Gustavo Augusto Lacorte
CARACTERIZAÇÃO DOS
POLIMORFISMOS DGAT1 K232A E
DGAT1 VNTR EM RAÇAS BOVINAS
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado
em Genética do Instituto de Ciências Biológicas
da Universidade Federal de Minas Gerais, como
requisito parcial para a obtenção do título de
Mestre em Genética.
Linha de pesquisa: Genética de Caracteres
Complexos
Orientadora: Profa. Dra.Cleusa Graça da Fonseca
Co-orientador: Dr. Marco Antônio Machado
Belo Horizonte
Departamento de Biologia Geral
Instituto de Ciências Biológicas
2006
Dedico este trabalho a todas
aquelas pessoas que me
ajudaram até aqui por
simplesmente acreditar em
meu potencial.
2
Agradecimentos
Agradeço primeiramente a minha orientadora Cleusa Graça da Fonseca, ao
meu co-orientador Marco Antonio Machado e a todos os professores pelo apoio
teórico-prático tão importante neste período.
Também à todos os amigos e colegas da Embrapa Gado de Leite e UFMG
pelo suporte aos meus experimentos e análises.
À Fapemig pela bolsa de mestrado e ao CNPq pelo financiamento do
projeto.
Não menos importantes, aos meus amigos e familiares e noiva, pelo
suporte nos dias difíceis.
E em especial, três doutoras que tiveram um papel decisivo na conclusão
deste trabalho: Dra. Maria Gabriela, Dra Maria Raquel e Dra Daiane Laat.
3
Sumário
SUMÁRIO ..................................................................................................................................................4
LISTAS .......................................................................................................................................................5
LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................................................5
LISTA DE T ABELAS ...................................................................................................................................6
LISTA DE ABREVIATURAS .........................................................................................................................7
RESUMO....................................................................................................................................................8
ABSTRACT................................................................................................................................................9
1. INTRODUÇÃO ....................................................................................................................................10
1.1. AS RAÇAS ANALISADAS ..................................................................................................................10
1.1.1. Sistemática e origem da domesticação do gado zebu......................................................10
1.1.2. Características adaptativas do gado zebu ao ambiente tropical......................................11
1.1.3. O gado zebu na Índia e a sua introdução no Brasil...........................................................12
1.1.4. O rebanho zebu do Brasil....................................................................................................13
1.5.1. Raças zebuínas amostradas...............................................................................................14
1.5.1.1. A raça Nelore ...................................................................................................................14
1.5.1.2. A Raça Gir ........................................................................................................................14
1.5.1.3. A Raça Guzerá.................................................................................................................15
1.5.1.4. A Raça Sindi ....................................................................................................................16
1.5.2. Raça Taurina Amostrada: A Raça Holandesa ...................................................................17
1.2. G ENES CANDIDATOS E MELHORAMENTO GENÉTICO BOVINO ............................................................18
1.2.1. QTLs e MAS .........................................................................................................................18
1.2.2. Detecção de QTLs e Abordagens de Genes Candidatos.................................................19
1.3. O GENE CANDIDATO DGAT1 ..........................................................................................................21
1.4. ANALISES POPULACIONAIS DO GENE DGAT1 .................................................................................25
2. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................................................26
2.1. ANIMAIS AMOSTRADOS ...................................................................................................................26
2.2. G ENOTIPAGEM DO POLIMORFISMO DGAT1 K232A........................................................................26
2.3.GENOTIPAGEM DO POLIMORFISMO DGAT1 VNTR..........................................................................28
2.4. ANÁLISES POPULACIONAIS .............................................................................................................29
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO.........................................................................................................31
5. CONCLUSÕES ...................................................................................................................................41
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................................42
ANEXOS ...................................................................................... ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO.
4
Listas
Lista de Figuras
FIGURA 1. GEL DE POLIACRILAMIDA MOSTRANDO OS GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO DGAT1 K232A (KK,
AK E AA). COLUNAS: M: MARCADOR DE PESO MOLECULAR (100 PB); 01 A 12: AMOSTRAS; C:
CONTROLE POSITIVO (GENÓTIPO AA)...................................................................................................32
FIGURA 2. GEL DE POLIACRILAMIDA MOSTRANDO GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO DGAT1 VNTR. COLUNA
M: MARCADOR DE PESO MOLECULAR (50 BP); 01 A 20: AMOSTRAS E ABAIXO SEUS RESPECTIVOS
GENÓTIPOS; C1 E C2: CONTROLES POSITIVOS. ..................................................................................32
FIGURA 3. FREQÜÊNCIAS ALÉLICAS PARA O POLIMORFISMO DGAT1 K232A...................................................35
FIGURA 4. FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS DO POLIMORFISMO DGAT1 K232A ...................................................36
FIGURA 5. FREQÜÊNCIAS ALÉLICAS DO POLIMORFISMO DGAT1 VNTR ...........................................................35
FIGURA 6. FREQÜÊNCIAS GENOTÍPICAS DO POLIMORFISMO DGAT1 VNTR ....................................................37
FIGURA 7. DENDROGRAMA (UPGMA) BASEADO NAS DISTÂNCIAS GENÉTICAS DE NEI CALCULADAS A PARTIR
FREQÜÊNCIAS DOS POLIMORFISMOS DGAT1 K232A E DGAT1 VNTR..........................................40
FIGURA 8. DENDROGRAMA (UPGMA) BASEADO NAS DISTÂNCIAS DE NEI CALCULADAS A PARTIR DAS
FREQÜÊNCIAS DO POLIMORFIMO DGAT1 VNTR................................................................................40
5
Lista de Tabelas
TABELA 1. CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRAGEM. .......................................................................................26
TABELA 2. RELAÇÃO DOS OLIGOINICIADORES (PRIMERS) UTILIZADOS. .......................................................28
TABELA 3. FREQÜÊNCIAS ALÉLICAS E GENOTÍPICAS E HETEROZIGOSIDADE PARA O LÓCUS DGAT1 K232A.
..................................................................................................................................................34
TABELA 4. FREQÜÊNCIAS ALÉLICAS E GENOTÍPICAS E HETEROZIGOSIDADE PARA O LÓCUS DGAT1 VNTR.
