Anais do IX Seminário de Iniciação Científica, VI Jornada de Pesquisa e Pós-Graduação
e Semana Nacional de Ciência e Tecnologia
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE GOIÁS
19 a 21 de outubro de 2011
DIVERSIDADE GENÉTICA EM POPULAÇÕES DE TUCUNARÉ AZUL
(CICHLA PIQUITI) NO RESERVATÓRIO DE SERRA DA MESA (NORTE DE
GOIÁS)
Ruan Carlos Pires Faquim (UEG)
Mariana Pires de Campos Telles (UFG)
Adriana Rosa Carvalho (UFRN)
Samantha Salomão Caramori (UEG)
[email protected]
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INTRODUÇÃO
As espécies de tucunaré (Cichla sp.) provenientes da Bacia Amazônica e do Rio
Tocantins-Araguaia são os maiores representantes deste grupo e apresentam grande
dispersão por todo território nacional em decorrência da sua introdução em várias áreas
das regiões tropicais e subtropicais. Sua entrada em regiões não naturais está
diretamente relacionada ao seu valor para a pesca esportiva (devido a sua agressividade
ao ser capturado) e para a piscicultura extensiva e semi-extensiva (GOMEIRO et al.,
2009).
Devido ao comportamento agressivo e territorialista, em especial em época
reprodutiva e por não ser uma espécie caracteristicamente migratória, é possível que
populações de lagos e rios apresentem separação genética, ainda que tenham alguma
conexão entre si (GOMEIRO et al., 2009). No entanto, até o momento são poucas as
informações sobre a movimentação natural das populações desta espécie em rios e lagos
(HOEINGHAUS, 2003).
A presença do tucunaré azul e amarelo no lago desde sua formação os tornou alvo de
pesca esportiva local. Mesmo existindo várias populações locais não se sabe se há
diferença genética dentro e entre as populações em decorrência da pesca e formação de
barreiras como consequência da inundação (CARVALHO et al., 2009).
A diminuição da variabilidade genética é o tema central na genética da conservação,
pois populações pequenas podem sofrer perda de diversidade genética, levando à
depressão por endogamia, perda de heterozigosidade e consequentemente de
adaptabilidade (ELLSTRAND & ELAM, 1993 AVISE, 1994). Portanto, a manutenção
da variabilidade genética é importante para a viabilidade dos programas de
recrutamento (sobrevivência dos peixes jovens no ambiente), a fim de evitar efeitos
adversos na ictiofauna (BARROSO et al., 2005; SIROL e BRITTO, 2006). Neste
contexto, o uso de marcadores moleculares como instrumentos eficientes para o
monitoramento genético é essencial para a conservação genética das populações
(SEKINO et al., 2002; ORTEGA-VILLAIZÁN et al., 2006)
Atualmente para este tipo de análise populacional, o estudo de regiões
microssatélites do DNA (por exemplo, GAGAGAGAGAGA), também conhecidos
como sequências simples repetitivas (SSR – Simple Sequence Repeats) ou curtas
repetições em tandem (STR – Short Tanden Repeats. Os microssatélites são sequências
normalmente não codificadoras e, em geral, muito pequenas, constituídas por motivos
compostos de um a seis nucleotídeos repetidos em série ao longo da fita de DNA (YUE
e ORBAN, 2002).
OBJETIVO GERAL
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O objetivo geral deste trabalho foi avaliar a magnitude e a distribuição da
variabilidade genética em sete subpopulações de Cichla piquiti (tucunaré azul) do
Reservatório de Serra da Mesa, norte do Estado de Goiás.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Os objetivos específicos foram:
i. Analisar a diversidade genética existente nas subpopulações amostradas ao longo
do Reservatório de Serra da Mesa-GO;
ii. Verificar se existe estruturação na variabilidade genética para as subpopulações
amostradas ao longo do Reservatório de Serra da Mesa-GO;
iii. Avaliar o nível de endogamia existente para a espécie Cichla piquiti (tucunaré
azul) nas subpopulações amostradas ao longo do Reservatório de Serra da Mesa-GO.
