Avaliação de Bacillus spp. no controle da flor preta do morangueiro, sob
condições de laboratório e casa-de-vegetação
Valdionei Giassi1; Katia Cristina Kupper2; Camila Kiritani3; Isabel Cristina Sousa4;
Edypol Guilherme Batista5
1
Biólogo pesquisador do Centro de Pesquisa Mokiti Okada (CPMO) [email protected]; 2Pesquisadora do Centro
APTA Citros Sylvio Moreira/IAC [email protected]; 3Bióloga do Centro de Pesquisa Mokiti Okada
[email protected]; 4Química do Centro de Pesquisa Mokiti Okada quí[email protected]; 5Estagiário do Centro de Pesquisa
Mokiti Okada [email protected]
RESUMO A Flor Preta, causada por Colletotrichum acutatum, é uma das principais doenças do morangueiro. Os
sintomas mais marcantes são manchas escuras e irregulares em frutos, folhas e flores. O controle da doença é feito por
fungicidas que nem sempre se mostram eficientes. Assim, a busca por alternativas de controle se faz necessária e o uso
de Bacillus spp. se mostra como técnica promissora. Este trabalho teve por objetivo avaliar diferentes isolados de
Bacillus spp. no controle da flor-preta, sob condições de laboratório e de casa-de-vegetação. In vitro, avaliou-se a
atividade antagônica e o efeito de substâncias antifúngicas termoestáveis sobre a germinação e o desenvolvimento
micelial do patógeno, observando-se que todos os isolados de Bacillus spp. afetaram o crescimento da colônia do fungo,
sendo que, cinco deles apresentaram inibições entre 32 e 34%, inibindo de 50 a 53% o crescimento da colônia do fungo
e afetaram a germinação de conídios entre 86 a 97%. Dos 11 isolados bacterianos submetidos a condições de casa-devegetação, apenas 2 não diferiram do controle, sendo que o isolado CPMO 3 apresentou 5,4% enquanto o tratamento
químico 26,99% de flores com sintomas da flor preta diferindo significativamente entre os tratamentos.
Palavras chaves: Controle biológico, cultivo pareado, germinação, substâncias antifúngicas
(Kupper et al. 2009; Batista Júnior et al., 2002). Diante do
INTRODUÇÃO
A
flor
xananassa Duch.),
preta
do
morangueiro
causada
(Fragaria
exposto, este trabalho teve como objetivo avaliar isolados
por Colletotrichum
de Bacillus spp. no controle da flor preta do morangueiro,
acutatum, ocasiona sérios problemas em todas as regiões
sob condições de laboratório e de casa-de-vegetação.
de cultivo, sendo limitante para a cultura em virtude de
sua natureza devastadora, podendo causar danos durante
MATERIAIS E MÉTODOS
todo o ciclo, com perdas de até 50% da produção
Os Bacillus spp. utilizados nesse trabalho foram
(Almeida et al., 2009). O método mais utilizado para seu
isolados a partir de folhas e frutos do morango
controle é o uso de fungicidas, que nem sempre são
proveniente de propriedade particular, localizada em
eficazes, levando a graves problemas, como o surgimento
Atibaia – SP; e folhas de café de cultivo espontâneo,
de linhagens do fungo resistentes aos princípios ativos
totalizando 16 isolados. O fungo C. acutatum foi isolado
utilizados (Tanaka et al., 1997; Ghini & Kimati, 2000).
de flores do morango com os sintomas da flor preta.
Pesquisas buscam desenvolver novas técnicas de
se destacada pelo baixo custo e por não acarretar
Influência do cultivo pareado de isolados de Bacillus
spp. no crescimento micelial de C. acutatum
Para avaliar o potencial antagônico dos isolados
problemas ao ambiente. A utilização de microrganismos
de Bacillus spp. sobre o crescimento micelial do C.
antagônicos, como algumas espécies de Bacillus vem se
acutatum, foi utilizado o método de cultura pareada em
destacando no controle de doenças do filoplano de plantas
placa de Petri com meio BDA (Fuga et al., 2011; Dennis
controle desta doença, entre elas, o controle biológico que
& Webster, 1971). Para isso foram retirados discos de 5
submetidos à análise de variância e as médias comparadas
mm de diâmetro, contendo meio e colônias do fungo com
pelo teste de Tukey a 5 % (SISVAR).
sete dias de idade e, colocados no centro de placas de
Bacillus spp. foi colocada a 3 cm de distância da colônia
Influência de metabólitos termoestáveis sobre o
crescimento micelial de C. acutatum
Inicialmente foi preparado um caldo bacteriano
do fitopatógeno. Adotou-se um delineamento inteiramente
de acordo com Kupper et al. (2009), colônias de bactérias
casualizado com 4 repetições, sendo o controle composto
foram transferidas em Erlenmeyers com capacidade para
somente pelo cultivo do fungo isento do antagonista.
