UFRRJ
INSTITUTO DE ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
DISSERTAÇÃO
POLIMORFISMO E EXPRESSÃO DO GENE DA
CALPASTATINA (CAST) ASSOCIADOS A MACIEZ DA
CARNE EM CAPRINO (Capra hircus)
Odair Scatolin Rossafa Garcia
2012
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
POLIMORFISMO E EXPRESSÃO DO GENE DA CALPASTATINA
(CAST) ASSOCIADA À MACIEZ DA CARNE EM CAPRINO (Capra
hircus)
Odair Scatolin Rossafa Garcia
Sob a Orientação da Professora
Maria Amélia Menck Soares
Dissertação submetida como requisito
parcial para obtenção do grau de
Mestre em Zootecnia, no Programa de
Pós-Graduação em Zootecnia, Área de
Concentração Produção Animal
Seropédica-RJ
Dezembro - 2012
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE ZOOTECNIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
ODAIR SCATOLIN ROSSAFA GARCIA
Dissertação submetida como requisito parcial para obtenção do grau de Mestre em Ciências
no Programa de Pós-graduação em Zootecnia, área de Concentração em Produção Animal.
DISSERTAÇÃO APROVADA EM 04/12/2012
_______________________________________________
Maria Amélia Menck Soare Dr. UFRRJ
_______________________________________________
Eliane Gasparino Dr. UEM
_______________________________________________
Denise Monnerat Nogueira Dr. UFRRJ
DEDICATÓRIA
Dedico este estudo aos meus pais, Odair Visintin Rossafa Garcia e Vilma Scatolin Rossafa Garcia.
Mais em especial para minha avó Eucleidina que esse ano nos deixou e assumiu um lugar mais alto e
está olhando por todos nós.
"A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mais pensar o que ninguém
ainda pensou sobre aquilo que todo mundo vê”
Arthur Schopenhauer
AGRADECIMENTOS
A Deus, por me dar forças em todos os momentos de minha caminhada em busca dos
meus objetivos.
À Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (UFRRJ) e a Universidade Federal de
Viçosa (UFV) por me proporcionarem toda estrutura necessário para a concretização desse
trabalho.
Aos meus pais, Odair e Vilma, que mesmo distantes sempre estiveram do meu lado e
são os grandes responsáveis por esta conquista, e pela compreensão nos momentos de
dificuldades durante este percurso. Aos meus irmãos, Bruno e Mariana, por agüentarem meus
estresses e estarem sempre comigo partilhando cada um desses momentos difíceis.
À orientadora, Professora Dra. Maria Amélia Menck Soares, que além de me
transmitir todo o conhecimento necessário, me proporcionou os melhores anos de minha vida,
com muita amizade, paciência, compreensão e por sua brilhante orientação e acima de tudo
pelo companheirismo, pela cumplicidade para passar por essa difícil fase de nossas vidas
“Serotexas”.
Ao Professor Ph.D. Marcelo Teixeira Rodrigues, ao Mestrando Leonardo Ferreira e a
Doutoranda Adriana Bagatoli pela ajuda e importante participação para a concretização desse
projeto, bem como do incentivo e conhecimentos transmitidos.
À Professora Dr. Eliane Gasparino pelo auxílio nas interpretações e análises dos
resultados e a professora Dr. Denise Monnerat Nogueira pelos ensinamentos e trocas de
experiências e parcerias realizadas, ajudando a construir e concretizar esse meu sonho.
A toda equipe de trabalho, ao nosso grupo de pesquisa GEPGAD que proporcionaram
bom momentos de estudos e reflexões.
Aos amigos que colaboraram para o desenvolvimento desta etapa tão importante na
minha vida, Felipe, Iure, Fernando, Afonso, Vitor, Ramon, Joaquim, Ana entre outros. Em
especial, ao Professor Marco Mello ao Nosso técnico e amigo Francisco pelo companheirismo
e parcerias na realização desse sonho.
Aos meus amigos de hoje e sempre que fizeram parte da minha vida, aos meus amigos
de Santa Fé do Sul e Cascavel (José Eduardo, Jean, Breno, Tauan, Guilherme, Netão, Sergio,
Magrão, Wilson), que me motivaram a continuar em busca desta conquista, à todos os outros
que fizeram parte da minha vida, direta ou indiretamente, por me fazerem continuar e não
desistir mesmo com todas as dificuldades. Agradeço pelas risadas, por todos os momentos
juntos e principalmente pela amizade verdadeira.
Agradeço a todos os professores e à Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro,
que contribuíram para a minha formação acadêmica e pessoal e pelo incentivo a buscar mais
conhecimentos.
Aos meus colegas.
E a todos que contribuíram para que esse trabalho fosse realizado.
BIOGRAFIA
ODAIR SCATOLIN ROSSAFA GARCIA, filho de Odair Visintin Rossafa Garcia e
Vilma Machado Scatolin Rossafa Garcia, nasceu em São José do Rio Preto - SP, em 02 de
janeiro de 1988.
No ano de 2006 iniciou o Curso de Graduação em Bacharelado em Ciências Biológicas,
na Universidade Estadual do Oeste do Paraná, concluindo-o em dezembro de 2009.
Em Agosto de 2010, iniciou Mestrado em Zootecnia, Área de Concentração em
Produção Animal, na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 1
2 REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................... 3
2.1 Fatores que Influenciam na Escolha da Carne...................................................................... 3
2.2 Mecanismo de Amaciamento da Carne ................................................................................ 4
2.3 Lócus CAST Utilizado como Gene Candidato..................................................................... 6
2.4 PCR Quantitativo em Tempo Real ....................................................................................... 7
3 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................................... 9
3.1 Composição da Amostra e Abate dos Animais .................................................................... 9
3.2 Genotipagem dos Animais ................................................................................................. 10
3.2.1 Isolamento de DNA ........................................................................................................ 100
3.2.2 Amplificação de um Fragmento do Gene da Calpastatina ........................................... 100
3.2.3 Análise de PCR-RFLP ..................................................................................................... 11
3.3 Análise de Expressão Gênica ............................................................................................. 12
3.3.1 Extração do RNA total..................................................................................................... 12
3.3.2 Síntese de cDNA ............................................................................................................ 133
3.3.3 PCR Quantitativo em Tempo Real .................................................................................. 13
3.4 Análise Fenotípica .............................................................................................................. 14
3.4.1 Força de Cisalhamento. .................................................................................................. 14
3.5 Análise Estatística .............................................................................................................. 15
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................... 16
4.1 Desenvolvimento de Procedimento para a Genotipagem dos Animais .............................. 16
4.2 Análise Computacional das Seqüências ............................................................................. 19
4.3 Estudo das Variáveis Avaliadas ......................................................................................... 20
4.4 Análise de Expressão do gene CAST .................................................................................. 21
5 CONCLUSÕES ..................................................................................................................... 25
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................. 26
ÍNDICE DE TABELAS
Tabela 1. Seqüência dos primers e temperatura de anelamento para os genes CAST, BACT,
GAPDH e HMBS respectivamente. .......................................................................................... 14
Tabela 2. Grupos genéticos e número de representantes por grupo e por genótipo. ............... 19
Tabela 3. Valores de correlação de Pearson para as características de carcaça peso ao abate
(PA), peso de carcaça (PC), força de cisalhamento (FC) e nível de expressão da Calpastatina
(CALP) ..................................................................................................................................... 20
Tabela 4. Médias e desvios padrões para as variáveis estudadas para características. ............ 23
ÍNDICE DE FIGURAS
FIGURA 1. Gel de poliacrilamida a 15% corado com nitrato de prata. Primeira canaleta =
padrão de peso molecular de 50 pb (Ludwig Biotecnologia). Demais canaletas = animais de
diferentes genótipos, compreendendo os 3 grupos: A (banda altas), B (bandas baixas) e I
(bandas intermediarias)............................................................................................................. 16
FIGURA 2. Figura esquemática demonstrando o padrão de bandas dos alelos B e C. Em A:
fragmento de 249 pb simulando o corte do alelo C com a enzima BstUI. Em B: fragmento de
249 pb simulando o corte do alelo B pela enzima AcilI. .......................................................... 18
FIGURA 3 Curvas de dissociação (melting) obtida após a reação de qPCR, referente ao gene
da calpastatina (A) e referente a dissociação do gene da B-Actina (B). .................................. 22
FIGURA 4. Gráfico dos valores da expressão do gene CAST e força decisalhamento para os
grupos genéticos. CAST = Calpastatina; Fc = Força de cisalhamento..................................... 24
RESUMO:
GARCIA, Odair Scatolin Rossafa Garcia. Avaliação de polimorfismo e expressão do gene
da calpastatina (CAST) sobre a maciez da carne em caprino (Capra hircus). 2012. 33 p.
