVD é mediado por fibras
noradrenérgicas e parece não se tratar de uma ação pós-sinápitca inespecífica
104
(Figura 36). Para reforçar ainda mais esta linha de pensamento, o efeito de PHY-N
foi investigado no mecanismo de contração induzidas por administração de NA
exógena, na ausência de EFS. PHY-N induziu contração semelhante ao induzido por
NA exógena. A contração induzida por PHY-N sofreu aumento em sua amplitude na
presença de NA exógena, porém de forma não significativa. Dessa forma, reforça-se
a participação das fibras noradrenérgicas no mecanismo de ação dessa toxina, já
que distanciam a possibilidade da ação da PHY-N ser diretamente pós-sináptica.
Neste caso, haveria competição pelos receptores α-adrenérgicos e, conseqüente
redução da amplitude da contração. Tal efeito não foi observado. Por tanto,
descarta-se uma interação pós-sináptica com receptores adrenérgicos e também um
efeito miotóxico deste extrato.
Neste sentido, Borja-Oliveira e colaboradores (2003), em seus estudos com
veneno de serpente Bothrops neuwiedii pauloensis (jararaca-pintada), mostraram
que este veneno bloqueou a transmissão neuromuscular sem deprimir a resposta
para a Ach e KCl. Esses achados corroboram com os nossos resultados, que
também sugerem que ação deste extrato protéico não é miotóxico, pois a
miotoxicidade inibe as contrações induzidas por NA exógena, o que não foi
observado em nosso estudo. Dessa forma, reforça-se a hipótese de ação présináptica.
A lidocaína, um bloqueador rápido dos canais de sódio, bloqueou
significativamente a contração induzida por PHY-N. Os canais de sódio
desempenham importante função na iniciação e propagação do potencial de ação
em neurônios eletricamente excitáveis e outras células, como miócitos e células
endócrinas. Estes canais são responsáveis pela fase de subida potencial de ação na
maioria das células eletricamente excitáveis. As comportas dos canais de sódio
abrem quando a membrana celular é despolarizada, levando a um grande influxo de
sódio, e inativam dentro de milisegundos. A comporta-voltagem dos canais de sódio
é formada por subunidade α e por uma ou mais subunidades β. A condução iônica
ocorre nos poros aquosos da subunidade α, e os elementos essências do
funcionamento do canal de sódio (abertura do canal, íon seletividade e inativação
105
Figura 36 – Esquema sugestivo de ação do extrato de Phyllorhiza punctata (PHY-N)
106
rápida, podem ser demonstradas quando as subunidades α são expressas sozinhas.
A co-expressão da subunidade β é requerida para a reconstituição completa das
propriedades dos canais de sódio nativo, como auxiliar estas subunidades a
modificar a cinética e voltagem-dependência das comportas (ou seja, abertura e
fechamento) do canal.
O principal componente do canal de sódio é a subunidade α, que consiste
num agregado de quatro domínios protéicos semelhantes, numa única cadeia
peptídica longa. Cada um dos quatro domínios contem α-hélice que se estendem por
toda a membrana (S1-S6) e os quatro domínios dispõem-se de modo simétrico em
torno de um poro aquoso central (o canal iônico) (YU; CATTERAL, 2003). Estudo
recente apresentou a hipótese de que a alça citoplasmática S4-S5 do domínio IV
(que faz parte da partícula de inativação) é o sítio de ação de lidocaína e da
benzocaína. A lidocaína age, portanto, estabilizando o fechamento do canal pela
partícula de inativação, favorecendo o estado inativado do canal de sódio voltagemdependente (ARAÚJO; DE PAULA; FRACETO, 2008).
Nossos resultados, por tanto, indicam a participação dos canais de sódio
neuronais no mecanismo de ação da PHY-N. Sugere-se que PHY-N aumenta
condutância ao sódio, de modo oposto a lidocaína e semelhante ao mecanismo de
ação da tityus toxina. Dessa forma, este extrato pode ser um importante ativador de
canais de sódio.
Parece, dessa forma, que PHY-N ativa fibras nervosas pré-sinapticamente,
estimulando a liberação do neurotransmissor, que, por conseguinte, ativam o tecido
muscular gerando a contração deste tecido. Conceição e colaboradores (2005),
propuseram afirmativa semelhante para a toxina animal do escorpião Tityus
serrulatus.
Resultados
similares
para
esta
espécie
de
escorpião
foram
demonstrados por outros autores em tecidos diversos (BARHANIN et al., 1983;
YATANI et al., 1988; CONCEIÇÃO et al., 1998). Burnett e colaboradores (1998)
também afirmaram que os venenos marinhos podem afetar particularmente o
transporte de íons de sódio e cálcio, reforçando nossos achados.
107
PHY-N também foi avaliada para sua atividade biológica na fibra nitrérgica
usando
o
corpo
cavernoso
de
camundongo pré-contraído como modelo.
Experimento preliminar com corpo cavernoso de coelho pré-contraído demonstrou
que PHY-N induziu relaxamento neste tecido, indicando, portanto, que PHY-N induz
relaxamento em tecidos pré-contraídos. Em corpo cavernoso de camundongo précontraído, observamos relaxamento semelhante, o que geraria, in vivo, a ereção
peniana do animal. Teixeira e colaboradores (1998) demonstraram que efeito similar
de relaxamento induzido por toxina de escorpião (Tityus serrulatus) foi observado
em corpo cavernoso de coelho pré-contraído. Também, Andrade e colaboradores
(2008), corroborando com nossos achados, observaram efeito semelhante in vivo
induzido pela toxina do veneno da aranha Phoneutria nigriventer.
O curso temporal de relaxamento induzido pela PHY-N em corpo cavernoso
de camundongo pré-contraído com PHE foi calculado demonstrando que PHY-N
apresentou ação inicial relativamente rápida, relaxando o tecido em mais de 50%
nos 10 primeiros minutos. Transcorridos 30 minutos, PHY-N induziu o relaxamento
completo do tecido. Este comportamento em relação ao tempo foi semelhante ao
observado para decaída do efeito da PHY-N em MVD. Este relaxamento em corpo
cavernoso de camundongo pré-contraído pode ser de origem neuronal, endotelial ou
muscular.
Para testar a participação neuronal, o efeito de PHY-N foi estudado na
presença de lidocaína, um bloqueador do potencial de ação neuronal. Na presença
prévia de lidocaína, PHY-N não induziu relaxamento significativo. Este experimento
demonstrou que, semelhante ao exposto em MVD, a resposta relaxante no corpo
cavernoso é de natureza neuronal. PHY-N parece apresentar alta afinidade pelos
canais de sódio, afinidade esta que parece ser superior à da lidocaína. A lidocaína
reverteu prontamente a ação de relaxamento da PHY-N, sem, no entanto, conseguir
manter este efeito.
