Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas
Universidade Federal de Ouro Preto
Yara Cristina de Paiva Maia
PEPTÍDEOS LIGANTES DE CÉLULAS TUMORAIS E
DE IMUNOGLOBULINAS G ESPECÍFICOS DO
CÂNCER DE MAMA
Orientador: Prof. Dr. Luiz Ricardo Goulart Filho
Co-orientadora: Profa. Dra. Renata Nascimento Freitas
Ouro Preto - 2011
Yara Cristina de Paiva Maia
PEPTÍDEOS LIGANTES DE CÉLULAS TUMORAIS E
DE IMUNOGLOBULINAS G ESPECÍFICOS DO
CÂNCER DE MAMA
Tese de doutorado apresentada ao Núcleo de
Pesquisas em Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Ouro Preto, como requisito parcial para
obtenção
do
grau
de
doutora
em
Ciências
Biológicas.
Orientador: Prof. Dr. Luiz Ricardo Goulart Filho
Co-orientadora: Profa. Dra. Renata Nascimento Freitas
Ouro Preto - 2011
iv
DEDICATÓRIA
Dedico o meu doutorado aos meus dois amores: Marcelo e Mariana!
Faltam-me palavras para expressar a minha profunda admiração, gratidão e amor por
vocês. Tudo que eu escrever será muito pouco perto do que vocês representam na minha
vida.
Marcelo, meu amado companheiro e amigo, obrigada pelo incentivo para seguir carreira
acadêmica e alcançar os meus sonhos, por mais difíceis e ousados que pudessem ser.
Obrigada pelo ombro amigo que tantas vezes me amparou e fez com que eu não desistisse.
O seu companheirismo, paciência, orientação e otimismo foram fundamentais para a
conclusão de um ciclo importante e decisivo na minha vida profissional.
A minha linda e amada filha Mariana, um verdadeiro presente de Deus! Você é o exemplo
de que os sonhos por mais difíceis e ousados que sejam, podem ser alcançados, desde que
se tenha fé, paciência e bom coração. Agradeço pela sua compreensão, pelo seu olhar
sereno, calmo e doce... Agradeço pela sua paciência e por compreender meus momentos de
silêncio e concentração para concluir esta tese. Espero que você entenda desde pequena o
verdadeiro valor do trabalho e a importância das escolhas, pois não podemos ter tudo ao
mesmo tempo. Espero em breve poder retribuí-la por tudo isso.
v
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a todos que, de maneiras diferentes, contribuíram para este
trabalho:
A Deus, por todas as graças que tenho alcançado e por me proporcionar saúde,
paciência, sabedoria e perseverança para finalizar mais uma etapa da minha formação.
Ao Prof. Dr. Luiz Ricardo Goulart, que prontamente aceitou se credenciar no
NUPEB para que eu pudesse desenvolver o meu trabalho de doutorado sob a sua
orientação no Laboratório de Nanobiotecnologia em Uberlândia. Obrigada pela liberdade
que me foi concedida durante estes anos, pelos inúmeros conhecimentos transmitidos e
pelo exemplo de pesquisador inovador, criativo, dedicado, produtivo e humano. Sinto-me
preparada para abraçar a docência e a pesquisa, pois seguirei o seu exemplo e estou certa
de que o sucesso acontecerá.
A Profa. Dra. Renata Nascimento Freitas, pelo exemplo de rigor, seriedade e critério
científico na condução de uma pesquisa. Obrigada pela sua amizade, carinho, atenção e
orientação desde o meu mestrado.
Aos docentes do Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas pelos ensinamentos
ministrados. Aos professores Renata Guerra, Ieso Miranda Castro e Andrea Maranhão
pelas sugestões e considerações feitas na banca de qualificação do doutorado e que tanto
contribuíram para o aperfeiçoamento desta tese.
A querida Cida, pela competência, amizade e por toda a solicitude e presteza desde o
meu mestrado.
Ao CNPq, CAPES, UFU, UFOP que financiaram o meu trabalho.
Aos meus amados pais, Antonio Carlos de Paiva e Yara Aguiar Rezende de Paiva,
por serem o meu “Porto Seguro” e por acreditarem que o maior legado que os pais podem
deixar para os filhos é a educação. Agradeço pelo exemplo de trabalho, caráter,
honestidade, respeito e união a mim transmitidos desde os meus primeiros passos. Se hoje
estou concluindo o doutorado e sou professora da UFU é devido à dedicação e exemplo de
vocês, portanto o título de doutora e a minha profissão pertencem também a vocês.
Ao Dr. Carlos Eduardo Paiva, o médico e irmão mais humano, inteligente, criativo e
trabalhador, exemplo de que trabalhar com retidão, seriedade, humildade e amor vale a
pena. Agradeço pela sua enorme e valiosa contribuição em um momento decisivo e
importante para a conclusão desta tese.
vi
A Dra. Bianca Sakamoto Ribeiro de Paiva, por ser a irmã que eu pude escolher na
vida. Obrigada pelas suas orações, orientações e amizade. Obrigada pelo seu ombro amigo
que tantas vezes ouviu os meus desabafos em relação aos insucessos experimentais e
pessoais e que vibrou com os meus momentos de sucesso. Obrigada pelo incentivo para
que eu fosse cada vez mais feliz e mais realizada.
Aos meus eternos amigos de Ouro Preto, vocês fazem parte da minha história.
Aos queridos e eternos amigos do laboratório de Nanobiotecnologia, Ana Carolina
Siquieroli, Ana Paula Carneiro, Ângela Sena, Ayla, Prof. Carlos, Carol Reis, Christiane,
Eliza, Emilia, Érica, Fabiana Santos, Fausto Capparelli, Galber, Janaína, professor Jair
Júnior, Juliana Franco, Karina Marangoni, Larissa Minari, Larissa Goulart, Luciana
Bastos, Lucélia, Patrícia Terra, Patrícia Tieme Fujimura, Paula Cristina, Paula Souza,
Rafael Nascimento, Rone, Tamiris, Thaise, Tininha, Thiago, Vanessa, Vívian, e
Washington pela troca de conhecimentos, pelas longas conversas, pela amizade, pelas
discussões científicas e pelo exemplo de que um grupo pode ser cada dia melhor e mais
produtivo.
A amiga Patrícia Tieme Fujimura, que em 2007 me apresentou o laboratório do Prof.
Luiz e desde então foi a amiga de todas as horas. Obrigada pela troca de conhecimentos e
pela valiosa colaboração em um momento que o tempo pareceu curto demais para tantos
experimentos e atividades.
A amiga Thaise que esteve comigo desde os primeiros passos para a organização do
banco de dados da mama e a partir daí esteve sempre presente. A convivência com uma
pesquisadora organizada, competente e inteligente foi muito enriquecedora para mim.
Estou certa de que colheremos muitos frutos de tanta dedicação e trabalho.
Ao amigo Fausto Capparrelli, pela presteza em momentos importantes da minha vida
de pesquisadora, por me ensinar os primeiros passos no mundo do PD e por não medir
esforços para auxiliar a todos os integrantes do Grupo Nanos.
Aos meus amigos Ju, Galber, Tamiris e Carol por todos os momentos de
convivência sempre agradável e pela enorme ajuda em momentos importantes desta tese.
A querida Vanessa pela seleção do anticorpo monoclonal e pela enorme ajuda na
realização dos ELISAS em um momento que o tempo era muito importante para mim.
Aos médicos e enfermeiros do Centro Obstétrico do Hospital de Clínicas do Hospital
de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia e de maneira muito especial ao Dr.
Donizeti Wilian Santos e a Dra Luanda Calábria.
vii
Não poderia deixar de agradecer a colaboração dos seguintes integrantes da equipe
médica e de enfermagem do Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia:
Dra. Priscila, Dr. Thales, Dr. Alair, Dr. Sinval, Dr. Eduardo, Vanessa, Gina, Cleonice,
Aparecida, Maria de Fátima, Ana Aloisa, Divina. Sem o trabalho e compreensão de vocês
nenhum resultado seria alcançado.
Agradecimento especial a enfermeira Emilia Hissami Toyama, que prontamente
colaborou com a coleta de todo o material biológico das pacientes portadoras de câncer de
mama. Agradecimento especial ao Osmar e a Noêmia, que tantas vezes me auxiliaram na
coleta do material biológico.
Ao Dr. Amilcar pela enorme contribuição na realização da imunofluorescência e
imunohistoquímica.
Ao Dr. Rafael Malagoli e ao Dr. Fernando Soares, por abrirem as portas da Anatomia
Patológica do Hospital ACCamargo, em São Paulo, para a realização da validação clínica
dos biomarcadores.
A Suely, pesquisadora do Hospital ACCamargo, pela enorme contribuição na
realização da Imunohistoquímica. A convivência com uma pesquisadora dinâmica,
competente e produtiva foi muito enriquecedora para mim.
A toda a equipe do Hospital ACCamargo, pelos conhecimentos transmitidos e pela
convivência durante o estágio realizado no Serviço de Anatomia Patológica.
Agradecimento especial ao Carlinhos e ao Severino que tanto contribuíram na realização
do Tissue Micro Array com os pacientes da Universidade Federal de Uberlândia.
A professora Dra. Ana Grace, Dr. João Marcos e ao Dr. Diego pela enorme
colaboração no desenvolvimento dos sensores eletroquímicos.
A Dra Paula Cristina pela realização do gel bidimensional e pela amizade.
Aos meus queridos sogros, Altair e Niza, pelas orações, pelo carinho e pelo amor.
Às minhas amigas Andrea e Cleusa, pela amizade, companheirismo, pelas orações e
por compreender os meus momentos de crise.
A toda a família da Casa da Fraternidade São Francisco de Assis pelo acolhimento e
pelas orações em momentos difíceis da minha vida profissional e pessoal.
As mulheres doadoras das amostras e a todos aqueles que sofreram, sofrem ou
sofrerão dos males causados pelo câncer. Obrigada por cederem o seu tempo e partilharem
a sua dor e experiência comigo.
viii
COLABORADORES
Prof. Dr. Amílcar Sabino Damazo (Departamento de Ciências Básicas em Saúde Faculdade de Ciências Médicas – UFMT, Laboratório de Histologia)
Profa. Dra. Ana Grace Brito Madurro, Prof. Dr. João Marcos Madurro e Dr. Diego
Leoni Franco (Laboratório de Filmes Poliméricos e Nanotecnologia – UFU)
Prof. Dr. Carlos Ueira Vieira (Laboratório de Nanobiotecnologia - UFU)
Dr. Carlos Eduardo Paiva (Oncologista clínico - Hospital do Câncer de Barretos)
Prof. Dr. Fernando Soares e Dr. Rafael Malagoli Rocha (Departamento de Anatomia
Patológica – Hospital ACCamargo)
Prof. Dr. Marcelo de Almeida Maia (Faculdade de Computação – UFU)
Dr. Wilian Donizeti Santos e Dra. Luanda Calábria (Departamento de Ginecologia e
Obstetrícia – HC – UFU)
ix
ÍNDICE GERAL
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS
RESUMO
ABSTRACT
x
Í NDICE GERAL
1
INTRODUÇÃO ............................................................................................................................................ 1
2
REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................................................... 3
2.1
EPIDEMIOLOGIA E ETIOLOGIA DO CÂNCER DE MAMA ............................................................................ 3
2.2
ASPECTOS ANÁTOMO-PATOLÓGICOS ..................................................................................................... 4
2.3
ASPECTOS MOLECULARES ..................................................................................................................... 7
2.4
ASPECTOS IMUNOLÓGICOS .................................................................................................................... 7
2.5
USO DE BIBLIOTECAS COMBINATORIAIS NO CÂNCER ........................................................................... 10
2.6
SENSORES ELETROQUÍMICOS ............................................................................................................... 14
3
OBJETIVOS............................................................................................................................................... 17
4
MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................................................... 18
4.1
4.1.1
Biopanning de células HCC 1954 ................................................................................................. 18
4.1.2
Análise de um peptídeo imunodominante sintetizado quimicamente ............................................. 24
4.1.3
Análise da qualidade da seleção – Screening ELISA .................................................................... 25
4.1.4
Análise in silico de peptídeo imunodominante .............................................................................. 27
4.2
5
ESTRATÉGIA 1: OBTENÇÃO DE SEQUÊNCIAS LIGANTES EM LINHAGEM CELULAR HCC 1954 ............... 18
ESTRATÉGIA 2: OBTENÇÃO DE SEQUÊNCIAS LIGANTES À IGG DE TECIDOS MAMÁRIOS ....................... 28
4.2.1
Biopanning de Imunoglobulinas G provenientes de tecido mamário ............................................ 29
4.2.2
Pre-screening (ELISA) dos ciclos de seleção dos biopannings ..................................................... 37
4.2.3
Análise da imunorreatividade dos fagos recombinantes ............................................................... 37
4.2.4
Análise do peptídeo sintético com melhor imunorreatividade via fago ......................................... 39
4.2.5
Desenvolvimento de sensor eletroquímico para a detecção do câncer de mama .......................... 41
4.2.6
Seleção de anticorpos scFv expressos na superfície de fagos ....................................................... 41
4.2.7
Análise in silico de peptídeo selecionado ...................................................................................... 48
RESULTADOS .......................................................................................................................................... 49
5.1
ESTRATÉGIA 1: SEQUÊNCIAS LIGANTES EM LINHAGEM CELULAR HCC 1954 ...................................... 49
5.1.1
Biopanning de células HCC 1954 ................................................................................................. 49
5.1.2
Análise do peptídeo imunodominante SC195 ................................................................................ 51
5.1.3
Seleção nos ciclos de biopanning .................................................................................................. 55
5.1.4
Análise in silico de peptídeo imunodominante .............................................................................. 62
5.2
ESTRATÉGIA 2: SEQUÊNCIAS MIMÉTICAS EM TECIDOS MAMÁRIOS ...................................................... 66
5.2.1
Biopanning utilizando Imunoglobulinas G provenientes de tecido mamário ................................ 66
5.2.2
Pre-screening (ELISA) dos ciclos de seleção dos biopannings ..................................................... 71
5.2.3
Imunorreatividade dos fagos recombinantes ................................................................................. 71
5.2.4
Imunorreatividade do peptídeo sintetizado a partir do fago F4 .................................................... 76
5.2.5
Desenvolvimento de sensor eletroquímico para a detecção do câncer de mama .......................... 77
xi
6
5.2.6
Seleção dos anticorpos scFv.......................................................................................................... 80
5.2.7
Análise in silico de peptídeo selecionado ...................................................................................... 81
DISCUSSÃO............................................................................................................................................... 84
6.1
ESTRATÉGIA 1: SEQUÊNCIAS LIGANTES EM LINHAGEM CELULAR HCC 1954 ...................................... 84
6.1.1
A perda de variabilidade nos sucessivos ciclos de seleção ........................................................... 84
6.1.2
O peptídeo imunodominante SC195 como potencial marcador de prognóstico ........................... 86
6.1.3
Análise in silico de peptídeo selecionado ...................................................................................... 88
6.1.4
Considerações sobre o processo de seleção por phage display .................................................... 89
6.2
ESTRATÉGIA 2: SEQUÊNCIAS MIMÉTICAS EM TECIDOS MAMÁRIOS ...................................................... 90
6.2.1
O impacto na seleção do biopanning com a utilização de vários grupos...................................... 90
6.2.2
Imunorreatividade em soro dos fagos recombinantes obtidos de tecido ....................................... 91
6.2.3
Análise in silico de peptídeo selecionado ...................................................................................... 94
6.2.4
Viabilidade de desenvolvimento de sensor eletroquímico ............................................................. 95
6.2.5
Viabilidade para o uso de anticorpos scFv ................................................................................... 95
6.2.6
Considerações sobre a estratégia de seleção subtrativa em phage display .................................. 97
7
CONCLUSÃO ............................................................................................................................................ 98
8
ANEXOS ..................................................................................................................................................... 99
9
8.1
ANEXO I – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ......................................................... 99
8.2
ANEXO II – QUESTIONÁRIO CLÍNICO ................................................................................................. 101
8.3
ANEXO III – APROVAÇÃO DO PROJETO PELO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA .................................. 103
8.4
ANEXO IV - PRODUTO ....................................................................................................................... 104
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................................... 105
xii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Micro anatomia da mama. UTDL = unidade terminal ducto-lobular. Fonte: Brasileiro Filho, G.
Bogliolo Patologia. Sétima edição, Guanabara Koogan, 2006.
Figura 2 - A. Células epiteliais da glândula mamária. Representação do corte de um ducto mamário normal, no
qual se observam células luminais, progenitoras e mioepiteliais. A membrana basal separa as células
mioepiteliais do estroma adjacente. (Adaptada de Birnbaum, D et al. Int. J. Oncol., 25:249-58,2004.) B. Dúctulo
de glândula mamária normal. Imunohistoquímica para uma proteína basal (p63) identifica os núcleos das células
basais/mioepiteliais (seta). Fonte: Brasileiro Filho, G. Bogliolo Patologia. Sétima edição, Guanabara Koogan,
2006.
Figura 3- Fago filamentoso. A) Composição do gene III, mostrando o sítio de ligação de clonagem para
introdução do gene adicional; B) Partícula viral com as proteínas pIII, pVI, pVII, pVIII e PIX; C) Cristalografia
dos domínio D1 e D2 da proteína III (97), as alfa-hélices estão coloridas em vermelho e as fitas β em ciânico.
(HOLLIGER et al., 1999).
Figura 4 - Ciclos de seleção de proteínas a partir de uma biblioteca de phage display. Bibliotecas de proteínas
(coloridas) são apresentadas em partículas de fagos fusionadas às proteínas de superfície (preto) (SIDHU e
KOIDE, 2007).
Figura 5 - Representação esquemática do fragmento scFv. Os domínios VH e VL presentes na molécula scFv
aparecem nas cores verdes e vermelhas, respectivamente. O polipeptídeo (peptide linker) estabilizador dos
domínios está indicado pela seta (WEISSER e HALL, 2009).
Figura 6 - Organograma descritivo da metodologia adotada com apresentação das estratégias 1 e 2.
Figura 7 - Delineamento experimental para a realização do biopanning com a biblioteca contendo 12
aminoácidos randômicos e utilizando-se como alvo extrato proteico de células HCC 1954 BL e HCC 1954.
Figura 8 - Esquema ilustrativo da utilização de microesferas ativadas com proteína G para purificação de IgG e
imunoprecipitação de proteínas específicas.
Fonte:http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/100.03D04D_Dynabeads_Protein_G_(rev004).pdf.
Figura 9 - Estratégia experimental do biopanning realizado com Imunoglobulinas G provenientes de tecido de
pacientes com câncer de mama.
Figura 10 - Esquema representativo do ensaio imunoenzimático ELISA para avaliação da reatividade dos cinco
fagos em amostras de soro.
Figura 11 - Etapas de construção do sensor para câncer de mama. Eletrodo de grafite (azul), polímero (marrom),
peptídeo (vermelho) e IgG (ciano).
Figura 12 - Título dos fagos. As colônias azuis representam a infecção das bactérias E.coli (ER2738) com os
fagos M13 carregando o gene da β-galactosidase. A, B, C e D representam titulações de 10-1 até 10-4.
Figura 13 - Gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídeo, contendo: M: DNA de fago M13 padrão
contendo 400ng de DNA (Pharmacia). 1-6: Amostras do DNA de fago M13 selecionados randomicamente no
biopanning.
Figura 14 - Imunofluorescência para o peptídeo SC195 indicando marcação positiva em células de
adenocarcinoma ductal de mama.
Figura 15 - Valores médios da razão da absorbância (HCC1954/HCC1954BL) dos trinta primeiros clones mais
reativos obtidos no primeiro ciclo de seleção referente aos dois sequenciamentos realizados.
Figura 16 - Valores médios da razão da absorbância (HCC1954/HCC1954BL) dos trinta primeiros clones mais
reativos obtidos no segundo ciclo de seleção referente aos dois sequenciamentos realizados.
Figura 17 - Valores médios da razão da absorbância (HCC1954/HCC1954BL) dos três clones obtidos no terceiro
ciclo de seleção referente aos dois sequenciamentos realizados.
Figura 18 - Validação dos fagos selecionados por meio de PD tendo como alvo linhagem celular HCC 1954.
Figura 19 - Alinhamento tridimensional do peptídeo C195 contra alvos selecionados.
Figura 20 - Expressão do gene KCNMA1 em diversos tipos de câncer. (Fonte: www.genecards.com)
Figura 21 - Expressão do gene INPP1 da fosfatase 1 de polifosfato de inositol em diversos tipos de câncer.
(Fonte: www.genecards.com)
xiii
Figura 22 - Gel SDS-PAGE para análise das proteínas extraídas de tecidos mamários. Coluna M: Marcador de
peso molecular Prestained SDS-PAGE Standards Broad Range (Bio-rad). Colunas 1 a 3: 15 microgramas de
proteínas de tecido de paciente com câncer de mama, doença benigna da mama e controles, respectivamente.
Figura 23 - Membrana de Dot Blot das amostras de extrato de proteína total (Ptn. T.), proteínas remanescentes
(R) e de IgG purificada (IgG P.) de amostras de pacientes CO, DBM e CM.
Figura 24 - Absorbância dos 5 clones mais reativos de cada grupo de pacientes
Figura 25 - Gráficos representativos das leituras a 492 nm do ensaio ELISA mostrando a reatividade dos clones
contra os soros de pacientes individuais de diferentes grupos.
Figura 26 - Gráfico representativo da Curva ROC (CA x CO) referente ao Fago F4.
Figura 27 - Gráfico de dispersão para comparação da absorbância do fago F4 em relação ao grau histológico, a
receptor de estrógeno (RE), a receptor de progesterona (RP) e a receptor c-erb B2.
Figura 28 - Gráfico de Dispersão da Absorbância relativo ao peptídeo sintético F4. A linha horizontal representa
o valor do cut off obtido por meio da curva ROC.
Figura 29 - Diagrama de Nyquist de eletrodos modificados com poli ácido 3-hidroxifenilacético contendo (―)
peptídeo (sonda) e (―) peptídeo-IgG (alvo) em solução contendo 5 mM de ferrocianeto de potássio, 5 mM de
ferricianeto de potássio e 0,1 M de cloreto de potássio, potencial aplicado: +0.24 V, amplitude: 0,10 V. Inset:
região de alta frequência ampliada.
Figura 30 - Diagrama de Nyquist de eletrodos modificados com poli ácido 3-hidroxifenilacético contendo
(―■―) peptídeo (sonda), (―▲―) peptídeo e igG (alvo) e (―♦―)peptídeo e igG (alvo não-complementar) em
solução contendo 5 mM de ferrocianeto de potássio, 5 mM de ferricianeto de potássio e 0,1 M de cloreto de
potássio, potencial aplicado: +0.24 V, amplitude: 0,10 V. Inset: região de alta frequência ampliada.
Figura 31 - Circuito equivalente para simulação dos dados de EIE. Rs é a resistência da solução, Qdl,1 é a
capacitância da dupla camada elétrica, Rct,1 é a resistência à transferência de carga, W é a resistência de Warburg
e Qdl,2 é a segunda capacitância.
Figura 32 - Voltamogramas de pulso diferencial de eletrodos modificados com poli ácido 3-hidroxifenilacético
contendo (―) apenas o peptídeo (sonda), (―) contendo peptídeo e igG (alvo) e (―) peptídeo e igG (alvo não
complementar) em solução contendo 5 mM de ferrocianeto de potássio, 5 mM de ferricianeto de potássio e 0,1
M de cloreto de potássio, 16 mV/s.
Figura 33 - Absorbância dos clones (anticorpos scFv) mais reativos relacionados ao peptídeo sintético (SF4).
Figura 34 - Absorbância dos cinco clones (Anticorpos scFv) mais reativos em relação ao fago com o peptídeo e o
fago selvagem.
Figura 35 - Alinhamento tridimensional do peptídeo F4 contra alvos selecionados.
xiv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Variáveis para o cálculo de sensibilidade especificidade e acurácia
Tabela 2 - Seleção dos fagos com peptídeos ligantes ao extrato proteico de células HCC 1954. Título obtido
(pfu) no processo de seleção.
Tabela 3 - Frequência de cada clone obtido no terceiro ciclo de seleção.
Tabela 4 - Relação das amostras analisadas na Imunofluorescência, com o diagnóstico histopatológico e com a
intensidade de marcação em relação ao Recepetor de Estrógeno (RE), Receptor de Progesterona (RP) e HER.
Tabela 5 - Avaliação da Intensidade de Fluorescência (IF) categorizada em 0, 1-2 e 3 considerando os
Receptores de Estrógeno (RE), receptores de progesterona (RP), classificação de Scarff-Bloom-Richardson
SBR) e o perfil (luminal ou triplo negativo TPN) utilizando-se o Teste Exato de Fischer.
Tabela 6 - Valores médios com os respectivos desvios padrões da absorbância dos clones presentes nos três
ciclos de seleção.
Tabela 7 - Valores referentes ao Ensaio Imunoenzimático dos clones selecionados referentes aos três ciclos de
seleção com os valores da média da absorbância do clone em relação ao extrato proteico das células HCC 1954,
em relação às células normais e valores da média da absorbância da razão Tumor/ Câncer.
Tabela 8 - Clones referentes aos três ciclos de seleção com respectivos valores de absorbância e marcação na
imunohistoquímica.
Tabela 9 - Comparação dos resultados referentes à Imunohistoquímica realizada com o fago C195 e a
Imunofluorescência realizada com o peptídeo sintético SC195.
Tabela 10 - Alinhamentos mais significativos para o peptídeo C195 – Banco de Dados “Reference Proteins”
Tabela 11 - Caracterização dos agrupamentos de pacientes com CM, DBM e CO que fizeram parte do
biopanning.
Tabela 12 - Aspectos clínico-patológicos dos cinco grupos de câncer de mama (G1, G2, G3, G4, G5)
considerando o grau do tumor, o estadiamento, a classificação de Scarff-Bloom Richardson (SBR), os receptores
de estrógeno e progesterona, cerB2 e p53.
Tabela 13 - Seleção dos fagos com peptídeos ligantes a proteínas do câncer de mama. Título obtido (UFC) no
processo de biopanning com amostras de IgG provenientes do soro e tecido.
Tabela 14 - Ciclos de seleção do biopanning com o respectivo número de sequências válidas, sequências únicas
e repetidas.
Tabela 15 - Fagos F4, C10, B1, D11 e A7 com os respectivos valores referentes à curva ROC considerando os
grupos CA x CO, CA x DBM e CA x DBM x CO.
Tabela 16 - Fagos com correlação de Pearson estatisticamente significativa (P-value < 0,05).
Tabela 17 - Correlação de Pearson entre os valores de absorbância dos 33 pacientes para os 5 fagos
(acima Valor de Correlação de Pearson, abaixo P-value).
Tabela 18 - Peptídeo sintético SF4 com os valores referentes à curva ROC.
Tabela 19 - Sensibilidade, especificidade e acurácia do peptídeo SF4.
Tabela 20 - Parâmetros obtidos por meio de simulação de dados de EIE usando circuito equivalente proposto
para eletrodos de grafite modificado com poli ácido 3- hidroxifenilacético contendo peptídeo (sonda), peptídeo e
IgG (sonda e alvo) e peptídeo e igG (sonda e alvo não-complementar)
Tabela 21 - Alinhamentos mais significativos para o peptídeo F4 – Banco de Dados “Reference Proteins”
xv
LISTA DE ABREVIATURAS
BCIP - Bromochloroindolyl phosphato
BLASTp - (Basic Local Alignment Search Tool), programa de busca por alinhamento.
BLOSUM - (BLOck SUbstitution Matrix)
BSA - Bovine Serum Albumin, Soroalbumina Bovina
CEP/UFU - Comitê de Ética em Pesquisa na UFU
CM - Câncer de mama humano
CO - Controle
DAB- 3-3’ – (diaminobenzidine tetrahydrochloride), tetrahidrocloreto diaminobenzidina
DNA - Ácido desoxirribonucleico
DNA2PRO- Programa do RELIC destinado a dedução do DNA
DTT - Ditiotreitol
EDTA - Etileno diamino tetra acetato
ELISA- (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), Imunoensaio enzimático
EIE - Espectroscopia de Impedância Eletroquímica
ER2738 - Escherichia coli cepa ER2738
HC- Hospital de Clínicas
HE- Hematoxilina e Eosina
HER-2- Human receptor 2 = cerb2
HRP- (Horse rad Imuno Histoquímica peroxidase), marcação com peroxidase
IgG - Imunoglobulinas G
IHQ - Imunohistoquímica
INCA - Instituto Nacional de Câncer
IPTG- (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)
LB- Meio de cultura Luria-Bertani
M13KE - Bacteriófagos filamentosos
ML - Mass Ladder
NBT - Nitroblue tetrazolium
Ni – Níquel
OD - Densidade ótica
OPD- Orto-fenilenodiamina
PAAF - Punção Aspirativa por Agulha Fina
PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida
xvi
pB - Par de base
PBS- Tampão fosfato salino
PBST - Fosfato de sódio com tween 20 0,5%
pComb3X - Vetor de clonagem
PCR - Reação em cadeia da polimerase
PD - Phage Display
PDB – Protein Data Bank
PEG - Polietileno glicol
Ph.D - Bibliotecas de Phage Display New England Biolabs
pIII - Proteína III do capsídio de bacteriófagos filamentosos
pIX – Proteína nove do capsídeo do fago
pVI- Proteína seis do capsídeo do fago
pVII- Proteína sete do capsídeo do fago
PVIII - Proteína VIII do capsídio de bacteriófagos filamentosos
RELIC- (Receptor Ligands Contacts), site com programas disponíveis on-line para análise de
sequências peptídicas
scFv - Fragmento variável de cadeia única
SDS - Dodecil Sulfato de Sódio
SEL- Selvagem
TBS - Trifosfato de sódio, Tampão Tris-Nacl
TBST - Trifosfato de sódio com Tween 20
TNM - Tumor Linfonodo Metástase
TRH - Terapia de Reposição Hormonal
UFC - Unidade formadora de colônia
UFU- Universidade Federal de Uberlândia
UNIPROT- (Universal Protein Resource)
VPD - Voltamogramas de pulso diferencial
X-gal - 5-Bromo-4-cloro-3indolil-α-D-galactosideo
3- HFA - Ácido 3-hidroxifenilacético
xvii
RESUMO
Até o momento, não existem biomoleculares que sejam efetivamente utilizados no
diagnóstico do câncer de mama. Uma alternativa para auxiliar a busca por marcadores
moleculares é baseada na seleção de ligantes de alta afinidade por meio de Phage Display
(PD). O principal objetivo desta tese foi o desenvolvimento de novos biomarcadores
envolvidos no câncer de mama selecionados contra uma linhagem celular tumoral altamente
agressiva e contra IgG purificada específica de tecido mamário de pacientes. Após a seleção
PD em biblioteca aleatória de peptídeos, todos os clones imunorreativos foram caracterizados
por sequenciamento, deduzidos in vitro e submetidos a análises in silico. Validações
posteriores foram conduzidas com ELISA e análise histopatológica. Apesar de terem sido
relatadas diversas variações da metodologia, a maior parte dos processos de seleção usou
ligantes obtidos depois de três ciclos de seleção. Os marcadores relatados na literatura foram
pouco explorados devido à complexidade dos processos de validação. Este trabalho
demonstrou que as seleções do primeiro e segundo ciclos são viáveis e podem ser utilizadas
para aumentar o número de potenciais marcadores a serem testados. Os resultados com
linhagem de células tumorais identificaram três potenciais marcadores no terceiro ciclo de
seleção, dos quais foi selecionado aquele com melhor relação de absorbância tumor/controle
no ELISA para síntese química. O peptídeo sintético foi associado com uma marcação menos
intensa em tumores triplo negativos (Receptor de Estrógeno, Receptor de Progesterona e
ErbB2). Outros peptídeos do segundo ciclo também demonstraram especificidade a tecidos
tumorais. Para a estratégia de mapeamento de antígenos contra IgG purificada específica de
tecido mamário, um peptídeo (F4) pode reconhecer tanto tecidos tumorais de mama quanto
IgG circulante. Ambos clone F4 e peptídeo sintético SF4 alcançaram diagnóstico de alta
acurácia, mas surpreendentemente, o clone F4 apresentou a melhor sensibilidade e
especificidade (77,8% e 85,7%, respectivamente), sugerindo que pode ser utilizado no
diagnóstico para triagem precoce de câncer de mama, anterior às análises por imagem e
patológicas. A identificação e caracterização do biomarcador putativo está em investigação
por meio de seleção combinatorial de anticorpos scFv contra o fago F4 e o peptídeo SF4, os
quais serão utilizados para captura imunológica do antígeno verdadeiro e para análise por
espectrometria de massas. Um sensor eletroquímico de baixo custo utilizando o peptídeo SF4
também foi desenvolvido.
xviii
ABSTRACT
Currently there are no biomarkers that have effectively been used in breast cancer (BC)
diagnosis, which has been accomplished mainly based on mammography and pathological
analysis of biopsy specimens. An alternative technology for the discovery of markers is
through selection of high affinity ligands by Phage Display (PD). The main objective of this
investigation was the development of new biomarkers involved in breast cancer that were
selected against a highly aggressive tumor cell lineage and against purified tissue-specific IgG
from BC patients. After PD selections of random peptide libraries, all immunoreactive ligands
were further characterized by sequencing, in vitro translated and submitted to bioinformatic
analyses. Further validations were performed by ELISA and immunohistochemistry.
Although many variations of the methodology have been reported, most of the selection
processes have used ligands obtained after three or more cycles of selection, but successful
markers have been marginally explored due to complex validation processes. We have
demonstrated that selections in the first and second cycles are feasible and can be used to
increase the number of potential markers to be tested. Furthermore, results from the tumor cell
lineage also identified three potential peptide markers in the third cycle that presented the best
relation was chosen for peptide synthesis. The synthetic peptide was associated to less intense
labeling of triple negative tumors (Estrogen Receptor, Progesterone receptor, and ErbB2).
Other peptides from the second cycle also seemed very specific to tumor tissues. For the
antigen mapping strategy against purified tissue-specific IgG from patients’ tumor biopsies,
one peptide (F4) could recognize both breast tumor tissues as well as circulating IgG from
patients. Both F4 clone and its synthetic peptide reached a very high accurate diagnosis, but
surprisingly, the selected F4 clone presented the highest sensitivity and specificity, (77.8%
and 85.7%, respectively), suggesting that it can be used as a diagnostic reagent for early BC
screening prior to imaging and pathological analyses. Identification and characterization of
the putative biomarker is under investigation through Fab combinatorial antibody selection
against both F4 clone and peptide, which will be used for immunological capture of the true
antigen and for mass spectrometry analysis. A low cost electrochemical sensor using the SF4
peptide was also developed.
xix
1
Introdução
O câncer de mama ocupa o primeiro lugar em incidência e o segundo em mortalidade
entre as mulheres no mundo e é considerado um problema de saúde pública a nível mundial.
Segundo dados do Instituto Nacional do Câncer, 15% das pacientes com câncer de mama
apresentam idade inferior a 45 anos e 60 % dos casos são diagnosticados em estádios
avançados (estádios 3 e 4) (INCA, 2009). A melhor compreensão anatomo-patológica e
molecular do câncer de mama vem permitindo observar que os diferentes subtipos desta
doença apresentam características clínicas e prognósticas diferentes, além de perfil de
resposta aos tratamentos diferenciados para cada subtipo. Na última década os esforços foram
no sentido de se buscar e caracterizar um marcador tumoral associado ao câncer, hoje as
pesquisas apontam para a busca de padrões ou perfis para o câncer. Com base na
heterogeneidade da doença, acredita-se que alterações em diversas vias de sinalização celular
sejam necessárias para que a doença ocorra.