Dissertação (Mestrado em Zootecnia). Instituto de Zootecnia, Departamento de Genética,
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2012.
A calpastatina é um inibidor endógeno das calpaínas, cuja principal função é modular a ação
proteolítica destas enzimas responsáveis pelo enfraquecimento miofibrilar post-mortem. Em
caprinos são escassos os estudos envolvendo o gene que codifica a calpastatina (gene CAST),
embora já tenham sido relatodos sete alelos deste gene. Com este trabalho objetivou-se
avaliar a existência dos sete alelos já descritos do gene que codifica a calpastatina em um
rebanho experimental da espécie caprina (Capra hircus) e avaliar se há relação entre
diferentes genótipos com a expressão gênica e maciez da carne de cabritos. Para esta
finalidade, foram genotipados 40 cabritos das raças Saanen e Alpina, os quais foram abatidos
para as análises de expressão e maciez, utilizando-se o músculo longissimus dorsi para ambas
as análises. Para a genotipagem foi utilizada a técnica da reação em cadeia pela polimerase
(PCR) e posterior digestão dos fragmentos amplificados por enzimas de restrição, técnica
conhecida como PCR-RFLP. A expressão gênica foi conduzida utilizando a técnica de PCR
em Tempo Real (qPCR) e o fenótipo maciez da carne foi analisado em texturômetro. Os
dados foram analisados utilizando-se o procedimento GLM do SAS. O procedimento
UNIVARIATE foi utilizado para verificar a normalidade dos resíduos da expressão dos genes
em estudo (expressos com 2-∆Ct) e dados de maciez. Foi utilizado ANOVA com oito classes
de genótipos em um delineamento inteiramente casualizado. As médias foram comparadas
pelo teste de Tukey e as correlações de Pearson testadas pelo teste de t. Os dados são
sugestivos de que a expressão da calpastatina está negativamente corelacionada ao peso da
carcaça (p<0,1) e positivamente correlacionada com a força de cisalhamento do músculo
(p<0,05). Nas análises de genotipagem foi possível identificar seis dos sete alelos descritos na
literarura (alelo A, B, D, E, F e G, nas frequências de 0.43, 0.07, 0.05, 0.13, 0.15 e 0.1
respectivamente), sendo que nenhum animal portava o alelo C. Um possível novo alelo foi
identificado, sendo denominado de alelo H, com frenquência de 0.07 . Para as analises
estatísticas os genótipos foram agrupados (0= alelo desconhecido, 1=A/A e A/D, 2= A/E,
3=A/F, 4=A/G, 5= B/B, B/H e H/H, 6=D/D, D/E, E/E e EF e, 7= G/E e G/G. Os cabritos do
grupo sete apresentaram os maiores níveis de expressão do gene CAST no músculo (p<0,05).
Com este experimento, confirmou-se o que já havia sido observado em outras espécies de
animais domésticos: a maiores expressão do gene CAST está envolvida com a menor maciez
da carne caprina, indicando que este gene pode ser utilizado como marcador molecular para
maciez também nesta espécie.
PALAVRAS-CHAVE: Cabra, desenvolvimento muscular, marcador molecular, PCR em
tempo real.
ABSTRACT:
GARCIA, Odair Scatolin Rossafa Garcia. Evaluation of polymorphism and expression in
calpastatin gene (CAST) on meat tenderness in goats (Capra hircus). 2012. 33 p.
Dissertação (Mestrado em Zootecnia). Instituto de Zootecnia, Departamento de Genética,
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2012.
Calpastatin is an endogenous calpain inhibitor which main function is to module proteolysis
action of those enzymes responsible for the post-mortem myofibril deterioration. There are
few studies on gene encoding calpastatin (CAST) in goats, although it has reported the
existence of seven alleles of this gene. This work aimed to evaluate the existence of seven
alleles of the gene encoding the calpastatin in an experimental herd of goats (Capra hircus)
and assess whether there is a relationship between different genotypes with gene expression
and tenderness of meat goats. For this purpose, genotyping was performed on 40 Saanen and
Alpine animals, which were slaughtered for expression and softness analysis, using the
longissimus dorsi muscle in both analyzes. For genotyping was used polymerase chain
reaction (PCR) technique and subsequent digestion of amplified fragments by restriction
enzymes, a technique known as PCR-RFLP. The gene expression was conducted using the
Real Time PCR (qPCR) technique and phenotype tenderness was held in texturometer. Data
were analyzed using the GLM procedure of SAS. The univariate procedure was used to verify
the normality of the residuals of the expression of the genes under study (expressed with 2ΔCt) and tenderness data. ANOVA was used with eight classes of genotypes in a completely
randomized design. Means were compared by Tukey test and Pearson correlations tested by t
test. The data suggest that expression of calpastatin is negatively correlated of carcass weight
(p <0.1) and positively correlated with muscle shear force (p <0.05). In the analyzes of
genotyping was possible to identify six of the seven described alleles (allele A, B, D, E, F and
G at frequencies of 0.43, 0.07, 0.05, 0.13, 0.15 and 0.1 respectively), whereas no animals
carried the C allele. A possible new allele was identified, being named H allele in this work,
with 0.07 frequency. For the statistical analysis genotypes were grouped (allele 0 = unknown,
1 = A/A and A/D, 2 = A/E, 3 = A/F, 4 = A/G, 5 = B/B, B/H and H/H 6 = D/D, D/E, E/E, EF,
and 7 = G/E and G/G. The group 7 of goats showed higher levels of CAST gene expression in
muscle (p <0.05). With this work, it was confirmed what has been observed in other species
of domestic animals: the higher gene CAST expression is involved with less tenderness of
goat meat, indicating that this gene can be used as molecular marker for tenderness also in this
species.
KEYWORDS: goat, muscular development, molecular marker, real time PCR.
1 INTRODUÇÃO
A caprinocultura Brasileira está voltada principalmente para a produção de leite e os
animais adultos de descarte, juntamente com os machos jovens destes rebanhos, podem ser
terminados para o abate por proporcionar renda adicional ao produtor. Entretanto, a carcaça
destes animais apresentam, em geral, características inadequadas ao mercado consumidor.
Verifica-se também que alguns produtores realizam cruzamentos utilizando fêmeas de raças
leiteiras (Saanen ou Alpina) e machos de raças com aptidão para corte, em geral da raça Boer,
sendo que o leite destas fêmeas pode ser aproveitado normalmente e os machos jovens
mestiços são comercializados para o consumo de carne. Devido a qualidade de carne atribuída
à raça Bôer, os animais mestiços podem ser considerados de dupla aptidão.
Segundo Madruga (1999), a distribuição da gordura na carcaça caprina apresenta-se
bem diferente das outras espécies de ruminantes, como os ovinos, por exemplo. A gordura
subcutânea em caprinos é caracteristicamente muito fina, e a cavidade abdominal constitui o
principal depósito de gordura, sendo que 50 a 60% da gordura total estão localizados entre o
abdômen e as vísceras. Estas características tornam a carne caprina um produto desejável para
quem se preocupa com a redução de gordura de origem animal sem deixar de ingerir proteína.
Entretanto, alguns consumidores apresentam objeções quanto ao sabor característico da carne
de caprino adulto, que segundo Wong et al. (1975) se dá pela presença de alguns ácidos
graxos de cadeia ramificada contendo o grupo metil, como exemplo do ácido 4-metil
octanóico. Pike et al. (1973), relataram que a carne caprina teve aceitação inferior à carne
bovina e suína, quando se analisaram os aspectos de sabor e maciez. Kirton (1970),
comparando carne caprina e ovina de animais machos de diferentes idades de abate observou
que a preferência sensorial pela carne ovina se dá pela ausência de suculência na carne
caprina, atribuída ao baixo teor de gordura deste produto.