250 ml, contendo 50 ml do meio batata dextrose
Petri com o mesmo meio . Uma alçada de cada isolado de
Após isto, as culturas foram incubadas em BOD
a 25°C, com fotoperíodo de 12 horas.
autoclavado (120°C e 1 atm) por 15 minutos. Após a
As avaliações
incubação em condições de laboratório por 48 horas sob
ocorreram quando o fungo da placa controle atingiu as
agitação constante, amostras de 10 ml de cada caldo
bordas da placa, determinando-se a medição da colônia do
fermentado foi transferida para Erlenmeyers, contendo 90
fitopatógeno, com o auxílio de paquímetro digital. Foi
ml do meio BDA, que foram esterilizados em autoclave
determinada a porcentagem de inibição da colônia de C.
(120°C e 1 atm) por 20 minutos. O meio autoclavado foi
acutatum pela fórmula:
vertido em placas de Petri (20 ml cada) e após a
solidificação, foram colocados no centro de cada placa
%Inibição=[(cre.mic.tes.-cre.mic.trat.)-cres.mic.test.]x100
um disco de 5 mm de diâmetro de C. acutatum mais meio
cre. mic. tes.= crescimento micelial testemunha
de cultura. As testemunhas foram constituídas de placas
cre. mic. trat.= crescimento micelial tratamento.
contendo meio de cultura sem metabólito. O efeito do
metabólito foi avaliado através da medição do diâmetro
Efeito de Bacillus spp. na germinação de conídios de
C. acutatum
Foram coletadas suspensões de células da
da colônia de C. acutatum, quando o fungo da placa
controle atingiu a borda da placa. Usou-se delineamento
bactéria e do fungo obtendo-se assim, colônias ativas.
inteiramente casualizado com 5 repetições e os dados
Adicionou-se 10 L da suspensão de cada isolado de
submetidos à análise de variância e as médias dos
6
Bacillus spp. (1 x 10 ufc/mL) e de suspensão de conídios
tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey a 5 % .
4
do patógeno (1 x 10 esporos/mL) em áreas demarcadas
tratamento testemunha foram colocadas gotas de água
Efeito de metabólitos termoestáveis, produzidos por
Bacillus spp., na germinação de C. acutatum
Para avaliar o efeito da produção de metabólitos
salina destilada e esterilizada no lugar dos Agentes de
na
Controle Biológico (ACBS). Depois as mesmas foram
delineamento inteiramente casualizado com 6 repetições
colocadas no interior de placas de Petri esterilizadas,
por tratamento. Foram retirados 1000 µL de caldo
contendo algodão embebido em água esterilizada. As
bacteriano autoclavado, isolados, e acrescentado em tubo
culturas foram incubadas em B.O.D., no escuro a 25ºC
de diluição com 1000 µL de uma suspensão do
por 12 horas (Kupper et al., 2009).
fitopatógeno (1x104 conídios/ml). O tratamento controle
na lâmina, preparadas com meio ágar-água. Para o
germinação
do
fitopatógeno,
utilizou-se
um
Ao término desse período, a cada repetição foi
constitui-se apenas de 1000 µL da suspensão e 1000 µL
adicionado 10µL de azul lático a fim de inibir o
de solução salina. Retirou-se uma alíquota de 20 µL que
desenvolvimento do patógeno e de qualquer outro
foi depositada em áreas previamente demarcadas em
microrganismo e, posteriormente, foi determinado o
lâminas com meio Ágar-Água e submetidas à incubação
número de conídios germinados e não germinados. Foi
por 14 horas no escuro a 25°C. Em seguida, foi realizada
utilizado um delineamento inteiramente casualizado,
a contagem de conídios germinados e não germinados
tendo cada tratamento 6 repetições. Os dados foram
(Kupper et al., 2009; Furlani et al., 2007). Os dados
foram submetidos à análise de variância e as médias
dois melhores o BM16 e o BM24 com 36,6% e 38,4% de
comparadas pelo teste de Tukey a 5 % de probabilidade.
antagonismo quando comparado ao controle. O mesmo
ocorreu com Kupper et al. (2003) quando todos
apresentaram potencial de antagonismo sem sobreposição
Ensaio em Casa de Vegetação
de colônia. Furlani et al. (2007) e Costa (2001) também
O experimento foi realizado em casa de
obtiveram
resultados
satisfatórios
na
inibição
do
vegetação no período de maio a setembro de 2013. Sendo
crescimento micelial do fitopatógeno com isolados de
conduzidos em vasos plásticos com capacidade de 2 kg os
Bacillus spp. utilizando a técnica do cultivo pareado.
quais foram preenchidos com 45,75% solo argiloso
45,75%, solo arenoso 0,5%, bokashi e 8% capim picado.