MATERIAL E MÉTODOS
Foram realizadas quatro amostragens durante o período de agosto de 2009 e
dezembro de 2010, com uso de redes com malhas de dez diferentes tamanhos: 2, 4; 3; 4;
5; 6; 7; 8; 10; 12 e 16 cm, com aproximadamente oito dias de duração para cada coleta.
A área de estudo foi dividida em sete pontos de coleta localizados em quatro rios
tributários no Reservatório de Serra da Mesa: Rio Bagagem, Rio Maranhão, Rio
Tocantinzinho e Rio Traíras.
Para cada um dos indivíduos capturados foi colhida uma amostra
de músculo situado na parte inferior da nadadeira dorsal. Estas estruturas foram
mantidas em etanol comercial 96% para melhor preservação do material genético
animal, seguindo PERIOTO (2004).
Metodologia para análise molecular
Foi extraído DNA de aproximadamente 1 cm3 de músculo dos indivíduos coletados a
partir material anteriormente conservado em etanol comercial 96% com utilização do
protocolo segundo TAGGART et al. (1992). Assim, para verificar a quantidade e
qualidade do DNA, o mesmo foi submetido a uma eletroforese em gel de agarose 1%,
com tampão TBE 1X (Tris, ácido bórico, EDTA), corado com brometo de etídio e
fotografado com utilização de luz UV. A eletroforese foi conduzida em 80 V por
aproximadamente 60 minutos em cuba horizontal.
Após encontrar a temperatura de anelamento ideal para cada um dos primers os 99
indivíduos foram analisados para obtenção dos resultados. As reações de PCR foram
submetidas à eletroforese vertical em gel de poliacrilamida 6% com a utilização de um
marcador Ladder 10bp (InvitrogenTM), que apresenta uma faixa de fragmentos de
tamanhos que variam entre 10 e 330pb, com intervalo de 10pb (pares de base). A
eletroforese foi realizada a 70 W com a variação entre 2 a 3 horas de acordo com a
altura do loco. Em seguida, os fragmentos foram submetidos a uma coloração em nitrato
de prata para a visualização dos alelos, seguindo o protocolo descrito por CRESTE et
al.(2001).
Caracterização dos polimorfismos por loco
Na realização das análises de variabilidade genética foram estimados os seguinte
parâmetros: frequência gênica(alélica), número de alelos por loco, heterozigosidade
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observada e esperada, pressupondo equilíbrio de Hardy-Weinberg, e índice de fixação(f)
conforme proposto por Weir & Cockerham(1984). Para testar os desvios do equilíbrio
de Hardy-Weinberg e das expectativas para o desequilíbrio de ligação foram realizados
testes baseados em randomização, com correção de Bonferroni(GOUDET et al., 1996).
Para tanto, foi utilizado o programa FSTAT 2.9.3.2(GOUDET, 2002).
Para obter informações sobre o poder de discriminação individual dos locos, as
probabilidades de identidade genética(I), que é a probabilidade de dois indivíduos
escolhidos aleatoriamente em uma população terem genótipos idênticos (PAETKAU, et
al., 1995) e de exclusão de paternidade(Q), que se refere à probabilidade de se excluir
uma falsa paternidade(WEIR, 1996), foram estimadas para cada loco polimórfico e para
o conjuntos de locos utilizando-se o programa Identity 1.0(WAGNER & SEFC, 1999).
Caracterização dos polimorfismos por população
Para avaliação da magnitude e na distribuição foram estimados os coeficientes F,
e f de Wright (1951), obtidos pela análise de variância das frequências alélicas(WEIR
& COCKERHAM, 1984). A significância estatística deste teste foi obtida a partir de
5.000 randomizações utilizando-se a correção de Bonferroni(GOUDET et al., 1996).