Os fatores que mais são levados em conta na escolha da carne são a cor, gordura
visível, preço e corte da carne. No entanto o fator mais relevante no momento do consumo é a
maciez seguida do sabor e suculência (Savell & Shanckelfod 1992). A relação preço e corte
da carne, duas características importantes no momento de adquirir a carne para o consumo,
estão diretamente associadas à maciez das peças, ou seja, cortes mais macios tendem a ter um
preço mais elevado (Igarasi et, al., 2008).
1
Na tentativa de predizer a maciez da carne, com maior precisão, pesquisadores em
ciência da carne vêm utilizando métodos instrumentais e testes sensoriais como provadores
treinados, para determinar com maior precisão as diferenças da maciez entre as amostras
(Wheeler, et. al,. 2004). Segundo Otremba et. al,. (1999), a avaliação sensorial da maciez da
carne depende de fatores como tipo de julgador, forma de preparação das amostras e tipo de
músculo utilizado. É importante frisar que há três tipos de julgador: o treinado, semitreinado e
consumidor, e que o método de cozimento e forma de preparação das amostras podem não
seguir os mesmos parâmetros de uma pesquisa para outra, podendo haver diferenças no
julgamento das avaliações sensoriais. Em pesquisas recentes Wheeler et. al., (2004),
concluíram que há grande variabilidade quanto a analise da maciez no julgamento de
consumidores não treinado em laboratório e que a variabilidade das análises diminuem
conforme aumenta as repetições dos teste com o consumidor.
A força de cisalhamento é considerada por vários autores como o método instrumental
mais eficiente na análise da maciez da carne. Wheeler et. al,. (1997) concluíram que a força
de cisalhamento é o método direto, para predizer a maciez da carne, sendo considerado mais
preciso quando comparados com outros métodos indiretos. Porem o mesmo relata que apesar
de ser o método mais preciso e mais utilizado há a necessidade de padronização do método
quanto aos parâmetros: orientação das fibras musculares, temperatura de resfriamento e
congelamento do bife, tempo que o mesmo fica fora do freezer antes da cozedura e qual o
método, taxa e grau de cozedura utilizados nas análises.
Todas as metodologias anteriormente citadas, para análise da característica de maciez
da carne, há a necessidade de realizar o abate do animal, perdendo assim a oportunidade de
preservar os animais com a característica desejada, os quais poderiam ser utilizados como
reprodutores. A genética molecular é uma ferramenta que permite predizer o potencial
genético do animal para as características de interesse comercial, como maciez, através da
seleção assistida por marcadores ou genes candidatos. Neste sentido, alguns genes estão sendo
avaliados em diferentes espécies de animais domésticos, como o gene da calpastatina, cujas
variações no DNA ou na expressão, estão sendo testadas para a qualidade de carne em gado
(Schenkel et al.; 2006), aves (Liu et al.; 2008), suíno (Ciobanu et al.; 2004) e ovino (Bagatoli
et al. 2011).
Javanmard et al. (2010), estimaram a freqüência de seis genes relacionados com
características de carcaça em caprinos na raça Bôer, dentre os quais, o gene que codifica a
2
calpastatina (CAST). Os autores encontraram apenas dois alelos deste gene, o que pode ser
explicado pelo processo de seleção artificial pelo qual esses animais vêm passando por
décadas, sendo possível a fixação de alguns alelos em detrimento de outros. Entretanto, em
submissão direta ao GenBank, Zhou e Hickford (2007) identificaram a existência de sete
alelos do gene CAST em caprinos. Os autores observam que estes alelos podem servir para
futuras pesquisas no que se refere a relação de algum destes alelos com a variação na maciez
da carne.
Com o presente estudo objetivou-se avaliar a existência dos sete alelos para o gene que
codifica a calpastatina em um rebanho experimental da espécie caprina (Capra hircus) e
associar a maciez da carne com os genótipos e expressão gênica em machos jovens entorno de
150 dias.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Fatores que Influenciam na Escolha da Carne
O mercado consumidor está cada vez mais exigente, forçando todas as linhas de
produções a passarem por melhorias para atenderem as demandas do mercado. A indústria da
carne também vem sofrendo vários avanços no processo de produção em busca de melhorias
que atendam ao mercado consumidor. Dentre essas melhorias, as mais citadas são as
características qualitativas da carne como sabor, maciez, suculência e cor da carne. Segundo
Felício (1993) as características da qualidade da carne podem ser divididas em quatros
categorias que vão de qualidade visual: aspectos que atraem ou repelem o consumidor na hora
da escolha da carne; qualidade gustativa: atributos que fazem com que o consumidor volte ou
não a adquirir o produto; qualidade nutricional: nutrientes que fazem com que o consumidor
crie uma imagem favorável ou desfavorável da carne como alimento compatível com suas
exigências para uma vida saudável, e por último, mas não menos importante, a segurança:
aspectos higiênico-sanitários e a presença ou não de contaminantes químicos.
Dentre tantas características que influem na qualidade da carne, a maciez vem
recebendo destaque, sendo considerada a principal característica organoléptica que leva a
satisfação do consumidor na hora de degustar o produto. A indústria da carne e pesquisadores
3
em ciência da carne vem promovendo pesquisas e mudanças com o intuito de padronizar um
produto com garantia de maciez e que atenda com satisfação as exigências dos consumidores
(Koohmaraie, 1995).
A causa da variabilidade da maciez da carne relaciona-se tanto com a constituição
genética do animal como com as variações do ambiente. Os processos ante e post-mortem
envolvem fatores que criam um balanço que resulta no fenótipo final de maciez. Isso ocorre
através de processos opostos que, ou são capazes de reduzir a maciez, como no complexo
actina-miosina e encurtamento do sarcômero pela ativação da calpastatina, ou são capazes de
aumentar, através da proteólise de proteínas miofibrilares pelo antagonismo das calpaínas
(Soria & Corva, 2004). Além disso, outras características podem afetar esse balanço da
maciez da carne, como os que ocorrem no processo ante-mortem, como a genética do animal,
idade, sexo, nutrição, e como os que ocorrem no processo post-mortem, devido ao rigor
mortis, por estimulação elétrica, esfriamento de carcaça, maturação, pH e cozimento. Essa
variação do fenótipo também está associada às diferenças entre e dentro das raças (Asghar &
Pearson, 1980).
2.2. Mecanismo de Amaciamento da Carne
Os processos fisiológicos post-mortem e relaciona-se a processos de rigidez cadavérica
e maturação. Tal processo só é possível pela presença de energia, ATP, e através de estímulos
que são ocasionados pela entrada de cálcio nas células. Desta maneira, após a morte do
animal, a musculatura entra num estado de contração irreversível, denominado de rigidez
cadavérica, ou rigor mortis. Ele só é interrompido quando as fontes de ATP e cálcio se
esgotam e ativam um complexo proteolítico que é responsável pela quebra dos miofilamentos
(Powers; Howley, 2000).
São conhecidos e descritos na literatura três tipos de sistemas enzimáticos
responsáveis pela proteólise dos componentes estruturais do músculo, transformando o em
carne: o sistema das catepsinas, o sistema enzimático das calpaínas e o complexo
multicatalítico de proteases (MCP), esse último é tido como o menos importante, pois tem sua
maior taxa de atividade preferencialmente em peptídeos, em pH neutro ou alcalino, e em
temperaturas de 45ºC (Koohmaraie, et. al 1992), características que fogem dos padrões atuais
4
de conservação da carne. Dentre os dois sistemas de proteases que são considerados no
processo post-mortem, um é classificado como proteases dependentes de cálcio, as calpaínas
(CAPN), e o outro como proteases lisossomais, como as catepsinas (CTS) (Johnson et al.,
1990).
As catepsinas são proteases que ficam armazenadas nos lisossomos e há algumas
controvérsias quanto a sua liberação e ação no processo post morten, havendo uma hipótese
de que essas enzimas sejam liberadas através da ruptura dos lisossomos para o citosol. No
entanto, LaCourte et. al., (1986), através de dados experimentais relatam que as catepsinas
ainda continuavam nos lisossomos 28 dias após o abate do animal e armazenamento da carne
a 4° C. Koohmaraie et. al., (1992), através de suas pesquisas, confirmam que as catepsinas
não tem um papel tão importante nas taxas de proteólises post morten. Já Alves et. al., (2005),
assume que as catepsina podem agir em efeito sinérgico com as calpaínas, e que as mesmas
atuam em pH mais baixos que as calpaínas e degradam não só proteínas miofribilares como
também exercem ação sobre as proteínas do tecido conjuntivo, como por exemplo o colágeno.
