Projeto de iniciação científica
Estudo do aumento de escala do processo
enzimático de hidrólise da celulose obtida a
partir de resíduos lignocelulósicos do bagaço de
cana (Saccharum officinarum L.)
Relatório Final
Bolsista: Verônica Maria Fadário Frade
Orientador: Prof. Dr. Luis Fernando P. Ferreira
Co-orientador: Prof. Dr.a Adriana Célia Lucarini
Departamento: Engenharia Química
Fevereiro/2011
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
Resumo
Os resíduos lignocelulósicos são fontes abundantes em carboidratos e a sua
bioconversão tem recebido grande atenção. Tais resíduos são formados por: celulose,
hemicelulose e lignina. Em uma das linhas de estudo está a hidrólise desse resíduo, que
pode ser ácida ou enzimática, visando a obtenção de açúcares fermentescíveis. A ação
das enzimas é influenciada por fatores físicos e químicos do meio reacional, tais como
temperatura, pH e velocidade de agitação. No desenvolvimento e otimização desse
processo é de fundamental importância o conhecimento dos fatores que afetam a
biocatálise. O objetivo desse estudo foi verificar o efeito da rotação e da quantidade de
enzima empregada na hidrólise enzimática de bagaço de cana previamente tratado,
utilizando as celulases. Como resultado disso, obteve-se uma máxima concentração de
2,81 g/L de glicose, com uma rotação de 280 rpm e utilizando-se 0,1 g de celulase para
volume reacional total de 40 mL.
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
1
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Esquema ilustrativo da formação da celulose.................................................. 8
Figura 2: 0-acetil-4-metilglicouranoxilana de folhosas ................................................ 10
Figura 3: arabino-4-0-metilglicouranoxilana de coníferas ............................................ 11
Figura 4: Unidades do polímero de β-1,4-glicano-piranosil ......................................... 17
Figura 5: Componentes obtidos a partir da celulose ..................................................... 20
Figura 6: Superfície de resposta da concentração de glicose aos ensaios realizados .... 27
Figura 7: Superfície de resposta da concentração de açúcares redutores aos ensaios
realizados ........................................................................................................................ 28
Figura 8: Superfície de resposta da concentração de glicose aos ensaios realizados .... 30
Figura 9: Superfície de resposta da concentração de açúcares redutores aos ensaios
realizados ........................................................................................................................ 30
Figura 10: Curva de calibração do Método Enzimático ................................................ 39
Figura 11: Curva de calibração do Método DNS .......................................................... 40
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Conteúdo médio celulósico em plantas ........................................................... 9
Tabela 2: Composição química aproximada do bagaço integral, fração fibra e medula
para diferentes regiões geográficas em % (calculados sobre o bagaço seco) ................. 19
Tabela 3: Composição do reativo de DNS em porcentagem em peso .......................... 23
Tabela 4: Planejamento estatístico para 40 mL ............................................................. 26
Tabela 5: Planejamento estatístico para 400 mL ........................................................... 26
Tabela 6: Resultados obtidos para volume de 40 mL ................................................... 27
Tabela 7: Resultados obtidos para volume de 400 mL ................................................. 29
Tabela 8: Dados para a curva de calibração .................................................................. 38
Tabela 9: Absorbância obtida para cada concentração de glicose ................................ 38
Tabela 10: Dados para curva de calibração ................................................................... 39
Tabela 11: Absorbância obtida para cada concentração de glicose .............................. 40
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
2
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
SUMÁRIO
1 – Introdução ................................................................................................................... 5
2 – Etanol a partir de materiais lignocelulósicos .............................................................. 6
3 – A celulose ................................................................................................................... 8
3.1 – Principais fontes de celulose ................................................................................ 9
3.2 – Hemicelulose ..................................................................................................... 10
3.2.1 – Xilanas ......................................................................................................... 10
3.2.2 – Mananas ...................................................................................................... 11
3.2.3 – Galactanas ................................................................................................... 11
3.3 – Lignina ............................................................................................................... 11
3.4 – Importância do bagaço de cana como fonte lignocelulósica ............................. 12
4 – Enzimas .................................................................................................................... 13
4.1 – Enzimas como catalisadores .............................................................................. 14
4.2 – Substrato dependente ......................................................................................... 14
4.3 – Sítio ativo ........................................................................................................... 15
4.4 – Efeito da temperatura ......................................................................................... 15
4.5 – Efeito do pH ....................................................................................................... 15
4.6 – Cinética de uma reação enzimática .................................................................... 16
4.7 – A enzima Celulase ............................................................................................. 16
4.8 – Reação hidrólise ................................................................................................. 17
5 – Objetivos................................................................................................................... 20
6 – Materiais e Métodos ................................................................................................. 21
6.1 – Matérias-primas ................................................................................................. 21
6.2 – Equipamentos..................................................................................................... 21
6.3 – Métodos ............................................................................................................. 21
6.3.1 – Preparação da solução aquosa enzimática ................................................... 21
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
3
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
6.3.2 – Preparação da solução tampão de Mcllvaine (fosfato citrato) .................... 22
6.3.3 – Determinação da concentração de Glicose - Método Enzimático............... 22
6.3.4 – Determinação da concentração de Açúcares Redutores – Método DNS .... 23
6.3.5 – Preparação e polpação da cana .................................................................... 24
6.3.6 – Sacarificação enzimática da celulose contida no bagaço de cana ............... 24
6.4 – Planejamento estatístico ..................................................................................... 25
6.4.1 – Planejamento estatístico para volume de 40 mL ......................................... 25
6.4.2 – Planejamento estatístico para volume de 400 mL ....................................... 26
7 – Resultados e discussões ............................................................................................ 26
7.1 – Primeira etapa – volume de 40 mL .................................................................... 26
7.2 – Segunda etapa – volume de 400 mL .................................................................. 28
8 – Conclusão ................................................................................................................. 32
9 – Referencias ............................................................................................................... 33
Anexos ............................................................................................................................ 37
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
4
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
1 – Introdução
A dependência cada vez maior de energia, a possibilidade do esgotamento das
fontes de combustíveis fósseis num futuro não muito distante e um sentimento
ambiental cada vez mais forte, fundamentado pelas drásticas mudanças climáticas,
compreendem fatores que pressionam a procura por alternativas energéticas. Nesse
contexto surgem o etanol e o biodiesel como opções viáveis. O etanol, produzido no
Brasil a partir da cana-de-açúcar, é o exemplo de maior êxito dentre os biocombustíveis,
sendo utilizado por grande parte da frota de veículos automotores, de maneira pura ou
misturada à gasolina. Contudo, o aumento da demanda por esse combustível de origem
vegetal, além de seu apelo ambiental, fez com que se procure aperfeiçoar e aumentar as
possibilidades de produção do etanol. É nesse ponto que surge o etanol celulósico
(Lima, 2009).
Uma matéria-prima em potencial para uma boa relação custo-benefício na
produção de etanol é o material lignocelulósico, o qual é acessível e de baixo custo por
ser um resíduo de vários processos. O Brasil atualmente produz o etanol mais viável e
rentável do mundo, mas a produção ainda não é suficiente para obter a quantidade
necessária para atender as necessidades mundiais. Os países interessados na tecnologia
do etanol estão desenvolvendo a tecnologia do etanol celulósico, que utiliza a matériaprima fibrosa de todos os resíduos gerados pelo país (Fuentes et al., 2007).
A produção desse tipo de biocombustível encontra entraves no seu
desenvolvimento, sendo necessária pesquisa para a geração de tecnologias para
produção industrial do combustível. Inúmeras pesquisas biotecnológicas são realizadas
(Sticklen, 2008; Rubin, 2008; Lynd et al., 2008, citado por Lima, 2009), abrangendo os
três principais pilares da produção do etanol celulósico: a produção de biomassa viável,
o desenvolvimento de degradadores de parede celular e a otimização da fermentação
dos açúcares formados (Doe us, 2006, citado por Lima, 2009).
A escolha da espécie produtora de biomassa é um passo fundamental na
produção do etanol celulósico. Deve ser levada em conta sua produtividade, a
produtividade de celuloses e hemiceluloses e a produtividade e tipo de lignina presente.
Além disso, há o potencial do uso dos restos culturais das mais diversas espécies para a
produção do álcool, como é o caso da cana, que se extrai o caldo e o restante de sua
biomassa é rica em celulose (Lima, 2009).