..................................................................................................................................................35
TABELA 5. DISTÂNCIA GENÉTICA DE NEI (1972) CALCULADA A PARTIR DAS FREQÜÊNCIAS DOS
POLIMORFISMOS DGAT1 K232A E DGAT1 VNTR...................................................................39
TABELA 6. DISTÂNCIA GENÉTICA DE NEI (1972) CALCULADA A PARTIR DAS FREQÜÊNCIAS DO POLIMORFISMO
DGAT1 VNTR...........................................................................................................................39
6
Lista de Abreviaturas
ABCGIL
ABCBRH
ABCZ
ACAT1
ACAT2
ASA
ASBIA
ASSOGIR
bp
BTA
cM
DGAT1
DNA
DYD
EMBRAPA
EST
He
Ho
IBGE
MAS
MOET
Ne
PCR
PIB
QTL
SNP
UPGMA
USP-RP
VNTR
– Associação Brasileira dos Criadores de Gir Leiteiro
– Associação Brasileira dos Criadores de Bovinos da Raça Holandesa
– Associação Brasileira dos Criadores de Zebu
– Acil CoA: colesterol aciltransferase 1
– Acil CoA: colesterol aciltransferase 2
– Allele-specific amplification (Amplificação alelo-específica)
– Associação Brasileira de Inseminação Artificial
– Associação Brasileira dos Criadores de Gir
– base pair (par de bases)
– Bos Taurus Autosomic (Cromossomo Autossômico Bovino)
– Centimorgan
– Diacilglicerol aciltransferase 1
– Ácido desoxiribonucleico
– Daugther yield deviation
– Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
– Expressed sequence tags
– Heterozigosidade esperada
– Heterozigosidade observada
– Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
– Marker-assisted selection
– Multiple ovulation and embryo transference
– Número efetivo populacional
– Polymerase chain reaction
– Produto interno bruto
– Quantitative Trait Loci
– Single nucleotide polymorphism
– Unweighted Pair Group Method with Arithmetic
– Universidade de São Paulo – Ribeirão Preto
– Variable number of tandem repeats
7
Resumo
A identificação de QTLs e genes influenciam características de produção e
composição do leite têm sido o foco de vários estudos nos últimos anos. Vários
destes estudos têm confirmado a presença de um QTL na extremidade
centromérica do BTA14 e o gene acil-CoA: diacilglicerol aciltransferase 1 (DGAT1)
foi identificado como o mais provável responsável pela variação deste QTL.
Recentes estudos com populações de gado Holandês identificaram em DGAT1
duas regiões polimórficas com efeitos sobre a variação das características de
produção e composição do leite: DGAT1 K232A e DGAT1 VNTR. O objetivo do
presente trabalho foi estimar as freqüências alélicas e genotípicas destas duas
regiões em amostras de cinco raças bovinas brasileiras: Holandesa, Gir, Guzerá,
Sindi e Nelore. As freqüências alélicas do locus DGAT1 K232A foram de 27%,
96% e 2,5% para o alelo K nas raças Holandesa, Gir e Sindi, respectivamente. As
maostras das raças Nelore e Guzerá se mostraram monomórficas para este locus
(ausência do alelo A). O locus DGAT1 VNTR foi polimórfico em todas as raças
analisadas, apresentando um número total de seis alelos. O grau de polimorfismo
apresentado por DGAT1 VNTR suporta a possibilidade de futuros estudos de
associação entre os alelos deste locus e a variação de características de
produção, composição do leite e adaptação.
8
Abstract
The search for QTLs and genes that affect milk yield and composition traits has
been the aim of many studies in recent years. The presence of a QTL in the
centromeric region of BTA14 has been confirmed by these studies and the acylCoa: diacyl glycerol acyltransferase (DGAT1) gene was pointed out as a possible
source for variation in this QTL. In Holstein cattle populations, two polymorphic
regions of DGAT1, influencing milk production and composition, were identified:
DGAT1 K232A and DGAT1 VNTR. Estimates of allelic and genotypic frequencies
for these regions were obtained in samples of Holstein, Gyr, Guzerat, Red Sindhi
and Nellore Brazilian populations. Estimated frequencies of K variant were 27%,
96% and 97.5% for Holstein, Gyr and Red Sindhi cattle, respectively. Allele A was
absent in Guzerat and Nellore samples. A total of six alleles were detected in
DGAT1 VNTR and the five populations are polymorphic. Future association studies
among DGAT1 VNTR alleles and milk yield, milk composition and fitness traits are
recommended.
9
1. INTRODUÇÃO
1.1. As Raças Analisadas
1.1.1. Sistemática e origem da domesticação do gado zebu
A sistemática da tribo Bovini sempre foi alvo de grande controvérsia quanto
a organização do genero Bos. Baseado na morfologia e atualmente também por
alguns dados moleculares como alguns polimorfismos protéicos (Manwell e Baker,
1980) e polimorfismos em microssatélites autossômicos (MacHugh e cols., 1997),
o gado doméstico europeu (Bos taurus) e o indiano (Bos indicus) são
considerados como espécies distintas. Entretanto, mesmo agrupadas como
espécies distintas elas são perfeitamente fecundas entre si, dando suporte para a
classificação não como duas espécies, mas como duas sub-espécies: o Bos
taurus taurus e o Bos taurus indicus. Além disso, como não estão em vias de
especiação, o termo subespécie também não é o mais apropriado, sendo por esta
razão classificada como uma única espécie por Lineu em 1758 e mantida pela
Comissão Internacional de Nomenclatura Zoologica (2003) (Wilson e Reeder,
2005).
As relações entre estes dois tipos principais de bovinos têm sido
intensamente pesquisadas, com algumas hipóteses sobre sua domesticação
(MacHugh e cols., 1997). Uma das escolas acredita que a domesticação dos
bovinos ocorreu primordialmente a partir de um ancestral único, o auroque (Bos
primigenius primigenius), durante o período Neolítico recente, por comunidades
agrícolas do Oriente. A população de Bos indicus seria então originada
posteriormente através de seleção de animais taurinos (Epstein e Mason, 1984).
Uma visão alternativa considera que a domesticação das populações zebuínas
ocorreu independentemente da dos taurinos, por um grupo de pastores do
Neolítico que viviam na região do atual Paquistão. Uma sub-espécie de auroque
(Bos primigenius namadicus) seria o possível ancestral do gado zebu. Esta
10
interpretação é suportada por evidências arqueológicas e genéticas (Meadow,
1993; Loftus e cols., 1994; Bradley e cols., 1996).