O sistema proteolítico enzimático das calpaínas é considerado o de maior relevância
no amaciamento da carne no processo post morten (Fortes, 2007). Goll et. at., (1992)
descrevem esse complexo como sendo responsável por cerca de 90% ou mais do
amaciamento da carne. As calpaínas constituem-se da μ-calpaína, m-calpaína e da calpaína
específica do músculo-esquelético (Geesink e Koohmaraie, 2006). A μ-calpaína, ou calpaína
do tipo I, requer baixas concentrações de cálcio e é ativada quando há uma diminuição de pH.
A m-calpaína, ou calpaína do tipo II, requer níveis mais elevados de cálcio (Volpelli et al.,
2004). Elas agem na degradação das proteínas miofibrilares e do citoesqueleto, conduzindo a
um aumento progressivo na maciez da carne (Chung et al., 2007), enfraquecendo a linha Z da
miofibrila (Andrighetto et al., 2006). Estes sistemas proteolíticos são avaliados
principalmente em músculo longissimus, que é o mais estudado por sua importância
econômica (Whipple e Koohmaraie, 1992).
Em estudos da utilização das calpaínas como gene candidato para maciez de carne,
White et. al., (2005) avaliaram uma região do gene da μ-calpaína, em que ocorre transição de
uma citosina por uma timina na posição 6545 do gene, localizada na região 3’ UTR. Casas et.
al., (2006) avaliaram a mesma região gênica da calpaina em três populações de bovinos e
relacionaram o polimorfismo com a força de cisalhamento, e observando que o alelo C estava
diretamente relacionado com a menor força de cisalhamento.
5
A calpastatina é um inibidor endógeno das calpaínas, cuja principal função é modular
a ação proteolítica destas enzimas responsáveis pelo enfraquecimento miofibrilar postmortem. Ela depende da presença de Ca2+ para se associar aos domínios da calpaína e inibir
sua atividade (Méndez, 2007). Segundo Goll et al. (2003), a calpastatina contém subunidades
A e C as quais se ligam aos domínios IV e VI da calpaína, respectivamente. A molécula de
calpastatina é descrita como uma estrutura de quatro seqüências repetidas e homólogas,
chamadas de domínios I, II, III e IV. Essas regiões são altamente conservadas dentro dos
domínios de 1-4 neste gene, sendo responsáveis pela inibição da atividade proteolítica da
calpaína. Cada domínio no gene apresenta uma capacidade diferente de inibir a µ- ou mcalpaína, seguindo uma ordem de eficiência, domínio I > domínio IV > domínio III > domínio
II. Nele também se encontra um domínio designado como L, possuindo uma região N
terminal alcalina. O domínio L sozinho não apresenta efeito inibitório, mas é importante por
regular os canais de cálcio pertencentes à membrana celular. Segundo Méndez, (2007), a
região N terminal, denominada XL, possui sítios para a fosforilação do AMP cíclico. Neste
sentido, o gene CAST pode ser considerado um gene candidato a exercer influência sobre a
maciez da carne devido a sua atuação na fibra muscular após a morte do animal, conforme
será explorado no tópico seguinte.
2.3 Lócus CAST Utilizado como Gene Candidato
Um gene candidato é um gene cujo produto está relacionado ao sistema biológico de
interesse. Segundo Supakorn (2009), os genes candidatos podem ser separados em seis
categorias econômicas, como características de crescimento, reprodutivo, carne, leite, lã e
resistência a doenças.
Alguns exemplos da utilização de genes candidatos relacionados às características de
interesse econômico na produção animal são; gene do halotano, envolvido com a qualidade da
carne em suínos (Culau et al., 2002) e o gene da miostatina, relacionada à qualidade da carne
e da carcaça, associado à formação de musculatura dupla em bovinos, ovinos e até mesmo em
aves e peixes (Teixeira et al., 2006). As mutações encontradas nos genes já são
comercializadas como marcadores moleculares com o objetivo de selecionar animais para
6
melhor maciez da carne, como é o exemplo da empresa australiana Pfizer, que faz o estudo
desses marcadores e dispõem para seus clientes as previsões genômicas para o rebanho.
No que se refere a característica de maciez da carne, Zhou e Hickford, (2007)
avaliaram a variação no éxon 6 do gene da calpastatina em ovinos, o maior exon (pb¿), e
descreveram diferentes formas alélicas neste lócus. As análises realizadas nestes alelos
revelaram que na proteína ocorreu substituição de um aminoácido na região correspondente,
onde a glicina foi substituída por uma leucina, sendo, um polimorfismo no domínio L da
proteína. O efeito da substituição de aminoácido sugere que a regulação da entrada de cálcio é
controlada por esta região, e é possível que isso afete a modulação da calpaína e
conseqüentemente altere o fenótipo de maciez da carne. A calpastatina cessa seus efeitos
somente quando a calpaína é esgotada ou o sistema enzimático é totalmente destruído. No que
se refere aos estudos em bovino, Bishop et al. (1993), localizaram o gene da calpastatina no
cromossomo 7 nesta espécie, posteriormente, Schenkel et al. (2006) relacionaram os efeitos
de polimorfismos no gene da calpastatina com características de qualidade de carne,
atribuindo ao alelo C maior maciez e maior produção de gordura na carne. Em suíno o gene
foi localizado no cromossomo 2 (Rettenberger et. al.; 1996), e segundo os resultados
encontrados em Ciobanu et al. (2004), o gene da calpastatina pode ser usado como gene
marcador para característica de qualidade de carne também nessa espécie, associando um de
seus alelos com maciez e suculência. Liu et al. (2008) estudaram o gene da calpastatina em
frangos, e relacionaram o polimorfismo nesse gene com as características das fibras
musculares, como densidade e diâmetro.
Em caprino, apesar de já terem sido identificados sete alelos no lócus da calpastatina,
não há dados que relacionem esses alelos à características de produção ou mesmo de
expressão, o que nos motivou a realizar essa avaliação.
2.4 PCR Quantitativo em Tempo Real
A amplificação gênica em tempo real trouxe grandes avanços no estudo de genes
expressos diferencialmente nos tecidos, em respostas a estímulos, auxiliando no entendimento
de processos biológicos, através da quantificação gênica. Segundo Heid, et al. (1996), até
7
mesmo quantidades mínimas de ácidos nucleicos podem ser percebidas nas amostras
biológicas.
Essa técnica é mais rápida e precisa do que a PCR convencional, pois permite
quantificar o material genético no momento da amplificação. Através da Transcrição Reversa
pela Reação em Cadeia da Polimerase (RT-PCR) e fluorescência é possível comparar
diferentes quantidades de RNA mensageiro (RNAm) sem a necessidade de um processamento
pós-PCR como por exemplo a eletroforese, o que torna as respostas quantitativas
correspondentes às respostas qualitativas (Bustin et al., 2005).
Dois métodos mais comumente usados para as análises do PCR quantitativo em tempo
real são de quantificação absoluta, que gera uma curva padrão relacionada ao sinal de PCR
que determina o número de cópias do transcrito de interesse, e de quantificação relativa, que
mostra a diferença de expressão entre a transcrição alvo do grupo de interesse e um grupo
controle ou referência (Livak & Schmittgen, 2001).
O primeiro passo para o início da reação da PCR quantitativa em tempo real é
converter uma molécula de RNA em um DNA complementar (cDNA), o qual é sintetizado a
partir de primers aleatórios, de oligo-dT, de primers específicos da sequência alvo ou de uma
combinação de primers aleatórios e oligo-dT (Bustin et al., 2005). A reação gera cópias de um
molde de DNA de forma exponencial, que é a chamada “fase de plateu”, e cada produto
destas reações irá gerar uma resposta diferente. Através desta razão será possível medir a
quantidade de produto da PCR. Durante a fase exponencial o método utiliza um sistema
fluorescente em plataforma capaz de detectar a luz oriunda da reação de amplificação. O sinal
de fluorescência é determinado por uma altura limiar em que todas as amostras serão
comparadas. O número de ciclos para a amplificação necessária que seja capaz de gerar esse
sinal de fluorescência em um limiar é determinado como “Ciclo Threshold”, ou Ct
(Ginzinger, 2002). Logo, quanto maior for a quantidade de cópias do transcrito alvo no início
da reação, menor serão o número de ciclos necessários para gerar um número alto de
amplicons e assim, com poucos ciclos de amplificação, a fluorescência atinge seu limiar de
detecção (Bustin et al., 2005).