Cada vaso recebeu uma muda de morango, cultivar
Camarosa. O experimento contou com 13 tratamentos: 11
isolados de Bacillus spp que melhor se destacaram na
“in
etapa
vitro”,
um
tratamento
químico
(TEBUCONAZOL 200g/l i.a) e um controle (água).
exceção dos ACBs BM001, BM14 e BM 25 que
estimularam a germinação, os outros agentes afetaram a
germinação dos conídios do fitopatógeno, porém os que
apresentaram uma porcentagem de inibição melhor em
Para a produção das suspensões dos isolados de
Bacillus spp, colônias de cada ACB foi multiplicada em
Erlenmeyers (dois frascos para cada agente de controle
biológico), com capacidade para 125 ml, contendo 50 ml
de meio batata-dextrose, agitados a 120 rpm em
temperatura ambiente por 48 horas.
Efeito de Bacillus spp. na germinação de C. acutatum
do morango
Nos testes em laboratório verificou-se que, com
Os antagonistas
relação ao controle foram os
agentes de controle
biológico: BM18, CPMO3, CPMO4, CPMO5 E CPMO6,
com 68,17%, 70,29%, 81,30%, 73,87% e 79,05% .
Kupper et al. (2009) observaram que suspensões de
células de três isolados de Bacillus spp. e de três isolados
de Trichoderma spp., somente dois não inibiram a
7
(1x10 células/mL), o químico (TEBUCONAZOL 200g/l
germinação do fitopatógeno. Em outro estudo sobre o
i.a) e a testemunha (água) foram aplicados semanalmente
efeito de dois isolados de B. subtilis na inibição da
por meio de pulverizador manual, sendo aplicado o
germinação do C. acutatum (Costa, 2001) verificou que
volume de calda suficiente para atingir o ponto de
os agentes de controle biológico inibiram a germinação de
escorrimento.
conídios do patógeno e foram capazes de produzir
As aplicações dos tratamentos foram
realizadas semanalmente no período da tarde.
metabólitos em quantidade suficiente para inibir o
No início da fase de florescimento, as plantas
foram
pulverizadas
com
uma
suspensão
de
conídios/mL do fungo C. acutatum e submetidas à câmera
umida para a germinação dos conídios. As avaliações da
incidência da flor preta foram efetuadas ao longo do ciclo
da cultura (Gouvea et al., 2009). Foi utilizado um
delineamento
inteiramente
casualizado
com
desenvolvimento do fungo.
104
quatro
repetiçôes por tratamento, e os resultados submetidos à
análise de variância e as médias comparadas pelo teste
Tukey a 5%.
Influência de metabólitos termoestáveis sobre o
crescimento micelial de C. acutatum
Cinco dos dezesseis isolados de Bacillus spp.
apresentaram inibição do crescimento micelial do
fitopatógeno acima de 50%, em relação ao controle, o que
revela que mesmo depois de autoclavado os metabólitos
mostraram-se estáveis e mantiveram suas atividades. Em
estudo semelhante, Kupper et al. (2003) mostrou que dos
60 isolados de Bacillus subtilis, apenas dois não
RESULTADOS E DISCUSSÃO
obtiveram sucesso, tornando-o um organismo atraente
Influência do cultivo pareado de isolados de Bacillus
spp. no crescimento de C. acutatum do morango
Todos os isolados de Bacillus spp. apresentaram
para estudos de controle biológico.
antagonismo ao crescimento micelial do fungo, sendo os
Efeito de metabólitos termoestáveis na germinação do
C. acutatum
Dos 16 isolados estudados, apenas dois não
inibiram a germinação dos conídios. O ACB que melhor
teve resultado obteve 97,01% de inibição. Realizando
Agradecimentos
A
Fundação
Mokiti
Okada
pelo
apoio
e
financiamento do experimento, a Drª Katia C. Kupper pela
estudo semelhante, Kupper et al. (2009), utilizou 6 orientação no decorrer do experimento e a todos que de
isolados, sendo que apenas um deles não produziu alguma forma contribuiram.
metabólitos tóxicos termoestáveis capazes de inibir a
germinação do C. acutatum.