Proteínas mamárias câncer específicas podem ser identificadas para utilização como
marcadores em diagnósticos e prognósticos (ZHONG et al., 2008). Neste sentido, esforços
têm sido empregados no sentido de se descobrir novos marcadores moleculares, contribuindo
assim na predição da evolução clínica de um número maior de pacientes, possibilitando a
detecção do câncer em estádios precoces (diagnóstico), favorecendo o monitoramento da
progressão da doença e possibilitando a detecção de metástases ocultas. Estes marcadores
moleculares podem ainda ter papel prognóstico, por meio da avaliação do risco de recorrência
e morte na ausência do tratamento. Outros benefícios da descoberta de marcadores
moleculares encontram-se na definição de terapia sistêmica adjuvante, predição de resposta ao
tratamento (Fator preditivo), estadiamento ou triagem populacional e ainda estes marcadores
podem funcionar como carreadores de drogas. Os marcadores tumorais podem ser detectados
em alvos como tumores sólidos, células tumorais, saliva, soro e plasma. A obtenção de
biomarcadores pode melhorar a qualidade de vida das mulheres portadoras desta patologia.
A literatura cita dois marcadores (antígenos) associados ao câncer de mama, o CA 15-3
e o CA 27-29. Os dois marcadores estão aumentados em 10% em pacientes com câncer de
mama em estádios precoces e em 75% em pacientes com doença avançada. Até o momento
nenhum antígeno é recomendado para a triagem ou diagnóstico em estádios iniciais do câncer
de mama (HARRIS et al., 2007).
1
Uma alternativa para auxiliar a busca de marcadores é a técnica conhecida como
phage display (PD), a qual permite selecionar ligantes de alta afinidade e seus receptores.
Estes ligantes são selecionados em vários ciclos de biopanning. Ocorre que ainda não é bem
estudada como esta recomendação de seleção de ligantes ao término do processo pode
influenciar na qualidade dos marcadores selecionados. Esta tese analisa a eficácia de duas
estratégias para aplicação da técnica phage display para obtenção de biomarcadores
associados com o câncer de mama com o objetivo de selecionar biomarcadores durante o
processo bem como para o desenho dos biomarcadores.
A presente tese poderá auxiliar na determinação de novos alvos tumorais fornecendo
subsídios para compreender as alterações proteicas causadas pelo câncer. Enfim, acredita-se
que em um futuro próximo o diagnóstico precoce do câncer e os critérios de prognóstico
sejam guiados principalmente, pelo monitoramento de marcadores tumorais. Assim
marcadores tumorais que possam ser detectados no soro do paciente pode ser um caminho
promissor na detecção precoce do câncer ou no monitoramento da doença (ZHONG et al.,
2008). Neste sentido, pelo fato de ainda não existir um método efetivo para o diagnóstico
precoce do câncer de mama uma proposta foi desenvolver um imunossensor de baixo custo
utilizando um peptídeo sintético obtido neste estudo para a detecção precoce do câncer de
mama.
Além disso, um ligante que ataca apenas o tumor pode abrir caminhos promissores para
o tratamento do câncer, podendo carrear drogas não-tóxicas que se tornam ativas quando
atingem o alvo. Esta técnica pode evitar que as células saudáveis sejam danificadas, ao usar
um ligante específico das células tumorais. Se bem-sucedida em humanos, a técnica pode
melhorar a qualidade de vida de pacientes com câncer.
2
2
Revisão da literatura
A seguir serão abordados aspectos referentes à epidemiologia e etiologia do câncer de
mama, bem como seus aspectos anátomo-patológicos, moleculares e imunológicos. Em
seguida, serão revistas referências relacionadas ao uso de bibliotecas combinatoriais no câncer
utilizando como células e autoanticorpos como alvos. Finalmente, será feita uma breve
revisão sobre sensores eletroquímicos.
2.1 Epidemiologia e etiologia do câncer de mama
O nome câncer abrange um vasto conjunto de doenças caracterizadas por apresentar um
grupo de células que cresce aparentemente sem controle algum. O câncer está entre as
primeiras causas de morte, ao lado das cardiopatias, doença do aparelho respiratório, doenças
infecciosas e parasitárias (BOYLE e LEVIN, 2008).
No Brasil, as estimativas, para o ano de 2010, válidas também para o ano de 2011,
apontam a ocorrência de 489.270 casos novos de câncer. Os tipos mais incidentes, à exceção
do câncer de pele do tipo não melanoma, serão os cânceres de próstata e de pulmão no sexo
masculino e os cânceres de mama e do colo do útero no sexo feminino, acompanhando o
mesmo perfil da magnitude observada para a América Latina (INCA, 2009). O câncer de
mama ocupa o primeiro lugar em incidência e o segundo em mortalidade entre as mulheres no
mundo e é considerada uma doença heterogênea com alterações em diversas vias de
sinalização molecular.
Os principais fatores de risco para o desenvolvimento do câncer de mama estão
relacionados a uma maior exposição do tecido mamário aos estrógenos circulantes. São
fatores de risco estabelecidos a idade, menarca precoce, menopausa tardia, nuliparidade,
primeira gestação tardia, obesidade na pós-menopausa, história familiar, hiperplasia atípica
prévia e câncer na mama contralateral (MCPHERSON et al., 2000) (PETRACCI et al., 2011).
A literatura descreve alguns fatores de risco relacionados ao estilo de vida (álcool, dieta,
obesidade e atividade física), densidade mamográfica, radiação ionizante, níveis de fator de
crescimento semelhante à insulina (IGF-1) e prolactina, agentes quimiopreventivos e fatores
genéticos (genes de alta e baixa penetrância) (DUMITRESCU e COTARLA, 2005). Apenas
aproximadamente 10% dos casos de câncer de mama são familiares decorrentes da herança de
mutações em genes de alta penetrância. Os genes supressores tumorais BRCA1 e BRCA2,
3
localizados nos braços longos dos cromossomos 17 e 13 respectivamente, são responsáveis
por parcela importante dos casos de câncer de mama hereditários (MCPHERSON et al.,
2000). Apesar de conferirem um risco adicional, mutações nos genes TP53, PTEN e CDH1
raramente são responsáveis pelo desenvolvimento do câncer de mama (CURIGLIANO et al.,
2007).
A prevenção primária dessa neoplasia ainda não é totalmente possível devido à
variação dos fatores de risco que estão envolvidas na sua etiologia. Entretanto, a detecção
precoce do câncer é fundamental para o sucesso do tratamento, pois a cada milímetro de
crescimento do tumor, há uma redução em 1% na chance de cura da doença (INCA, 2009).
Neste sentido, novas estratégias de rastreamento factíveis para países com dificuldades
orçamentárias como o Brasil têm sido estudadas e até o momento a mamografia, para
mulheres com idade entre 50 e 69 anos, é recomendada como método efetivo para detecção
precoce (INCA, 2009). Países como a Inglaterra, Alemanha, França, Itália e Estados Unidos
também recomendam a realização da mamografia a partir dos 50 anos. A Sociedade
Americana de Câncer e a Sociedade Brasileira de Mastologia recomendam a realização da
mamografia a partir dos 40 anos e países como o Japão, Coréia do Sul e Suécia seguem este
padrão de rastreamento. Ocorre que 15% dos casos de câncer de mama são detectados antes
dos 45 anos e 60% dos casos são diagnosticados em estádios muito agressivos.
O exame clínico da mama deve ser realizado em todas as mulheres que procuram o
serviço de saúde, independente da faixa etária, como parte do atendimento à saúde da mulher.
Para as mulheres de grupos populacionais considerados de risco elevado (com história
familiar de câncer de mama em parentes de primeiro grau), recomenda-se o exame clínico da
mama e a mamografia, anualmente, a partir de 35 anos (SCHOUSBOE JT et al., 2011).
Apesar de ser considerado um câncer de relativamente bom prognóstico, se
diagnosticado e tratado oportunamente, as taxas de mortalidade por câncer de mama
continuam elevadas no Brasil, muito provavelmente porque a doença ainda é diagnosticada
em estádios avançados. Na população mundial, a sobrevida média após cinco anos é de 61%,
sendo que para países desenvolvidos essa sobrevida aumenta para 73%, já nos países em
desenvolvimento fica em 57% (INCA, 2009).
2.2 Aspectos anátomo-patológicos
A mama é formada por um sistema de ductos ramificados a partir do mamilo, os quais
se estendem radialmente entre o estroma fibrogorduroso. O complexo sistema de ductos
4
ramificados pode ser dividido em dois grupos: a unidade terminal ducto-lobular (UTDL) e os
grandes ductos (Figura 1). A UTDL é considerada a unidade anátomo-funcional da mama. As
células epiteliais que compõem a glândula estão arranjadas em duas camadas: a camada
epitelial luminal e a camada mioepitelial basal (Figura 2). Toda esta estrutura encontra-se
circundada pela membrana basal (BRASILEIRO FILHO, 2006). A biologia e patologia da
mama são embasadas nas células glandulares ou luminais e nas células mioepiteliais.
Os ductos e lóbulos são revestidos por uma camada luminal de células secretoras
cuboidais. As células mioepiteliais estão em contato com a membrana basal contendo
proteínas de músculo liso (BIRNBAUM et al., 2004; MAYROSE et al., 2007). No tecido
mamário humano normal, os ductos e os lóbulos mamários estão delineados por duas camadas
celulares distintas, uma superficial, formada por células epiteliais que estão em contato direto
com a luz do ducto, denominada luminal, e outra interna que possui íntima relação com a
membrana basal à qual está justaposta, denominada basal (Figura 2) (GUSTERSON et al.,
2005). Histologicamente, a maior parte dos cânceres esporádicos da mama tem origem nas
células epiteliais luminais, sendo este fato apoiado por evidências morfológicas, bioquímicas
e moleculares (CALLAGY et al., 2003).
Os diferentes subtipos do câncer de mama apresentam características clínicas e
prognósticas distintas, além de perfil de resposta ao tratamento diferenciado para cada subtipo
de tumor. Alguns estudos apontam que a agressividade dos tumores se deve ao fato de
estarem relacionados ao receptor de estrógeno (RE) positivo ou negativo. As variações
morfológicas também estão relacionadas ao RE, como por exemplo, os carcinomas medulares
em RE-negativos e os carcinomas tubulares e lobulares em RE-positivos (INCA, 2009).
Na atual década, crescente número de evidências vem demonstrando que a expressão
gênica dos tumores de mama é diversa entre os grupos histologicamente identificáveis e,
como resultado direto desse entendimento, pode-se, por exemplo, definir o emprego de
drogas, como o trastuzumabe (PICCART-GEBHART et al., 2005) naquelas pacientes que
apresentam expressão patologicamente aumentada do human epidermal growth factor
receptor 2 (HER-2) ou dos antagonistas dos receptores de estrógeno (RE) ou de progesterona
(RP) naquelas pacientes cujos tumores expressam esses receptores hormonais (JAIYESIMI et
al., 1995). Neste cenário das terapias dirigidas contra alvos moleculares específicos, um
subgrupo específico de câncer de mama desperta especial interesse, por ainda ser órfão de
tratamento direcionado, o triplo negativo. Neste grupo de tumores, as células não apresentam
em sua superfície a expressão de receptores de estrógeno, progesterona ou HER-2. O câncer
5
de mama do subtipo luminal apresenta evolução boa, ao passo que o subtipo triplo negativo
apresenta evolução ruim, sendo considerado de pior prognóstico.
Figura 1 - Micro anatomia da mama. UTDL = unidade terminal ducto-lobular. Fonte: Brasileiro Filho, G.
Bogliolo Patologia. Sétima edição, Guanabara Koogan, 2006.
Figura 2 - A. Células epiteliais da glândula mamária. Representação do corte de um ducto mamário normal, no
qual se observam células luminais, progenitoras e mioepiteliais. A membrana basal separa as células
mioepiteliais do estroma adjacente. (Adaptada de Birnbaum, D et al. Int. J. Oncol., 25:249-58,2004.) B. Dúctulo
de glândula mamária normal. Imunohistoquímica para uma proteína basal (p63) identifica os núcleos das células
6
basais/mioepiteliais (seta). Fonte: Brasileiro Filho, G. Bogliolo Patologia. Sétima edição, Guanabara Koogan,
2006.
2.3 Aspectos moleculares
O aparecimento de um tumor está associado com a ocorrência de alterações que se
acumulam progressivamente no material genético de uma célula normal associadas com
alterações epigenéticas. Dessa forma, o câncer pode ser considerado como uma doença
genética e como uma doença genômica e a caracterização destas alterações são fundamentais
para a compreensão das bases moleculares da doença. A identificação de genes e processos
envolvidos consiste no primeiro passo para o desenvolvimento de métodos diagnósticos mais
sensíveis, terapias e medidas preventivas mais específicas e eficazes (MAIA, 2007).
O câncer é caracterizado por uma proliferação celular descontrolada que leva à
formação de um tumor e ocorre devido a danos genéticos herdados e/ou adquiridos que
alteram a expressão ou as propriedades bioquímicas de genes envolvidos na regulação do
crescimento e diferenciação celular. Anormalidades tanto nos proto-oncogenes como nos
genes supressores tumorais podem conferir a uma célula vantagens de crescimento e
desenvolvimento sobre as células normais.
A progressão do tumor está associada com a ocorrência de seis capacidades funcionais
que são úteis para a racionalização da complexidade das doenças neoplásicas. Estes marcos
incluem o aumento dos sinais de crescimento celular, redução nos sintais de anti crescimento
celular, aumento da invasão e metástase, redução do controle do programa de multiplicação
celular, aumento da angiogênese e redução da apoptose (HANAHAN et al., 2000).
Subjacente a estes marcos encontram-se duas características habilitadoras que são a
instabilidade genômica que leva a diversidade genética e a inflamação que promove múltiplas
funções relacionadas com os marcos acima citados. Dois marcos emergentes para a
progressão do câncer é a reprogramação do metabolismo energético e a evasão da resposta
imune ao tumor (HANAHAN e WEINBERG, 2011).
2.4 Aspectos imunológicos
Embora os tumores possam ter uma capacidade de obter diferentes respostas frente à
transformação celular, o sistema imune frequentemente falha em reconhecer o câncer como
uma ameaça ou se torna tolerante ao crescimento tumoral e metástases (SMYTH et al., 2001).
7
Existem evidências que muitos tipos de câncer geralmente provocam uma resposta imune e
que pacientes com câncer podem produzir autoanticorpos (SAHIN et al, 1995; CHEN et al,
1998; STOCKERT et al, 1998; BRICHORY et al, 2001, MINENKOVA, 2003). Pesquisas
têm mostrado que os autoanticorpos são uma forma de resposta imune contra o tumor para
vários antígenos tumorais próprios desenvolvidos por muitos pacientes (BRADFORD et al.,
2006).
Foi realizado um estudo em 2005, com o objetivo de identificar autoanticorpos contra
antígenos tumorais nos pacientes com câncer de próstata e os autores sugeriram que tais
autoanticorpos pudessem ter valor diagnóstico e prognóstico (XIAOJU et al., 2005). Uma
melhor compreensão do significado biológico da resposta imune, como por exemplo, a
utilização no diagnóstico ou classificação do tumor, no potencial terapêutico, no uso no
tratamento da doença, pode ser benéfica para pacientes com câncer (FORRESTER et al.,
2007). O estudo da autoimunidade associada ao tumor pode oferecer esclarecimentos não
apenas na patogênese das doenças autoimunes em geral, mas talvez até em eventos que
direcionam alguns tipos de cânceres (TAN, 2001).
A natureza dinâmica do sistema circulatório e seus constituintes refletem as condições
fisiológicas e patológicas mais diversas fazendo com que a busca de biomarcadores tumorais
no soro esteja sendo amplamente investigada (HANASH et al., 2008). Em adição, uma nova
área de pesquisa é a imunômica tumoral, ciência baseada no conceito de que os pacientes com
câncer produzem autoanticorpos contra antígenos de seus tumores. O crescimento de um
tumor no organismo pode então ser caracterizado pela presença de autoanticorpos que
precedem achados clínicos por meses ou anos. A geração de anticorpos circulantes que se
ligam à autoproteínas pode ser compreendida como uma amplificação do sistema imune de
um sinal que indica a presença do tumor (CARON et al., 2007), sugerindo que ambas as
moléculas possam apresentar valor diagnóstico e prognóstico nesta doença.
Existem muitos estudos sobre a resposta imune humoral de pacientes com diversos tipos
de cânceres, tais como, colorretal (COOMBER e WARD, 2001), de testículo e próstata
(FOSSA et al., 2004), pulmão (YAGIHASHI et al., 2005), mama (MADRID, 2005)
(CANELLE et al., 2006), carcinoma hepatocelular (COVINI et al., 1997), melanoma
(HOUGHTON et al., 2001) e cânceres ginecológicos (KORNEEVA et al, 2000).
A presença de autoanticorpos no soro de pacientes com câncer tem sido relatada em
uma infinidade de estudos tais como autoanticorpos contra P53 (CRAWFORD et al., 1982;
COOMBER e WARD, 2001), fator de crescimento de fibroblasto (ZIMERING e THAKKERVARIA, 2002), proteínas ribossomais (SCHEURLE et al., 2000), proteínas heat shock
8
(KORNEEVA et al., 2000), α-metilacetil Coa (SREEKUMAR et al., 2004), mucina (VON
MENSDORFF-POUILLY et al., 2000), proteína HER2 (DISIS et al., 1997) estas duas últimas
envolvidas na inibição da progressão tumoral.
A detecção de anticorpos presentes no soro e que estejam associados a antígenos
tumorais pode fornecer pistas para a descoberta de marcadores sorológicos para o diagnóstico
e prognóstico do câncer (HANASH, 2003). Alterações no nível da expressão gênica
(SCANLAN et al., 2001) e expressão aberrante de produtos gênicos associados ao tumor
(JÄGER et al., 2001) são fatores importantes no desenvolvimento da resposta imune humoral
em pacientes com câncer. Existem inúmeras vantagens para o uso de anticorpos como
marcadores de desenvolvimento tumoral. A primeira é que autoanticorpos circulam no sangue
muito mais precocemente do que antígenos sorológicos. Autoanticorpos associados a P53 têm
sido relatados em pacientes com estádio inicial de câncer de ovário e câncer colorretal. Em
segundo lugar, os anticorpos podem estar presentes em maior quantidade do que os antígenos
tumorais. Em contraste com a detecção de antígenos sorológicos, a detecção de anticorpos
sorológicos para antígenos tumorais podem prover marcadores sorológicos confiáveis para
prognóstico e diagnóstico do câncer (ZHONG et al., 2008).
Assim, a detecção de autoanticorpos no soro de pacientes com câncer de mama pode
fornecer uma forma menos invasiva e mais precisa de diagnóstico, além de novas abordagens
terapêuticas, como por exemplo, o uso de triagem de autoanticorpos (ZHONG et al., 2008).
Um estudo utilizando a técnica de phage display com o objetivo de identificar proteínas
associados ao câncer de mama e de avaliar a reatividade dos autoanticorpos em soro de
pacientes com câncer de mama e controles mostrou que a acurácia de diagnóstico aumentou
quando se utilizou uma combinação de marcadores (ZHONG et al., 2008).
O interesse imediato na aplicação terapêutica da imunidade do câncer concentra-se em
estimular o sistema imune contra os antígenos tumorais. Isso levou ao desenvolvimento de
inúmeros protocolos de vacinação contra o câncer. A habilidade dessas vacinas de estimular a
produção de anticorpos e de ativar os linfócitos T é observada com frequência, porém,
clinicamente ainda não se converteram em uma resposta antitumoral objetiva (DUPONT,
2002).
Além disso, esforços têm sido destinados à caracterização de marcadores que
reconheçam especificamente alvos tumorais com utilidade diagnóstica. Um exemplo bem
sucedido do aproveitamento desse conceito foi o mapeamento dos anticorpos produzidos
pelos pacientes de câncer de próstata utilizando uma biblioteca de peptídeos apresentada em
fagos e identificação de um potencial marcador de progressão tumoral, a proteína GRP78,
9
altamente expressa em metástases (KWON et al., 2003). Em um trabalho mais recente foi
demonstrado que a partir de autoanticorpos é possível selecionar biomarcadores solúveis no
soro de pacientes com câncer de próstata a partir da combinação das técnicas de phage display
e microarray. Em adição, um estudo da resposta imune humoral de pacientes com câncer de
mama em um painel de antígenos tumorais humanos identificados por phage display revela
que os anticorpos contra estes antígenos é indicativo de potencial uso como marcadores em
imunoterapia ou em diagnóstico (PAVONI et al., 2007).
2.5 Uso de bibliotecas combinatoriais no câncer
A necessidade de desenvolver ferramentas inovadoras de diagnóstico e prognóstico que
efetivamente exploram biomarcadores para os cânceres humanos tem sido considerada
(CASIANO et al., 2006). Várias tecnologias vêm sendo utilizadas na identificação e detecção
desses biomarcadores por meio de autoanticorpos como eletroforese em gel bi-dimensional
(CANELLE et al., 2006), microarrays (PATWA et al., 2009), ressonância plasmônica de
superfície –SPR- (AVRAMIS et al., 2009), SEREX (WANG et al., 2009), biossensores
(CONROY et al., 2009), e phage display (PASSARELLA et al., 2009).
Tradicionalmente, a maioria dos métodos de identificação de marcadores tumorais é
baseada em anticorpos monoclonais contra proteínas das quais se tenha alguma suspeita e,
dessa forma, buscam os mesmos marcadores para diversos tipos de câncer. A utilização de
metodologias que fazem uma varredura das células tumorais, sem conhecimento prévio das
proteínas nelas presentes, propicia a identificação de novos marcadores tumorais. A técnica de
bibliotecas apresentadas na superfície de fagos permite a utilização não apenas de um
anticorpo monoclonal, mas de uma vasta biblioteca de anticorpos ou peptídeos contra o
conjunto das proteínas do tumor. Por esta vantagem, a técnica de phage display (PD) vem
sendo empregada visando a identificação de marcadores tumorais (AUSTIN, 1989).
Esta tese é fundamentada no uso da técnica de phage display, que consiste na expressão
e seleção por afinidade de proteínas ou peptídeos expressos em fusão com proteínas virais
presentes em capsídeo de bacteriófagos. Os fagos recombinantes expressando peptídeos
randômicos podem ser selecionados por afinidade e a seguir expandidos em ciclos adicionais
de crescimento em bactérias E. coli hospedeiras apropriadas (SMITH, 1985). A técnica de PD
é baseada no uso de um fago filamentoso (M13), um bacteriófago que infecta E. coli. A
partícula de fago é formada por uma fita simples de DNA envolta por uma capa protéica
10
constituída por cinco proteínas: pIII, pVI, pVII, pVIII e pIX conforme ilustrado na Figura 3
(HOUSHMAND, 1999).
Figura 3- Fago filamentoso. A) Composição do gene III, mostrando o sítio de ligação de clonagem para
introdução do gene adicional; B) Partícula viral com as proteínas pIII, pVI, pVII, pVIII e PIX; C) Cristalografia
dos domínio D1 e D2 da proteína III (97), as alfa-hélices estão coloridas em vermelho e as fitas β em ciânico.
(HOLLIGER et al., 1999).
A técnica utiliza o princípio de que polipeptídeos podem ser expressos na superfície
desses bacteriófagos pela inserção de um segmento de DNA codificante no genoma dos
mesmos, de modo que a proteína ou o peptídeo expresso fique exposto na superfície da
partícula viral fusionado a uma proteína endógena, pIII ou pVIII (BARBAS et al., 2001),
enquanto seu material genético permanece no interior do fago (BENHAR, 2001).
O fato do fago M13 ter a capacidade de infectar E. coli, pela ligação da pIII ao pilus F
da célula bacteriana (AZZAZY e HIGHSMITH, 2002), é utilizado para recuperar os fagos
ligados ao alvo pela amplificação em E. coli (BARBAS et al., 2001). As novas partículas de
fago são montadas no espaço periplasmático da bactéria (BENHAR, 2001). O gene lacZ no
bacteriófago recombinante M13, facilita a distinção entre colônias bacterianas infectadas com
fagos que carregam sequências exógenas (colônias azuis) e colônias não infectadas por
partículas virais ou mesmo infectadas com fagos selvagens (colônias brancas) (MESSING,
1983).
Um ciclo completo de biopanning está representado na Figura 4. O esquema mostra
que bibliotecas altamente diversas podem ser apresentadas em fagos e clones com
especificidade a determinados antígenos podem ser selecionados pela ligação aos antígenos
imobilizados, seguido pela lavagem e remoção dos fagos não ligantes. Os fagos ligantes
podem ser amplificados pela infecção em bactérias e utilizados em outros ciclos de seleção
para enriquecimento dos fagos ligantes ao antígeno de interesse. O DNA de cada clone
11
selecionado pode ser sequenciado e revelar a sequência da proteína apresentada que possui
afinidade com o antígeno. Neste processo a molécula alvo é imobilizada em um suporte
Figura 4 - Ciclos de seleção de proteínas a partir de uma biblioteca de phage display. Bibliotecas de
proteínas (coloridas) são apresentadas em partículas de fagos fusionadas às proteínas de superfície (preto)
(SIDHU e KOIDE, 2007).
sólido, geralmente uma placa de microtitulação, mas também se utiliza microesferas
magnéticas, resinas, membranas ou células. Uma população de fagos em solução é incubada
com a molécula alvo. Os fagos contendo peptídeos com afinidades pelo alvo são capturados e
permanecem ligados; os fagos não ligados (não específicos) são eliminados por sucessivas
lavagens. O grupo de fagos ligados ao alvo é então eluído e amplificado (crescido em E. coli).
Os fagos resultantes deste processo são titulados e submetidos a um novo biopanning (ligação
ao alvo, eluição e amplificação) visando o enriquecimento das sequências específicas para o
alvo. Após três ou quatro repetições deste processo, clones individuais são submetidos a
ensaios imunológicos e suas sequências de DNA podem ser obtidas por sequenciamento
(BARBAS et al., 2001).
O reconhecimento e remoção das células transformadas é uma incumbência permanente
do processo de vigilância imunológica, sendo os anticorpos componentes fundamentais desta
atividade antitumoral do sistema imune (VOLLMERS e BRÄNDLEIN, 2009).
Os anticorpos ou imunoglobulinas (Ig) são glicoproteínas de massa molecular elevada,
em torno de 150 kDa, encontradas em abundância no soro de animais vertebrados. Essas
moléculas são de natureza tetramérica, compostas por duas cadeias leves e duas cadeias
pesadas, unidas por uma extensiva rede de interações não-covalentes, estabilizadas por pontes
12
dissulfeto. Tanto as cadeias leves quanto as pesadas, contêm uma série de domínios
globulares repetitivos homólogos, cada uma com cerca de 110 resíduos de aminoácidos que se
enovelam independentemente em um motivo globular classificado como Domínio Imune
(PADLAN, 1994).
Cada cadeia leve contém um domínio variável (VL) e um domínio constante (CL); as
cadeias pesadas contêm um domínio variável (VH) e três domínios constantes (CH1, CH2 e
CH3). A molécula de anticorpo pode ser subdividida em porções Fc e Fab, onde Fc é
constituída pelos domínios constantes (CH2-CH3) e Fab constituída pelos domínios VH-CH1 e
VL-CL, responsáveis pela ligação aos antígenos e, portanto, denominado sítio combinatorial
para o antígeno. Dentro de cada domínio VH e VL existem três regiões hipervariáveis, onde a
variabilidade está concentrada e loops são formados. Em uma imunoglobulina, as três regiões
hipervariáveis da cadeia leve e as três regiões hipervariáveis da cadeia pesada e ocupam
conjuntamente um espaço tridimensional para formar uma superfície de ligação para o
antígeno. Como estas sequências formam uma superfície complementar à superfície
tridimensional de um antígeno ligado, as regiões hipervariáveis são também chamadas regiões
determinantes de complementaridade (CDRs) (FERREIRA e TEIXEIRA, 2005).
Os fragmentos de anticorpos scFv (single-chain variable fragment) representam o
menor domínio funcional VH-VL de um anticorpo necessário para uma ligação de alta
afinidade a um antígeno. Os peptídeos conectores flexíveis que ligam as cadeias VH e VL são
usualmente compostos por 10 a 25 aminoácidos, sendo o decapentapeptídeo (Gly4Ser)3 o mais
comum deles (Figura 5) (WEISSER e HALL, 2009). As regiões variáveis podem ser
conectadas no sentido VH-conector-VL ou VL-conector-VH e a orientação das cadeias no scFv
pode afetar a eficiência da expressão, estabilidade e capacidade de ligação do mesmo ao
13
Figura 5 - Representação esquemática do fragmento scFv. Os domínios VH e VL presentes na molécula scFv
aparecem nas cores verdes e vermelhas, respectivamente. O polipeptídeo (peptide linker) estabilizador dos
domínios está indicado pela seta (WEISSER e HALL, 2009).
.
antígeno (DESPLANCQ et al., 1994).
Em phage display, pode ser utilizado diferentes alvos tais como proteína total, saliva,
soro, tecido e células. A linhagem celular HCC 1954 é uma linhagem agressiva, proveniente
da glândula mamária de uma paciente indiana com 61 anos de idade diagnosticada com
carcinoma ductal invasivo sem metástase nos linfonodos, estadiamento IIA, grau III.
HCC1954 é positivo para o marcador específico de célula epitelial – Epithelial Glycoprotein 2
e para citoqueratina 19 e é negativo para a expressão do receptor de estrógeno (RE) e receptor
de progesterona (RP); verifica-se também a super expressão de HER-2 (GAZDAR et al.,
1998).
A linhagem celular HCC 1954 BL é uma linhagem celular originária da mesma paciente
indiana, citada no parágrafo acima, proveniente de células B linfoblastóides derivadas do
fibroblasto de um linfócito imaturo. Portanto, nesta linhagem celular encontram-se células
mononucleares originárias do sangue periférico do mesmo paciente, não sendo células
tumorais. Estas células mononucleares são transformadas e infectadas no vírus Epstein Barr e
mantidas imortalizadas, mas que morrem após certo nível de passagens. Vale dizer que esta
linhagem celular chegou ao Brasil na passagem 15. A linhagem celular HCC 1954 e HCC
1954 BL foram recentemente sequenciadas e comparadas (GALANTE et al., 2011).
2.6 Sensores eletroquímicos
Biossensores são dispositivos analíticos que integram a especificidade de um elemento
biológico a um transdutor que converte um sinal biológico em um sinal mensurável. Os
biossensores de afinidade utilizam anticorpos ou haptenos, receptores, fragmentos de DNA ou
oligonucleotídeos como elementos de reconhecimento biológico (LUPPA et al., 2001;
GOULART et al., 2010).
O elemento de biorreconhecimento de um biossensor interage com o analito alvo,
assegurando a seletividade e especificidade do sensor (ARYA et al., 2008) sendo que a
sensibilidade é altamente influenciada pelo transdutor. O transdutor quantifica um sinal
resultante da interação do composto biológico com o analito alvo. A imobilização das
biomoléculas no eletrodo é uma das etapas mais importantes na construção de um biossensor.
A adsorção física é o método mais simples e rápido de imobilização, pois não exige qualquer
modificação química e necessita apenas de uma solução contendo a biomolécula. Baseia-se na
formação de ligações de hidrogênio, forças atrativas de Van der Waals e formação de
complexos de transição de elétrons entre a sonda e o analito e a superfície da matriz. As
14
principais vantagens da adsorção são o baixo custo e a facilidade de imobilização (SHARMA
et al., 2003; JIANG et al., 2008).
Uma alternativa para garantir a imobilização das biomoléculas sobre a superfície dos
eletrodos condutores são os filmes poliméricos eletropolimerizados (POURNARAS et al.,
2008). Os polímeros condutores são policonjugados com propriedades eletrônicas
semelhantes às dos metais que mantém as propriedades de polímeros orgânicos convencionais
e podem ser sintetizados quimicamente e eletroquimicamente (HEINZE, 1991). A
polimerização eletroquímica é mais utilizada em aplicações biológicas uma vez que o
processo é realizado à temperatura ambiente, os eletrodos apresentam uma maior área de
superfície, a espessura do filme pode ser controlada na escala de nanômetro para micrômetro
e as propriedades do mesmo podem ser moduladas pela variação de condições de
polimerização eletroquímica (PENG et al., 2009).
Alguns estudos mostraram o desenvolvimento de outros filmes poliméricos derivados
do 3-aminofenol, 4-aminofenol sobre a superfície do eletrodo de grafite utilizando as técnicas
eletroquímicas de voltametria cíclica e impedância (BRITO-MADURRO et al., 2007;
FRANCO et al., 2008). Além disso, um estudo recente apresentou o desenvolvimento de um
novo filme polimérico derivado do ácido-3-hidroxifenilacético sobre a superfície do eletrodo
de grafite por voltametria cíclica (OLIVEIRA et al., 2010).
Os imunossensores utilizam as propriedades de interação entre anticorpos e antígenos
específicos, para obter um sinal correspondente a essa interação. A construção de um
imunossensor consiste na modificação de um transdutor com um material biológico que
servirá como sonda (anticorpos ou antígenos) para detecção da reação de ligação específica da
sonda com o analito alvo (anticorpos ou antígenos). Esse processo consiste de uma
transferência de sinal, para responder às mudanças eletroquímicas do receptor causadas pela
ligação específica(RUAN et al., 2002).
Transdutores eletroquímicos são os métodos mais comuns utilizados nos biossensores.
O princípio baseia-se nas propriedades elétricas dos eletrodos que são afetados pela interação
anticorpo-antígeno. Esses transdutores podem determinar o nível do analito alvo medindo a
variação de potencial, condutância, corrente ou impedância causada pela imunorreação,
apresentando alta especificidade e baixos limites de detecção semelhante aos métodos de
imunoensaios tradicionais (JIANG et al., 2008).
A Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIE) é frequentemente utilizada para
investigar as transformações e processos químicos associados à variação da condutividade em
um circuito eletroquímico.
Essa técnica atraiu extenso interesse para o avanço da
15
quantificação da interação entre Ac e Ag (BALKENHOHL e LISDAT, 2007; JIANG et al.,
2008; RAMANAVICIUS et al., 2009), visto que detecções eletroquímicas diretas são
complicadas uma vez que dificilmente ambos compostos biológicos apresentam
eletroatividade.
O desenvolvimento de biossensores é uma alternativa para obtenção de diagnósticos
clínicos e laboratoriais realizando análises ultra-sensíveis, precisas, rápidas e em tempo real.
Além disso, esses dispositivos têm sido utilizados como ferramentas analíticas em várias
outras áreas, tais como no monitoramento ambiental, indústria de alimentos, indústria
farmacêutica e genética (SHARMA et al., 2003; NAYAK et al., 2009; THALER et al., 2009).
Desta forma, os biossensores representam uma alternativa rápida e de baixo custo para
substituir e minimizar o tempo gasto em diagnóstico e análise laboratorial, uma vez que
podem detectar uma variedade de moléculas biológicas com alta especificidade e
sensibilidade.
Frente a estes fatos, uma abordagem biotecnológica baseada em phage display, poderá
permitir a identificação de marcadores moleculares específicos para o câncer de mama,
selecionados a partir de células e imunoglobulinas G de tecido de pacientes com câncer de
mama. A seleção dos peptídeos a partir de prováveis autoanticorpos presentes nos tecidos
mamários aumenta a probabilidade de uma seleção mais específica dos antígenos tumorais. A
utilização de biossensores utilizando estes marcadores selecionados pode ser um caminho
promissor na detecção precoce do câncer de mama. Ainda, a seleção de anticorpos
monoclonais que reconheçam os peptídeos obtidos nesta tese poderão ser utilizados no
diagnóstico e tratamento do câncer de mama.
16
3 Objetivos
O principal objetivo desta tese foi selecionar e caracterizar peptídeos ligantes às células
HCC 1954 e às imunoglobulinas G provenientes de tecidos de pacientes com câncer de mama.