Para quantificar essas mudanças relativas na expressão gênica é necessário utilizar
alguns métodos para determinar equações que validem as hipóteses. Um dos métodos
utilizado é o ΔCt, que determina o efeito do tratamento na expressão de um gene a partir de
um gene controle (Livak & Schmittgen, 2001).
8
Os genes de referência, geralmente um gene chamado de housekeeping (organizador
da casa), que são genes de manutenção da célula, são utilizados para minimizar o erro do PCR
em tempo real. A normalização destes genes controlam a entrada das quantidades de RNA na
transcrição reversa. Os mais comumente usados incluem a β-actina, gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase (GAPDH) e 18S do RNA ribossomal (Huggett et al., 2005).
Portanto, a identificação dos genes candidatos à maciez da carne, pelo estudo de
polimorfismo, de variação na expressão e associação destas variações com o fenótipo
desejado permitirá ampliar a compreensão sobre os processos fisiológicos o que auxiliará nas
estratégias voltadas ao melhoramento da característica de interesse tendo como consequência
o fenótipo final esperado.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Composição da Amostra e Abate dos Animais
Foram utilizados 40 machos jóvens (Capra hircus) de raças Saanen e Alpina, com
idade aproximada de 150 dias, alojados no setor de caprinocultura da Universidade Federal de
Viçosa-MG. Os animais foram mantidos em sistema de confinamento total (free stalls) e
alimentados inicialmente com leite em pó reconstituído e posteriormente com silagem de
milho e mistura concentrada para atender as necessidades nutricionais e ainda, com
fornecimento de água a vontade.
Para o abate, os animais permaneceram em jejum de dieta sólida por 12 horas, em
média, e foram pesados antes do abate. O abate foi realizado por meio de atordoamento
através de concussão cerebral seguido de sangria através da secção das veias jugular e
carótida. Imediatamente após o abate, amostras de tecido muscular (longíssimus dorsi) foi
coletado para as análises de expressão gênica e de força de cisalhamento.
9
3.2 Genotipagem dos Animais
3.2.1 Isolamento de DNA
Para a identificação dos alelos da calpastatina de cada animal, em data anterior ao
abate foram coletados aproximadamente 25 mL de sangue em tubos de vacuntainer estéreis
contendo EDTA 8% (ácido etilenodiamino tetra-acético). Os tubos contendo sangue foram
deixados em repouso, onde houve a formação de três fases: a primeira, contendo
principalmente as células vermelhas do sangue; a intermediária, contendo principalmente os
leucócitos e a fase superior, formada pelo plasma sanguíneo. A fase intermediária foi
transferida para tubos estéreis e utilizada para o isolamento de DNA.
O isolamento do DNA genômico foi realizado por purificação com o reagente
brometo de cetil trimetil amônio (CTAB) conforme tampão descrito em Lodhi et. al., (1994).
Foram adicionados a um tubo de 2mL cerca de 100μL de leucócitos e 500μL de tampão de
extração, e mantido em banho-maria à 65°C por uma hora até que o material fosse dissolvido.
Após esse processo foi feito o resfriamento do material a temperatura ambiente e adicionado
500μL de clorofórmio e álcool isoamílico (24:1) com vigorosas agitações até atingir uma
coloração esbranquiçada. Foi feita a centrifugação por 10 minutos a 10.000 rpm, a fase aquosa
foi transferida para tubos de 1,5 mL e adicionado 350 μL de isopropanol a 4°C e mantida por
30 minutos na geladeira para que ocorresse a precipitação do DNA. Posteriormente o material
foi centrifugado a 12.000 rpm por 20 minutos, o sobrenadante foi descartado e o pellet lavado
três vezes com etanol 75%. Após a lavagem foi retirado o etanol ficando somente o pellet no
tubo. Após a secagem do pellet, foi adicionado água ultra-pura e o DNA foi homogeneizado a
temperatura ambiente.
3.2.2 Amplificação de um Fragmento do Gene da Calpastatina
Para a amplificação da região do exons 6 do lócus CAST em caprinos, foi projetado
um par de primer com base na seqüência gênica disponível no GenBank (n° de acesso
EU128177), por intermédio do programa WebPrimers (http://yeastgenome.org/cgibin/web-
10
prime). As seqüências obtidas foram (direto 5 ' - GTT ATG AAT TGC TTT CTA CTC - 3 ' e
reverso 5 ' - ATA CGA TTG AGA GAC TTC AC - 3 ').
A obtenção das cópias do fragmento de interesse (amplificação do exon 6 do gene
CAST), foi realizada pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR). Cada tubo de
reação continha os seguintes reagentes: 0,5 pmoles de cada primers, 0,8 mM MgCl2, 400nM
de cada desoxirribonucleotídeo, 50 mM de KCl, 20 mM de Tris-HCl, uma unidade de Taq
DNA polimerase (Invitrogen), aproximadamente 100ng de amostras de DNA em volume
final de 20 μL. As reações foram conduzidas em termociclador da marca (LongGene®,
ModelMG96+) e consistiu de um passo inicial a 94°C por cinco minutos para que ocorresse a
desnaturação do DNA genômico, seguido por 35 ciclos que se repetiam da seguinte maneira:
94°C por 30 segundos para a abertura da fita molde de DNA, 61°C por 25 segundos, para que
ser efetuado o anelamento dos primers na região complementar, e 72°C por 25 segundos para
a extensão do fragmento pela taq DNApolimerase. A finalização da PCR se deu por um passo
a temperatura de 72°C durante 3 minutos.
Após a amplificação, o produto da PCR foi submetido à eletroforese a 160V (volts)
por uma hora e trinta minutos em gel de poliacrilamida 5% e corado com nitrato de prata
possibilitando a visualização dos fragmentos de DNA. Para a diferenciação dos fragmentos,
devidamente amplificados, foi realizada uma segunda eletroforese e gel de poliacrilamida
15% (corrida longa), em uma torre de eletroforese apresentando 38cm de altura por 16 horas a
160V e corado com nitrato de prata.
3.2.3 Análise de PCR-RFLP
A técnica da PCR, associada com a avaliação de polimorfismo nos fragmentos de
DNA obtidos por enzimas de restrição, também conhecida por PCR-RFLP (do inglês, PCR Restriction Fragment Length Polymorphism), consiste em submeter os fragmento
previamente amplificados por PCR à digestão com uma (ou mais) endonuclease de restrição,
capaz de reconhecer regiões especificas na fita de DNA clivando-a. Caso ocorra alterações em
seus sítio de corte, como, por exemplo, os polimorfismos de nucleotídeo único (SNP - do
inglês Single Nucleotide Polymorphism), as amostras de diferentes animais podem ser
11
diferenciadas pela ausência ou presença de polimorfismo, e através de eletroforese é possível
reconhecê-los.
Para a diferenciação dos sete alelos por ensaio de PCR-RFLP, foi necessário verificar
se
as
seqüência
disponíveis
no
GenBank
(www.ncbi.nlm.nih.gov:
EU128177
-
correspondendo ao alelo A; EU128178 - alelo B; EU128179 - alelo C; EU128180 - alelo D;
EU128181 - alelo E; EU128182 - alelo F e EU128183, correspondendo ao alelo G ), podiam
ser reconhecidos por diferentes enzimas de restrição. Esta avaliação foi realizada com o
auxilio do programa WebCutter (http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/), de acesso gratuito.
Depois de identificadas, as endonucleases selecionadas foram testadas com os
diferentes produtos de PCR seguindo as especificações recomendadas pelo fabricante,
conforme consta no folheto que acompanha cada enzima (HphI, AciI, BslI, BstUI - BioLabs).
Os produtos de digestão foram analisados em gel de poliacrilamida 10% corado com nitrato
de prata.
3.3 Análise de Expressão Gênica
3.3.1 Extração do RNA total
Para a o isolamento de amostras de RNA, logo após o abate, foi coletada uma pequena
quantidade, entorno de 0,1 grama, do tecido muscular longissimus dorsis, localizado acima da
décima segunda costela, transferido para tubos de polipropileno de 2,0 mL, estéreis e livres de
RNAse, contendo o reagente RNA-Holder (BioAgency), seguindo os valores de quantidades
indicados pelo fabricante. Os tubos foram deixados por um período de 6 horas a temperatura
ambiente, e após este período foram armazenados em freezer -20° C.