1.1.2. Características adaptativas do gado zebu ao ambiente tropical
Os bovinos criados na região tropical apresentam uma ampla variação nos
índices de produtividade, sobrevivência e fertilidade quando se comparam os
grupos taurinos e zebuínos (Santos e cols., 2005).
De maneira geral, os animais de origem zebuína (Bos taurus indicus) se
adaptam melhor às condições tropicais, sendo mais resistentes ao estresse
térmico quando comparados aos de origem taurina, pois apresentam menor
tamanho, maior relação superfície de pele/tamanho corporal, mais glândulas
sudoríparas e menor termogênese (Brito e cols., 2002; Turner, 1980). Além da
menor resistencia ao estresse térmico, Nichi (2003) afirmou que reprodutores de
origem
taurina apresentam também menor fertilidade em condições tropicais,
sendo que um maior estresse oxidativo em nível testicular resulta em danos no
tecido testicular e nas células espermáticas e, consequentemente, em diminuição
da fertilidade. Rocha e cols. (1998) verificaram que altas temperaturas e umidade
resultaram em acentuado declínio na qualidade de oócitos recuperados de vacas
de origem taurina. Outro fator adaptativo dos animais de origem zebuína ao
ambiente tropical é a superior resistência a endo e ectoparasitos (Byford e cols.,
1976).
Por outro lado, segundo Nichi (2003), os animais de origem taurina
apresentam vantagens com relação aos zebuínos, sendo que as principais são a
maior precocidade, maior potencial de crescimento, melhor acabamento de
carcaça e maior produção de leite. Vale ressaltar que estas vantagens dos
animais taurinos sobre os zebuínos são observadas em ambientes temperados ou
que reproduzem as condições temperados, sendo o desempenho destes animais
muito dependente da sua interação com o ambiente no qual ele está inserido
(interação genótipo-ambiente).
11
1.1.3. O gado zebu na Índia e a sua introdução no Brasil
Como descrito por Santiago (1985), a palavra Zebu tem origem indiana e
significa “terra” ou “berço sagrado”, dada a importância religiosa dos bovinos
naquele país. Para a ciência, a história do gado Zebu se inicia no vale do Indo por
volta de 3000 A.C. Nos anos de 1500 A.C., em virtude da invasão dos arianos, a
Índia desenvolveu uma civilização baseada no sistema de castas e para evitar
conflitos com os vizinhos da região, cada marajá adotava um gado diferente e ao
longo dos anos este gado foi se agrupando e formando as mais de 50 raças já
descritas.
Os primeiros autores que descreveram os zebuínos tomaram por base os
rebanhos encontrados nas províncias e numerosos distritos do antigo império,
dando às raças e variedades estudadas nomes correspondentes às regiões em
que elas haviam se formado ou eram encontradas em maior número.
A entrada de alguns reprodutores provenientes da África e mais tarde da
Ásia, que se cruzaram com o gado nativo, compõe o primeiro grupo de zebuínos
brasileiros. Os animais entrados nos séculos XVII e XVIII e com mais freqüência
na primeira metade do século XIX, deram origem aos tipos nacionais
contemporâneos.
O primeiro núcleo de zebus puros do Brasil foi estabelecido pelo imperador
D. Pedro I, em 1826, na fazenda Real de Santa Cruz, nas proximidades do Rio de
Janeiro. Eram da região do Nilo e deram origem a um mestiço zebuíno chamado
de “China” que se difundiu pelo Brasil Central.
Depois se verificaram algumas importações de touros, casais ou pequenos
lotes nos anos de 1850, 1854, 1878 e 1887. Em 1893, o criador brasileiro Teófilo
de Godoy foi à Índia trazendo 8 cabeças. Já em 1903 e 1906 este fez novas
viagens, estimulando a importação do gado zebu por outros criadores.
As grandes importações de gado zebuíno coincidem com o início da
Primeira Guerra Mundial, em conseqüência da valorização da exportação de
carne, entrando no Brasil cerca de 3.000 reprodutores de 1914 a 1921. Em 1921,
12
as importações foram proibidas pelo Governo Brasileiro em decorrência de um
surto de peste bovina na Antuérpia. Isso fez com que os criadores passassem a
cuidar melhor dos seus plantéis, iniciando a seleção e melhoramento do rabanho
nacional. Durante muito tempo prevaleceu a idéia de que o gado indiano deveria
ser sempre cruzado. Em 1930, observou-se que 80 a 90% do rebanho era
mestiço, formando uma raça chamada de Indubrasil.
Já na década de 30, dois criadores mineiros conseguem licença do governo
brasileiro e importaram da Índia 192 animais das raças Gir, Nelore, Guzerá. A
chegada desses animais trouxe maior interesse pela criação de gado considerado
puro, verificando uma redução pelo interesse na raça Indubrasil. Novas
importações foram realizadas, mas segundo Magnabosco e cols. (1997) o número
de importações foi de aproximadamente 7000 animais.
1.1.4. O rebanho zebu do Brasil
O rebanho bovino brasileiro possui cerca de 205 milhões de animais
(IBGE, 2004), sendo o Brasil o detentor do maior rebanho bovino comercial do
mundo e o líder mundial de exportação de carne, com cerca de 7 milhões e meio
de toneladas de carne produzidas por ano (IBGE, 2003). A produção de leite (10%
do rebanho total) atinge um valor anual de 23 bilhões de litros. A agropecuária
hoje tem papel fundamental na economia brasileira, sendo responsável por 33%
do PIB, 42% das exportações totais e 37% dos empregos brasileiros (Ministério da
Agricultura, 2005).
O Brasil constitui, depois da Índia, o mais importante centro de criação e
seleção das raças zebuínas, no qual acredita-se que 80% do rebanho brasileiro
seja de zebuínos puros ou apresente alguma composição genética de zebuínos e
possui presentemente plantéis puros de sete raças: Nelore, Gir, Guzerá,
Indubrasil, Sindi, Kangayam,Tabapuã, Brahman, além de vários rebanhos
mestiços.