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
5
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
Materiais lignocelulósicos, como o bagaço de cana-de-açúcar, são os mais
abundantes complexos orgânicos de carbono na forma de biomassa de planta e
consistem principalmente de três componentes: celulose, hemicelulose e lignina
(Badhan, 2009, citado por Santos et al., 2010). A utilização de resíduos agroindustriais,
como o bagaço de cana-de-açúcar, tem aumentado em processos como, geração de
eletricidade, produção de polpa e papel e produtos de fermentação, como etanol e
enzimas (Carrillo, 2005, citado por Santos et al., 2010). A produção de etanol
celulósico, a partir do bagaço de cana-de-açúcar, requer a hidrólise da celulose, que
pode, após pré-tratamento, ser realizada por celulases e β-glicosidases (Jan, 2003; Lima,
2005, citado por Santos et al., 2010).
2 – Etanol a partir de materiais lignocelulósicos
Com exceção da cana, as tecnologias comercialmente disponíveis na atualidade
para a produção de bioetanol por meio do amido e de açúcares, como no caso do milho
e da beterraba, envolvem ganhos energéticos e ambientais bastante estreitos. Além
disso, essas matérias-primas apresentam uma limitada vantagem econômica e
encontram, em geral, mercados alternativos mais remuneradores, como alimentos ou
insumos para outros fins. Entretanto, apesar de suas destacadas vantagens, a cana de
açúcar não é uma opção viável para todas as regiões do planeta. Por esse motivo, os
países do hemisfério norte vêm procurando incessantemente rotas tecnológicas que
permitam a produção de um biocombustível eficiente, tanto do ponto de vista ambiental
quanto do ponto de vista econômico. Atualmente, predomina a idéia de que, para o
futuro próximo, entre cinco e dez anos, a tecnologia de produção de bioetanol por meio
da hidrólise de materiais celulósicos venha a representar essa sonhada alternativa.
Porém, existem grandes obstáculos por superar e é difícil predizer com confiança o
tempo que, efetivamente, vai levar esse desenvolvimento (BNDES e CGEE, 2008).
O bioetanol vem sendo produzido pela hidrólise e fermentação de materiais
lignocelulósicos desde o fim do século XIX, mas somente nos últimos 20 anos essa
tecnologia tem sido proposta para atender o mercado de combustíveis. Os principais
programas de pesquisa e desenvolvimento são conduzidos nos Estados Unidos e na
Europa, basicamente em escalas experimentais de produção, mas seu sucesso poderia
transformar o bioetanol em um biocombustível passível de ser produzido em quase
todas as regiões do mundo, aproveitando a alta disponibilidade de resíduos orgânicos de
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
6
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
diversas fontes (Macedo, 2005, citado por BNDES e CGEE, 2008). Praticamente todos
os resíduos de biomassa, produzidos nas atividades agrícolas e industriais, e mesmo o
lixo urbano apresentam elevados teores de materiais lignocelulósicos.
As tecnologias para a obtenção de bioetanol com base em materiais
lignocelulósicos envolvem a hidrólise dos polissacarídeos da biomassa em açúcares
fermentescíveis e sua posterior fermentação para a produção do bioetanol. Para executar
essa tarefa, a hidrólise utiliza tecnologias complexas e multifásicas, com base no uso de
rotas ácidas e/ou enzimáticas para a separação dos açúcares e remoção da lignina
(BNDES e CGEE, 2008).
Nos processos enzimáticos, a composição e a estrutura da biomassa têm forte
influência na natureza e nos rendimentos dos processos de hidrólise e fermentação. Na
realidade, muito esforço de pesquisa deverá estar focado no melhor entendimento da
formação dos componentes da estrutura vegetal e como seria possível modificá-la para
aumentar os rendimentos do processo de hidrólise (DOE, 2006, citado por BNDES e
CGEE, 2008), já que a hidrólise somente é eficiente, de fato, após alguma separação das
frações da biomassa.
A biomassa lignocelulósica é composta por polissacarídeos (celulose e
hemicelulose) e pela lignina, polímero complexo de grupos metoxi e fenilpropânicos,
que mantém as células unidas. A fração celulósica (40%-60% da matéria seca) é um
polímero linear do dímero glicose-glicose (celobiose), rígido e difícil de ser quebrado;
sua hidrólise gera glicose, um açúcar de seis carbonos, cuja fermentação com
Saccharomyces cerevisiae já é bem conhecida. Por sua vez, a fração hemicelulósica
(20%-40%), em geral, é constituída de uma cadeia principal de xilose (ligações β-1,4)
com várias ramificações de manose, arabinose, galactose, ácido glicurônico etc. A
hemicelulose é muito mais fácil de ser hidrolisada do que a celulose, mas a fermentação
dos açúcares de cinco carbonos (pentoses) ainda não é tão desenvolvida quanto os
processos envolvendo a glicose. Já a estrutura bioquímica da fração de lignina (10%25%) não está relacionada a moléculas simples de açúcar, não sendo pretendida para a
produção de bioetanol por rotas fermentativas. Essa fração, no entanto, desempenha um
papel fundamental para o sucesso da tecnologia de hidrólise. Apesar de ser possível
produzir diversos produtos com base na lignina, atualmente o foco dos estudos tem se
voltado para o uso desse material como fonte de energia para os processos, o que
garantiria a auto-suficiência e, eventualmente, até a possibilidade de exportar alguma
energia elétrica excedente. Naturalmente, essa situação é positiva tanto para a
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
7
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
viabilidade econômica da tecnologia quanto para os quesitos ambientais, já que
reduziria a dependência por recursos energéticos fósseis externos (BNDES e CGEE,
2008).
De forma geral, a primeira etapa do processo consiste no pré-tratamento
mecânico da matéria-prima, que visa à limpeza e à “quebra” do material, a fim de
causar a destruição da sua estrutura celular e torná-la mais acessível aos tratamentos
químicos ou biológicos posteriores. A etapa seguinte consiste na remoção da lignina e
na hidrólise da hemicelulose, que também pode ser denominada pré-tratamento. Para
essa etapa, existem diversos tipos de processos, com diferentes rendimentos e efeitos
distintos sobre a biomassa e conseqüente impacto nas etapas subseqüentes (BNDES e
CGEE, 2008).
3 – A celulose
A celulose é o composto orgânico mais comum na natureza. Ela constitui entre
40 e 50% de quase todas as plantas. Há estimativas de que cerca de 50 bilhões de
toneladas deste composto químico são produzidas por ano. Ela está presente também em
bactérias e algas, mas em pequenas proporções, estando localizada principalmente na
parede secundária das células vegetais (Klock et al., 2005).
O estudo da química da celulose iniciou em 1838 com Payen, que mostrou por
análise elementar que o tecido de plantas contém um componente majoritário com
44,4% de carbono; 6,2% de hidrogênio e 49,3% de oxigênio, o que é equivalente a uma
fórmula empírica de C6H10O5 e um peso molecular de 162 g/mol. Evidências
conseguidas após 1930, provaram que a celulose é um polímero composto por um
grande número de unidades repetidas. (Figura 1). Posteriormente foi provado que estas
unidades derivam-se da condensação da D-glicose, (um açúcar simples monossacarídeo hexose C6H12O6) (Klock et al., 2005).
Figura 1: Esquema ilustrativo da formação da celulose
Fonte: Klock et al., 2005
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
8
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
3.1 – Principais fontes de celulose
Com relação às principais fontes de celulose, ela é o componente majoritário,
perfazendo aproximadamente a metade das madeiras tanto de coníferas, como de
folhosas sendo outras possíveis fontes de celulose:
⇒ Algas marinhas, exemplo: valônia que possui longas microfibrilas.
⇒ Pêlos de frutos - pericarpo, exemplos: algodão, casca de coco. No algodão é
encontrada a celulose mais pura 98%.
⇒ Fibras de floema-líber, exemplos: juta, linho, cânhamo, rami, etc.
⇒ Gramíneas-monocotilêdoneas, exemplos: esparto, bagaço de cana, bambu, palhas de
cereais, etc.
⇒ Fibras do xilema-lenho, exemplos: madeiras utilizadas comercialmente, de fibras
longas (coníferas), e de fibras curtas (folhosas).
⇒ Celulose artificial, exemplo: rayon, viscose, etc.
⇒ Bagaço de cana-de-açúcar (Americano et al., 2006, Klock et al., 2005)
Dessas, a forma mais pura de celulose 99,8% pode ser obtida do algodão (98%)
por desengorduramento com solvente orgânico e extração com solução a quente de
hidróxido de sódio a 1% (Klock et al., 2005). O quadro a seguir exemplifica o conteúdo
médio de celulose em várias plantas (Tabela 1):
Tabela 1: Conteúdo médio celulósico em plantas
Planta
Algodão
Rami
Bambo
Madeira
Cascas de árvores
Musgos
Engaço de bananeira
Bactérias
Cana de açúcar
Celulose (%)
95 – 99
80 – 90
40 – 50
40 – 50
20 – 30
25 - 30
53 - 54
20 - 30
58 - 59
Fonte: Klock et al., 2005
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
9
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
3.2 – Hemicelulose
A hemicelulose é uma mistura de polímeros polissacarídeos de baixa massa
molecular, onde estão associadas com a celulose nos tecidos das plantas. O termo
hemicelulose não designa um composto químico definido, mas sim uma classe de
componentes poliméricos com propriedades peculiares (D’Almeida, 1981).