Para a extração do RNA total, as amostras de tecido foram trituradas com o auxílio de
pistilos devidamente lavados e autoclavados. O RNA foi extraído com uso do reagente
Trizol® (Invitrogen, Carlsbad CA, USA) de acordo com as normas do fabricante, na
proporção de 1 mL para cada 100 mg de tecido. Após a completa dissociação, foram
adicionados 200 µL de clorofórmio seguido de homogeneização manual por 1 minuto. Após a
centrifugação do material a 4ºC, durante 15 minutos a 12.000 rpm, a fase líquida foi
transferida para novos tubos onde adicionou-se 500 µL de isopropanol. Novamente o material
12
foi homogeneizado e centrifugado a 4ºC, durante 15 minutos a 12.000 rpm. O sobrenadante
foi descartado e o precipitado lavado com 1 mL de etanol 75%. Por último, a amostra foi
centrifugada novamente a 12.000 rpm por 5 minutos e após o descarte do sobrenadante, o
pellet foi deixado a temperatura ambiente por 15 minutos para completa evaporação do álcool
e, posteriormente, ressuspenso em água ultrapura livre de RNase.
A concentração foi mensurada via espectrofotômetro no comprimento de onda de 260
nm e a integridade do RNA foi avaliada em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídeo
visualizado em luz ultravioleta.
3.3.2 Síntese de cDNA
Para confecção do DNA complementar (cDNA) foi utilizado o kit SuperScripptTM III
First-Strand Syntesis Super Mix (Invitrogen Corporation, Brasil) de acordo com as normas do
fabricante. Em tubo estéril e RNA free foram adicionados 6 µL de RNA total, 1 µL de oligo
(dT) (50uM oligo(dT)20 e 1 µL de tampão de anelamento (Annealing buffer). As reações
foram incubadas por 5 minutos a 65ºC e então colocadas sobre o gelo por 1 minuto. Em
seguida, foram adicionados 10 µL de solução 2x First-Strand Reaction Mix e 2 µL de
solução contendo a enzima transcriptase reversa (SuperScript III - Invitrogen) e inibidor de
RNAse. A solução foi incubada por 50 minutos a 50ºC para a síntese do cDNA. A reação foi
então incubada por 5 minutos a 85ºC e imediatamente colocada sob o gelo. As amostras
foram armazenadas a -20ºC até o momento do uso.
3.3.3 PCR quantitativo em Tempo Real
Para as reações de PCR em tempo real foi utilizado o composto fluorescente SYBR
GREEN (SYBR® GREEN PCR Master Mix Applied Biosystems, USA), o qual, quando em
solução apresenta pouca fluorescência, mas durante os ciclos da PCR o acúmulo do corante
nas regiões específicas de ligação na dupla hélice faz com que a fluorescência aumente a cada
ciclo da reação, em razão direta a formação dos amplicons, podendo desta forma ser detectada
e quantificada. Os primers utilizados nas reações foram desenhados de acordo com a
seqüência do gene CAST disponível no GENBANCK (Tabela 1).
13
Foi testado como controle endógeno o gene que codifica a β-actina (BACT), o gene
que codifica o gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH), desenhados com o auxilio do
programa WebPrimers, e o gene que codifica o hidroximetilbilano sintase (HMBS ), extraídas
do trabalho de Péres et. al,. (2006), sendo que todas as análises foram realizadas em um
volume de 25 µL e em triplicatas.
Inicialmente foram feitas curvas de amplificação com quantidades conhecidas de
cDNA para determinar a eficiência de amplificação dos oligonucleotídeos e nível de
expressão de cada variante. É importante que todas as reações de PCR ocorram de forma
similar em condições ótimas. Para testar a eficiência de amplificação de cada um dos genes,
os resultados da reação (dados pelo valor de Ct) foram tabelados para os cálculos da equação
de regressão e do R-quadrado.
Tabela 1. Seqüência dos primers e temperatura de anelamento para os genes CAST, BACT, GAPDH e
HMBS respectivamente.
Gene
CAST
Primer
Direto: AAAGACCCAAGTCACAGGACGA
T0C de
Anelamento
Tamanho
Fragmento
60
64pb
Reverso: CAGTGGCAACAGCAGGAACA
β-ACT
Direto: ACCCAGATCATGTTTGAGACC
Reverso: TCCCCAGAGTCCATCACG
GAPDH
HMBS
95pb
60
Direto: TGGTCATAAGTCCCTCCACGAT
Reverso: CCACGAGAAGTATAACAACACC
60
121pb
Direto CTTTGGAGAGGAATGAAGTGG
Reverso: AATGGTGAAGCCAGGAGGAA
60
95pb
3.4 Análise Fenotípica
3.4.1 Força de Cisalhamento
Após o abate procedeu-se a esfola e a evisceração e posteriormente a carcaça quente
foi pesada e então refrigerada em câmara frigorífica (2 a 4 ºC) por 12 horas, ensacadas em
sacos plásticos e apoiada sobre estrados de madeira para que não corresse o risco de sofrerem
14
alterações nos dados de cisalhamento devido ao encurtamento das fibras, causada pelo frio.
Após este período, foi realizada a retirada do músculo Longissimus dorsis, com o auxílio de
bisturis. Os músculos foram identificados, embalados e congelados a –10ºC para posterior
análise.
Para a análise da força de cisalhamento do músculo, as amostras congeladas foram
cortadas, com o auxílio de uma serra elétrica, e retiradas três fatias de uma polegada de
espessura. O corte foi realizado perpendicularmente à orientação das fibras musculares. As
três fatias foram então descongelada a temperatura de refrigeração (4ºC), embaladas em papel
alumínio e mantidas em forno elétrico a 200º C até que a temperatura interna da amostra
atingisse 72º C. Após o cozimento, as amostras foram resfriadas em temperatura ambiente.
A força de cisalhamento foi mensurada com auxilio de um texturômetro, modelo
TAXT2 (Micro Stable Systems), acoplado a uma lâmina tipo Warner-Bratzler, sendo a
amostra cisalhada, transversalmente à direção das fibras musculares e os resultados das forças
foram expressos em quilogramas força (Kgf/cm2).
3.5 Análise Estatística
Para as análises estatísticas os genótipos foram agrupados da seguinte forma, 0= alelo
desconhecido, 1=A/A e A/D, 2= A/E, 3=A/F, 4=A/G, 5= B/B, B/raro e raro/raro, 6=D/D, D/E,
E/E e EF e, 7= G/E e G/G. Os dados foram analisados utilizando-se o procedimento GLM do
SAS. O procedimento UNIVARIATE foi utilizado para verificar a normalidade dos resíduos
da expressão dos genes em estudo (expressos com 2-∆Ct) e dados de produção. A
transformação logarítmica [ln(x+1)] (Vogel et. al., 2004) foi utilizada para o gene avaliado em
função do não atendimento às pressuposições de normalidade. Foi utilizado ANOVA com
nove classes de genótipos em um delineamento inteiramente casualizado. As médias foram
comparadas pelo teste de Tukey e as correlações de Pearson testadas pelo teste de t (P<0,05).
Modelo: Yij = μ + Gi + αij
Yij = variáveis dependentes (F.C, P.A, P.C, CAST)
μ = média do grupo
Gi = efeito das classes de gene (i = 0,1,2,3,4,5,6,7)
αij = erro aleatório associado a cada observação
15
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Desenvolvimento de Procedimento para a Genotipagem dos Animais
Dada a inexistência de protocolo disponível para a determinação dos genótipos dos
animais caprinos para os 7 alelos publicados no GenBank, uma das preocupações deste
trabalho foi estabelecer a técnica de PCR-RFLP para a determinação do genótipo de cada
animal. A avaliação inicial constou da separação dos fragmentos em gel de poliacrilamida na
concentração de 15%, o que possibilitou a observação de 3 grupos de tamanho: o grupo
denominado de bandas baixas compreendendo os alelos A (247pb), B e C (249pb), o grupo
intermediário compreendendo os alelos F e G com 252 e 253pb respectivamente e o grupo de
bandas altas compreendendo os alelos D e E com 259 e 260pb respectivamente (Figura 01).