13
1.5.1. Raças zebuínas amostradas
1.5.1.1. A raça Nelore
A raça Nelore é formada a partir do gado Ongole indiano, raça que
representa a mistura de pelo menos 14 outras raças. A entrada do Nelore no
Brasil ocorreu a partir de 1868, sendo as importações da década de 60 foram as
principais entradas de gado Nelore no Brasil (ABCZ, 2005). Atualmente, o gado
Nelore tem sido melhorado geneticamente para a produção de carne e é apontado
como responsável por, pelo menos, 80% da força produtiva da indústria de carne
no país, constuindo o maior rebanho mundial da raça. Apesar do grande número
de animais, Vozzi e cols. (2004) apontaram que a desigual contribuição dos
principais descendentes dos reprodutores importados (os 20 principais ancestrais
contribuem com 40% dos genes da população), bem como a permanência destes
touros por longos períodos nas centrais de inseminação estão contribuindo para o
aumento dos níveis de endogamia e provocando a diminuição do número efetivo
da população brasileira da raça Nelore (Ne= 68 animais), atingindo níveis
preocupantes de variabilidade genética. Outro dado ressaltado por Faria e cols.
(2002) é que não há indícios de sub-divisão populacional baseados nas
estatísticas de F de Wright.
1.5.1.2. A Raça Gir
A raça Gir é originária da raça indiana do mesmo nome, utilizada pelos indianos
para a produção de leite e tração. A entrada dos primeiros animais Gir no Brasil
data de 1912, sendo que a maior importação ocorreu na década de 30 e os
últimos animais trazidos na década de 60 (Queiroz e Lôbo, 1993). No início de sua
exploração a raça era bastante utilizada para corte, porém atualmente a seleção
para características produtivas tomou dois rumos distintos, separando-a no Gir
Padrão selecionado para corte e o Gir Leiteiro, levando à formação de duas
associações de criadores: Associação Brasileira dos Criadores de Gir (ASSOGIR)
14
e Associação Brasileira dos Criadores de Gir Leiteiro (ABCGIL), mas mantendo
ainda um único livro de registro genealógico para toda a raça (Faria e cols, 2002).
A raça Gir tem um importante papel no cenário brasileiro, sendo o segundo maior
rebanho zebuíno nacional, atrás apenas da raça Nelore. Devido a sua
considerável aptidão leiteira, a raça Gir é a preferida para cruzamentos leiteiros,
principalmente com a raça Holandesa (ABCZ, 2005). Prova disso é a considerável
venda de sêmen de reprodutores destinados a rebanhos leiteiros. Em 1999, foram
vendidas 165.061 doses de sêmen passando para 194.325 doses em 2000, o que
representou um aumento de 17,73%. Entretanto, a utilização de sêmen de Gir
para corte apresentou queda da ordem de 27,5%, passando de 41.839 doses
vendidas em 1999 para 30.304 doses em 2000 (ASBIA, 2002). Análises das
estatísticas de F de Wrigth realizadas por Faria e cols. (2002) indicaram que a
população da raça Gir no Brasil está sofrendo um processo de subdivisão e que
nos últimos anos os níveis de endogamia têm aumentado bastante, no qual com
uma população de mais de 180 mil animais registrados o número efetivo
populacional estimado é de apenas 45 animais.
1.5.1.3. A Raça Guzerá
A introdução da raça Guzerá no Brasil remonta à entrada dos primeiros
exemplares zebuínos, trazidos da Índia no final do século XIX. O rebanho nacional
de Guzerá foi formado por animais do tipo indiano Kankrej, além de contribuições
das raças Malvi, Hissar e Tharparkar (Santiago, 1985). A raça Guzerá teve uma
expressiva participação no plantel bovino nacional até a década de 30, porém na
década de 40, fêmeas foram intensamente utilizadas na formação do gado
Indubrasil sofrendo um forte gargalo populacional. Entretanto, segundo Silva
(2004), a partir de 1995 houve uma nova retomada da raça, com crescimento, em
2002, de 56,47% no número de novos registros de animais, elevando o Guzerá
para o posto de quarto lugar no número de registros na ABCZ. Além do número de
registros, houve considerável elevação na venda de sêmen de algumas linhagens
da raça (ASBIA, 2002). O gado Guzerá atualmente é considerado de dupla
aptidão, ou seja, apresenta aptidão para a produção de carne e também
15
capacidade leiteira. Atualmente, existem alguns grupos dedicados à seleção para
corte (concentrados na USP-RP) e também para leite (concentrados no núcleo
MOET). Além disso, alguns criadores, de maneira independente, buscam animais
de dupla aptidão e outros selecionam seus animais para apenas um dos fins
(Vercesi Filho e cols, 2002).
Com relação à estrutura genética da população, segundo dados de Vercesi
Filho e cols (2002), num período analisado de 1938 a 1998 a endogamia e sua
taxa de acréscimo tem-se mantido em patamares aceitáveis, com o número
efetivo estimado em 118 animais. Entretanto, segundo Faria e cols. (2004), a
variabilidade genética decresceu entre 1979 a 1998, indicando a necessidade de
monitoramento da raça.
1.5.1.4. A Raça Sindi
A raça Sindi é originária do Estado de Sind no Paquistão, pertencendo ao
mesmo grupamento da raça Gir. Os primeiros exemplares da raça chegaram ao
Brasil em 1952 e atualmente a maior parte do rebanho brasileiro está presente no
nordeste, mantendo-se desde a sua introdução, concentrado em poucos
rebanhos, não apresentando a evolução numérica verificada em outras raças
(Faria e cols, 2004).
A raça Sindi tem a produção de leite como principal aplicação e por ser um
gado originado numa região semi-árida, são animais muito rústicos, adaptando-se
muito bem às regiões Norte e Nordeste brasileiras (Faria e cols., 2001).
Faria e cols. (2004) observaram que, no período de 1979 a 1998, os níveis
de endogamia aumentaram na ordem de 33 vezes do primeiro ao último período
analisados, assim como o número efetivo populacional caiu vertiginosamente de
161 para 9 animais. Além disso, as estatísticas de F de Wrigth indicaram a
existência de subdivisão populacional. Foram encontrados também indícios do
aumento do efeito de gargalo populacional e de deriva genética.