Para investigar se a ação deste extrato em fibras nitrérgicas ocorre via
liberação do NO nas terminações nervosas no corpo cavernoso que, por
conseguinte, provocam relaxamento da musculatura lisa cavernosa (LUE, 2002;
WERNER et al., 2005), foram registradas as contrações induzidas por PHY-N na
108
presença de L-NAME. Na presença deste inibidor da óxido nítrico sintetase, PHY-N
não foi capaz de induzir o relaxamento. Por tanto, parece que a ação dessa toxina
nas fibras nitrérgica ocorre via liberação do NO. A literatura relata que o relaxamento
induzido pela toxina de escorpião Tityus serrulatus ocorre via liberação de NO
(Teixeira et al., 1998), de forma semelhante aos nossos dados.
Observou-se também que, na presença de L-NAME, PHY-N induziu
contrações em corpo cavernoso de camundongo pré-contraído. Como L-NAME
inibiu a via nitrérgica, sugere-se que PHY-N agiu por via noradrenérgica gerando
contrações no tecido pré-contraído (observados no registro), indicando que PHY-N
induz a liberação de outros neurotransmissores, como os noradrenérgicos, de forma
semelhante ao demonstrado em MVD.
O curso temporal de relaxamento do corpo cavernoso de camundongo
induzidos por PHY-N na presença de lidocaína ou L-NAME, comparado com o
relaxamento induzido apenas por PHY-N, também foi demonstrado. Na presença
prévia de lidocaína ou L-NAME, PHY-N não foi capaz de induzir relaxamento
significativo e esse comportamento foi sustentado ao longo do tempo.
Na preparação frênico-diafragma, a curva cumulativa dose-resposta da PHYN foi realizada demonstrando que PHY-N diminuiu a amplitude das contrações de
forma dose-dependente. A resposta de bloqueio máxima encontrada para PHY-N foi
na concentração de 3.000ng/ mL. A concentração de 1.000 ng/ mL, no entanto,
demonstrou ser o mais potente bloqueador significativo das contrações. Dessa
forma, acredita-se que PHY-N age como um bloqueador na junção neuromuscular
esquelética.
A curva tempo-resposta na preparação frênico-diafragma de camundongo
exibe o curso temporal de bloqueio induzido pela PHY-N comparada com o controle.
Em 10 minutos, PHY-N foi capaz de bloquear significativamente a contração,
mantendo esse bloqueio ao longo do tempo. Tal dado indica que PHY-N pode ser
um potente bloqueador neuromuscular de ação rápida. Estes resultados confrontam
com os dados encontrados com a espécie C. fleckeri, em preparação de frênicodiafragma, que apresentou efeito de contração neste tecido (ENDEAN, 1987). É
109
válido ressaltar que esta última é uma espécie com veneno bem mais potente
(podendo ser fatal) (KONSTANTAKOPOULOS et al., 2009) se comparada com a P.
punctata, que apenas causa queimaduras em seres humanos (MORANDINI et al.,
2005).
Todavia, Ramasamy e colaboradores (2003) demonstraram que o veneno
puro das espécies Chironex fleckeri e Chiropsalmus sp. inibiram significativamente,
tanto direta e quanto indiretamente, as contrações musculares esqueléticas, como
demonstrado por nós. Porém, o estudo dessas duas espécies foi realizado em
preparação neuromuscular de biventer-cervicis de pinto e não na preparação
frênico-diafragma de camundongo.
Para fortificar o dado da PHY-N como um bloqueador neuromuscular,
analisou-se qualitativamente esse efeito através da aplicação de injeções
intramusculares, na pata traseira de pintos de 8 dias de idade, de bloqueadores
neuromusculares ou extrato de PHY-N.
Os bloqueadores neuromusculares administrados foram galamina (6mg/Kg) e
succinilcolina (6mg/Kg). A galamina age pós-ganglionarmente e possui a
propriedade de causar paralisia. Esse bloqueador é da classe dos antagonistas
farmacológicos competitivos, por tanto, age competindo com ACh pela ocupação do
seu receptor, impedindo a despolarização da membrana pós-sináptica. O resultado
desta ação é uma paralisia flácida da musculatura esquelética.
A succinilcolina, por sua vez, é um bloqueador da classe despolarizante e, por
isso, age iniciando a despolarização (bem mais duradoura) da membrana através da
abertura dos canais, camuflando a ação da ACh. Normalmente, na placa motora
terminal da fibra muscular, a ACh liberada interage com os seus receptores, que
estão acoplados aos canais de sódio, provocando mudanças na voltagem. Os
canais de sódio, que são compostos por duas comportas, uma dependente de
voltagem (CDV) e a outra dependente do tempo (CDT), no repouso, mantém a CDV
fechada e a CDT aberta. Quando há o estímulo, a CDV abre e os íons sódio passam
pelo canal porque a PDT já se encontra aberta. Como a ACh é metabolizada muito
rapidamente, a CDT não tem tempo suficiente para fechar e continua aberta.
110
Quando a succinilcolina é utilizada, ela se liga ao receptor como a ACh, porém como
a metabolização não é tão rápida, a CDT se fecha e não entra mais íons sódio pelo
canal. Essa quantidade de Na+ que entra não é suficiente para causar uma forte
contração. Dessa forma, observa-se a ocorrência de pequenas contrações,
denominadas fasciculações, e a conseqüente paralisia da musculatura esquelética,
tornando-a rígida (BERNE; LEVY, 2000; RANGE; DALE; RITTER, 2001).
Após receber injeção de PHY-N, animal apresentou rigidez mais próximo do
local da aplicação da injeção, demostrando que PHY-N age como um bloqueador da
classe despolarizante, como a succinilcolina, iniciando a despolarização da
membrana pela abertura dos canais. Acredita-se que a rigidez mais localizada, e
não generalizada, como vista com a succinilcolina, se deva ao fato de que, talvez,
tenha havido alguma dificuldade de absorção da PHY-N pelo organismo do animal.
A toxina do escorpião Tityus serrulatus, por sua vez, apresenta a toxina gama
(Ts g) como a mais abundante toxina encontrada no veneno desta espécie. Esta
toxina é classificada como β-toxina cuja característica é ligar-se aos canais de Na+
independentemente de suas voltagens e de mudanças de ativação do canal para
potenciais de membrana mais negativo, sem modificar a sua inativação (YANG et
al., 1996; GONÇALVES et al., 2003; CONCEIÇÃO et al., 2005).
A capacidade de compostos polifenólicos, tais como os flavonóides, de alterar
a função e estrutura das proteínas e de desestabilizarem a estrutura tridimensional
de algumas dessas proteínas tem sido relativamente bem descrita (IGLESIAS et al.,
2005). Algumas plantas mexicanas, normalmente utilizadas na medicina popular,
apresentaram uma forte inibição dos efeitos neurotóxicos induzidos pelo veneno de
Centruroides limpidus limpidus em camundongos. (JIMÉNEZ-FERRER et al., 2005).