Um objetivo secundário foi analisar a eficácia da própria técnica phage display na
obtenção de biomarcadores associados ao câncer de mama de tal forma a aprimorar a
aplicação da mesma.
Os objetivos específicos do trabalho referentes à seleção e caracterização de peptídeos
ligantes à linhagem celular são os seguintes:
•
Seleção de peptídeos ligantes a extrato proteico total de linhagem celular HCC
1954;
•
Caracterização da reatividade dos peptídeos ligantes expressos por fagos às
células;
•
Identificação de possíveis ligantes alvos mimetizados por peptídeos selecionados
para identificar e compreender os processos aos quais os peptídeos estão
relacionados;
•
Verificar a antigenicidade do peptídeo sintético desenhado a partir de fago;
•
Avaliação dos critérios de seleção de peptídeos na técnica phage display e da
abordagem de desenho dos biomarcadores.
Os objetivos referentes à seleção e caracterização de peptídeos ligantes às
imunoglobulinas G provenientes de tecidos são os seguintes:
•
Seleção de peptídeos ligantes a IgGs provenientes de tecido;
•
Identificação de possíveis antígenos alvos mimetizados pelos peptídeos
selecionados para identificar e compreender os processos imunológicos aos quais
os peptídeos estão relacionados;
•
Verificação da possibilidade de os peptídeos miméticos ligantes de tecido serem
detectados na corrente sanguínea;
•
Validação em larga escala de peptídeos selecionados como biomarcadores para
triagem;
•
Seleção de anticorpos monoclonais scFv ligante aos peptídeos miméticos (contra
fago e peptídeo sintético) com a finalidade de caracterizar os antígenos
verdadeiros;
•
Correlação dos marcadores selecionados com os dados clínicos das pacientes.
17
4 MATERIAL E MÉTODOS
A fim de se obter biomarcadores específicos para o câncer de mama, a proposta foi
utilizar duas diferentes estratégias. Uma visão geral das estratégias pode ser encontrada na
Figura 6. Inicialmente na estratégia 1, utilizou-se como alvo células HCC 1954 e HCC 1954
BL, para se obter biomarcadores ligantes as mesmas. Na estratégia 2, utilizou-se como alvos
imunoglobulinas G provenientes de amostras de tecido de pacientes com câncer de mama,
doença benigna da mama e controles, respectivamente. Nesta estratégia buscou-se selecionar
peptídeos recombinantes miméticos de IgGs. A Figura 6 apresenta um organograma com a
descrição geral da metodologia utilizada. Nesta tese, serão analisadas questões referentes à
técnica adotada a fim de se discutir e propor alternativas para otimização do processo de
seleção dos alvos.
4.1 Estratégia 1: Obtenção de sequências ligantes em linhagem celular
HCC 1954
Nesta seção será descrita a metodologia adotada referente à estratégia 1, que consistiu
na seleção de peptídeos ligantes a linhagem celular específica de câncer de mama. Serão
descritos os protocolos e a metodologia adotada referente ao biopanning, às análises in silico,
à imunofluorescência realizada com o peptídeo sintético, à imunohistoquímica realizada com
os fagos e os ensaios imunoenzimáricos realizados com os fagos e às análises in silico.
4.1.1 Biopanning de células HCC 1954
4.1.1.1
Seleção do alvo para a realização do biopanning com células
Foi utilizado extrato proteico total de células HCC 1954 de paciente indiana com
carcinoma ductal invasivo, Grau III e células HCC 1954 BL originárias das células B de
linfócitos imaturos provenientes do sangue periférico da mesma paciente.
18
Estratég ia s para Ob ten ção de
Bio marcad ores para C M
An álise de u m Pep tíd eo
Im u n od o mi nan te
Obje tivo: Re con he cime nt o d a ma rc ação do
p ep tíde o em t ecido
Sín tese q uím ica do pe ptíd eo im u nod om ina nt e
Aná lise p or I mu no fluo re scên cia
An álise da q u alid ad e da seleção n os
Ciclo s d e Biop an n ing
Bio p an nin g
Célu las HCC 1954
O bjetivo : Ob te nçã o d e seq uên cias
lig an tes em linh age m celu la r
Obje tivo: Avalia r a q ualida de d a seleçã o nos
d if er en tes ciclos de b iopa nn in g
Scree ning E LIS A
Purificaç ão de F ag os
Aná lise p or Im u noh isto quí mica
Se leçã o d o Alvo
Aná lise in silico
Ob je tivo: Id ent if icaçã o d e poss íveis a lvo s liga nte s p ar a
ide ntifica r e co m pr een de r pr oce ssos re la cion ad os a
pe ptí de os selecio nad os
Bio pan nin g
T itula ção do s C lo ne s
Am p lifica ção do s fa gos
Ob ten ção e Se qu encia m ent o d o D NA
Se le ção de P ro teí nas Alvo com B la stP
An álise d o Alinh am en to Trid im e nsion al de P ep tíde o
Se le cion ado co nt ra Prot eín as Alvos
Pr e-screen in g
Obje tivo: Sele ção de clon es ma is re ativo s pa ra red uzir a
varia bilida de de se qu ência s
ELI SA
Aná lise E stat ística D e scrit iva
Análi se d a Im u no rr eativida de
O bjetivo : V erif icar r eco nh ecim en to d e fag os
se lecion ad os e m te cid o no soro de pa cient es, com
a ná lise de e spe cif icid ad e e se nsibilida de
E LIS A
A nálise Esta tíst ic a
Aná lise d o Pep tíde o Si ntético com
Mel ho r Im u no rr eativid ade via F ag o
O bjet ivo : V erificar r eco nh ecim en to de pe ptí deo sin te tiza do a pa rt ir d e seleçã o e m te cid o no soro de pa cien t es, com an álise de esp ecificid ade e sen sibilidad e
Bio p ann in g
Ig G d e T ecid o
Obje tivo: Obt ençã o de se quê ncia s
m im ét ica s em te cid o
e spe cífica s pa ra o C M
Se le ção de A lvo s de Te cido
Ob je tivo: Ob ten ção de a lvo s d is tinta m ent e
car a cter izad os p ara CA /D BM /C O
E LIS A
A ná lise Est atíst ica
Des envo lvi men to d e S ens or
Obje tivo: An álise d e via bilidad e de co nstruçã o d e um
im u no ssen sor pa ra d ia gn óst ico d e b aixo cu sto
De sen volvim ent o d e Sen sor E le troq uím ico
A prova ção no C EP
S eleç ão de Pa cien tes
Fo rm a ção do s Grup os
Teste s Pr elim inares
O bte nçã o de Ig G de
Te cido po r Gru po s
Obje tivo: Ve rifica r a po ssibilida de de sele ção an ticor po
m o no clona l em b ib lio te ca a ssocia da a cân cer a pa rtir
d e fag o e p ep tíd eo sint ético
Biop an ning
Seleção d e scF v Reco n hec edo r de
Fag o e Pep tíd eo S intético
Bio pan nin g
Pre- screen ing EL IS A
Tit ulaçã o d os C lon es
Am plificaçã o d os f ago s
Obte nçã o e S eq ue nciam e nto do D N A
Co nt ra pr ova do s resu ltad os obt idos de fa go s
An álise in s ilico
Ob je tivo: Id en tificaçã o d e po ssíveis a nt íge nos
m im et iza do s pa ra ide ntifica r e co m pr ee nd er pr oce sso s
im u noló gicos re la cion ad os a p ept íde os sele cio na do s.
Se leção de P ro teí na s Alvo com B la stP
An álise do Alinh am en to Trid im e nsion al d e P ep tíde o
Se lecion ad o co nt ra Prot eín as Alvos
Figura 6 - Organograma descritivo da metodologia adotada com apresentação das estratégias 1 e 2.
19
As células HCC 1954 BL foram transformadas e infectadas no vírus Epstein Barr e mantidas
imortalizadas. As linhagens celulares descritas anteriormente são linhagens diferentes, porém
originadas de um mesmo paciente, sendo a primeira proveniente de tecido tumoral e a
segunda do sangue, não sendo considerada tumoral. HCC 1954 e HCC 1954 BL são linhagens
celulares obtidas da American Type Culture Collection (ATCC) e mantidas em meio RPMI
contendo 10% de soro albumina bovina (BSA) e aminoácidos não essenciais. Estas linhagens
foram gentilmente cedidas pelo Instituto Ludwig. As células HCC 1954 foram ressuspendidas
em tampão de extração de proteínas (50mM de Tris pH 7.5, 5mM de EDTA, 10mM de
EGTA, 50mM de NaF, 20mM de β-Glicerolfosfato, 250mM de NaCl, 0.3% de NP-40 e
20mM de ortovanadato de sódio) acrescidas de 1% de mix de inibidores de protease (GE).
4.1.1.2
Seleção dos peptídeos e estratégia do biopanning
Utilizou-se uma biblioteca de peptídeos randômicos contendo 12 aminoácidos (Ph. D12 mer- New England Biolabs, Schwalbach, Alemanha) com diversidade de 2,7 x 109 clones
para a realização da seleção dos peptídeos recombinantes. Esta biblioteca possui 2,0 x 1014
clones, apresentando redundância de 105 clones. O procedimento de seleção foi realizado de
acordo com as recomendações do fabricante e com algumas adaptações a fim de se otimizar o
processo de seleção.
A seleção foi feita por meio do bioppaning, no qual foram realizadas sucessivas
incubações e lavagens até que se recuperassem os fagos selecionados ao final do processo, os
quais foram amplificados em E. coli ER2738. A seleção foi repetida por mais duas vezes
usando sempre o eluato anterior ao ciclo de seleção em questão como representante da
biblioteca de fagos. A estratégia metodológica para a realização do biopanning está descrita
na Figura 7.
Uma placa de microtitulação (NUNC maxisorp
rt
Nalgere Nunc International Co.,
Rochester, NY, USA) foi sensibilizada com 160 µL/poço com extrato proteico de células HCC
1954 BL, a 100 µg/mL, diluídas em tampão bicarbonato 0,1 M (pH 8,6) com posterior
incubação overnight a 4ºC, sob agitação lenta em câmara úmida (recipiente fechado com
papel toalha úmido). O poço seguinte foi sensibilizado com extrato proteico de células
tumorais HCC 1954.
A seguir, a placa foi seca batendo-a vigorosamente contra papel toalha autoclavado. O
bloqueio ocorreu por meio da adição de 250 µL/poço de tampão bloqueio (NaHCO3 0,1M,
pBSA 5mg/mL) mantido por 1 hora a 4 ºC sob agitação lenta. Após a incubação, o bloqueio
com o excesso de NaHCO3 foi descartado e a placa foi lavada por seis vezes com 200
20
µL/poço de TBS-T (TRIS HCL 50 mM, pH 7,5, NaCl 150mM, TWEEN 20 (TBS-T) 0,1%
por 1 minuto, sendo seca em seguida com papel toalha. A seguir, realizou-se a diluição de 10
µL da biblioteca de fagos em 100 µL de TBS-T e manteve-se no gelo até que foi adicionada
no primeiro poço contendo extrato proteico de tecido de mama normal. No poço seguinte,
foram adicionados 200 µL de TBS somente para o poço não ficar seco. Incubou-se a mistura
por 1 hora sob agitação lenta à temperatura ambiente e em seguida o sobrenadante. Os fagos
não ligantes foram recolhidos e armazenados em tubos do tipo eppendorf. Os fagos não
ligantes foram removidos por lavagem por 10 vezes com TBS-T 0,1% no primeiro ciclo de
seleção e 0,5% nos seguintes e eluídos com 50 mM de tampão glicina (pH 2,0). A seguir,
adicionou-se 15 µL de TRIS- HCl, pH 7,4, 2 M, em um tubo e recolheu-se o eluato (Peptídeos
Eluato não amplificado). Os fagos recuperados foram amplificados em E. coli ER2738. A
seleção foi repetida por mais duas vezes usando sempre o eluato anterior ao ciclo de seleção
em questão como representante da biblioteca de fagos.
Figura 7 - Delineamento experimental para a realização do biopanning com a biblioteca contendo 12
aminoácidos randômicos e utilizando-se como alvo extrato proteico de células HCC 1954 BL e HCC 1954.
4.1.1.3
Titulação dos clones obtidos nos biopannings
A titulação é um procedimento utilizado para determinar a quantidade de partículas
virais na entrada e saída durante os ciclos do biopanning.
A solução de fagos titulada foi submetida a diluições seriadas crescentes exponenciais
sob log10 em meio Luria- Bertani (LB, triptona 10g/L, extrato de levedura 5g/L, NaCl 10g/L).
Para eluatos não amplificados foram utilizadas as diluições de 10-1 até 10-4; para soluções com
fagos amplificados a faixa de diluição utilizada foi de 10-8 a 10-11. Para cada diluição
acrescentou-se 200µL da cultura de ER2738 em fase exponencial (OD600nm ~0,5) e a solução
foi agitada rapidamente e incubada por 5 minutos a temperatura ambiente. As células
21
bacterianas, agora infectadas, foram transferidas para tubos de cultura contendo 3mL de ágarTop (10g de Bacto-Triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl, 1 g de MgCl2.6
H2O/litro) a 45°C e espalhadas sobre uma placa de Petri contendo meio LB sólido, com IPTG
(0,5mM), Xgal (40 µg/mL) e tetracilina (20mg/mL). Titulou-se uma pequena quantidade da
amostra deste eluato (1µL) e o restante foi utilizado para reamplificação, realizada em 20 mL
de cultura de células E. coli ER2738 em fase exponencial precoce do seu crescimento
(OD600nm ~ 0,3) contendo tetraciclina e incubada por 4-5 horas sob forte agitação com
temperatura controlada a 37º C, antes do procedimento de precipitação dos fagos para
titulação posterior. A mistura foi agitada brevemente e incubada por 5 minutos à temperatura
ambiente. As células infectadas foram transferidas para tubos de cultura contendo 3mL de
ágar Top a 45ºC e espalhadas sobre placa de Petri contendo meio LB sólido, com IPTG, XGal e tetraciclina. Para cada diluição foi preparada uma placa.
As placas foram incubadas à 37ºC, por 12 horas, após a qual, foram contadas as
colônias azuis das placas. Multiplicou-se cada número pelo fator de diluição de cada placa
para obter o título dos fagos.
4.1.1.4
Amplificação dos fagos obtidos nos Biopannings
Após a seleção, a amplificação dos fagos foi realizada utilizando uma colônia de E. coli
da linhagem ER2738 que foi inoculada em 20mL de meio LB, e incubada sob agitação a 37ºC
por 4 horas, e 1mL desta cultura foi diluído em 120mL de meio LB (autoclavado e com
tetraciclina a 100µL/mL) distribuindo-se 1 mL em cada poço da placa Deepwell.
Usando palitos de dentes esterilizados, colônias azuis (bactérias infectadas com fagos)
foram retiradas da placa de Petri (de todos os ciclos não-amplificados) e transferidas para um
poço da placa Deepwell contendo cultura diluída. Esta foi vedada com um adesivo próprio e
incubada, por 5 horas sob forte agitação a 37ºC. Para manutenção, foram retirados 100µl de
cada poço, e transferidos para uma placa de microtitulação Corning Incorporated Costar®
3591 e adicionado 100µL de glicerol 50%. Após a incubação, a placa foi centrifugada por 20
minutos a 3700 rpm, transferindo seu sobrenadante para outra Deepwell estéril. Foi
adicionado 1/6 do volume em PEG/NaCl (20% de Polietilenoglicol 8000 e 2,5 M de NaCl –
solução estéril) e incubado por 14 horas a 4 ºC. Em seguida, a placa foi centrifugada por 1
hora a 3700 rpm e todo o sobrenadante dispensado, secando-se a placa sobre papel-toalha
(trocado várias vezes para evitar contaminação cruzada). O precipitado foi ressuspendido em
200µL de PBS 1X (Tampão Fosfato Salina).
22
Os fagos reamplificados a partir do primeiro ciclo de seleção foram utilizados em um
segundo ciclo e assim subsequentemente por um total de três ciclos, sendo que a partir do
segundo aumentou-se a estringência do tampão de lavagem de 0,1% para 0,5%, utilizando-se
então 0,5% de Tween 20 em todas as lavagens.
Para todas as titulações utilizou-se 1µL dos fagos, diluídos em 9 µL do meio de cultura
LB.
4.1.1.5
Obtenção e sequenciamento do DNA de todos os ciclos de seleção dos
Biopannings
As colônias, oriundas das placas tituladas nos 3 ciclos de seleção, foram isoladas e
transferidas para poços de placas de cultura (tipo Deepwell), contendo 1,2mL de cultura de
ER2738 em fase de crescimento exponencial (OD600nm ~ 0,3) para a extração do DNA dos
fagos. A placa foi então vedada com um adesivo perfurado e incubada a 37°C por 24 horas,
sob vigorosa agitação (250 rpm). Para isolar os fagos das bactérias, as placas foram
centrifugadas a 3700 rpm, a 20°C, durante 30 minutos. Então, 800µL do sobrenadante foram
transferidos para outra placa e incubados, por 10 minutos, com 350µL de PEG/NaCl. Após o
período de incubação, a placa foi centrifugada a 3700 rpm, a 20°C, durante 40 minutos para
precipitação dos fagos. Em seguida, o sobrenadante foi descartado e 100µL de tampão iodeto
(10mM de Tris-HCl pH 8,0, 1mM de EDTA e 4M de NaI) foram adicionados aos fagos
precipitados. As placas foram agitadas vigorosamente por 40 segundos e 250µL de etanol
absoluto foi acrescentado. Após uma incubação de 10 minutos, à temperatura ambiente, as
placas foram centrifugadas (3700 rpm, 20°C, 10 minutos) e o sobrenadante descartado. O
DNA dos fagos foi lavado com 500µL de etanol a 70% e recentrifugado nas mesmas
condições. Finalmente, o DNA precipitado remanescente foi diluído em 20µl de água Milli-Q.
A qualidade do DNA fita simples foi verificada pela corrida eletroforética em gel de agarose
0,8% corado com solução de brometo de etídeo.
Na reação de sequenciamento, foram utilizados 500ng de DNA molde, 5pmol do primer
-96 gIII (5’- OHCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG -3’ - Biolabs) e Premix (DYEnamic ET
Dye Terminator Cycle Kit. – Amersham Biosciences).
A reação de 35 ciclos foi realizada em um termociclador de placas (MasterCycler Eppendorf) nas seguintes condições: desnaturação (a 95ºC por 20 segundos), anelamento do
primer (a 58ºC por 15 segundos) e extensão (a 60ºC por um minuto). O DNA amplificado foi
precipitado com 1 µL de acetato de amônio e etanol, homogeneizando-se a placa com leves
23
batimentos. Foram acrescentados 27,5µL de etanol absoluto, em seguida, a placa foi
centrifugada por 45 minutos, a 4000rpm e o sobrenadante descartado.
Adicionou-se 150µL de etanol 70% ao DNA precipitado e centrifugou-se por 10
minutos, a 4000rpm. A solução de etanol foi descartada, a placa permaneceu invertida sobre
um papel toalha e nesta posição foi pulsada a 800rpm, durante um segundo. A placa foi
coberta por um papel alumínio durante cinco minutos para evaporar o etanol remanescente.
Os precipitados resultantes foram ressuspendidos no tampão de diluição (DYEnamic ET Dye
Terminator Cycle Kit – Amersham Biosciences).
A leitura do sequenciamento foi realizada em um sequenciador automático MegaBace
1000 (Amersham Biosciences) e as sequências de DNA foram deduzidas pelo programa
DNA2PRO12. Este programa é designado para dedução de sequências de insertos tanto de
bibliotecas da New England Biolabs (Ph. D.-12TM ou Ph. D.-C7CTM) quanto de outras
bibliotecas de interesse que contiverem as sequências iniciais e finais do vetor, no caso o
bacteriófago M13. O programa automaticamente localiza a posição do inserto, deduz o
mesmo e indica qualquer erro possível na sequência, tais como códons inesperados ou erros
na sequência próxima (http://relic.bio.anl.gov/dna2pro12. aspx). As sequências que não
puderam ser deduzidas pelo programa, foram deduzidas manualmente.
4.1.2 Análise de um peptídeo imunodominante sintetizado quimicamente
O clone relativo ao fago recombinante (mais frequente obtido no biopanning) e
encontrado no segundo e terceiro ciclo de seleção foi sintetizado, marcado com FITC e
acetilado na extremidade N terminal, com o objetivo de se estabilizar o peptídeo para
realização de Imunofluorescência.
Pacientes com diagnóstico de carcinoma ductal de mama (n=27) atendidos no Hospital
do Câncer foram submetidos ao processo cirúrgico para remoção do câncer. As amostras de
carcinoma ductal de mama e amostras de tecido periférico da mama do mesmo paciente,
representando células normais, foram microdissecadas, fixadas em paraformaldeído a 4% e
imediatamente transportadas do Hospital ao Laboratório de Histologia da Faculdade de
Medicina/UFMT para as análises histopatológicas.
Pacientes submetidos à radioterapia neoadjuvante foram excluídos deste estudo.
Dos pacientes incluídos foram obtidas informações disponíveis nos prontuários
médicos, sobre a presença de marcação de receptores de estrógeno (RE), receptores de
progesterona (RP) e HER. Os dados foram tabulados bem como as informações
histopatológicas.
24
Como controles negativos, foram utilizados pacientes com carcinoma de intestino. O
critério para avaliação da imunofluorescência foram a intensidade e a quantidade.
Os cortes de mama foram acondicionados em lâminas contendo adesivo biológico
Biobond (Brithis BioCell international, UK). A detecção do peptídeo foi realizada da seguinte
forma: inicialmente os cortes foram desparafinizados e reidratados. Em seguida, foram
submetidos a um processo de ativação antigênica pelo tratamento de citrato de sódio a 0,2 M a
100°C por 1 h. Em seguida, os cortes foram submetidos a um processo de bloqueio da
peroxidase pelo tratamento com peróxido de hidrogênio a 3% em metanol a 70% por 30 mim.
Os cortes foram permeabilizados em solução de Tween a 0,4% em PBS. Os sítios não
específicos foram bloqueados com solução de BSA a 5% em PBS. Finalmente, os cortes
foram incubados com o peptídeo, diluído em uma solução de BSA a 1% na concentração de
1:200. O controle da reação foi realizado pelo tratamento da lâminas com BSA a 1% sem o
peptídeo. Os cortes foram lavados em PBS e analisados no microscópio de fluorescência
AxioScope. A1 (Zeiss, GR) com set de filtros 09 da ZEISS (470 exitação/525 emissão).
4.1.3 Análise da qualidade da seleção – Screening ELISA
A fim de verificar a reatividade dos clones obtidos no biopanning foi realizado um prescreening para selecionar os clones mais reativos. Inicialmente foi realizada amplificação do
sobrenadante dos fagos obtidos utilizando-se o anti fago (Anti M13) seguida da revelação por
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) que será descrito com mais detalhes.
Primeiramente foi realizada a adsorção, onde duas placas foram sensibilizadas, sendo
que a metade da placa foi sensibilizada com extrato proteico de células tumorais HCC1954 e a
outra metade com extrato proteico de células normais HCC 1954 BL, da mesma maneira que
foi realizada no biopanning. O volume de extrato proteico utilizado foi equivalente a 100 µL
por poço em uma placa contendo 100 poços. A concentração inicial de extrato proteico de
células tumorais foi equivalente a 8µg/µL e a concentração final desejada é equivalente a
1µg/µL por poço. A concentração inicial de extrato proteico de células normais foi
equivalente a 11,88µg/µL e a concentração final desejada é equivalente a 1µg/µL por poço.
O ELISA foi realizado em triplicata. Foi utilizado o fago selvagem, sem o peptídeo para
controle e em três poços foi colocado apenas o anticorpo secundário para controle da reação.
Nos poços vazios foi colocado apenas NaHCO3.
A placa foi lavada duas vezes com tampão PBST 0,1%. O bloqueio foi realizado
utilizando-se 300 µL de PBS com leite desnatado 5% e a placa foi mantida por uma hora a
37°C. A seguir, a placa foi lavada 2 vezes com PBST 0,1%. Foram adicionados 100 µL de
25
sobrenadante de fago e mantido por 1 hora a 37°C. A placa foi lavada cinco vezes com PBST
0,1%. Adicionou-se o anticorpo conjugado (sintético), Anti M13 na concentração 1:5000 e
diluído em PBS com leite desnatado. A placa foi incubada a 37°C por 1 hora. A placa foi
lavada cinco vezes com PBST 0,1%. A revelação foi realizada utilizando-se OPD e a reação
foi parada utilizando-se ácido sulfúrico 4M. A reação foi monitorada no escuro por 10
minutos a temperatura ambiente e a leitura foi realizada a 492 nm.
4.1.3.1
Purificação dos fagos
Primeiramente foi realizada a purificação de 10 fagos, 3 referentes a cada ciclo de
seleção e o fago selvagem. Utilizou-se 100 mL de meio LB infectado com E. coli ER2738
(DO600nm=0,3) e adicionou-se 30 µL do sobrenadante dos fagos. Estes fagos foram mantidos
a 37ºC over night a 280 rpm. No dia seguinte, os tubos foram centrifugados a 10000 rpm por
10 minutos e o sobrenadante foi transferido para outro tubo e foi adicionado 1/6 de PEG.
Manteve-se os tubos na câmara fria durante a noite. No dia seguinte, os tubos foram
centrifugados por 15 minutos a 10000 rpm e o sobrenadante foi descartado cuidadosamente
para que o precipitado não fosse descartado. Os tubos foram centrifugados novamente. Foi
adicionado 1 mL de PBS 1x e homogeneizou-se o precipitado. O homogenato foi passado
para tubo de 2 mL e centrifugou-se novamente e o precipitado foi novamente homogeneizado
O homogenato foi transferido para novo tubo de 2 mL e adicionou-se 1/6 de PEG. Os fagos
foram incubados em gelo por 1 hora e a seguir centrifugou-se os tubos por 15 minutos a
14000 rpm e o sobrenadante foi descartado. Adicionou-se 100 µL de PBS 1x e os fagos foram
mantidos a 4ºC.
4.1.3.2
Análise histopatológica
Foram realizados ensaios imunoenzimáticos com os fagos que apresentaram maiores
valores da média da razão da absorbância (HCC 1954/HCC 1954BL) no ELISA. Vale dizer
que foram selecionados aleatoriamente clones acima do percentil 50 e que apresentaram
relação de absorbância câncer/controle acima de 1.
As análises histopatológicas foram realizadas utilizando-se 20 lâminas com tecido
mamário normal proveniente de paciente que realizou mamoplastia. Foram utilizadas 4
lâminas correspondentes a pacientes com Doença benigna da mama, sendo 2 delas de
pacientes com fibroadenoma e 2 de pacientes com papilose intraductal. Foram utilizadas 16
lâminas provenientes de pacientes com câncer de mama, sendo que 3 delas foram
correspondentes a carcinoma ductal in situ grau I, 2 delas de carcinoma ductal in situ grau II,
26
3 de carcinoma ductal in situ grau III, 2 de carcinoma invasivo grau I, 3 de carcinoma
invasivo grau II, 3 de carcinoma invasivo grau III. A fim de se verificar a marcação em outros
tecidos não mamários foram utilizadas 5 lâminas de pacientes com tecido de colon intestinal
normal e 5 lâminas provenientes de pacientes com adenocarcinoma de colon intestinal.
As biópsias foram fixadas em formaldeído 4% e tampão fosfato de sódio 0,1M (pH 7,4)
por 24 horas a 4°C. A seguir, foram fragmentados, lavados e desidratados em etanol,
incubadas em xilol e embebidas em parafina. As seções foram cortadas (3 µm de espessura),
montadas nos slides e coradas com hematoxilina e eosina para análise patológica e
identificação do tumor em microscópio Axioscope. A2 (Zeiss, GR).
A validação dos peptídeos W (Selvagem), C183, C195, C342, C197, C186, C12, C3,
C341 foi determinada por imunohistoquímica (DAMAZO et al., 2006). As lâminas foram
incubadas com citrato de sódio para a reativação antigênica, bloqueadas com 10% de soro
albumina bovina (BSA) em tampão PBS e incubadas por 12 horas a 4°C com os fagos
descritos acima (1:100 em 1% de PBS/BSA). Como controle negativo da reação utilizou-se
lâminas incubadas com soro de camundongo não imune (diluição de trabalho 1:100; SigmaAldrich, USA) ao invés dos fagos. O anticorpo anti-M13 produzido em camundongo foi
adicionado e incubado por 4 horas a temperatura ambiente. Finalmente, um anticorpo IgG de
equino anti-camundongo (específico a fragmento Fc) conjugado a 1 nM de outro coloidal
(1:50 em 1% PBSA; Invitrogen, USA) foi posteriormente adicionado. Uma solução
complementada com prata (Invitrogen, USA) foi usada para aumentar o contraste das
partículas de ouro e as lâminas foram contracoradas com hematoxilina. As análises foram
realizadas em microscópio Axioscope A2.
4.1.4 Análise in silico de peptídeo imunodominante
Os peptídeos selecionados em um biopanning correspondem a um pequeno fragmento
de uma proteína maior que tem um papel específico em um processo biológico complexo. A
simples seleção de um peptídeo marcador para o câncer de mama não fornece informação a
respeito deste processo biológico. Estratégias de bioinformática podem fornecer informações
complementares sobre possíveis proteínas relacionadas com os peptídeos selecionados. O
objetivo da análise in silico realizada neste estudo foi indicar possíveis alvos relacionados aos
peptídeos e com estes alvos compreender o processo biológico ao qual os peptídeos pudessem
estar relacionados.
A metodologia para obtenção destas informações foi baseada na seleção de proteínas
alvos usando o BlastP do NCBI, seleção dos alvos com base em uma análise qualitativa das
27
suas funcionalidades e análise qualitativa do alinhamento tridimensional do peptídeo contra os
alvos selecionados.
O peptídeo imunodominante com maior reatividade ELISA no terceiro ciclo foi
selecionado nesta análise. O BlastP foi selecionado por permitir alinhamento entre proteínas.
A base de dados selecionada foi a RefSeq, porque testes preliminares mostraram que os
resultados das outras bases ou eram muito amplos (com baixa especificidade) ou eram muito
restritivos (com baixa sensibilidade). Além disso, as sequências da base RefSeq passam por
revisões e possuem anotações referenciais de boa qualidade, o que é fundamental para o
objetivo da análise que é prover informação relevante sobre o processo biológico relacionado
ao peptídeo. O organismo alvo para a seleção de proteínas foi Homo sapiens. O aplicativo
web do BlastP automaticamente alterou alguns parâmetros, como por exemplo, ajuste
automático para pequenas sequências de entrada.
As anotações dos 35 primeiros alvos com melhor score foram analisadas e foi
verificado quais apresentaram algum tipo de relação com o câncer. Este número de alvos foi
escolhido de maneira arbitrária até que se já obtivesse informação qualitativa significativa.
Os alvos que tiveram alguma relação com o câncer foram utilizados em uma pesquisa
no Protein Data Bank – PDB para a obtenção do identificador da respectiva proteína. Não
necessariamente todos os alvos obtidos com o BlastP estarão no PDB, pois esta base de dados
somente possui proteínas com estrutura tridimensional resolvida. Em seguida, o peptídeo
selecionado foi alinhado contra a proteína obtida no PDB utilizando o programa Pepsurf
(MAYROSE et al., 2007). O algoritmo utilizado pelo Pepsurf procura alinhar o peptídeo para
identificar uma região mimética na proteína alvo. Esta etapa foi necessária para que se
pudesse verificar se o alinhamento sequencial obtido com o BlastP seria reproduzido de forma
satisfatória tridimensionalmente e em uma região exposta da proteína alvo. Os resultados dos
alinhamentos foram analisados qualitativamente para apontar a relevância da respectiva
proteína alvo na explicação do processo biológico.
4.2 Estratégia 2: Obtenção de sequências ligantes à IgG de tecidos
mamários
Nesta parte serão descritos os métodos adotados na estratégia 2, que consistiu na
obtenção de peptídios ligantes a imunoglobulinas G presentes em tecido mamário de
pacientes com CM.
28
4.2.1 Biopanning de Imunoglobulinas G provenientes de tecido mamário
Nesta seção será apresentada a metodologia referente à seleção do alvo, ao biopanning
propriamente dito, às titulações e amplificações realizadas. Será apresentado o protocolo
referente à obtenção e sequenciamento do DNA de todos os ciclos de seleção.
4.2.1.1
Triagem de pacientes e amostras biológicas
O estudo foi realizado com mulheres que recorrerem ao Hospital de Clínicas da
Universidade Federal de Uberlândia para a realização de cirurgia de mama. As pacientes
foram solicitadas a participar do estudo como voluntárias e solicitadas a assinar Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo I). Após a cirurgia e resultado histopatológico, os
tumores, tecidos e lesões encontradas foram classificados quanto ao tipo histológico,
estadiamento e status de receptores de estrogênio (RE) / progesterona (RP). O presente
projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa na Universidade Federal
de Uberlândia, Análise final número 176/08 do Comitê de Ética em Pesquisa para o protocolo
de registro no CEP/UFU: 064/08 (Anexo III).
As mulheres que tiveram diagnóstico de câncer de mama comprovado pelo exame
anatomo-patológico fizeram parte do grupo de “casos”. As mulheres que, após a cirurgia, não
apresentaram diagnóstico de câncer de mama e apresentaram fibroadenoma, hiperplasia ductal
atípica, papiloma ou outras doenças benignas da mama constituíram o grupo de doença
benigna da mama. Foram também selecionadas mulheres que recorreram ao hospital para a
realização mamoplastia e que posteriormente a realização da cirurgia tiveram resultado
histopatológico sem presença de qualquer alteração benigna ou maligna de mama.
Questionário sócio-econômico e clínico (Anexo II) foi aplicado às voluntárias. Foi
investigada a existência ou não de história de doença benigna da mama considerando a
memória / conhecimento da paciente sobre sua história clínica, assim como a história pessoal
e familiar de câncer de mama. Hábitos gerais como tabagismo, etilismo e prática de atividade
física foram questionados. Variáveis antropométricas foram questionadas, a fim de se
caracterizar o perfil das pacientes.
As neoplasias malignas da mama foram classificadas de acordo com a sexta edição do
Sistema TNM, da American Joint Comittee on Cancer (AJCC) (GREENE et al., 2002). Os
dados do tumor incluindo o tipo histológico e pesquisa imunohistoquímica de receptores de
estrógeno e progesterona foram obtidos dos laudos do exame anatomopatológico. Todos os
dados foram compilados em uma planilha, para arquivo e análise estatística.
29
As mulheres que apresentaram história individual de qualquer outro tipo de câncer em
qualquer época da vida foram excluídas do estudo. As mulheres foram consideradas para o
grupo de casos após a confirmação do diagnóstico anatomo-patológico, cujo resultado
apresentado foi positivo para malignidade e invasor. Os casos com padrão citopatológico de
malignidade suspeitos ou indeterminados foram excluídos do estudo.
Durante a cirurgia, uma amostra de tecido da mama (aproximadamente 200 mg) da
paciente foi coletada em tubos eppendorfs devidamente etiquetados. Os fragmentos foram
imersos em tampão para extração de proteínas totais (Tris-HCL 20mM pH7, 2, EDTA 10mM,
EGTA 2mM, sacarose 250mM, DTT 1mM, Benzamidina 1mM) e foram armazenados
imediatamente na geladeira por no máximo 1 hora e a seguir armazenados a -20ºC. As
amostras foram armazenados em ultra freezer a -80 ºC. As informações referentes aos
pacientes foram compiladas no programa SPSS (Software Package Statistical System) versão
18.0.
