Rui Seabra Ferreira Junior
AVALIAÇÃO DA RESPOSTA HUMORAL E DA CAPACIDADE DE
NEUTRALIZAÇÃO DO SORO DE CAMUNDONGOS SWISS INOCULADOS COM
VENENOS NATIVO E IRRADIADO COM COBALTO-60 DE SERPENTES Crotalus
durissus terrificus, Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu E Bothrops moojeni
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Doenças Tropicais da
Faculdade de Medicina de Botucatu, da
Universidade Estadual Paulista – UNESP, para
obtenção do Título de Mestre em Doenças
Tropicais (Modalidade Biologia Tropical)
Orientador: Prof. Dr. Domingos Alves Meira
Co-Orientador: Prof. Dr. Benedito Barraviera
Botucatu – SP
2003
Sumário
1 Introdução
1
2 Objetivos
8
3 Material e Métodos
9
3.1 Material
9
3.1.1. Animais utilizados nos experimentos
9
3.1.2. Peçonhas utilizadas nos experimentos
9
3.1.3. Reagentes e fonte de irradiação
3.3 Métodos
10
10
3.2.1. Irradiação das peçonhas
10
3.2.2. Atividade tóxica das peçonhas
10
3.2.3. Processo de imunização dos camundongos
11
3.2.4 Titulação dos anticorpos séricos produzidos
11
3.2.5. Neutralização e potência do soro produzido
13
3.2.5.1 Capacidade neutralizante “in vitro” do antiveneno nativo e irradiado
13
3.2.5.2 Potência “in vitro” do antiveneno nativo e irradiado
13
3.2.5.3 Capacidade neutralizante “in vivo”
14
3.2.6. Avaliação clínica dos animais
14
3.2.7. Análise estatística
14
4 Resultados
4.1 Método de ensaio imunoenzimático (ELISA)
4.1.1 Resultados do método de ELISA para o soro produzido a partir de
16
16
16
veneno nativo e irradiado de Crotalus durissus terrificus
4.1.2 Resultados do método de ELISA para o soro produzido a partir de
27
veneno nativo e irradiado de Bothrops jararaca
4.1.3 Resultados do método de ELISA para o soro produzido a partir de
38
veneno nativo e irradiado de Bothrops jararacussu
4.1.4 Resultados do método de ELISA para o soro produzido a partir de
49
veneno nativo e irradiado de Bothrops moojeni
4.1.5 Resultados da titulação pelo método de ELISA para o soro produzido a
60
partir de veneno nativo e irradiado de Crotalus durissus terrificus, Bothrops
jararaca, Bothrops jararacussu e Bothrops moojeni
4.2 Capacidade neutralizante e potência dos anticorpos antiveneno nativo e
73
irradiado
4.2.1 Teste “in vitro”
74
4.2.2 Teste “in vivo”
90
4.3. Avaliação clínica dos animais
5. Discussão
91
93
6. Considerações finais
105
7. Resumo
106
8. Summary
107
9. Referências bibliográficas
108
10. Apêndice
115
Trabalho desenvolvido nos Laboratórios do
Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos - CEVAP
Universidade Estadual Paulista, Campus de Botucatu, São Paulo
e no Instituto de Pesquisa Energéticas e Nucleares – IPEN/CNEN
São Paulo
Eu agradeço a Deus,
por me dar forças para vencer mais esta batalha
e por ver que quanto mais eu acredito Nele,
mais ele acredita em mim.
Uma noite eu tive um sonho...
Sonhei que estava andando na praia com o Senhor,
E através do Céu, passavam cenas da minha vida.
Para cada cena que passava, percebi pegadas na areia.
Uma era minha e a outra do Senhor.
Quando a última cena da minha vida passou diante de nós,
Olhei para as pegadas na areia,
Notei que, muitas vezes no caminho da minha vida,
Havia apenas um par de pegadas na areia,
Notei também que isso aconteceu
Nos momentos mais difíceis da minha vida.
(...) – Senhor, não compreendo...
Por que nas horas em que eu mais necessitava
Vós me deixastes?
O Senhor respondeu:
Meu filho, Eu te amo e jamais te deixaria
Nas horas da tua prova e do teu sofrimento.
Quando vistes na areia apenas um par de pegadas,
Foi exatamente aí que Eu te carreguei em meus braços!
Dedicatória
À minha esposa, Ana Silvia, amor da minha vida, pelo incentivo durante esta fase
e as minhas desculpas pelos atrasos e momentos ausentes.
Aos meus pais, Rui e Maria Emília, pela minha formação, caráter e incansável
estímulo durante toda vida.
Aos meus irmãos, Milena e Danilo, pelo amor e confiança depositados em mim.
Ao meu avô, Joaquim Luís Neto (In memorian) por acreditar.
Ao meu sogro, Benedito e minha sogra, Silvia, pelo apoio e auxílio durante este
período.
Aos meus cães, Alf (Bigodão), Estrelinha (Vaca), Dolly (Lula) e Kika (Chico Amigo)
pelo ouvido amigo nas horas difíceis.
Não precisamos saber nem “como” nem “onde”,
mas existe uma pergunta que todos nós devemos
fazer sempre que começamos qualquer coisa:
“Para que tenho que fazer isto?”.
Meus agradecimentos especiais
Ao Prof. Dr. Benedito Barraviera, pela orientação dedicada e compreensiva que
influenciou de forma decisiva minha formação profissional. Nenhuma palavra seria
capaz de expressar a minha gratidão por seus ensinamentos
Vencedores nascem antes de qualquer vitória.
Vencedores nascem da motivação,
Nascem da dedicação e do esforço.
Vencedores não nascem vencedores.
Vencedores se tornam vencedores,
Porque tiveram quem acreditasse neles,
Torcesse por eles e lutasse por eles.
Vencedores são todos aqueles que se preparam
Para um dia vencer!
À Prof. Dra. Nanci do Nascimento pelo constante apoio, participação e eterna
disposição
O primeiro sintoma de que estamos
matando nossos sonhos é a falta de
tempo. As pessoas mais ocupadas têm
tempo para tudo. As que não nada fazem
estão sempre cansadas.
Ao Prof. Dr. Domingos Alves Meira, Mestre dos Mestres, pelo exemplo de
profissionalismo e orientação.
É preciso não relaxar nunca,
mesmo tendo chegado tão longe.
Tudo que o mundo precisa são de
exemplos, e não de opiniões.
Agradeço a todas as pessoas que de alguma forma contribuíram para a realização
deste trabalho.
Aos docentes do Departamento de Doenças Tropicais e Diagnóstico por Imagem,
Prof. Dr. Domingos Alves Meira, Profa. Dra. Jussara Marcondes Machado, Prof.
Dr. Rinaldo Pôncio Mendes, Prof. Dr. Benedito Barraviera, Prof. Dr. Paulo Câmara
Marques Pereira e Prof. Dra. Lenice Rosário de Souza, pela enorme contribuição
na minha formação.
Ao Prof. Dr. José Carlos Martinez, pelos ensinamentos transmitidos e discussões
“estatísticas”.
À amiga Janaína Baptista Alves, pela paciência, participação e confiança.
Ao Prof. Dr. Carlos Alberto Magalhães Lopes, pelo incentivo e conselhos.
Ao Prof. Dr. Sony Dimas Bicudo, pelas sugestões e contribuições.
Ao Prof. Dr. Hélio Langoni, pelas primeiras orientações na minha carreira
acadêmica.
Ao Dr. Patrick J. Spencer, pela amizade e prestação.
Aos amigos do CEVAP, Paulo, Marcos, Fernanda e Thomaz pelo total auxílio.
À Fabiana Custódio e André Trombeta, pela disponibilidade constante cooperação
diária.
À Heloísa Pardini, pela amizade e inglês sempre perfeito.
Aos amigos Camilo e Guilherme, pelo companheirismo e amizade
Ao amigo Edmílson, pela atenção e dedicação.
Aos amigos Cláudio e Fábio, pela paciência durante este período.
Aos funcionários do CEVAP e do IPEN, pela atenção nos serviços prestados.
Ao Biotério da UNESP, pela prontidão em fornecer os animais utilizados.
Aos funcionários da seção de Pós-Graduação da FMB, pelos auxílios prestados
sempre com muita dedicação.
Aos funcionários da Biblioteca do Campus de Botucatu pela elaboração da ficha
catalográfica.
Ao Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos – CEVAP / UNESP,
em especial a Profa. Dra. Silvia Regina Sartori Barraviera pelo total apoio logístico
para a realização deste trabalho.
1 Introdução
Nos diversos reinos biológicos existem espécies de organismos que são
capazes de produzir certas substâncias que, se forem colocadas em contato com
outro organismo, podem desencadear diversos tipos de reações, inclusive
provocar a morte. Na natureza, esses organismos utilizam tais substâncias como
meio para obtenção de alimentos e para autodefesa e são comumente
denominados de peçonhentos ou venenosos e suas substâncias tóxicas de
peçonhas ou venenos (1).
Os venenos ofídicos são misturas complexas, constituídas principalmente por
proteínas, peptídeos e em pequenas proporções carboidratos, lipídeos,
nucleotídeos, aminoácidos e componentes orgânicos. Os principais componentes
tóxicos são proteínas e enzimas, as quais estão diretamente relacionadas com a
alimentação e defesa da serpente (2).
O
tratamento
adequado
dos
indivíduos
acidentados
por
serpentes
peçonhentas é um desafio que o homem tenta solucionar há muito tempo.
Assim, antes da descoberta do soro antiofídico, os indivíduos picados eram
tratados por curandeiros que os submetiam a simpatias, aplicações de soluções
preparadas a partir de um grande número de vegetais e álcool e também pelo uso
de pedras porosas cuja função era de retirar o veneno contido na ferida (3).
Trabalhos desenvolvidos por Behring e Kitasato (1894) a partir da soroterapia
contra difteria e tétano, mostraram que o soro dos animais “vacinados” contra a
peçonha possuía também uma substância antitóxica capaz de neutralizar os
efeitos do veneno e de transmitir imunidade passiva a outro animal não imunizado
(4).
Ainda em 1894, Calmette, Phisalix e Bertrand, também demonstraram a
possibilidade de transferência de resistência de um animal imunizado, para outro
não imunizado conferindo proteção passiva às peçonhas (4).
Descoberta e estabelecida a possibilidade de animais serem imunizados
contra o veneno ofídico, estava lançada a base da soroterapia aplicada ao
tratamento das picadas por serpentes venenosas.
Segundo Vital Brazil (3), a partir desses resultados, Calmette propôs que o
soro hiperimune, obtido a partir do veneno de uma determinada espécie de
serpente, seria capaz de neutralizar o veneno de qualquer outra.
2
Em 1897, Vital Brazil estudando os venenos das serpentes brasileiras,
solicitou do Instituto Lille, de Paris, o soro de Calmette, para avaliar a capacidade
de neutralização deste soro. O soro de Calmette foi injetado 12 horas antes da
inoculação do veneno, em cobaias e foi observado que os animais morriam no
mesmo espaço de tempo que as testemunhas que não haviam recebido qualquer
medicação (3). Como o soro havia sido preparado dois anos antes, Vital Brazil
teve o cuidado de não tirar conclusões sobre a ineficiência na neutralização dos
venenos das serpentes brasileiras.
Em maio de 1899, após nova experiência sem sucesso com o soro de
Calmette, Vital Brazil resolveu testar o soro obtido de cães e cabritos, que ele
havia imunizado utilizando veneno de jararacas e cascavéis. Observou que o soro
destes animais conferia proteção específica para cada um destes venenos e que
eles não apresentavam sintomas de envenenamento (5).
Em uma conferência na Escola de “Pharmácia” de São Paulo, Vital Brazil
apresentou cientificamente os resultados de seus experimentos, tendo ainda
descrito os sintomas provocados por mordeduras das serpentes brasileiras
classificando o envenenamento em crotálico e botrópico. Dessa forma o soro
específico para o tratamento de cada caso poderia ser escolhido (5).
Na seqüência dos experimentos, Vital Brazil constatou que, misturando os
soros anticrotálico e antibotrópico em doses iguais, esta mistura conferia proteção
tanto nos acidentes causados por serpentes do gênero Bothrops quanto
serpentes do gênero Crotalus. Isto possibilitava o tratamento quando não era
conhecida a espécie de serpente causadora do acidente (5).
Outra constatação de Vital Brazil foi a de que, a quantidade de soro a ser
utilizada deveria ser proporcional à quantidade de veneno inoculada (3).
No tratamento dos acidentes por picadas de serpentes são utilizados soros
heterólogos obtidos a partir do plasma de animais, geralmente eqüídeos e ovinos,
hiperimunizados com venenos de serpentes (6).
Os antivenenos preparados a partir de plasmas hiperimunizados de cavalos
são considerados como o único tratamento específico para o envenenamento por
serpentes no Brasil (7, 8).
Os adjuvantes que vêm sendo utilizados na hiperimunização de cavalos com
bons resultados são o Adjuvante de Freund Completo e Incompleto, que são
administrados respectivamente no primeiro e segundo inóculos e o alginato de
sódio ou hidróxido de alumínio nos demais (9, 10).
3
Devido às reações adversas causadas por estes adjuvantes nos animais
soroprodutores, têm sido realizados esforços no sentido de identificar novos
adjuvantes eficientes para a produção de antivenenos (10).
Nos últimos cem anos o cavalo permaneceu como animal de escolha para a
produção de antivenenos, pois normalmente é fácil de manusear e pode ser
treinado para se manter parado, com um mínimo de contenção, durante a sangria
e plasmaferese. Também os métodos de purificação das antitoxinas obtidas a
partir do sangue de eqüinos, são mais conhecidos e estudados em relação a
outros animais (11,12).
Para obtenção de plasmas hiperimunes antibotrópicos e anticrotálicos, os
cavalos são inoculados com diversas doses de venenos dessecados que
normalmente possuem atividade tóxica elevada. Com relativa freqüência são
observadas reações locais e sistêmicas que podem levar, inclusive o animal à
morte (13).
Segundo os mesmos autores, as reações locais e sistêmicas observadas nos
cavalos foram consistentemente reduzidas ou ausentes, nos animais que
receberam os venenos tratados com glutaraldeido quando comparadas com
aquelas dos animais imunizados com venenos não tratados.
Por outro lado, o título de anticorpos no soro de todos os animais foi
praticamente o mesmo, concluíndo-se, portanto, que o glutaraldeido reduziu a
atividade tóxica dos venenos sem alterar a sua imunogenicidade.
A inoculação do veneno bruto fornece títulos elevados; entretanto, o veneno
total é freqüentemente mal tolerado pelo animal. Como resultado, toxóides tem
sido preparados por destoxicação biológica do veneno a qual preserva sua
imunogenicidade (14).
O alto custo, tanto do cavalo como o da sua manutenção, estimula a pesquisa
de esquemas de hiperimunização que visam obter títulos elevados de anticorpos
específicos nesses animais a partir da imunização (15).
Os venenos podem perder a sua atividade tóxica, conservando, entretanto as
suas características antigênicas e imunogênicas, com capacidade de quando
introduzido num organismo, induzir a formação de anticorpos. Com a perda da
fração tóxica este produto recebe o nome de anaveneno (16) ou toxóide (17).
Quanto às técnicas utilizadas para preparação de antivenenos, encontram-se
inúmeros trabalhos em que foram utilizados agentes químicos e/ou físicos para tal
propósito. Dentre os agentes químicos destacam-se: carboximetil-celulose (18);
fotoxidação na presença de azul de metileno (19); agentes quelantes (20);
4
formalina (21); iodo (22); glutaraldeido (13); entre outros. Entre os agentes físicos,
os principais são: radiação X (23); radiação ultravioleta (24); calor (21) e radiação
gama (25-27).
Em alguns destes estudos, as toxinas obtidas ainda mantiveram certa
toxicidade e apresentaram baixa imunogenicidade. Como exemplos podemos
citar o estudo de Costa et al. (21), no qual foi comparada a ação imunogênica do
veneno de Crotalus durissus terrificus destoxicado pelo tratamento com
formaldeido e pela ação térmica, com o veneno nativo. Neste estudo os autores
verificaram que o veneno submetido ao tratamento por calor ainda se apresentava
tóxico e com baixa imunogenicidade quando comparado ao veneno submetido ao
tratamento por formaldeido; e que, embora este último tenha apresentado bons
resultados, ao final do esquema de imunização ele não foi tão eficiente quanto o
veneno nativo. Entretanto, algumas metodologias mostraram-se bem sucedidas;
como exemplos podemos citar os trabalhos de Daniel et al. (22), que obtiveram
um toxóide com o tratamento do veneno crotálico pela iodação que se apresentou
cerca de 100 vezes menos tóxico que o veneno não tratado e mantendo a
imunogenicidade.
Rogero et al. (25), Nascimento et al. (26); Clissa et al. (27), trabalhando com a
radiação gama, demonstraram que esta vem sendo bastante eficiente na
atenuação de venenos ofídicos, sendo capaz de diminuir a toxicidade, sem alterar
a imunogenicidade e sem adicionar nenhuma substância ao veneno.