Vasconcelos e colaboradores (2004) mostraram que o extrato aquoso de Bauhinia
forficata inibiu o efeito letal induzido pela TsTx-V (α-neurotoxina). Assim, observa-se
que algumas frações aquosas ou orgânicas de várias plantas demonstraram um
potencial efeito anti-veneno ou anti-toxina contra todo veneno ou contra algumas
frações isoladas. Uma vez que várias espécies tem sido utilizadas na medicina
popular e este extrato apresenta grande quantidade de compostos polifenólicos,
como a cumarina, flavonóides, objetivou-se investigar se o efeito de morina e de um
111
nova cumarina sintética (7-hidroxi-2-oxo-2H-cromeno-3-carboxílico) sobre a toxina
gama (Ts g), principal neurotoxina encontradas no veneno do escorpião Tityus
serrulatus.
A toxina nativa do escorpião Tityus serrulatus (Tsg N) demostrou efeito de
contração em canal deferente de camundongo (MVD) e ação neurotóxica em
preparação biventer-cervicis. Foram investigadas as possíveis alterações nestes
efeitos induzidos pelas toxinas modificadas com cumarina (Tsg C) e morina (Tsg M)
quando comparadas à toxina nativa.
Nos ductos deferentes de camundongo eletricamente estimulados, um
modelo de neurotransmissão autonômica, Tsg N induziu um rápido início de
hiperexcitabilidade autonômica, provavelmente devido ao aumento da liberação do
transmissor dos nervos simpáticos. Quando comparadas às toxinas modificadas,
ambos os compostos não induziram uma clara ou evidente isenção desta atividade
farmacológica. Resultado semelhante ao observado por nós com a Tsg N também
foi verificado por Conceição e colaboradores (2005), onde as β toxinas
apresentaram efeito máximo de contração entre 1 a 2 minutos. Todavia, esses
autores não trabalharam com toxinas modificadas.
Em Alves (2008) observou-se efeito antagônico da ação da toxina gama em
MVD. Neste trabalho, doses menores do veneno promoveram relaxamento do
órgão, enquanto que doses maiores provocaram aumento da amplitude das
contrações. É válido ressaltar que nesse estudo não houve experimentos com
toxinas modificadas. Este efeito de relaxamento produzido por doses menores não
foi observado por nós, apesar do efeito de aumento da amplitude das contrações em
doses maiores ter sido semelhante. Essa contração com a administração de doses
mais altas pode ter ocorrido devido à ativação dos receptores α-adrenérgicos. Essa
evidência se fortifica visto que na presença de um bloqueador α-adrenérgico, a
fentolamina, a contrações induzidas pelas toxinas modificadas (tanto para Tgs C
como para Tgs M) foram significativamente abolidas.
A amplitude máxima de contração tônica evocados por 300 ng/mL de Tsg N
não apresentou diferença significativa quando comparadas com as contrações
112
atingidas com Tsg M e com Tsg C. A Tsg M, no entanto, demonstrou ser o mais
potente indutor de aumento significativo do tônus a 100 ng/ mL.
A Ts g nativa (Tsg N) induziu hiperexcitabilidade autonômica, demonstrando
"picos" e, após o disparo aberrante, as contrações neurogênicas foram abolidas (em
aproximadamente 20min após o pico de atividade).
O
bloqueio
da
neurotransmissão
cinética
após
um
período
de
hiperexcitabilidade foi registrado. O tempo de queda do efeito da toxina nativa foi
entre 15 e 20 minutos. Decaída rápida do efeito da toxina foi observado de forma
semelhante por Conceição e colaboradores (2005). Não houve significativas
alterações induzidas por tratamento com morina ou cumarina em tempo necessário
para completar o bloqueio da neurotransmissão pela toxina gama.
Na verificação da participação dos canais de sódio nas contrações induzidas
por essas toxinas modificadas em MVD, foram feitos registros das contrações
induzidas pela Tsg C ou Tsg M, na ausência de estimulação nervosa, e na presença
de lidocaína. As contrações induzidas tanto por Tsg C como por Tsg M foram
significativamente bloqueadas quando comparados às contrações induzidas por Tsg
N. Tais resultados demonstram que as toxinas modificadas não alteram a
característica da toxina nativa, uma β-toxina, de ligar-se aos canais de Na+;
característica já bem estabelecida na literatura (YANG et al., 1996; GONÇALVES et
al., 2003; CONCEIÇÃO et al., 2005).
Na avaliação da participação dos receptores α-adrenérgicos nos efeitos das
contrações induzidas pelas frações modificadas Tsg C e Tsg M observou-se que as
contrações induzidas por essas toxinas modificadas foram significativamente
bloqueadas na presença da fentolamina, reforçando a hipótese de participação das
fibras noradrenérgicas no mecanismo de ação dessa toxina. Tais resultados
corroboram com os dados apresentados por Alves (2008) para a toxina nativa.
No segundo conjunto de experimentos com a preparação de músculo
biventer-cervicis, analisou-se os efeitos neurotóxicos do ensaio. Para isso,
contrações através da aplicação exógena de acetilcolina (ACh, 55 ou 110µM por
113
60s) e KCl (5mM para 120-130s) foram obtidos na ausência de estimulação nervosa
antes da adição de toxinas modificadas e não modificadas.
Os efeitos neurotoxicidade observados com o tratamento com a Tsg M ou Tsg
C não modificou os efeitos neurotóxicos, mas a Tsg C mostrou um atraso no início
dos efeitos neurotóxicos, quando comparados com os as Tsg M, todavia o efeito
final não foi significativamente diferente.
Resultados
cedidos
pelo
professor
Doutor
Marcus
Hikari
Toyama
demonstraram que ambos os compostos, morina anidrosa e cumarina sintética,
apresentaram um discreto caráter hidrofóbico, apresentando um aumento relativo da
massa molecular da toxina nativa (Tsg N) após o tratamento com morina ou
cumarina. Ts g N apresentou uma massa molecular de 6.872,13 Da e as toxina
tratados com morina e cumarina apresentaram uma massa molecular de 7.277,81
Da e 7.381,32 Da, respectivamente. A toxina nativa apresentou também a presença
de grandes estruturas espiraladas aleatórias e quantidade moderada de folha beta e
pequena quantidade de alfa hélice.
O tratamento da Ts g tanto com morina como com cumarina induziu uma
proteína desnovelada moderada ou forte, mas não levou a desnaturação de Ts g.