Seleção dos pacientes para a realização do biopanning com tecido
Foram selecionados 55 pacientes, sendo 25 pacientes com câncer de mama, 20 pacientes
com doença benigna da mama e 10 pacientes controles para a realização do biopanning. As
pacientes controles foram submetidas à mamoplastia redutora ou mama acessória e após o
exame histopatológico não apresentaram características benignas ou malignas na mama. As
pacientes com DBM apresentaram diagnóstico de alterações fibrocísticas, papiloma ou
fibroadenoma. As pacientes com CM apresentaram diagnóstico de câncer in situ, câncer
ductal infiltrante ou câncer ductal invasor.
Extração de proteínas totais do tecido das pacientes
Foram utilizados 50 mg de fragmentos de tecidos tumorais de 55 pacientes. Após serem
pesados, estes fragmentos foram macerados em cadinho com pestilo de porcelana em
nitrogênio líquido e em seguida foi adicionado 1mL Tampão de Extração (Tris-HCL 20mM
pH7, 2, EDTA 10mM, EGTA 2mM, sacarose 250mM, DTT 1mM, Benzamidina 1mM). O
material foi transferido para microtubo, foram adicionados 10 µL de benzamidina 100mM e 3
µL de PMSF 150mM e centrifugado por 30 min a 20.000 x g, a temperatura ambiente. Após
este procedimento, o sobrenadante foi coletado e a concentração de proteínas totais foi
quantificada.
30
Quantificação das proteínas totais extraídas do tecido por Bradford
A quantificação de proteínas foi realizada pelo método de Bradford (BRADFORD,
1976) que utiliza o corante comassie blue. Este método é normalmente o mais utilizado, pelo
fato do coomassie blue exibir o máximo de absorção com comprimento de onda de 595nm. O
corante coomassie blue (C47H48N3O7S2Na) existe sob duas formas coloridas, a vermelha, a
qual é convertida a azul, por meio da reação do corante com a proteína, produzindo um
complexo proteína-corante que possui um alto coeficiente de extinção. Este processo é muito
rápido, mantendo-se a cor estável ao longo do período.
O método é baseado na complexação do corante Coomassie Blue com a cadeia
polipeptídica. Para o preparo do reagente de Bradford, foi pesado 100 mg de coomassie blue
G-250 e dissolvido em 50 mL de etanol 95%. Foram adicionados 100 mL de ácido fosfórico
comercial concentrado (H3PO4 ~17 M) e completado com água para um volume final de 200
mL e mantido a 4º C. Foi criada uma curva de diluição da solução padrão de proteínas em um
volume final de 100 µL utilizando-se uma proteína. As amostras foram preparadas em volume
final de 100 µL para teste diluindo-as em PBS (NaCL 150 mM, NaHPO4 10 mM; pH 7,2). A
solução de Bradford foi diluída cinco vezes em água destilada. Foi misturado 900 µL de
solução de Bradford diluído em cada um dos tubos da curva-padrão e das amostras. A
coloração foi estabilizada por 5 minutos. Foi determinada a A595 para cada um dos pontos
experimentais da diluição seriada. A curva padrão foi calculada utilizando-se o software
Prism. Foi calculada a melhor reta e a concentração protéica foi obtida.
Perfil das proteínas totais extraídas utilizando Eletroforese em SDS- PAGE
A eletroforese foi realizada segundo Barbas e colaboradores (BARBAS et al., 2001) em
gel a 16% (p/v). As amostras foram diluídas em 10µL de tampão de amostra (12mL de SDS a
10%, 6 mL de Glicerol 1mL de Tris-HCl 1M pH 6,8), desnaturadas a 100ºC por dois minutos
e aplicadas em cada poço do gel. Um marcador de massa molecular (SIGMAMARKERTM,
Wide Molecular Weight Range) foi utilizado para determinar o tamanho das proteínas no gel e
foi corrido em uma canaleta adjacente para acompanhar a corrida. Foram utilizados dois
tampões de corrida: ânodo (Tris-HCl 0,2M pH 8,9) e cátodo (Glicina 0,1M; Tris 0,1M; 0,1%
de SDS). A corrente foi fixada em 120V e a corrida realizou-se por 4 horas.
Para a visualização e análise das proteínas nos géis, realizou-se a coloração com nitrato de
prata.
31
Coloração de gel com nitrato de prata
Após a corrida, o gel foi corado com prata (SAMBROOK et al., 1989). Inicialmente
incubou-se o gel durante 12 horas com solução de etanol: ácido acético glacial: água
(30:10:60) para fixar as proteínas no gel. A solução fixadora foi então descartada e o gel
incubado por 30 minutos, a temperatura ambiente, sob leve agitação com uma solução de
etanol 30%. Este passo foi repetido, a solução de etanol foi descartada e o gel incubado duas
vezes com água deionizada, durante 10 minutos, à temperatura ambiente e sob leve agitação.
A água foi removida e uma solução de AgNO3 0,1% adicionada e descartada após 30 minutos.
Após este processo os dois lados do gel foram lavados com água deionizada. Em seguida,
uma solução aquosa de carbonato de sódio 2,5% e formaldeído 0,02% foi acrescentada ao gel
e mantida a temperatura ambiente, sob suave agitação. Com o surgimento das bandas a
reação foi interrompida por ácido acético 1% e o gel foi lavado 3 vezes com água Milli-Q
Purificação das IgGs do tecido
Partículas de tamanho submicron, ou microesferas são usadas em testes como substrato
ou suporte para reações imunológicas e separação de micromoléculas e partículas
subcelulares. Microesferas são partículas de polímeros esféricos de diferentes tamanhos e
compostos por diversos materiais, dependendo da utilização, tais como polietileno, sílica e
magnéticas.
Microesferas magnéticas são utilizadas para a detecção e purificação de proteínas e
anticorpos, sendo comumente utilizadas também para purificação de ácidos nucléicos.
Partículas magnéticas têm sido amplamente utilizadas em diagnósticos e pesquisa básica para
captura de biomoléculas e células. Diversos agentes biológicos podem ser utilizados,
principalmente imunoglobulinas, proteínas A e G e estreptavidina, utilizados em
imunoprecipitações (FRESCHI e GOULART, 2007).
O processo de purificação/captura de biomoléculas via partículas magnéticas é simples,
rápido e extremamente fácil, e necessita apenas de um separador magnético que utiliza um
imã para gerar um campo magnético e capturar as microesferas ativadas. Um esquema
ilustrativo demonstrando o processo de purificação de IgG e imunoprecipitação de proteínas
com microesferas ativadas com proteína G está esquematizado na Figura 8.
32
Figura 8 - Esquema ilustrativo da utilização de microesferas ativadas com proteína G para purificação de IgG e
imunoprecipitação de proteínas específicas.
Fonte:http://www.invitrogen.com/content/sfs/manuals/100.03D04D_Dynabeads_Protein_G_(rev004).pdf.
A utilização de partículas submícron com separação magnética têm sido amplamente
aplicada para diversas finalidades, como imobilização e separação de células bacterianas para
possíveis aplicações em diagnósticos microbiológicos. Esta estratégia foi utilizada para
seleção de peptídeos contra hormônio liberador de gonadotrofina conjugado com
microesferas, neste caso o autor promoveu o biopanning com o antígeno acoplado às
microesferas (XIAOJU et al., 2005) e ainda para a captura a partir de linfomas de células B
para seleção de peptídeos com a finalidade de encontrar novos marcadores para o diagnóstico
do câncer (MCGUIREA et al., 2006).
Os anticorpos utilizados como alvos para a seleção dos peptídeos sintéticos foram
purificados com microesferas magnéticas ativadas com proteínas G. As microesferas
magnéticas ativadas com proteína G foram utilizadas para purificação de 200 µL
imunoglobulinas G do tecido dos pacientes com câncer de mama, doença benigna da mama e
controles.
Foram utilizados 100µL de micoresferas (Dynalbead Protein G) que foram lavados três
vezes com 500 µL de tampão MES (0,1M, pH5,0) para ativar a proteína G. Em seguida, foi
adicionado 300 µg de proteínas totais referentes a cada grupo de tecido procedendo-se à
incubação sob agitação por uma hora a temperatura ambiente. Em seguida as microesferas
foram lavados com tampão MES pH 6,0, 50 mM e a eluição ocorreu com a adição de 30 µL
de tampão citrato (0,1 M, pH=2,33). O sobrenadante (IgGs) foi recolhido e neutralizado com
15 µL de TRIS-HCl (1M, pH=9,0).
33
Estimou-se a quantidade de anticorpos obtida pelo método de detecção e quantificação
de proteínas descrito anteriormente (JOHNSTONE e THORPE, 1987), onde a concentração
da amostra é equivalente a Absorbância a 280 nm x Fator de diluição/ 1,36.
Dot blot para confirmação da purificação das Imunoglobulinas
Uma membrana de nitrocelulose foi sensibilizada com 2 µL de cada grupo de IgG
purificada por spot. A membrana foi incubada a temperatura ambiente, até secarem os spots,
lavada três vezes por 5 minutos cada com TBS-T. Após as lavagens, a membrana foi
bloqueada por 1 hora à temperatura ambiente com 1 mL de tampão bloqueio (TBS-T 0,1%leite em pó desnatado 5%). Após o bloqueio a membrana foi lavada mais três vezes como
anteriormente. Em seguida, foi adicionado o anticorpo secundário anti- IgG humana
conjugado com fosfatase alcalina 1:5000 (Sigma Chemical) em tampão de bloqueio e
incubação por mais 1 hora a temperatura ambiente. A reação foi revelada com o substrato
NBT/BCIP (nitroblue tetrazolium/ 5-bromo-4chloro-3-indolyl phosphate- Sigma).
4.2.1.2
Biopanning
Para a seleção dos peptídeos recombinantes (expressos na proteína III do capsídeo de
fagos filamentosos contendo 5 cópias por partícula de fago), reativos com os anticorpos
descritos anteriormente, utilizou-se uma biblioteca randômica de peptídeos com 12
aminoácidos (Ph.D-12 mer- New England Biolabs, Schwalbach, Alemanha) com
complexidade de 2,7 x 109 transformantes. O procedimento de seleção foi realizado de acordo
com as recomendações do fabricante e com algumas adaptações a fim de otimizar o processo
de seleção.
A biblioteca utilizada apresenta 2 x 1014 clones com diversidade de 2 x 109,
apresentando a redundância de 105 clones. Esta biblioteca não cobre todo o repertório
genômico e neste projeto trabalhou-se com aminoácidos randômicos, utilizando-se técnicas de
proteômica funcional. O que importa nesta biblioteca é a diversidade, independente do
número de vezes da repetição do clone. Importante mencionar que cada biopanning
apresentará clones diferentes, pois depende da exposição do peptídeo na superfície e da
maneira pela qual os clones se ligam na superfície e da capacidade de saturação das proteínas.
Neste sentido, toda a variabilidade que a biblioteca possui será perdida, pois satura-se no
primeiro momento e a placa é lavada, sendo o sobrenadante descartado, pois não ocorreu a
ligação. Não importa tanto a diversidade da biblioteca, mas sim a capacidade de saturação da
34
superfície. A realização de biopanning com nanopartículas é melhor uma vez que há um
aumento na superfície de ligação.
A seleção foi feita por meio do bioppaning, no qual foram realizadas sucessivas
incubações e lavagens até que se recuperem os fagos selecionados ao final do processo, os
quais foram amplificados em E. coli ER2738. A seleção foi repetida por mais duas vezes
usando sempre o eluato anterior ao ciclo de seleção em questão como representante da
biblioteca de fagos.
Apesar de os anticorpos serem purificados diretamente dos tecidos mamários, para que
a especificidade dos peptídeos seja assegurada foram realizadas eluições negativas durante os
ciclos do biopanning, com o intuito de “subtrair” fagos ligantes às imunoglobulinas G
produzidas em tecidos com doença benigna da mama e tecidos normais, utilizando-se
imunoglobulinas G dos mesmos.
Foram utilizado 5 grupos de pacientes com câncer de mama, 2 grupos de pacientes com
doença benigna da mama e 3 grupos controles. Cada grupo correspondia a um pool de
pacientes com diagnósticos e características clínicas que serão apresentados nos resultados.
Uma placa de microtitulação (NUNC maxisorp
rt
Nalgere Nunc International Co.,
Rochester, NY, USA) foi sensibilizada com 160 µL/poço com IgGs anteriormente purificadas,
a 100 µg/mL, diluídas em tampão bicarbonato 0,1 M (pH 8,6) com posterior incubação
overnight a 4ºC, sob agitação lenta em câmara úmida. Na placa de microtitulação, os 3
primeiros wells foram sensibilizados com 100 µg/mL de IgGs de mama normal: Grupo 1 (3
controles), Grupo 2 (3 controles) e Grupo 3 (4 controles). Os dois poços seguintes foram
sensibilizados com IgGs de pacientes com doença benigna da mama: Grupo 1 e Grupo 2 (10
pacientes cada). Os 5 poços seguintes foram sensibilizados com grupos de pacientes com
câncer de mama: Grupo 1, Grupo 2, Grupo 3, Grupo 4 e Grupo5 (para o biopanning de
tecidos foram utilizados 5 Grupos) (Figura 9).
A seguir, a placa foi seca batendo-a vigorosamente contra papel toalha autoclavado para
remover a solução residual, para a realização do bloqueio da mesma. O bloqueio ocorreu por
meio da adição de 250µl/poço de tampão bloqueio (NaHCO3 0,1M, pBSA 5mg/ml), 1 hora a
4 ºC sob agitação lenta. Após a incubação, o bloqueio com o excesso de NaHCO3 foi
descartado e a placa foi lavada por seis vezes com 200 µL/poço de TBS-T 0,1% por 1 minuto,
sendo seca em seguida com papel toalha. A seguir, realizou-se a diluição de 10µL da
biblioteca de fagos em 100 µL de TBS-T e manteve-se no gelo até que foi adicionada no
primeiro poço contendo as IgGs com o Grupo 1 de pacientes controles. Nos outros 9 poços,
foram adicionados 200 µL de TBS somente para o poço não ficar seco. Incubou-se a mistura
35
G1
G2
G3
G1
G2
G1
G2
G3
G4
G5
1º Round: 3 Controles
2 Benignos
5 Câncer de mama (pool do eluído para o 2 º Round)
2 º Round: 3 Controles
2 Benignos
5 Câncer de mama (pool do eluído para o 2 º Round)
3 º Round: 5 Câncer de mama
OBS.: Sequenciamento de todos os Rounds
Figura 9 - Estratégia experimental do biopanning realizado com Imunoglobulinas G provenientes de tecido de
pacientes com câncer de mama.
Legenda: G= grupo
anticorpo-fago por 1 hora sob agitação lenta à temperatura ambiente e em seguida o
sobrenadante contendo os fagos não ligados foi transferido para o segundo poço sensibilizado
com IgG Grupo 2 controle. Incubou-se por 1 hora a temperatura ambiente sob agitação lenta e
adicionou-se 200 µL de TBS nos outros 8 poços somente para não ficar seco. Este
procedimento foi realizado até o quinto poço que continha IgGs de pacientes com doença
benigna da mama. Posteriormente, o sobrenadante foi coletado e adicionado ao quinto poço,
contendo Grupo 1 CM contendo IgGs de pacientes com CM, sendo incubado por 1 h à
temperatura ambiente. Os fagos não ligantes foram recolhidos e armazenados em tubos do
tipo eppendorf. Os fagos ligantes foram removidos por lavagem por 10 vezes com TBS-T
0,1% no primeiro ciclo de seleção e 0,5% nos seguintes e eluidos com 50 mM de tampão
glicina (pH 2,0). A seguir, adicionou-se 15 µL de TRIS 2 M em um tubo e recolheu-se o
eluato (Peptídeos Eluato não amplificado), sendo que foram recolhidos 5 eluatos,
correspondendo aos 5 grupos de pacientes com câncer de mama que foram armazenados sob
refrigeração. Os fagos recuperados foram amplificados em E. coli ER2738. A seleção foi
repetida por mais duas vezes usando sempre o eluato anterior ao ciclo de seleção em questão
como representante da biblioteca de fagos.
36
4.2.1.3
Titulação, amplificação e sequenciamento do DNA de todos os ciclos de
seleção
Os fagos recuperados foram titulados, amplificados em E. coli ER278, o DNA foi
extraído, sequenciado e as sequências analisadas como descrito nas subseções 4.1.1.3, 4.1.1.4
e 4.1.1.5.
4.2.2 Pre-screening (ELISA) dos ciclos de seleção dos biopannings
Foi realizado pre-screening para verificar a reatividade dos clones obtidos de todos os
ciclos de seleção. Primeiramente foi realizada a adsorção de IgG, por meio da sensibilização
das placas, simulando o procedimento realizado no biopanning. Foi utilizado um volume final
de 100 µL. A placa foi mantida em câmara fria por 24 horas. O experimento foi realizado em
triplicata e foi adicionado o fago selvagem, o controle secundário e nos poços vazios foram
adicionados 100 µL de NaHCO3. No dia seguinte, a placa foi lavada 2 vezes com PBS-T
0,1%. O bloqueio foi feito com 300 µL de PBS leite desnatado 5% e mantido por 1 hora a
37°C. Em seguida foram adicionados 100 µL de sobrenadante de fago e mantido por 1 hora a
37°C. A placa foi lavada 5 vezes com PBS-T. O anticorpo conjugado (sintético) Anti M13 foi
diluído em 1:5000 em PBSM 0,05% e incubado por 1 hora a 37°C. A placa foi novamente
lavada 5 x com PBST. A revelação foi feita com OPD a 1 mg/ml e a reação foi interrompida
com 25µL de ácido sulfúrico 4M. A leitura foi realizada a 492nm.
4.2.3 Análise da imunorreatividade dos fagos recombinantes
Após a pré-seleção dos peptídeos miméticos expressos pelo bacteriófago, os clones
mais reativos foram testados com 18 soros individuais de pacientes com câncer de mama, 9
soros individuais de pacientes com doença benigna da mama, e 7 controles saudáveis. Os
Ensaios Imunoenzimáticos foram feitos em triplicata, sendo que os fagos selvagens
representantes de cada grupo, juntamente com poços sem sensibilizar com o clone alvo foram
utilizados como controle da reação.
Para isso, as placas de microtitulação foram sensibilizadas com 1010fagos/poço diluído
em tampão carbonato 100mM pH 8,6 por 16 horas a 4°C. Após a sensibilização, descartou-se
o sobrenadante, e as mesmas foram bloqueadas com PBS suplementado com 5% de BSA por
1 hora a 37°C. Em seguida, lavaram-se as placas uma vez com PBS, e em seguida incubou
com diferentes soros de câncer de mama, doença benigna da mama e controle diluído na
proporção de 1:100 em PBS-T 0,05% suplementado com 5% de BSA por 1 hora a 37°C
37
Lavou-se, novamente, cinco vezes com PBS-T 0,1% de tween, e incubou com anti-IgG
conjugado com peroxidase diluído 1:5000 em PBS-T 0,05% suplementado com 5% BSA,
durante 1 hora a 37°C. Lavou-se, novamente, cinco vezes com PBS-T 0,1% e a ligação
antígeno/anticorpo foi detectada pela adição de tampão orto-fenilenodiamina (OPD) a
1mg/mL. A reação foi interrompida pela adição de ácido sulfúrico 4N. A reatividade foi
obtida em leitor de placas (Titertek Multiskan Plus, Flow Laboratories, USA) pela leitura a
492nm. A Figura 10 descreve o procedimento aqui realizado.
Para a determinação dos parâmetros de validação diagnóstica foram calculados a
sensibilidade, a especificidade e a acurácia da reatividade dos clones em relação aos soros dos
pacientes com câncer de mama, doença benigna da mama e controle.
A sensibilidade diagnóstica corresponde à medida da capacidade do teste em detectar
todos os indivíduos com determinada doença, apresentando a porcentagem de todos os
pacientes positivos. A especificidade se refere à capacidade do teste em ser negativo quando o
indivíduo não possui a doença, podendo ser calculado como a porcentagem de resultados
negativos em pacientes sem a doença. A acurácia é a eficiência dos testes, a concordância
global dos resultados verdadeiros positivos e negativos em indivíduos com e sem a afecção.
O cálculo para sensibilidade, especificidade e acurácia é realizado pelas seguintes
fórmulas, onde as variáveis A, B, C e D são definidas na Tabela 1:
Sensibilidade = A / (A + B)
Especificidade = D / (C + D)
Acurácia = A + D / (A + B + C + D)
Tabela 1 - Variáveis para o cálculo de sensibilidade especificidade e acurácia.
Pacientes
Doentes
+
A
B
Não Doentes
C
D
Este teste foi feito para analisar a reatividade dos clones com soro de pacientes com
câncer, pacientes com doenças benignas ou pacientes controles.
A Curva ROC (Receiver Operating Characteristic) foi calculada utilizando-se o
software GraphPadPrism. Esta curva plota a sensibilidade (verdadeiros positivos) sobre o
eixo Y contra 1, a especificidade (falsos positivos) sobre o eixo X, considerando-se cada valor
observado como um possível ponto de corte. A área sob a curva (AUC ) foi calculada como
uma medida única para a eficácia de um marcador discriminativo. Quando um marcador não
tem valor discriminativo, a curva ROC se posiciona perto da diagonal e as AUC estão
38
próximas a 0,5. Quando um teste tem um forte valor discriminativo, a curva ROC irá moverse para o canto superior esquerdo, a AUC ficará próxima a 1,0.
Clones
selecionados
1010 fagos/ poço
Sensibilização
Bloqueio
Adição do anticorpo
16 h / 4 ºC
1 h / 37 ºC
primário
PBS/BSA 5%
1 h / 37 ºC
Soro 1:100
Conjugado
(Fc
IgG
específica)
peroxidase
Adição do
Interrupção da
secundário
substrato
reação pela adição
1 h / 37 ºC
enzimático OPD
de H2SO4 2 N e
+ tampão+ H2O2
leitura a 492 nm
Adição do anticorpo
15 min / Ta
1:5000
Lavagens
PBS-T
0,05%
BSA 5%
Figura 10 - Esquema representativo do ensaio imunoenzimático ELISA para avaliação da reatividade dos cinco
fagos em amostras de soro.
4.2.4 Análise do peptídeo sintético com melhor imunorreatividade via fago
O fago que apresentou a melhor curva ROC foi selecionado e realizou-se a sua síntese.
Nesta seção será apresentada a síntese do peptídeo e os ELISAs realizados para verificar a
reatividade deste peptídeo em amostras de soro. As análises estatísticas realizadas serão
apresentadas a seguir.
4.2.4.1
Síntese de peptídeo
O peptídeo (9 mg) obtido do fago F04, que apresentou o melhor comportamento no
screening realizado com amostras de soro, foi sintetizado pela GenScript em janeiro de 2011,
lot No. 112835002020911ZW, contendo 20 aminoácidos. Este peptídeo foi mantido a -20ºC.
A massa molecular do peptídeo foi equivalente a 2055,42 e a pureza do mesmo
correspondente a 88,7%. Peptídeos sintetizados quimicamente carregam grupamentos amina e
carboxilas livres e são eletricamente carregados. Com o objetivo de se remover a carga
elétrica, os peptídeos são geralmente modificados pela acetilação N-terminal e amidação Cterminal. As vantagens da acetilação N-terminal e amidação C-terminal dos peptídeos é que a
39
terminação dos peptídeos fica descarregada, comparadas com o peptídeo sintético padrão,
então eles imitam peptídeos naturais, aumentando a permeabilidade nas células. Outra
vantagem é que é reforçada a estabilidade pra digestões por aminopeptidases. Estes peptídeos
podem ser úteis para a realização de ELISAs, dentre outras aplicações. Neste sentido, foi
realizada a amidação carboxiterminal da sequência.
4.2.4.2
Testes ELISA para estudo da imunorreatividade do peptídeo sintético
Primeiramente foram realizados ensaios para otimizar a reação, utilizando-se diversas
diluições (1:25, 1:50, 1:100, 1:200) para se definir a concentração ideal do soro a ser utilizado
e foram testados diversos tipos de bloqueio. As melhores condições foram com a diluição do
soro de 1:100 e a realização dos ensaios sem bloqueio. Utilizou-se 230 amostras de soro,
sendo que destas, 60 amostras eram correspondentes a pacientes com câncer de mama, 110
correspondentes a pacientes com doença benigna da mama e 60 controles. Estas amostras
foram provenientes de pacientes que recorreram ao Hospital de Clíncias da Universidade
Federal de Uberlândia para a realização de cirurgias oncológicas ou para a realização de
mamoplastia redutora. Os ELISAs foram realizados em triplicata.
Para isso, as placas de microtitulação foram sensibilizadas com 2,5 µg do peptídeo
sintético F4 diluído em tampão carbonato 100mM pH 8,6 e incubado por 16 horas a 4°C.
Após a sensibilização, descartou-se o sobrenadante e lavou-se as placas uma vez com PBS, e
em seguida incubou com diferentes soros de câncer de mama, doença benigna da mama e
controle diluído na proporção de 1:100 em PBS-T 0,05% suplementado com 5% de BSA por
1 hora a 37°C Lavou-se, novamente, três vezes com PBS-T 0,05%, e incubou com anti-IgG
conjugado com peroxidase diluído 1:5000 em PBS-T 0,05% suplementado com 5% BSA,
durante 1 hora a 37°C. Lavou-se, novamente, três vezes com PBS-T 0,5% e a ligação
antígeno/anticorpo foi detectada pela adição de tampão orto-fenilenodiamina (OPD) a
1mg/mL. A reação foi interrompida pela adição de ácido sulfúrico 4N. A reatividade foi
obtida em leitor de placas (Titertek Multiskan Plus, Flow Laboratories, USA) pela leitura a
492nm.
Os ELISAS foram realizados em triplicata, e utilizou-se PBS como branco da reação.
Para a determinação dos parâmetros de validação diagnóstica foi calculados a sensibilidade, a
especificidade e a acurácia da reatividade dos clones em relação aos soros dos pacientes com
câncer de mama, doença benigna da mama e controle.
40
4.2.5 Desenvolvimento de sensor eletroquímico para a detecção do câncer de mama
Eletrodos de trabalho de carbono grafite foram modificados com polímero derivado do
monômero ácido 3-hidroxifenilacético (3-HFA). Os eletrodos foram polidos com suspensão
de alumina (0,3 µm), colocados sob sonicador para remoção de resíduos de alumina e secos
com nitrogênio ultra-puro. Estudos eletroquímicos de polimerização foram realizados em
potenciostato da CH Instruments modelo 420A. Espectroscopia de Impedância Eletroquímica
(EIE) foi realizada em um potenciostato da Autolab PGSTAT302N com módulo Fra2 da Eco
Chimie BV. Todas as soluções foram preparadas utilizando água deionizada obtida de um
deionizador da Gehaka com filtro de osmose reversa.
Todas as medidas foram conduzidas em uma célula eletroquímica de 03 compartimentos
contendo grafite como eletrodo de trabalho, Ag/AgCl KCl (3M) como referência e platina
como auxiliar.
A polimerização foi realizada de acordo com Oliveira et al (OLIVEIRA et al., 2010). Os
eletrodos modificados com polímero foram tratados em PBS por cronoamperometria à -0,2 V
por 120 s. Em dois eletrodos, imediatamente após esta etapa, foi imobilizado o peptídeo (1
µg, diluído em PBS). Os eletrodos modificados foram deixados em dessecador, isolados de
luz e sob vácuo por cerca de 1 hora. Após isso, os eletrodos foram lavados em PBS por cerca
de 6 segundos a 300 rpm e secos com nitrogênio. Um dos eletrodos foi colocado em contato
com o alvo complementar (IgG, 3 µg, diluído em PBS), deixado no dessecador na ausência de
luz e sob vácuo por cerca de 1 hora. O sistema foi lavado em PBS por 6 segundos a 300 rpm e
seco com nitrogênio. Os dois eletrodos foram avaliados em uma célula eletroquímica
contendo solução de ferricianeto/ferrocianeto de potássio em meio de cloreto de potássio para
medidas de Espectroscopia de Impedância Eletroquímica (EIE), faixa de frequência de 100
KHz à 10 mHz, amplitude de 10 mV, potencial aplicado de +0,24 V. Após esse experimento,
foram realizadas Voltametrias de Pulso Diferencial (DPV) dos sistemas, de -0,6 à +0,6 V, 16
mV.s-1. Um esquema representativo pode ser visto na Figura 11.
4.2.6 Seleção de anticorpos scFv expressos na superfície de fagos
A biblioteca de fragmentos de anticorpos scFv utilizada foi construída a partir de
amostras de RNA total obtidas de leucócitos (sangue periférico) de 14 pacientes com
carcinoma de próstata submetidos a prostatectomia radical. O Kit Super Script III
(InvitrogenTM) foi utilizado para a síntese do cDNA. Em seguida, as regiões variáveis das
imunoglobulinas foram amplificadas em 55 reações independentes de PCR, utilizando-se 20
41
Figura 11 - Etapas de construção do sensor para câncer de mama. Eletrodo de grafite (azul), polímero
(marrom), peptídeo (vermelho) e IgG (ciano).
primers diferentes para a síntese das cadeias pesada e leve (VH e VL, respectivamente), esta
última formada pelas cadeias kappa κ e lambda λ. Para a amplificação das sequências scFv, os
produtos de PCR das cadeias VH e VL foram reunidos em quantidades iguais para gerar um
produto final de sobreposição que foi purificado e em seguida submetido a uma reação de
restrição com a enzima de restrição Sfi I (Fermentas Life Sciences) para a clonagem. A
digestão do vetor fagomídeo pComb3X com a mesma enzima foi feita simultaneamente e a
reação de ligação foi realizada com a enzima T4 DNAgase (Promega). Ao final de todo o
processo de construção, foi obtida uma biblioteca da ordem de 4,6 x 106 sequências de
fragmentos de anticorpos scFv gentilmente cedida por Thaise Gonçalves de Araújo
(Laboratório de Nanobiotecnologia / UFU).
4.2.6.1
Biopanning
Foi realizada seleção de anticorpo monoclonal scFv que reconhecesse o fago F4 e o
peptídeo sintético F4. A seguir serão descritos os passos realizados durante o biopanning.
Preparação do fago auxiliar VCSM 13 e obtenção de placas de lise
Foram inoculados 2 mL de células XL1-Blue eletrocompetentes em 2 mL de meio SB
contendo tetraciclina 10 mg/mL, incubado a 37ºC sob agitação, até atingir OD600nm de 0,6–1,0.
Alíquotas de 50 µl de células foram distribuídas em microtubos. A cada microtubo foi
42
adicionado 1 µl de fagos auxiliares diluídos (10-6, 10-7 e 10-8), para garantir a formação de
placas de lises isoladas, e incubadas durante 15 minutos à temperatura ambiente. Os 50 µl da
cultura foram adicionados em 3 mL de meio LB top ágar liquefeito (45-50ºC) e vertido em
uma placa de petri contendo LB ágar. As placas foram incubadas a 37ºC durante a noite e, no
dia seguinte, observou-se a formação de placas de lise.
Amplificação de placas de lise
Foram inoculados 10 mL de células XL1-Blue eletrocompetentes em 10 mL de meio SB
com tetraciclina 10 mg/mL e incubado a 37ºC durante uma hora sob agitação. Uma placa de
lise foi transferida com auxílio de um palito estéril ao tubo contendo a cultura de bactérias
seguida de nova incubação a 37ºC sob agitação durante 2 horas. A cultura infectada foi
transferida para um erlenmeyer de 1 litro com 250 mL de meio SB pré-aquecido e foi
adicionada kanamicina 70 mg/mL, seguida de incubação a 37ºC sob agitação durante a noite.
No dia seguinte, a cultura foi transferida para tubos estéreis, centrifugada a 2500 x g durante
15 minutos e o sobrenadante coletado em tubos novos. O sobrenadante foi submetido à
incubação a 70ºC durante 20 minutos em banho maria seguida de nova centrifugação a 2500 x
g, durante 15 minutos. O sobrenadante foi estocado em tubos estéreis a 4ºC.
Determinação do título da preparação de fagos auxiliares
Os fagos auxiliares foram inoculados em 2 mL de meio SB contendo tetraciclina (10
mg/mL), 2 µl de células XL1-blue eletrocompetentes e incubado a 37ºC em agitação até
atingir a OD600nm de 0,6 a 1,0. Foram realizadas diluições seriadas do fago auxiliar: 1 µL em
10 µL de meio SB (10-6, 10-7 e 10-8), em seguida adicionou-se 50 µL da cultura bacteriana na
OD600nm de 0,6 a 1,0, os microtubos foram incubados a temperatura ambiente durante 15
minutos. Adicionou-se ás células infectadas 3 mL de meio LB top ágar, o mesmo foi
misturado e espalhado em placas contendo meio LB ágar. As placas foram incubadas a 37ºC
durante a noite e, no dia seguinte, as placas de lise foram contadas e o título de fagos foi
determinado em unidades formadoras de placas (ufc/mL) de fagos.
Reamplificação da biblioteca
Foram inoculados 50µL de células XL1-Blue eletrocompetentes em 50mL de meio SB
contendo tetraciclina (10 µg/mL). A cultura foi agitada a 37ºC até atingir uma OD600nm de 1,0.
À cultura foram adicionados 50 µL da biblioteca seguida da incubação a 37ºC durante 1 hora.
43
Em seguida foram adicionados carbenicilina (50 µg/mL) e glicose para uma concentração
final de 2%. Nesta etapa, é possível titular a saída dos fagos infectantes inoculando-se 1 µL e
10 µL de diluições de 10-4, 10-5, e 10-6 da cultura infectada em placas contendo LB ágar
suplementado com carbenicilina e 2% de glicose. Os 50mL de cultura infectada foram
incubados a 37ºC durante 1 hora. Após esse período foram adicionados mais 15 µL de
carbenicilina (100 µg/mL) seguida de nova incubação a 37ºC por 1 hora. A cultura foi
sedimentada por centrifugação a 3.000 x g por 10 minutos e ressuspensa em 50 mL de SB
contendo os antibióticos nas proporções anteriores. Em seguida foram adicionados 2mL do
fagos auxiliar VCSM13 e 150mL de meio SB contendo carbenilicilina (50 µg/mL) e
tetraciclina (10 µg/mL). A cultura total foi incubada a 37ºC por 2 horas com posterior adição
de 280 µL de kanamicina (50 µg/mL) e incubação nas mesmas condições durante a noite. No
dia seguinte, a cultura foi submetida à centrifugação a 3000 x g durante 15 minutos a 4°C. O
sedimento foi estocado a -20ºC para futuras preparações plasmidiais. Ao sobrenadante foram
adicionados 8g de PEG 8000 (polietilenoglicol) e 6g de cloreto de sódio e agitado a 250 rpm,
durante 10 minutos a 37°C. Em seguida, o sobrenadante foi incubado em banho de gelo
durante 30 minutos. Os fagos foram coletados por centrifugação a 10.000 x g durante 30
minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado e a garrafa mantida invertida sobre papel
toalha, por pelo menos 10 minutos. Para garantir a secagem do sedimento, as bordas da
garrafa foram enxugadas com papel toalha. O sedimento foi ressuspendido em 2 mL de
TBS/BSA 1% (p/v), a suspensão foi transferida para dois microtubos e centrifugada a 12000
rpm, durante 5 minutos, a 4°C. Em seguida, o sobrenadante, contendo as partículas virais, foi
transferido para um tubo novo e estocado a 4°C.
Acoplamento do fago em microesferas Epoxy
Coletou-se as microesferas que foram colocadas no aparato magnético para retirada do
sobrenadante, em seguida estas foram lavadas com tampão fosfato de sódio 0,1M, pH 7,4. O
sobrenadante foi retirado e acrescentou-se na proporção de 3:1 sulfato de amônio 3M e
tampão fosfato 1,2M. Os fagos foram acrescentados na concentração de 1x1012 para o fago F4
e 5x1012 para o fago selvagem e incubado por 16-24h a 37°C sob agitação. Em seguida as
microesferas foram lavadas 3 vezes com PBS e bloqueadas com PBS-BSA 5% e incubados a
37C por 1 hora. As microesferas foram lavadas 1 vez com PBS e ressuspendidas em PBS.