16
1.5.2. Raça Taurina Amostrada: A Raça Holandesa
O gado Holandesa originário da Holanda, Bélgica e norte da Alemanha
(região da Frísia, por isso também chamado de Holandesa-Friesian) se espalhou
para a Inglaterra e para a maioria dos países da Europa. Posteriormente, foi
levado para a América, no séc. XVII, principalmente para os Estados Unidos e
Canadá, onde foi intensamente selecionado para a produção de leite. Na América
Latina, Brasil e Argentina são os maiores e mais importantes centros de criação da
raça. Atualmente em quase todos os países do mundo são encontrados animais
da raça holandesa, tendo destaque Estados Unidos, Canadá, Austrália, Nova
Zelândia e Israel como maiores centros criadores.
No Brasil, os primeiros relatos de gado Holandês são de animais trazidos
pelos invasores holandeses, que dominaram parte do Nordeste brasileiro.
Também existem relatos de que o gado holandês estabelecido em Portugal,
chamado localmente de Turino, tenha sido introduzido por colonizadores
portugueses (Santiago, 1983). Mas a primeira entrada substancial de animais da
raça holandesa ocorreu no início do século XX, principalmente na região CentroSul do país. Em 1934, foi criada a Associação Brasileira de Criadores de Bovinos
da Raça Holandesa e em 1935 foi criado o livro genealógico da associação
(Santiago, 1983) com 109 animais. Atualmente o número de registros chega à
casa de 2 milhões, estando os animais concentrados principalmente nos estados
de São Paulo, Minas Gerais e Paraná, estados detentores de 84% do rebanho
(ABCBRH, 2000).
Cerca de 10% do rebanho bovino nacional é destinado à produção leiteira,
sendo que a raça holandesa e seus mestiços compõem a parte mais
representativa do rebanho leiteiro nacional, com produções que chegam a atingir
valores semelhantes aos observados em países desenvolvidos de clima
temperado (Zambianchi e cols, 2002). Segundo dados da ASBIA (1998), 29% de
todo o sêmen comercializado no Brasil são de touros holandeses.
O desenvolvimento do rebanho holandês no Brasil é baseado na contínua
importação de animais, embriões e sêmen, vindos principalmente dos Estados
17
Unidos, Canadá e Europa. Animais vivos, geralmente vacas, tem sido importados
principalmente da Argentina e Uruguai. A inseminação artificial tem sido utilizada
intensamente, com sêmen trazido principalmente da América do Norte (Costa e
cols., 2001).
1.2. Genes candidatos e melhoramento genético bovino
1.2.1. QTLs e MAS
Os avanços recentes da biologia molecular e o refinamento das técnicas de
avaliação genética das espécies domésticas têm aberto novas perspectivas de
impacto nos sistemas de produção e, sobretudo, permitem compreender a relação
biológica existente entre os genes e as características de interesse comercial. Os
modelos aplicados baseiam-se em evidências de que as características de
interesse econômico apresentam, em sua grande maioria, variação contínua e
são expressas por muitos loci gênicos, denominados Loci de Características
Quantitativas (QTL – Quantitative Trait Loci).
Por definição, QTLs são loci gênicos ou regiões cromossômicas que
contribuem para a variabilidade das características complexas que são
influenciadas por vários genes e também pelo ambiente (Koning, 2006). A
identificação destes QTLs e a possibilidade de compreensão do seu mecanismo
de ação promovem a oportunidade para a seleção de animais com desempenho
superior em características de interesse comercial, tais como taxa de crescimento,
composição de produtos (leite, carne e ovos), fertilidade, sobrevivência em
diferentes ambientes e resistência a doenças. O conhecimento dos alelos destes
QTLs presentes nos indivíduos permitiria a seleção direta dos animais
geneticamente superiores, processo conhecido como seleção assistida por
marcadores (MAS – Marker-assisted Selection; Williams, 2005).
A taxa de ganho genético que pode ser obtida através de seleção é
determinada por quatro fatores: variação genética, acurácia de seleção,
intensidade de seleção e intervalo de gerações. A caracterização molecular dos
QTLs pode influenciar favoravelmente cada um destes fatores. Alelos favoráveis
de QTLs podem ser movidos de população para população através de
18
introgressão assistida por marcadores, aumentando a variância genética. A
quantificação da informação dos alelos de um QTL por meio da estimativa dos
valores genéticos (breeding values) dos animais aumenta a acurácia de seleção.
Além disso, a genotipagem em nível de DNA permite a avaliação genética dos
animais em estágios iniciais do desenvolvimento e independentemente do sexo,
aumentando a intensidade de seleção e diminuindo o intervalo de gerações
(Georges, 2001). Portanto a seleção assistida por marcadores incorpora dados
moleculares ao processo tradicional de seleção, sendo um poderoso processo de
incremento genético (Meuwissen e Goddard, 1992).
1.2.2. Detecção de QTLs e Abordagens de Genes Candidatos
Nos últimos vinte anos, muitos genes que controlam características
monogênicas ou mendelianas foram identificados. Entretanto, genes que
contribuem para características complexas têm sido identificados numa velocidade
bem menor, devido a fatores complicadores como a heterogeneidade de locus,
epistasia, baixa penetrância, expressividade variável, pleiotropia e limitações
estatísticas (Risch, 2000). Nos últimos anos tecnologias e ferramentas genômicas
têm tornado mais acessível a identificação de genes que influenciam
características complexas, os QTLs. Glazier e cols. (2002) revisaram que
atualmente o processo de identificação de genes que contribuem para
características complexas envolve quatro etapas fundamentais: (1) mapeamento
de baixa resolução; (2) mapeamento refinado; (3) identificação de seqüências
candidatas (genes candidatos) e (4) testes funcionais de genes candidatos.
Glazier e cols. (2002) apontaram ainda, que além destas abordagens baseadas
em critérios estatísticos, existem evidências circunstanciais como estudos de
padrões de expressão tecidual, que aliados aos passos fundamentais podem
promover fonte suficiente de evidências para o estabelecimento de um gene
envolvido na característica complexa.
A primeira etapa do processo de identificação de um QTL é estabelecer
evidências em nível de genoma, numa abordagem denominada varredura
genômica (genomic scan) com marcadores, que se baseia na genotipagem de
19
todo o genoma com marcadores distribuídos ao longo dos cromossomos a fim de
estabelecer associações entre alelos específicos do marcador e a variação para a
característica fenotípica. Nestas abordagens usualmente se estabelece um
intervalo de 10 a 30 cM que contém o QTL para a característica analisada
(Rothschild & Soller, 1997).