A radiação gama, produzida por uma fonte de Cobalto-60, é uma radiação
eletromagnética de alta energia associada à ausência de massa. Esta possui
grande poder de penetração e capacidade de promover ionização e excitação no
meio onde se propaga. Dentro do espectro eletromagnético, os raios cósmicos, a
radiação gama e os raios X são classificados como radiações ionizantes (28).
Estas recebem este nome porque provocam ionizações, ou seja, ao
atravessarem uma substância (tecido biológico ou qualquer outro tipo de matéria)
têm a propriedade de arrancar elétrons, em geral da camada periférica dos
átomos, resultando na formação de pares de íons, positivo e negativo. Estes tipos
de radiações eletromagnéticas causam também excitações, processos nos quais
os elétrons das camadas externas do átomo-alvo absorvem energia suficiente
para atingir um estado energético mais elevado, permanecendo associados ao
átomo e emitindo energia sob a forma de luz visível ou ultravioleta (29).
5
As proteínas são um dos principais constituintes de materiais biológicos, entre
os quais se incluem os venenos de origem animal. A irradiação de proteínas no
estado seco ou em solução leva a alterações químicas, físico-químicas e
estruturais bastante significativas. Estas mudanças resultam em uma diminuição e
inativação de algumas atividades biológicas destas proteínas, tais como atividade
tóxica, enzimática e/ou imunológica (27).
O tratamento de materiais biológicos com a radiação ionizante está sendo
aplicado em várias áreas, tais como esterilização de materiais hospitalares (30),
imobilização de enzimas (31), irradiação de alimentos (32), atenuação de toxinas
(25), entre outros.
No Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN/CNEN-SP), com a
crise na produção de soros antiofídicos instalada no país no início da década de
80, iniciaram-se os estudos sobre a radiação ionizante como ferramenta na
destoxicação de venenos ofídicos. Entre os estudos realizados nos últimos quinze
anos destacam-se os trabalhos de Murata (33); Nascimento (34); Murata et al.
(35); Guarnieri (36); Souza-Filho et al. (37); Spencer (38); Andriani (39); Cardi
(40); De Paula (41); Rogero et al. (25); Nascimento et al. (26); Clissa et al. (27);
Boni-Mitake et al. (42), entre outros.
Todos estes experimentos têm sido avaliados pelas mais modernos técnicas
imunobiológicas.
Historicamente, Theakston et al. (43) foram os primeiros pesquisadores a
descreverem o uso da técnica imunoenzimática de ELISA para a detecção de
veneno de serpentes e de anticorpos antivenenos, baseado no método duplo
sanduíche, usando IgG fracionada na fase fixa em placa de microtitulação.
Barbosa et al. (44) consideram que o uso do teste de ELISA para determinar a
potência de soros antiofídicos, produzidos em eqüinos, se mostram mais
vantajosos em relação ao custo e reprodutibilidade quando comparado aos testes
em camundongos.
Barraviera et al. (45) usaram a técnica de ELISA para detecção sensível e
específica de níveis de antígenos e anticorpos no soro e líquido cerebroespinhal
de pacientes picados por Crotalus durissus terrificus no Brasil.
Heneine et al. (46) relataram uma correlação significante entre a técnica de
ELISA e a potência de antiveneno testada in vivo.
Durante as últimas duas décadas, diversos métodos de ELISA têm sido
descritos em várias partes do mundo com diferentes intenções. Entretanto, estes
novos métodos são similares ao desenvolvido por Theakston et al. (43).
6
No âmbito da epidemiologia dos acidentes ofídicos, apesar da longa tradição
do Brasil neste campo, somente há poucos anos foi definida uma política
abrangente que enfocasse as múltiplas questões relacionadas aos acidentes
humanos provocados por animais peçonhentos (47).
O sistema de produção de antivenenos no Brasil vinha passando por uma
crise desde o início dos anos 80s, que culminou em maio de 1986 com o óbito de
uma criança, atribuído à “falta de soro”. Esta situação levou o Ministério da Saúde
a implantar um Programa Nacional de Ofidismo na antiga Secretaria de Ações
Básicas em Saúde. Tal programa é formado por grupos de Trabalho (GTs)
composto
por
técnicos
de
diversas
instituições
científicas
brasileiras,
responsáveis por áreas específicas (47).
A instalação deste programa tornou obrigatória a notificação dos acidentes
ofídicos ao Ministério da Saúde a partir de 1986, possibilitando assim estabelecer
parâmetros quanto à ocorrência, mortalidade e evolução clínica dos acidentes,
uma vez que estes possuem grande importância médica e epidemiológica no
Brasil (48, 49).
Entre os quatro gêneros responsáveis por acidentes ofídicos no Brasil, as
serpentes do gênero Bothrops causam o maior número de acidentes (88,3%),
seguido pelas do gênero Crotalus (8,3%), Lachesis (2,7%) e Micrurus (0,7%) (48).
Sendo assim, as serpentes pertencentes ao gênero Bothrops e Crotalus se
destacam das demais por causarem o maior numero de acidentes (88%) e o
maior índice de letalidade (72% nos casos não tratados com soro e 11% nos
casos tratados) respectivamente, representando os envenenamentos ofídicos de
maior gravidade em nosso meio.
A ocorrência dos acidentes ofídicos, que pode ser considerado um acidente de
trabalho, está geralmente associada ao aumento da atividade do homem no
campo. A maioria dos acidentes ocorre na região Sudeste com 43%, seguidos
pelas regiões Nordeste (17%), Centro-Oeste (16%), Sul (15%) e Norte (9%) (49,
50).
Na região de Botucatu, o Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da
UNESP, atende em média 100 casos por ano de acidentes envolvendo animais
peçonhentos. Entre os acidentes mais graves destacam-se os causados por
serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus, que podem ser fatais na ausência de
terapêutica precoce e adequada (51, 52).
7
Os registros sobre acidentes ofídicos em animais domésticos são bastante
escassos na literatura brasileira. Em estudo retrospectivo utilizando prontuários de
animais atendidos entre 1972 e 1989, do Hospital Veterinário da Faculdade de
Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, campus de Botucatu, foram
encontradas 149 ocorrências de acidentes ofídicos. Desses casos, 85,8% foram
causados por serpentes do gênero Bothrops; 7,4% pelo gênero Crotalus e 6,8%
não foram identificadas. O tratamento com o soro propiciou a cura em 94,8% dos
animais (53).
Por fim, diante de todas as considerações feitas anteriormente, estamos frente
a um sério problema de Saúde Pública que exige do profissional competência,
habilidade, rapidez e disponibilidade de soro para o tratamento adequado de seus
pacientes. Além disso, os pesquisadores do mundo todo buscam alternativas para
a produção de soro heterólogo que sejam mais baratas e menos traumáticas para
os animais produtores.
8
2 Objetivos
Os objetivos do presente trabalho foram:
1- Avaliar, acompanhar e comparar a resposta imune humoral de
camundongos inoculados com veneno obtido de Crotalus durissus
terrificus, Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu e Bothrops moojeni
na forma nativa e irradiada com
60
Co, utilizando o ensaio imuno
enzimático de ELISA;
2- Determinar e comparar a potência e a capacidade de neutralização do
soro obtido dos camundongos inoculados com veneno de Crotalus
durissus terrificus, B. jararaca, B. jararacussu e B. moojeni na forma
nativa e irradiado com 60Co utilizando método “in vitro”;
3- Avaliar a imunidade obtida pelos camundongos inoculados com veneno
nativo e irradiado com
60
Co mediante desafio “in vivo” com veneno
nativo de Crotalus durissus terrificus, B. jararaca, B. jararacussu e B.
moojeni, após o processo de hiperimunização;
4- Avaliar os efeitos colaterais nos camundongos inoculados com veneno
nativo ou irradiado com
60
Co obtido de Crotalus durissus terrificus, B.
jararaca, B. jararacussu e B. moojeni durante todo o processo de
hiperimunização.
9
3 Material e Métodos
3.1 Material
Para atingir os objetivos no presente trabalho e para facilitar a compreensão
serão descritos os animais, as peçonhas, os reagentes utilizados, bem como a
fonte de irradiação.
3.1.1. Animais utilizados nos experimentos
Foram utilizados camundongos Swiss, com peso entre 18-22 gramas,
criados e mantidos no Biotério do Centro de Estudos de Venenos e Animais
Peçonhentos, CEVAP-UNESP, no Campus de Botucatu, São Paulo.
Durante a realização dos experimentos, os animais foram mantidos em
caixas de polipropileno com oito animais por caixa. Para a forração ou cama
nas caixas foi utilizada maravalha de pinho. A alimentação e a água foram
disponibilizadas ad libitum.
3.1.2. Peçonhas utilizadas nos experimentos
Foram utilizadas peçonhas obtidas de serpentes adultas das espécies
Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu e Bothrops
moojeni mantidas no serpentário do Centro de Estudos de Venenos e Animais
Peçonhentos (CEVAP), localizado na UNESP, Campus de Botucatu, São
Paulo.
A extração do veneno foi realizada segundo metodologia desenvolvida pela
equipe técnica do Laboratório de Extração de Venenos do CEVAP (1). Os
venenos foram liofilizados após a extração e mantidos em freezer a -20 ºC.
Uma parte dos venenos foi submetida à radiação gama ionizante no Instituto
de Pesquisa Energéticas e Nucleares – IPEN/CNEN-SP, localizado no campus
da Universidade de São Paulo – USP, sendo denominado de veneno irradiado.
A outra parte foi liofilizada e mantida em freezer a -20 ºC, sendo denominado
veneno nativo (26).
10
3.1.3. Reagentes e fonte de irradiação
Todos os reagentes utilizados foram de qualidade pró-análise. Para o
preparo das soluções foi utilizada água destilada.
A irradiação realizada foi feita por meio de uma fonte de
60
Co (Gama Cell
220, Atomic Energy Agency of Canadá), disponível no Departamento de
Aplicações de Técnicas Nucleares do IPEN/CNEN-SP.
3.2 Métodos
A metodologia empregada incluiu a irradiação das peçonhas, a atividade
tóxica das peçonhas, o processo de imunização dos camundongos, a titulação
dos anticorpos, a neutralização e a avaliação da potência do soro, a avaliação
clínica dos animais e por fim a análise estatística.
3.2.1. Irradiação das peçonhas
Dos venenos liofilizados retiraram-se alíquotas de 2 mg que foram diluídas
com solução salina acidificada (NaCl 150 mM, pH 3,0) alcançando a
concentração final de 2mg/ml. A seguir, as amostras foram irradiadas com uma
dose de 2000 Gy (taxa de dose 5,25 KGy/h) em uma fonte de 60Co.
A irradiação das amostras ocorreu sempre na presença de oxigênio, na
temperatura ambiente e de forma homogênea e ininterrupta (26).
3.2.2. Atividade tóxica das peçonhas
A determinação da toxicidade das amostras nativas foi realizada pelo cálculo
da dose letal capaz de matar 50% dos animais do experimento (DL50), segundo
Spearman-Karber (54).
Os valores das DL50 dos venenos nativos utilizados neste experimento foram
previamente realizados pelo Instituto de Pesquisa Energéticas e Nucleares –
IPEN/CNEN-SP, e descritos a seguir:
•
Crotalus durissus terrificus : 0,148 µg/g de camundongo
•
Bothrops jararaca : 2,4 µg/g de camundongo
•
Bothrops jararacussu: 4,4 µg/g de camundongo
•
Bothrops moojeni : 4,4 µg/g de camundongo
11
3.2.3. Processo de imunização dos camundongos
Foram imunizados nove grupos de oito animais cada, com uma DL50 do
respectivo veneno, nativo e irradiado, a cada inóculo, segundo o esquema de
imunização descrito a seguir.
3.2.3.1. Crotalus durissus terrificus
Os inóculos ocorreram no dia um, utilizando Adjuvante Completo de Freund
por via intradérmica; dia 15 utilizando Hidróxido de Alumínio por via subcutânea
e nos dias 21, 30, 45 utilizando PBS por via intraperitonial.
3.2.3.2. Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu e Bothrops moojeni
Os inóculos ocorreram no dia um, utilizando Adjuvante Completo de Freund
por via intradérmica; dia 15 utilizando Adjuvante Incompleto de Freund por via
subcutânea e nos dias 21, 30, 45 utilizando PBS por via intraperitonial.
O grupo controle recebeu inóculos nos mesmos dias somente com os
adjuvantes.
Todos animais foram inoculados com 200 µl de uma solução contendo 100
µl do excipiente e 100 µl de uma mistura do respectivo veneno diluído em
solução salina. O grupo controle recebeu 200 µl de uma solução contendo 100
µl do excipiente e 100 µl de solução salina.
Antes de cada inóculo, os animais foram sangrados pelo plexo retro-orbital,
uma amostra de 100 µl de sangue foi retirado, o soro foi separado e feito um
“pool” de cada grupo. O soro foi mantido congelado a – 20 oC.
3.2.4 Titulação dos anticorpos séricos contra os venenos inoculados
por
meio
do
Ensaio
imuno
enzimático
immunosorbent assay – ELISA)
A- Reagentes
a) Placas de microtitulação Hemobag de 96 poços
b) Tampão carbonato/bicarbonato de sódio 0,05 M pH 9,6
(Enzyme
linked
12
c) Solução salina, contendo 0,05% de Tween 20®
d) Leite em pó desnatado (Molico®) a 5%
e) Soro IgG de carneiro anti-IgG de camundongo, conjugado com peroxidase
(SIGMA®)
f) Orto fenilenodiamina
g) Água oxigenada
h) Tampão citrato/fosfato 0,05M pH 5,0
i) Ácido cítrico 0,2M
B- Procedimento
Foram sensibilizadas, por 12 horas a 4 oC em câmara úmida, placas
plásticas de 96 poços com 100 µl por poço com uma solução de antígeno a 10
µg/ml (1µg/poço), diluídos em tampão carbonato/bicarbonato de sódio 0,05M e
pH 9,6. A placa foi lavada 4 vezes com solução salina 0,15M contendo 0,05%
de Tween 20®. Foram aplicados 200µl por poço de solução de bloqueio (5g de
Molico® q.s.p. 100ml de PBST) e deixado por 1 hora a 37oC, em câmara úmida.
Foram aplicados, nos poços, 100 µl de soro de camundongos previamente
imunizados, diluídos a partir de 1/200 em solução de bloqueio e aplicadas na
placa, em duplicata.
Após a incubação por 1 h a 37oC, em câmara úmida, as placas foram
lavadas 4 vezes com PBST 0,15M, e iniciou-se a revelação com adição de
100µl de soro de carneiro anti IgG de camundongo conjugado com peroxidase
(SIGMA®), diluído 1/2000 da fração aliquotada (Sigma), em solução de
bloqueio; aplicou-se 100µl por poço. Após a incubação durante 1 hora a 37OC,
em câmara úmida, as placas foram lavadas 4 vezes com PBST 0,15M.
A reação foi revelada pela adição de uma solução de OPD (Ophenylenediamine) 0,5mg/ml e H2O2 (30%) 0,5mg/ml em tampão citrato de
sódio/ácido cítrico (0,05M e pH 5,0); foram aplicadas 100µl por poço e deixadas
durante 20 minutos, a temperatura ambiente, no escuro e então foi
interrompida com a adição de 50µl (por poço) de ácido cítrico 0,2M.
A leitura de cada poço foi feita em leitor automático de microplaca
(DYNATECH MR 4000®), utilizando-se filtro de comprimento de onda de
450nm.
Todas as amostras de soro foram testadas em duplicata. O soro de animais
não imunizados foi utilizado como controle.
13
3.2.5. Neutralização e potência do soro
3.2.5.1 Avaliação da capacidade de neutralização “in vitro” do
antiveneno nativo e irradiado
Para a avaliação da capacidade de neutralização dos soros obtidos dos
camundongos inoculados com veneno nativo ou com veneno irradiado de
serpentes das espécies Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararaca, B.
jararacussu e B. moojeni, no 60º dia após a primeira inoculação, uma alíquota
contendo 100 µl do “pool” de cada soro foi incubado com 100 µl de uma
solução contendo quantidades de veneno nativo diluídos em PBS equivalentes
a: 1, 3, 5, 10 e 15 DL50. A incubação foi feita em tubos tipo “eppendorf”
mantidos em estufa a 37 ºC, por um período de trinta minutos (55).
Posteriormente, 200 µl de cada solução foram inoculados individualmente em
quatro camundongos por via intraperitoneal. Para efeito de controle, foram
inoculados em outros quatro camundongos 200 µl de uma solução contendo
uma DL50 de veneno diluída em PBS para comprovação da sua toxicidade.
Outros quatro camundongos receberam apenas 100 µl de uma alíquota de soro
diluída em 100 µl de PBS para avaliação da sua inocuidade. Após 24 e 48
horas a taxa de mortalidade foi registrada.