Em caso de cumarina, observou-se um grande aumento da espiral aleatória desta
proteína. Estes resultados mostram que morina e cumarina induziram um
desnovelamento parcial da estrutura da proteína, sugerindo que morina e cumarina
realmente estão ligadas à estrutura da proteína. Esta adição desses compostos
polifenólicos sobre a Ts g foi claramente demonstrado pela mensuração da
fluorescência de proteínas antes e após incubação com estes dois compostos,
deixando claro que morina e cumarina gera um discreto ou evidente desdobramento
da T g, e este efeito está em conformidade com outras proteínas tratadas com
compostos polifenólicos (KANAKISA; TARANTILISA; POLISSIOUA, 2006; ZHUA et
al., 2007).
Todavia, apesar das mudanças conformacionais, em ambos os casos, não foi
observado uma supressão ou alteração dos efeitos farmacológicos induzidos por
Tsg N. Estes resultados sugerem que o núcleo hidrofóbico dessas proteínas não é
114
crucial para a atividade farmacológica das mesmas. A análise estrutural dessa
proteína mostraram a presença de outros importantes e potencias regiões para a
interação de Ts g com os receptores (POLIKARPOV et al., 1999; PINHEIRO et al.,
2003). Estes resultados sugerem que outras regiões moleculares da Ts g devem ser
importantes para a sua ação.
115
7. CONCLUSÃO
• Extrato de Phyllorhiza punctata (PHY-N) induz contrações em tecidos
músculares em tônus basal (canal deferente de camundongo) e induz
relaxamento em tecidos pré-contraídos (corpo cavernoso de coelho e
camundongo).
• Acredita-se que o efeito contrátil da PHY-N é pré-sináptico e mediado por
fibras noradrenérgicas em canal deferente (MVD).
• Há participação dos canais de sódio neuronais no mecanismo de ação
contrátil da PHY-N em MVD.
• A resposta relaxante da PHY-N no corpo cavernoso é de natureza
neuronal.
• PHY-N parece apresentar alta afinidade pelos canais de sódio, afinidade
esta que parece ser superior à da lidocaína.
• PHY-N parece ser um importante ativador dos canais de sódio,
aumentando a condutância para este íon.
• O efeito relaxante da PHY-N em corpo cavernoso de camundongo ocorre
via liberação do óxido nítrico.
• PHY-N, em doses elevadas, age como um bloqueador neuromuscular
esquelético, não cessando esse efeito de bloqueio ao longo do tempo.
• PHY-N age como um bloqueador da classe despolarizante, como a
succinilcolina in vivo.
• A toxina nativa do escorpião Tityus serrulatus (Tsg N) demostrou efeito de
contração em canal dferente de camundongo e ação neurotóxica em
preparação biventer-cervicis.
116
• As toxinas modificadas com morina (Tsg M) e cumarina (Tsg C), apesar
das mudanças conformacionais, não apresentaram supressão ou alteração
dos efeitos farmacológicos induzidos por Ts g.
• Tsg N induziu um rápido início de hiperexcitabilidade autonômica e as
toxinas modificadas não induziram uma clara ou evidente isenção desta
atividade farmacológica.
• Tsg N apresentou decaída rápida de efeito, após amplitude máxima, e não
houve significativas alterações induzidas por tratamento com morina ou
cumarina.
• As contrações induzidas por Tsg C e Tsg M foram bloqueadas na presença
de fentolamina e lidocaína, demonstrando que as toxinas modificadas não
alteram a característica da toxina nativa de possuir ação pré-sináptica e de
ligar-se aos canais de Na+ e ser mediada via adrenérgica.
• Não houve modificações nos efeitos de neurotoxicidade observados com
tratamento com a Tsg M ou Tsg C.
• As toxinas modificadas c/ morina e cumarina, apesar das mudanças
conformacionais, não apresentaram alteração dos efeitos farmacológicos
induzidos por Ts g.
117
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136
Anexos
ANEXO 01
Poster 7. IX Symposium of the Brazilian Society on Toxinology. J. Venom. Anim.
Toxins incl. Trop. Dis., 2007, 13,1, p.265
THE EFFECT OF THE TOXIN Phyllorhiza punctata IN MOUSE VAS DEFERENS
VASCONCELOS R.F. (1), AGUIAR F.L. (1), TOYAMA D.O. (2), FONTELES M.C.
(1), SANTOS C.F. (1), NASCIMENTO N.R.F. (1)
(1) ISCB, University State of Ceará; (2) UNESP
The Phyllorhiza punctata species (Stomolophidae) was discovered in the Brazilian
coast in middle of the decade of 1950. This species were collected during periods of
low tide by free diving at different rocky shores of the São Vicente Channel on the
southern coast of Sao Paulo, Brazil. The Tentacles were removed from body,
imemersed in ice-cold aqueous solution of 0,1%TFA and subjected to three cycles of
freezing. After that, the solution was centrifuged and the supernatant was
filtered,centrifuged and submainted to desalting and final cleaning. Then this extract
was conncentrated by lyophilization. In preliminary experiments this extract (PHY-N)
showed mouse vas deferens (MVD) contraction effect. To investigate whether the
increase of neurogenic contractions in MVD induced by PHY-N was dependent on a
post-synaptic mechanism a1-adrenergic, the following protocol was used. Albinic
Swiss mice had been sacrificed by cervical displacement and vas deferens had been
removed. A segment of approximately 1 cm of length was removed of the prostate
portion and chemical preparation in organic chamber that contained solution of Krebs
for vas deferens. PHY-N was evaluated for its biological activity in the autonomic
neuromuscular junction by using the eletrical stimulated MVD as a model. A
cummulative concentration-response curve (0.1 to 1000 ng/mL) was perfomed for
each fraction in separated protocols. The EC50 was determined by non-linear
regression and the result showed the 1,172 µg/mL value. The contractions elicited
after exposition to exogenous noradrenaline (NA; 10 mM; n=6), were analyzed in the
absence or presence of the EC50 of the fraction. The results showed that contraction
induzed by NA (72,3±19,7) was not significantly altered by PHY-N (96,0± 22,2).
137
Suggesting that contraction induced by PHY-N was not dependent on a post-synaptic
mechanism a1-adrenergic.
KEY WORDS: Phyllorhiza punctata, mouse vas deferens.
FINANCIAL SUPPORT: FUNCAP, CAPES, CNPq
CORRESPONDENCE TO:University State of Ceará. Av. Paranjana, 1700, Fortaleza
– CE, CEP: 60.740-903
138
ANEXO 02:
Artigo científico na versão inglês, oriundo dessa dissertação, para submissão em
revista científica.
Effect of 7-hydroxy-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylic acid and
anhydrous morin on the toxin gamma from Tityus serrulatus.
Toyama, M.H.1*, Aparício R.2, Boschero, A.C.3, Toyama, D.O.4, Alvim Jr. J.5, Corrêa,
A.G.5, Vasconcelos-Carneiro, R.F.6, Aguiar, F.L.N.6,Fonteles, M.C.4,6, Nascimento,
N.R.F.6.and Santos, C.F.6
1UNESP, Campus do Litoral Paulista , São Vicente; 2Instituto de Química,
UNICAMP, Campinas; 3Departamento de Fisiologia e Biofísica, IB, UNICAMP,
Campinas; 4Faculdade de Ciências Biológicas, Exatas e Experimentais,
Universidade Mackenzie; 5Departamento de Química, UFSCar, São Carlos; 6
Instituto Superior de Ciências Biomédicas, UECE, Fortaleza-CE.