Na sua composição podem aparecer condensados unidades de açúcar como β-Dxilose, β-D-manose, β-D-glicose, α-L-arabinose, α-D-galactose e os ácidos β-Dglucourônico, β-D-galactourônico e α -D-4-0-metilglucourônico (D’Almeida, 1981).
Algumas unidades de açúcares possuem cinco carbonos e outras seis,
denominadas respectivamente de pentose e hexose que, quando condensadas, recebem o
nome de pentosana e hexosana, com fórmula geral (C5H8O4)n e (C6H10O5)n
respectivamente, onde n é o grau de polimerização. Uma pentosana quando hidrolisada
leva apenas a unidades de xilose é denominada xilana e uma que leva unidades de
arabinose, arabinana. Uma hexosana quando hidrolisada, dependendo da sua unidade
pode ser chamada de manana ou galactana (D’Almeida, 1981).
Portanto as hemiceluloses são polímeros nos quais participam pelo menos dois
tipos de açúcares (D’Almeida, 1981).
3.2.1 – Xilanas
São polissacarídeos com um esqueleto linear formado por unidades de xilose
ligadas entre si pelos carbonos 1 e 4. No caso de folhosas, a cadeia de xilanas apresenta,
em intervalos irregulares, grupos de ácido 4-0-metilglucurônico conectados às unidades
de xilose e, muitos dos grupos hidroxilas dos carbonos 2 e 3 são substituídos por grupos
0-acetila. As xilanas de coníferas diferem das de folhosas pela ausência de grupo acetila
e pela presença de unidades de arabinofuranose (D’Almeida, 1981).
Figura 2: 0-acetil-4-metilglicouranoxilana de folhosas
Fonte: D’Almeida, 1981
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
10
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
3.2.2 – Mananas
São polissacarídeos com um esqueleto linear formado por unidades de manose e
glicose conectadas entre si pelos carbonos 1 e 4. No caso de folhosas, as glucomananas
formam cadeias pouco ramificadas. No caso de coníferas, estão ligados ao esqueleto de
glucomanana grupos acetila e galactose (D’Almeida, 1981).
3.2.3 – Galactanas
São polímeros bastante ramificados e solúveis em água. As galactanas possuem
um esqueleto linear de unidades de galactose conectadas entre si, e de cadeias laterais
de unidades de galactose, somente unidades de arabinose e de ácidos glucourônicos
(D’Almeida, 1981).
Figura 3: arabino-4-0-metilglicouranoxilana de coníferas
Fonte: D’Almeida, 1981
3.3 – Lignina
A lignina é uma substância química que confere rigidez à parede da célula,
gerando uma estrutura resistente a impacto, compressão e dobra. A lignina também
contribui para impedir a penetração de enzimas destruidoras da parede celular e resistem
ao ataque de microorganismos. A lignina provém da polimerização dehidrogenativa dos
seguintes álcoois: álcool trans-coniferilico; álcool trans sinapilico e álcool trans-paracumárico. Também podem possuir, em sua estrutura, ácidos carboxílicos aromáticos, na
forma de éster. A lignina não pode ser considerada como substância única, pois existem
variações de planta para planta, e podem ser classificadas em duas classes principais
(D’Almeida, 1981):
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
11
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
•
Lignina guaiacil: presentes na maioria das coníferas, seus produtos de oxidação com
nitrobenzeno são, vanilina e para-hidroxibenzaldeído.
•
Lignina guaiacil-siringil: presentes na maioria das folhosas, incluindo as gramíneas,
a oxidação com nitrobenzeno leva a quantidades significativas de aldeído siríngico.
Foram feitos vários modelos para a lignina, todos com falhas, porém o maior
modelo estrutural para ligninas de coníferas foi desenvolvido através de simulação em
computador por Glasser e Glasser (1974). Baseava-se principalmente na simulação de
reações de copulação de radiais dos álcoois p-hidroxicinamil (D’Almeida, 1981).
Os principais grupos funcionais encontrados nas ligninas são:
•
Grupos metoxilas (-OCH3): é o grupo funcional mais característico da lignina
•
Grupos hidroxilas (-OH): estes são de natureza variada, isto é, fenólicos, assim
como alifáticos primários, secundários e terciários.
•
Grupos carbonilas e grupos carboxílicos.
•
Grupos éter (R-O-R): podem ser aromáticos ou alifáticos.
•
Duplas ligações (-C = C-)
•
Grupos éster: ocorrem em algumas folhosas.
A lignina contém como elementos somente carbono, hidrogênio e oxigênio.
3.4 – Importância do bagaço de cana como fonte lignocelulósica
As fontes mais comuns de celulose industrial atualmente são a madeira e o
algodão, sendo a fibra de algodão provavelmente a fonte natural mais rica em celulose,
com cerca de 95%, como citado anteriormente. Na madeira, resíduos agrícolas,
folhagens, e outras, a celulose está associada com outras substâncias como a lignina e
hemicelulose, ambas em quantidades consideráveis, o que leva a necessidade de
desenvolvimento de tecnologias visando à eliminação desses resíduos (Silvério, 1988).
Atualmente, a produção de substâncias químicas derivadas da celulose, é realizada a
partir de celulose oriunda do línter de algodão e da madeira. A utilização destas
matérias-primas contribui significativamente com os elevados custos de processamento
industrial, decorrentes do alto valor comercial do línter e da complexidade do
processamento da madeira. No caso particular da madeira, deve-se ainda levar em
conta, os danos causados ao meio ambiente pela geração de efluentes e desmatamento.
Porém, estão sendo desenvolvidas inúmeras pesquisas visando viabilizar a
utilização de outras fontes de celulose, principalmente no que diz respeito à utilização
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
12
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
de resíduos. Nesse contexto, dentre os resíduos agrícolas o bagaço de cana ocupa um
lugar de destaque em vários países, pela sua abundância, fácil acessibilidade e baixo
custo, fatores que são realidade no Brasil, devido a grande capacidade de produção de
álcool e açúcar dentro no país (Goldstein, 1995).
A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum L.) é uma planta de grande
importância para a economia brasileira, tornando-se grande geradora de empregos e de
energia via industrialização desta em açúcar, álcool além da produção de energia, fonte
de celulose e produção de ração animal (Manzano et al., 2000). Estruturalmente, a cana
consiste de vários tipos de tecidos, tais como córtex (ou casca), tecido parenquimatoso e
hastes fibrovasculares. O córtex é composto de fibras muito lignificadas, sendo
caracterizado pela espessura da parede celular, comprimento e rigidez de suas fibras. A
parte interior do talo é constituída por um tecido parenquimatoso (medula) de caráter
fibroso o qual possui como principal função o armazenamento do suco adocicado
produzido pela planta (Machado, 2000).
De uma maneira geral, o bagaço consiste de fibras e medula, nas proporções de
aproximadamente 65 a 35 % respectivamente e assim como outros materiais
lignocelulósicos ele é constituído de celulose, polioses e lignina (Tabela 2) podendo ser
utilizado na produção de polpas celulósicas e, portanto, utilizado na produção de acetato
de celulose. A polpação pode ser realizada com a fração fibra e/ou medula cabendo
salientar que a fração medula requer maior consumo de reagentes (Machado, 2000).
4 – Enzimas
As enzimas são proteínas sintetizadas em células vivas, possuindo assim,
estruturas protéicas, as quais podem ser primárias, secundárias, terciárias ou ainda
quaternárias, dependendo da atividade catalítica para qual são destinadas. A atividade
catalítica depende da integralidade de sua conformação protéica nativa, sendo que esta
pode ser perdida caso haja a desnaturação ou dissociação das mesmas em subunidades
(Vieira, 2003, citado por Campestrini et al., 2005).
A estrutura e o centro ativo enzimático são decorrentes de sua estrutura
tridimensional, que podem ser afetados por agentes capazes de provocar alterações
conformacionais na proteína. Isso torna a atividade enzimática dependente das
características do meio, principalmente o pH e a temperatura reacionais (Marzzoco et
al., 1999).
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
13
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
As enzimas catalisam reações químicas específicas sem serem consumidas, além
de não haver a formação de produtos colaterais e agem em soluções aquosas diluídas
(tampões), em condições muito suaves de temperatura e pH, sendo que cada enzima
possui uma temperatura e um pH ótimos, onde sua atividade é máxima, ou seja, a
velocidade da reação a qual está catalisando é máxima (Marzzoco et al., 1999).