RESULTADOS
Dentre os dez locos padronizados, seis exibiram polimorfismo e quatro
apresentaram-se monomórficos para os 99 indivíduos analisados. Observou-se,
portanto, que quatro dos dez alelos analisados não são bons para analises genéticas
populacionais, por apresentarem-se monomórficos, o que não permite acessar a
informações sobre variabilidade diversidade genética. Nos dez locos foram encontrados
27 alelos, que variaram de um (Tuc 4, 8, 11 e 18) a cinco alelos (Tuc 5, 13 e 16), com
uma média igual a 2,7 alelos por loco. Os alelos apresentaram tamanhos que variaram
de 102 a 316 pares de base por loco.
A frequência alélica variou de 0,00505 a 0,94949. A heterozigosidade média
observada (Ho) e esperada (He), por loco foi igual a 0,143 e 0,17 respectivamente. As
médias das probabilidades combinadas de identidade (I) e de exclusão de paternidade
(Q) foram iguais a 0,81 e 0,052, respectivamente.
A partir da análise dos dez locos microssatélites para as sete subpopulações, pôde-se
verificar que existem frequências bem diferenciadas entre os alelos quando são
consideradas as sete populações. Assim, foi observada diferença significativa entre os
valores de Heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He) pelo equilíbrio de HardyWeinberg, resultando em valores de (f) positivos e significativos para as subpopulações,
com valores de p ≤ 0.00119, indicando que os alelos não estão seguindo as proporções
esperadas para o equilíbrio de Hardy-Weinberg em todos os locos, para as sete
populações.
Ao se observar os valores de F, que mensura a redução global (nas populações como
um todo) de heterozigotos devido ao acasalamento não aleatório entre as subpopulações
variou de -0,104 a 1, com uma média de 0,617 demonstrando que as populações estão
estruturadas entre si. Os valores de θ variaram entre 0,011 a 0,178, apresentando um
valor global igual a 0,0611. Essa análise mostra que cerca de 6% da variabilidade
genética está presente no componente entre subpopulações e, consequentemente, 94%
no componente intrapopulacional. Já os valores de f, variaram entre -0,134 a 1 com uma
média de 0,555.
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Os valores da heterozigosidade esperada (He) e observada (Ho) por população se
mostram diferentes, variando de 0,142 a 0,464 e entre 0 e 0,199, com medias de 0,254
e 0,0808 respectivamente. Ao observar o coeficiente de endogamia ( f ) por população
pode-se perceber que a população que apresenta menor valor de endogamia é a
população um com um valor de 0,439 enquanto a que apresenta maior valor é a
população seis com valor de f =1 e uma variação de dois alelos por loco (Tabela 6).
Os valores de Fst par a par, demonstram que as populações em sua maioria
apresentam ligações reprodutivas entre si, demonstrando que não estão isoladas uma das
outras devido a distância proporcionada pela grande amplitude do lago e dos pontos de
coleta. Das populações analisadas, as únicas que apresentaram valores significativos de
isolamento entre si foram as populações três e dois e três e seis. Para tal foram
considerados valores de significância p ≤ 0.002381.
DISCUSSÃO
De maneira geral esse conjunto de loco não demonstrou resultados satisfatórios
para as analises requeridas. Quatro dos dez primers apresentaram apenas alelos
monomórficos. Este fato só pode ser explicado devido ao pouco número de repetições
das regiões micros satélites, o que implica em baixo polimorfismo, visto que, para a
maioria das espécies estudadas o número médio de repetições em um loco é diretamente
proporcional ao grau de polimorfismo de comprimento, o que indica que em locos
longos a mutação é mais frequente que em locos curtos (HARR & SCHLOTTERER,
2000; ELLEGREN, 2000). Assim é compreensível, que mais unidades de repetição
apresentem mais oportunidades para que ocorra a mutação por derrapagem durante a
replicação (slippage) (ELLEGREN, 2004).