*Corresponding author:
Marcos Hikari Toyama
UNESP, Campus do Litoral Paulista
Phone: +55 13 3569-9433
Fax: +55 13 3469-9402
e-mail: [email protected]
139
Abstract.
In the present work we showed the results of coumarin (7-hydroxy-2-oxo-2Hchromene-3-carboxylic acid) and morin on the structure and function of toxin gamma
(toxin δ or Ts g).
Both polyphenolic compound used here showed moderate
hydrophobic character that allowed inserting on the hydrophobic pocket of the Ts g.
The treatment of this Ts g with coumarin decreased significantly the α-helix structure
and coumarin increase the β-sheets and the randon coil structure whereas morin
showed a marginal modification. The Mass spectrometry measuring showed that
one molecule of morin and two molecule of coumarin have been incorporated to the
mass of Ts g. These results were confirmed by increasing of fluorescence of the Ts
g incubated with morin and coumarin. Even though all these modification observed
we did not observed significant qualitative change in the pharmacological effect
elicited by isolated native or modified protein. The divergence of the results between
morin and coumarin treatment to allowed speculate that both compound should be
act on the same hydrophobic pocket of Ts g but by two different manner. Thus we
conclude that all pharmacological action carried out by this neurotoxin (Ts g) and
maybe other scorpion toxins are mainly dependent on the ability of some loops to
interact specifically with receptors and the final attachment or stabilization of these
toxin with receptors occurs a independently the presence of hydrophobic interaction
of hydrophobic core of these proteins, such observed for other scorpion neurotoxins.
Key word: scorpion toxin, coumarin, flavonoid, Tityus serrulatus and scorpion
venom.
140
1. Introduction.
The ability of polyphenolic compound to modify the function and structure of
proteins has been described for sPLA2 and the ability of some polyphenolic
compound, such as flavonoid to disestablishing the three-dimensional structure of
some proteins such as PLA2 and other has been relatively well described (Iglesias et
al., 2006). Other important polyphenolic compound that showed a potential against
snake venom sPLA2 is found to umbelliferone (Toyama et al., 2009).
Uawongglul et al., (2006) showed that organic extract from
Andrographis
paniculata, Barringtonia acutangula, Calamus sp., Clinacanthus nutans, Euphorbia
neriifolia, Ipomoea aquatica, Mesua ferrea, Passiflora laurifolia, Plectranthus
amboinicus,Rumex sp., Ricinus communis and Sapindus rarak has a different
potence degree to inhibit the toxic effect of Heterometrus laoticus scorpion venom.
Some mexican plant normaly used in the folk medicine of Mexico showed strong
inhibitory effect neurotoxic effect induced by Centruroides limpidus limpidus venom in
mice. (Jiménez-Ferrer et al., 2005; Vasconcelos et al., 2004) showed that aqueous
extracts of Bauhinia forficata inhibited the lethal effect induced by TsTx-V (α-sodium
neurotoxin).
Thus we observed that some aqueous or organic fraction of several planta
showed a potential antivenom or antitoxin effect agains whole venom or some
isolated fraction. Since several specied used has been known in the folk medicine
and these extract have great amount of polyphenolic compound such as coumarin,
flavonoids. In this article.we investigate the effect of morin and a novel synthetic
coumarin (7-hydroxy-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylic acid) on the main neurotoxin
found in the Tityus serrulatus venom, toxin gamma (Ts g).
2. Material and Methods.
2.1. Animals.
Albino Swiss mice, weighing between 30 and 40g, were obtained from the
Superior Institute of Biomedical Sciences animal facility having free access to water
and food. The protocols of the present study followed the ethical guidelines from the
Brazilian College of Animal Experimentation and were approved by the local
committee.
141
2.2. Venoms, reagents and drugs.
Venom fom the Tityus serrulatus was kindly donate by the Instituto Butantan
(São Paulo, Brazil). Morin was obtained from the Sigma Co., Ltd. (USA) and the
coumarin 7-hydroxy-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylic acid) was synthesized at the
Chemistry Department of Federal University of São Carlos according to described by
Alvin Jr., et al., 2005. Solvents, chemical and other ACS or high purified reagents
used for protein purification and protein modification and characterization were HPLC
grade or higher were acquired from Sigma-Aldrich chemicals (USA), Merk (USA) and
Bio-Rad (USA). The Ts g were isolate as described by Marangoni et al., 1995 and
Polikarpov et al., 1999, using a ion exchange chromatography (SP5PW, 0.78 x 8cm).
The homogeneity of the Ts g was confirmed by reverse phase HPLC, Tricine sodim
dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis and by MALD TOF mass
spectrophotometer. ATP, phentolamine, morphine, noradrenaline, tetrodotoxin,
charbamylcoline and tetrodotoxin were purchased from Sigma/Aldrich Chemical
Company (St. Louis, MO, USA).
2.3. Incubation of Ts g with morin and coumarin.
The incubation of Ts g with anhydrous morin (M) (mol : mol) and with
coumarin
(7-hydroxy-2-oxo-2H-chromene-3-carboxylic
acid,
C)
followed
the
procedures described by Iglesias et al. (2005). Basically morin of coumarin was
dissolved in dimethylsulphoxide (DMSO), the concentration of which during
incubation never exceeded 1 %. 10 µL of morin or coumarin solution (100 nM) were
added to 1000 µL of homogenized solution of purified Ts g (1.5 mg, 250 µM). The
mixed solution was incubated for 60 min in a water bath at 37˚C. 200-µL samples of
this mixture were loaded onto a preparative reverse phase HPLC column to separate
the treated toxin Ts g M (toxin gamma after incubation with morin) or Ts g C (toxin
gamma after incubation with coumarin) from anhydrou morin or coumarin. Using the
same chromatographic condition, 200 µL of toxin gamma native (Ts g N) analyzed.
After column equilibration with HPLC buffer A (aqueous solution of 0.1 % TFA),
samples were eluted using a discontinuous gradient of HPLC buffer B (66.6 % of
Acetonitrile in 0.1 % TFA) at a constant flow rate of 2.0 mL. min-1, the
chromatographic run being monitored at A214 nm for detection of Ts g N, Ts g C and
142
Ts g M. In addition each chromatographic run were monitored using a PDA HPLC
detector.
The resulting native toxin gamma was termed Ts g and its purity degree was
evaluated by Tricine SDS-PAGE and mass spectrometry on a MALDI-TOF mass
spectrometer, as previously described (Toyama et al., 2003 and Toyama et al.,
2005).