Entretanto, a separação por tamanho não foi suficiente para especificar os alelos de mesmo
tamanho ou de tamanho semelhante.
Figura 1. Gel de poliacrilamida a 15% corado com nitrato de prata. Primeira canaleta = padrão de
peso molecular de 50 pb (Ludwig Biotecnologia). Demais canaletas = animais de diferentes
genótipos, compreendendo os 3 grupos: A (banda altas), B (bandas baixas) e I (bandas
intermediarias).
16
Os alelos foram identificados pela diferença de tamanho, entretanto os alelos B e C,
que apresentam o mesmo tamanho de fragmento (249pb), foram utilizadas as enzimas AciI
(sítio de reconhecimento = ccgc) e BstUI (sítio de reconhecimento = cgcg). A primeira
reconhece e corta apenas o alelo B, o que gera dois fragmentos, um com 189 pb e outro com
60 pb; a segunda reconhece e corta apenas o alelo C, o que também resulta na formação de
dois fragmento menores, um com 157 pb e outro com 92 pb. Como os tamanhos dos
fragmentos resultantes após o corte são diferentes, é possível distinguir um alelo do outro.
Como não foi observado nenhum alelo C, foi montado um esquema demonstrativo de como
estariam dispostas as bandas de ambos os alelos após o corte com as enzimas de restrição
mencionadas (figura 2). O alelo A (grupo das bandas baixas) não é reconhecido por nenhuma
das duas enzimas (AciI e BstUI).
Alem da identificação dos alelos descritos acima, foi possível utilizar ainda a enzima
de restrição HphI (sítio de reconhecimento = ggtga) que reconhece os alelos D e E dentre os
outros alelos. Como confirmação, a enzima de restrição BslI (sítio de reconhecimento =
ccnnnnnnnngg) pode ser utilizada, visto que a mesma reconhece todos os alelos menos os
alelos D e E.
Na fase de amplificação e separação dos grupos em bandas altas, intermediárias e
baixas, um dos fragmentos havia sido separado como pertencente ao grupo dos intermediários
F e G (252 e 253pb), porém ao expor a ação da enzima BslI que reconhece todos os alelos
menos D e E, o mesmo não sofreu corte. Para confirmar, foi realizada a digestão com a
enzima HphI que reconhece apenas os alelos D e E, entretanto, o fragmento continuou
íntegro, sem sofrer corte pela enzima, o que mostra uma diferença com relação aos alelos
divulgados por Zhou e Hickford (2007). Esta observação faz supor que um novo alelo foi
identificado pelo presente estudo, sendo necessário o seqüenciamento de bases para a
confirmação desta suposição. Este alelo, denominado neste trabalho como alelo H, apareceu 4
vezes em heterozigose e uma vez em homozigose. Além da característica maciez, este alelo
pode ser examinado como marcador para outras características relacionadas a crescimento,
peso ou demais características relacionadas ao desenvolvimento muscular.Não foi encontrado
nesse trabalho nenhum animal portando o alelo C (249pb).
17
Figura 2. Figura esquemática demonstrando o padrão de bandas dos alelos B e C. Em A: a primeira canalete esta
a representação do marcador de peso molecular de 50pb, seguido S/C = fragmento de PCR sem digestão
pela enzima BstUI; B/B = genótipo homozigoto para o alelo B que não apresenta a região de
reconhecimento pela enzima, B/C genótipo heterozigoto no qual a enzima só reconhece e cliva o alelo
C, originando 3 bandas, uma com 249pb (B) e outras 2 com 157 e 92pb (C) e por ultimo C/C genótipo
homozigo com a clivagem dos 2 alelos. Em B: as siglas tem o mesmo significado porem o alelo B é que
é clivado pela endonuclease originando 2 bandas menores com 189 e 60p.
Nas análises de genotipagem foi possível identificar seis dos sete alelos já descritos na
literatura, sendo que dos 40 cabritos avaliados, 37 puderam ter seus genótipos identificados
quanto ao lócus CAST. A freqüência alélica foi estimada por contagem direta, e o alelo mais
comum foi o alelo A, que apareceu com a frequência de 0,43. Os demais alelos apareceram
com frequências relativamente baixas: B (0,07), alelo C (0,00), alelo D (0,05), alelo E (0,13),
alelo F (0,15) e alelo G (0,1). O alelo H, identificado neste estudo pela primeira vez, apareceu
com uma frequência de 0,07. Maior número de animais genotipados será necessário para
confirmação destas frequências, inclusive em outras populações de caprinos no Brasil e ao
redor do mundo.
Após a identificação dos genótipos dos animais do experimento, foi necessário o
agrupamento em oito classes para melhor análise das associações dos genótipos com as
características avaliadas. Três animais não tiveram seus genótipos identificados por problemas
metodológicos e foram inseridos em uma classe denominada de DESC (desconhecidos)
(Tabela2). Estes animais não foram descartados das análises, pois as demais avaliações foram
realizadas (maciez da carne e dados de expressão gênica).
18
Tabela 2. Grupos genéticos e número de representantes por grupo e por genótipo.
Grupo
0
Genótipo 3 DES
Número
Total
3
1
2
3
4
5
6
7
6 A/A
1 A/D
4 A/E
10 A/F
4 A/G
1 B/B
3 B/H
1 H/H
1 D/D
1 D/E
1 E/E
1 E/F
1 G/G
2 G/E
7
4
10
4
5
4
3
4.2 Análise Computacional das Seqüências
Como análise do alinhamento da região gênica do lócus CAST em caprino com a
mesma região do exons 6 da em ovino (DQ414513.1) e bovino (EF443057), utilizando o
programa CLUSTALW (Thompson, et al. (1994), foi possível constatar que a região é bastante
conservada entre estas espécies, os alelos A, D, F e G mostraram 88,4% de similaridade a
seqüência EF443057 de bovino, enquanto os alelos B, C e E se mostraram 88% similar a
mesma região. Quando comparado as seqüências com a seqüência DQ414513.1 de ovinos, os
alelos F e G apresentaram 94% de similaridade, os alelos A, C, D e E 93,6% de similaridade
enquanto o alelo B apresentou 93,2% de similaridade com a mesma região. A análise
comparativa entre os alelos do gene da calpastatina em caprinos já havia sido realizada por
Zhou & Hichford, (2007) e constataram que a maioria das mutações do tipo SNP estão
situadas na região de intron, próxima a região receptora de splincing, o que pode ocasionar
variações no processamento do RNA e conseqüentemente na expressão da calpastatina. Ainda
os mesmo autores detectaram uma mutação do tipo SNP no exon 6, responsável pela alteração
do aminoácido serina por uma arginina no domínio L da proteína. Hao et. al., (2000) sugeriu
que a calpastatina tem a função de regulação dos canais de Ca2+ e que esta função é atribuída
ao domínio L. Portanto variações neste domínio pode ter impacto sobre a regulação na
atividade dos canais e conseqüentemente no processo proteolítico das calpaínas.
19
4.3 Estudo das Variáveis Avaliadas
O peso médio da carcaça foi de 13,67 kg, compatível com os valores encontrados em
carcaças caprinas do nordeste brasileiro que apresentam peso médio de 12,5 a 14 kg (Madruga
et. al., 1999), consideravelmente menores que o peso de carcaça relatados para cabritos
nativos da Flórida, onde o peso vivo varia de 21 a 24 kg, embora estes animais tenham sido
abatidos com 8 meses de idade (Harrelson et. al., 1995). O peso destes animais sugere que os
mesmos tiveram um desenvolvimento dentro do esperado, servindo para as estimativas de
maciez por estarem próximos ao peso ideal de abate.
Os dados de correlação mostram um valor alto e positivo entre o peso ao abate (PA) e
peso da carcaça (PC), de 0,85, o que seria esperado, visto que quanto maior o peso do animal
ao abate, maior também será o peso da carcaça, confirmando, inclusive, o que já havia sido
observado em outras espécies de animais de produção como suíno (Lindhoim-Perry et. al.,
2009). Outra correlação alta e positiva também foi observada entre a expressão do gene da
calpastatina e força de cisalhamento (FC). Ressalta-se, entretanto, que a calpastatina não é
única a interferir nesta característica e que o balanço entre as enzimas proteolíticas envolvidas
no processo de modificações após o abate do animal necessita de esclarecimentos. Assim, esta
possível relação precisa ser melhor investigada.