3.2.5.2 Avaliação da potência “in vitro” do antiveneno nativo e
irradiado
Para a avaliação da potência dos soros obtidos dos camundongos
inoculados com veneno nativo ou com veneno irradiado de serpentes das
espécies Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararaca, B. jararacussu e B.
moojeni, no 60º dia após a primeira inoculação, uma alíquota do “pool” de cada
soro foi diluída em PBS nas seguintes concentrações: 1:5, 1:10, 1:20, 1:40, e
1:80. Uma alíquota de soro puro também foi incluída no teste. Uma alíquota de
100 µl de cada solução foi incubada com 100 µl de uma solução contendo
cinco DL50 de veneno nativo diluído em PBS. A incubação foi feita em tubos
tipo “eppendorf” mantidos em estufa a 37 ºC, por um período de trinta minutos
(55). Posteriormente, 200 µl de cada solução foram inoculados individualmente
em quatro camundongos por via intraperitoneal. Para efeito de controle, foram
inoculados em outros quatro camundongos 200 µl de uma solução contendo
14
cinco DL50 de veneno diluída em PBS para comprovação da sua toxicidade.
Outros quatro camundongos receberam apenas 100 µl de uma alíquota de soro
diluída em 100 µl de PBS para avaliação da sua inocuidade. Após 24 e 48
horas a taxa de mortalidade foi registrada.
A capacidade neutralizante do “pool” dos soros (em µg de toxina/ml de antisoro) foi
calculada conforme KAISER et al. (56), utilizando-se a seguinte
equação:
Capacidade neutralizante da toxina (CNT) = (D – DL50) x 1 x 105 X (1/V50)
Sendo D = Dose total da toxina (µg/g); DL50 em µg/g; V50 = Volume
antiveneno que reduz a letalidade de 1 ml da solução de injeção da toxina a
50%. A letalidade de 50% significará que o antiveneno foi capaz de reduzir a
dose efetiva para 1 DL50.
3.2.5.3 Avaliação da capacidade neutralizante “in vivo”
Ao final do processo de imunização, a fim de se verificar a capacidade
neutralizante ”in vivo” dos anticorpos produzidos pelos animais, quatro
camundongos de cada grupo foram pesados e desafiados individualmente com
cinco DL50 do veneno nativo respectivo diluído em PBS. Cada animal recebeu
200 µl dessa solução via intraperitoneal. Após 24 e 48 horas a taxa de
mortalidade foi registrada.
3.2.6. Avaliação clínica dos animais
Os animais foram observados durante todo o processo de hiperimunização. A
presença de alterações locais na pele e/ou subcutâneo como edema, fístulas,
abscessos e necroses, e o número de animais que vieram a óbito durante o
processo foram relatados. Para isto, foi utilizada uma análise descritiva das
observações.
3.2.7. Análise estatística
A análise estatística dos dados foi realizada por meio de Análise de
Variância pelo teste de F de Snedecor, ao nível de 5% de significância (57).
Este teste é indicado para se identificar diferenças entre médias populacionais,
15
em decorrência das várias causas que atuam simultaneamente entre os
elementos de uma população. Por meio deste teste comparou-se o grupo de
camundongos inoculados com veneno nativo com o grupo de camundongos
inoculados com veneno irradiado e também os momentos (Dia 0 x Dia 15 x Dia
21 x Dia 30 x Dia 45 x Dia 60). A diferença estatística foi considerada a partir
do nível de 5%.
16
4 Resultados
4.1. Método de Ensaio Imunoenzimático (ELISA)
4.1.1 Resultados do método de ELISA para o soro produzido a partir
de veneno nativo e irradiado de Crotalus durissus terrificus
As médias de densidades ópticas resultantes dos títulos de anticorpos
obtidos pela inoculação de veneno nativo e veneno irradiado com
60
Co e os
resultados da análise estatística dos ensaios imunoenzimáticos (ELISA) do
“pool” de soro dos animais, nos diferentes momentos e diluições encontram-se
nas Tabelas 01 a 05. Nas Figuras 01 a 05 estão representados graficamente os
valores das médias de densidades ópticas, nos diferentes momentos e
diluições, para os dois Grupos de animais, inoculados com veneno nativo e
veneno irradiado com 60Co respectivamente.
17
Tabela 01: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450
nm) obtidas por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool”
de soros (diluição 1:200) de oito camundongos, inoculados no início do
experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Crotalus
durissus terrificus nativo (Grupo I) e irradiado com 60Co (Grupo II).
Dias (D)
Grupos
(G)
0
15
21
30
45
60
I
0,00
0,0215
0,034
0,0735
0,1955
0,21
II
0,00
0,0185
0,0265
0,0625
0,127
0,2115
G I = G II; como FLinhas = 1,89 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %),
D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 34,16 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %)
Figura 01: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:200) de oito
camundongos inoculados com veneno de Crotalus durissus terrificus nativo e
irradiado com 60Co.
18
A análise da tabela 01 e da figura 01 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos I e II, realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:200, mostrou que não houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 1,89 < Fcrítico =
7,71);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:200, mostrou que houve diferença estatística
ao nível de 5% de significância (FCalculado = 34,16 > Fcrítico = 6,39);
19
Tabela 02: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450
nm) obtidas por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool”
de soros (diluição 1:400) de oito camundongos, inoculados no início do
experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Crotalus
durissus terrificus nativo (Grupo I) e irradiado com 60Co (Grupo II).
Dias (D)
Grupos
(G)
0
15
21
30
45
60
I
0,00
0,014
0,026
0,0595
0,129
0,167
II
0,00
0,011
0,0215
0,051
0,0895
0,1695
G I = G II; como FLinhas = 2,04 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).
D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 60,81 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %).
Figura 02: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:400) de oito
camundongos inoculados com veneno de Crotalus durissus terrificus nativo e
irradiado com 60Co.
20
A análise da tabela 02 e da figura 02 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos I e II, realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:400, mostrou que não houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 2,04 < Fcrítico =
7,71);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:400, mostrou que houve diferença estatística
ao nível de 5% de significância (FCalculado = 60,81 > Fcrítico = 6,39);
21
Tabela 03: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450
nm) obtidas por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool”
de soros (diluição 1:800) de oito camundongos, inoculados no início do
experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Crotalus
durissus terrificus nativo (Grupo I) e irradiado com 60Co (Grupo II).
Dias (D)
Grupos
(G)
0
15
21
30
45
60
I
0,00
0,0031
0,02
0,0425
0,0945
0,134
II
0,00
0,0075
0,0125
0,033
0,073
0,141
G I = G II; como FLinhas = 1,11 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).
D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 89,71 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %).
Figura 03: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:800) de oito
camundongos inoculados com veneno de Crotalus durissus terrificus nativo e
irradiado com 60Co.
22
A análise da tabela 03 e da figura 03 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos I e II, realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:800, mostrou que não houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 1,11 < Fcrítico =
7,71);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:800, mostrou que houve diferença estatística
ao nível de 5% de significância (FCalculado = 89,71 > Fcrítico = 6,39);
23
Tabela 04: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450
nm) obtidas por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool”
de soros (diluição 1:1600) de oito camundongos, inoculados no início do
experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Crotalus
durissus terrificus nativo (Grupo I) e irradiado com 60Co (Grupo II).
Dias (D)
Grupos
(G)
0
15
21
30
45
60
I
0,00
0,00
0,014
0,029
0,0685
0,121
II
0,00
0,00
0,004
0,018
0,035
0,1315
G I = G II; como FLinhas = 1,10 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).
D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 29,34 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %).
Figura 04: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:1600) de oito
camundongos inoculados com veneno de Crotalus durissus terrificus nativo e
irradiado com 60Co.
24
A análise da tabela 04 e da figura 04 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos I e II, realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:1600, mostrou que não houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 1,10 < Fcrítico =
7,71);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:1600, mostrou que houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 29,34 > Fcrítico =
6,39);
25
Tabela 05: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450
nm) obtidas por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool”
de soros (diluição 1:3200) de oito camundongos, inoculados no início do
experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Crotalus
durissus terrificus nativo (Grupo I) e irradiado com 60Co (Grupo II).
Dias (D)
Grupos
(G)
0
15
21
30
45
60
I
0,00
0,00
0,0085
0,0125
0,0405
0,089
II
0,00
0,00
0,002
0,014
0,0235
0,119
G I = G II; como FLinhas = 1,43 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).
D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 23,91 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %).
Figura 05: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:3200) de oito
camundongos inoculados com veneno de Crotalus durissus terrificus nativo e
irradiado com 60Co.
26
A análise da tabela 05 e da figura 05 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos I e II, realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:3200, mostrou que não houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 1,43 < Fcrítico =
7,71);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:3200, mostrou que houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 23,91 > Fcrítico =
6,39);
27
4.1.2
Resultados do método de ELISA para o soro produzido a
partir de veneno nativo e irradiado de Bothrops jararaca
As médias de densidades ópticas resultantes dos títulos de anticorpos
obtidos pela inoculação de veneno nativo e veneno irradiado com
60
Co e os
resultados da análise estatística dos ensaios imunoenzimáticos (ELISA) do
“pool” de soro dos animais, nos diferentes momentos e diluições encontram-se
nas Tabelas 06 a 10. Nas Figuras 06 a 10 estão representados graficamente os
valores das médias de densidades ópticas, nos diferentes momentos e
diluições, para os dois Grupos de animais, inoculados com veneno nativo e
veneno irradiado com 60Co respectivamente.
28
Tabela 06: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450
nm) obtidas por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool”
de soros (diluição 1:200) de oito camundongos, inoculados no início do
experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Bothrops
jararaca nativo (Grupo III) e irradiado com 60Co (Grupo IV).
Dias (D)
Grupos
(G)
0
15
21
30
45
60
III
0,00
0,1665
0,267
0,276
0,3435
0,365
IV
0,00
0,141
0,2285
0,261
0,3825
0,3825
G III = G IV; como FLinhas = 1,28 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).
D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 155,03 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %).
Figura 06: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:200) de oito
camundongos inoculados com veneno de Bothrops jararaca nativo e irradiado
com 60Co.
29
A análise da tabela 06 e da figura 06 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos III e IV, realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:200, mostrou que não houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 1,28 < Fcrítico =
7,71);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:200, mostrou que houve diferença estatística
ao nível de 5% de significância (FCalculado = 155,03 > Fcrítico = 6,39);
30
Tabela 07: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450
nm) obtidas por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool”
de soros (diluição 1:400) de oito camundongos, inoculados no início do
experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Bothrops
jararaca nativo (Grupo III) e irradiado com 60Co (Grupo IV).
Dias (D)
Grupos
(G)
0
15
21
30
45
60
III
0,00
0,0775
0,2415
0,2665
0,324
0,362
IV
0,00
0,0655
0,2155
0,2535
0,3685
0,3765
G III = G IV; como FLinhas = 2,87 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).
D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 121,26 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %).
Figura 07: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:400) de oito
camundongos inoculados com veneno de Bothrops jararaca nativo e irradiado
com 60Co.
31
A análise da tabela 07 e da figura 07 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos III e IV, realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:400, mostrou que não houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 2,87 < Fcrítico =
7,71);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:400, mostrou que houve diferença estatística
ao nível de 5% de significância (FCalculado = 121,26 > Fcrítico = 6,39);
32
Tabela 08: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450
nm) obtidas por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool”
de soros (diluição 1:800) de oito camundongos, inoculados no início do
experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Bothrops
jararaca nativo (Grupo III) e irradiado com 60Co (Grupo IV).
Dias (D)
Grupos
(G)
0
15
21
30
45
60
III
0,00
0,041
0,2165
0,256
0,32
0,3525
IV
0,00
0,0455
0,2045
0,249
0,3575
0,3755
G III = G IV; como FLinhas = 1,01 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).
D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 154,4 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %)
Figura 08: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:800) de oito
camundongos inoculados com veneno de Bothrops jararaca nativo e irradiado
com 60Co.
33
A análise da tabela 08 e da figura 08 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos III e IV, realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:800, mostrou que não houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 1,01 < Fcrítico =
7,71);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:800, mostrou que houve diferença estatística
ao nível de 5% de significância (FCalculado = 154,4 > Fcrítico = 6,39);
34
Tabela 09: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450
nm) obtidas por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool”
de soros (diluição 1:1600) de oito camundongos, inoculados no início do
experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Bothrops
jararaca nativo (Grupo III) e irradiado com 60Co (Grupo IV).
Dias (D)
Grupos
(G)
0
15
21
30
45
60
III
0,00
0,019
0,197
0,2415
0,3145
0,341
IV
0,00
0,018
0,1725
0,2465
0,356
0,359
G III = G IV; como FLinhas = 1,37 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).
D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 49,64 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %)
Figura 09: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:1600) de oito
camundongos inoculados com veneno de Bothrops jararaca nativo e irradiado
com 60Co.
35
A análise da tabela 09 e da figura 09 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos III e IV, realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:1600, mostrou que não houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 1,37 < Fcrítico =
7,71);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:1600, mostrou que houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 49,64 > Fcrítico =
6,39);
36
Tabela 10: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450
nm) obtidas por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool”
de soros (diluição 1:3200) de oito camundongos, inoculados no início do
experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Bothrops
jararaca nativo (Grupo III) e irradiado com 60Co (Grupo IV).
Dias (D)
Grupos
(G)
0
15
21
30
45
60
III
0,00
0,012
0,1345
0,209
0,308
0,332
IV
0,00
0,0105
0,1315
0,206
0,328
0,35
G III = G IV; como FLinhas = 1,32 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).
D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 52,45 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %).
Figura 10: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:3200) de oito
camundongos inoculados com veneno de Bothrops jararaca nativo e irradiado
com 60Co.
37
A análise da tabela 10 e da figura 10 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos III e IV, realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:3200, mostrou que não houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 1,32 < Fcrítico =
7,71);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:3200, mostrou que houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 52,45 > Fcrítico =
6,39);
38
4.1.3 Resultados do método de ELISA para o soro produzido a partir
de veneno nativo e irradiado de Bothrops jararacussu
As médias de densidades ópticas resultantes dos títulos de anticorpos
obtidos pela inoculação de veneno nativo e veneno irradiado com
60
Co e os
resultados da análise estatística dos ensaios imunoenzimáticos (ELISA) do
“pool” de soro dos animais, nos diferentes momentos e diluições encontram-se
nas Tabelas 11 a 15. Nas Figuras 11 a 15 estão representados graficamente os
valores das médias de densidades ópticas, nos diferentes momentos e
diluições, para os dois Grupos de animais, inoculados com veneno nativo e
veneno irradiado com 60Co respectivamente.
39
Tabela 11: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450
nm) obtidas por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool”
de soros (diluição 1:200) de oito camundongos, inoculados no início do
experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Bothrops
jararacussu nativo (Grupo V) e irradiado com 60Co (Grupo VI).
Dias (D)
Grupos
(G)
0
15
21
30
45
60
V
0,00
0,155
0,2135
0,245
0,3555
0,389
VI
0,00
0,107
0,244
0,251
0,475
0,3445
G V = G VI; como FLinhas = 2,81 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).
D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 18,01 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %).
Figura 11: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:200) de oito
camundongos inoculados com veneno de Bothrops jararacussu nativo e
irradiado com 60Co.
40
A análise da tabela 11 e da figura 11 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos V e VI, realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:200, mostrou que não houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 2,81 < Fcrítico =
7,71);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:200, mostrou que houve diferença estatística
ao nível de 5% de significância (FCalculado = 18,01 > Fcrítico = 6,39);
41
Tabela 12: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450
nm) obtidas por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool”
de soros (diluição 1:400) de oito camundongos, inoculados no início do
experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Bothrops
jararacussu nativo (Grupo V) e irradiado com 60Co (Grupo VI).
Dias (D)
Grupos
(G)
0
15
21
30
45
60
V
0,00
0,1125
0,202
0,2295
0,3405
0,3605
VI
0,00
0,0505
0,2145
0,231
0,3755
0,3355
G V = G VI; como FLinhas = 2,08 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).
D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 37,07 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %).
Figura 12: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:400) de oito
camundongos inoculados com veneno de Bothrops jararacussu nativo e
irradiado com 60Co.
42
A análise da tabela 12 e da figura 12 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos V e VI, realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:400, mostrou que não houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 2,08 < Fcrítico =
7,71);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:400, mostrou que houve diferença estatística
ao nível de 5% de significância (FCalculado = 37,07 > Fcrítico = 6,39);
43
Tabela 13: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450
nm) obtidas por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool”
de soros (diluição 1:800) de oito camundongos, inoculados no início do
experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Bothrops
jararacussu nativo (Grupo V) e irradiado com 60Co (Grupo VI).
Dias (D)
Grupos
(G)
0
15
21
30
45
60
V
0,00
0,0595
0,1885
0,2215
0,3385
0,3475
VI
0,00
0,0265
0,1825
0,2225
0,3685
0,3325
G V = G VI; como FLinhas = 1,97 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).
D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 120,01 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %).
Figura 13: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:800) de oito
camundongos inoculados com veneno de Bothrops jararacussu nativo e
irradiado com 60Co.
44
A análise da tabela 13 e da figura 13 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos V e VI, realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:800, mostrou que não houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 1,97 < Fcrítico =
7,71);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:800, mostrou que houve diferença estatística
ao nível de 5% de significância (FCalculado = 120,01 > Fcrítico = 6,39);
45
Tabela 14: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450
nm) obtidas por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool”
de soros (diluição 1:1600) de oito camundongos, inoculados no início do
experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Bothrops
jararacussu nativo (Grupo V) e irradiado com 60Co (Grupo VI).