2.4. Spectroscopic analyses.
2.4.1. Circular dichroism spectroscopy.
Purified toxin - native (Ts N) and anhydrous morin-treated Ts g (Ts g M) and
coumarin treated Ts g (Ts g C) – were dissolved in 10 mM sodium phosphate buffer
(pH 7.4) and final protein concentrations were adjusted to 8.7 mM.
After
centrifugation at 4000 g for 5 min, samples were transferred to a 1 mm path-length
quartz cuvette. Circular dichroism spectra in the wavelength range 185–300 nm
were acquired inhouse with a J720 spectropolarimeter (Jasco Corp., Japan) using a
bandwidth of 1 nm and a response time of 1s. Data collection was performed at
room temperature, with a scanning speed of 100 nm. min-1. Nine scans were
accumulated for each sample and all spectra were corrected by subtraction of buffer
blanks. The CD spectra are expressed in theta machine units in millidegrees.
2.4.2. Intrinsic fluorescence.
The relative intrinsic fluorescence intensity of native Ts g or Ts g M or Ts g C
were monitored with a Shimadzu spectrofluorimeter. 2.0-mL reaction mixtures in 1
cm path length quartz cuvette consisted of 100 mM Tris–HCl buffer (pH 7.4), Ts g N,
Ts g C and Ts g M (200 µg. mL-1) and 5 mM calcium. Fluorescence was measured
between 300 and 450 nm after excitation at 280 nm.
2.5. Pharmacological characterization.
2.5.1. Insulin secretion.
143
Rat islets were isolated by collagenase digestion of the pancreas (Bordin et
al., 1995). For static secretion, groups of five islets were first incubated for 45 min at
37 ºC in Krebs-bicarbonate buffer of the following composition (in mmol/L): 115 NaCl,
5 KCl, 2.56 CaCl2, 1 MgCl2, 10 NaHCO3, 15 HEPES, and 5.6 glucose, supplemented
with 3 g of bovine serum albumin/L and equilibrated with a mixture of 95% O2–5%
CO2, pH 7.4. The medium was then replaced with fresh Krebs-bicarbonate buffer and
islets incubated for an additional 1 h with medium containing different concentrations
of glucose in the absence or presence of native or treated protein (5µg/mL). The
insulin content of the medium at the end of the incubation period (60 minutes in the
presence of native or treated toxin) was measured by radioimmunoassay (Scott et
al., 1981).
2.5.2. Neurotoxic effect assay.
Male chicks (4-8 days old) were killed with ether and the biventer cervicis
muscle was removed (Ginsborg and Warriner, 1960) and mounted under a resting
tension of 1 g in a 4 ml organ bath containing aerated (95% O2 + 5% CO2) Krebs
solution (pH 7.5, 37 ºC) of the following composition (mM): 118.7 NaCl, 4.7 KCl, 1.88
CaCl2, 1.17 KH2PO4, 1.17 MgSO4, 25.0 NaHCO and 11.65 glucose.
A bipolar
platinum ring electrode was placed around the tendon, which ran the nerve trunk
supplying the muscle. Indirect stimulation was applied with a Grass S4 stimulator
(0.1 Hz, 0.2 msec, 3-4 mV). Muscle contractions and contractures were recorded by
connecting the preparation to a force displacement transducer (Narco Biosystems
Inc) coupled to a Gould RS 3400 recorder. Contractures to exogenously applied
acetylcholine (ACh, 55 or 110 µM for 60 s) and KCl (5 mM for 120–130 s) were
obtained in the absence of nerve stimulation prior to the addition of modified and
non-modified toxin (5 µg/ml) and at end of the experiment. The preparations were
allowed to stabilize for at least 20 min before the addition of ACh or KCl and a single
concentration (5 µg/ml) of the compounds.
2.5.3. Isolated mouse vas deferens.
The mouse vas deferens setup was mounted as described by Hughes et al.,
1975. Briefly, after sacrification of albino Swiss mice by cervical displacement, 1 cm
lenght prosthatic segments of vas deferens were dissecated and carefully cleaned of
surrounding tissues. Thereafter, the tissue was vertically suspended between two
144
parallel platinum electrodes under a resting tension of 0.3g in a modified Krebs
solution (pH 7.4; 37 ºC and gassed with 95% O2 and 5% CO2), with zero nominal
concentration of Mg2+ containing in mM: NaCl 118, KCl 4.75, CaCl2 2.54, KH2PO4
0.93, NaHCO3 24, glucose 11, EDTA 0.027, ascorbic acid 0.1. The tissues were
attached to an isometric force-displacement transducer (F-60 Narco Biosystems,
Houston, TX, USA) coupled to a multichannel recorder (Narco Biosystems). After a 1
hour equilibration period with 15 min wash intervals, contractile responses were
induced by transmural eletrical field stimulation (EFS) with submaximal square waves
pulses (1ms lenght and 0.1Hz frequency). The effect of venom fractions and control
drugs were expressed as a percentage of the twitches amplitude before addition of
the test compounds. The neurogenic nature of twitches were comproved by the
complete blockade after 0.3µM tetrodotoxin exposition (Rae and Calixto, 1990) and
the main noradrenergic component of this twitches were proved by 100 µM
phentolamine in the same way (Perry, 1970).
2.6. Antibacterial Activity.
Antibacterial activity of native and chemically treated toxin g was conducted
following the method described by Oliveira et al., 2008.
Briefly, Xanthomonas
axonopodis. pv. passiflorae (Gram-negative) bacterial strain and Clavibacter
michiganensis michiganensis (Gram-positive) bacterial strain were harvested from
fresh agar plates and suspended in distilled sterilized water (A650nm = 0.3/ cc
103CFU/ml). Aliquots of the bacterial suspension were diluted to 10-5 CFU/ml and
incubated with Ts g N, Ts g M and Ts g C (65 µg/ ml) for 1 h at 37 ºC; after
incubation, survival was assayed on nutrient (Difco) plates (n=5).
2.7. Three-dimensional structure of PLA2.
The 3D structure of Ts g was determined by comparative homology modelling
from the models of PDB. This allowed the observation of a model of the native toxin.
2.8. Statistical analyses.
145
The results were reported as the means ± SEM of n experiments. The
significance of differences between means was assessed by analysis of variance,
followed by a Dunnett’s test when several experimental groups were compared with
the control group. The confidence limit for significance was 5% (p>0.05).
3. Results.
Purified Ts g and other Ts g chemically treated with anhydrouns morin (Ts g
M) and treated with coumarin (Ts g C) were analyzed by reverse phase HPLC. At
shown in the figure 1, we observed a clear increasing of hydrophobic character of the
Ts g after treatment with anhydrouns morin or coumain (7-hydroxy-2-oxo-2Hchromene-3-carboxylic acid). Beyond this chromatographic shift of native Ts g in
comparison with Ts g M or Ts g C, we observed also a discrete change of 280nm
region by UV scanning from the 200 to 300nm (inserts of figures 1a, 1b and 1c).