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
Ensaio em Casa de Vegetação
Dos onze isolados de Bacillus spp. 9 obtiveram
resultados
superiores
ao
tratamento
controle
correspondendo 5,4 a 26,4% de número de flores com
sintomas da doença e o tratamento químico 27% enquanto
que o tratamento controle apresentou 45,42%, sendo que o
Bacillus spp. correspondente ao tratamento CPMO3
apresentou níveis significativos de controle quando
comparado ao tratamento químico, conforme apresentado
na Figura 1. Avaliando-se o efeito de diferentes fungicidas
ALMEIDA, T. F.; CAMARGO, M.; PANIZZI, R. de. Efeito de
extratos de plantas medicinais no controle de Colletotrichum
acutatum, agente causal da flor preta do morangueiro.
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2009.
BATISTA JÚNIOR, C.B., ALBINO, U.B., MARTINES, A.M.,
SARIDAKIS, D.P., MATSUMOTO, L.S., AVANZI, M.A.,
ANDRADE, G.; Efeito fungistático de Bacillus thuringiensis e
de outras bactérias sobre alguns fungos fitopatógenos.
Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 37, n. 8, p. 11891194, 2002.
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acutatum, agente causal da flor-preta do morangueiro.
Trabalho (Graduação em Agronomia). Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista,
Jaboticabal, 2001, 45p.
no controle da Flor-preta do morango Kososki et al.(2001)
observaram que os melhores tratamentos foram os que
apresentaram apenas 40% das flores doentes. Concluindo
DENNIS, C., WEBSTER, J.; Antagonistic properties of
species groups of Trichoderma III. Hyphal interactions.
Transactions of the British Mycological Society 57:359-363.
1971.
que o controle químico, isoladamente, pode não ser um
método eficiente para o manejo da flor-preta, indicando a
necessidade de investigação de outras estratégias de
FUGA, C.A.G., GONÇALVES, D.C., CUNHA, W.V.; Inibição
do crescimento micelial de Colletotrichum gloesporioides por
Bacillus ssp. "in vitro". Revista do Núcleo Interdisciplinar de
Pesquisa e Extensão, v. 1, n. 8, p. 188-194, 2011.
controle da antracnose do morangueiro. Assim o uso de
Bacillus spp. pode ser uma alternativa para a substituição
do uso de fungicidas químicos no controle da flor preta do
morangueiro.
FURLANI, A.C.F.A., CAMARGO, M., PANIZZI, R.C.,
PEREIRA, C.F.; Atividade de células, filtrado e autoclavado
de Bacillus ssp. como bioagentes de controle de
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196-200, 2007.
GHIMI, R., KIMATI, H.; Resistência de fungos a fungicidas.
Jaguariúna. Embrapa Meio Ambiente, 2000.
GOUVEA, A., KUHN, O.J., MAZARO, S.M., MAY-DE MIO,
L.L., DESCHAMPS, C., BIASI, L.A., FONSECA, V.C.;
Controle de doenças foliares e de flores e qualidade póscolheita do morangueiro tratado com Saccharomyces
cerevisiae. Horticultura Brasileira, v27, n4, p.527-533, 2009.
Figura 1- Porcentagem de flores com sintomas da flor preta, letras iguais na coluna não
diferem estatísticamente pelo teste de Tukey 5% de probabilidade.
Conclusões
Nas condições estudadas o Bacillus spp CPMO3 se
mostrou eficiente no controle da flor preta do morangueiro
em casa de vegetação. Entretanto ensaio a campo será
necessário para comprovar sua eficiência.
KOSOSKI, R.M., FURLANETTO, C., TOMITA, C.K.; Efeito
de fungicidas em Colletotrichum acutatum e controle da
antracnose do morangueiro. Fitopatol. bras. v26 n3 Brasília.
2001.
KUPPER, K.C., BELLOTTE, J.A.M., GOES, A.; Controle
alternativo de Colletotrichum acutatum agente causal da
queda prematuro dos frutos cítricos. Revista Brasileira de
Fruticultura, v.31, n.4, Jaboticabal, 2009.
KUPPER, K.C., GIMENES-FERNANDES, N., GOES, A.;
Controle biológico de Colletotrichum acutatum, agente causal
da queda prematura dos frutos cítricos. Fitopatologia
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TANAKA M.A.S.; PASSOS F.A.; BETTI J.A.; Resistência de
Colletotrichum fragariae e C. acutatum ao benomyl na
cultura do morango no Estado de São Paulo. Scientia
Agricola 54: 139-146. 1997.