4.1 – Enzimas como catalisadores
As enzimas aumentam a velocidade de reações químicas específicas que, sem o
uso de catalisadores (no caso, as enzimas), ocorreriam muito lentamente. Estas, não
podem alterar o ponto de equilíbrio das reações que catalisam, e também não são
consumidas ou transformadas em tais reações (Marzzoco et al., 1999).
Do ponto de vista termodinâmico, uma enzima é um catalisador que acelera uma
reação porque diminui sua energia de ativação, sendo que, quanto maior for a energia de
ativação, mais lenta a reação ocorrerá. O aumento na velocidade da reação ocorre
devido ao fato de a enzima aumentar o número de moléculas ativadas, ou seja, capazes
de reagir. Após terem reagido com o substrato, as enzimas se separam dos produtos,
liberando a molécula de catalisador para novas reações (Marzzoco et al., 1999).
4.2 – Substrato dependente
Algumas enzimas têm especificidade quase absoluta por um dado substrato, e
não atacará nem mesmo moléculas muitíssimo parecidas. Por outro lado, existem
enzimas que possuem uma ampla especificidade de substratos com características
estruturais semelhantes (Lehninger, 1989).
A especificidade das enzimas se deve a algumas características estruturais
distintas dos substratos, como a ligação química específica que pode ser atacada pela
enzima, ou como algum outro grupo funcional (grupo de ligação), o qual se liga à
enzima e posiciona a molécula de substrato no sítio ativo, de forma apropriada para que
a ligação suscetível fique localizada de modo preciso em relação ao grupo catalítico da
enzima (Lehninger, 1989).
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
14
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
4.3 – Sítio ativo
As reações catalisadas enzimaticamente ocorrem no interior dos limites de uma
cavidade, ou fenda, na estrutura molecular da enzima, chamada de sítio ativo. Este sítio
contém aminoácidos cujas cadeias laterais criam uma superfície complementar ao
substrato, permitindo que as enzimas atuem na ruptura de uma determinada ligação
química. O sítio ativo liga-se ao substrato, formando um complexo enzima-substrato
que será convertido à enzima e produto (Campestrini et al., 2005), como demonstrado
através da seguinte reação: E + S ⇔ ES ⇔ E + P, onde E, S e P significam,
respectivamente, enzima, substrato e produto (Lehninger, 1989).
4.4 – Efeito da temperatura
Toda reação química catalisada por enzimas será afetada de acordo com a
variação da temperatura. Quando a temperatura aumenta, a velocidade de reação
inicialmente aumenta, em virtude da energia cinética aumentada entre as moléculas e o
substrato. Em temperaturas ótimas, a velocidade de destruição das enzimas causada pelo
calor, é equilibrada pelo aumento na reatividade enzima-substrato e a velocidade da
reação é máxima (Campestrini et al., 2005). Porém, devido à sua natureza protéica, em
temperaturas excessivas, ocorre a desnaturação térmica da enzima, acarretando a
diminuição de sua concentração efetiva, fazendo com que a velocidade da reação
também diminua (Lehninger, 1989).
4.5 – Efeito do pH
Como as enzimas são proteínas, as mudanças no pH afetarão profundamente o
caráter iônico dos grupos carboxila e amina na superfície da molécula, influenciando
bastante a natureza catalítica (Lehninger, 1989).
A concentração de H+ afeta a velocidade das reações químicas. Extremos de pH
podem acarretar a desnaturação das enzimas (Campestrini et al., 2005). Cada enzima
possui um pH ótimo ou uma faixa de pH ideal, no qual importantes grupos doadores ou
receptores de próton no sítio catalítico estão em seus estados de ionização adequados
(Lehninger, 1989).
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
15
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
Portanto, as enzimas possuem um pH ótimo ou uma faixa de pH ideal para que
possam desenvolver com maior eficiência sua atividade catalítica, sendo que em valores
superiores ou inferiores de pH podem suprimir ou desnaturar as enzimas (Campestrini
et al., 2005).
4.6 – Cinética de uma reação enzimática
O estudo da catalise enzimática é baseada em medidas da velocidade de reação,
que é diretamente proporcional à concentração de substrato. Reações catalisadas por
enzimas se dão em duas etapas, sendo que na primeira, a enzima liga-se reversivelmente
ao substrato, formando um complexo enzima-substrato, enquanto que na segunda etapa,
o produto é libertado e a enzima fica livre para se ligar à outra molécula de substrato.
Em uma reação enzimática típica, a velocidade da primeira fase é mais elevada que a
segunda (Marzzoco et al., 1999).
Como mencionado anteriormente, a velocidade de reação é diretamente
proporcional à concentração de substrato, devido ao fato de a concentração do
complexo enzima-substrato ser muito elevada, significando que não há enzimas em
solução em sua forma livre. Neste ponto, diz-se que a velocidade de reação é máxima, a
partir do qual, qualquer aumento na concentração de substrato não provocará efeitos
perceptíveis sobre a velocidade da reação. Contudo, a velocidade reacional também é
proporcional à concentração de enzimas presentes no meio, o que possibilita a
determinação da atividade enzimática (Marzzoco et al., 1999).
4.7 – A enzima Celulase
O complexo celulase envolve pelo menos três enzimas que apresentam modos de
ação
distintos.
A
β-1,4-glicano-glicanoidrolase
(endoglicanase),
β-1,4-glicano-
celobioidrolase (exoglicanase) e β-1,4-glicosidase (celobiase). As endoglicanases
atacam, de forma randômica, ligações glicosídicas em regiões internas da molécula de
celulose, gerando oligossacarídeos de cadeias menores de celotriose, celobiose e
glicose.
As
exoglicanases
(celobiohidrolases)
atuam
nas
extremidades
dos
oligossacarídeos produzidos pela ação das endoglicanases, formando principalmente,
moléculas de celobiose, que por sua vez, são clivadas por β-glicosidases, liberando
glicose (Beguin & Aubert, 1994; Bhat & Bhat, 1997; NG, 2004, citado por Daroit,
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
16
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
2007).
). A atividade das enzimas do complexo celulase é geralmente sinérgica, ou seja, a
atividade combinada das enzimas é maior do que a soma da atividade individual de cada
componente (Ortega et al., 2001; Galbe & Zacchi, 2002; Lynd et al., 2002,
2002 citado por
Daroit, 2007).
A atividade de endoglicanases e exoglicanases
exoglicanases é geralmente inibida por
celobiose. As β-glicosidases,
glicosidases, nesse sentido, não só produzem glicose a partir de
celobiose, mas também reduzem o efeito inibitório da celobiose, permitindo a maior
eficiência tanto das endo quanto das exoglicanases (Beguin
(Beguin & Aubert, 1994; Lee et al.,
1996; Szczodrak & Fiedurek, 1996; Lau & Wong, 2001; Sun & Cheng, 2002,
2002 citado por
Daroit, 2007).
). A hidrólise eficiente da celobiose em glicose é, desta forma, crítica pela
completa digestão da celulose (Busto et al., 1997,
1997 citado
itado por Daroit, 2007),
2007 e as βglicosidases têm importante função de regulação da degradação enzimática da celulose
(Berghem & Pettersson, 1974,
1974 citado por Daroit, 2007).
Figura 4:
4 Unidades do polímero de β-1,4-glicano-piranosil
4.8 – Reação hidrólise
A celulose pode ser hidrolisada, com ácidos ou através da utilização de
processos enzimáticos a glicose sendo que a degradação microbiana da celulose é total e
específica e tem estimulado o uso dos processos de fermentações celulolíticas pelo
homem (Ruegger et al.,., 2004), e segue a seguinte reação genérica:
n C6H10O5 + n H2O → n C6H12O6
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum
(
officinarum L.)
17
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
No processo enzimático, a hidrólise é catalisada por enzimas chamadas
genericamente de celulases, e a hidrólise da celulose por celulases resulta na produção
final de glicose. Estas, porém, por serem proteínas, não conseguem penetrar com
facilidade a barreira da lignina das células vegetais e, dessa forma, o difícil acesso
destas enzimas às fibras de celulose constitui o principal problema para
desencadeamento desse processo de degradação (Ruegger et al., 2004, Feldman et al.,
1988 e Galliano et al., 1988). Nesse contexto o trabalho de desenvolvimento de técnicas
de deslignificação para expor a celulose ao ataque das enzimas, se torna importante
visando à obtenção de biocombustíveis.
Na natureza, existe uma grande variedade de microrganismos que produzem
celulases; apenas alguns são conhecidos como verdadeiros celulolíticos, isto é, são
capazes de degradar a celulose natural. Em condições laboratoriais, algodão e papel de
filtro, dentre outros, são usados como substratos indutores para a produção de exoglicosidases e para medir a atividade do complexo celulolítico total (Ruegger et al.,
2004).