Dias (D)
Grupos
(G)
0
15
21
30
45
60
V
0,00
0,036
0,1725
0,215
0,339
0,3235
VI
0,00
0,0115
0,1695
0,205
0,3625
0,314
G V = G VI; como FLinhas = 3,92 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).
D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 219,91 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %).
Figura 14: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:1600) de oito
camundongos inoculados com veneno de Bothrops jararacussu nativo e
irradiado com 60Co.
46
A análise da tabela 14 e da figura 14 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos V e VI, realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:1600, mostrou que não houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 3,92 < Fcrítico =
7,71);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:1600, mostrou que houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 219,91 > Fcrítico =
6,39);
47
Tabela 15: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450
nm) obtidas por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool”
de soros (diluição 1:3200) de oito camundongos, inoculados no início do
experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Bothrops
jararacussu nativo (Grupo V) e irradiado com 60Co (Grupo VI).
Dias (D)
Grupos
(G)
0
15
21
30
45
60
V
0,00
0,0255
0,147
0,2015
0,28
0,313
VI
0,00
0,0045
0,1105
0,158
0,3555
0,296
G V = G VI; como FLinhas = 1,56 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).
D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 27,52 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %).
Figura 15: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:3200) de oito
camundongos inoculados com veneno de Bothrops jararacussu nativo e
irradiado com 60Co.
48
A análise da tabela 15 e da figura 15 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos V e VI, realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:3200, mostrou que não houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 1,56 < Fcrítico =
7,71);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:3200, mostrou que houve diferença
estatística nível de 5% de significância (FCalculado = 27,52 > Fcrítico = 6,39);
49
4.1.4 Resultados do método de ELISA para o soro produzido a partir de
veneno nativo e irradiado de Bothrops moojeni
As médias de densidades ópticas resultantes dos títulos de anticorpos
obtidos pela inoculação de veneno nativo e veneno irradiado com
60
Co e os
resultados da análise estatística dos ensaios imunoenzimáticos (ELISA) do
“pool” de soro dos animais, nos diferentes momentos e diluições encontram-se
nas Tabelas 16 a 20. Nas Figuras 16 a 20 estão representados graficamente os
valores das médias de densidades ópticas, nos diferentes momentos e
diluições, para os dois Grupos de animais, inoculados com veneno nativo e
veneno irradiado com 60Co respectivamente.
50
Tabela 16: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450
nm) obtidas por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool”
de soros (diluição 1:200) de oito camundongos, inoculados no início do
experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Bothrops
moojeni nativo (Grupo VII) e irradiado com 60Co (Grupo VIII).
Dias (D)
Grupos
(G)
0
15
21
30
45
60
VII
0,00
0,1055
0,186
0,1965
0,3705
0,3705
VIII
0,00
0,061
0,178
0,203
0,3775
0,3885
G VII = G VIII; como FLinhas = 1,49 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).
D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 113,01 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %).
Figura 16: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:200) de oito
camundongos inoculados com veneno de Bothrops moojeni nativo e irradiado
com 60Co.
51
A análise da tabela 16 e da figura 16 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos VII e VIII, realizada pelo teste F
de Snedecor, na diluição de 1:200, mostrou que não houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 1,49 < Fcrítico =
7,71);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:200, mostrou que houve diferença estatística
ao nível de 5% de significância (FCalculado = 113,01 > Fcrítico = 6,39);
52
Tabela 17: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450
nm) obtidas por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool”
de soros (diluição 1:400) de oito camundongos, inoculados no início do
experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Bothrops
moojeni nativo (Grupo VII) e irradiado com 60Co (Grupo VIII).
Dias (D)
Grupos
(G)
0
15
21
30
45
60
VII
0,00
0,065
0,1745
0,1935
0,3505
0,357
VIII
0,00
0,031
0,1405
0,1835
0,362
0,371
G VII = G VIII; como FLinhas = 1,01 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).
D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 134,81 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %).
Figura 17: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:400) de oito
camundongos inoculados com veneno de Bothrops moojeni nativo e irradiado
com 60Co.
53
A análise da tabela 17 e da figura 17 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos VII e VIII, realizada pelo teste F
de Snedecor, na diluição de 1:400, mostrou que não houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 1,01 < Fcrítico =
7,71);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:400, mostrou que houve diferença estatística
ao nível de 5% de significância (FCalculado = 134,81 > Fcrítico = 6,39).
54
Tabela 18: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450
nm) obtidas por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool”
de soros (diluição 1:800) de oito camundongos, inoculados no início do
experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Bothrops
moojeni nativo (Grupo VII) e irradiado com 60Co (Grupo VIII).
Dias (D)
Grupos
(G)
0
15
21
30
45
60
VII
0,00
0,035
0,154
0,1665
0,339
0,3555
VIII
0,00
0,014
0,0955
0,158
0,338
0,3545
G VII = G VIII; como FLinhas = 2,80 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).
D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 140,05 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %).
Figura 18: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:800) de oito
camundongos inoculados com veneno de Bothrops moojeni nativo e irradiado
com 60Co.
55
A análise da tabela 18 e da figura 18 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos VII e VIII, realizada pelo teste F
de Snedecor, na diluição de 1:800, mostrou que não houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 2,80 < Fcrítico =
7,71);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:800, mostrou que houve diferença estatística
ao nível de 5% de significância (FCalculado = 140,05 > Fcrítico = 6,39);
56
Tabela 19: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450
nm) obtidas por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool”
de soros (diluição 1:1600) de oito camundongos, inoculados no início do
experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Bothrops
moojeni nativo (Grupo VII) e irradiado com 60Co (Grupo VIII).
Dias (D)
Grupos
(G)
0
15
21
30
45
60
VII
0,00
0,0195
0,132
0,147
0,323
0,3475
VIII
0,00
0,009
0,0745
0,14
0,3261
0,345
G VII = G VIII; como FLinhas = 1,87 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).
D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 140,24 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %).
Figura 19: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:1600) de oito
camundongos inoculados com veneno de Bothrops moojeni nativo e irradiado
com 60Co.
57
A análise da tabela 19 e da figura 19 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos VII e VIII, realizada pelo teste F
de Snedecor, na diluição de 1:1600, mostrou que não houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 1,87 < Fcrítico =
7,71);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:1600, mostrou que houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 140,24 > Fcrítico =
6,39);
58
Tabela 20: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450
nm) obtidas por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool”
de soros (diluição 1:3200) de oito camundongos, inoculados no início do
experimento (dia zero), aos 15, 21, 30 e 45 dias com veneno de Bothrops
moojeni nativo (Grupo VII) e irradiado com 60Co (Grupo VIII).
Dias (D)
Grupos
(G)
0
15
21
30
45
60
VII
0,00
0,012
0,106
0,1135
0,3085
0,33
VIII
0,00
0,006
0,0395
0,11
0,3095
0,3365
G VII = G VIII; como FLinhas = 1,05 < Fcrítico = 7,71 (α = 5 %).
D0 ≠ D15 ≠ D21 ≠ D30 ≠ D45 ≠ D60; como FColunas = 94,74 > Fcrítico = 6,39 (α = 5 %).
Figura 20: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA) em “pool” de soros (diluição 1:3200) de oito
camundongos inoculados com veneno de Bothrops moojeni nativo e irradiado
com 60Co.
59
A análise da tabela 20 e da figura 20 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos VII e VIII, realizada pelo teste F
de Snedecor, na diluição de 1:3200, mostrou que não houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 1,05 < Fcrítico =
7,71);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
momentos (dia zero, 15, 21, 30, 45 e 60), realizada pelo teste F de
Snedecor, na diluição de 1:3200, mostrou que houve diferença
estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 94,74 > Fcrítico =
6,39);
60
4.1.5
Resultados da titulação pelo método de ELISA para o soro
produzido a partir de veneno nativo e irradiado de Crotalus durissus
terrificus, Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu e Bothrops moojeni
As Tabelas 21 a 24 apresentam as médias de densidades ópticas
resultantes da diluição dos títulos de anticorpos obtidos pela inoculação de
veneno nativo e veneno irradiado com
60
Co e os resultados da análise
estatística dos ensaios imunoenzimáticos (ELISA) do “pool” de soro dos
animais no 60º dia após a primeira inoculação.
As Figuras 21 a 24 representam graficamente os valores das médias de
densidades ópticas resultantes da diluição dos títulos de anticorpos obtidos do
“pool” de soro dos animais pela inoculação de veneno nativo e veneno
irradiado com
inoculação.
60
Co para os dois Grupos de animais no 60º dia após a primeira
0,134
0,141
0,167
0,1695
0,21
0,2115
I
II
0,1315
0,121
1:16
0,119
0,089
1:32
0,067
0,082
1:64
0,0215
0,019
1:128
Diluições (D) x 102
0,0115
0,01
1:256
0,0105
0,0065
1:512
G I = G II; como FLinhas = 2,36 < Fcrítico = 4,96 (α = 5 %).
D1:2 ≠ D1:4 ≠ D1:8 ≠ D1:16 ≠ D1:32 ≠ D1:64 ≠ D1:128 ≠ D1:256 ≠ D1:512 ≠ D1:1024 ≠ D1:2048 como FColunas = 202,86 > Fcrítico = 2,98 (α = 5 %), (Dx102)
1:8
1:4
1:2
Grupos
(G)
0,0095
0,0035
1:1024
0,0035
0,0005
1:2048
Tabela 21: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450 nm) obtidas por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool” de soros do 60º dia após a primeira inoculação, diluídos
de 1:200 a 1:204800, de oito camundongos, com veneno de Crotalus durissus terrificus nativo (Grupo I) e
irradiado com 60Co (Grupo II).
61
Figura 21: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) em
“pool” de soros do 60º dia após a primeira inoculação, diluídos de 1:200 a 1:204800, de oito camundongos inoculados
com veneno de Crotalus durissus terrificus nativo e irradiado com 60Co.
62
63
A análise da tabela 21 e da figura 21 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos I e II, realizada pelo teste F de
Snedecor, mostrou que não houve diferença estatística ao nível de 5%
de significância (FCalculado = 2,36 < Fcrítico = 4,96);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
diluições (1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256; 1:512; 1:1024;
1:2048), realizada pelo teste F de Snedecor, mostrou que houve
diferença estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 202,86 >
Fcrítico = 2,98);
0,3525
0,3755
0,362
0,3765
0,365
0,3825
III
IV
0,359
0,341
1:16
0,35
0,332
1:32
0,33
0,2835
1:64
0,3195
0,2495
1:128
Diluições (D) x 102
0,299
0,178
1:256
0,2025
0,106
1:512
G III ≠ G IV; como FLinhas = 17,42 > Fcrítico = 4,96 (α = 5 %).
D1:2 ≠ D1:4 ≠ D1:8 ≠ D1:16 ≠ D1:32 ≠ D1:64 ≠ D1:128 ≠ D1:256 ≠ D1:512 ≠ D1:1024 ≠ D1:2048 como FColunas = 36,82 > Fcrítico = 2,98 (α = 5 %), . (Dx102)
1:8
1:4
1:2
Grupos
(G)
0,1305
0,101
1:1024
0,0955
0,052
1:2048
Tabela 22: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450 nm) obtidas por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool” de soros do 60º dia após a primeira inoculação, diluídos de
1:200 a 1:204800, de oito camundongos, com veneno de Bothrops jararaca nativo (Grupo III) e irradiado com 60Co
(Grupo IV).
64
Figura 22: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) em
“pool” de soros do 60º dia após a primeira inoculação, diluídos de 1:200 a 1:204800, de oito camundongos inoculados
com veneno de Bothrops jararaca nativo e irradiado com 60Co.
65
66
A análise da tabela 22 e da figura 22 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos III e IV, realizada pelo teste F de
Snedecor, mostrou que houve diferença estatística ao nível de 5% de
significância (FCalculado = 17,42 > Fcrítico = 4,96);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
diluições (1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256; 1:512; 1:1024;
1:2048), realizada pelo teste F de Snedecor, mostrou que houve
diferença estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 36,82 >
Fcrítico = 2,98);
0,3475
0,3325
0,3605
0,3355
0,389
0,3445
V
VI
0,314
0,3235
1:16
0,296
0,313
1:32
0,2765
0,1545
1:64
0,2665
0,1195
1:128
Diluições (D) x 102
0,211
0,0845
1:256
0,146
0,0535
1:512
G V = G VI; como FLinhas = 4,33 < Fcrítico = 4,96 (α = 5 %).
D1:2 ≠ D1:4 ≠ D1:8 ≠ D1:16 ≠ D1:32 ≠ D1:64 ≠ D1:128 ≠ D1:256 ≠ D1:512 ≠ D1:1024 ≠ D1:2048 como FColunas = 11,48 > Fcrítico = 2,98 (α = 5 %), (Dx102)
1:8
1:4
1:2
Grupos
(G)
0,113
0,0315
1:1024
0,055
0,022
1:2048
Tabela 23: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450 nm) obtidas por ensaio
imunoenzimático indireto (ELISA), realizados em “pool” de soros do 60º dia após a primeira inoculação, diluídos de
1:200 a 1:204800, de oito camundongos, com veneno de Bothrops jararacussu nativo (Grupo V) e irradiado com
60
Co (Grupo VI).
67
Figura 23: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) em
“pool” de soros do 60º dia após a primeira inoculação, diluídos de 1:200 a 1:204800, de oito camundongos inoculados
com veneno de Bothrops jararacussu nativo e irradiado com 60Co.
68
69
A análise da tabela 23 e da figura 23 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos V e VI, realizada pelo teste F de
Snedecor, mostrou que não houve diferença estatística ao nível de 5%
de significância (FCalculado = 4,33 < Fcrítico = 4,96);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
diluições (1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256; 1:512; 1:1024;
1:2048), realizada pelo teste F de Snedecor, mostrou que houve
diferença estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 11,48 >
Fcrítico = 2,98);
0,3555
0,3545
0,357
0,371
0,3705
0,3775
VII
VIII
0,345
0,3475
1:16
0,3365
0,33
1:32
0,3185
0,2345
1:64
0,1875
0,168
1:128
Diluições (D) x 102
0,122
0,1175
1:256
0,087
0,079
1:512
G VII = G VIII; como FLinhas = 3,45 < Fcrítico = 4,96 (α = 5 %).
D1:2 ≠ D1:4 ≠ D1:8 ≠ D1:16 ≠ D1:32 ≠ D1:64 ≠ D1:128 ≠ D1:256 ≠ D1:512 ≠ D1:1024 ≠ D1:2048 como FColunas = 132,72 > Fcrítico = 2,98 (α = 5 %) (Dx102)
1:8
1:4
1:2
Grupos
(G)
0,0465
0,0385
1:1024
0,025
0,024
1:2048
Tabela 24: Distribuição dos valores das médias das densidades ópticas (450 nm) obtidas por ensaio imunoenzimático
indireto (ELISA), realizados em “pool” de soros do 60º dia após a primeira inoculação, diluídos de 1:200 a 1:204800,
de oito camundongos, com veneno de Bothrops moojeni nativo (Grupo VII) e irradiado com 60Co (Grupo VIII).
70
Figura 24: Valores médios de densidade óptica (450 nm) obtidos por ensaio imunoenzimático indireto (ELISA) em
“pool” de soros do 60º dia após a primeira inoculação, diluídos de 1:200 a 1:204800, de oito camundongos inoculados
com veneno de Bothrops moojeni nativo e irradiado com 60Co.
71
72
A análise da tabela 24 e da figura 24 permite tecer os seguintes comentários:
1- A análise comparativa entre os Grupos VII e VIII, realizada pelo teste F
de Snedecor, mostrou que não houve diferença estatística ao nível de
5% de significância (FCalculado = 3,45 < Fcrítico = 4,96);
2- A análise comparativa entre os títulos de anticorpos em diferentes
diluições (1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256; 1:512; 1:1024;
1:2048), realizada pelo teste F de Snedecor, mostrou que houve
diferença estatística ao nível de 5% de significância (FCalculado = 132,72 >
Fcrítico = 2,98);
73
4.2.
Capacidade
neutralizante
e
potência
dos
anticorpos
antiveneno nativo e irradiado
Foi avaliada a capacidade neutralizante dos soros antiveneno nativo e
irradiado, obtidos de camundongos hiperimunizados com venenos de Crotalus
durissus terrificus, Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu e
Bothrops
moojeni.
O cálculo da capacidade neutralizante da toxina ou antígeno (CNT) foi
realizado segundo KAISER et al. (56). Para o soro antiveneno nativo de
Crotalus durissus terrificus, por exemplo, o cálculo foi realizado da seguinte
maneira:
CNA = (0,74 – 0,148) x 1 x 105 x (1/100)
CNA = 592 µg de veneno/ml de soro
Para um camundongo de 20 g, por exemplo, uma DL50 do veneno de
Crotalus durissus terrificus é 2,96 µg de veneno. Portanto, 592/2,96 = 200 DL50.