Seleção de anticorpos recombinantes scFv por phage display
44
Para a seleção de anticorpos scFv foram utilizados dois diferentes alvos: peptídeo
sintético F4 e o fago F4 obtidos no presente estudo. Estes marcadores foram obtidos na
seleção de peptídeos recombinantes ligantes a IgG tecidual de pacientes com carcinoma
mamário.
Foram conduzidos dois ciclos de seleção, sendo cada um deles antecedido pela
reamplificação da biblioteca de scFv em E.coli XL1-Blue eletrocompetentes com o auxílio do
fago auxiliar VCSM13, para a montagem e replicação das proteínas virais (BARBAS et
al., 2001).
Para o peptídeo sintético foi realizada a seleção em uma placa de microtitulação: dois
poços de uma placa de microtitulação (NUNC MaxiSorp®), sendo um para cada seleção,
foram previamente adsorvidos com 50µg de peptídeo sintético, diluídos em 50µl de tampão de
sensibilização (100µg/mL em 0,1 M NaHCO3, pH 8,6) e incubados por 18 horas a 4°C sob
leve agitação. Ao final da sensibilização, a placa foi bloqueada com 250µl de solução
bloqueio TBS-leite BSA 3% (p/v) por 1 hora a 37°C; e lavada seis vezes com TBS-T 0,1%
(v/v). Foram adicionados 70µL da biblioteca recém amplificada em cada poço e a placa foi
incubada por 1 hora a 37°C. Os fagos ligantes foram eluídos com solução ácida (Glicina-HCl,
pH 2,2) e posteriormente neutralizados com 2M de Tris, pH 9,1, e posteriormente transferidos
para a cultura de bactérias XL1-Blue eletrocompetentes que se encontravam na OD600 nm= 1.0
para a infecção, amplificação e titulação dos bacteriófagos.
Para o fago F4 foi realizada a seleção em mocroesferas epoxy: Utilizou-se uma alíquota
de 20 µL de microesferas contendo fagos selvagens acoplados, o sobrenadante foi coletado,
adicionou-se 50 µL da biblioteca e incubou-se por 1h a 37ºC. A seguir o sobrenadante foi
coletado e passado para o microtubo contendo 20 µL da microesfera contendo fagos F4
acoplados, incubou-se 1h a 37°C, descartou-se o sobrenadante e os fagos ligantes foram
eluídos com solução ácida (Glicina-HCl, pH 2,2) por 10 minutos e posteriormente
neutralizados com 2M de Tris, pH 9,1, e posteriormente transferidos para a cultura de
bactérias XL1-Blue eletrocompetentes que se encontravam na OD600nm= 1.0 para a infecção,
amplificação e titulação dos bacteriófagos.
Preparação de DNA plasmidial
Após o término do segundo ciclo de seleção os bacteriófagos obtidos foram submetidos
à extração do DNA plasmidial utilizando-se o QIAprep Spin Miniprep Kit. Este DNA foi
utilizado para transformar a linhagem E.coli não supressora TOP10 (Invitrogen). Após a
45
transformação os clones obtidos foram inoculados para a produção de scFv na forma solúvel
para posterior análise.
Após a eluição os fagos foram acrescidos a uma cultura de E. coli XL1 Blue na
OD600nm=1,0, incubados por 1h a 37C. Em seguida foram adicionados carbenicilina (50
µg/mL) e glicose para uma concentração final de 2% e incubou-se a cultura por 1h. A seguir 5
ml da cultura foram centrifugados a 3000 x g por 15 minutos, o sobrenadante foi descartado e
o precipitado ressuspenso em 250 µL de tampão P1, acrescentou-se 250 µL de tampão P2 e o
tubo foi invertido até que a solução ficasse azul, 350 µL de tampão N3 foram adicionados e o
tubo invertido até que a solução ficasse branca. Centrifugou-se a 13.000 rpm por 10 minutos,
o sobrenadante foi aplicado na coluna e centrifugado por 60s, para que o líquido passasse pela
membrana. A coluna foi lavada com 500 µL de tampão PB e centrifugada por 60s. O liquido
passado pela membrana foi descartado e a coluna lavada com 750 µL de tampão PE e
centrifugada por 60s. o liquido passado pela membrana foi descartado da coluna e transferido
para um novo tubo de 1,5mL, adicionou-se 50 µL de tampão EB a coluna foi deixada em
repouso por 1 minuto e centrifugada por 2 minutos. o liquido passado pela membrana
constitui o DNA plasmidial, que foi analisado em gel de agarose 0,8%.
Transformação da linhagem de E. coli não supressora Top 10 com fagomídeos
provenientes do segundo ciclo de seleção
Aliquotas de 200 µL de bactérias Top10 eletrocompetentes foram eletroporadas com 2
µL do DNA plasmidial e em seguida incubadas com 3 mL de meio SOC por 1 hora a 37ºC
sob agitação. Alíquotas de 10 e 100 µL do crescido foram plaqueados em LB Agar.
Produção de scFv na forma solúvel em placa deep well
Colônias contendo clones individuais, eluídos após o segundo ciclo de seleção foram
inoculados em 1mL de meio SB contendo 100mg/mL de carbenicilina e 2% de glicose 2M
(v/v), em placa deep well e crescidos durante a noite sob agitação a 37ºC. No dia seguinte,
50µl da cultura de cada clone foram transferidas para uma nova placa de 96 poços, estéril,
contendo 1 mL de meio SB suplementado com 100mg/mL de carbenicilina e 2% de glicose
2M (v/v) e crescida a 37ºC até atingir uma OD600nm próxima de 1. Após esse período a cultura
foi centrifugada a 3.700 rpm durante 10 minutos e o sedimento ressuspenso em 1,5mL de SB
suplementado com carbenicilina (100 µg/mL) e IPTG a 2 mM. A placa foi incubada sob
agitação a 30ºC por 18 horas seguida de centrifugação a 3.700 rpm por 20 minutos. O
46
sobrenadante de cultura foi transferido para uma nova placa e armazenado a 4°C até ser
utilizado nos ensaios ELISA.
4.2.6.2
Teste ELISA para análise da expressão heteróloga de moléculas scFv
Este ensaio foi realizado para detectar clones que secretavam scFv no sobrenadante de
cultura induzida por IPTG.
Placas de microtitulação foram sensibilizadas overnight a 4ºC com o sobrenadante da
cultura induzida em tampão carbonato. O bloqueio dos sítios inespecíficos foi realizado com
300µL de PBS BSA 3% durante 1 hora à 37ºC. Na sequência, o bloqueio foi descartado e
lavado 1 vez com PBS e foram adicionados 50 µL anticorpo anti-HA conjugado com
peroxidase na diluição de 1:1000 em PBS BSA 3% e a placa foi mantida por 1 hora e trinta
minutos a 37ºC, sob leve agitação. O anticorpo foi descartado e a placa lavada 3 vezes com
PBST. Para revelar a reação, foram utilizados 50 µL do substrato OPD (SIGMAFAST™
OPD) incubados à temperatura ambiente, ao abrigo da luz, por 30 minutos. Em seguida, a
reação foi interrompida com 30 µL de H2SO4 2N. Enfim, a leitura da reação foi realizada no
comprimento de onda 492nm, considerando-se os poços da placa que não foram
sensibilizados (brancos).
Análise dos fragmentos de anticorpos selecionados por meio de ELISA - Pre screening
O objetivo da realização deste pre screening foi selecionar os clones mais reativos
obtidos no biopanning.
Uma placa de microtitulação (Nunc Maxisorp) foi sensibilizada com o fago F4 (1010) e a
outra placa foi sensibilizada com o peptídeo sintético F4 (25µg). Após incubação durante a
noite a 4ºC a solução foi descartada. O bloqueio dos sítios inespecíficos foi realizado com
300µL de PBS BSA3% durante 1 hora à 37ºC. Na sequência, o bloqueio foi descartado e
lavado 1 vez com PBST 0,05% e foram adicionados 100 µL do sobrenadante de cultura de
indução dos Fabs. Seguiu-se incubação por 1 hora à 37ºC, sob leve agitação. Após a
incubação os sobrenadantes foram descartados e a placa lavada 3 vezes com PBST 0,05%. O
anticorpo secundário anti-HA conjugado com peroxidase foi posteriormente adicionado na
diluição de 1:1000 em PBS/BSA 3% e a placa foi mantida por 1 hora e trinta minutos a 37ºC,
sob leve agitação. O anticorpo foi descartado e a placa lavada 3 vezes com PBST. Para revelar
a reação, foi utilizado 50 µL do substrato OPD (SIGMAFAST™ OPD) incubados à
temperatura ambiente, ao abrigo da luz, por 30 minutos. Em seguida, a reação foi parada com
47
30 µL de H2SO4 2N. Enfim, a leitura da reação foi realizada no comprimento de onda 492nm,
considerando-se os poços da placa que não foram sensibilizados (brancos).
4.2.6.3
Contraprova dos resultados obtidos de fagos
A especificidade dos scFvs selecionados foi testada por ensaios de ELISA. As placas de
microtitulação (Nunc Maxisorp) foram sensibilizadas com do fago F4 (1010), fago selvagem
1010 e o peptídeo sintético a 25 µg/poço. As placas foram incubadas overnight a 4ºC. No dia
seguinte a solução foi descartada. O bloqueio dos sítios inespecíficos foi realizado com 300µL
de PBS BSA 3% durante 1 hora à 37ºC. Na sequência, o bloqueio foi descartado e lavado 3
vezes com PBS-T 0,05% e foram adicionados 100µL do sobrenadante de cultura de indução
dos scFv. Seguiu-se incubação por 1 hora, à 37ºC. Após a incubação os sobrenadantes foram
descartados e a placa lavada 3 vezes com PBS-T 0,05%. O anticorpo secundário anti-HA
conjugado com peroxidase foi posteriormente adicionado na diluição de 1:1000 em PBS BSA
3% e a placa foi mantida por 1 hora e trinta minutos a 37ºC, sob leve agitação. O anticorpo foi
descartado e a placa lavada 3 vezes com PBS-T. Para revelar a reação, utilizaram-se 50 µL do
substrato OPD (SIGMAFAST™ OPD) incubados à temperatura ambiente, ao abrigo da luz,
por 30 minutos. Em seguida, a reação foi parada com 30µL de H2SO4 2N. Enfim, a leitura da
reação foi realizada no comprimento de onda 492nm.
4.2.7 Análise in silico de peptídeo selecionado
Esta etapa tem objetivo similar à análise in silico realizada na estratégia 1. O peptídeo
que apresentou melhores resultados de especificidade e sensibilidade foi selecionado nesta
análise. O BlastP foi utilizado da mesma maneira que na estratégia 1 para a pesquisa dos
alvos.
As anotações dos 50 primeiros alvos com melhor score foram analisadas e foram
verificados quais alvos apresentaram algum tipo de relação com o câncer.
Os alvos foram analisados qualitativamente e após uma consulta ao Protein Data Bank,
foram utilizados em um alinhamento tridimensional com o peptídeo. Os resultados dos
alinhamentos tridimensionais foram analisados qualitativamente para apontar a relevância da
respectiva proteína alvo na explicação do processo biológico.
48
5
RESULTADOS
Nesta seção, serão apresentados os resultados referentes às duas estratégias realizadas
com o objetivo de se obter marcadores específicos para o câncer de mama tendo como alvo
linhagem celular HCC 1954 (estratégia 1) e imunoglobulinas G (estratégia 2) presentes no
tecido mamário.
5.1 Estratégia 1: Sequências ligantes em linhagem celular HCC 1954
A seguir serão descritos os resultados referentes ao biopanning realizado, as análises in
silico, a análise do peptídeo imunodominante sintetizado e referente à análise da qualidade da
seleção realizada.
5.1.1 Biopanning de células HCC 1954
A seleção de peptídeos ligantes ao extrato proteico de células HCC 1954 foi realizada
utilizando uma biblioteca de peptídeos expressas na superfície de fago filamentoso M13 e
foram realizados três passos de subtração utilizando células HCC-1954 BL.
As titulações realizadas foram eficientes em todos os ciclos de seleção dos peptídeos, as
colônias apresentaram coloração azulada, demonstrando a quebra do substrato X-Gal e a
expressão do gene da β-galactosidase dos fagos pelas bactérias ER-2738, como demonstrado
na Figura 12. Pelo processo do biopanning foi possível aumentar a especificidade dos
peptídeos selecionados contra o alvo, no caso, extrato proteico de células HCC 1954.
Foram utilizadas placas cujas colônias encontravam-se mais espaçadas e com isso
poderiam ser mais facilmente contadas. Após a contagem e multiplicação pelo desvio do fator
de diluição, foram obtidos títulos de entrada e saída de cada ciclo de seleção.
Os títulos de entrada e saída obtidos neste experimento são apresentados na Tabela 2,
demonstrando o enriquecimento dos clones a favor do alvo durante os ciclos de seleção. Os
títulos de entrada dos fagos no biopanning foram sempre maiores que os títulos de saída, pois
os fagos com maior afinidade a proteínas do tumor ficam ligados a elas por interação
peptídeo/proteína e o restante dos fagos com baixa ou sem afinidade foram lavados
(removidos). Nas amplificações ocorre o inverso, indicando a eficiência do processo.
49
Figura 12 - Título dos fagos. As colônias azuis representam a infecção das bactérias E.coli (ER2738) com os
fagos M13 carregando o gene da β-galactosidase. A, B, C e D representam titulações de 10-1 até 10-4.
Tabela 2 - Seleção dos fagos com peptídeos ligantes ao extrato proteico de células HCC 1954. Título obtido
(pfu) no processo de seleção.
Número de partículas de fagos
extrato proteico de células
Ciclos de Seleção
Entrada
Saída
Primeiro/ 0,01% tween
4 x 1010
1,0 x 103
Segundo/ 0,05% tween
4 x 1010
1,2 x 103
10
Terceiro/ 0,05% tween
4 x 10
1,0 x 104
O DNA extraído dos fagos foi selecionado randomicamente e foi submetido à
eletroforese em gel de agarose 0,8%, para verificar sua qualidade e estimar sua quantidade,
comparando a intensidade das bandas das amostras com a intensidade da banda do DNA
padrão, o qual continha uma massa de 400ng. As quantidades estimadas dos DNAs extraídos
foram próximas da quantidade do DNA padrão (Figura 13).
M
1
2
3
4
5
6
Figura 13 - Gel de agarose 0,8% corado com brometo de etídeo, contendo: M: DNA de fago M13 padrão
contendo 400ng de DNA (Pharmacia). 1-6: Amostras do DNA de fago M13 selecionados randomicamente
no biopanning.
50
Confirmada a qualidade do DNA, foram isolados 300 clones para sequenciamento.
Foram obtidas 271 sequências válidas, das quais 159 foram distintas. Os cromatogramas
gerados pelo sequenciador foram analisados pelo programa Phred basecalling para análise da
qualidade. O percentual de validade no sequenciamento de 90% está dentro da normalidade.
Este fato é esperado, uma vez que pode haver diferença na quantidade de DNA, pois o
sequenciamento ocorre em larga escala e isso dificulta a correta amplificação da fita de DNA.
Ainda pode haver erro nas sequências repassadas para o programa que processa a dedução das
mesmas.
As 159 sequências distintas foram codificadas com a inicial C de “Células” para melhor
compreensão dos resultados.
Foram obtidas 93 sequências válidas no primeiro ciclo de seleção, sendo 85 distintas.
Foram obtidas 92 sequências válidas no segundo ciclo de seleção, sendo 72 distintas. Foram
obtidas 86 sequências válidas no terceiro ciclo de seleção, sendo 3 distintas.
O peptídeo com a Seq. ID NoC195 esteve presente 6 vezes no segundo ciclo de seleção
e 84 vezes no terceiro ciclo de seleção, sendo esta sequência a mais frequente em toda a
seleção e a única que apareceu em 2 ciclos diferentes.
A Tabela 3 apresenta as sequências de cada clone obtidas no terceiro ciclo e a respectiva
frequência desses clones.
Tabela 3 - Frequência de cada clone obtido no terceiro ciclo de seleção.
Peptídeo
Frequência total
Seq. ID No C341
1/86
Seq. ID No C195
84/86
Seq. ID No C342
1/86
5.1.2 Análise do peptídeo imunodominante SC195
Foi realizada a síntese química do peptídeo Seq. ID No C195 pela GenScript e este foi
marcado com FITC e acetilado na extremidade N terminal, para estabilizar o peptídeo. Este
peptídeo sintético continha 13 aminoácidos, foi codificado com a inicial S de sintético e
denominado, SC195. Foram obtidos 9 mg de peptídeo com 85% de grau de pureza.
As análises demonstram que houve uma marcação fraca e difusa no citoplasma de
pacientes controles (Figura 14-A). As análises demonstram intensa marcação no carcinoma
ductal de mama, principalmente em pacientes com fenótipo subtipo luminal (RE+ ou RP+ e
HER2-), sendo que as células estavam marcadas principalmente na membrana celular
(Figuras 14-B, 14-C). Pacientes triplo negativo (RE-, RP- e HER-) tiveram uma marcação
51
mais fraca para o peptídeo (Figura 14-D). As amostras de carcinoma de intestino, não
apresentaram marcações para o peptídeo (Figura 14-E) (Figura F) Controle negativo da
reação.
Os resultados quantitativos da Imunofluorescência realizada com o peptídeo sintético
(SC195) são apresentados na Tabela 4. As intensidades de marcação na Imunofluorescência
foram codificadas em 0, 1, 2 e 3. A ausência de marcação foi codificada em 0, a marcação
mais fraca foi codificada em 1 e assim sucessivamente. A Tabela 5 apresenta a análise
estatística com teste exato de Fischer realizada considerando os receptores de estrógeno,
progesterona, o grau do carcinoma e o perfil do paciente com os respectivos valores de p. Não
houve diferença estatisticamente significativa quando se avaliou a graduação do câncer, por
outro lado houve diferença estatisticamente significativa quando se avaliou os receptores de
estrógeno (p=0,0012) e progesterona (p=0,0012). Ao avaliar o perfil dos pacientes
considerando os subtipos luminal e triplo negativos, foi encontrada diferença estatisticamente
significativa (p=0,0032), e observou-se que houve uma menor marcação nas pacientes TPN
em relação as pacientes do subtipo luminal.
52
Figura 14 - Imunofluorescência para o peptídeo SC195 indicando marcação positiva em células de
adenocarcinoma ductal de mama. (A) Pacientes controles apresentam marcação fraca e difusa do peptídeo nas
células ductais apresentando marcação difusa no citoplasma. Detalhe evidenciando células epiteliais. (B, C e D)
Paciente com adenocarcinoma ductal, respectivamente, invasivo grau 3 (RE++, RP++, HER-), “in situ” grau 2
(RE++, RP++, HER-) e invasivo grau 1 (RE-, RP-, HER-) apresentam positividade para o peptídeo. (E)
Adenocarcinoma de intestino apresenta ausência para imunomarcação com o peptídeo. (F) Controle negativo da
reação indicando ausência de fluorescência pela supressão do peptídeo. Barra = 10 µm.
53
Tabela 4 - Relação das amostras analisadas na Imunofluorescência, com o diagnóstico histopatológico e com a
intensidade de marcação em relação ao Recepetor de Estrógeno (RE), Receptor de Progesterona (RP) e HER.
N° da
paciente
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
33
33
34
35
36
37
38
39
Tipo de tumor
Carcinoma ductal invasivo G1
Carcinoma ductal invasivo G2
Carcinoma ductal invasivo G1
Carcinoma ductal invasivo G1
Carcinoma in situ G1
Carcinoma ductal invasivo G2
Carcinoma ductal invasivo G1
Carcinoma ductal invasivo G1
Carcinoma ductal in situ G2
Carcinoma ductal invasivo G1
Carcinoma ductal invasivo G1
Carcinoma ductal invasivo G1 e alteração
fibrocística difusa
Carcinoma ductal in situ G2 e G3
Carcinoma ductal invasivo G1
Carcinoma ductal invasivo G2
Carcinoma ductal invasivo G1
Carcinoma ductal invasivo G2
Carcinoma ductal invasivo G2
Carcinoma ductal invasivo G1
Hiperplasia ductal com atipia, carcinoma
ductal invasivo G1 e carcinoma in situ G1
Carcinoma ductal invasivo G2
Carcinoma ductal invasivo G3
Carcinoma ductal invasivo G2
Carcinoma ductal invasivo G2
Carcinoma ductal invasivo G3
Carcinoma ductal in situ G3
Carcinoma ductal invasivo G1 e G2
Adenocarcinoma de Intestino
Adenocarcinoma de Intestino
Ducto mamário normal
Ducto mamário normal
Ducto mamário normal
Ducto mamário normal
Ducto mamário normal
Ducto mamário normal
Ducto mamário normal
Ducto mamário normal
Ducto mamário normal
Ducto mamário normal
RE
RP
HER
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
Intensidade de
Fluorescência
+++
+
+++
+++
+
+++
+
+
+++
+++
+++
+
+
+
+
-
+
+
-
-
+++
+++
+
+
+
+
+
-
-
+
-
-
++
+
+
+
++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
54
Tabela 5 - Avaliação da Intensidade de Fluorescência (IF) categorizada em 0, 1-2 e 3 considerando os
Receptores de Estrógeno (RE), receptores de progesterona (RP), classificação de Scarff-Bloom-Richardson
SBR) e o perfil (luminal ou triplo negativo TPN) utilizando-se o Teste Exato de Fischer.
Variáveis
IF int 0
IF int 1-2
IF int 3
P
3 (100%)
15 (100%)
9 (100%)
RE
0,0012
Positivo
0 (0%)
3 (20%)
8 (88,8%)
Negativo
3 (100%)
12 (80%)
1 (11,2%)
RP
0,0012
Positivo
0 (0%)
3 (20%)
8 (88,8%)
Negativo
3 (100%)
12 (80%)
1 (11,2%)
SBR
0,6084
Grau 1
1 (33,3%)
6 (40%)
6 (66,6%)
Grau 2
1 (33,3%)
7 (46,6%)
2 (22,2%)
Grau 3
1 (33,3%)
2 (13,4%)
1 (11,2%)
Perfil
0,0032
Luminal
0 (0%)
4 (26,6%)
8 (88,8%)
TPN
3 (100%)
11 (73,4%)
1 (11,2%)
5.1.3 Seleção nos ciclos de biopanning
As sequências peptídicas obtidas no biopanning foram analisadas por ELISA para
avaliar a reatividade dos peptídeos obtidos em todos os ciclos de seleção.
A seguir são apresentados três gráficos (Figuras 15, 16 e 17) com os valores da média
da razão da absorbância (HCC 1954/HCC1954BL) referentes aos três ciclos de seleção,
respectivamente. São apresentados os maiores valores da média da razão da absorbância dos
Razão da absorbância dos
clones
clones.
14
12
10
8
6
4
2
0
41 59 57 21 66 49 51 39 48 52 47 56 55 40 84 50 54 31 19 34 30 82 15 53 87 80 42 22 33 2
ID das sequências
Figura 15 - Valores médios da razão da absorbância (HCC1954/HCC1954BL) dos trinta primeiros clones mais
reativos obtidos no primeiro ciclo de seleção referente aos dois sequenciamentos realizados.
55
200
195
199
183
197
242
230
234
249
186
222
201
194
256
210
251
244
233
239
206
214
245
257
255
253
259
236
254
208
258
ID das sequências
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Razaõ da absorbância dos clones
Razão da absorbância dos
Clones
Figura 16 - Valores médios da razão da absorbância (HCC1954/HCC1954BL) dos trinta primeiros clones mais
reativos obtidos no segundo ciclo de seleção referente aos dois sequenciamentos realizados.
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
195
342
341
S
ID das Sequências
Figura 17 - Valores médios da razão da absorbância (HCC1954/HCC1954BL) dos três clones obtidos no terceiro
ciclo de seleção referente aos dois sequenciamentos realizados.
Foi verificado que os peptídeos obtidos no primeiro e segundo ciclo de seleção
apresentaram valores significativos de absorbância. De acordo com os resultados do ELISA,
puderam ser observados valores de absorbância elevados já no primeiro ciclo de seleção,
podendo ser verificada a presença de um peptídeo com valor de absorbância equivalente a
1,148. Sugere-se que a perda da variabilidade em algumas situações não é eficaz.
Pode-se observar que houve variabilidade de reatividade nos diferentes lotes de
sequenciamento. Pode ser observado que nos ciclos houve um aumento da imunodominância,
mas perdeu-se a variabilidade e a reatividade. No primeiro ciclo de seleção, 97% dos clones
foram imunorreativos (relação de absorbância HCC1954 / HCC1954BL maior que 1), no
segundo ciclo 88% foram imunorreativos e no terceiro ciclo 100% dos clones foram
imunorreativos. Observou-se uma clara redução da variabilidade e um aumento da
imunodominância no terceiro ciclo onde apenas 3 clones foram sequenciados. Observa-se que
a variabilidade é perdida com o aumento da imunodominância.
56
No primeiro ciclo observou-se que o clone mais reativo teve uma relação de
absorbância igual a 12,22. No segundo ciclo observou-se que o clone mais reativo teve uma
razão de absorbância igual a 18,9.
No segundo ciclo de seleção, manteve-se a variabilidade e observou-se um aumento da
reatividade. Neste sentido, os clones obtidos no primeiro e segundo ciclo de seleção foram
mais reativos e apresentaram melhores resultados no ELISA. Pressupõe-se que a técnica seja
mais efetiva quando se realiza ciclos de seleção no intuito de serem encontrados clones
imunodominantes, porém a cada realização de um ciclo verifica-se a perda de variabilidade
dos clones. Neste sentido, a fim de se resgatar a variabilidade e a existência de clones mais
reativos, uma proposta é voltar no primeiro e no segundo ciclo de seleção para se resgatar
clones mais imunoreativos.
O clone C195 obteve uma menor razão de reatividade (3,25) em relação aos clones mais
reativos no primeiro ciclo (12,22) e no segundo ciclo (18,9). Isto pode ser um indicativo de
que clones com maior reatividade no ELISA nos primeiros e segundos ciclos de seleção
poderiam ser melhores que os imunodominantes do terceiro ciclo de seleção. A razão da
absorbância média é muito menor no terceiro ciclo. A absorbância mínima para controle
(célula BL) é a metade no primeiro e segundo ciclo (0,014) contra o terceiro ciclo (0.027). A
absorbância máxima para o câncer (HCC 1954) é maior nos primeiros e segundo ciclos (+1.15) contra (0.85) no terceiro ciclo. Neste sentido, a justificativa para este fato é que há
maior variabilidade nos primeiros ciclos.
A Tabela 6 apresenta os valores das médias e desvios padrões da absorbância dos clones
e da razão da absorbância dos clones selecionados nos três ciclos de seleção.
Tabela 6 - Valores médios com os respectivos desvios padrões da absorbância dos clones presentes nos três
ciclos de seleção.
Primeiro ciclo de
Segundo ciclo de
Terceiro ciclo de
seleção
seleção
seleção
Média absorbância HCC 1954
0,25
0,29
0,39
Desvio padrão
HCC 1954
0,24
0,26
0,40
Mín- Max
HCC 1954
0,018-1,148
0,04-1,16
0,06-0,85
Média absorbância HCC 1954 BL
0,086
0,115
0,23
Desvio padrão
HCC 1954 BL
0,106
0,135
0,30
Mín- Max
HCC 1954 BL
0,014 - 0,585
0,014 – 0,892
0,027 – 0,58
Média da razão da absorbância
3,85
3,12
2,37
HCC 1954/ HCC 1954 BL
Desvio padrão HCC 1954/HCC 1954 BL
2,46
2,74
0,90
Mín- Max HCC 1954/ HCC 1954 BL
0,48 – 12,22
0,74 – 18,9
1,45 – 3,25
% dos clones com razão da reatividade
97%
89%
100%
maior que 1,0
57
A absorbância mínima para controle (célula BL) é a metade nos primeiros e segundos
ciclos (0,014) contra a absorbância no terceiro ciclo (0,027).
A absorbância máxima em relação às células HCC 1954 (Câncer) é maior nos primeiros
e segundos ciclos (+-1,15) contra (0,85) no terceiro ciclo.
Sugere-se que a causa destes achados é a maior variabilidade dos primeiros ciclos e os
clones obtidos nestes ciclos poderiam ser melhores que os imunodominantes.
Imunohistoquímica com fagos dos três ciclos de biopanning
As sequências Seq. ID CNo 3, e Seq. ID CNo 12 (Primeiro Ciclo de seleção), Seq. ID
CNo 186, Seq. ID CNo 183 e Seq. ID CNo 197 (Segundo Ciclo de seleção) e Seq. ID CNo 341,
Seq. ID CNo 195 e Seq. ID CNo 342 (Terceiro Ciclo de seleção) foram selecionadas para
realização de testes imunohistoquímicos. Foram escolhidas aleatoriamente sequências que
apresentassem razão de reatividade maior que 1 e absorbância acima do percentil 50. Como o
objetivo foi avaliar a antigenicidade de peptídeos presentes nos três ciclos de seleção e
relacionar a reatividade ELISA com os resultados imunohistoquímicos, outros critérios de
seleção poderiam ter sido adotados sem perda de generalidade.
Na Tabela 7 são apresentados os valores da média da absorbância dos clones em relação
ao extrato proteico de células HCC 1954, em relação às células HCC 1954 BL e também é
apresentada a média da razão da absorbância tumor/controle dos clones mais reativos. O clone
selvagem não apresenta o peptídeo e a sua absorbância também foi avaliada.
Tabela 7 - Valores referentes ao Ensaio Imunoenzimático dos clones selecionados referentes aos três ciclos de
seleção com os valores da média da absorbância do clone em relação ao extrato proteico das células HCC 1954,
em relação às células normais e valores da média da absorbância da razão Tumor/ Câncer.
Clones
Ciclo de seleção
Média da
Média da Média da razão da
absorbância em
absorbância em
absorbância
relação a células
relação a células
HCC1954/
HCC 1954
HCC 1954 BL
HCC1954 BL
Selvagem
Primeiro
0,01
0,17
0,07
Segundo e
Terceiro
C3
Primeiro
0,28
0,11
2,52
C12
Primeiro
0,36
0,12
3,02
C183
Segundo
0,49
0,18
2,69
C186
Segundo
0,27
0,08
3,09
C197
Segundo
0,20
0,07
2,80
C195
Terceiro
0,28
0,08
3,25
C341
Terceiro
0,84
0,58
1,45
C342
Terceiro
0,06
0,02
2,40
58
Análise imunohistoquímica realizada com os fagos
A antigenicidade dos peptídeos derivados de linhagem celular HCC 1954 foi validada
por IHQ. Ao realizar a IHQ com os peptídeos (fagos), foi observado que os clones C12 e
C341 não apresentaram marcação.
Houve marcação na membrana celular, como pode ser verificado na Figura 18. O fago
selvagem (W) não apresentou marcação em células de epitélio ductal normal de mama (A),
em epitélio ductal com fibroadenoma (B), papilomatose intraductal (C), Carcinoma ductal in
situ G1(D), carcinoma invasivo G1 (E), carcinoma invasivo GIII (F). Como controle da
reação foi utilizado tecido de epitélio intestinal normal e tecido com adenocarcinoma. Os
tecidos de epitélio intestinal normal e adenocarcinoma não apresentaram marcação com
nenhum dos peptídeos (Figuras 18-G e 18-H). Os outros fagos (C183, C195, C342, C197,
C186 e C3) mostraram marcação positiva na membrana de diferentes células. No entanto, os
fagos C12 e C341 não apresentaram marcação. O fago C183 marcou positivamente epitélio
ductal normal de células de mama, epitélio ductal com fibroadenoma, células de carcinoma
invasivo grau III e carcinoma invasivo grau III e carcinoma ductal “in situ” grau II e III
(Figuras 18-I a 18-L). Os fagos C195 e C342 marcaram epitélio ductal com fibroadenoma e
carcinoma ductal “in situ” grau II e III (Figuras 18-M a 18-P). Os fagos C197 e C186
marcaram carcinoma ductal “in situ” grau I e III e não marcaram mama normal (Figuras 18-Q
e 18-R). Finalmente, o fago C3 apresentou marcação em epitélio ductal normal e em
carcinoma invasivo Grau I (Figuras 18-S e 18-T).
A Tabela 8 apresenta os resultados quantitativos da imunohistoquímica e ELISA.
Todos os fagos analisados apresentaram marcação para tecidos de mama, pois não
houve marcação em tecidos de colon normal e adenocarcinoma de intestino.
O clone C3 do primeiro ciclo de seleção marcou 50% de células normais significando
uma baixa especificidade. Cabe ressaltar, que não houve nenhum tipo de marcação com o
clone C12, o que impossibilita avaliar a existência de correlação entre a absorbância e os
resultados de IHQ.
Apenas no segundo ciclo de seleção foi observada a presença de clones (C186 e C197)
com nível de especificidade expressivo, pois não marcaram mama normal em nenhum dos 20
elementos da amostra e marcaram amostras de câncer. Os demais clones que não marcaram
HCC 1954 BL, não foram tão específicos, pois também não apresentaram nenhuma marcação
(C12, C341), ou marcaram fibroadenoma (C195 e C342). O outro clone do segundo ciclo de
seleção (C183) marcou 100% dos tecidos normais e foi o que obteve a maior absorbância do
segundo ciclo para HCC 1954 BL.
59
Figura 18 - Validação dos fagos selecionados por meio de PD tendo como alvo linhagem celular HCC 1954.
Fago selvagem (Wilde) (A-H) apresentou ausência de imunomarcação em epitélio de mama normal (A),
fibroadenoma (B), papilomatose intraductal (C), carcinoma ductal “in situ” grau I (D), carcinoma invasivo
grau I (E) e III (F). Epitélio intestinal normal (G) e adenocarcinoma (H) não apresentaram marcação nem
para o fago W e nem para os outros fagos. A imunomarcação (setas) para o fago C183 mostrou marcação
em células de mama normal (I), fibroadenoma (J), carcinoma ductal in situ grau II (K) e carcinoma invasivo
grau II (L). Os fagos C195 e C342 marcaram fibroadenoma (M e O) e carcinoma ductal in situ grau III (N e
P). Os fagos C197 e C186 apresentaram marcação em carcinoma ductal in situ grau II (Q e R). O fago C3
apresentou marcação em células de mama normal (S) e carcinoma invasivo grau I (T). Coloração:
Hematoxilina. Barras= 10 µm.
60
Tabela 8 - Clones referentes aos três ciclos de seleção com respectivos valores de absorbância e marcação na imunohistoquímica.
Clone
Ciclo de
seleção
Media
absorb.
HCC 1954
Media
absorb.
HCC 1954
BL
Media da
razão da
absorb.
HCC
1954/HCC1
954 BL
Mama
Fibroad.
Papilose
CA ductal in
CA ductal in
CA ductal in
CA invasivo
CA
CA
Tecido
Adenocar
normal
(n=2)
intraducto
situ
situ
situ
grau I (n=2)
invasivo
invasivo
de colon
cinoma
(n=2)
(n=3)
intestinal
de colon
normal
intestinal
(n=5)
(n=5)
(n=20)
grau
I
grau
(n=2)
II
grau
III
grau
(n=3)
(n=3)
II
grau
III
(n=3)
C3
1
0,28
0,11
2,52
10 (50%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
2 (100%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
C12
1
0,36
0,12
3,02
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
C183
2
0,49
0,18
2,69
20
(100%)
2
(100%)
0 (0%)
0 (0%)
2 (100%)
2 (66%)
0 (0%)
0 (0%)
2 (66%)
0 (0%)
0 (0%)
C186
2
0,27
0,08
3,09
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
1 (33,3%)
0 (0%)
2 (66%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
C197
2
0,2
0,07
2,8
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
2 (66%)
0 (0%)
2 (66%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
C195
3
0,28
0,08
3,25
0 (0%)
1 (50%)
0 (0%)
0 (0%)
2 (100%)
3 (100%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
C341
3
0,84
0,58
1,45
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
C342
3
0,06
0,02
2,4
0 (0%)
1 (50%)
0 (0%)
0 (0%)
1 (50%)
2 (66%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
Selv.