Os estudos iniciais de ligação de baixa resolução geralmente estabelecem
uma posição no mapa para que estudos posteriores de refinamento sejam
conduzidos, a fim de se reduzir ao máximo o tamanho do intervalo crítico da
região que abriga o QTL, podendo chegar a até 1 cM (Ikeda e cols., 2002; Frary e
cols., 2000; Yano e cols., 2000; Takahashi e cols., 2001). Koning (2006)
apontaram a existência de várias metodologias para se realizar o mapeamento
refinado de QTLs, que incorporam componentes genealógicos, dados sobre
variações fenotípicas da característica e a utilização de um grande número de
marcadores genéticos que cobrem a região previamente mapeada em estudos
preliminares. Weller e cols. (1990) enfatizaram que os principais modelos
experimentais de mapeamento refinado em gado de leite são as análises de meioirmãos chamadas desenho de filhas (daugther design) e desenho de netas
(granddaugther design). No desenho de filhas vários touros e suas filhas são
genotipados para vários loci marcadores e adicionalmente os dados fenotípicos
das filhas (geralmente sob as formas de breeding value ou daugther yield
deviation – DYD) são utilizados para determinar a ligação entre os marcadores e o
QTL (Van Raden e cols., 1991). Já no desenho de netas apenas os avôs e seus
filhos (geralmente de 50 a 200) são genotipados e a informação fenotípica é
coletada a partir das filhas deste grupo de touros para que se determine a ligação.
Weller e cols. (1990) comentaram ainda que o desenho de filhas é apropriado para
populações experimentais pequenas, enquanto que o desenho de netas é
recomendado para grandes populações e oferece maior poder estatístico em
comparação com o desenho de filhas. Com relação às análises de meios irmãos,
Koning (2006) salientou que esta análise modela apenas o componente paterno
do QTL, ignorando a informação de alelos maternos ou qualquer ligação genética
entre as famílias de meio-irmãos.
20
A terceira etapa do processo é a análise da seqüência de DNA dentro do
intervalo delimitado pelo mapeamento refinado. Esta abordagem é necessária
para identificar variantes nucleotídicas candidatas. Apesar de consideráveis
esforços, os intervalos mínimos que delimitam um QTL frequentemente incluem
alguns genes, chamados de genes candidatos posicionais e numerosas variantes
polimórficas de seqüências de DNA que podem estar em regiões codificantes ou
não-codificantes. Deste modo, cada um desses nucleotídeos variantes se torna
candidato e deve ser funcionalmente testados em estudos de associação com a
variação do QTL (Glazier e cols., 2002). Outra abordagem, a dos chamados genes
candidatos funcionais, utiliza informações prévias sobre genes que estão
localizados na região do QTL e que de algum modo tem sua função metabólica
envolvida na fisiologia e desenvolvimento da característica. O último e mais
conclusivo passo apontado por Glazier e cols. (2002) para a identificação de um
gene envolvido numa característica complexa é a demonstração de que a
substituição de uma variante nucleotídica resulta numa mudança de um fenótipo
para outro.
Uma vez estabelecidos quais são os sítios polimórficos responsáveis pela
variação fenotípica, métodos de detecção destes polimorfismos em larga escala
devem ser desenvolvidos tornando possível a utilização da informação genotípica
em programas de seleção assistida por marcadores. Várias técnicas de detecção
de polimorfismos de única sequencia (SNPs) estão disponíveis (revisada por
Winter, 2000) incluindo a técnica de clivagem de DNA amplificado alelo-específica
(PCR-RFLP),
a
técnica
de
amplificação
alelo
específico
(ASA),
mini-
sequenciamento e mais recentemente técnicas que envolvem espectrometria de
massa MALDI-TOF (Mass Array by Sequenom®).
1.3. O gene candidato DGAT1
Na última década grandes esforços têm sido empregados para a
construção dos mapas físico e genético do genoma bovino que atualmente conta
com mais de 4.000 marcadores, em sua maioria marcadores microssatélites,
SNPs e também ESTs (expressed sequence tags) (Ihara e cols., 2004; Williams,
21
2005). Esta saturação do genoma bovino permitiu a identificação de vários QTLs
para características relacionadas com a produção e composição do leite em várias
populações de gado leiteiro, nos cromossomos autossômicos bovinos (BTA) 06,
14, 20 e 26 (Coppieters e cols., 1998; Ashwell e cols., 2004; Chen e cols., 2006 e
Gautier e cols., 2006).
Estudos preliminares de mapeamento genético para características de
produção e composição de leite conduzidos por Looft e cols. (1998) e Heyen e
cols. (1999) identificaram um QTL no cromossomo 14 que, em estudos
posteriores, foi localizado na extremidade centromérica do BTA14 (Riquet e cols.,
1999; Coppieters e cols., 1998). Em 2002, um estudo de mapeamento refinado
restringiu este QTL a um intervalo entre os marcadores BULGE09 e BULGE039,
que compreendia cerca de 3 cM (Farnir e cols., 2002). Grisart e cols. (2002) e
Winter e cols. (2002), trabalhando independentemente, apontaram o gene DGAT1
como sendo um gene candidato posicional para explicar a variação do QTL do
BTA14. Além disso, Smith e cols. (2000) descobriram que a lactação estava
ausente em ratos nocauteados sem as duas cópias do gene DGAT1, fazendo de
DGAT1 também um gene candidato funcional.
O gene DGAT1, codificante da enzima Diacilglicerol aciltransferase 1(EC
2.3.1.20), pertence a uma família gênica com três membros conhecidos, DGAT1,
ACAT1 e ACAT2 (Buhman et al 2001). O gene DGAT1 bovino codifica uma
enzima formada por 489 aminoácidos, envolvida na biossíntese de triglicerídeos,
que ocorre na membrana do reticulo endoplasmático e se expressa em muitos
tecidos, com os mais altos níveis de expressão no intestino, testículo, tecido
adiposo, glândulas mamárias e tecido epitelial (Cases e cols., 2001). Existem duas
vias descritas em mamíferos para a biossíntese de novo de triglicerídeos (via de
glicerol-3-fosfato e via de monoacilglicerol) e em ambas as vias, o diacilglicerol é
sintetizado e subsequentemente convertido em triacilglicerol através da atividade
da enzima diacilglicerol aciltransferase (dgat) (Coleman e cols., 2000). Por estar
envolvida com o metabolismo de triglicerídeos e estocagem de energia, Cases e
cols. (1998) sugeriram que a enzima dgat1 esteja envolvida em processos de
absorção intestinal de gordura, regulação da concentração de triacilglicerol no
22
plasma, estocagem de gordura em adipócitos e no tecido muscular, produção de
leite e ovos, incluindo oócitos em mamíferos e produção de óleos em sementes de
plantas.