Sendo assim, o soro antiveneno nativo de Crotalus durissus terrificus foi
capaz de neutralizar cerca de 592 µg de veneno por ml de soro, o equivalente a
200 DL50
74
4.2.1 Teste “in vitro”
4.2.1.1. Os resultados obtidos nos testes “in vitro” para a determinação da
capacidade de neutralização de um “pool” dos soros antiveneno crotálico,
obtidos no 60º dia após a primeira inoculação dos dois grupos inoculados com
veneno nativo e irradiado com
60
Co, estão representados nas Tabelas 25 e 26
respectivamente.
Tabela 25: Determinação da capacidade de neutralização de um “pool” dos
soros antiveneno Crotálico obtidos no 60º dia após a primeira inoculação, de
oito camundongos hiperimunizados com veneno nativo, inoculados via
intraperitoneal em quantidades variáveis de DL50 do veneno nativo.
Observações
mortos / vivos
Soro
(µl)
Veneno
DL50
24 horas
48 horas
Mortalidade
(%)
100
1
0:4
0:4
0
100
3
0:4
0:4
0
100
5
2:2
2:2
50
100
10
4:0
4:0
100
100
15
4:0
4:0
100
100
-----
0:4
0:4
0
----
1
4:0
4:0
100
Tabela 26: Determinação da capacidade de neutralização de um “pool” dos
soros antiveneno Crotálico obtidos no 60º dia após a primeira inoculação, de
oito camundongos hiperimunizados com veneno irradiado com 60Co, inoculados
via intraperitoneal em quantidades variáveis de DL50 do veneno nativo.
Observações
mortos / vivos
Soro
(µl)
Veneno
DL50
24 horas
48 horas
Mortalidade
(%)
100
1
0:4
0:4
0
100
3
0:4
0:4
0
100
5
1:3
1:3
25
100
10
3:1
3:1
75
100
15
4:0
4:0
100
100
-----
0:4
0:4
0
----
1
4:0
4:0
100
75
4.2.1.2 Os resultados obtidos nos testes “in vitro” para a determinação da
capacidade de neutralização de um “pool” dos soros antiveneno Bothrops
jararaca, obtidos no 60º dia após a primeira inoculação dos dois grupos
inoculados com veneno nativo e irradiado com
60
Co, estão representados nas
Tabelas 27 e 28 respectivamente.
Tabela 27: Determinação da capacidade de neutralização de um “pool” dos
soros antiveneno Bothrops jararaca obtidos no 60º dia após a primeira
inoculação, de oito camundongos hiperimunizados com veneno nativo,
inoculados via intraperitoneal em quantidades variáveis de DL50 do veneno
nativo.
Observações
mortos / vivos
Soro
(µl)
Veneno
DL50
24 horas
48 horas
Mortalidade
(%)
100
1
0:4
0:4
0
100
3
0:4
0:4
0
100
5
1:3
1:3
25
100
10
4:0
4:0
100
100
15
4:0
4:0
100
100
-----
0:4
0:4
0
----
1
4:0
4:0
100
Tabela 28: Determinação da capacidade de neutralização de um “pool” dos
soros antiveneno Bothrops jararaca obtidos no 60º dia após a primeira
inoculação, de oito camundongos hiperimunizados com veneno irradiado com
60
Co, inoculados via intraperitoneal em quantidades variáveis de DL50 do
veneno nativo.
Observações
mortos / vivos
Soro
(µl)
Veneno
DL50
24 horas
48 horas
Mortalidade
(%)
100
1
0:4
0:4
0
100
3
0:4
0:4
0
100
5
1:3
1:3
25
100
10
4:0
4:0
100
100
15
4:0
4:0
100
100
-----
0:4
0:4
0
----
1
4:0
4:0
100
76
4.2.1.3 Os resultados obtidos nos testes “in vitro” para a determinação da
capacidade de neutralização de um “pool” dos soros antiveneno Bothrops
jararacussu, obtidos no 60º dia após a primeira inoculação dos dois grupos
inoculados com veneno nativo e irradiado com
60
Co, estão representados nas
Tabelas 29 e 30 respectivamente.
Tabela 29: Determinação da capacidade de neutralização de um “pool” dos
soros antiveneno Bothrops jararacussu obtidos no 60º dia após a primeira
inoculação, de oito camundongos hiperimunizados com veneno nativo,
inoculados via intraperitoneal em quantidades variáveis de DL50 do veneno
nativo.
Observações
mortos / vivos
Soro
(µl)
Veneno
DL50
24 horas
48 horas
Mortalidade
(%)
100
1
0:4
0:4
0
100
3
0:4
0:4
0
100
5
2:2
2:2
50
100
10
3:1
3:1
75
100
15
4:0
4:0
100
100
-----
0:4
0:4
0
----
1
4:0
4:0
100
Tabela 30: Determinação da capacidade de neutralização de um “pool” dos
soros antiveneno Bothrops jararacussu obtidos no 60º dia após a primeira
inoculação, de oito camundongos hiperimunizados com veneno irradiado com
60
Co, inoculados via intraperitoneal em quantidades variáveis de DL50 do
veneno nativo.
Observações
mortos / vivos
Soro
(µl)
Veneno
DL50
24 horas
48 horas
Mortalidade
(%)
100
1
0:4
0:4
0
100
3
0:4
0:4
0
100
5
1:3
1:3
25
100
10
3:1
3:1
75
100
15
4:0
4:0
100
100
-----
0:4
0:4
0
----
1
4:0
4:0
100
77
4.2.1.4 Os resultados obtidos nos testes “in vitro” para a determinação da
capacidade de neutralização de um “pool” dos soros antiveneno Bothrops
moojeni, obtidos no 60º dia após a primeira inoculação dos dois grupos
inoculados com veneno nativo e irradiado com
60
Co, estão representados nas
Tabelas 31 e 32 respectivamente.
Tabela 31: Determinação da capacidade de neutralização de um “pool” dos
soros antiveneno Bothrops moojeni obtidos no 60º dia após a primeira
inoculação, de oito camundongos hiperimunizados com veneno nativo,
inoculados via intraperitoneal em quantidades variáveis de DL50 do veneno
nativo.
Observações
mortos / vivos
Soro
(µl)
Veneno
DL50
24 horas
48 horas
Mortalidade
(%)
100
1
0:4
0:4
0
100
3
0:4
0:4
0
100
5
2:2
2:2
50
100
10
3:1
3:1
75
100
15
4:0
4:0
100
100
-----
0:4
0:4
0
----
1
4:0
4:0
100
Tabela 32: Determinação da capacidade de neutralização de um “pool” dos
soros antiveneno Bothrops moojeni obtidos no 60º dia após a primeira
inoculação, de oito camundongos hiperimunizados com veneno irradiado com
60
Co, inoculados via intraperitoneal em quantidades variáveis de DL50 do
veneno nativo.
Observações
mortos / vivos
Soro
(µl)
Veneno
DL50
24 horas
48 horas
Mortalidade
(%)
100
1
0:4
0:4
0
100
3
0:4
0:4
0
100
5
1:3
1:3
25
100
10
3:1
3:1
75
100
15
4:0
4:0
100
100
-----
0:4
0:4
0
----
1
4:0
4:0
100
78
4.2.1.5 Os resultados obtidos nos testes “in vitro” para a determinação da
potência de neutralização de um “pool” dos soros antiveneno crotálico, obtidos
no 60º dia após a primeira inoculação dos dois grupos inoculados com veneno
nativo e irradiado com
60
Co, estão representados nas Tabelas 33 e 34
respectivamente e Figura 25.
Tabela 33: Determinação da potência de neutralização do “pool” de soros
antiveneno crotálico, obtidos de oito camundongos hiperimunizados com
veneno nativo, inoculados via intraperitoneal em concentrações variáveis de
soro e fixada a concentração do veneno em 5 DL 50 do veneno nativo.
Diluição
Soro
Veneno
DL50
Mortos/Vivos Mortos/Vivos Mortalidade
24 horas
48 horas
(%)
Puro
5
2:2
2:2
50
1:5
5
4:0
4:0
100
1:10
5
4:0
4:0
100
1:20
5
4:0
4:0
100
1:40
5
4:0
4:0
100
1:80
5
4:0
4:0
100
Puro
-----
0:4
0:4
0
----
5
4:0
4:0
100
O “pool” dos soros obtidos de camundongos hiperimunizados com veneno
nativo de Crotalus durissus terrificus neutralizaram 0,592 mg/ml, equivalente a
200 DL50 do veneno nativo.
79
Tabela 34: Determinação da potência de neutralização do “pool” de soros
antiveneno crotálico, obtidos de oito camundongos hiperimunizados com
veneno irradiado com
60
Co, inoculados via intraperitoneal em concentrações
variáveis de soro e fixada a concentração do veneno em 5 DL50 do veneno
nativo.
Diluição
Soro
Veneno
DL50
Mortos/Vivos Mortos/Vivos Mortalidade
24 horas
48 horas
(%)
Puro
5
1:3
1:3
25
1:5
5
2:2
2:2
50
1:10
5
2:2
2:2
50
1:20
5
3:1
3:1
75
1:40
5
3:1
3:1
75
1:80
5
4:0
4:0
100
Puro
-----
0:4
0:4
0
----
5
4:0
4:0
100
O “pool” dos soros obtidos de camundongos hiperimunizados com veneno
irradiado de Crotalus durissus terrificus neutralizaram 5,92 mg/ml, equivalente
a 2000 DL50 do veneno nativo.
80
Figura 25: Neutralização da atividade tóxica do veneno Crotálico pelo soro
obtido contra o veneno nativo (-■-) e irradiado (-●-).
81
4.2.1.6 Os resultados obtidos nos testes “in vitro” para a determinação da
potência de neutralização de um “pool” dos soros antiveneno Bothrops
jararaca, obtidos no 60º dia após a primeira inoculação dos dois grupos
inoculados com veneno nativo e irradiado com
60
Co, estão representados nas
Tabelas 35 e 36 respectivamente e Figura 26.
Tabela 35: Determinação da potência de neutralização do “pool” de soros
antiveneno Bothrops jararaca, obtidos de oito camundongos hiperimunizados
com veneno nativo, inoculados via intraperitoneal em concentrações variáveis
de soro e fixada a concentração do veneno em 5 DL 50 do veneno nativo.
Diluição
Soro
Veneno
DL50
Mortos/Vivos Mortos/Vivos Mortalidade
24 horas
48 horas
(%)
Puro
5
1:3
1:3
25
1:5
5
2:2
2:2
50
1:10
5
3:1
3:1
75
1:20
5
3:1
3:1
75
1:40
5
4:0
4:0
100
1:80
5
4:0
4:0
100
Puro
-----
0:4
0:4
0
----
5
4:0
4:0
100
O “pool” dos soros obtidos de camundongos hiperimunizados com veneno
nativo de Bothrops jararaca neutralizaram 48 mg/ml, equivalente a 1000 DL50
do veneno nativo.
82
Tabela 36: Determinação da potência de neutralização do “pool” de soros
antiveneno Bothrops jararaca, obtidos de oito camundongos hiperimunizados
com veneno irradiado com
60
Co, inoculados via intraperitoneal em
concentrações variáveis de soro e fixada a concentração do veneno em 5
DL50 do veneno nativo.
Diluição
Soro
Veneno
DL50
Mortos/Vivos Mortos/Vivos Mortalidade
24 horas
48 horas
(%)
Puro
5
1:3
1:3
25
1:5
5
2:2
2:2
50
1:10
5
3:1
3:1
75
1:20
5
3:1
3:1
75
1:40
5
4:0
4:0
100
1:80
5
4:0
4:0
100
Puro
-----
0:4
0:4
0
----
5
4:0
4:0
100
O “pool” dos soros obtidos de camundongos hiperimunizados com veneno
irradiado de Bothrops jararaca neutralizaram 48 mg/ml, equivalente a 1000
DL50 do veneno nativo.
83
Figura 26: Neutralização da atividade tóxica do veneno de Bothrops jararaca
pelo soro obtido contra o veneno nativo (-■-) e irradiado (-●-).
84
4.2.1.7 Os resultados obtidos nos testes “in vitro” para a determinação da
potência de neutralização de um “pool” dos soros antiveneno Bothrops
jararacussu, obtidos no 60º dia após a primeira inoculação dos dois grupos
inoculados com veneno nativo e irradiado com
60
Co, estão representados nas
Tabelas 37 e 38 respectivamente e Figura 27.
Tabela 37: Determinação da potência de neutralização do “pool” de soros
antiveneno
Bothrops
jararacussu,
obtidos
de
oito
camundongos
hiperimunizados com veneno nativo, inoculados via intraperitoneal em
concentrações variáveis de soro e fixada a concentração do veneno em 5
DL50 do veneno nativo.
Diluição
Soro
Veneno
DL50
Mortos/Vivos Mortos/Vivos Mortalidade
24 horas
48 horas
(%)
Puro
5
2:2
2:2
50
1:5
5
2:2
2:2
50
1:10
5
2:2
2:2
50
1:20
5
2:2
2:2
50
1:40
5
3:1
3:1
75
1:80
5
4:0
4:0
100
Puro
-----
0:4
0:4
0
----
5
4:0
4:0
100
O “pool” dos soros obtidos de camundongos hiperimunizados com veneno
nativo de Bothrops jararacussu neutralizaram 352 mg/ml, equivalente a 4000
DL50 do veneno nativo.
85
Tabela 38: Determinação da potência de neutralização do “pool” de soros
antiveneno
Bothrops
hiperimunizados
jararacussu,
com
veneno
obtidos
irradiado
de
com
60
oito
Co,
camundongos
inoculados
via
intraperitoneal em concentrações variáveis de soro e fixada a concentração do
veneno em 5 DL50 do veneno nativo.
Diluição
Soro
Veneno
DL50
Mortos/Vivos Mortos/Vivos Mortalidade
24 horas
48 horas
(%)
Puro
5
1:3
1:3
25
1:5
5
2:2
2:2
50
1:10
5
2:2
2:2
50
1:20
5
3:1
3:1
75
1:40
5
3:1
3:1
75
1:80
5
4:0
4:0
100
Puro
-----
0:4
0:4
0
----
5
4:0
4:0
100
O “pool” dos soros obtidos de camundongos hiperimunizados com veneno
irradiado de Bothrops jararacussu neutralizaram 176 mg/ml, equivalente a
2000 DL50 do veneno nativo.
86
Figura 27: Neutralização da atividade tóxica do veneno de Bothrops
jararacussu pelo soro obtido contra o veneno nativo (-■-) e irradiado (-●-).
87
4.2.1.8 Os resultados obtidos nos testes “in vitro” para a determinação da
potência de neutralização de um “pool” dos soros antiveneno Bothrops moojeni,
obtidos no 60º dia após a primeira inoculação dos dois grupos inoculados com
veneno nativo e irradiado com
60
Co, estão representados nas Tabelas 39 e 40
respectivamente e Figura 28.
Tabela 39: Determinação da potência de neutralização do “pool” de soros
antiveneno Bothrops moojeni, obtidos de oito camundongos hiperimunizados
com veneno nativo, inoculados via intraperitoneal em concentrações variáveis
de soro e fixada a concentração do veneno em 5 DL 50 do veneno nativo.
Diluição
Soro
Veneno
DL50
Mortos/Vivos Mortos/Vivos Mortalidade
24 horas
48 horas
(%)
Puro
5
2:2
2:2
50
1:5
5
2:2
2:2
50
1:10
5
2:2
2:2
50
1:20
5
3:1
3:1
75
1:40
5
3:1
3:1
75
1:80
5
4:0
4:0
100
Puro
-----
0:4
0:4
0
----
5
4:0
4:0
100
O “pool” dos soros obtidos de camundongos hiperimunizados com veneno
nativo de Bothrops moojeni neutralizaram 176 mg/ml, equivalente a 2000 DL50
do veneno nativo.
88
Tabela 40: Determinação da potência de neutralização do “pool” de soros
antiveneno Bothrops moojeni, obtidos de oito camundongos hiperimunizados
com veneno irradiado com
60
Co, inoculados via intraperitoneal em
concentrações variáveis de soro e fixada a concentração do veneno em 5
DL50 do veneno nativo.
Diluição
Soro
Veneno
DL50
Mortos/Vivos Mortos/Vivos Mortalidade
24 horas
48 horas
(%)
Puro
5
1:3
1:3
25
1:5
5
2:2
2:2
50
1:10
5
2:2
2:2
50
1:20
5
3:1
3:1
75
1:40
5
3:1
3:1
75
1:80
5
4:0
4:0
100
Puro
-----
0:4
0:4
0
----
5
4:0
4:0
100
O “pool” dos soros obtidos de camundongos hiperimunizados com veneno
irradiado de Bothrops moojeni neutralizaram 176 mg/ml, equivalente a 2000
DL50 do veneno nativo.
89
Figura 28: Neutralização da atividade tóxica do veneno de Bothrops
moojeni pelo soro obtido contra o veneno nativo (-■-) e irradiado (-●-).
90
4.2.2 Teste “in vivo”
Os resultados obtidos nos testes “in vivo” dos camundongos inoculados com
veneno de Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu
e Bothrops moojeni, realizado no 60º dia após a primeira inoculação dos
grupos inoculados com veneno natural e irradiado com
60
Co, mostraram que
não houve óbito em nenhum dos grupos estudados após 24 e 48 h de
observação.