1, 2 e
0,01
0,17
0,07
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
(W)
3
Legenda: W= selvagem, absorb.= absorbância.
61
As absorbâncias dos clones C186 e C197 para HCC 1954 BL foram praticamente
idênticas (0,08 e 0,07, respectivamente) e foram menos que a metade da absorbância para
HCC 1954 BL do outro clone C183 do segundo ciclo de seleção. Neste caso, houve uma
correlação entre os valores da absorbância HCC 1954 BL e a especificidade na IHQ no
segundo ciclo de seleção.
No terceiro ciclo de seleção, o clone C341 apresentou um resultado insatisfatório na
imunohistoquímica, pois não houve marcação. Os clones C195 e C342 apresentaram a
mesma especificidade na IHQ, apesar da absorbância em HCC 1954 BL ter sido
significativamente maiores para o C195 (0,08 contra 0,02). Um fato importante é que o
clone C195 apresentou sensibilidade maior que o clone C342 na IHQ, e também
apresentou uma absorbância em HCC 1954 significativamente maior (0,28 contra 0,06),
mostrando uma correlação entre os valores de absorbância HCC 1954 e a sensibilidade na
IHQ no terceiro ciclo de seleção.
Comparação da IHQ do fago C195 e IF do peptídeo sintético SC195
A Tabela 9 apresenta uma comparação dos resultados de IHQ do fago C195 e de IF
do peptídeo sintético SC195.
Tabela 9 - Comparação dos resultados referentes à Imunohistoquímica realizada com o fago C195 e a
Imunofluorescência realizada com o peptídeo sintético SC195.
Normal
In situ
Invasivo
Grau 1
Grau 2
Grau 3
Grau 1
Grau 2
Grau 3
Fago
0/20
0/3
2/2
3/3
0/2
0/3
0/3
C195
0%
100%
100%
0%
0%
0%
Sint.
0*/10
0/1
2/2
1/1
6/12
2/9
1/3
SC195
0%
100%
100%
50%
22%
33%
O clone C195 (fago) não marcou tecidos normais. O clone SC195 sintético na IHQ
marcou os tecidos normais, porém com uma marcação fraca e difusa no citoplasma. Neste
sentido, se esta marcação não for considerada, houve uma especificidade semelhante na
marcação no clone C195 com o fago em relação ao clone sintético.
O peptídeo sintético mostrou-se mais específico que o fago, pois houve marcação em
células com câncer invasivo.
5.1.4 Análise in silico de peptídeo imunodominante
A Tabela 10 mostra o resultado do alinhamento do peptídeo C195 com a base de
dados RefSeq do NCBI.
62
Tabela 10 - Alinhamentos mais significativos para o peptídeo C195 – Banco de Dados “Reference Proteins”
Rank
3
4
5
6
7
8
9
10
11
13
17
20
21
27
28
29
32
33
34
Descrição
calcium-activated potassium channel subunit alpha-1 isoform d [Homo sapiens]
calcium-activated potassium channel subunit alpha-1 isoform a [Homo sapiens]
calcium-activated potassium channel subunit alpha-1 isoform c [Homo sapiens]
neprilysin [Homo sapiens] >ref|NP_000893.2| neprilysin [Homo sapiens]
calcium-activated potassium channel subunit alpha-1 isoform b [Homo sapiens]
spindlin-2ª [Homo sapiens]
CTD small phosphatase-like protein isoform 1 [Homo sapiens]
CTD small phosphatase-like protein isoform 2 [Homo sapiens]
spindlin-2B [Homo sapiens] >ref|NP_001006683.1| spindlin-2B [Homo sapiens]
Multiple inositol polyphosphate phosphatase 1 isoform 3 [Homo sapiens]
Multiple inositol polyphosphate phosphatase 1 isoform 1 precursor [Homo sapiens]
Transient receptor potential cation channel subfamily M member 1 [Homo sapiens]
breast cancer type 2 susceptibility protein [Homo sapiens]
insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1 isoform 2 [Homo sapiens]
insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1 isoform 1 [Homo sapiens]
transcription cofactor HES-6 isoform b [Homo sapiens]
transcription cofactor HES-6 isoform a [Homo sapiens]
T-lymphoma invasion and metastasis-inducing protein 1 [Homo sapiens]
spindlin-3 [Homo sapiens]
Score
Máximo
22.3
22.3
22.3
22.3
22.3
21.8
21.8
21.8
21.8
21.4
21.4
20.6
20.6
20.2
20.2
20.2
20.2
19.7
19.7
Score
Total
32.2
32.2
42.2
22.3
32.2
21.8
21.8
21.8
21.8
21.4
21.4
33.1
59.8
20.2
20.2
20.2
20.2
31.8
19.7
Cobertura
da E value
Consulta
66%
35
66%
35
83%
35
50%
35
66%
35
58%
47
66%
47
66%
47
58%
47
75%
62
75%
62
83%
112
83%
112
66%
151
66%
151
75%
151
75%
151
83%
203
58%
203
Foram selecionados para apresentação os alvos encontrados pelo BlastP dentre os 35
melhores ranqueados. O conteúdo das colunas é ranqueamento do alvo, a descrição da
proteína, os scores máximos e totais, a cobertura da consulta e o E-value. Cabe ressaltar
que em consultas usuais no Blast, o valor de E-value desejado é menor que 1 e
preferenciamente muito próximos a zero. Isto ocorre quando o tamanho da consulta é
semelhante ao tamanho do alvo porque boas respostas seriam improváveis de serem
obtidas aleatoriamente para um dado alvo. No nosso caso, como a consulta é formada por
apenas 12 aminoácidos e os alvos possuem centenas de aminoácidos, o E-value deixa de
ser uma referência que possa ser analisada de maneira absoluta. Sua utilidade passa a ser
apenas comparativa.
Na Figura 19 são apresentados os alinhamentos tridimensionais com as proteínas
selecionadas. Os alinhamentos dos peptídeos estão em rosa. Na Figura 19-A, o alvo em
questão é um canal de potássio ativado por cálcio. O gene que codifica esta proteína é o
KCNMA1. A Figura 20 mostra que este gene tem uma expressão significativa para câncer
de mama e ausência de expressão em pacientes normais. Além disso, esta proteína se
localiza na membrana celular. Na Figura 19- B, o alvo em questão é uma metaloprotease
que degrada diversos pequenos peptídeos. É sintetizada como uma proteína ligada a
membrana. Esta proteína também é conhecida como CD10 e CALLA (antígeno comum de
leucemia linfoblástica aguda) (VELASQUEZ et al., 2007).
63
Na Figura 19-C, o alvo é uma pequena proteína do tipo fosfatase CTD (domínio
carboxi-terminal). Este tipo de proteína está relacionado ao gene RBSP3, o qual já é
reconhecido como um supressor de tumor e pode controlar o mecanismo de transcrição da
RNA polimerase II. Na Figura 19-D, o alvo é spindlin-1 que é uma proteína relacionada a
câncer de ovário (JIANG et al., 2006).
Na Figura 19-E, o alvo é a polifosfatase 1 de polifosfato de inositol, o qual tem um
papel fundamental em diversas funções celulares, tais como, crescimento celular, apoptose,
migração celular, endocitose e diferenciação celular. A Figura 21 mostra a expressão do
respectivo gene INPP1 desta proteína, o qual se mostra sensivelmente expresso para câncer
de mama e não expresso para tecidos humanos normais (SU et al., 2004). Na Figura 19-F,
o alvo é o conhecido supressor de tumor BRCA2, o qual foi alinhado em uma ligação com
a proteína de estabilização DSS1 (J LI, 2006).
Na Figura 19-G, o alvo é a proteína 1 de invasão de células-T em linfoma e indutora
de metástase, a qual é codificada pelo gene TIAM1. A estrutura correspondente no PDB
refere-se ao domínio PH-CC-EX da TIAM1 (TERAWAKI et al., 2010) .
Na Figura 19-H, o alvo é a proteína 1 de ligação de mRNA do fator de crescimento
semelhante a insulina codificado pelo gene IGF2BP1.
O fator de transcrição HES-6, apesar de estar associado ao câncer de mama
(HARTMAN et al., 2009), não foi encontrado na base de dados Protein Data Bank. O
mesmo aconteceu para a proteína codificada pelo gene TRPM1, a qual foi ranqueada na
posição 20 e também está associada ao câncer (MILLER et al., 2004).
64
A
A
B
C
D
E
F
F
G
H
Figura 19 - Alinhamento tridimensional do peptídeo C195 contra alvos selecionados.
65
Figura 20 - Expressão do gene KCNMA1 em diversos tipos de câncer. (Fonte: www.genecards.com)
Figura 21 - Expressão do gene INPP1 da fosfatase 1 de polifosfato de inositol em diversos tipos de
câncer. (Fonte: www.genecards.com)
5.2 Estratégia 2: Sequências miméticas em tecidos mamários
A seguir serão apresentados os resultados referentes à seleção de sequências
miméticas em tecidos mamários, sendo descritos os resultados do biopanning, os ensaios
imunoenzimáticos realizados com o fago e com o peptídeo sintético e as análises in silico.
5.2.1 Biopanning utilizando Imunoglobulinas G provenientes de tecido mamário
Os resultados da estratégia 1 mostraram que os clones do último ciclo não
necessariamente produzem os melhores resultados. Com o objetivo de se conseguir uma
maior variabilidade dos clones e de não favorecer o clone mais imunodominante na
seleção, optou-se por realizar uma estratégia de seleção utilizando-se 3 grupos de controles
de mama sadia, 2 grupos de doença benigna da mama e 5 grupos de pacientes com câncer
de mama. A seleção negativa foi realizada para que os clones selecionados fossem mais
específicos para o câncer de mama. A Tabela 11 apresenta os agrupamentos de pacientes
selecionados, considerando a idade das pacientes, os diagnósticos, recorrência familiar de
câncer de mama, tabagismo, etilismo e história prévia de doença benigna da mama.
66
Tabela 11 - Caracterização dos agrupamentos de pacientes com CM, DBM e CO que fizeram parte do
biopanning.
Total
(n=50)
Grupo 1
Controles
(n=3)
Grupo 2
Controles
(n=3)
Grupo 3
Controles
(n=4)
Grupo 1 DBM
(n=10)
Grupo 2 DBM
(n=10)
Grupo 1 CM
(n=4)
Grupo 2 CM
(n=4)
Grupo 3 CM
(n=4)
Grupo 4 CM
(n=4)
Grupo 5 CM
(n=4)
Idade
Média ± DP
Mediana
Mín- Max
Etilismo
Sim
n (%)
Tabagismo
Sim
n (%)
História
familiar de CM
Sim
n (%)
História prévia
de DBM
Sim
n (%)
Diagnóstico
46,92 ± 15,42
44,50
21 – 80
43,33± 9,24
38,00
38 – 54
42,00± 19,00
37,00
26-63
47,75 ± 17,63
53,50
22-62
39,80 ± 9,20
42,00
25-50
38,20 ± 15,65
34,50
21-71
49,75 ± 8,42
49,50
42-58
43,50 ± 13,89
40,00
31-63
68,75 ± 13,35
72,00
51-80
51,00 ± 10,10
47,00
44-66
66,75 ± 8,73
67,00
56-77
9 (18%)
9 (18%)
7 (14%)
7 (14%)
0 (0%)
1 (33%)
0 (0%)
0 (0%)
Hipertrofia
mamária
0 (0%)
1 (33%)
0 (0%)
0 (0%)
Mama
acessória
0 (0%)
1 (33%)
0 (0%)
0 (0%)
Hipertrofia
mamária
2 (20%)
1 (33%)
1 (10%)
2 (20%)
Alterações
fibrocísticas
3 (30%)
0 (0%)
1 (10%)
1 (10%)
Fibroadenoma
0 (0%)
0 (0%)
2 (50%)
1 (25%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
0 (0%)
1 (33%)
1 (33%)
0 (0%)
2 (50%)
2 (50%)
1 (33%)
1 (33%)
2 (50%)
2 (50%)
1 (33%)
2 (50%)
CA ductal
infiltrante Grau
2e3
CA ductal
infiltrante Grau
2
CA ductal in
situ, infiltrante
e invasor
CA ductal in
situ, infiltrante
e invasor
CA ductal
infiltrante
-----
A Tabela 12 apresenta os aspectos clínico-patológicos dos grupos de câncer de
mama, apresentando o grau, estadiamento, a classificação de Scarff-Bloom-Richardson
(SBR), Receptores de estrógeno e progesterona e cerb B2.
Tabela 12 - Aspectos clínico-patológicos dos cinco grupos de câncer de mama (G1, G2, G3, G4, G5)
considerando o grau do tumor, o estadiamento, a classificação de Scarff-Bloom Richardson (SBR), os
receptores de estrógeno e progesterona, cerB2 e p53.
Identificação
Grau
Estadiamento SBR RE RP CerbB2 p53
do Grupo
Ductal infiltrante Grau3
T 2N 0M 0
3
+
Ductal infiltrante Grau3
T 2N 1M 0
3
+
3+
3+
+
Grupo 1 CM
Ductal infiltrante Grau2
T 2N X M X
2
4+
4+
1+
+
Ductal infiltrante Grau2
TR1AN0M0
2
3+
3+
+
Ductal infiltrante Grau2
T 2N 0M X
3
+
2+
3+
Grupo 2 CM
Ductal infiltrante Grau2
T 4N 3M 1
2
4+
3+
3+
+
Ductal infiltrante Grau2
T 2N 0M 0
2
4+
4+
2+
+
Ductal infiltrante Grau2
T 2N 0M 0
2
3+
2+
Ductal in situ
TxNxMx
2
4+
1+
+
Grupo 3 CM
Ductal infiltrante Grau2
T1NxMx
2
4+
+
Ductal infiltrante Grau2
T1NxMx
2
3+
+
Ductal invasor Grau2
T 2N 1M 1
2
0
+
+
+
67
Grupo 4 CM
Grupo 5 CM
Ductal invasor Grau3
Ductal in situ Grau 3
Ductal invasor Grau 2
Ductal infiltrante Grau 2
Ductal infiltrante Grau 2
Ductal infiltrante Grau 2
Ductal infiltrante Grau 2
Ductal infiltrante Grau 2
T 2N 1M 1
T 2N 2M 1
T 2N 1M 0
T 2N 1M 0
T 2N 2M x
T 1N 1M 0
T 1N 0M 0
T2N1Mx
3
3
2
2
2
2
2
2
3+
3+
3+
4+
4+
4+
3+
4+
2+
4+
4+
4+
3+
3+
3+
-
+
+
+
+
+
+
+
3+
Extração das proteínas totais
A quantificação das proteínas totais extraídas foi realizada pelo método de Bradford.
O intuito desta quantificação foi padronizar uma quantidade ideal para a realização da
purificação das IgGs e para se padronizar a quantidade de IgG para ser utilizada no
biopanning.
O perfil proteioco das proteínas extraídas do tecido das pacientes pode ser verificada
pela resolução em gel de acrilamida SDS-PAGE (Figura 22).
O processo de extração de proteínas de tecidos mamários, como o tumor, doença
benigna da mama e controle foi eficiente, como pode ser observado pelo padrão de bandas
formadas no gel SDS-PAGE, no qual o evidenciamento de várias bandas é um indicativo
da diversidade das proteínas.
Figura 22 - Gel SDS-PAGE para análise das proteínas extraídas de tecidos mamários. Coluna M: Marcador
de peso molecular Prestained SDS-PAGE Standards Broad Range (Bio-rad). Colunas 1 a 3: 15 microgramas
de proteínas de tecido de paciente com câncer de mama, doença benigna da mama e controles,
respectivamente.
A purificação das IgGs provenientes das proteínas totais extraídas do tecido de mama
foi realizada por meio da utilização de microesferas magnéticas. Estas foram quantificadas
e foi observada a presença das mesmas por meio do ensaio Dot Blot.
O ensaio dot blot permitiu a confirmação da presença de anticorpos nas amostras de
extrato protéico total de câncer de mama, doença benigna da mama e controle, bem como
na amostra purificada pelas microesferas magnéticas. A membrana de nitrocelulose (Figura
23) apresenta as diferentes marcações entre as IgGs isoladas das amostras de câncer, as
proteínas remanescentes (solução da qual foram capturadas as imunoglobulinas) e das
68
amostras de extrato de proteína total, comprovando a eficiência da metodologia utilizada
para o isolamento das IgG de tecidos mamários.
G1 CO TECIDO
Ptn T
R
IgG P
Ptn T
R
IgG P
G1 CM TECIDO
G2 CO TECIDO
G2 CM TECIDO
G3 CO TECIDO
G3 CM TECIDO
G1 DBM TECIDO
G4 CM TECIDO
G2 DBM TECIDO
G5 CM TECIDO
Figura 23 - Membrana de Dot Blot das amostras de extrato de proteína total (Ptn. T.), proteínas
remanescentes (R) e de IgG purificada (IgG P.) de amostras de pacientes CO, DBM e CM.
Biopanning
A seleção de peptídeos ligantes às IgGs de pacientes com câncer de mama foi
realizada utilizando-se a biblioteca de peptídeos expressas na superfície de fago
filamentoso M13 e foram realizados três passos de subtração utilizando-se IgGs de
pacientes sadios e de pacientes com doença benigna da mama, para garantir a eficiência de
seleção, eliminando potenciais IgGs ligantes presentes em tecidos sadios. A estratégia de
subtração é importante para assegurar uma maior especificidade na seleção dos peptídeos e
já foi realizada eficientemente em outros trabalhos.
69
Tabela 13 - Seleção dos fagos com peptídeos ligantes a proteínas do câncer de mama. Título obtido
(UFC) no processo de biopanning com amostras de IgG provenientes do soro e tecido.
Número de partículas de fagos –
Tecido
Ciclos de Seleção
Grupos de pacientes com CM
Entrada
Saída
Primeiro
Segundo
Terceiro
G1 CM
4 x 1010
2,1 x 106
G2 CM
4 x 1010
3,2 x 106
G3 CM
4 x 1010
1,3 x 105
G4 CM
4 x 1010
9,6 x 104
G5 CM
4 x 1010
3,1 x 106
G1 CM
4 x 1010
3,1 x 102
G2 CM
4 x 1010
1,8 x 102
G3CM
4 x 1010
3,3 x 102
G4 CM
4 x 1010
5,0 x 101
G5 CM
4 x 1010
2,6 x 102
G1 CM
4 x 1010
1,1 x 104
G2 CM
4 x 1010
6,0 x 103
G3CM
4 x 1010
1,0 x 104
G4 CM
4 x 1010
3,0 x 104
G5 CM
4 x 1010
1,4 x 104
A titulação dos eluatos amplificados e não amplificados em cada ciclo de seleção foi
utilizada para estimar a quantidade de fagos selecionados (Tabela 13). Os títulos de entrada
dos fagos durante a seleção foram sempre maiores que os títulos de saída, pois os fagos
com maior afinidade pela IgG do tecido ficam ligados a estas por interação
peptídeo/anticorpo e o restante dos fagos com baixa ou sem nenhuma afinidade foram
removidos durante as lavagens.
Durante 3 ciclos consecutivos de biopanning, todas as colônias de bactérias ER2738
infectadas com fago presentes nas placas de titulação apresentaram coloração azul,
indicando a presença do inserto.
A Tabela 14 apresenta um resumo com os resultados das frequências das sequências
dos peptídeos obtidas no biopanning contra IgG de tecidos. Insertos obtidos em todos os
ciclos de seleção foram sequenciados.
70
Tabela 14 - Ciclos de seleção do biopanning com o respectivo número de sequências válidas, sequências
únicas e repetidas.
Número de sequências
Número de sequências Número de sequências repetidas
válidas
únicas
Ciclo 1
21
21
Nenhuma repetição
Ciclo 2
57
37
1 sequência: 13 vezes
2 sequências: 4 vezes cada uma delas
2 sequências: 2 vezes cada uma delas
Ciclo 3
71
55
3 sequências: 2 vezes cada uma delas
10 sequências: 2 vezes cada uma delas
TOTAL
149
113
5.2.2 Pre-screening (ELISA) dos ciclos de seleção dos biopannings
Na pré-validação realizada utilizando os fagos do terceiro ciclo de seleção, foi
confirmada a reatividade de 60 peptídeos. Os fagos (peptídeos) B1, F4, A7, C10 e D11
foram os que apresentaram maior reatividade nos 5 grupos de pacientes e deste modo eles
foram selecionados para a realização de ensaios mais extensos de validação. A Figura 24
mostra os 5 clones mais reativos de cada um dos grupos de pacientes.
1,8
1,6
G1
G2
G3
G4
G5
Abs 492nm
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
B1 C2 A1 F2 E1
F4 F5 G3 B5 A4
A7 G5 H5 C7 A8
C10 F9 E9 B9 A10
D11 B11 H10 E10
A12
Figura 24 - Absorbância dos 5 clones mais reativos de cada grupo de pacientes
Legenda: G= grupo
5.2.3 Imunorreatividade dos fagos recombinantes
Os fagos selecionados no pre-screening foram submetidos ao ensaio ELISA com
soro de 18 pacientes com câncer de mama, 9 pacientes com doença benigna da mama e 7
pacientes controles. A Figura 25 apresenta a reatividade dos clones avaliados.
71
Fago C10
0.15
Fago F4
0.35
Abs 492nm
0.30
Abs 492nm
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0.10
0.05
0.00
CM
0.00
CM
DBM
CO
-0.05
SCM SDBM SCO
DBM
CO
CNR
SCM SDBM SCO
CNR
Grupos
Grupos
Fago B1
0.20
Fago D11
0.3
0.2
0.10
Abs 492nm
Abs 492nm
0.15
0.05
0.1
0.0
0.00
CM
DBM
CO
SCM SDBM SCO
CM
CNR
DBM
CO
SCM SDBM SCO
CNR
Grupos
Grupos
-0.1
Fago A7
Abs 492nm
0.3
0.2
0.1
0.0
CM
DBM
CO
SCM SDBM SCO
CNR
Grupos
Figura 25 - Gráficos representativos das leituras a 492 nm do ensaio ELISA mostrando a reatividade dos
clones contra os soros de pacientes individuais de diferentes grupos. CM (Câncer de Mama) DBM (Doença
Benigna da Mama) CO (Controle) SCM (Selvagem Câncer de Mama) SDBM (Selvagem Doença Benigna da
Mama) SCO (Selvagem Controle) CNR (Controle Negativo da Reação).
72
Para verificar a melhor sensibilidade e especificidade de um dado ponto de corte foi
feita a curva ROC dos clones avaliados. A Tabela 15 apresenta os valores referentes à
curva ROC, descrevendo os valores da área sob a curva, valores de P, de limiar de corte. A
sensibilidade, especificidade e a razão de verossimilhança são descritas abaixo
considerando os grupos CA x CO, CA x DBM e CA x DBM x CO, respectivamente.
Os valores de cut off foram obtidos considerando a melhor razão de verossimilhança.
Tabela 15 - Fagos F4, C10, B1, D11 e A7 com os respectivos valores referentes à curva ROC considerando
os grupos CA x CO, CA x DBM e CA x DBM x CO.
Análise Curva ROC e Acurácia – CA x CO
F4
C10
B1
D11
A7
Área sob a curva
0,89
0,77
0,80
0,66
0,71
P-value
0,00
0,04
0,02
0,2
0,10
Limiar de Corte
0,11
0,06
0,05
0,06
0,09
Sensibilidade
77,8%
72,2%
77,8%
55,6%
50,0%
52,36% a
46,52% a
52,36 a
26,02%a
95% IC (Sensibilidade)
93,59%
90,31%
93,59% 30,76% a 78,47%
73,98%
Especificidade
85,7%
85,7%
71,4%
71,4%
85,7%
42,13% a
29,04% a
42,13%
42,19 a
99,64%
96,33% 29,04% a 96,33%
a99,64%
95% IC (Especificidade)
99,64%
Razão de verossimilhança
5,44
5,06
2,72
1,94
3,5
95% IC (Especificidade)
Razão de verossimilhança
Análise Curva ROC e Acurácia – CA x DBM
F4
C10
B1
0,85
0,78
0,74
0,00
0,02
0,05
0,12
0,05
0,05
77,8%
72,2%
66,7%
52,36% a
46,52% a
29,93% a
93,59%
90,31%
92,51%
88,9%
77,8%
77,8%
39,99% a
52,36% a
51,75% a
97,19%
93,59%
99,72%
7,00
5,06
3,00
Acurácia Geral
Acurácia CA x CO
Acurácia CA x DBM
Análise de Acurácia
F4
C10
0,79
0,76
0,8
0,76
0,77
0,74
Área sob a curva
P-value
Limiar de Corte
Sensibilidade
95% IC (Sensibilidade)
Especificidade
B1
0,70
0,76
0,70
D11
A7
0,68
0,12
0,05
77,8%
21,20% a 86,30%
1,75
0,69
0,12
0,09
50,0%
26,02% a
73,98%
87,5%
47,30% a
99,68%
4,00
D11
0,59
0,6
0,55
A7
0,66
0,6
0,61
52,36% a 93,59%
55,6%
73
A Figura 26 apresenta a melhor curva ROC obtida foi referente ao fago F4.
125
Sensitivity%
Identity%
Sensitivity
100
75
50
25
0
0
25
50
75
100
100% - Specificity%
Figura 26 - Gráfico representativo da Curva ROC (CA x CO) referente ao Fago F4.
Foram estudadas diversas alternativas de combinação do uso dos valores de
absorbância dos fagos para melhorar a acurácia geral da proposta. Utilizando a função de
cálculo combinado descrita a seguir conseguiu-se uma acurácia geral equivalente a
84,84%. O cálculo combinado foi feito considerando valores limiares para F4, B1, C10 e
A7 equivalentes a 0,1277; 0,075; 0,07 e 0,102, respectivamente. Foi considerado câncer
quando se obteve pelo menos um valor de absorbância acima do limiar para os quatro
clones e foi considerado normal aquele que não apresentou nenhum valor de absorbância
acima do limiar para todos os quatro clones.
A Tabela 16 apresenta a correlação existente entre os peptídeos peptídeos. As células
em preto na tabela mostram a existência de correlação significativa. Observa-se que com
exceção do F4 todos os demais peptídeos apresentaram correlação entre si. A Tabela 17
apresenta os detalhes dos valores de correlação entre os clones.
Tabela 16 - Fagos com correlação de Pearson estatisticamente significativa (P-value < 0,05).
F4
B1
C10
D11
A7
F4
B1
C10
D11
A7
Tabela 17 - Correlação de Pearson entre os valores de absorbância dos 33 pacientes para os 5 fagos
(acima Valor de Correlação de Pearson, abaixo P-value).
F4
B1
C10
D11
B1
0,308
0,081
C10
0,635
0,352
0,044
0,000
D11
0,249
0,605
0,466
0,162
0,000
0,006
A7
0,225
0,729
0,506
0,451
0,207
0,000
0,003
0,008
74
A absorbância dos fagos também foi comparada com os dados clínicos de pacientes
com câncer, considerando:
•
Grau histológico considerando (1 = CA in situ grau 1, 2 = CA in situ grau 2, 3
= CA in situ grau 3, 4 = CA infiltrante grau 1, 5 = CA infiltrante grau 2, 6 = CA
infiltrante grau 3, 7 = CA invasivo grau 1, 7 = CA invasivo grau 1, 7 = CA
invasivo grau 1) ;
•
Receptor de estrógeno considerando (0 = negativo, 1 a 4 escalas de
positividade);
•
Receptor de progesterona considerando (0 = negativo, 1 a 4 escalas de
positividade);
•
Receptor c-erb B2 considerando (0 = negativo, 1 a 3 escalas de positividade).
A Figura 27 apresenta a dispersão dos valores de absorbância em relação às
categorias acima para o fago F4. Observou-se que não houve correlação entre os valores
de absorbância e as categorias acima avaliadas. As mesmas análises também foram
realizadas para os fagos C10, B1, D11 e A7 e da mesma forma não foi observada
nenhuma correlação.
0, 3
0,3
0, 25
0,25
0, 2
0,2
0, 15
0,15
0,1
0, 1
0,05
0, 05
0
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0
9
1
2
C a t e go ria de R E
3
4
C a t e gor i a do Gr a u H i s t ol ógi c o
0,3
0,3
0,25
0,25
0,2
0,2
0,15
0,15
0,1
0,1
0,05
0,05
0
0
0
1
2
3
4
0
1
2
3
C a t e gor ia de RP
C a t e gor i a de c - e r b B 2
Figura 27 - Gráfico de dispersão para comparação da absorbância do fago F4 em relação ao grau histológico,
a receptor de estrógeno (RE), a receptor de progesterona (RP) e a receptor c-erb B2.
75
5.2.4 Imunorreatividade do peptídeo sintetizado a partir do fago F4
O peptídeo apresentado pelo fago F4 foi o que apresentou a melhor curva ROC e
deste modo ele foi sintetizado. Após a síntese química o peptídeo SF4 foi submetido a
testes ELISA com uma amostra de 60 pacientes com câncer de mama, 110 pacientes com
doença benigna da mama e 60 pacientes controles. A dispersão dos valores de absorbância
dos respectivos pacientes é mostrada na Figura 28. A Tabela 18 apresenta o valor da área
sob a curva CM x CO de 0,7768.
Na Tabela 19 mostra-se que é possível uma sensibilidade de 95% com limiar de corte
igual a 0,138 ao custo de uma especificidade mais baixa igual a 46,7%, com uma acurácia
entre CM x CO de 71%. Caso seja interessante aumentar o limiar de corte para obter uma
especificidade maior, sugere-se o limiar de 0,18 para obter uma especificidade de 80%,
com uma acurácia geral de 73%.
0.5
Abs 492nm
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
CM
DBM
CO
Figura 28 - Gráfico de Dispersão da Absorbância relativo ao peptídeo sintético F4. A linha horizontal
representa o valor do cut off obtido por meio da curva ROC.
Legenda: CM= câncer de mama, DBM= doença benigna da mama, CO= controle
Tabela 18 - Peptídeo sintético SF4 com os valores referentes à curva ROC.
CM x CO CM x DBM
Área sob a curva
0,77
0,68
P-value
0,00
0,00
Tabela 19 - Sensibilidade, especificidade e acurácia do peptídeo SF4.
Especificidade a 80%
Limiar de Corte
0,18
Sensibilidade
41,67%
Especificidade
80%
Likelihood ratio
2,08
Acurácia Geral
73%
Acurácia CM x CO
66%
Acurácia CM x DBM
66%
Positividade
38%
Sensibilidade a 95%
0,13
95,0%
46,7%
1,78
49%
71%
49%
38%
76
Foi realizada a categorização dos pacientes com câncer de mama considerando
receptores de estrógeno, progesterona, HER2 e os diferentes diagnósticos de câncer
(câncer invasivo x câncer in situ), mas não foi encontrada diferença estatisticamente
significativa quando estes marcadores foram analisados.
5.2.5 Desenvolvimento de sensor eletroquímico para a detecção do câncer de mama
Foi utilizado o peptídeo sintético SF4 para a construção de um imunossensor.
Amostras de imunoglobulinas G provenientes de soro de pacientes com câncer de mama e
de pacientes controles foram utilizadas para a realização deste experimento.
A construção deste sensor foi feita em uma parceria com o Instituto de Química da
UFU e o objetivo do mesmo foi verificar a viabilidade da utilização do marcador obtido
nesta tese. Os experimentos realizados por EIE utilizando eletrodos modificados com
polímero com sonda e sonda/alvo podem ser vistos na Figura 29.
O gráfico apresenta um semi-círculo em regiões de alta frequência (mais à esquerda
no eixo x) e a tendência a uma reta em regiões de baixa frequência (mais à direita no eixo
x). A presença dos semi-círculos indica a presença de materiais com diferentes superfícies.
Na presença de peptídeo mais IgG houve um aumento de resistência (-Z’) em comparação
com o sistema contendo apenas o peptídeo nas regiões de alta frequência. Isso é justificado
pelo fato de que, com o aumento da camada biológica imobilizada, ocorre aumento de
resistência à transferência de carga do sistema, produzindo uma diminuição de
transferência eletrônica entre o par redox ferro/ferricianeto e a superfície do eletrodo. Esse
experimento indica ser possível a construção de um sensor para câncer de mama pela
imobilização de peptídeo e interação com IgG complementar por meio de medidas
eletroquímicas. Assim, o experimento foi realizado utilizando além dos sistemas sonda e
sonda/alvo, também o sistema sonda/alvo não-complementar conforme é apresentado na
Figura 30.
Com os resultados, o circuito equivalente mais apropriado para explicar os dados
experimentais é o apresentado na Figura 31. O circuito foi proposto e simulado (linhas) e
comparado com os dados experimentais (símbolos), como mostrado na Figura 30. Dessa
maneira foram gerados valores dos componentes do circuito, apresentados na Tabela 20.
De acordo com esta tabela pode-se observar similaridade entre os valores de resistência da
sonda e sonda/não-complementar (136,6 e 155,9 Ω.cm2), o que mostra que há uma
especificidade do sensor ao imobilizar uma sonda não-complementar sobre a superfície
77
modificada com o peptídeo. Ao se adicionar o alvo, o aumento de resistência é mais
substancial, de 196,4 Ω (50 Ω a mais do que a sonda), o que mostra uma maior
modificação da superfície pelo possível aumento da camada de material biológico, gerando
maior resistência à transferência de carga do par redox ferro/ferricianeto e o eletrodo.
Os valores de χ2 são razoáveis e não são melhores devido aos valores de Qdl,2,
região de baixa frequência, que apresenta variações experimentais de um sistema para o
outro. Embora isso ocorra, a região de alta frequência está muito bem simulada como pode
ser vista, pela Figura 30 e pelo inset da mesma, que gera os resultados de Rct,1, de
interesse para o trabalho em questão.
A comprovação desses resultados foi obtida em experimento de VPD em mesma
solução.
O voltamograma foi obtido (Figura 32) esperando menores valores de corrente de
oxidação de ferrocianeto de potássio para o sistema completo, contendo sonda e alvo e
semelhanças entre sonda e sonda/alvo não-complementar. Como pode ser observado, além
de obter menor valor, o sistema sonda/alvo apresentou duas ondas de oxidação. A onda
mais catódica pode ser atribuída à IgG imobilizada visto que nenhum dos outros sistemas
apresentou esse comportamento. Do mesmo modo que foi explicado a EIE, a transferência
eletrônica reduzida pela presença de mais camadas de material biológico promove uma
menor oxidação das substâncias em solução e, consequentemente, menor resposta de
corrente. As respostas muito semelhantes dos sistemas sonda e sonda/alvo nãocomplementar comprovam a especificidade do sensor.
Tabela 20 - Parâmetros obtidos por meio de simulação de dados de EIE usando circuito equivalente
proposto para eletrodos de grafite modificado com poli ácido 3- hidroxifenilacético contendo peptídeo
(sonda), peptídeo e IgG (sonda e alvo) e peptídeo e igG (sonda e alvo não-complementar).