Winter e cols. (2002) ao analisarem a seqüência do gene DGAT1 bovino,
verificaram a presença de 19 posições (ou regiões) variáveis, das quais duas eram
variações no número de unidades repetidas e 17 eram alterações em um único
nucleotídeo. Duas destas alterações, nas posições 10433 e 10434 (GenBank ,
acesso AJ318490) localizadas no éxon VIII, sendo substituições GpC ApA,
geravam uma substituição do aminoácido Lisina por Alanina na posição 232 da
proteína (DGAT1 K232A). Winter e cols. (2002) ainda através de alinhamento de
seqüência de DGAT1 de várias espécies de plantas e animais indicaram que a
variante
que codifica
o
aminoácido
Lisina
é
mais
conservada, sendo
provavelmente o estado ancestral.
Vários estudos posteriores, conduzidos a fim de se verificar a influência
deste polimorfismo na variação fenotípica observada em características de
produção, mostraram fortes associações entre o alelo codificante de Lisina e o
aumento do conteúdo de gordura, o decréscimo no conteúdo de proteína e o
decréscimo na produção de leite nas raças Holandesa, Jersey e Fleckvieh
(Spelman e cols., 2002; Thaller e cols., 2003; Weller e cols., 2003). Evidências
adicionais do efeito da mutação DGAT1 K232A vieram de estudos de expressão
do gene DGAT1, que demonstraram a existência de uma pequena diferença no
nível de expressão do mRNA entre as duas variantes de DGAT1 e
de uma
diferença no nível de atividade enzimática (medida como Vmax) entre as duas
variantes, com o Vmax sendo mais alto para a variante de Lisina (Grisart e cols.,
2004).
A mutação DGAT1 K232A não influencia somente características
envolvidas na produção de leite, alguns estudos apresentaram efeitos positivos da
variante de Lisina na qualidade da carne (característica ligada ao conteúdo de
gordura muscular) em raças de corte (Casas e cols., 2005). Thaller e cols. (2003)
registraram um significativo efeito da variante de Lisina no conteúdo de gordura
intramuscular na população alemã de gado Holandesa.
23
Entretanto, estudos realizados por Spelman e cols. (2002) e Thaller e cols.
(2003), mostraram que os efeitos dos alelos diferiam, em alguma extensão, dentro
das famílias, bem como entre as populações. Isto levou à formulação da hipótese
de que fontes adicionais de variação na região do gene DGAT1 seriam
responsáveis pela variabilidade dos fenótipos das famílias analisadas. Bennewitz
e cols. (2004) discutiram diferentes fontes adicionais possíveis além da variação
genética presente na mutação DGAT1 K232A. A primeira hipótese é que há um
outro alelo segregando no locus DGAT1 K232A; a segunda é que existe um locus
adjacente em forte ligação com o locus DGAT1 K232A e uma terceira
possibilidade seria a existência de outras regiões polimórficas dentro do gene
DGAT1 influenciando a variação fenotípica (Bennewitz e cols., 2004). Kuhn e cols.
(2005) e Sanders e cols. (2006), investigando os efeitos dos alelos de um
polimorfismo de número variável de repetições em tandem (VNTR), presente na
região promotora, encontraram variações adicionais nas características de
produção e de composição do leite nas populações alemãs das raças Holandesa e
Angeln. Um dos seis alelos descritos nesta VNTR (alelo de sete repetições)
apresentou efeitos similares em ambos os estudos, conferindo um aumento na
produção e no conteúdo protéico, conferindo também um aumento no conteúdo
energético do leite e escore de células somáticas na população da raça Angeln
(Sanders e cols., 2006). Além disso, a seqüência do motivo repetitivo da VNTR é
um potencial sítio de ligação do fator de transcrição Sp1 (Kuhn e cols., 2004).
Fuerbass e cols. (2006) realizaram estudos com genes repórteres, com o objetivo
de verificar o efeito dos alelos de DGAT1 VNTR na expressão gênica. Segundo
eles, ainda que os efeitos dos alelos de DGAT1 VNTR não mostrem significância
em seus experimentos in vitro, seus efeitos na transcrição gênica podem ser
diferentes in vivo. Todas estas evidências confirmam a hipótese de fonte adicional
de variação no QTL do BTA14 além da mutação DGAT1 K232A, proposta por
Bennewitz e cols. (2004), confirmam também a tendência, observada por Glazier e
cols. (2002), de que as variações em características complexas resultem mais
frequentemente de variantes em regiões não-codificantes regulatórias do que de
variantes de seqüências codificantes.
24
1.4. Analises populacionais do gene DGAT1
Tabor e cols. (2002) comentaram que a consistência da associação dos
alelos de um gene candidato com a variação do caráter pode ser diferente entre
as várias populações, dependendo, entre outros fatores, da frequência destes
alelos na população estudada. Portanto, estudos populacionais preliminares sobre
as frequências alélicas de um gene candidato são essenciais para a condução de
posteriores estudos de associação entre os alelos do gene candidato e a variaçao
da característica. Vários estudos populacionais sobre o polimorfismo DGAT1
K232A foram realizados. Entretanto, a maioria destes trabalhos aborda
populações de origem taurina, sendo escasso o conhecimento das freqüências
alélicas deste polimofismo em raças zebuínas (Kaupe e cols., 2004; Spelman e
cols., 2002; Ripoli e cols., 2006; Hori-Oshima e Barreras-Serrano, 2003; Pappas e
cols., 2004). Com relação ao polimorfismo de DGAT1 VNTR, apenas dois
trabalhos foram publicados relatando as frequencias alélicas do locus em duas
populações alemãs das raças taurinas Holandesa e Angeln. Frente a esta
carência de estudos populacionais dos polimorfismos do gene DGAT1 em raças
zebuínas, o objetivo deste trabalho foi estimar as frequências alélicas e
genotípicas dos polimorfismos DGAT1 VNTR e DGAT1 K232A, através de
amostras das principais raças zebuínas introduzidas no Brasil (Nelore, Guzerá,
Sindi e Gir) e da raça taurina Holandesa, afim de se verificar se existe variação
nestes polimorfismos dentro destas raças e em que extensão.