Tabela 3. Valores de correlação de Pearson para as características de peso ao abate (PA),
peso de carcaça (PC), força de cisalhamento (FC) e nível de expressão da Calpastatina
(CALP)
Característica s
PA
PC
FC
CALP
PA
1
PC
0,85006
(0,0075)*
1
FC
0,04621
(0,9135)
0,33062
(0,4238)
1
CALP
-0,33017
(0,4244)
-0,66670
(0,0710)
0,77136
(0,0250)*
1
*Teste de t (P<0,05)
20
4.4 Análise de Expressão do Gene CAST
Foi realizada uma primeira avaliação dos primer utilizando DNA genômico, extraído
das amostras de sangue, através da técnica de PCR e eletroforese em gel de poliacrilamida
12%, corado com nitrato de prata, para verificar se a amplificação correspondia ao tamanho
esperado e se não havia a amplificação de bandas inespecíficas. Nessa etapa o gene endógeno
HMBS foi descartado das análises de expressão, pois o mesmo apresentou 2 bandas
inespecíficas mais a banda com aproximadamente 95pb, correspondente a banda de interesse.
Para padronizar a reação e avaliar a eficiências dos genes endógenos GAPDH e BACT,
foram feitas curvas de amplificação com quantidades conhecidas de cDNA. Todas as reações
procederam com os mesmos parâmetros, de forma similar e em condições ótimas. Foi
analisado as variações dos CTs dentro das amostras (triplicata por individuo) e entre os
indivíduos para escolher o gene endógeno com a expressão mais constante, para ser utilizado
como gene controle nas reações. Para determinar a especificidade dos produtos da PCR
formados, foi feita uma curva de dissociação ou melting, realizada após a reação de qRTPCR. Essa curva avaliou a dissociação da dupla fita de DNA com o aumento da temperatura,
e o produto da reação é específico quando apenas uma única temperatura for encontrada
(figura 03). Assim, as reações não devem apresentar curvas de dissociação com picos de Tm
menores que o produto de PCR específico (formação de dímeros de primer) ou com mais de
um pico (formação de produtos não-específicos).
Tanto o gene da calpastatina quanto os dois genes endógenos (GAPDH e BACT),
apresentou um único pico para a curva de melting, o que confirmou não haver formação de
produtos inespecíficos ou dímeros de primers. Porem o gene GAPDH foi descartado da
análise, pois o mesmo não apresentou uma expressão constante para o tecido muscular. O que
corrobora com os resultados obtidos por Péres et. al., (2008), que avaliou a expressão de 10
genes utilizados como gene de referência em tecido muscular, e concluiu que o GAPDH não é
um bom gene para ser utilizado como gene de referência, enquanto os genes HMBS e BACT
se mostram constante para expressão no tecido muscular, sendo considerados genes estáveis.
Erknes, et al., (2006) também avaliou 10 genes endógenos utilizados como referencia em
pesquisas com músculos de suínos, e também concluiu que o gene que codifica a β-Actina é
um bom gene para ser usado como gene de referencia.
21
Figura 3 Curvas de dissociação (melting) obtida após a reação de qPCR, referente ao gene da calpastatina (A) e
referente a dissociação do gene da B-Actina (B).
Na tabela 4 está apresentado os valores médios ± desvio padrão das características de
força de cisalhamento (Kgf/cm2), peso ao abate (Kg), peso da carcaça (Kg) e expressão do
gene da Calpastatina (2ddCt) obtidos no estudo, em relação aos grupos de genótipos. Não foi
constatado nenhuma diferença estatística para as variáveis força de cisalhamento, peso ao
abate e peso da carcaça nos diferentes grupos genotípicos analisados.
22
Tabela 4. Médias e desvios padrões para as variáveis estudadas.
Variáveis
Genótipo
F.C
P.A
P.C
CAST
0
2,69 ± 0,52
28,66 ± 3,05
13,55 ± 1,27
3,56 ± 0,42b
1
2
2,84 ± 0,52
2,99 ± 0,35
28,71 ± 3,87
30,37 ± 4,02
13,65 ± 2,30
14,34 ± 1,46
3,73 ± 0,58b
3,39 ± 0,82b
3
4
5
3,02 ± 0,54
2,90 ± 0,32
2,84 ± 0,14
30,08 ± 4,15
30,12 ± 6,76
28,84 ± 2,76
13,96± 1,83
14,32 ± 2,76
13,26 ± 1,83
4,44 ± 0,50b
3,80 ± 0,69b
3,56 ± 0,83b
6
2,88 ± 0,66
27,00 ± 4,85
13,06 ± 3,06
3,62 ± 0,80b
7
3,29 ± 0,76
28,16 ± 3,33
12,57 ± 2,12
5,84 ± 0,96a
Média
2,93
29,16
13,67
3,74
Coef. Variação
17,21
14,50
15,57
18,09
P Valor
0,88
0,93
0,94
0,001
Médias (± erro padrão) seguidas de letras diferentes indicam que houve diferença pelo teste de Tukey (P <
0,05).
F.C = Força de cisalhamento (Kgf/cm2)
P.A = Peso ao abate (Kg)
P.C = Peso da carcaça (Kg)
CAST = Expressão do gene da calpastatina (2ddCt)
Através dessa análise foi possível observar que o grupo 7 foi o que apresentou a maior
taxa de expressão do gene da CAST, em relação aos outros grupos (p<0,05). Entretanto, a
inexistência de animais homozigotos para todos os alelos dificulta a interpretação adequada,
pois a interação entre os alelos pode estar ocorrendo em animais heterozigotos, o que deixa
margem de dúvida quanto ao afeito de cada alelo. Visto que o gene da calpastatina em caprino
apresenta um grande número de alelos, é difícil encontrar número suficiente de homozigotos
em populações onde os acasalamentos não são direcionados para se obter animais
homozigotos. Esta dificuldade pode ser superada pelo acasalamento de animais com
genótipos conhecidos para direcionar o surgimento de prole homozigota para os diferentes
alelos. Isto implica em maior tempo dedicado ao experimento, visto que inicialmente serão
necessárias análises de genotipagem dos parentais e cruzamento controlado. Após o
nascimento da prole, nova genotipagem deve ser realizada para a identificação dos genótipos
de interesse.
23
Figura 4. Gráfico dos valores da expressão do gene CAST e força decisalhamento para os grupos genéticos.
CAST = Calpastatina; Fc = Força de cisalhamento.
Os animais pertencentes ao grupo 7 foram os que apresentaram maior expressão do
gene CAST e conseqüentemente a maior força de cisalhamento. A maior expressão nesse
grupo pode estar relacionada com mutações no alelo G, mais precisamente no intron, que se
localiza próximo receptora de splincing, o que pode estar alterando e aumentando a expressão
do gene da calpastatina,ou até mesmo esse alelo pode estar em desequilíbrio de ligação com
algum outro fator que pode estar alterando a expressão do gene da calpastatina A força de
cisalhamento é o método instrumental mais utilizado e que melhor prediz as características de
maciez da carne (Wheeler et. al,. 1997). Os maiores níveis de expressão da calpastatina está
diretamente relacionado com o aumento da força de cisalhamento, que por sua vez resulta em
um maior grau de rigidez da carne. Essa correlação (maior expressão do gene CAST/maior o
valor da força de cisalhamento), se da pelo fato da calpastatina ser um inibidor endógeno das
calpaínas, assim quanto maior sua expressão maior sua ação inibitória sobre a calpaína e
menor a maciez do músculo (Wheeler et al., 1990; Shackelford et al., 1991).
24
5 CONCLUSÕES
Quanto a verificação de que os genótipos GG e GE podem ser utilizados como
marcador para a maior expressão do gene da Calpastatina em caprinos, estes resultados devem
ser interpretados com cautela por causa do tamanho relativamente pequeno de animais com os
mesmos genótipos ou pela existência de genótipos incomuns.
Todavia, a metodologia
descrita pela primeira vez neste trabalho, para a identificação dos alelos do gene CAST em
caprinos, representa um passo importante para a compreensão da influência destes nas
características relacionadas a qualidade de carne.
A verificação de que, também em caprinos, a maior expressão do gene que codifica a
calpastatina está relacionado À maior força de cisalhamento, está de acordo com os trabalhos
que relacionam este gene como marcador molecular para qualidade da carne em outras
espécies.
25
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