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
18
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
Tabela 2: Composição química aproximada do bagaço integral, fração fibra e medula
para diferentes regiões geográficas em % (calculados sobre o bagaço seco)
Origem
Tipo
Celulose
Lignina
Polioses
Cinzas
EUA
Integral
58,4
21,3
29,4
2,9
(Lousiana)
Fibra
61,4
20,7
30,0
2,0
Medula
54,6
21,3
29,9
4,6
Integral
56,8
22,3
31,8
2,3
Fibra
62,9
21,8
31,2
1,2
Medula
55,4
22,5
33,2
2,6
Integral
50,9
18,1
29,6
3,9
Fibra
59,9
19,8
31,6
1,2
Medula
53,9
18,8
31,9
3,2
África do Sul
Integral
45,3
22,1
24,1
1,6
Havaí
Integral
*
27,6 – 28,4
19,4 – 21,6
1,3 – 2,0
Fibra
*
25,8 – 27,3
20,0 – 22,0
0,6 – 0,8
Medula
*
27,6 – 28,8
19,3 – 21,5
1,8 – 2,4
Integral
46,6
20,7
25,2
2,6
Fibra
47,0
19,5
25,1
1,4
Medula
41,2
21,7
26,0
5,5
Integral
49,1
20,3
27,8
1,6
Fibra
51,1
20,8
26,7
0,8
Medula
47,5
20,2
28,5
3,0
Filipinas
Porto Rico
Cuba
Brasil (SP)
Fonte: Machado, 2000
Através do uso de enzimas, no caso a celulase, a celulose pode ser hidrolisada a
glicose e a mesma pode ser utilizada para aumento da produção de etanol, bem como
para a produção de insumos químicos como: etileno, buteno (dimerização de etileno),
propileno (metátese de buteno com etileno), butadieno (via acetaldeído, processo da
COPERBO) e ácido acrílico (via ácido láctico) (Figura 5). Através de outros processos
de fermentação pode-se obter ainda butanol, isopropanol, 2,3-butadienol, glicerol,
acetona, ácido acético e ácido butírico. A hidrólise da glicose com ácidos diluídos leva
ainda ao hidroximetilfurfural, que pode ser clivado em ácido levulínico (ácido g-cetopentanóico) e ácido fórmico. O ácido levulínico pode ser um interessante insumo para
poliésteres (Schuchardt et al., 2001, citado por Martins, 2007).
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
19
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
Glicose
Meio ácido
Fermentação
Hidroximetilfurfural
Fermentação
Ácido lático
Etanol
Desidratação
Ácido levulínico
Ácido acrílico
Desidratação
Etileno
Polimerização
Oxidação
Poliésteres
Buteno
Propileno
Acetaldeído
Butadieno
Figura 5: Componentes obtidos a partir da celulose
Fonte: Schuchardt et al., 2001, citado por Martins, 2007
Como o processo enzimático é conduzido em condições brandas (pH 4,8 e
temperatura entre 45° e 50°C), o custo de utilidades é relativamente baixo (Sun e
Cheng, 2002, citado por BNDES e CGEE, 2008), além de permitir maiores
rendimentos, possibilitar a fermentação simultânea à sacarificação e apresentar baixo
custo de manutenção, por não se ter problemas relacionados à corrosão. Por conta de
seu grande potencial de evolução e redução de custos, muitos especialistas vêem a
hidrólise enzimática como a chave para a produção de bioetanol a um custo competitivo
no longo prazo (Dipardo, 2000 e Lynd et al., 1996, citado por BNDES e CGEE, 2008).
Contudo, uma das maiores dificuldades para que as descobertas em laboratório,
especialmente na área de bioquímica, transformem-se em benefício efetivo para a
sociedade consiste na transferência de tecnologia em mudança de escala, o chamado
scale-up.
5 – Objetivos
Estudo do aumento da escala da reação de hidrólise enzimática, visando à
obtenção de etanol a partir do bagaço de cana.
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
20
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
6 – Materiais e Métodos
6.1 – Matérias-primas
⇒ Material lignocelulósico: será utilizado como substrato, o bagaço de cana
(Saccharum officinarum L.) previamente polpado.
⇒ Reagentes de hidrólise: para o desenvolvimento das reações de hidrólise da celulose
serão utilizadas celulases, além de tampão fosfato citrato.
6.2 – Equipamentos
⇒ Espectrofotômetro Hexis modelo DR 2800, da Hach;
⇒ Banho de aquecimento modelo Q-215S2, da Quimis;
⇒ Manta aquecedora;
⇒ pHmetro modelo B474, da Micronal;
⇒ Pipeta automática, da Gilson;
⇒ Agitador mecânico modelo 713D, da Fisaton;
⇒ Reator com capacidade de 5 litros em batelada, da Metalquim;
⇒ Moinho de facas, da Quimis.
6.3 – Métodos
6.3.1 – Preparação da solução aquosa enzimática
Para a preparação da solução enzimática utilizada nos ensaios, dissolveu-se uma
massa correspondente a 0,125 g do composto enzimático celulase em 25 mL de água
destilada, a qual foi agitada até a total dissolução do composto, gerando uma solução de
concentração 5 g/L, de modo a ter-se uma quantidade equivalente a 0,1 g de enzima
presente no meio reacional. Para a obtenção das outras soluções utilizadas nos ensaios,
procederam-se diluições, a fim de se obter quantidades de enzimas correspondentes a
0,065 e 0,025 g, no que diz respeito à primeira etapa dos ensaios (primeiro
planejamento estatístico). Para a segunda etapa, foi utilizada a solução enzimática com
concentração de 5 g/L. Estas soluções, assim como as demais preparadas, foram
conservadas em geladeira.
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
21
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
6.3.2 – Preparação da solução tampão de Mcllvaine (fosfato citrato)
Para a preparação da solução tampão de Mcllvaine, foram preparadas
inicialmente duas soluções distintas, sendo uma de fosfato de sódio dibásico, e outra de
ácido cítrico.
A solução aquosa de fosfato de sódio dibásico (Na2PO4) foi preparada na
concentração de 0,05 M, e para tal dissolveu-se uma massa de 8,907g de Na2PO4 em 1
litro de água destilada, sendo verificado, através do pHmetro, que esta solução possui
um pH de aproximadamente 9;
A solução aquosa de ácido cítrico (C6H8O7) foi preparada na concentração de
0,05 M, e para tal dissolveu-se uma massa correspondente a 10,504g de C6H8O7 em 1
litro de água destilada, sendo verificado, através do pHmetro, que esta solução possui
um pH de aproximadamente 2.
Partindo-se de uma das soluções citadas acima como base, adicionou-se aos
poucos a outra solução, até que atingisse o pH desejado, no caso 5, o qual foi detectado
por meio do pHmetro.
6.3.3 – Determinação da concentração de Glicose - Método Enzimático
O reativo de trabalho (método enzimático) foi preparado dissolvendo-se 3
das 4
soluções que compõe o kit enzimático. As soluções utilizadas foram: Reativo enzimático CAT
nº. 02202 (glicose oxidase e peroxidase); Reativo de Cor (1) CAT nº. 02203 (4-aminofenazona
0,025 mol/L e tampão Tris 0,92 mol/L) e Reativo de Cor (2) CAT nº. 02204 (Fenol 0,055
mol/L), com pH 7,4 ± 0,1. Após devidamente dissolvidas, a solução resultante possui um
volume final de 1 litro.
A concentração de glicose é obtida por método enzimático (Laborlab cat. n°. 02200),
através da análise espectrofométrica, utilizando uma curva de calibração que correlacione a
absorbância (Abs) com a concentração de glicose ([G]). Para elaboração dessa curva, amostras
padrões de glicose foram preparadas nas seguintes concentrações: 0,2; 0,4; 0,8; 1,0; 1,2; 1,6 e
2,0 g/L (Lucarini, 2006).
O princípio do método é baseado em técnicas colorimétricas onde, inicialmente,
a glicose presente na amostra é oxidada a ácido glicônico e peróxido de hidrogênio, em
presença de glicose-oxidase. O peróxido de hidrogênio formado, na presença de
peroxidase e do sistema constituído por fenol e 4-aminofenazona (aceptor e oxigênio
nesta
reação),
reage
formando
um
cromógeno
vermelho
(4-p-
benzoquinonamonoiminofenazona). A concentração desta substância, determinada por
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
22
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
métodos colorimétricos, é proporcional à concentração de glicose na amostra (Lucarini,
2006).