Os resultados mostraram, que estes não são um conjunto bom de locos para
exclusão de paternidade para estes indivíduos, pois os valores de Q variaram de 0,05 a
0,14. Assim, isto possibilita dizer, que quanto menor a probabilidade de exclusão, maior
será a probabilidade de parentesco entre os indivíduos das sete populações analisadas, o
que possivelmente é explicado pela descendência em comum entre elas ou efeito
fundador. Para I, o conjunto de locos apresentou valores de I(0,81) e os baixos valores
de Q(0,05), pois baixos números de alelos ou distribuição de frequência enviesada
tendem a representar baixos valores de heterozigosidade e consequentemente baixa
probabilidade de exclusão de paternidade e altos valores de probabilidade de identidade
(COLLEVATTI et al., 1999).
O valores do índice de fixação( f ) se mostraram significativos com valores de p ≤
0.00119 para seis das sete subpopulações,menos para subpopulação quatro, informando
que apenas 6% da diversidade ocorre entre as populações e 94% da diversidade ocorre
dentro das populações. Assim, mesmo que quase todos alelos estejam presentes em
todas as populações analisadas a variabilidade entre eles foi significativamente maior
dentro das populações do que entre elas, o que é possivelmente explicado por estas
serem descendentes de populações encontradas em um dos afluentes do reservatório
antes do represamento, conforme demonstrado pelo valor de F.
Os valores de F (Fit), informam que mesmo que os alelos estejam aleatoriamente
distribuídos entre as sete populações, não há uma estruturação da variabilidade genética
entre elas, indicando uma preferência dos espécimes pelo acasalamento intrapopulcional
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e não inter populacional nos sete pontos, como confirmado pelo baixo valor de θ
(0,0611).
Valores de heterozigosidade esperada (He) e observada (Ho) por população
evidenciam que a He foi maior que Ho, fator que pode ser explicado pelos altos valores
do coeficiente de endogamia dentro de cada uma das populações que variaram entre
0,439 a 1. Já os valores pouco significativos do Fst demonstram que as populações estão
em sua maioria interligadas entre si, não demonstrando isolamento reprodutivo para a
maioria das populações.
Para as populações de tucunaré analisadas, o isolamento não é observado de maneira
robusta ao ponto de não existir o cruzamento de indivíduos de populações distantes. O
fato pelo qual a comunidade de tucunarés azuis sofre uma pressão seletiva da pesca é o
tamanho dos indivíduos pescados, ocasionando diminuição do tamanho médio dos
indivíduos ao passar do anos. Segundo Schaefer(1954) a diminuição da densidade de
indivíduos adultos de grande porte tem como consequência um aumento da
sobrevivência de juvenis e adultos de menor porte, como fator de equilíbrio da
densidade populacional.
Assim, os dados para manejo de pescaria monoespecífica são bem mais conhecidos.
Segundo Beverton et. al. (1984) alguns fatores devem ser observados e trabalhados de
maneira imediata e a longo prazo. O manejo a longo prazo aplicado a uma só espécie
requer um grande volume de dados e que para um resultado de previsão a curto prazo
para melhoria do estoque em que se deseja trabalhar o recrutamento imediato de
indivíduos requeridos e volume da captura interferem diretamente nos resultados
esperados.
CONCLUSÕES
A variabilidade genética está fracamente estruturada entre as subpopulações
avaliadas de Cichla piquiti.
O índice de endogamia nas populações de Cichla piquiti aprestaram-se elevados.
As estruturação populacional é grande em cada uma das sete subpopulações,
demonstrado pelo alto nível de endogamia e preferência pela reprodução
intrapopulacional.
O isolamento genético entre as populações ocorre apenas entre três populações
distintas.
A necessidade de um manejo imediato é de fundamental importância assim
como um manejo a longo prazo para a espécie estudada.
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