Análise Combinada de Compostos-Alvo e Não-Alvo com Novo Método por
Espectrometria de Massas de Alta Sensibilidade e Seletividade
O monitoramento da contaminação por
substâncias tóxicas requer a determinação de
multirresíduos em uma única amostra, o que
representa um desafio na Química Analítica. Os
desenvolvimentos recentes nos espectrômetros
de massa triploquadrupolo favorecem essas
análises, porém, algumas restrições ainda
persistem, como o número limitado de
compostos-alvo analisados por corrida e a
impossibilidade de busca por compostos
desconhecidos após a análise. Os
espectrômetros de massa de alta resolução e
massa exata (HRAM) baseados na tecnologia
Orbitrap, da Thermo Scientific, por outro lado,
oferecem novas soluções para as análises
multirresíduos.
A caracterização de uma matriz complexa quanto
à presença de contaminantes conhecidos e
desconhecidos, por espectrometria de massa,
requer métodos que obtenham a maior
quantidade possível de dados de MS e MS/MS. O
método full scan seguido pela fragmentação de
todos os íons (AIF), que tem sido empregado até
o momento, tem a vantagem de coletar todas as
informações MS/MS possíveis da amostra e
poder fazer uma análise retrospectiva dos dados.
No entanto, a seletividade e os limites de
detecção do método AIF são desfavoráveis para
os componentes em baixas concentrações na
amostra. Neste trabalho, um novo método
genérico de aquisição de dados por
espectrometria de massas HRAM, chamado de
análise independente de dados variável (vDIA), é
apresentado. Com janelas amplas de isolamento
dos precursores para MS/MS, este novo método
alcança sensibilidade e seletividade na
quantificação e identificação de pequenas
moléculas comparáveis ao método full scan data
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dependent MS/MS (FS-ddMS ), que opera com
janelas de isolamento estreitas.
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O método FS-ddMS , em que os dados MS/MS
são obtidos para compostos-alvo definidos após o
full scan, é conhecido pela sua alta seletividade e
sensibilidade. A análise retrospectiva de dados
para compostos não definidos previamente como
alvos, no entanto, limita-se à quantificação, sem
confirmação da identidade por MS/MS. O método
de aquisição de dados vDIA supera as limitações
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dos métodos FS-ddMS e AIF, ao mesmo tempo
em que combina suas vantagens. Um registro
completo de dados de MS e MS/MS é obtido e
todos os compostos de interesse podem ser
processados, mesmo retrospectivamente e em
baixas concentrações. Perfis de eluição
completos, de todos os íons confirmatórios, de
todos os componentes da amostra podem ser
extraídos.
No modo de aquisição vDIA, o full scan é seguido
por varreduras sequenciais dentro de
faixas/janelas menores, tipicamente de 50 a 100
Da, de modo que a somatória dessas janelas seja
igual à faixa de massas completa. Este modo de
aquisição de dados aumenta significativamente a
sensibilidade/detectabilidade dos fragmentos
significativos para a confirmação dos compostos,
ao mesmo tempo em que fragmenta todos os
íons precursores do full scan anterior e mantém
as opções de triagem de compostos suspeitos ou
desconhecidos disponíveis no modo AIF. A
definição das janelas de fragmentação é feita pelo
analista. Cinco janelas são suficientes para
garantir a eficiência do método e a velocidade de
varredura adequada para o acoplamento com
uma separação cromatográfica rápida.
O método adotado neste trabalho contém as
cinco janelas de fragmentação apresentadas na
Figura 1, com um tempo total de análise igual a
650 ms. Foi empregado o espectrômetro de
massas híbrido quadrupolo-Orbitrap Q Exactive
Focus MS, da Thermo Scientific.
Figura 1. Método vDIA com 5 janelas de fragmentação
que cobrem a faixa de m/z 100 a 1000.
Para avaliar a eficiência do método vDIA,
amostras de produtos de origem animal como:
músculo e plasma suíno, e leite de vaca foram
fortificadas (spiked) com 44 medicamentos
veterinários diversos e analisadas pelo método
FS-vDIA descrito. Os níveis de fortificação foram:
5 µg/kg para antibióticos em matriz de músculo de
porco, 1 µg/kg para nitroimidazóis em matriz de
plasma de porco e 1 µg/kg de avermectinas em
matriz de leite de vaca. A Figura 2 apresenta a
excelente seletividade alcançada pelo método
FS-vDIA em níveis de concentração baixos.
Todos os íons dos analitos são confirmados tanto
por massa exata quanto por tempo de retenção.
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Diferentemente dos métodos ddMS , falsos
positivos são evitados porque os perfis de eluição
completos de todos os fragmentos estão
disponíveis para verificação das confirmações.
Figura 2. Seletividade do componente selecionado na
matriz. A: 5 µg/kg de ampicilina em músculo de porco;
B: 5 µg/kg sulfadiazina em rim de porco.
Uma série de diluições de uma mistura padrão de
44 drogas veterinárias, entre 0,01 e 500 µg/kg foi
analisada para avaliar a linearidade das curvas
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analíticas. Valores de R superiores a 0,999 foram
obtidos ao longo de toda a faixa de calibração
para todos os 44 compostos. A Figura 3
apresenta um exemplo das curvas analíticas
obtidas.
Figura 3. Exemplo de linearidade obtida na faixa de
calibração de 0,01 a 500 µg/Kg.
As análises multirresíduos frequentemente são
realizadas tanto para a determinação de
compostos-alvo quanto não-alvo. Para realizar
uma triagem ampla de compostos não-alvo, os
dados obtidos foram processados pelo software
TraceFinder™ v. 3.2, da Thermo Scientific, o qual
contém um banco de dados de m/z de fragmentos
e compostos, e uma biblioteca espectral com
1500 compostos/cada.
Além dos compostos-alvo, 30 compostos nãoalvo puderam ser identificados e confirmados por
meio de massa exata, coincidência do padrão
isotópico e da fragmentação de íons, e busca em
biblioteca de espectros. Como exemplo, o cortisol
(hidrocortisona) foi identificado pelos quatro
métodos de identificação e confirmação (Figura
4).
Figura 4. Identificação de cortisol em amostra de carne
de porco com todas as quatro etapas de confirmação.
O método de aquisição vDIA é um método de
aquisição genérico para multianalitos,
perfeitamente adequado para a aquisição de
dados quantitativos, com desempenho
insuperável na triagem de compostos não-alvo e
desconhecidos. Supera as limitações das
técnicas de fragmentação full-range com
seletividade e sensibilidade comparáveis às
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aquisições ddMS ao mesmo tempo em que gera
um registro completo de dados full scan e de
fragmentação para cada uma das amostras
analisadas.
Para mais informações entre em contato com Gilson Siqueira, Especialista em Segurança em Alimentos e Ambiental
da Nova Analítica. [email protected]. br