Since the both compound anydrous morin and synthetic coumarin showed a
discret hydrophobic character, we permerfomed some spectroscopic anaysis using a
Mass spectrometry that showed an relative increasing of the molecular mass of
native Ts g after treatment with morin or coumarin. Following the analysis of fig.2a,
native toxin (Ts g N) presented a molecular mass of 6872.13 Da whereas the toxin
treated with morin and coumarin presenting a molecular mass of 7277.81 Da and
7381.32 Da, respectively.
Circular discroism measurement of native toxin showed the presence of large
random coil strucutre and moderate amount of betha strand and small amount of
alpha helix, which these last form a hydrophobic pocket of Ts g. Treatment of Ts g
with morin did not induced a so evident changes induced by treatment of Ts g with
coumarin (Fig. 2b), both anhydrouns morin and coumarin induce a moderate or
strong protein desnovelation but did not lead to desnaturation of Ts g. In case of
coumarin, we observe a high increase of random coil of this protein.
Increasing of fluorescence of Ts g C or Ts g M in comparison with Ts g native
(Ts g N) is shown in the figure 2c. The fluorescence of native Ts g is due the intrinsic
fluorescence of tryptophan found in its structure. In case of Ts g M or Ts g C we
observed a summation of fluorescence of tryptophan togheter the fluorescence of
morin (Ts g M) or coumarin (Ts g C). These results corroborate the results from the
mass spectrometer measurement in figure 2a.
Previously work performed with Marangoni et al., (1995) and Gonçalves et al.,
(2003) proved that isolated beta cells isolated from the pancreatic islets of rodents is
146
good model for evaluate the action of scorpion toxin.
In the high glucose
concentration we observed that Ts g potentiate the insulin secretion. Ts g treated
with morin (Ts g M) statistically did not show differences with Ts g native. But,
coumarin treatment strongly decrese this effect induced by native Ts g (Fig. 3a). In
the case of the neurotoxicity effects, the treatment of the toxin with morin or coumarin
did not modify the neurotoxic effect, but the analysis of Figure 3b, shows that
coumarin-treated Ts g showed a delayed onset of the neurotoxic effect when
compared with native and morin treated-toxin, but the final effect was not significantly
different.
Native Ts g (Ts g N) induced autonomic hyperexcitability inducing “spikes” and
after aberrant firing the neurogenic contractions were abolished (≈ 20min after peak
activity) (Fig. 4a). The maximal amplitude of tonic contraction evoked by 300 ng/mL
Ts g N was 200 ± 33.3 % compared to 408 ± 50.7% (p<0.05 compared with Ts g
alone) attained with Ts g conjugated with morin or 296 ± 92.2 with cumarine
conjugated Ts g (fig. 4). The morin conjugated derivative of Ts g was shown to be
more potent inducing significative increase in tonus at 100 ng/mL (336.7 ± 49.6 %;
p<0.05 vs. Ts g alone and with Ts g conjugated with coumarine (Ts g C) (Fig. 4b).
The kynetics for neurotransmission blockade after a period of hyperexcitability is
depicted in figure 4c.
The was no significant alterations induced by morin or
coumarin treatment in the time necessary for complete block of neurotransmission by
toxin g.
Antimicrobial effect of some scorpio neurotoxins have been described and
some of these toxin showed antibacterial and antiparasite activity such case of
charybdotoxin. Some reports showed that atimicrobial effect did not dependent of its
neurotoxic effect. In this article we investigate the antibacterial effect of Ts g on the
two well stablished model by our research group using a Xanthomonas axonopodis
pv passiflorae (Gram negative) and Clavibacter michiganensis michiganensis (Gram
positive). The antibacterial activity showed that Ts g induce a moderate antibacterial
activity against Gram negative strain and higly against Gram positive (Fig. 5a and
5b). This effect were strongly inhibited by previous treatment of Ts g with morin or
coumarin (Fig. 5a and 5b). The structural analysis of Ts g with charybdotoxin and
other antimicrobial peptides showed the presence of conservation of the gamma core
(GXC.....C) found in severel antimicrobial activity.
147
The 3D model of Ts g showed in Figure 6a showed the presense of B and J
loop and the C-terminal loop and in 6b we showed the hydrophobic core of this
protein. In 6c, we found the structural similarities between gamma core of fond in the
charybdotoxin and in Ts g.
4. Discussion.
Toxins δ (Ts g) is the most abundant protein found in the Tityus serrulatus
venom and has several common features such as presence of four disulfide bridges,
three β sheets and α helix structure. This toxin are classified as β-toxin that binds to
Na+ channels independently of its voltage and shift of channel of channel activation
to more negative membrane potentials without modifying its inactivation (Catterall,
2000, Yang et al., 1996 and Gonçalves et al., 2003). The pharmacological activity of
the β scorpion sodium neurotoxin is droved by some conditions that are crucial to
allow the correct interaction of these toxins with sodium channel. Firstly, the positive
electrostatic potential at the N terminus provide by the N-terminal β-amino group and
by Lys/ Arg in the position 1; one second condition is the presence of positively
charged groups in position 12 (in β toxins), one third requirement would be the
presence of the negative potential of Glu/ Asp2; the last condition for interaction of
the β-toxin with sodium channels is the presence of conserved aromatic cluster are
important for their activity (Fontecilla-Camps et al., 1982 and 1988 and Sun et al.,
2003).
Our results clearly showed that morin and coumarin induce a partial
desnovelation of protein structure as shown by CD spectra and these results suggest
that morin and coumarin binds to protein structure as shown by mass spectrometry
analysis. This addition of these polyphenolic compound on the Ts g is cleary shown
by measuring of fluorescence of protein before and after incubation with these both
compounds and also induced a discrete increasing of UV-Vis spectra scanning.
Since both compound are characterized as hydrophobic compound it possible
that both compound binds in the hydrophobic core of the protein, where found the
main secondary structure of protein such as α helix and β strands and probably the
interaction of this compound with these structures induced a discrete change of the
alpha helix and beta strands content as shown by CD spectra in case of morin. But
in case of synthetic coumarin these changes was most evident and wat three higher
than to morin. This slight discrepancy between both polyphenolic compounds should
148
be due the their structural characteristics.
da Silva et al., 2004 demostranted
influence of electronic, steric and hydrophobic properties of some flavonoid
compounds can be inhibit the xanthine oxidase by difference mode and intensity.