A análise é realizada através da adição de 50 µL da amostra hidrolisada em 5 mL
do reativo de trabalho. A mistura é então incubada em banho termostatizado a 37°C por
10 minutos, sendo em seguida resfriada em banho de gelo. Após, realizou-se a leitura
em espectrofotômetro em um comprimento de onda ajustado para 505 nm, mediante
calibração do instrumento com água destilada (branco), pois esta possui a mesma
coloração do reativo de trabalho.
O reativo foi armazenado em geladeira e em frasco escuro, pois é sensível à luz
e à temperatura, sendo de um mês seu período de validade. A partir de uma solução-mãe
de glicose (2g/L), preparou-se os correspondentes padrões cujas concentrações variaram
entre 0,2 e 2,0 mg/mL, como mostra a tabela localizada em Anexos, assim como as
curvas de calibração.
6.3.4 – Determinação da concentração de Açúcares Redutores – Método DNS
O método do DNS consiste na mistura de 1 mL da amostra com 1,5 mL da solução de
DNS. Agita-se e aquece-se a mistura em banho de água fervente por 5 minutos. A amostra é
resfriada em água ate que a temperatura ambiente seja atingida. Completa-se o volume total
para 25 mL com água destilada em tubos aferidos e agita-se. Determina-se a absorbância das
amostras a 540 nm contra um branco preparado com 1,5 mL da solução de DNS e água
destilada até completar 25ml de solução (Lucarini, 2006).
O reativo de DNS apresenta a seguinte composição em porcentagem em peso, conforme
Tabela 3:
Tabela 3: Composição do reativo de DNS em porcentagem em peso
Componente
%(p/p)
Ácido 3,5-dinitro salicílico (DNS)
0,6
Hidróxido de Sódio
1,13
Tartarato duplo de sódio e potássio
17,5
Fenol
0,43
Metabissulfito de sódio
0,47
Água destilada
q.s.p
Fonte: Lucarini, 2006
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
23
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
Tartarato duplo de sódio e potássio, normalmente presente no reagente ácido
dinitrosalicílico pela redução de açúcar, interfere na ação protetora do metabissulfito de
sódio, mas também é essencial para a estabilidade da cor. A melhor composição de um
reagente de ácido dinitrosalicílico é dada na Tabela 3, através dos estudos realizados por
Miller, publicados no Analytical Chemistry, em 1959.
O reagente ácido dinitrosalicílico, desenvolvido por Sumner para a determinação
da redução de açúcar, é composta de ácido dinitrosalicílico, tartarato duplo de sódio e
potássio, fenol, metabissulfito de sódio e hidróxido de sódio. Segundo os autores do
ensaio, Tartarato duplo de sódio e potássio é introduzido para prevenir a dissolução do
oxigênio no reagente; fenol, para aumentar a quantidade de cores produzidas; e
metabissulfito de sódio e potássio, para estabilizar a cor obtida na presença do fenol. A
base é necessária para reduzir a ação da glicose no ácido dinitrosalicílico.
6.3.5 – Preparação e polpação da cana
Inicialmente, é necessário que o bagaço de cana passe por um processo de
lavagem, que visa a remoção de melado e possíveis impurezas. Após a lavagem, a cana
é seca em estufa e moída em um moinho de facas.
O processo de polpação é realizado em um reator batelada, o qual é carregado
com aproximadamente 230 g de bagaço de cana moída e 3 L de solução de soda a 9%
em massa. A mistura é então submetida a uma temperatura de aproximadamente 130ºC,
e um pressão entre 1,2 e 1,6 atm e agitação de 125 rpm, por 3 horas. Após este período,
a solução é descarregada, filtrada e lavada, sendo posteriormente encaminhada a estufa
para secagem.
6.3.6 – Sacarificação enzimática da celulose contida no bagaço de cana
As hidrólises enzimáticas foram realizadas com uma massa equivalente a 2 g de
cana previamente polpada inseridos em um balão de fundo redondo de uma boca, ao
qual foram adicionados 20 ml da solução enzimática de Celulase em concentrações
diferentes, de acordo com o planejamento estatístico, e 20 ml de solução tampão fosfato
citrato com pH 5. Após a adição dos reagentes, feitos sempre em duplicata, a mistura
contida no balão foi agitada manualmente, visando a homogeneização do meio reacional
para posterior tomada de pH. Em seguida, o balão foi encaminhado a um banho
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
24
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
termostatizado, o qual possuía temperatura equivalente a 50ºC, sendo submetido à
agitação variável de acordo com o planejamento estatístico, por um período de 2 horas.
Depois de decorrido o tempo de reação, a solução resultante foi filtrada a vácuo,
sendo que o pH foi novamente medido para comparações posteriores com os valores
iniciais. Analisou-se as amostras (sempre em duplicata) através do método enzimático
(item 6.3.3) e do método DNS (item 6.3.4). Em ambos os métodos, foi medida a
absorvância da solução colorida em 505 nm e 540 nm respectivamente, contra branco de
reagentes.
A concentração de glicose e de açúcares redutores nas amostras foi obtida
mediante a utilização de uma curva de calibração, preparada a partir de uma solução de
glicose em água. Vide anexos para ambas as metodologias.
6.4 – Planejamento estatístico
Como a celulose na forma de substrato é insolúvel em solução aquosa, as
enzimas terão que ser adsorvidas para poderem reagir. Assim, o processo enzimático é
heterogêneo, portanto, os efeitos difusionais das enzimas são tão importantes quanto os
efeitos cinéticos.
Baseado nisso, propôs-se um planejamento estatístico fatorial 22 de primeira
ordem, com três repetições dos pontos centrais, totalizando em 5 combinações
reacionais para ambas as etapas, sendo que a primeira refere-se a um volume total de
reagentes de 40 mL e a segunda, para um volume de 400 mL, de modo a monitorar a
conversão de celulose a glicose perante variações nas condições reacionais.
6.4.1 – Planejamento estatístico para volume de 40 mL
Com o objetivo verificar qual a melhor velocidade de agitação e a quantidade
ideal de enzima a ser empregada para obter-se a maior quantidade de glicose, propôs-se
o seguinte planejamento:
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
25
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
Tabela 4: Planejamento estatístico para 40 mL
Enzima
+
+
0
0
0
Rotação (rpm) Ensaio
+
1
2
+
3
4
0
5
0
6
0
7
Onde:
+
0,1
Enzima (g)
0
0,025
0,065
Rotação (rpm)
+
0
380
280
330
6.4.2 – Planejamento estatístico para volume de 400 mL
Com o objetivo verificar qual a melhor velocidade de agitação e o pH que
proporciona a maior quantidade de glicose, propôs-se o seguinte planejamento:
Tabela 5: Planejamento estatístico para 400 mL
pH
+
+
0
0
0
Rotação (rpm) Ensaio
+
1
2
+
3
4
0
5
0
6
0
7
Onde:
+
6
pH
4
0
5
rotação (rpm)
+
0
350
0
175
7 – Resultados e discussões
Após terem sido realizados os ensaios dos planejamentos estatísticos, obtiveram-se os
seguintes resultados:
7.1 – Primeira etapa – volume de 40 mL
Baseando-se
no
primeiro
planejamento
estatístico,
realizaram-se
seus
correspondentes ensaios, sendo obtidos os seguintes resultados:
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
26
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
Tabela 6:: Resultados obtidos para volume de 40 mL
Ensaio Enzima (g)
1
0,1
2
0,1
3
0,025
4
0,025
5
0,065
6
0,065
7
0,065
Rotação
(rpm)
380
280
380
280
330
330
330
pHinicial
5,42
5,41
5,35
5,52
5,53
5,58
5,40
pHfinal
5,61
5,72
5,54
5,95
5,85
5,71
5,67
Abs.
DNS
1,40
1,64
0,51
0,43
1,17
0,96
0,93
Abs.
Enz.
0,53
0,57
0,12
0,13
0,39
0,28
0,25
[A.R]
(g/L)
2,46
2,88
0,92
0,78
2,07
1,69
1,65
[G]
(g/L)
2,62
2,81
0,64
0,68
1,92
1,40
1,23
Através de uma superfície de resposta,
resposta, foi possível estimar as concentrações de
glicose e açúcares redutores dentro da faixa das condições trabalhadas nos ensaios. Com
os resultados obtidos, construiu-se
construiu
a superfície de resposta da concentração de glicose
(Figura 6) que expressa o comportamento enzimático nos meios reacionais estudados.
Porém, na primeira linha da tabela, nota-se
nota se que o valor da concentração de glicose é
maior que o valor de açúcares redutores. Isso pode ser atribuído a erro experimental nas
análises realizadas.