Para se verificar a toxicidade do veneno, um grupo de animais não
hiperimunizados recebeu cinco DL50 de veneno nativo de Crotalus durissus
terrificus, sendo observado 100% de mortalidade. O mesmo fenômeno foi
observado para os venenos de Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu e
Bothrops moojeni.
91
4.3. Avaliação clínica dos animais
Todos os animais dos nove grupos estudados foram examinados durante o
processo de hiperimunização. As descrições das alterações seguem abaixo:
Grupo I – inoculado com veneno nativo de Crotalus durissus terrificus
Nenhuma alteração no local das inoculações foi notada durante o processo de
hiperimunização.
Grupo II – inoculado com veneno irradiado de Crotalus durissus terrificus
Nenhuma alteração no local das inoculações foi notada durante o processo de
hiperimunização.
Grupo III – inoculado com veneno nativo de Bothrops jararaca
Foi notada presença de necrose no local das inoculações em seis dos oito
animais inoculados. O edema no local das inoculações era extenso em todos
os animais. Ocorreram três mortes durante o processo de hiperimunização.
Grupo IV – inoculado com veneno irradiado de Bothrops jararaca
Um pequeno edema no local das inoculações foi notado em três animais. Isto
ocorreu somente na primeira inoculação ao longo do processo de
hiperimunização.
Grupo V – inoculado com veneno nativo de Bothrops jararacussu
Foi notada presença de necrose no local das inoculações em três dos oito
animais inoculados. O edema no local das inoculações era extenso em todos
os animais. Ocorreram duas mortes durante o processo de hiperimunização.
Grupo VI – inoculado com veneno irradiado de Bothrops jararacussu
Um pequeno edema no local das inoculações foi notado em dois animais
somente na primeira inoculação ao longo do processo de hiperimunização.
Grupo VII – inoculado com veneno nativo de Bothrops moojeni
Foi notada presença de necrose no local das inoculações em dois dos oito
animais inoculados. O edema no local das inoculações era extenso em todos
os animais. Ocorreram duas mortes durante o processo de hiperimunização.
Grupo VIII – inoculado com veneno irradiado de Bothrops moojeni
Um pequeno edema no local das inoculações foi notado em três animais. Isto
ocorreu somente na primeira inoculação ao longo do processo de
hiperimunização.
Grupo IX - controle
Nenhuma alteração no local das inoculações foi notada durante todo o período
de observação.
92
Figura 29: Observação de extensa área necrótica causada dois dias após a
aplicação intradérmica de veneno nativo de Bothrops jararaca
Figura 30: Observação da área de inoculação dois dias após a aplicação
intradérmica de veneno irradiado de Bothrops jararaca
93
5. Discussão
O único tratamento eficaz preconizado até o momento para os acidentes
causados por serpentes peçonhentas é o soro heterólogo específico (50).
Tradicionalmente, estes soros são produzidos em eqüinos hiperimunizados
(12), e por tratar-se de um soro heterólogo pode produzir reações indesejáveis
no paciente (9).
Por outro lado, a produção do soro em animais domésticos apresenta como
inconvenientes os efeitos indesejáveis da inoculação do veneno bruto. Estes se
caracterizam por reações locais intensas acompanhadas de necrose, fístulas,
hemorragias (13) culminando com o afastamento destes animais da linha de
produção. Segundo Ângulo et al. (58), poucos estudos têm sido realizados
sobre as alterações clínicas e fisiológicas dos animais imunizados com
venenos para a produção de antivenenos.
No intuito de reduzir a extensão destas alterações, a destoxicação dos
venenos de serpentes por vários métodos têm sido sugeridas (13, 18-27, 59).
Assim, os objetivos deste trabalho foram delineados com intuito de investigar a
eficiência da técnica de irradiação de venenos com
60
Co na produção de soros
antivenenos em camundongos. Além disso, a técnica de ELISA previamente
padronizada, foi utilizada para detectar e acompanhar o título de anticorpos
durante o processo de hiperimunização. Por fim, foram avaliadas a capacidade
de soroneutralização e a potência dos soros obtidos por meio de métodos “in
vitro” e “in vivo” e os efeitos colaterais do processo de imunização foram
registrados.
O presente trabalho foi realizado com venenos nativos e irradiados, cuja
DL50 utilizada mostrou-se dentro dos valores observados na literatura (27, 33,
60-64).
Para se avaliar a atividade imunogênica de venenos, toxinas e anticorpos
vários métodos foram desenvolvidos nos últimos anos (65). Dessa forma, os
testes de radioimunoensaios, de hemaglutinação, de imunoeletroforese, de
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) e imunoensaios fluorescentes
foram avaliados (45, 65).
Theakston et al. (43) foram os primeiros pesquisadores a descreverem o
uso do teste de ELISA para a detecção de venenos de serpentes e anticorpos
antivenenos. Este teste tem mostrado ser um método com melhor
94
especificidade, sensibilidade,
rapidez de execução, simplicidade e
baixo
custo (65, 66).
Devido a sua sensibilidade e especificidade, Oguiura et al. (66) utilizaram o
método de ELISA para quantificar a crotamina do veneno de Crotalus durissus
terrificus. Barral-Neto et al. (67), avaliaram experimentalmente a detecção de
veneno de Bothrops jararaca por esta técnica.
Clissa et al. (27) avaliaram a atividade imunogênica do veneno nativo e
irradiado de Crotalus durissus terrificus em coelhos por meio de ensaio
imunoenzimático (ELISA).
Por outro lado, com a crise na produção de soros antiofídicos ocorrida no
Brasil na década de 80, pesquisadores do Instituto de Pesquisas Energéticas e
Nucleares (IPEN/CNEN-SP), iniciaram estudos sobre o uso da radiação
ionizante como ferramenta na destoxicação de venenos (25-27, 33-42, 68).
Guarnieri et al. (68) analisando os efeitos de doses crescentes de radiação
no veneno de Bothrops jararaca em solução salina a uma concentração de 2,0
mg/ml não observaram precipitação, mas verificaram que ocorreu a formação
de agregados protéicos solúveis nas amostras irradiadas, proporcionalmente
ao aumento da dose. Quando o veneno de Bothrops jararacussu foi irradiado
nas mesmas condições, também não foi observada a precipitação das
proteínas, mas sim a formação de agregados em solução (38).
Posteriormente, Nascimento et al. (26) avaliaram a influência da radiação
ionizante sobre a crotoxina do veneno de Crotalus durissus terrificus. A seguir,
utilizando o método de ELISA verificaram seus aspectos imunológicos.
De Paula (41) utilizando o ensaio imunoenzimático (ELISA), avaliou
qualitativa e quantitativamente o nível de anticorpos antiveneno de Crotalus
durissus terrificus e de crotoxina irradiada em fonte de
60
Co produzidos em
camundongo. Verificou que os soros produzidos foram capazes de reconhecer
as toxinas nativas.
Nesta pesquisa, o teste de ELISA foi utilizado para detectar, monitorar e
comparar os títulos de anticorpos nos grupos experimentais de camundongos
que receberam os diferentes venenos de Crotalus durissus terrificus, Bothrops
jararaca, Bothrops jararacussu e Bothrops moojeni na forma nativa e irradiada
com 60Co.
Os valores de densidade óptica no teste de ELISA para as diversas
diluições do veneno nativo e irradiado de Crotalus durissus terrificus
95
demonstraram que não houve diferença estatisticamente significante entre os
dois grupos estudados.
Os resultados observados mostraram um nível maior de anticorpos nos
dias 15, 21, 30 e 45 no grupo inoculado com veneno nativo. Entretanto, no dia
60, os níveis se equivaleram nas diluições de 1:200 e 1:400. Acima destas
diluições, o veneno irradiado mostrou níveis maiores de anticorpos.
Notamos ainda que os anticorpos já são formados a partir do primeiro
inóculo e que o pico é alcançado no 60º dia. Neste último realizamos uma
titulação dos níveis de anticorpos de 1:200 até 1:204800. Não houve diferença
estatística entre os dois grupos estudados, e os níveis de anticorpos se
mantiveram elevados até a diluição de 1:6400.
Observamos, pelos títulos de anticorpos produzidos tanto no grupo de
camundongos hiperimunizados com veneno nativo quanto no grupo de
camundongos hiperimunizados com veneno irradiado de Crotalus durissus
terrificus que ambos venenos foram imunogênicos e induziram a formação de
anticorpos capazes de reconhecer o veneno nativo de Crotalus durissus
terrificus.
Os valores de densidade óptica no teste de ELISA para as diversas
diluições do veneno nativo e irradiado de Bothrops jararaca demonstraram que
não houve diferença estatística entre os dois grupos estudados.
Os resultados observados mostraram um nível maior de anticorpos nos
dias 15, 21 e 30 no grupo inoculado com veneno nativo. Entretanto, a partir do
dia 45, o grupo inoculado com veneno irradiado desenvolveram títulos maiores.
Os anticorpos já são formados a partir do primeiro inóculo e o pico foi
alcançado no dia 45, mantendo-se praticamente o mesmo no dia 60. Neste
último realizamos uma titulação dos níveis de anticorpos de 1:200 até
1:204800. Houve diferença estatística entre os dois grupos estudados. Os
níveis de anticorpos do grupo que recebeu veneno irradiado foram maiores que
os do grupo que recebeu veneno nativo praticamente em todas as diluições.
Estes títulos se mantiveram elevados até a diluição de 1:102400.
Observamos, pelos títulos de anticorpos produzidos tanto no grupo de
camundongos hiperimunizados com veneno nativo quanto no grupo de
camundongos hiperimunizados com veneno irradiado de Bothrops jararaca que
ambos venenos foram imunogênicos e induziram a formação de anticorpos
capazes de reconhecer o veneno nativo de Bothrops jararaca.
96
Os valores de densidade óptica no teste de ELISA para as diversas
diluições do veneno nativo e irradiado de Bothrops jararacussu demonstraram
que não houve diferença estatística entre os dois grupos estudados.
Os resultados observados mostraram um número maior de anticorpos nos
dias 15 e 60 no grupo inoculado com veneno nativo, e maiores nos dias 21, 30
e 45 no grupo com veneno irradiado.
Os anticorpos já são formados a partir do primeiro inóculo e o pico foi
alcançado no dia 60 para o grupo com veneno nativo e no dia 45 no grupo com
veneno irradiado, tendo este último uma pequena queda no dia 60. No dia 60,
realizamos uma titulação dos níveis de anticorpos de 1:200 até 1:204800. Não
houve diferença estatística entre os dois grupos estudados. Os níveis de
anticorpos do grupo que recebeu veneno nativo foram maiores que os do grupo
que recebeu veneno irradiado até a diluição de 1: 3200. A partir desta diluição,
o grupo com veneno irradiado mostrou maiores títulos mantendo níveis
elevados até a diluição de 1:204800. No grupo inoculado com veneno nativo os
títulos permaneceram elevados até a diluição de 1: 51200.
Observamos, pelos títulos de anticorpos produzidos tanto no grupo de
camundongos hiperimunizados com veneno nativo quanto no grupo de
camundongos hiperimunizados com veneno irradiado de Bothrops jararacussu
que ambos venenos foram imunogênicos e induziram a formação de anticorpos
capazes de reconhecer o veneno nativo de Bothrops jararacussu.
Os valores de densidade óptica no teste de ELISA para as diversas
diluições do veneno nativo e irradiado de Bothrops moojeni demonstraram que
não houve diferença estatística entre os dois grupos estudados.
Os resultados observados mostraram um número maior de anticorpos nos
dias 15 e 21 no grupo inoculado com veneno nativo, e maiores nos dias 30, 45
e 60 no grupo com veneno irradiado.
Os anticorpos já são formados a partir do primeiro inóculo, quando o grupo
inoculado com veneno nativo desenvolve títulos maiores. O pico foi alcançado
no dia 45 e se manteve praticamente o mesmo até o dia 60. Neste último,
realizamos uma titulação dos níveis de anticorpos de 1:200 até 1:204800. Não
houve diferença estatística entre os dois grupos estudados. Os níveis de
anticorpos do grupo que recebeu veneno irradiado foram maiores que os do
grupo que recebeu veneno nativo praticamente em todas as diluições. Ambos
os grupos mantiveram títulos elevados até a diluição de 1: 51200.
97
Observamos, pelos títulos de anticorpos produzidos tanto no grupo de
camundongos hiperimunizados com veneno nativo quanto no grupo de
camundongos hiperimunizados com veneno irradiado de Bothrops moojeni que
ambos venenos foram imunogênicos e induziram a formação de anticorpos
capazes de reconhecer o veneno nativo de Bothrops moojeni.
A análise dos resultados obtidos em seu conjunto permite diversas
considerações e observações a partir da literatura.
Assim, tem sido descrito que a irradiação de peçonhas de serpentes e
toxinas isoladas causam a diminuição de sua toxicidade (26, 27, 35, 37, 42, 6870).
De acordo com Souza Filho et al. (37), Nascimento et al. (71) e BoniMitake et al. (42), a diminuição da toxicidade da crotoxina e da crotamina, pela
radiação gama de
60
Co após a administração em camundongos, foi cerca de
duas vezes menor.
Segundo Costa (72), a diminuição da toxicidade da peçonha de abelha
(Apis mellifera) irradiada pode ser devido às alterações estruturais nas
moléculas de proteínas, observados a partir de resultados de espectrometria,
eletroforese e cromatografia líquida de alto desempenho. Assim sendo, podese sugerir que estas alterações estruturais nos componentes da peçonha
poderiam promover a atenuação da toxicidade da mesma.
A toxicidade em camundongos, de amostras nativa e irradiada com dose
de 1000 Gy, da fração crotoxina do veneno de Crotalus durissus terrificus foi
verificada por Souza-Filho et al. (37). Estes autores observaram que a amostra
irradiada (DL50 de 309 µg/Kg) foi duas vezes menos letal que a forma nativa
(147 µg/Kg). Quando a irradiação era aumentada para 1500 Gy, havia uma
diminuição da letalidade para cerca de 3,5 vezes.
Estes resultados são compatíveis também com os encontrados por outros
autores (27, 35, 73), que sugeriram que a redução da toxicidade seria
explicada pela formação de agregados após a irradiação. Neste caso, rejeita-se
a hipótese de uma simples mudança na estrutura da molécula de proteína
indicando a formação de um novo composto.
Segundo Cardi et al. (74), a irradiação gama provou ser o método de maior
sucesso para a destoxicação da crotoxina. Segundo o autor, a redução da
toxidade se deve a uma endocitose precoce da crotoxina por células
fagocíticas, melhorando o processamento do antígeno. Isto porque a irradiação
98
promove oxidação da molécula facilitando sua fagocitose, devido à presença
dos receptores “Scavenger” presente na superfície dos macrófagos.
É sabido que os antígenos ao entrarem no organismo sofrem um processo
de oxidação pelas células de defesa para facilitar o processo de fagocitose.
Diante de amostras irradiadas, os macrófagos já encontram estas moléculas
oxidadas e portanto, eliminam esta etapa do processo. Um melhor
processamento, associado a uma apresentação mais rápida do antígeno faz
com que o sistema imunológico produza anticorpos mais completos, contra um
maior número de epítopos do antígeno (25).
Para Hati et al. (59) a destoxicação pode resultar em alterações estruturais
de epítopos relevantes e por essa razão diminuir a eficácia dos anticorpos
produzidos contra estas toxinas.
Souza et al. (75) investigaram a habilidade da radiação gama produzida
pelo
60
Co (2000 Gy) na atenuação dos efeitos tóxicos do veneno de Bothrops
jararacussu em junções neuromusculares de camundongos. Concluíram que a
radiação é capaz de abolir a paralisia e a miotoxidade causada pelo veneno.
Segundo os mesmos autores, estes achados apóiam a hipótese de que a
radiação gama pode ser uma importante ferramenta para melhorar a produção
de soros antiofídicos por reduzir a toxicidade dos venenos, preservando sua
imunogenicidade.
No presente trabalho foi possível observar que o método de ELISA
mostrou-se útil no acompanhamento da produção de anticorpos durante o
processo de hiperimunização de camundongos com veneno nativo e irradiado
das quatro espécies de serpentes avaliadas.
O método permitiu ainda observar detalhadamente a evolução e o perfil
dos anticorpos produzidos.
Os testes de soroneutralização podem ser realizados por meio de técnicas
“in vitro” e “in vivo” utilizando animais de experimentação (44).
Nos testes de soroneutralização “in vitro” realizados nesta pesquisa,
observando-se a sobrevida dos animais após o desafio, notamos que aqueles
que receberam soro de animais imunizados com veneno irradiado de Crotalus
durissus terrificus, ao receberem o desafio de cinco DL50, apresentaram uma
porcentagem de sobrevida maior que os camundongos que receberam soro de
animais imunizados com veneno nativo de Crotalus durissus terrificus. No
primeiro, a mortalidade foi de 25%, contra 50% no grupo que recebeu soro de
animais imunizados com veneno nativo.
99
Ao se realizar o desafio com 10 DL50 observou-se sobrevida de 25% dos
animais no grupo que recebeu soro produzido em animais imunizados com
veneno irradiado, contra 0% de sobrevida no grupo que recebeu soro
produzido em animais imunizados com veneno nativo.