Eletrodo modificado
Eletrodo modificado
Eletrodo modificado
com poli(3-HFA)com poli(3-HFA)com poli(3-HFA)Peptídeo
Peptídeo-IgG+
Peptídeo-IgG4,56
1,42
3,56
RS / (Ω cm2)
Qdl,1 / (mF cm-2)
0,43
0,36
0,45
0,70
0,81
0.80
n1
136,6
196,4
155,9
Rct,1 / (Ω cm2)
0,0064
0,0096
0,0095
W / (Ω cm2 s-1/2)
Qdl,2 / (mF cm-2)
11,72
26,25
23,60
1,00
1,00
1,00
n2
-2
-2
2
2,38x10
4,77x10
2,58
x
10-2
χ
78
300
-2
-Z" (Ω.cm )
-2
-Z" (Ω.cm )
1000
800
225
150
75
0
0
600
75
150 225
-2
-Z' (Ω.cm )
300
400
200
0
0
200
400
600
800
-2
1000
1200
-Z' (Ω.cm )
Figura 29 - Diagrama de Nyquist de eletrodos modificados com poli ácido 3-hidroxifenilacético contendo
(―) peptídeo (sonda) e (―) peptídeo-IgG (alvo) em solução contendo 5 mM de ferrocianeto de potássio, 5
mM de ferricianeto de potássio e 0,1 M de cloreto de potássio, potencial aplicado: +0.24 V, amplitude: 0,10
V. Inset: região de alta frequência ampliada.
600
400
300
300
-Z" (Ω.cm -2)
-Z" (Ω.cm-2)
500
200
200
100
100
0
0
100
200
-Z' (Ω.cm-2)
300
0
0
100
200
300
400
500
600
-2
-Z' (Ω.cm )
Figura 30 - Diagrama de Nyquist de eletrodos modificados com poli ácido 3-hidroxifenilacético contendo
(―■―) peptídeo (sonda), (―▲―) peptídeo e igG (alvo) e (―♦―)peptídeo e igG (alvo não-complementar)
em solução contendo 5 mM de ferrocianeto de potássio, 5 mM de ferricianeto de potássio e 0,1 M de cloreto
de potássio, potencial aplicado: +0.24 V, amplitude: 0,10 V. Inset: região de alta frequência ampliada.
Figura 31 - Circuito equivalente para simulação dos dados de EIE. Rs é a resistência da solução, Qdl,1 é a
capacitância da dupla camada elétrica, Rct,1 é a resistência à transferência de carga, W é a resistência de
Warburg e Qdl,2 é a segunda capacitância.
180
Corrente (µA)
150
120
90
60
30
0
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
Potencial (V)
Figura 32 - Voltamogramas de pulso diferencial de eletrodos modificados com poli ácido 3hidroxifenilacético contendo (―) apenas o peptídeo (sonda), (―) contendo peptídeo e igG (alvo) e (―)
peptídeo e igG (alvo não complementar) em solução contendo 5 mM de ferrocianeto de potássio, 5 mM de
ferricianeto de potássio e 0,1 M de cloreto de potássio, 16 mV/s.
79
5.2.6 Seleção dos anticorpos scFv
A seleção de fagos obtidos na biblioteca combinatorial scFv apresentou um
enriquecimento no número de clones eluídos do primeiro para o segundo ciclo. Após o
último ciclo de seleção, clones isolados obtidos das placas correspondentes ao eluato do
segundo ciclo foram amplificados em E. coli XL1-Blue em placas deep well. Parte das
células bacterianas foi usada para extração de plasmídeos e parte foi induzida a expressar o
scFv com IPTG. Após a indução, o sobrenadante foi coletado. Apesar de não ser uma
linhagem não-supressora, bactérias dessa linhagem são capazes de produzir anticorpos
solúveis, porém em quantidades menores. Foram realizados ELISAs com o objetivo de se
encontrar clones que secretavam scFv no sobrenadante da cultura induzida por IPTG.
A detecção de moléculas solúveis utilizando o anticorpo anti-HA nos ensaios de
ELISA evidenciou a presença da região VH, uma vez que o epítopo de hemaglutinina
encontra-se fusionado a essa cadeia.
Em relação aos anticorpos scFv específicos ao F4 sintético (SF4), pode ser observado
que dos 32 clones selecionados no biopanning, 11 deles apresentaram reatividade acima de
0,2 e produziram scFv na forma solúvel. Foram selecionados os 4 clones mais reativos, que
foram denominados scFv 1D, scFv 2G, scFv 3C, scFv 1F (Figura 33).
Os ensaios ELISA permitiram uma abordagem rápida da produção, secreção e
reatividade dos anticorpos scFv reativos ao peptídeo sintético F4 (SF4).
2
1,8
1,6
Absorbância
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
2C
3E
2B
4C
1F
4B
2E
1D
3C
1H
2G
0
Clones
Figura 33 - Absorbância dos clones (anticorpos scFv) mais reativos relacionados ao peptídeo sintético (SF4).
80
Em relação aos anticorpos scFv específicos ao fago F4, pode ser observado que dos
96 clones selecionados no biopanning, 50 deles apresentaram reatividade acima de 0,2 e
produziram scFv na forma solúvel e apresentaram maior reatividade nos ensaios ELISA.
Na Figura 34 é apresentada os valores de absorbância dos clones mais reativos. Estes 50
clones foram selecionados para que fossem realizados testes de especificidade em relação
ao fago selvagem. Os clones mais específicos foram denominados como scFv 3D e scFv
5D.
0,4
0,35
Fago F4
Abs 492nm
0,3
Fago Selvagem
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
3D
5D
5C
Clones
10C
6E
Figura 34 - Absorbância dos cinco clones (Anticorpos scFv) mais reativos em relação ao fago com o peptídeo
e o fago selvagem.
5.2.7 Análise in silico de peptídeo selecionado
A Tabela 21 apresenta os alvos com melhor score no alinhamento BlastP do peptídeo
F4 com proteínas da base de dados RefSeq. Para a apresentação foram filtradas apenas as
proteínas que estão associadas a algum tipo de câncer. Na tabela são apresentados a
posição (rank) da proteína na lista retornada pelo BlastP, os scores máximos e totais, a
cobertura da consulta e o E-value. Cabe ressaltar que em consultas usuais no Blast o valor
de E-value desejado é menor que 1 e preferenciamente bastante próximo de 0. Isto ocorre
quando o tamanho da consulta é semelhante ao tamanho do alvo porque boas respostas
seriam improváveis de serem obtidas aleatoriamente para um dado alvo. No nosso caso,
como a consulta é formada por apenas 12 aminoácidos e os alvos possuem centenas de
aminoácidos, o E-value deixa de ser uma referência que possa ser analisada de maneira
absoluta. Sua utilidade passa a ser apenas comparativa.
81
A Figura 35 apresenta os alinhamentos tridimensionais com as proteínas
selecionadas. Os alinhamentos dos peptídeos estão em rosa. Na Figura 35-A, o alvo em
questão é uma estrutura de PPIL1 ligada a um fragmento de SKIP, a qual é codificado pelo
gene TRIB3 cujo alinhamento Pepsurf apresentou P-value = 1.6 x 10-4. A Figura 35-B, o
alvo apresentado é uma quinase WNK1, a qual foi utilizada pois a WNK2 não estava
disponível no PDB. A Figura 35-C apresenta o alvo MAPKAP2 que é uma proteína
quinase ativado por mitógeno e na Figura 35-D apresenta o alvo MAPKAP6. Apesar de o
alvo MAPKAP6 não ter ocorrido no alinhamento BlastP, o mesmo foi escolhido pois a
MAPKAP7 não foi encontrada no PDB. Sugere-se que o alinhamento tridimensional para
MAPKAP7 deveria ser ainda melhor que o da MAPKAP6. A Figura 35-E apresenta o alvo
MeCP2. A Figura 35-F apresenta o alvo que é um enhancer para interleucina.
Tabela 21 - Alinhamentos mais significativos para o peptídeo F4 – Banco de Dados “Reference Proteins”
1
tribbles homolog 3 [Homo sapiens]
24.0
Score
Total
24.0
6
methyl-CpG-binding domain protein 1 isoform 8 [Homo sapiens]
21.0
21.0
50%
84
7
methyl-CpG-binding domain protein 1 isoform 9 [Homo sapiens]
21.0
21.0
50%
84
8
methyl-CpG-binding domain protein 1 isoform 7 [Homo sapiens]
21.0
21.0
50%
84
13
cytokine receptor common subunit beta precursor [Homo sapiens]
21.0
36.1
83%
84
14
serine/threonine-protein kinase WNK2 [Homo sapiens]
20.6
77.4
75%
112
16
interleukin enhancer-binding factor 3 isoform d [Homo sapiens]
20.2
20.2
100%
151
17
nuclear receptor coactivator 6 isoform 1 [Homo sapiens]
20.2
68.1
91%
151
18
interleukin enhancer-binding factor 3 isoform e [Homo sapiens]
20.2
20.2
100%
151
20
interleukin enhancer-binding factor 3 isoform b [Homo sapiens]
20.2
20.2
100%
151
21
interleukin enhancer-binding factor 3 isoform a [Homo sapiens]
20.2
20.2
100%
151
22
interleukin enhancer-binding factor 3 isoform c [Homo sapiens]
20.2
20.2
100%
151
23
cullin-9 [Homo sapiens]
20.2
20.2
66%
151
24
nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 2 isoform D [Homo sapiens]
19.7
35.6
83%
203
25
serine/threonine-protein kinase 11-interacting protein [Homo sapiens]
19.7
35.6
66%
203
27
mitogen-activated protein kinase 7 isoform 2 [Homo sapiens]
19.7
65.3
58%
203
28
mitogen-activated protein kinase 7 isoform 1 [Homo sapiens]
19.7
75.3
66%
203
30
nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 2 isoform B [Homo sapiens]
19.7
35.6
83%
203
31
nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 2 isoform C [Homo sapiens]
19.7
35.6
83%
203
32
protein transport protein Sec31A isoform 5 [Homo sapiens]
19.3
34.4
100%
272
Rank Descrição
Score Máximo
Cobertura
da Consulta
66%
E value
11
38
Protein TFG isoform 2 [Homo sapiens]
19.3
19.3
50%
272
45
19.3
30.5
75%
272
47
rho guanine nucleotide exchange factor 17 [Homo sapiens]
mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 2 [Homo sapiens]
19.3
19.3
50%
272
50
tumor necrosis factor alpha-induced protein 3 [Homo sapiens]
19.3
19.3
66%
272
82
A
B
C
D
E
F
Figura 35 - Alinhamento tridimensional do peptídeo F4 contra alvos selecionados.
83
6
DISCUSSÃO
A seguir será apresentada a discussão abordando as duas estratégias realizadas nesta
tese.
6.1 Estratégia 1: Sequências ligantes em linhagem celular HCC 1954
Aspectos relacionados ao processo de seleção por PD, ao peptídeo sintético como
potencial marcador de prognóstico e às análises in silico serão discutidos nesta seção.
6.1.1 A perda de variabilidade nos sucessivos ciclos de seleção
As bibliotecas apresentadas na superfície de fagos podem conter mais de um bilhão
de sequências de peptídeos aleatórios, sendo uma técnica eficiente na “sondagem” da
superfície de células malignas. Pressupõe-se que a técnica seja mais efetiva quando se
realiza vários ciclos de seleção no intuito de serem encontrados clones imunodominantes.
No estudo realizado por Li Zhong em 2008, utilizando como alvo anticorpos específicos de
câncer de mama, foram realizados quatro ciclos de seleção (ZHONG et al., 2008). Em
outro estudo, também foram realizados quatro ciclos de seleção (RIBEIRO et al., 2010).
Devido ao fato de as células hospedeiras infectadas e sua progênie produzirem
apenas 104-105 moléculas de fagos, a literatura recomenda a realização de mais de um ciclo
de seleção para que haja enriquecimento de um ligante específico além da seleção de fagos
não cognatos (SERGEEVA et al., 2006). Geralmente, a razão entre ligantes específicos e
não específicos após um ciclo de seleção, é inicialmente, de duas ou três ordens de
magnitude e é superada por ciclos de seleção sequenciais. Entretanto, sugere-se que o
aumento dos ciclos, também, significa perda da diversidade na população de fagos alvoespecíficos, gradual e desvantajosa em muitos casos.
Os resultados mostraram que a variabilidade dos peptídeos distintos foi diminuindo a
cada ciclo de seleção (85, 72 e 3, respectivamente). Este resultado é esperado porque a
placa de microtitulação possui uma capacidade de saturação limitada. Logo, já no primeiro
ciclo de seleção é de se esperar que ocorra uma redução drástica da variabilidade de
peptídeos disponíveis para o próximo ciclo. De fato, a redução no número de partículas foi
de 4x1010 para 103. Logo, a entrada para o segundo ciclo é de no máximo 103 peptídeos
distintos. Este processo de redução de variabilidade tende a continuar ocorrendo com o
84
passar dos ciclos. No caso do biopanning realizado nesta tese, para o terceiro ciclo a
variabilidade de entrada foi supostamente muito pequena, porque apenas 3 peptídeos
distintos foram selecionados.
Esta redução expressiva de variabilidade não necessariamente traz benefícios para a
seleção de peptídeos, pois apesar de o C195 selecionado no terceiro ciclo ter apresentado
uma boa especificidade e sensibilidade, não necessariamente estes resultados seriam
melhores do que outros peptídeos selecionados em ciclos anteriores. Foi mostrado que o
C341 selecionado no terceiro ciclo teve resultados de sensibilidade e especificidade piores
do que os clones C186 e C197 selecionados no segundo ciclo, conforme demonstração por
IHQ. Estes peptídeos C186 e C197 mostraram um expressivo nível de especificidade, pois
não marcaram nenhum caso de mama normal e nem casos com doença benigna da mama.
Sugere-se que estes peptídeos encontrados no segundo ciclo possam ser potenciais
biomarcadores teciduais para utilização em diagnósticos e em processos terapêuticos como
carreadores de drogas.
Foi verificado que os peptídeos obtidos no primeiro e segundo ciclo de seleção
apresentaram valores significativos de absorbância, o que levou ao questionamento de que
já no primeiro ciclo de seleção do biopanning é possível de ser obter peptídeos reativos.
No primeiro ciclo de seleção, 97% dos clones foram imunorreativos (relação de
absorbância HCC1954 / HCC1954BL maior que 1), no segundo ciclo 88% foram
imunorreativos e no terceiro ciclo 100% dos clones foram imunorreativos.
Além disso, o clone imunodominante com melhor comportamento (C195) obteve
uma baixa razão de reatividade (3,25) comparado aos clones mais reativos no primeiro
ciclo (12,22) e no segundo ciclo (18,9). Isto poderia ser um indicativo de que clones com
maior reatividade no ELISA nos primeiros e segundos ciclos de seleção poderiam ser
melhores que os imunodominantes do terceiro ciclo de seleção. Além do mais, a
absorbância mínima para controle (célula BL) é a metade no primeiro e segundo ciclo
(0,014) contra o terceiro ciclo (0,027). A absorbância máxima para o câncer (HCC 1954) é
maior nos primeiros e segundo ciclos (~1,15) contra (0,85) no terceiro. Estes resultados
podem ser um indicativo de que clones com maior reatividade no ELISA nos primeiros e
segundos ciclos de seleção poderiam ser melhores que os imunodominantes do terceiro
ciclo de seleção.
Entretanto, a seleção de peptídeos nos primeiros ciclos de seleção não é uma tarefa
trivial porque a variabilidade ainda pode ser muito elevada. Com o intuito de elaborar uma
85
proposta para lidar com a alta variabilidade dos ciclos iniciais de seleção, os resultados
apresentados nesta tese mostraram haver uma correlação entre a absorbância do clones
para células de câncer e células controle com a sensibilidade e especificidade. O clone do
segundo ciclo que marcou 100% de pacientes normais obteve a maior absorbância para
controle do segundo ciclo e esta foi mais que o dobro dos outros clones do segundo ciclo
que não marcaram nenhum paciente normal. O clone C195 do terceiro ciclo apresentou
sensibilidade maior que os outros clones deste ciclo e sua absorbância foi maior que a do
outro clone que apresentou alguma marcação na IHQ.
Logo, sugere-se como proposta realizar um pre-screening ELISA nos ciclos iniciais
do biopanning. Nos trabalhos atuais, este pre-screening ocorre somente no último ciclo de
seleção. Além disso, este pre-screening deve ter como critério de seleção um
balanceamento ótimo entre a escolha de altos valores de absorbância para casos e baixos
valores para controle. Cabe ressaltar que não necessariamente os resultados de absorbância
implicarão em melhores resultados em IHQ e IF uma vez que não houve uma validação em
escala estatisticamente significativa.
6.1.2 O peptídeo imunodominante SC195 como potencial marcador de prognóstico
Os fatores prognósticos atuais são incapazes de predizer a evolução da totalidade dos
pacientes, assim como os marcadores preditivos não conseguem evitar que grande parte
das pacientes com câncer de mama sejam submetidas a tratamento desnecessário. A busca
de outros marcadores tumorais, tanto prognósticos quanto preditivos tem sido alvo de
inúmeras pesquisas, que buscam predizer a evolução clínica de um número maior de
pacientes (PAIVA, 2008).
Estudos iniciais utilizando metodologia de cDNA microarray definiram subtipos
moleculares de câncer de mama com características clínicas distintas (PEROU et al., 2000;
SØRLIE et al., 2001; VAN'T VEER et al., 2002). O subtipo mama normal não tem
implicações práticas até o presente momento. Os subtipos luminais A e B apresentam
expressão do receptor de estrógeno e/ou do receptor de progesterona e evolução clínica
menos agressiva. É importante notar que o subtipo luminal A é classicamente o de melhor
prognóstico, com características de doença indolente e resposta aos agentes antihormonais.
O subtipo HER2 apresenta características agressivas e maior incidência de recorrência
local ou metástase à distância. Na última década os cânceres de mama subtipo HER2 vêm
aumentando sua sobrevida mediana, em função da disponibilidade de tratamentos mais
86
específicos, especialmente com a ampla utilização clínica do medicamento trastuzumabe,
cujo alvo molecular é o receptor de transmembrana HER2. O subtipo basalóide (basal-like)
tem também características agressivas e sobrevida significativamente menor. Uma das
dificuldades com este subtipo molecular é a ausência de tratamentos específicos
disponíveis. Baseado nos estudos iniciais com cDNA microarray, estudos posteriores com
utilização de imunohistoquímica puderam avaliar a associação dos referidos subtipos
genotípicos com perfis baseados em expressão protéica. Atualmente se aceita a definição
dos subtipos luminal (RE e/ou RP positivos), HER2 (RE e RP negativos com HER2+) e
triplo negativo (RE, RP e HER2 negativos) por padrões imunohistoquímicos como
similares aos baseados em metodologia de cDNA microarray. Em relação ao subtipo triplo
negativo, existem controvérsias sobre a necessidade de acréscimo de outros marcadores
para melhor definição prognóstica, como as citoqueratinas (CK) 5/6, P63 e EGFR.
O comportamento clínico do câncer de mama triplo negativo é classicamente mais
agressivo do que os demais tumores deste órgão, consequentemente, a sobrevida dessas
pacientes é inferior a da população geral das pacientes com essa patologia (SOTIRIOU et
al., 2003; NIELSEN et al., 2004) e semelhante àquela das pacientes portadoras de tumores
HER-2 positivos, a qual igualmente representa subtipo agressivo de neoplasia mamária
(ABD EL-REHIM et al., 2005). Além disso, esses tumores apresentam maior tendência por
tecidos e órgãos, sendo a ocorrência de metástases ósseas, muitas vezes, problema
secundário nesta doença. Essa maior tendência por envolvimento visceral (como de
pulmões e fígado) acompanha-se, segundo algumas séries recentes, de maior incidência de
metástases cerebrais neste grupo de tumores, fato que poderá ser importante em um futuro
próximo para estabelecer novas estratégias de estadiamento e, por conseguinte, de
tratamento dessas pacientes (IBRAHIM et al., 2008). A característica agressividade e a
tendência à disseminação sistêmica precoce desse tipo de neoplasia são bem ilustradas em
um estudo que avaliou a correlação entre o tamanho do tumor, o número de linfonodos
comprometidos e a incidência de metástases sistêmicas, mostrando que, para os tumores
triplo negativos, a correlação sequencial desses achados muitas vezes é rompida, sendo
frequente o achado de disseminação sistêmica em tumores pequenos, nos quais o
comprometimento linfonodal axilar está ausente ou ocorre de maneira pouco expressiva
(FOULKES et al., 2004). Essas características celulares agressivas são a provável
explicação para o frequente reconhecimento e o diagnóstico desse tipo de tumor no
intervalo entre as mamografias anuais (COLLETT et al., 2005).
87
O fato de ter sido encontrada marcação mais fraca em pacientes triplo negativos pode
ser um indicativo de que o marcador C195 esteja associado com os receptores uma vez que
os receptores hormonais são negativos.
O peptídeo selecionado e validado é um marcador ligante de tumor, podendo
funcionar como um anticorpo. Almeja-se identificar o seu ligante verdadeiro e determinar
a existência ou não de algum efeito neutralizante no tumor, como por exemplo, um efeito
terapêutico. Como projeto futuro, almeja-se utilizar uma linhagem celular agressiva e
injetá-la em camundongo e verificar se é possível bloqueá-la utilizando este peptídeo.
Outra perspectiva é aumentar a casuística realizando um Tissue Micro Array de
mama, com diferentes diagnósticos, desde mama normal, displasias, tumores in situ e
cânceres mais invasivos para confirmação dos resultados obtidos nesta tese. Este TMA já
foi confeccionado em colaboração com o Serviço de Patologia Investigativa do Hospital
ACCamargo utilizando 82 pacientes (câncer de mama, doença benigna da mama e
controle) que recorreram ao Serviço do Hospital de Clínicas da UFU. Estes experimentos
encontram-se em andamento.
6.1.3 Análise in silico de peptídeo selecionado
Os alinhamentos tridimensionais demonstraram uma viabilidade adequada para os
alvos obtidos a partir do BlastP. Os piores alinhamentos tridimensionais foram para
spindlin-2 e para o supressor de tumor BRCA2. O fato de o peptídeo C195 estar
relacionado a um gene supressor de tumor pode estar convergindo com os resultados da
imunofluorescência que apontaram o C195 como um marcador de melhor prognóstico,
uma vez que poderia estar havendo uma expressão insuficiente para suprimir o tumor,
porém suficiente para retardar o seu desenvolvimento. Outro supressor de tumor
encontrado foi o RBSP3, que apresentou um alinhamento tridimensional bem caracterizado
(GHOSH et al.).
Os resultados de imunohistoquímica apresentaram uma significativa marcação do
peptídeo na membrana celular. O melhor alinhamento pelo BlastP foi para uma proteína
codificada pelo gene KCNMA1, a qual se localiza na membrana celular (SU et al., 2004).
O segundo melhor alinhamento pelo BlastP também é uma proteína ligada a membrana
que é a neprilisina. Recentemente, a proteína codificada pelo gene TIAM1 foi relatada
como tendo uma região PH-CC-Ex, a qual media a ligação na membrana plasmática e em
proteínas de sinalização (TERAWAKI et al., 2010). Em todos estes casos, o alinhamento
88
tridimensional se mostrou significativo qualitativamente, o que reforça os achados
consistentes com a imunohistoquímica.
Uma possível alternativa é que o peptídeo C195 esteja relacionado com fosfatases,
uma vez que ocorreram dois alinhamentos para este tipo de proteína: a fosfatase de fosfato
inositol e a fosfatase CTD.
Quatro alvos relacionados ao peptídeo C195 estão relacionados com o prognóstico
do câncer de mama que são a neprisilina (SENGUL et al., 2010), a proteína do gene
RBSP3 (MITRA et al., 2010), a proteína do gene TIAM1 (XU et al., 2010) e a proteína 1
de ligação de mRNA do IGF-2 (GU et al., 2004).
Importante mencionar que o peptídeo (SC195) ligante de tecido pode ser mimético
de uma proteína que se liga à receptores ou à outras proteínas de ligação na superfície.
6.1.4 Considerações sobre o processo de seleção por phage display
As linhagens celulares HCC1954 e HCC1954 BL são células diferentes originárias
do mesmo paciente, sendo a primeira originária do tecido tumoral e a segunda originária
do sangue periférico. O marcador analisado pode ter apresentado reatividade com as
células normais do tecido mamário, uma vez que não foi realizada a subtração com as
células do tecido normal. De qualquer forma, o peptídeo imunodominante selecionado C195 apresentou valor prognóstico. A estratégia de subtração com tecido normal de outros
pacientes seria importante para assegurar maior especificidade na seleção de peptídeos,
eliminando potenciais peptídeos ligantes em tecidos normais.
Diversos tipos de tumores possuem muitos fatores (marcadores) comuns ou
processos tumorais similares, mas com ativações em tempos diferentes, e mesmo em
localizações diferentes, podem ter até funções semelhantes. Geralmente, estes marcadores
comuns são complementares a outros marcadores e ativados diferencialmente. Nem
sempre estão presentes em um determinado tipo de tumor em um determinado momento, o
que não significa que não tenham função. Logo, a análise de um determinado grupo de
pacientes pode ser influenciada por esta questão espaço-temporal.
Na comparação da imunohistoquímica do fago com a imunofluorescência do
peptídeo sintético observou um melhor comportamento do fago em relação à não marcação
de pacientes controle. Isto pode sugerir que o fago funcione como uma sonda por si só,
uma vez que o bacteriófago estabiliza uma conformação do peptídeo e provavelmente haja
uma ação cooperativa entre o fago e o peptídeo otimizando a identificação do sítio, sendo
89
assim há uma maior especificidade do ligante. Observa-se que o peptídeo isolado pode
apresentar uma ligação menos específica, devido a uma falta de conformação estrutural ou
falta do próprio ligante conformacional que é parte da pIII existente no fago. Entretanto, é
importante ressaltar que a técnica de imunohistoquímica foi realizada com marcação
de partículas de ouro coloidal, e para que o produto de reação pudesse ser observado, a
marcação precisa estar forte. Na imunofluorescência, qualquer sinal, por mais fraco que
seja, é perceptível. Desta forma, podemos dizer que a imunohistoquímica realizada foi de
certa forma menos sensível, pois somente apareceram as marcações mais fortes e mais
significativas. Os resultados da próxima seção na estratégia 2, de certa forma vão reforçar a
hipótese de que o fago realmente estabiliza a conformação do peptídeo.
6.2 Estratégia 2: Sequências miméticas em tecidos mamários
Nesta seção serão discutidas questões referentes à estratégia de seleção adotada, à
imunorreatividade dos marcadores selecionados em amostras de soro, às análises in silico,
à construção de um sensor eletroquímico utilizando um peptídeo sintético e à seleção de
um anticorpo scFv que reconheça fago e peptídeo sintético.
6.2.1 O impacto na seleção do biopanning com a utilização de vários grupos
Para o biopanning, utilizou-se a estratégia de seleção negativa para aumentar a
seleção de peptídeos ligantes a IgG associados ao tumor. Este tipo de seleção, já tem sido
desenvolvido por Mikhail Popkov et al. 2004, com o objetivo de remover a reação cruzada
com antígenos de clones comuns em phage display, em pesquisas de neurônios de rato
(HOU et al, 2004), de carcinoma hepatocelular metastática (JIA, 2006) e de câncer de
próstata (MINTZ et al, 2003). Este tipo de seleção prevê apenas uma “subtração” em um
grupo controle.
Neste estudo foi proposta uma nova abordagem onde ocorre a “subtração” em três
grupos controle e dois grupos com doença benigna da mama com a intenção de aumentar a
especificidade para o câncer de mama. Se por um lado esta estratégia tende a selecionar
peptídeos mais específicos para o câncer de mama, por outro lado ela poderia limitar a
variabilidade dos clones selecionados. Para evitar esta limitação de variabilidade foi
proposta a seleção de peptídeos utilizando 5 grupos de câncer de mama em cada ciclo de
seleção, onde potencialmente cada um dos grupos selecionaria clones distintos.
90
Os resultados mostraram que no terceiro ciclo foram obtidas 55 sequências distintas.
Isto comprova a efetividade da abordagem proposta na manutenção da variabilidade das
sequências obtidas, especialmente quando comparado com o biopanning da estratégia 1, o
qual selecionou apenas 3 sequências no terceiro ciclo.
6.2.2 Imunorreatividade em soro dos fagos recombinantes obtidos de tecido
É sabido que a biópsia do tecido é o modelo ideal para o estudo de biomarcadores.
No entanto, em termos de diagnóstico e prognóstico da doença, a utilização de testes
baseados em fluidos corporais humanos parece ser muito mais atrativa, visto que oferece
vantagens importantes, incluindo a pequena invasão, o custo mínimo e a facilidade da
coleta e processamento do material biológico. A análise do proteoma de fluidos corporais
se tornou uma das abordagens mais promissoras para a descoberta de biomarcadores para
doenças humanas (HU et al., 2006).
Os cinco fagos (peptídeos) que reconheceram IgG proveniente de tecido foram
validados em amostras de soro. Este fato pode ser verificado pela reatividade dos fagos nos
ensaios imunoenzimáticos com amostras de soro. Algumas hipóteses podem ser levantadas
a fim de se justificar a presença destes marcadores no soro dos pacientes, e uma delas é que
estes peptídeos podem ser ligantes de receptores solúveis que podem ser secretados
(OWEN-SCHAUB, 2001). Sugere-se que o anticorpo se liga a um receptor ou a uma
proteína de superfície e seja secretado. Outra hipótese é que ele seja um receptor solúvel
que sai da membrana e seja secretado, uma vez que existem estudos que apontam
receptores que podem ser secretados (ZUNT et al., ; JABLONSKA et al., 2001). Um
destes tipos de receptores, os sTLR, tem uma parte solúvel e é uma molécula circulante.
Além disso, existem vários CDs solúveis como por exemplo, o CD14 que é solúvel em
doenças infecciosas e é secretado (KITCHENS et al., 2001). A fim de se comprovar estas
hipóteses, uma alternativa é a caracterização dos fagos por espectrometria de massas para
se definir o ligante verdadeiro.
Os resultados demonstraram que o fago F4 foi o que demonstrou melhor
comportamento. Isto pode ser observado por uma maior área sob a curva ROC a qual teve
significância estatística. Cabe dizer que a área sob a curva não teve significância para os
fagos D11 e A7. A melhor sensibilidade e especificidade do fago F4 podem ser
comprovadas pela própria área sobre a curva.
91
O uso da metodologia de phage display para encontrar alvos ou ligantes tumorais tem
tido resultados promissores entre os pesquisadores. Zhong et al (2008), verificou que a
combinação de três tipos de peptídeos expressos pelos fagos apresentavam 80% de
sensibilidade e 100% especificidade na predição do estado da amostra, enquanto cada um
separadamente prediziam 77,0% de sensibilidade e especificidade de 82,8%, entre 87
amostras de pacientes e 87 amostras de controle. Tong et al (2008) encontraram fagos
ligantes a autoanticorpos em carcinoma e Ran et al (2008) relataram que auto-anticorpos
contra antígenos derivados de tecidos de câncer poderiam ser utilizados como marcadores
do soro para detecção de câncer de cólon. Neste sentido, optou-se por realizar a análise
agrupada dos quatro fagos F4, B1, C10 e D11 a fim de se verificar um aumento na acurácia
geral. A acurácia geral teve um aumento discreto e foi para 84,8%. A acurácia geral do
fago F4 foi de 79%. Esperava-se um aumento maior na acurácia geral, uma vez que a
literatura acima citada demonstra um aumento considerável na sensibilidade ao se agrupar
os marcadores. Foi possível verificar que os fagos combinados não estão contribuindo na
melhoria da acurácia geral, uma vez que eles apresentam um padrão de comportamento
semelhante, fato este observado na correlação realizada entre eles. Sugere-se que estes
fagos (peptídeos) por apresentarem o mesmo perfil possam estar envolvidos em uma
mesma via de sinalização ou que eles sejam fragmentos de um mesmo receptor ou ainda
que estejam envolvidos com níveis de expressão semelhantes.
Ao correlacionar os valores da absorbância dos fagos com os dados clínicos dos
pacientes não foi possível encontrar correlação.
O peptídeo sintético SF4 apresentou resultados um pouco inferiores aos resultados
obtidos quando o peptídeo F4 encontrava-se com o fago. Este fato pode ser comprovado
pela menor área sob a curva ROC. Sugere-se que o comportamento do peptídeo com o fago
seja superior uma vez que o bacteriófago estabiliza uma conformação do peptídeo e
provavelmente haja uma ação cooperativa entre o fago e o peptídeo otimizando a
identificação do sítio, sendo assim há uma maior especificidade do ligante. Em síntese,
pode ser observado que foram encontrados dois resultados do peptídeo, com e sem fago. O
resultado com o fago foi mais específico sugerindo que o mesmo pode ser usado como
uma sonda.
Entretanto, foram obtidos valores consideráveis de especificidade e sensibilidade para
o peptídeo sintético F4 (SF4). Sugere-se que o SF4 possa ser utilizado na triagem,
antecipando ou complementando a mamografia já realizada na rotina clínica. Foi possível
92
encontrar uma sensibilidade de 95% para o marcador SF4 com uma especificidade de
46,7%.
Em relação ao câncer de mama não existe um marcador definido para diagnóstico. O
CA-15.3 é um marcador sérico e o mais utilizado na prática clínica, mas é útil para avaliar
resposta ao tratamento e diagnosticar recorrência, mas não é útil para o diagnóstico.
Além do CA-15.3 e do CA-27 outros marcadores associados ao câncer de mama
foram identificados como os membros da família MAGE, NY-ESO-1, HER-2/neu, MUC1,
p53mutante, c-myc, BRCA1 e BRCA2 (ZHONG et al., 2008). Nenhum dos marcadores
citados anteriormente apresentaram comportamento melhor que o SF4. Por outro lado,
alguns estudos apontam uma limitação na aplicação clínica dos marcadores quando
analisados independentemente, mas quando utilizados em conjunto pode ser observado um
aumento nos valores para o diagnóstico. Sugere-se que o marcador SF4 possa ser utilizado
em conjunto com outros marcadores séricos para a avaliação dos pacientes com câncer de
mama, porém estudos prospectivos e com um maior número de pacientes em diferentes
estádios da doença são necessários.
Foi realizada a categorização dos pacientes com câncer de mama considerando
receptores de estrógeno, progesterona, HER2 e os diferentes diagnósticos de câncer
(câncer invasivo x câncer in situ), mas não foi encontrada diferença estatisticamente
significativa quando estes marcadores foram analisados. Este achado pode ser devido ao
fato de os grupos terem ficado muito pequenos quando se categorizou os mesmos. É
possível que o marcador possa estar relacionado com o prognóstico, porém é necessário
aumentar o tamanho da amostra e avaliar a evolução (sobrevida). Também é possível que
este marcador possa ser utilizado para triagem uma vez que a sensibilidade é bastante alta
(45% a 90% de especificidade) comparada à sensibilidade de outros marcadores da
literatura (15%-35%), mas para isto seria necessário um estudo com uma amostra com
melhor caracterização para câncer in situ (EGTM, 2009).
É conhecido que existem vários mecanismos tumorais de escape do sistema imune.
Um destes mecanismos é a indução de tolerância imunológica, sendo que um dos caminhos
que o tumor explora é o desvio do sistema imunológico (IGNEY e KRAMMER, 2002).
Neste desvio, a resposta imune é dirigida por uma resposta humoral Th2, em detrimento de
uma resposta Th1 que é conhecida por ser eficiente na rejeição tumoral por células T
(ZIEGLER et al., 2009). Na resposta Th2, há a secreção de IL-4, a qual estimula a
93
produção de linfócitos B e anticorpos e também há secreção de IL-5, a qual estimula a
multiplicação e diferenciação de linfócitos B e a produção de IgA e IgE.