3
2
1,5
1
0,5
0,085
0
0,055
280 290 300
310 320
0,025
330 340
350 360
370 380
Enzima (g)
[G] (g/L)
2,5
Rotação (rpm)
Figura 6: Superfície de resposta da concentração de glicose aos ensaios realizados
Observando a Figura 6, pode-se verificar um leve aumentoo da concentração de
glicose quando daa diminuição da rotação, ou seja, a catálise enzimática é mais eficiente
em rotações mais baixas, pois quando elevadas podem acarretar desnaturação mecânica
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum
(
officinarum L.)
27
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
das enzimas, além disso, quanto maior a quantidade de enzima, maior a concentração de
glicose obtida, evidenciada pelo comportamento ascendente da superfície obtida.
3
2
1,5
1
0,1
0,5
0,065
0
280 290 300
310 320
0,025
330 340
350 360
370 380
Enzima (g)
[A. R] (g/L)
2,5
Rotação (rpm)
Figura 7: Superfície de resposta da concentração de açúcares redutores aos ensaios realizados
De acordo com os resultados mostrados na Figura 7, verifica-se
se que foi gerada
uma superfície semelhante ao da figura anterior,
anterior, pois quanto maior a quantidade de
enzima empregada, maior a eficiência da catálise, e por conseqüência, a quantidade de
açúcares convertidos é mais elevada. Analogamente, o perfil de concentrações apresenta
um leve decaimento no que diz respeito à agitação do meio reacional.
7.2 – Segunda etapa – volume de 400 mL
Baseado
do no segundo planejamento estatístico a Tabela 7 mostra os resultados
correspondentes aos ensaios propostos:
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum
(
officinarum L.)
28
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
Tabela 7: Resultados obtidos para volume de 400 mL
Ensaio pHtampão
1
6
2
6
3
4
4
4
5
5
6
5
7
5
Rotação
(rpm) pHinicial pHfinal
350
6,19
6,25
0
6,18
6,22
350
4,23
4,19
0
4,26
4,15
175
5,28
5,08
175
5,29
5,20
175
5,29
5,14
Abs.
DNS
1,14
1,15
1,46
1,25
0,31
1,44
0,87
Abs.
Enz.
0,34
0,34
0,69
0,40
0,49
0,74
0,62
[A.R]
(g/L)
2,01
2,03
2,57
2,21
0,56
2,53
1,55
[G]
(g/L)
1,68
1,66
3,39
1,96
2,42
3,63
3,03
Observando os resultados mostrados na Tabela 7, pode ser observado que para
ensaios realizados com valores de pH inicial acima de 5, ocorreu uma elevação no pH
do meio reacional durante a hidrolise. Ao passo que para valores menores ou iguais a 5,
foi observada uma diminuição deste pH, indicando que há a liberação de íons OHdurante a reação, quer seja os íons pré existentes (provenientes da polpação) ou
resultantes da reação de hidrolise.
Através de uma superfície de resposta construída com dos resultados obtidos nos
ensaios de hidrolise, foi possível estimar as concentrações de glicose e açúcares
redutores dentro da faixa das condições trabalhadas nesses ensaios. A superfície de
resposta, Figura 8, mostra o comportamento da concentração de glicose em função dos
meios reacionais estudados. Porém, no ensaio 3 e nos ensaios referentes ao ponto
central (5, 6 e 7; Tabela 7), observa-se que a concentração de glicose possui valores
maiores que os valores da concentração de açúcares redutores. Esse fato pode ter sido
causado por falha no procedimento das análises ou saturação das soluções utilizadas pra
tal.
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
29
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
3,5
2,5
2
350
280
210
[G] (g/L)
3
1,5
41
4,5
140
Rotação (rpm)
5
70
5,5
0
pH
6
Figura 8: Superfície de resposta da concentração de glicose aos ensaios realizados
Observando os resultados mostrados na
n Figura 8, verifica--se que em pH
diferentes de 5 a concentração de glicose apresenta um declínio em relação à
concentração obtida em pH 5. Além disso, com a diminuição da rotação, a concentração
conce
de glicose também cai, contrariando os ensaios anteriores do planejamento anterior, nos
quais a concentração de glicose aumenta com a diminuição da rotação. Esse fato pode
estar ligado maior dificuldade de transferência de massa, e distribuição da enzima no
substrato, ocasionado pelo aumento no
n volume feito para o segundo planejamento.
planejamento
2
1,5
[A.R.] (g/L)
2,5
1
0
70
140
210
280
Rotação (rpm)
pH
350
Figura 9: Superfície de resposta da concentração de açúcares redutores aos ensaios realizados
De acordo com a Figura 9, verifica-se
se que foi gerada uma superfície diferente da
figura anterior,, indicando que há alguma falha no processo de análise,
análise, pois, a glicose é
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum
(
officinarum L.)
30
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
um açúcar redutor, portanto ambas as Figuras 8 e 9 deveriam apresentar um
comportamento semelhante, sendo que a concentração de açúcares redutores deve
possuir valores mais elevados, ou iguais, aos valores da concentração de glicose. Outro
fato que ressalta a possível falha é o ponto ótimo encontrado, no qual tem-se pH 4 sem a
presença de agitação sendo que ensaios anteriores demonstram que o pH ideal para tal
reação é 5. Diante do exposto, não é possível determinar qual das duas análises
apresentou a falha.
Esses resultados deveriam ter sido repetidos para que se pudesse sanar os
problemas apresentados nas analises e mostrar dados mais confiáveis, porém não havia
mais matéria-prima nem tempo hábil para realizá-los já que a aluna de iniciação se
formou e não faz mais parte do quadro discente desse centro universitário. Porém os
resultados alcançados já são de grande valia e mostram caminhos para novos ensaios e
projetos para uma nova leva de alunos interessados em pesquisa.
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
31
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
8 – Conclusão
Analisando os dados coletados nos ensaios do primeiro planejamento estatístico,
verificou-se que, dentre os meios reacionais estudados, o que fornece uma eficiência
mais elevada é aquele no qual se tem uma agitação mais baixa, cerca de 280 rpm e uma
quantidade de enzima de 0,1 g, que resulta em 2,81 g/L de glicose para 2 g de bagaço de
cana polpado. Contudo, observou-se que o pH da solução reacional elevou-se durante a
reação. Esse fato pode estar relacionado com a presença de soda ou íons Na+ adsorvidos
no bagaço, utilizada para realizar o tratamento de deslignificação (polpação), que
podem não ter sido totalmente removidos durante a lavagem efetuada após o processo.
Além disso, o tampão empregado não está mantendo o pH constante, que seria a sua
função.
Para os ensaios do segundo planejamento estatístico, optou-se por lavar o bagaço
de cana polpado com água, sendo seco em estufa antes da hidrólise. Esse procedimento
simples pareceu solucionar o problema da elevação do pH durante a reação, pois, de
acordo com as medidas de pH antes e após a hidrólise, não se verifica uma variação
significativa deste parâmetro.
Com relação ao segundo planejamento estatístico, não é possível concluir qual é
a melhor condição de trabalho, pois os resultados das análises foram divergentes e, em
virtude de falta de reagentes, não foi possível refazer-se os testes.
Para projetos futuros, sugiro um novo estudo de aumento de escala, pois não foi
possível determinar-se com precisão suas influências nesta reação, além do estudo do
uso de um evaporador rotativo para concentrar o hidrolisado, para que a fermentação se
torne possível.
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
32
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
9 – Referencias
AGUIAR, C. M., MARGONAR, M. H. L., LUCENA, S. J. Produção de celulases por
Aspergillus niger e efeito do pH e da Temperatura na hidrólise enzimática de resíduos
lignocelulósicos. XVI Encontro de Química da Região Sul, 2008. Disponível em
http://www.furb.br/temp_sbqsul/_app/_FILE_RESUMO_CD/799.pdf , acessem 9 de
agosto de 2010, as 20;52.
AMERICANO, B. B., PARCIORNIK, N., SANTOS, M. M. De O. Emissões de gases
de efeito estufa nos processos industriais e por uso de solventes. Ministério da Ciência
e Tecnologia. 2006.
BLANCO, R., M. L. Beneficiamento e polpação de Ráquis de bananeira “Nanicão”
(Musa Grupo AAA, “Giant Cavendishii”). Dissertação de (Mestrado). Escola
Superior de Agricultura “Luiz de Quiroz” – USP. Piracicaba, 1996.
BNDES e CGEE. Bioetanol de Cana-de-Açúcar – Energia para o desenvolvimento
sustentável. Editora eletrônica Abreu,s System. Rio de Janeiro, 2008.
BRASILEIRO, L. B., COLODETTE, J. L., PILÓ-VELOSO, D. A utilização de
perácidos na deslignificação e no branqueamento de polpas celulósicas. Química Nova.