A inocuidade do soro foi avaliada pela inoculação de soro total,
observando-se uma sobrevida de 100% dos animais. Por outro lado, ao se
inocular apenas veneno nativo, a mortalidade observada foi de 100%,
demonstrando-se assim a toxicidade do veneno.
A análise dos resultados permite sugerir que o soro produzido a partir do
veneno de Crotalus durissus terrificus irradiado foi mais eficaz que o produzido
a partir do veneno nativo.
Nos testes de soroneutralização “in vitro” realizados, após o desafio de
cinco DL50 de veneno nativo de Bothrops jararaca, observamos a mesma
porcentagem de sobrevida tanto no grupo de animais que receberam soro de
animais imunizados com veneno nativo de Bothrops jararaca quanto no grupo
de camundongos que receberam soro de animais imunizados com veneno
irradiado. A mortalidade observada foi de 25%.
Após o desafio “in vitro” com cinco DL50 de Bothrops jararacussu e
Bothrops moojeni, observamos que aqueles animais que receberam soro de
animais imunizados com veneno irradiado apresentaram uma sobrevida maior
que os animais que receberam soro de animais imunizados com veneno nativo.
A mortalidade dos animais que receberam soro produzido a partir de veneno
irradiado foi de 25%, contra 50% do grupo que recebeu soro produzido a partir
de veneno nativo.
O desafio com 10 DL50, tanto no grupo de animais que receberam soro de
animais imunizados com veneno nativo, quanto no grupo de animais que
receberam soro de animais imunizados com veneno irradiado apresentaram
uma sobrevida de 25%.
A inocuidade do soro foi avaliada pela inoculação de soro total,
observando-se uma sobrevida de 100% dos animais. Por outro lado, ao se
inocular apenas veneno nativo, a mortalidade observada foi de 100%,
demonstrando-se assim a toxicidade do veneno.
Mandal et al. (76) imunizaram coelhos com veneno irradiado da serpente
Vipera russeli e observaram que 0,1 ml do soro obtido destes animais
neutralizava cinco DL50 em camundongos. Estes resultados foram semelhantes
100
aos observados no presente trabalho, em que pese a serpente estudada ser de
espécie diferente das propostas.
Os testes de soroneutralização e de potência podem ainda ser realizados
sem a necessidade de animais de experimentação. Assim, BARBOSA et al.
(44) usaram o método de ELISA para determinar a potência
de soros
hiperimunes de venenos crotálicos e botrópicos. Houve diminuição dos custos
e houve melhora na sua reprodutibilidade quando comparado com os testes “in
vivo”.
Maria et al. (77) e Heneine et al. (46), verificando a correlação entre
métodos “in vivo” e “in vitro” para a neutralização e potência de soros
antibotrópicos, sugerem que o método de ELISA pode ser utilizado como uma
técnica “in vitro” para se avaliar a potência de soros antibotrópicos brasileiros
durante o processo de hiperimunização. Entretanto, o teste clássico “in vivo”
em camundongos deve ser usado nos testes finais da produção do antiveneno.
Desta forma, não se pode dispensar o emprego de animais de experimentação
nos testes finais de avaliação de soroneutralização e potência, como o
realizado no presente trabalho.
O teste de potência de neutralização foi realizado no presente trabalho com
o intuito de se verificar a quantidade de veneno neutralizada por um mililitro de
soro.
A potência de neutralização de cinco DL50, utilizando-se um “pool” de soros
obtidos de um grupo de camundongos inoculados com veneno nativo Crotalus
durissus terrificus foi de 0,592 mg de veneno/ml de antiveneno, equivalente a
200 DL50. Para tanto, se utilizaram 100 µl de soro puro que foi capaz de reduzir
a mortalidade para 50%. Quando se utilizou um “pool” de soros obtidos de um
grupo de camundongos inoculados com veneno irradiado de Crotalus durissus
terrificus, a mortalidade foi reduzida a 50%, quando se utilizaram 100 µl deste
soro na diluição de 1/10. Sua capacidade de neutralização foi de 5,92 mg de
veneno/ml de antiveneno, equivalente a 2000 DL50, maior, portanto, que a
verificada anteriormente.
Cabe ainda ressaltar que quando se utilizou o soro obtido com o veneno
nativo, 100% dos animais foram a óbito na diluição de 1/5, enquanto quando se
utilizou o soro obtido com veneno irradiado, a mortalidade foi de 100% apenas
com a diluição de 1/80.
Um grupo de animais foi testado apenas com o soro puro para avaliar a
sua inocuidade, observando-se 0% de mortalidade. Outro grupo de animais
101
recebeu cinco DL50 de veneno nativo de Crotalus durissus terrificus para
verificação de sua toxicidade, observando-se 100% de mortalidade.
Estes resultados demonstram que o soro obtido a partir do grupo de
camundongos inoculados com veneno irradiado de Crotalus durissus terrificus
teve um melhor desempenho que o soro obtido a partir do grupo inoculado com
veneno nativo.
A potência de neutralização de cinco DL50, utilizando-se um “pool” de soros
obtidos de um grupo de camundongos inoculados com veneno nativo Bothrops
jararaca foi de 48 mg de veneno/ml de antiveneno, equivalente a 1000 DL50.
Para tanto, se utilizaram 100 µl de soro diluído 1/5 que foi capaz de reduzir a
mortalidade para 50%. Quando se utilizou um “pool” de soros obtidos de um
grupo de camundongos inoculados com veneno irradiado de Bothrops jararaca,
a mortalidade foi reduzida a 50%, quando se utilizaram 100 µl deste soro na
diluição de 1/5. Sua capacidade de neutralização foi de 48 mg de veneno/ml de
antiveneno, equivalente a 1000 DL50.
Quando se utilizou o soro obtido a partir do veneno nativo, 100% dos
animais foram a óbito na diluição de 1/40. O mesmo fenômeno ocorreu ao se
utilizar o soro obtido a partir do veneno irradiado.
Diante destes resultados, notamos que o soro obtido a partir do grupo de
camundongos inoculados com veneno nativo de Bothrops jararaca teve o
mesmo desempenho que o soro obtido a partir do grupo inoculado com veneno
irradiado.
A potência de neutralização de cinco DL50, utilizando-se um “pool” de soros
obtidos de um grupo de camundongos inoculados com veneno nativo de
Bothrops jararacussu foi de 352 mg de veneno/ml de antiveneno, equivalente a
4000 DL50. Para tanto, se utilizaram 100 µl de soro diluído 1/20 que foi capaz
de reduzir a mortalidade para 50%. Quando se utilizou um “pool” de soros
obtidos de um grupo de camundongos inoculados com veneno irradiado de
Bothrops jararacussu, a mortalidade foi reduzida a 50%, quando se utilizaram
100 µl deste soro na diluição de 1/10. Sua capacidade de neutralização foi de
176 mg de veneno/ml de antiveneno, equivalente a 2000 DL50.
Quando se utilizou o soro obtido a partir do veneno nativo, a mortalidade
esteve em 50% quando se utilizaram 100µl do veneno puro e diluídos a 1/5,
1/10 e 1/20; 75% de mortalidade na diluição de 1/40 e 100% de mortalidade na
diluição de 1/80. Quando se utilizou o soro obtido com veneno irradiado, a
mortalidade esteve em 25% quando se utilizaram 100µl do veneno puro, em
102
50% quando diluídos em 1/5 e 1/10; 75% na diluição de 1/20 e 1/40 e; 100% de
mortalidade na diluição de 1/80.
Diante destes resultados, notamos que o soro obtido a partir do grupo de
camundongos inoculados com veneno nativo de Bothrops jararacussu teve um
melhor desempenho que o soro obtido a partir do grupo inoculado com veneno
irradiado.
A potência de neutralização de cinco DL50, utilizando-se um “pool” de soros
obtidos de um grupo de camundongos inoculados com veneno nativo Bothrops
moojeni foi de 176 mg de veneno/ml de antiveneno, equivalente a 2000 DL50.
Para tanto, se utilizaram 100 µl de soro diluído 1/20 que foi capaz de reduzir a
mortalidade para 50%. Quando se utilizou um “pool” de soros obtidos de um
grupo de camundongos inoculados com veneno irradiado de Bothrops moojeni,
a mortalidade foi reduzida a 50%, quando se utilizaram 100 µl deste soro na
diluição de 1/20. Sua capacidade de neutralização foi de 176 mg de veneno/ml
de antiveneno, equivalente a 2000 DL50.
Quando se utilizou o soro obtido a partir do veneno nativo, a mortalidade
esteve em 50% quando se utilizaram 100µl do veneno puro e diluídos em 1/5 e
1/10; 75% na diluição de 1/20 e 1/40 e; 100% de mortalidade na diluição de
1/80. Quando se utilizou o soro obtido com veneno irradiado, a mortalidade
esteve em 25% quando se utilizaram 100µl do veneno puro, em 50% quando
diluídos em 1/5 e 1/10; 75% na diluição de 1/20 e 1/40 e; 100% de mortalidade
na diluição de 1/80.
Diante destes resultados, notamos que o soro obtido a partir do grupo de
camundongos inoculados com veneno nativo de Bothrops moojeni teve
desempenho semelhante ao soro obtido a partir do grupo inoculado com
veneno irradiado.
A fim de se verificar a capacidade neutralizante “in vivo”, os animais
hiperimunizados foram desafiados com os diferentes venenos nativos.
Assim, foram realizados testes com veneno de Crotalus durissus terrificus,
Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu e Bothrops moojeni, no 60º dia após a
primeira inoculação dos dois grupos inoculados com veneno natural e irradiado
com
60
Co. O desafio foi realizado com cinco DL50 de veneno nativo e os
animais foram observados durante 48 horas. Foi registrado 100 % de sobrevida
para todos os grupos testados. Isto sugere que o processo de imunização dos
camundongos foi eficiente na neutralização de cinco DL50 dos diferentes
venenos nativos.
103
Os testes de soroneutralização (in vivo e in vitro) mostraram que todos os
soros produzidos foram capazes de neutralizar os venenos homólogos nativos,
corroborando os trabalhos (26, 27, 35, 37, 42, 68) que afirmam que a radiação
ionizante tem a propriedade de atenuar a toxicidade de venenos sem
comprometer contudo as
suas
propriedades
imunológicas. Entretanto,
observamos que o soro produzido contra o veneno de cascavel irradiado
apresenta uma maior capacidade de neutralizar o veneno nativo, enquanto que
os soros antivenenos, de serpentes do gênero Bothrops, não apresenta
diferença entre irradiado e não irradiado, quanto ao poder de neutralização.
Estes resultados poderiam ser explicados pelo fato do veneno de cascavel
apresentar menos componentes que os venenos botrópicos, pois se sabe que
o efeito da radiação depende, dentre outros fatores, da composição da
amostra. A presença de várias substâncias, no momento da irradiação, leva a
um efeito radioprotetor entre as moléculas. Assim, considerando-se que os
venenos das serpentes do gênero Bothrops constituem misturas protéicas
extremamente complexas, é de se supor que sejam menos afetados pelos
efeitos da radiação.
Durante o processo de hiperimunização todos camundongos foram
observados diariamente a procura de alterações clínicas nos locais de
inoculação. Estas alterações incluíam edema no local do inóculo, fibrose e nos
animais inoculados com veneno nativo de Bothrops jararaca, Bothrops
jararacussu e Bothrops moojeni apareceram abscessos e necroses. Alguns
animais destes grupos vieram a óbito durante este processo. Nenhum animal
pertencente ao grupo inoculado com veneno nativo e irradiado de Crotalus
durissus terrificus foi a óbito ou tiveram alterações clínicas no local de
inoculação. No grupo controle os resultados foram semelhantes.
Segundo Ângulo et al. (58), algumas alterações teciduais locais moderadas
como edema, abscessos, fistulas e fibroses podem ser observadas nos animais
durante o processo de hiperimunização com venenos de serpentes do gênero
Bothrops. Alterações sistêmicas não foram observadas.
Nos grupos de animais que receberam veneno irradiado, foram observados
apenas pequenos edemas somente na primeira inoculação, apesar de
receberem juntamente o Adjuvante Completo de Freund’s.
CARVALHO et al. (78), citam como o maior problema na produção de
antivenenos comerciais a toxicidade do veneno bem como do Adjuvante de
Freund’s. Este causa inflamação e lesões no local do inóculo e contribui para a
104
redução
da
longevidade
imunoglobulinas.
de
cavalos
como
animais
produtores
de
105
6 Considerações finais
Por fim, a análise dos resultados em seu conjunto permite considerar que:
* O teste de ELISA mostrou-se eficiente para avaliar, acompanhar e
comparar a resposta imune dos camundongos inoculados com os venenos
Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu e Bothrops
moojeni nativo e irradiado;
* Os títulos do soro produzido em camundongos imunizados com veneno
irradiado e avaliados pelo método de ELISA contra o veneno nativo foram
semelhantes aos títulos do soro obtido com veneno irradiado;
* A capacidade imunogênica dos venenos foi mantida após a irradiação;
* Foi observada a diminuição da toxicidade dos venenos após a sua
irradiação com 60Co;
* O soro produzido a partir do veneno irradiado de Crotalus durissus
terrificus obteve uma maior potência e capacidade neutralizante quando
comparado ao soro obtido a partir de veneno nativo.
* Os anticorpos antiveneno nativo e irradiado mostraram-se igualmente
eficientes na neutralização da ação tóxica do veneno de Bothrops jararaca,
Bothrops jararacussu e Bothrops moojeni segundo os testes de desafio “in
vitro”;
* Os anticorpos dos animais hiperimunizados foram capazes de neutralizar
cinco DL50 dos diferentes venenos.
* As alterações clínicas durante o processo de hiperimunização foram
mínimas quando utilizado o veneno irradiado principalmente das serpentes do
gênero Bothrops;
Portanto, de acordo com os resultados obtidos no presente estudo justificase plenamente a utilização da radiação gama na destoxicação do veneno das
serpentes Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu
e Bothrops moojeni, com o intuito de aprimorar a soroprodução. A presente
experiência, realizada em animais de laboratório, deverá ser transportada para
animais de produção, com o intuito de se avaliar os custos, a especificidade
dos anticorpos e os efeitos colaterais durante o processo de imunização.
106
7 Resumo
O ensaio imunoenzimático de ELISA foi utilizado para avaliar, acompanhar e
comparar a resposta imune humoral de camundongos SWISS durante o
processo de hiperimunização com veneno nativo e irradiado com Cobalto-60
(60Co) obtido das serpentes Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararaca,
Bothrops jararacussu e Bothrops moojeni. A potência e a capacidade de
neutralização foram avaliadas por meio de desafios “in vitro”. A imunidade
obtida ao final do processo de hiperimunização foi verificada mediante desafio
“in vivo” e os efeitos colaterais foram avaliados. A imunização dos animais, com
uma DL50 de cada veneno, ocorreu nos dias um, 15, 21, 30 e 45, quando foram
colhidas amostras de sangue. No 60º dia ocorreram os desafios. Os resultados
demonstraram que o teste de ELISA mostrou-se eficiente na avaliação,
acompanhamento e comparação da resposta imune dos camundongos durante
o processo de hiperimunização. Os títulos do soro produzido com veneno
nativo foram semelhantes aos títulos do soro obtido com veneno irradiado. A
capacidade imunogênica foi mantida após a irradiação com
60
Co. O soro
produzido a partir do veneno irradiado de Crotalus durissus terrificus
apresentou potência e capacidade de neutralização maiores, quando
comparado ao soro obtido a partir do veneno nativo.Os anticorpos antiveneno
nativo e irradiado, mediante os desafios “in vitro”, mostraram-se igualmente
eficazes na neutralização dos venenos de Bothrops jararaca, Bothrops
jararacussu e Bothrops. Todos anticorpos foram capazes de neutralizar cinco
DL50 dos respectivos venenos. As alterações clínicas foram mínimas durante o
processo de hiperimunização com veneno irradiado e evidentes com veneno
bruto.
PALAVRAS CHAVE: Hiperimunização; irradiação; Veneno de serpente; ELISA;
Soroneutralização.
107
8 Summary
ELISA was used to evaluate, follow, and compare the humoral immune
response of Swiss mice during hyperimmunization with natural and Cobalt-60irradiated (60Co) Crotalus durissus terrificus, Bothrops jararaca, Bothrops
jararacussu, and Bothrops moojeni venoms. Potency and neutralization were
evaluated by in vitro challenges. After hyperimmunization, immunity was
observed by in vivo challenge and the side effects were assessed. The animals’
immunization with one LD50 of each venom was on days one, 15, 21, 30, and
45, when blood samples were collected; the challenges occurred on the 60th
day. Results showed that ELISA was efficient in evaluating, following, and
comparing mouse immune response during hyperimmunization. Serum titers
produced with natural venom were similar to those with irradiated venom.
Immunogenic capacity was maintained after
60
Co irradiation. Serum produced
from Crotalus durissus terrificus irradiated venom showed higher potency and
neutralization capacity than that from natural venom. Antibodies from natural
and irradiated venom by in vitro challenges were also efficient in neutralizing
Bothrops jararaca, Bothrops jararacussu, and Bothrops moojeni venoms. All
antibodies were capable of neutralizing five LD50 from these venoms. Clinical
alterations were minimum during hyperimmunization with irradiated venom and
evident with natural venom.