Nossos resultados mostraram que o peptídeo SF4 tem um nível de especificidade
significativo nos casos de câncer, o que sugere que o mesmo esteja mimetizando um
antígeno associado ao tumor. Além disso, este antígeno está sendo reconhecido por IgGs,
em razão da metodologia proposta. Sugere-se assim que estes anticorpos tenham sido
produzidos por uma resposta Th2. Foi relatado que a partir de um antígeno que induz uma
resposta Th2, foi possível produzir células Th1 que foram imunocompetentes na proteção
tumoral. Estas células Th1 foram produzidas a partir de IL-4.knockout de camundongos
BALB/c (ZIEGLER et al., 2009). Sugere-se ainda que o antígeno mimetizado pelo
peptídeo SF4 seja circulante tanto em tecido quanto em soro e que esteja induzindo uma
resposta Th2 em ambos locais provavelmente provocando o escape imunológico.
Neste sentido, a técnica phage display poderá gerar biomarcadores específicos para
auxiliar no diagnóstico e no tratamento individualizado de cada paciente. É muito provável
que a análise do complexo conteúdo proteico de tecidos e diferentes fluidos biológicos
tenha, no futuro, um impacto significativo na avaliação e no diagnóstico do câncer.
6.2.3 Análise in silico de peptídeo selecionado
O melhor alinhamento listado pelo BlastP ocorreu para uma proteína quinase,
codificada a partir do gene TRIB3. As quinases modificam outras proteínas por meio de
fosforilação.
É interessante notar que outros alinhamentos ocorreram para quinases
(serino-treonina e MKs), indicando uma alternativa onde alguma proteína pode estar sendo
fosforilada e induzindo uma resposta imune. O alinhamento tridimensional mostrou
viabilidade para as diversas quinases analisadas. Na literatura já foi relatado como esta
quinase pode estar relacionada com câncer (BOWERS et al., 2003). O resultado de
alinhamento tridimensional se mostrou viável para este alvo.
Sugere-se que a alternativa para o peptídeo estar associado a uma proteína de ligação
metil-CpG seja menos provável porque a cobertura do peptídeo foi de apenas 50% e o
resultado do alinhamento tridimensional em uma proteína MeCP2 não foi bem
caracterizado. Na literatura foi reportado como esta proteína pode estar associada ao
câncer (CROWTHER-SWANEPOEL, 2010; XIAOFAN ZHANG et al., 2010).
94
Sugere-se ainda que o F4 esteja associado a um receptor de citocinas. Esta é uma
alternativa viável por estar relacionada à resposta imune e existem trabalhos que associam
este receptor ao câncer (UBERTI et al., 2010).
Outra alternativa apresentada é que o F4 pode estar associado a um enhancer para
produção de interleucina, o que pode ser uma hipótese viável uma vez que o F4 está
associado a uma resposta imune, além da cobertura de alinhamento do peptídeo ter sido de
100%. Houve viabilidade tridimensional para os enhancers de interleucinas.
Outra alternativa é que o F4 esteja associado a um fator nuclear de células T
ativadas, o qual está presente no citoplasma e se transloca para o núcleo mediante um
estímulo de receptor de células T. O complexo tem um papel central na indução de
transcrição gênica durante a resposta imune (MARCOULATOS et al., 1998).
Porém, para confirmar os achados citados anteriormente, uma alternativa é a
realização de espectrometria de massas para caracterização do(s) ligante(s) verdadeiro(s).
6.2.4 Viabilidade de desenvolvimento de sensor eletroquímico
Foi possível construir um sensor para câncer de mama sobre matriz polimérica de
poli ácido 3-hidroxifenilacético utilizando o peptídeo SF4 por meio de técnicas de EIE e
VPD. Este sensor discriminou corretamente uma amostra de IgG de paciente com câncer e
uma amostra de IgG normal. Este resultado abre uma perspectiva para validação em larga
escala da acurácia deste sensor. Espera-se que os resultados sejam pelo menos similares
aos resultados de curva ROC obtidos com os ensaios ELISA.
Uma vez que esta validação se mostre adequada, seria possível a transferência de
tecnologia para a produção em larga escala de um kit de baixo custo para diagnóstico,
porque os eletrodos podem ser integrados a chips microfabricados. Estes testes portáteis
poderiam ser incluídos na conduta clínica para prevenção secundária de câncer de mama
com impacto significativo na saúde pública.
6.2.5 Viabilidade para o uso de anticorpos scFv
A técnica de PD permite o desenvolvimento de anticorpos recombinantes anticâncer, mais comumente usados como moléculas scFv comercialmente convertidas como
moléculas inteiras (Single-Chain Variable Fragment), as quais podem ser modificadas para
aumentar sua afinidade e avidez e podem, ainda, ser conjugados com moléculas que
induzem diferentes efeitos antigênicos (BORYSOWSKI e GORSKI, 2004). Porém,
95
atualmente os anticorpos recombinantes disponíveis no mercado são obtidos a partir de
moléculas inteiras e muitos estudos ainda estão por vir a fim de possibilitar a inserção
destes anticorpos provenientes de moléculas scFv.
Os anticorpos representam uma ferramenta efetiva no âmbito da terapêutica e do
diagnóstico do câncer. Fragmentos de anticorpos recombinantes, tais como moléculas
scFvs, vêm se tornando uma alternativa ao uso de anticorpos monoclonais completos no
tratamento do câncer, uma vez que são menores, possuem algumas particularidades que
são vantajosas em certas aplicações clínicas, como por exemplo a grande variabilidade, sua
produção é mais econômica e são mais facilmente manipulados (WEISSER e HALL,
2009).
A seleção de anticorpos scFv pode trazer benefícios por um potencial aumento da
especificidade, podendo ser útil no diagnóstico, prognóstico e tratamento do câncer de
mama. No entanto, a seleção de anticorpos scFv que reconheça os peptídeos (fagos) não é
uma tarefa trivial. A estratégia utilizada nesta tese foi selecionar anticorpos scFv que
reconhecessem o fago F4 e o peptídeo sintético SF4 para identificar o antígeno verdadeiro
e para mapear os epítopos, utilizando as moléculas scFv selecionadas.
Nesta tese foi possível selecionar anticorpos scFv que se ligaram ao peptídeo F4
quando o mesmo encontrava-se na PIII do fago. Ou seja, o peptídeo F4 quando estava no
fago assumiu uma determinada conformação e conseguiu se ligar em uma molécula scFv.
A fim de comprovar se o anticorpo scFv reconhecia o peptídeo e não o fago, foram
realizados ensaios imunoenzimáticos utilizando o fago selvagem. Os nossos resultados
mostraram que os anticorpos selecionados reconheceram o fago com o peptídeo e não o
fago selvagem.
Nesta tese, também foi possível selecionar anticorpos scFv que reconheceram o
peptídeo sintético SF4. Neste sentido, quando o fago foi retirado, o peptídeo sintético
também assumiu uma conformação e se ligou ao anticorpo scFv. Deste modo, o anticorpo
se ligou a epítopos conformacionais conhecidos como mimetopos.
Os resultados mostraram que foi possível selecionar anticorpos monoclonais com
reatividade adequada o que abre uma perspectiva para posterior caracterização e validação
dos mesmos.
96
6.2.6 Considerações sobre a estratégia de seleção subtrativa em phage display
O uso da metodologia de PD para encontrar alvos ou ligantes tumorais tem tido
resultados entre outros pesquisadores. Zhong et al (2008), verificou que a combinação de
três tipos de peptídeos expressos pelos fagos apresentavam 80% de sensibilidade e 100%
especificidade na predição do estado da amostra, enquanto o cada um separadamente
prediziam 77,0% de sensibilidade e especificidade de 82,8%, entre 87 amostras de
pacientes e 87 amostras de controle. Tong et al (2008) encontrou fagos ligantes a
autoanticorpos em carcinoma e Ran et al (2008) relatou que autoanticorpos contra
antígenos de câncer poderiam ser utilizados como marcadores no soro para detecção de
câncer de cólon.
Na análise de combinação dos 5 peptídeos foi observado que não houve aumento
significativo na acurácia geral. Um estudo mais detalhado mostrou que não foi possível
obter melhoria na acurácia porque existiu uma correlação entre os 5 peptídeos para os
pacientes avaliados. Isto significa que os mesmos podem estar relacionados a uma mesma
via de sinalização molecular. Além disto, isto significa que a escolha de um número
pequeno de peptídeos mais reativos ao final do terceiro ciclo de seleção, apesar de ter
produzido bons resultados de acurácia isoladamente, não necessariamente pode trazer os
melhores resultados finais quando se deseja produzir uma combinação dos mesmos.
Entretanto, no terceiro ciclo de seleção foram obtidos 55 peptídeos distintos que poderiam
ter sido avaliados. Esta grande variabilidade encontrada no terceiro ciclo foi devido à
abordagem proposta neste trabalho e esta variabilidade poderia ter sido utilizada para
identificar peptídeos que não estivessem correlacionados entre si. A combinação de
peptídeos não correlacionados poderia ter produzido uma acurácia mais significativa do
que a que foi obtida.
De qualquer forma, cabe ressaltar que seria um esforço significativo obter os valores
de absorbância ELISA para 55 peptídeos em um número expressivo de pacientes. Uma
alternativa para diminuir este esforço seria, além da escolha dos peptídeos mais reativos, a
realização também da escolha aleatória de um número intermediário de peptídeos que não
fossem necessariamente os mais reativos.
97
7 Conclusão
A perda da variabilidade de peptídeos selecionados por phage display após o segundo
ciclo do biopanning é alta, levando à seleção de peptídeos imunodominantes com
aplicabilidade nem sempre efetiva. Entretanto, nos primeiros ciclos de seleção, a alta
variabilidade permite a escolha de peptídeos com reatividade semelhante ou maior do que
de peptídeos dos últimos ciclos. Este achado abre caminho para o estudo de novos alvos
biológicos mais eficazes.
O peptídeo SC195 selecionado a partir de uma uma linhagem celular bastante
agressiva se comportou de maneira consistente como um marcador de prognóstico, uma
vez que conseguiu separar casos do subtipo triplo negativo de casos do subtipo luminal.
Os peptídeos (fagos) presentes no segundo ciclo de seleção do biopanning de células
mostraram em análise imunohistoquímica um perfil de marcação na membrana celular,
sugerindo que os mesmos possam funcionar como potenciais carreadores de drogas,
abrindo uma potencial linha de investigação futura.
Foi possível selecionar um marcador ligante de IgG de tecido que foi detectado em
soro de pacientes com câncer de mama. Como recentemente tem sido demonstrado que
autoanticorpos presentes em soro tem um alto potencial diagnóstico, os resultados
encontrados sobre a viabilidade do uso deste marcador em diagnóstico estão compatíveis
com outros achados e, portanto demonstram uma direção consistente no trabalho.
O marcador SF4 ligante de IgG de tecido apresentou uma sensibilidade de 95% a uma
especificidade de 46,7% em amostras de soro de pacientes com câncer de mama, sugerindo
que o mesmo possa ser utilizado como um marcador de triagem para o câncer de mama.
O sensor para câncer de mama utilizando peptídeo sintético SF4 foi construído,
demonstrando a viabilidade de aplicação de diagnóstico com baixo custo.
Os achados in silico apontam que os peptídeos selecionados não necessariamente estão
mimetizando um único alvo, mas um conjunto de alvos mutuamente relacionados ao
desenvolvimento do câncer de mama.
Os anticorpos scFv ligantes aos peptídeos miméticos (contra fago e peptídeo sintético)
puderam ser selecionados, indicando a possibilidade de desenvolvimento de marcadores
com maior especificidade.
98
8 Anexos
8.1 Anexo I – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
99
100
8.2 Anexo II – Questionário Clínico
101
102
8.3 Anexo III – Aprovação do projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa
103
8.4 Anexo IV - Produto
DEPÓSITO DE PATENTE NO INPI EM 01/04/2011, SOB O NÚMERO
014110001064 :
MAIA, Y. C. P.; GOULART, L.R.; CAPPARELLI, F. E. ; MAIA, M. A.;
SIQUIEROLI, A. C. S.; ARAÚJO, T.G.; GOULART, L. T.; UEIRA-VIEIRA, C.;
FREITAS, R. N. Peptídeos ligantes à células específicas de Câncer de Mama e
aplicações. 2011.
104
9
Referências bibliográficas
ABD EL-REHIM, D. M. et al. High-throughput protein expression analysis using tissue
microarray technology of a large well-characterised series identifies biologically distinct
classes of breast cancer confirming recent cDNA expression analyses. International Journal
of Cancer, v. 116, n. 3, p. 340-50. 2005.
ARYA, S. K. et al. Recent advances in cholesterol biosensor. Biosensors and Bioelectronics,
v. 23, n., p. 1083–1100. 2008.
AUSTIN, P. Will dAbs challenge mAbs? Nature, v. 341, p. 484-485. 1989.
AVRAMIS, V. I. et al. Immunogenicity of Native or Pegylated E. coli and Erwinia
Asparaginases Assessed by ELISA and Surface Plasmon Resonance (SPR-Biacore) Assays of
IgG Antibodies (Ab) in Sera from Patients with Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL).
Anticancer Research, v. 29, n. 1, p. 299-302. 2009.
AZZAZY, H. M. e HIGHSMITH, W. E. J. R. Phage display technology: clinical applications
and recent innovations. Clinical Biochemistry, v. 35, p. 425-45. 2002.
BALKENHOHL, T. e LISDAT, F. An impedimetric immunosensor for the detection of
autoantibodies directed against gliadins. The Analyst, v. 132, p. 314–322. 2007.
BARBAS, C. F. et al. Phage Display. A laboratory manual. . New York: Cold Spring
Harbor Laboratory Press, v. 2001
BENHAR, I. Biotechnological applications of phage and cell display. Biotechnol Adv, v. 19,
p. 1-33. 2001.
BIRNBAUM, D. et al. Basal and luminal breast cancers: basic or luminous? International
Journal of Oncology, v. 25, p. 249-258. 2004.
BORYSOWSKI, J. e GORSKI, A. Phage-display technology and its application to
experimental. Oncology therapy, v. 58, p. 100-107. 2004.
BOWERS, A. J. et al. SKIP3, a novel Drosophila tribbles ortholog, is overexpressed in human
tumors and is regulated by hypoxia. Oncogene, v. 22, n. 18, p. 2823-35. 2003.
BOYLE, P. e LEVIN, B. World Cancer Report 150 cours Albert Thomas, 69372 Lyon
Cedex 08, France, p. 510. 2008
BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Ananalitical
Biochemistry, v. 72, p. 248-254. 1976.
BRADFORD, T. J. et al. Cancer immunomics: Using autoantibody signatures in the early
detection of prostate cancer. Urologic Oncology: Seminars and Original Investigations, v.
24, n. 3, p. 237–242. 2006.
105
BRASILEIRO FILHO, G. Bogliolo Patologia. Rio de Janeiro: Editora Guanabara Koogan
S.A., 2006.
BRITO-MADURRO, A. et al. Immobilization of purine bases on a poly-4-aminophenol
matrix. Journal of Materials Science, v. 42, n. 9, p. 3238-3243. 2007.
CALLAGY, G. et al. Molecular classification of breast cancers using tissue microarrays.
Diagnostic Molecular Pathology, v. 12, p. 27-34. 2003.
CANELLE, L. et al. A proteomic approach to investigate potential bioMarkers directed
against membrane-associated breast cancer proteins. Electrophoresis, v. 27, n. 8, p. 16091616. 2006.
CARON, M. et al. Cancer immunomics using autoantibody signatures for biomarker
discovery. Molecular Celular Proteomics, v. 6, n. 7, p. 1115-22. 2007.
CASIANO, C. A. et al. Tumor-associated Antigen Arrays for the Serological Diagnosis of
Cancer. Molecular & Cellular Proteomics, v. 5, n. 10, p. 1745-1759. 2006.
COLLETT, K. et al. A basal epithelial phenotype is more frequent in interval breast cancers
compared with screen detected tumors. Cancer Epidemiol Biomarkers Prevention, v. 14, n.
5, p. 1108-12. 2005.
CONROY, P. J. et al. Antibody production, design and use for biosensor-based applications.
Seminars in Cell & Developmental Biology. v. 20, n. 1, p. 10–26. 2009.
COOMBER, D. W. e WARD, R. L. Isolation of human antibodies against the central DNA
binding doMain of p53 from an individual with colorectal cancer using antibody phage
display. Clinical Cancer Research, v. 7, n. 9, p. 2802-2808. 2001.
COVINI, G. et al. Diversity of antinuclear antibody responses in hepatocellular carcinoma.
Journal of Hepatology, v. 26, n. 6, p. 1255-1265. 1997.
CRAWFORD, L. V. et al. Detection of antibodies against the cellular protein p53 in sera from
patients with breast cancer. International Journal of Cancer, v. 30, n. 4, p. 403-408. 1982.
CROWTHER-SWANEPOEL, D. Common variants at 2q37.3, 8q24.21, 15q21.3 and 16q24.1
influence chronic lymphocytic leukemia risk. Nature Genetics, v. 42, n. 2, p. 132-136. 2010.
CURIGLIANO, G. et al. Immunology and breast cancer: Therapeutic cancer vaccines. The
Breast, v. 16, p. 20-26. 2007.
DAMAZO, A. S. et al. Spatial and Temporal Profiles for Anti-Inflammatory Gene Expression
in Leukocytes during a Resolving Model of Peritonitis. Journal of Immunology
(Baltimore), v. 176, n. 7, p. 4410-4418. 2006.
DESPLANCQ, D. et al. Multimerization behaviour of single chain Fv variants for the tumourbinding antibody B72.3. Protein Engineering, v. 7, n., p. 1027-33. 1994.
106
DISIS, M. L. et al. High-titer HER-2/neu protein-specific antibody can be detected in patients
with early-stage breast cancer. Journal of Clinical Oncology, v. 15, n. 11, p. 3363-3367.
1997.
DUMITRESCU, R. G. e COTARLA, I. Understanding breast cancer risk - where do we stand
in 2005? Journal of Cellular and Molecular Medicine v. 9, n. 1, p. 208-221. 2005.
DUPONT, B. Introduction: current concepts in immunity to human cancer and therapeutic
antitumor vaccines. Immunology Review, v. 188, p. 5-8. 2002.
EGTM. Tumour markers in breast cancer - EGTM recommendations 2009.
FERREIRA, A. P. e TEIXEIRA, H. C. Tópicos de imunologia básica. Juiz de Fora, v. 2005
FORRESTER, S. et al. An experimental strategy for quantitative analysis of the humoral
immune response to prostate cancer antigens using natural protein microarrays. . Proteomics.
Weinheim, v. 1, n. 5, p. 494-505. 2007.
FOSSA, A. et al. Serological cloning of cancer/testis antigens expressed in prostate cancer
using cDNA phage surface display. Cancer Immunology, v. 53, n. 5, p. 431-438. 2004.
FOULKES, W. D. et al. The prognostic implication of the basal-like (cyclin E high/p27
low/p53+/glomeruloid- microvascular-proliferation+) phenotype of BRCA1-related breast
cancer. Cancer Research, v. 64, n. 3, p. 830-5. 2004.
FRANCO, D. L. et al. Electropolymerization of 3-aminophenol on carbon graphite surface:
Electric and morphologic properties. Materials Chemistry and Physics, v. 107, p. 404-409.
2008.
FRESCHI, A. P. P. e GOULART, L. R. Desenvolvimento de Aplicações Tecnológicas da
Metodologia de Phage Display no Diagnóstico do Câncer de Próstata. Instituto de
Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, 2007. 117 p.
GALANTE, P. A. F. et al. Distinct patterns of somatic alterations in a lymphoblastoid and a
tumor genome derived from the same individual. Nucleic Acids Research, April 14, 2011, p.
1-13. 2011.
GAZDAR, A. F. et al. Characterization of paired tumor and non-tumor cell lines established
from patients with breast cancer. International Journal of Cancer, v. 78, n. 6, p. 766-774.
1998.
GHOSH, A. et al. Frequent alterations of the candidate genes hMLH1, ITGA9 and RBSP3 in
early dysplastic lesions of head and neck: clinical and prognostic significance. Cancer
Science, v. 101, n. 6, p. 1511-1520.
GOULART, L. R. et al. Biomarkers for Serum Diagnosis of Infectious Diseases and Their
Potential Application in Novel Sensor Platforms. . Critical Reviews in Immunology, v. 30,
n. 2, p. 201-222. 2010.
GREENE, F. et al. AJCC cancer staging manual. New York, v. 2002
107
GU, L. et al. Increased expression of IGF II mRNA-binding protein 1 mRNA is associated
with an advanced clinical stage and poor prognosis in patients with ovarian cancer.
International Journal of Oncology, v. 24, n. 3, p. 2004.
GUSTERSON, B. A. et al. Basal cytokeratins and their relationship to the cellular origin and
functional classification of breast cancer. Breast Cancer Research and Treatment, v. 7, n.
4, p. 143-8 2005.
HANAHAN, D. e WEINBERG, R. A. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell, v.
144, p. 2011.
HANAHAN, D. et al. The hallmarks of cancer. Cell, v. 100, p. 57–70. 2000.
HANASH, S. Disease proteomics. Nature, v. 422, p. 226-232. 2003.
HANASH, S. M. et al. Mining the plasma proteome for cancer biomarkers. Nature, v. 452, p.
571-9. 2008.
HARRIS, L. et al. American Society of Clinical Oncology 2007 update of recommendations
for the use of tumor markers in breast cancer. Journal of Clinical Oncology, v. 25, p. 52875312. 2007.
HARTMAN, J. et al. Hes-6, an inhibitor of Hes-1, is regulated by 17beta-estradiol and
promotes breast cancer cell proliferation. Breast Cancer Research and Treatment, v. 11, n.
6, p. R29. 2009.
HEINZE, J. Electrochemistry of conductin ng polymers. Synthetic Metals, v. 43, p. 28052823. 1991.
HOLLIGER, P. et al. Crystal structure of the two Nterminal domains of g3p from filamentous
phage fd at 1.9 Å: Evidence for conformational lability. Journal of Molecular Biology v.
288, p. 649-657. 1999.
HOUGHTON, A. N. et al. Immunity against cancer: lessons learned from melanoma.
Current Opinion in Immunology v. 13, p. 134–140. 2001.
HOUSHMAND, H., G. Use of bacteriophage T7 displayed peptides for determination of
monoclonal antibody specificity and biosensor analysis of the binding reaction. Anal
Biochem, v. 268, p. 363-370. 1999.
HU, S. et al. Human body fluid proteome analysis. Proteomics, v. 6, p. 6326-53. 2006.
IBRAHIM, N. K. et al. A nomogram to predict subsequent brain metastasis in metastatic
breast cancer (MBC) patients. Journal of Clinical Oncology, v. 26, n. 15S, p. 1040. 2008.
IGNEY, F. H. e KRAMMER, P. H. Immune escape of tumors: apoptosis resistance and tumor
counterattack. Journal of Leukocyte Biology, v. 71, p. 907-920. 2002.
108
INCA. Estimativa 2010: incidência de câncer no Brasil Rio de Janeiro: Instituto Nacional de
Câncer, Brasil Ministério da Saúde: 98 p. 2009.
J LI, C. Z., Y BAI, D E WAZER, V BAND AND Q GAO. DSS1 is required for the stability
of BRCA2. Oncogene, v. 25, p. 1186–1194. 2006.
JABLONSKA, E. et al. TNF-alfa, IL-6 and Their Soluble Receptor Serum Levels and
Secretion by Neutrophils in Cancer Patients. Archivum Immunologiae et Therapiae
Experimentalis, v. 49, p. 63-69. 2001.
JÄGER, D. et al. Identification of a tissue-specific putative transcription factor in breast tissue
by serological screening of a breast cancer library. Cancer Research, v. 61, p. 2055-2061.
2001.
JAIYESIMI, I. A. et al. Use of tamoxifen for breast cancer: twenty-eight years later. Journal
of Clinical Oncology, v. 13, n. 2, p. 513-29. 1995.
JIANG, F. et al. Expression, purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of
human spindlin1, an ovarian cancer-related protein. Protein Pept. Lett, p. 2006.
JIANG, X. et al. Immunosensors for detection of pesticide residues. Biosensors and
Bioelectronics, v. 23, p. 1577–1587. 2008.
JOHNSTONE, A. e THORPE, R. Immunochemistry in practice Oxford and Boston and
Chicago, Ill. : Blackwell Scientific Publications 1987.
KITCHENS, R. L. et al. Plasma CD14 decreases monocyte responses to LPS by transferring
cell-bound LPS to plasma lipoproteins. Journal of Clinical Investigation, v. 108, p. 485–
493. 2001.
KORNEEVA, I. et al. Serum antibodies to the 27-kd heat shock protein in women with
gynecologic cancers. Am J Obstet Gynecol, v. 183, n. 1, p. 18-21. 2000.
KWON, Y. et al. Analysis of plausible downstream target genes of Hoxc8 in F9
teratocarcinoma cells. Putative downstream target genes of Hoxc8. Molecular Biology
Reports, v. 30, n. 3, p. 141-8. 2003.
LUPPA, P. B. et al. Immunosensors- principles and applications to clinical chemistry. Clinica
Chimica Acta, v. 314, n. 1, p. 2001.
MADRID, F. F. Autoantibodies in breast cancer sera: candidate bioMarkers and reporters of
tumorigenesis. Cancer Letters, v. 230, n. 2, p. 187-198. 2005.
MAIA, Y. C. P. Fatores clínicos, comportamentais, nutricionais, polimorfismo C677T do
gene da enzima metilenotetraidrofolato redutase (MTHFR) e risco de câncer de mama.
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto, Ouro
Preto, 2007. 141 p.
MARCOULATOS, P. et al. Mapping interleukin enhancer binding factor 3 gene (ILF3) to
human chromosome 19 (19q11-qter and 19p11-p13.1) by polymerase chain reaction
109
amplification of human-rodent somatic cell hybrid DNA templates. Journal Interferon
Cytokine Research, v. 18, n. 5, p. 351-355. 1998.
MAYROSE, I. et al. A graph-based algorithm for epitope mapping using combinatorial
phage-display libraries. Nucleic Acid Research, v. 35, n. 1, p. 69-78. 2007.
MCGUIREA, M. J. et al. Novel Ligands for Cancer Diagnosis: Selection of Peptide Ligands
for Identification and Isolation of B-Cell Lymphomas. Journal of Immunological Methods,
v. 34, n. 4, p. 443-452. 2006.
MCPHERSON, K. et al. ABC of breast deseases.Breast cancer-epidemiology, risk factors,
and genetics. British Medical Journal, v. 321, p. 624-8. 2000.
MESSING, J. New M13 vectors for cloning. Methods Enzymol v. 101, p. 20-78. 1983.
MILLER, A. J. et al. Transcriptional regulation of the melanoma prognostic marker
melastatin (TRPM1) by MITF in melanocytes and melanoma. Cancer Research, v. 64, n. 2,
p. 509-516. 2004.
MITRA, S. et al. RBSP3 is frequently altered in premalignant cervical lesions: clinical and
prognostic significance. Genes Chromosomes Cancer v. 49, n. 2, p. 155-170. 2010.
NAYAK, M. et al. Detection of microorganisms using biosensors- A smarter way towards
detection techniques. Biosensors and Bioelectronics, v. 25, p. 661-667. 2009.
NIELSEN, T. O. et al. Immunohistochemical and clinical characterization of the basal-like
subtype of invasive breast carcinoma. Clinical Cancer Research, v. 10, n. 16, p. 5367-74.
2004.
OLIVEIRA, R. M. L. et al. Electrochemical and morphological studies of an electroactive
material derived from 3-hydroxyphenylacetic acid: a new matrix for oligonucleotide
hybridization. Journal of Materials Science, v. 45, p. 475-482. 2010.
OWEN-SCHAUB, L. Soluble Fas and Cancer. Clinical Cancer Research, v. 7, p. 1108–
1109. 2001.
PADLAN, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Molecular Immunology, v. 31, p. 169217. 1994.
PAIVA, C. E. Avaliação da expressão dos genes TGFB1 e TGFBR2 em amostras de
carcinomas ductais invasivos Programa de Pós-Graduação em Patologia da Faculdade de
Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina de Botucatu,
Botucatu, 2008. 72 p.
PASSARELLA, R. J. et al. Recombinant Peptides as BioMarkers for Tumor Response to
Molecular Targeted Therapy. Clinical Cancer Research, v. 15, n. 20, p. 6421-6429. 2009.
PATWA, T. H. et al. The identification of phosphoglycerate kinase-1 and histone H4
autoantibodies in pancreatic cancer patient serum using a natural protein microarray.
Eletrophoresis. Weinheim, v. 30, n. 12, p. 2215 – 2226. 2009.
110
PAVONI, E. et al. New display vector reduces biological bias for expression of antibodies in
E. coli. Gene, v. 15, n. 391(1-2), p. 120-9. 2007.
PENG, H. et al. Conducting polymers for electrochemical DNA sensing. Biomaterials, v. 30,
p. 2132–2148. 2009.
PEROU, C. M. et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature, v. 406, p. 747–
752. 2000.
PETRACCI, E. et al. Risk Factor Modification and Projections of Absolute Breast Cancer
Risk. J Natl Cancer Inst, 2011.
PICCART-GEBHART, M. J. et al. Trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2positive breast cancer. New England Journal of Medicine, v. 353, n. 16, p. 1659-72. 2005.
POURNARAS, A. V. et al. Development of an impedimetric immunosensor based on
electropolymerized polytyramine films for the direct detection of Salmonella typhimurium in
pure cultures of type strains and inoculated real samples. Analytica Chimica Acta, v. 624, p.
301–307. 2008.
RAMANAVICIUS, A. et al. Electrochemical impedance spectroscopy of polypyrrole based
electrochemical immunosensor. Bioelectrochemistry, v. 79, n. 1, p. 11-16. 2009.
RIBEIRO, V. S. et al. Selection of high affinity peptide ligands for detection of circulating
antibodies in neurocysticercosis. Immunology Letters, v. 129, p. 94-99. 2010.
RUAN, C. et al. Immunobiosensor Chips for Detection of Escherichia coli O157:H7 Using
Electrochemical Impedance Spectroscopy. Analytical Chemistry, v. 74, p. 4814-4820. 2002.
SAMBROOK, J. et al. Molecular cloning: a laboratory manual, New York, v. 1989
SCANLAN, M. J. et al. Humoral immunity to human breast cancer: antigen definition and
quantitative analysis of mRNA expression. Cancer Immunology, v. 1, p. 4-20. 2001.
SCHEURLE, D. et al. Cancer gene discovery using digital differential display. Cancer
Research, v. 60, n. 15, p. 4037-4043. 2000.
SCHOUSBOE JT et al. Personalizing mammography by breast density and other risk factors
for breast cancer: analysis of health benefits and cost-effectiveness. Ann Intern Med, v. 155,
n. 1, p. 10-20. 2011.
SENGUL, D. et al. CD10 for the distinct differential diagnosis of basal cell carcinoma and
benign tumours of cutaneous appendages originating from hair follicle. Polish Journal of
Pathology, v. 61, n. 3, p. 140-146. 2010.
SERGEEVA, A. et al. Display technologies: application for the discovery of drug and gene
delivery agents. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 58, n. 15, p. 1622-1654. 2006.
111
SHARMA, S. K. et al. Biomolecules for development of biosensors and their applications.
Current Applied Physics, v. 3, p. 307-316. 2003.
SIDHU, S. S. e KOIDE, S. Phage display for engineering and analyzing protein interaction
interfaces. Current Opinion in Structural Biology, v. 17, p. 481-7. 2007.
SMITH, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned
antigens on the virion surface. Science, v. 228, p. 1315-1337. 1985.
SMYTH, M. J. et al. A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy. Nat
Immunol, v. 2, p. 293-299. 2001.
SØRLIE, T. et al. Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses
with clinical implications. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 98, n., p.
10869–10874. 2001.
SOTIRIOU, C. et al. Breast cancer classification and prognosis based on gene expression
profiles from a populationbased study. Proceedings of the National Academy of Sciences,
v. 100, n. 18, p. 10393-8. 2003.
SREEKUMAR, A. et al. Humoral immune response to alpha-methylacyl-CoA racemase and
prostate cancer. Journal of National Cancer Institute, v. 96, n. 11, p. 2004.
SU, A. et al. A gene atlas of the mouse and human protein-encoding transcriptomes.
Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 101, n. 16, p. 6062-7. 2004.
TAN, E. M. Autoantibodies as reporters identifying aberrant cellular mechanisms in
tumorigenesis. Journal of Clinical Investigation, v. 108, n. 10, p. 1411-1415. 2001.
TERAWAKI, S. et al. The PHCCEx domain of Tiam1/2 is a novel protein- and membranebinding module. EMBO J, v. 6, n. 29, p. 236-50. 2010.
THALER, M. et al. Biosensor analyses of serum autoantibodies: application to
antiphospholipid syndrome and systemic lupus erythematosus. Analytical and Bioanalytical
Chemistry, v. 393, p. 1417–1429. 2009.
UBERTI, B. et al. Inhibition of beta1 integrin and IL-3Rbeta common subunit interaction
hinders tumour angiogenesis. Oncogene, v. 29 n. 50, p. 6581-6590. 2010.
VAN'T VEER, L. J. et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast
cancer. Nature, v. 415, p. 530-536. 2002.
VELASQUEZ, E. F. et al. Clinical relevance of Neutral Endopeptidase (NEP/CD10) in
melanoma. Journal of Translational Medicine, v. 5, n. 2, p. 2007.
VOLLMERS, H. P. e BRÄNDLEIN, S. Natural antibodies and cancer. New Biotechnology,
v. 25, p. 294-98. 2009.
112
VON MENSDORFF-POUILLY, S. et al. Survival in early breast cancer patients is favorably
influenced by a natural humoral immune response to polymorphic epithelial mucin. Journal
of Clinical Oncology, v. 18, n. 3, p. 574-583. 2000.
WANG, K. et al. Identification of tumor-associated antigens by using SEREX in
hepatocellular carcinoma. Cancer Letters, v. 281, n. 2, p. 144-150. 2009.
WEISSER, N. E. e HALL, J. C. Applications of single-chain variable fragment antibodies in
therapeutics and diagnostics. Biotechnology Advances, v. 27, p. 502-20. 2009.
XIAOFAN ZHANG et al. MicroRNA-related genetic variations as predictors for risk of
second primary tumor and/or recurrence in patients with early-stage head and neck cancer.
Carcinogenesis, v. 31, n. 12, p. 2118-2123. 2010.
XIAOJU, W. et al. Autoantibody Signatures in Prostate Cancer. The New England Journal
of Medicine, v. 353, p. 1224-1335. 2005.
XU, K. et al. The role of fibroblast Tiam1 in tumor cell invasion and metastasis. Oncogene, v.
29, n. 50, p. 6533-6542. 2010.
YAGIHASHI, A. et al. Detection of autoantibodies to survivin and livin in sera from patients
with breast cancer. Clinica Chimica Acta, v. 362, n. 1-2, p. 125-130. 2005.
ZHONG, L. et al. Autoantibodies as potential biomarkers for breast cancer. Breast Cancer
Research and Treatment, v. 10, n. 3, p. 2008.
ZIEGLER, A. et al. EpCAM, a human tumor-associated antigen promotes Th2 development
and tumor immune evasion. Blood, v. 113, p. 3494-3502. 2009.
ZIMERING, M. B. e THAKKER-VARIA, S. Increased fibroblast growth factor-like
autoantibodies in serum from a subSet of patients with cancer-associated hypercalcemia. Life
Sciences, v. 71, n. 25, p. 2939–2959. 2002.
ZUNT, S. L. et al. Soluble forms of Toll-like receptor 4 are present in human saliva and
modulate tumour necrosis factor-a secretion by macrophage-like cells. Clinical and
Experimental Immunology, v. 156, p. 285-293.
113