V. 24, n. 6, 2001.
CAMPESTRINI. E., SILVA. V. T. M., APPELT. M. D. Utilização de enzimas na
alimentação animal. Revista Eletrônica Nutritime. V. 2. Nº. 6, novembro/dezembro
2005.
CONN, E. E., P. K. STUNPF. Manual de bioquímica. Edgard Blucher LTDA. 1973.
COSTA, M. M., COLODETTE, J. L., LANDIM, A., SILVA, C. M., CARVALHO, A.
M. M. L. Nova tecnologia de branqueamento de celulose adaptada ao fechamento do
circuito de água. Revista Árvore. V. 30, n. 1, 2006.
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
33
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
D’ALMEIDA, M. L. O. Celulose e papel – Tecnologia de fabricação da pasta
celulósica, v. 1. São Paulo, IPT, 1981.
DAROIT, D. J. Caracterização de uma beta-glicosidase de Monascus purpureus.
Dissertação de Mestrado. Universidade Federal do Rio Grande do Sul – Faculdade
de Agronomia, Porto Alegre, 2007.
FELDMAN, K. A., LOVETT, J. S., TSAO, G. T. Isolation of the cellulase enzymes
from the termophilic fungus Thermoascus aurantiacus and regulation of enzymes
production. Enzymes and Microbial Technology. v. 10, 1988.
______. Fórum Brasileiro de Mudanças Climáticas, FBMC (2002). Mudanças
Climáticas – Guia de informações. Brasília, D.F.
FUENTES, L. L. G., FILHO, R. S., COSTA, A. C. Estudo da Hidrólise Enzimática do
Bagaço de Cana e Caracterização do Material Antes e Após o Pré-Tratamento. V
EPFEQ - ENCONTRO DE PESQUISA DA FACULDADE DE ENGENHARIA
QUÍMICA
/
UNICAMP
–
2007.
Disponível
em
http://www.feq.unicamp.br/EPFEQ/07/BIO03.pdf , 9 de agosto de 2010, as 29:48.
GOLDSTEIN, I. S. Organic Chemicals from Biomass. CRC Press. Inc., Florida, 1981.
GALLIANO, H., GAS, G., DURANT, H. Lignocelullose biodegradation and lignase
excretion by mutant strains of Phanerochaete chrysosporium hyperproducing celullases.
Biotechnology Letters. v. 10, 1988.
KLOCK, U., MUNIZ, G. I. B., HERNANDEZ, J. A., ANDRADE, A. S. Química da
madeira. 2005.
LEHNINGER. A. L. Princípios de Bioquímica. Sarvier. São Paulo, 1989.
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
34
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
LIMA,
B.
M.
Biocombustível
&
Biotecnologia:
etanol
celulósico.
http://www.genetica.esalq.usp.br/pub/seminar/BMLima-200901-Resumo.pdf (acesso 8
de agosto de 2010, 21:26)
LUCARINI, A. C. Caderno de laboratório da disciplina bioquímica industrial II. São
Bernardo do Campo, 2006.
MACHADO, G. O. Preparação e caracterização de CMC e CMC grafitizada.
Dissertação de Mestrado. Universidade de São Paulo – Instituto de química de São
Carlos – Ciência e engenharia de Materiais. São Carlos, 2000.
MANZANO, P. R., FUKUSHIMA, R. S., GOMES, J. D. F., GARIPPO, G.
Digestibilidade do bagaço de cana-de-açúcar tratado com reagentes químicos e pressão
de vapor, Revista Brasileira de Zootecnia. V. 29. n. 4. 2000.
MARTINS, R. E. Estudo da imobilização de celulase em géis de quitosana. Dissertação
de Mestrado. Universidade Federal de São Carlos – Centro de Ciências Exatas e
Tecnologia. São Carlos, 2007.
MARZZOCO, A., TORRES, B. B. Bioquímica básica. 2. ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 1999.
MILLER, G. L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.
Analytical Chemistry, v. 31,. n. 3, p. 426-428, 1959.
REYES, J. PERALTA-ZAMORA, P., DURÁN, N. Hidrolise enzimática de casca de
arroz utilizando-se celulases. Efeito de tratamentos químicos e fotoquímicos. Química
Nova. V. 21. Nº. 2, 1998.
RUEGGER, M. J. S., TAUK-TOMISIELO. Atividade da celulase de fungos isolados do
solo da Estação Ecológica de Juréia-Itatins, São Paulo, Brasil. Revista Brasileira de
Botânica. V. 27. Nº. 2, 2004.
SANTOS, J. R. A., MAIOR, A. M. S., GOUVEIA, A. R. Comparação entre processos
em SHF e em SSF de bagaço de cana de açúcar para a produção de etanol por
Saccharomyces
cerevisiase.
Química
nova,
vol
33,
2010.
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
35
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0100-40422010000400027&script=sci_arttext
(acesso 8 de agosto de 2010, 21:31)
SCANDIFFIO, M. I. G. Análise prospectiva do álcool combustível ao Brasil – Cenários
2004-2024. Dissertação de Mestrado. Universidade Estadual de Campinas –
Faculdade de Engenharia Mecânica, Campinas, 2005.
SILVÉRIO, H. N. La Indústria de los derivados de la caña de azúcar. Editorial
Científico-Técnica la Habana. Habana, Cuba, 1988.
SOFFNER, M. L. A. P. Produção de polpa celulósica a partir de engaço de bananeira.
Dissertação de Mestrado. Escola Superior de Agricultura “Luiz de Quiroz” – USP.
Piracicaba, 2001.
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
36
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
Anexos
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
37
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
Anexo 1: Curvas de calibração do espectrofotômetro
•
Método Enzimático
A concentração de glicose é obtida no método enzimático através da análise
espectrofotométrica, utilizando uma curva de calibração que correlacione absorbância e
concentração de glicose. Para a elaboração dessa curva foram utilizadas amostras
padrões de concentração: 0,2; 0,4; 0,8; 1,0; 1,2; 1,6; 2,0. Utilizando solução mãe de
glicose 2g/L.
Tabela 8: Dados para a curva de calibração
Tubo
[G] (g/L)
Vsolução mãe (mL)
Vágua (mL)
Vtotal (mL)
1
2
3
4
5
6
7
0,2
0,4
0,8
1
1,2
1,6
2
1
2
4
5
6
8
10
9
8
6
5
4
2
0
10
10
10
10
10
10
10
De acordo com as análises realizadas no espectrofotômetro, obteve-se:
Tabela 9: Absorbância obtida para cada concentração de glicose
[G] (g/L)
0,2
0,4
0,8
1
1,2
1,6
2
Abs.
0,034
0,086
0,168
0,188
0,225
0,313
0,418
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
38
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
Método Enzimático
2,5
y = 4,8539x + 0,0356
R² = 0,992
[G] (g/L)
2
1,5
1
0,5
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Absorvância
Figura 10: Curva de calibração do Método Enzimático
•
Método DNS
Para a utilização do método DNS, foi necessário o levantamento da curva de
calibração (absorbância em função da concentração de glicose). Esta curva foi elaborada
partindo-se de uma solução contendo 1 g/L de glicose (Merk D(+) Glicose anidro
180,16 g/mol) diluída em água destilada.
A partir desta solução, foram efetuadas diluições consecutivas para obter
soluções de 0,1, 0,2, 0,4, 0,5, 0,7 e 0,8 g/L. A quantidade de volume da solução de 1
g/L, denominada “volume estoque”, necessária para obter as diluições, foram calculadas
a partir da expressão: C1V1 = C2V2.
Tabela 10: Dados para curva de calibração
Tubo
1
2
3
4
5
6
7
[G] (g/L) Vsolução mãe (mL) Vágua (mL)
0,1
0,2
0,4
0,5
0,6
0,8
1
0,1
0,2
0,4
0,5
0,6
0,8
1
0,9
0,8
0,6
0,4
0,3
0,2
0
Vtotal (mL)
1
1
1
1
1
1
1
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
39
Laboratório de Química do Centro Universitário da FEI
_______________________________________________________________________________________________
De acordo com as análises realizadas no espectrofotômetro, obteve-se:
Tabela 11: Absorbância obtida para cada concentração de glicose
[G] (g/L)
0,1
0,2
0,4
0,5
0,6
0,8
1
Abs.
0,036
0,103
0,229
0,269
0,322
0,431
0,566
Curva de calibração
Método DNS
1,2
[G] (g/L)
1
y = 1,7423x + 0,0274
R² = 0,9973
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Absorvância
Figura 11: Curva de calibração do Método DNS
_______________________________________________________________________________________________
Estudo do aumento de escala do processo enzimático de hidrólise da celulose obtida a partir de resíduos
lignocelulósicos do bagaço de cana (Saccharum officinarum L.)
40