KEY WORDS: Hyperimmunization; Irradiation; Snake venom; ELISA; Serum
neutralization
108
9 Referências bibliográficas
1.
Da Silva RJ. Effect of Crotalus durissus terrificus (LAURENTI, 1768) and Bothrops
jararaca (WIED, 1824) venoms on the evolution of ehrlich ascites tumor. J Venom
Anim Toxins 1996; 2 (2): 167.
2.
Meier J. Venomous Snakes. In: Stocker KF. Medical Use of Snake Venom Proteins.
Boca Raton, Boston: CRC; 1990. p. 1-32.
3.
Brazil V. Serumtherapia anti-ophidica. Rev Med de São Paulo 1909; 7 (15): 197229.
4.
Hawgood BJ. Doctor Albert Calmette 1963-1933: founder of antivenomous
serotherapy and of antituberculous BCG vaccination. Toxicon 1999; 37: 1241-58.
5.
Brazil V. Contribuição ao estudo do veneno ophidico. III – Tratamento de
mordeduras das cobras. Rev Med de São Paulo 1901; 4: 375-78.
6.
Gutiérrez JM, Lomonte B, Estrada R, Angulo Y. Comparative study on the ability of
IgG and Fab sheep antivenoms to neutralize local hemorrhage, edema and
myonecrosis induced by Bothrops asper (terciopelo) snake venom. Toxicon 2000;
38: 233-44.
7.
Ministério da Saúde do Brasil. Secretaria Nacional de Ações Básicas da Saúde.
Acidentes Ofídicos: Contribuição ao estudo da morbidade. Brasília: 1990.
8.
Maria WS, Pacheco BG, Barbosa CF, Velarde DT, Chávez-Olórtegui C.
Determination of the neutralizing potency of horse antibothropic and anticrotalic
antivenoms in blood samples colleted on filter paper. Toxicon 2001; 39: 1607-09.
9.
Barraviera B, Peraçoli MTS. Soroterapia heteróloga. In: Barraviera B. Venenos
animais: uma visão integrada. Rio de Janeiro: Editora de Publicações Científicas
Ltda; 1994.
10.
Rucavado A, Moreno E, Gutiérrez JM. Effect of adjuvants on the antibody response
of mice to Bothrops asper (Terciopelo) snake venom. Braz J Med Biol Res 1996; 29
(10): 1337-40
11.
Christensen PA. The preparation and purification of antivenoms. Mem Inst Butantan
1966; 33: 245-50.
Segundo normas de Vancouver: “Uniform Requeriments for Manuscripts submitted to
Biomedical Journals” (International Committe of Medical Journals Editors, 1993) (79) e por
deliberação do Curso de Pós-Graduação de Doenças Tropicais da Saculdade de Medicina de
Botucatu da UNESP.
109
12.
Sjostrom L, Al-Abdulla IH, Rawat S, Smith, DC, Landon J. A comparasion of ovine
and equine antivenoms. Toxicon 1994; 32; 427-33.
13.
Guidolin R, Dias Da Silva W, Higashi HG, Caricati CP, Lima MLSR, Morais JF, et al.
Hiperimunização de cavalos soroprodutores com venenos botrópicos e crotálico
tratados por glutaraldeido. Mem Inst Butantan 1989; 51: 85-90.
14.
Chippaux JP, Goyffon M. Venoms, antivenoms and immunotherapy. Toxicon 1998;
36 (6): 823-46.
15.
Guidolin R, Raw I, Higashi HG. Produção de plasma antitetânico hiperimune, de
origem eqüina. Bol Biotecnol 1992; 3: 17-23.
16.
Soerensen B. Animais peçonhentos: reconhecimento, distribuição geográfica,
produção de soros, clínica e tratamento dos envenenamentos. São Paulo: Livraria
Atheneu; 1990.
17.
Boquet P. Immunological propeties os snake venoms. In: LEE, C.Y. Snake Venoms.
Handbook of Experimental Pharmacology. Berlim: Spring-Verlag; 1979.
18.
Moroz C, Goldblum N, Vries A. Preparation of Vipera palestinae antineurotoxin
using carboximethyl-cellulose-bound neurotoxin as antigen. Nature 1963; 16: 69798.
19.
Kocholaty WF, Joyce C, Goetz BD, Thomas AB, Ledford EB. Immunogenic
response of the venoms of Fer de Lance, Bothrops atrox asper, and La Cascabella,
Crotalus durissus durissus, following photooxidative detoxification. Toxicon 1968; 5:
153-58.
20.
Girox E, Lachann PJ. “In vivo” diminuition by chelators of snake venom provoked
hemorrage and “in vitro” inhibition of proteolytic activity. Toxicon 1981; 19: 481-92.
21.
Costa LM. Estudo comparativo da resposta imune de cavalos ao veneno de
Crotalus durissus terrificus, in natura, tratado com formaldeído e submetido à ação
térmica. Vac Soros 1985; 1: 24-29.
22.
Daniel JP, Heneine LG, Tavares CA, Nascimento MC, Heneine IF.Generation of
protective imune sera by Crotalus durissus terrificus detoxified by controled
iodination Braz J Med Biol Res 1987; 20: 713-20.
23.
Flowers HH. The effects of X-irradiation on the biological activity of Cottonmouth
Mocacasin (Agkistrodon piscivorus) venom. Toxicon 1963; 1: 131-36.
24.
Tejansen P, Ottolenghi A. The effect of ultra-violet light on the toxicity and
enzymatic and antigenic activities of snake venom. Toxicon 1970; 8: 225-33.
25.
Rogero JR, Nascimento N. Detoxification of snake venom using ionizing radiation. J
Venom Anim Toxins 1995; 1 (1): 7-10.
110
26.
Nascimento N, Seebart C, Francis B, Rogero JR, Kaiser II. Influence of ionizing
radiation on crotoxin: biochemical and immunological aspects. Toxicon 1996; 34:
123-31.
27.
Clissa PB, Nascimento N, Rogero JR. Toxicity and immunogenicity of Crotalus
durissus terrificus venom treated with different doses of gama rays. Toxicon 1999;
37: 1131-41.
28.
Freire-Maia N. Radiogenética humana. São Paulo: Edgard Blücher; Editora da USP
1972.
29.
Grosch DS, Hopywood LE. The eletrophoretic analysis of snake venoms. Arch
Biochem 1979; 13: 253-59.
30.
Skiens WE. Sterilizing radiation effects on selected polymers. Radiat Phys Chem
1980; 15: 47-57.
31.
Hartmeier W. Immobilized Biocatalusts – An Introduction. New York: SpringerVerlag; 1986.
32.
Bernardes DML. Avaliação de métodos de identificação de especiarias e vegetais
desidratados submetidos a irradiação gama [tese]. Instituto de Pesquisas
Energéticas e Nucleares: São Paulo; 1996.
33.
Murata Y. Efeitos da radiação gama no veneno de Crotalus durissus terrificus
[dissertação]. Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares: São Paulo; 1988.
34.
Nascimento, N. Estudo comparativo entre crotoxina nativa e irradiada. Aspectos
bioquímicos e farmacológicos [dissertação]. Instituto de Pesquisas Energéticas e
Nucleares: São Paulo; 1991.
35.
Murata Y, Nishikawa AK, Nascimento N, Higashi HG, Dias Da Silva W, Rogero JR.
Gamma irradiation reduces the toxic activities of Crotalus durissus terrificus venom
but does not affect their immunogenic activities. Toxicon 1992; 28: 617.
36.
Guarnieri M.C. Estudo dos efeitos da radiação gama de
60
CO nas propriedades
bioquímicas, biológicas e imunológicas do veneno de Bothrops jararaca [tese].
Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares: São Paulo; 1992.
37.
Souza-Filho JN, Guarnieri-Cruz MC, Murata Y, Rogero JR. Detoxification of the
crotoxin complex gamma radiation. Braz J Med Res 1992; 25: 103-13.
38.
Spencer PJ. Biochemical and immunological alterations of
60
Co irradiated Bothrops
jararacussu venom. J Venom Anim Toxins 1996; 2 (2): 165.
39.
Adriani EP. Irradiation Of Crotoxin In Aqueous Solution: The Role Of The Main
Reactive Species In Structural And Biological Alterations. J Venom Anim Toxins
1996; 2 (2): 168.
111
40.
Cardi BA. Estudo morfocitológico comparativo da crotoxina nativa e irradiada em
tecidos e células de camundongos CBA/J [dissertação]. Instituto de Pesquisas
Energéticas e Nucleares: São Paulo; 1995.
41.
De Paula RA. Attainment and evaluation of antisera raised against irradiated whole
crotalic venom or crotoxin in 60co soure. J Venom Anim Toxins 1996; 2 (2): 166.
42.
Boni-Mitake M, Costa H, Spencer PJ, Vassilieff VS, Rogero JR. Effests of
60
Co
gamma radiation on crotamine. Braz J Med Biol Res 2001; 34: 1531-38.
43.
Teakston RDG, Lloyd-Jones MJ, Reid HA. Micro-ELISA for detecting and assying
snake venom and venom-antibody. The Lancet 1977;.sep 24: 639-41.
44.
Barbosa CF, Rodrigues RJ, Olortegui CC. Determination of the neutralizing potency
of horse antivenom against bothropic and crotalic venoms by indirect enzyme
immunassay. Braz J Med Biol Res 1995; 28: 1077-80.
45.
Barraviera B, Sartori A, Pereira Da Silva M F, Kaneno R, Peraçoli, RMTS. Use of an
ELISA assay to evaluate venom, antivenom, IgG and IgM human antibody levels in
serum and cerebrospinal fluid from patients bitten by Crotalus durissus terrificus in
Brazil. J Venom Anim Toxins 1996; 2 (1): 14-27.
46.
Heneine LG, Carvalho Jr AD, Barbosa CF, Santos MRA. Development of an ELISA
to asses the potency of horse therapeutic polyvalent antibothropic antivenom.
Toxicon. 1998; 36: 1363-70.
47.
Cardoso JLC. Acidentes por animais peçonhentos na Coordenação de Zoonoses e
Animais Peçonhentos – comentários e sugestões. Brasília 1993 Nov.
48.
Resende CC, Araújo FAA, Salenave RNUR. Análise epidemiológica dos acidentes
ofídicos. Brasil – junho de 1986 a dezembro de 1987. Ministério da Saúde –
Secretaria Nacional de Ações Básicas de Saúde Brasília DF 1989 nov.
49.
Barraviera B. Estudo Clínico dos acidentes ofídicos [CD-ROM]. Rio de Janeiro:
EPUB; 1999.
50.
Ministério da Saúde Brasil. Manual de diagnóstico e tratamento de acidentes por
animais peçonhentos. In: Ferreira Jr RS, Barraviera B. Artrópodes de Interesse
Médico [CD-ROM]. Rio de Janeiro: EPUB; 2001.
51.
Barraviera B, Coelho KYR, Cupi PR, Meira DA. Liver dysfunction in patients bitten
by Crotalus durissus terrificus (Laurenti, 1768) snakes im Botucatu (State of São
Paulo, Brazil). Rev Inst Med Trop S Paulo 1995; 37: 63-9.
52.
Barraviera B, Lomonte B, Tarkowski A, Hanson LA, Meira DA. Acute-phase
reactions, including cytokines, in patients bitten by Bothrops and Crotalus snakes in
Brazil. J Venom Anim Toxins 1995; 1: 11-22.
112
53.
Bicudo PL. Acidentes ofídicos em Medicina Veterinária. In: Barraviera B. Venenos
animais: uma visão integrada. Rio de Janeiro: Editora de Publicações Científicas
Ltda; 1994.
54.
WHO. Progress in characterization of venoms and standardization of antivenoms,
WHO offset publication 1981; 58: 450-53.
55.
León G, Valverde JM, Rojas G, Lomonte B, Gutiérrez JM. Comparative study on the
ability of IgG and Fab sheep antivenoms to neutralize local hemorrhage, edema and
myonecrosis induced by Bothrops asper (terciopelo) snake venom. Toxicon 2000;
38: 233-44.
56.
Kaiser II, Middlebrook JL, Crumrine MHm, Stevenson WW. Cross-reativity and
neutralization by rabbit antisera raised against crotoxin, its subunits and two related
toxins. Toxicon 1986; 24 (7): 669-78.
57.
Costa Neto PLO. Estatística. São Paulo Brasil: Editora Edgard Blücher Ltda; 1999.
58.
Angulo Y, Estrada R, Gutiérrez JM. Clinical and laboratory alterations in horses
during immunization with snake venoms for the production of polyvalent (Crotalinae)
antivenom. Toxicon 1997; 35: 81-90.
59.
Hati RN, Mandal M, Hati AK. Active immunization of rabbits with gamma irradiated
Russel´s viper venom toxoid. Toxicon 1990; 28 (8): 895-902.
60.
Netto DP. Humoral response and neutralization capacity of sheep serum inoculated
with natural and Cobalt 60-irradiated Crotalus durissus terrificus venom (Laurenti,
1768). J Venom Anim Toxins incl Trop Dis 2002; 8 (2): 297-314.
61.
Da Silva WD, Guidolin R, Raw I. Cross-reativity of horse monovalent antivenoms to
venoms of ten Bothrops species. Mem Inst Butantan 1989; 51 (4):’153-68.
62.
Bogarín G, Morais JF, Yamaguchi IK, Stephano MA, Marcelino JR, Gutiérrez JM et
al. Neutralization of crotaline snake venoms from Central and South America by
antivenoms produced in Brazil and Costa Rica. Toxicon 2000; 38: 1429-41.
63.
Muniz EG, Maria WS, Estevão-Costa MI, Buhrnheim P, Chávez-Olórtegui C.
Neutralizing potency of horse antibothropic Brazilian antivenom against Bothrops
snake venoms from the Amazonian rain forest. Toxicon 2000; 38: 1859-63.
64.
Camey KU, Velarde DT, Sanchez EF. Pharmacological characterization and
neutralization of the venoms used in the production of Bothropic antivenom in Brazil.
Toxicon 2002; 40: 501-09.
65.
Selvanayagam ZE, Gopalakrishnakone P. Tests for detection of snakes venoms,
toxins and venom antibodies: review on recent trends (1987-1997). Toxicon 1999;
37: 565-86.
113
66.
Oguiura N, Camargo ME, Da Silva ARP, Horton DSPQ. Quantification of crotamine,
a small basic myotoxin, in South American rattlesnake (Crotalus durissus terrificus)
venom by enzyme-linked immunosorbent assay with parallel-lines analysis. Toxicon
2000; 38: 443-48.
67.
Barral-Neto M, Schriefer A, Vinhas V, Almeida AR. Enzyme-linked immunosorbent
assay for the detection of Bothrops jararaca venom. Toxicon 1990; 28: 1053-61.
68.
Guarnieri-Cruz MC, Murata Y. Attenuation ob Bothrops jararaca venom by ionizing
radiation. Toxicon 1990; 28: 92-98
69.
Purananda C. Studies on effects of radiations on snake venoms with special
aspects on their sterilization – Vienna. Int Atom Energy Agency 1972.
70.
Herrera E, Yarleque A, Campos S, Zavaleta A. Gamma irradiation effect on
biological activity and enzymatic properties of snake venoms. Inf Nucl 1986; 3: 1-14.
71.
Nascimento N, Spencer PJ, Andrade Jr HF. Effects of gamma radiation on snake
venoms. Radiat Phys Chem 1998; 52: 665-69.
72.
Costa, H.
60
Co gamma radiation effects on Apis mellifera venom: biochemical,
pharmacological, and immunological aspects. J Venom Anim Toxins 2002; 8 (1):
182.
73.
Nascimento N. Biochemical and immunological characterization of the main
products of crotoxin irradiation. J Venom Anim Toxins 1996; 2 (2): 169.
74.
Cardi BA, Andrade HF, Rogero JR, Nascimento N. Differential biodistribution of
native and 2 kGy
60
Co irradiated crotoxin in tissues of CBA/J mice. Natural Toxins
1998; 6 (1): 19-25.
75.
Souza FAD, Spencer PJ, Rogero JR, Nascimento N, Dal Pai-Silva M, Gallacci M.
60
Co gamma irradiation prevents Bothrops jararacussu venom neurotoxicity and
myotoxicity in isolated mouse neuromuscular junction. Toxicon 2002; 40 (8): 1101106.
76.
Mandal MRN, Hati AK, Hati RN. Neutralization of pathophysiological manifestations
of Russel’s viper envenoming by antivenom raised against gamma-irradiated toxoid.
Toxicon 1993; 31: 213-16.
77.
Maria WS, Cambuy MO, Chávez-Olórtegui C. Neutralizing potency of horse
antibothropic antivenom. Correlation between in vivo and in vitro methods. Toxicon
1998; 36 (10): 1433-39.
78.
Carvalho VT, Gomes RT, Viotti AP, Freitas TV. Immunization with liposomeencapsulates Bothrops jararaca venom. Toxicon 2000; 38: 881-86.
114
79.
Uniform requeriment for manuscripts [cited 2003 jul 20]. Available from: URL:
http://www.icmje.org
115
10. Apêndice