Kanakisa et al., 2006 investigated the effect of binding of some antioxidant flavonoids
with Human serum albumin (HSA). According to their finding flavonoids can be form
a stable complex with HSA and the molecular interaction between the flavonoid with
HSA involves both H-bonding and ionic interactions via ring OH groups, which can
interact with protein amino groups more effectively. Kanakisa et al., 2006 and Zhua
et al., 2007 showed that flavonoid complexation causes protein unfolding that leads
the inhibition of enzyme catalysis. Our resuls showed that morin and coumarin leads
a discrete or evidente unfolding of Ts g and this effect is accordance with other
protein treated with polyphenolic compound.
In both cases, we did not observed a abolishment of the pharmacological
effect but solely a moderate or strong decrease of the pharmacological effect induced
by Ts g. These results suggest that hydrophobic core in these protein is not crucial
for the pharmacological actvity of this protein. The structural analysis of this protein
showed the presence of other important and potential region for interaction of the Ts
g with receptor (Polikarpov et al., 1999 and Pinheiro et al., 2003).
In the electrically driven mouse vas deferens, a model of autonomic
neurotransmission, Ts g induced a rapid onset autonomic hyperexcitability probably
due burst of transmitter release from sympathetic nerves. This results suggest that
both compoud did not induce a clear or evident dimishing of this pharmacological
activity. This is evident for insulin secretion, neurotoxic activity.
This results suggest that other molecular region in the Ts g should be
important for this effect including the loop found in the toxin structure. The presence
of some basis amino acid residues in this C-terminal region has been described as
crucial for interaction of the toxin with some neurotoxic receptor. In case of some αlike scorpion toxins, this region comprose a long amino acid sequence that involve in
the specific interaction with cell receptor (He et al., 1999). The similar profile was
described by Darbon et al., 1983 and Granier et al., 1989, where that demostranted
the implication of the presence of this region in some scorpion neurotoxin as crucial
region for toxin-receptor interaction. This region has a particular molecular profile that
differ from the others α and β scorpion neurotoxin (Polikarpov et al., 1999).
149
Finally, the presence of K(52), R(56) and K(60) in this region and the peculiar
orientation of this C-terminal region suggest that these amino acid residues as the
orientation of this region should be crucial for toxin-receptor interaction. Mantegazza
and Cestèle (2005) showed that interaction and physiological effect induced for some
β-scorpion toxin is drived by electrostatic interaction between the toxin and some
acid amino acid of domain II of voltage-dependent sodium channels.
Recently
some
scorpion
neurotoxinc
has
been
characterized
antimicrobial peptides against bacteria, fungi and parasites.
as
a
THe antimicrobial
peptides has been classified in with or without didulfide brigeds. In both cases these
peptides has some comon features that contribute to their antimicrobial action
indluding small size (less 10 kDa), presence of cationic charge (pI 7 to 10) and
amphipathic
stereogeometry,
conferring
relatively
hydrophobic facets (Yeaman and Yount, 2003).
polarized
hydrophilic
and
All these antimicrobial peptides
despite the huge strucutural variation showed the presence of γ-core motif, which
has been considered a comum core motif across these peptides. Yet the presence
of this core is not necessarily an exclusive structural determinant of antimicrobial
activity. In some cases, the γ-core alone is sufficient for antimicrobial activity such in
case of charybdotoxin that exerted direct antimicrobial activity against bacteria and
Candida albicans (Yount and Yeaman, 2004). The structural analysis of the Tsg and
charybdotoxin showed that γ-core motif comprise the presence of two atiparalle beta
strand as shown in the figure 6c. All strucutural results suggest a interactin of these
compound with the Tsg strucuture, since the hydrophobic nature of these compound
it possible that morin or synthetic coumarin to interact with the hydrophobic core of
protein (Fig. 6b), which includes two beta strand.
This results allowed to conclude that Ts g and probably other neurotoxins
demostrated the presence of two biologically and distinct regions. The antimicrobial
region is clearly dependent of the integrity of the some second structures sucha as
two antiparalle β strands and the pharmacological effect is mainly driven by presence
of C-terminal domain that is not strongly affected by incubation of Ts g with morin or
coumarin. Buth in this case is not possible to exclude completely of the participation
of the hydrophobic core.
5. Acknowledgements.
150
The authors are grateful to the Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de
São Paulo (FAPESP), Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível
Superior (CAPES) and Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e
Tecnológico (CNPq) for financial support.
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154
ANEXO
Figure 1. C18 analytica HPLC chromatogram of the native toxin g (Ts g N) and the Ts
g previously incubated with anhydrous morin (Ts g M) or coumarin (Ts g C). All
these samples were subjected at same chromatographic condition used for
characterization of Ts g N. In addition we analyzed the UV scanning of the Ts g after
incubation with coumarin or morin.
155
Figure 2. (a) shows the molecular mass of the Ts g native (Ts g N), Ts g M and Ts g
C after purification in the C18 HPLC. In Fig. 2b. shows the results of CD spectra of
native Ts g N, Ts g treated with morin (Ts g M) and Ts g treated with coumarin (Ts g
C). CD spectra of native Ts g and Ts g M or Ts g C. Data over the range 185 – 280
nm is shown. The CD spectra are expressed in theta machine units in milli degrees.
(c) we observed the fluorescence measuriment of Ts g N, Ts g M and Ts g C.
156
Figure 3. In 3a it had shown the effect of scorpion toxin on the pancreatic β cells, in
presence of 16.7mM of glucose. Native toxin (Ts g N ) as well the toxin treated with
morin (Ts g -M) increase the insulin secretion at similar rate, whereas toxin treated
with coumarin (Ts g -C) decrease the insulin secretion in comparison with native toxin
or toxin treated with morin. In case of the neurotoxic response induced by the tree
compounds only toxin treated with coumarin showed a marginal difference with
native toxin and toxin treated with morin that both induce similar effects.
157
Figure 4. (a) Physiographic recording showing the effect of Ts g (300 ng/mL) on the
eletrically-driven MVD. Vertical calibration=10 mN and horizontal calibration = 15s (b)
Effect of Tityus serrulatus (Ts g) and its derivatives in neurogenic contractions
evoked in mice vas deferens (30V; 0.5ms; 0.1Hz). (c) kinetics of neuronal blockade
after Ts g induced spikes.* p<0.05 vs. Ts g alone, ANOVA followed by Tukey-Kramer
with 5% significance. # p<0.05 vs. Ts g treated with cumarine, ANOVA followed by
Tukey-Kramer with 5% significance.
158
Figure 5. (a) Effect of Ts g on the Gram negative bacterial strain (Xanthomonas
axonopodis pv passiflorae or Xanthomonas) and incubated with Gram positive
bacterial strain (Clavibacter michiganensis michiganensis or Clavibacter). Under
same condition the Ts g treated with Morin or Coumarin, Ts g M and Ts g C,
respectively. In the aminoacid aligment of gamma core with charybdotoxin and Ts g.
159
Figure 6. 3D model of Ts g showing the presence of B,J and C-terminal loop (a) and
presence of hydrophobic core (b) and comparative models of Ts g and charybdotoxin
where presenting the gama core.
160