25
2. Materiais e métodos
2.1. Animais amostrados
As amostras foram obtidas do Banco de DNA de Bovinos de Leite da
Embrapa consistindo de 278 animais das raças Nelore, Guzerá, Sindi, Gir,
Holandesa (Tabela 1). Amostras de sêmen das raças Gir, Nelore, Guzerá e
Holandesa foram selecionados de companhias de inseminação artificial que
comercializam o sêmen dos principais contribuidores genéticos para as atuais
populações destas raças no Brasil. As amostras da raça Sindi foram apenas de
animais do sexo feminino pelo fato da dificuldade de se obter amostras desta raça,
na qual o tamanho populacional é muito reduzido e concentrado em poucos
rebanhos do norte e nordeste do Brasil.
Tabela 1. Caracterização da amostragem.
Raça
Grupo genético
Gir
Guzerá
Nelore
Sindi
Holandesa
Total
Zebuíno
Zebuíno
Zebuíno
Zebuíno
Taurino
Número
amostral
53
53
62
60
50
278
Sexo
Machos
Machos
Machos
Fêmeas
Machos
2.2. Genotipagem do polimorfismo DGAT1 K232A
A extração do DNA baseou-se no procedimento de fenol-clorofórmio
descrito por Sambrook e cols. (2001) utilizando-se amostras de sangue periférico
(fêmeas) e sêmen (machos). Um fragmento de 411 pares de bases contendo o
SNP foi amplificado para cada amostra. As reações em cadeia da polimerase
(PCRs) foram realizadas totalizando um volume de 20 µL contendo 60 ng de DNA
genômico como molde, tampão de PCR 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada
dNTP, 5% de DMSO, 1 U de Taq polimerase e 0,5 µM de cada oligonucleotídeo
iniciador
(primer).
As
seqüências
dos
primers
foram:
Forward:
5’-
26
GCACCATCCTCTTCCTCAAG-3’ e Reverse: 5’- GGAAGCGCTTTCGGATG-3’
(Tabela 2), conforme descrito por Winter e cols. (2002). O programa de PCR
otimizado incluiu uma fase de desnaturação inicial a 94° C por 4 minutos; 10 ciclos
de 94° C (60 s), 66 °C (60 s, baixando um grau a cada ciclo) e 72°C (60 s) seguido
de 25 ciclos de 94°C (60 s), 56° C (60 s) e 72°C (60 s); e uma fase final de
extensão de 10 minutos a 72°C.
A performance da PCR foi verificada por eletroforese de uma alíquota (10
µL) do produto amplificado em um gel de agarose na concentração de 1,5 %,
corado por brometo de etídeo por 30 minutos e fotografado sob luz ultravioleta
(UV) por meio de uma câmera digital (EagleEye II, Stratagene Co.). O
polimorfismo de SNP DGAT1 K232A foi detectado por meio da técnica de PCRRFLP. O procedimento consistia na digestão de uma alíquota de 10 µL de DNA
amplificado com 2 U da enzima de restrição CfrI (MBI Fermentas) por seis horas a
37°C seguido de uma etapa de desnaturação de 20 minutos a 65°C. As PCRs
bem como as reações de digestão foram realizadas num termociclador 9700 PCR
Sistem (Applied Biosystems).
Os produtos digeridos foram visualizados em gel de poliacrilamida nativa
numa concentração de 5% (altura do gel: 25 cm) utilizando tampão de TBE 1X
(400V por 100 minutos).Os géis foram corados após a eletroforese com nitrato de
prata. O tamanho dos alelos foi estimado através da comparação visual das
amostras com um marcador de peso molecular na escala de 100 pares de bases
(100 bp ladder). Um fragmento único (não digerido) de 411 pares de bases indicou
a presença do alelo denominado K e dois fragmentos de 203 e 208 pares de
bases indicavam a presença do alelo A. Para cada rodada de genotipagem, uma
amostra de um indivíduo previamente conhecido como homozigoto para o alelo A
foi adicionado para evitar uma possível identificação errônea de alelos causada
pela digestão parcial da enzima de restrição (controle positivo do sistema de
detecção) (Figura 1). Além do controle positivo, a cada rodada de genotipagem
dos animais foram adicionados controles negativos para a verificação de uma
possível contaminação das amostras.
27
2.3.Genotipagem do polimorfismo DGAT1 VNTR
A genotipagem do polimorfismo de VNTR no promotor do gene DGAT1 foi
conduzida de acordo com Kuhn e cols. (2004), consistindo na amplificação de uma
região entre as posições 1439 a 1565 da seqüência do gene DGAT1 depositada
no GenBank (AJ318490). As reações em cadeia da polimerase foram executadas
totalizando 25 µL de reação final, utilizando 90 ng de DNA genômico como molde,
tampão de PCR 1X, 1,5 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 5% de DMSO, 2 U
de Taq polimerase e 0,6 mM de cada primer. As seqüências dos primers utilizados
foram:
Forward:
5’-TCAGGATCCAGAGGTACCAG-3’
e
Reverse:
5’-
GGGGTCCAAGGTTGATACAG-3’ (Tabela 2). O programa de PCR utilizado,
assim como o de genotipagem do SNP envolveu um protocolo de touchdown com
os seguintes passos: (1) uma etapa inicial de desnaturação a 94°C por 4 minutos;
(2) 5 ciclos de 94°C (45 s), 70 °C (45 s, baixando dois graus a cada ciclo) e 72°C
(45 s); (3) 25 ciclos de 94°C (45 s), 60°C (45 s) e 72°C (45 s); e (4) um passo de
extensão final a 72°C por cinco minutos.
De cada reação realizada, uma alíquota de 10 µL foi visualizada em gel de
poliacrilamida nativa na concentração de 12%. A eletroforese foi executada
utilizando tampão TBE 1X (200 V por 200 minutos) e corados posteriormente com
nitrato de prata (Figura 2). A identificação dos alelos foi realizada por comparação
com marcadores de peso molecular nas escalas de 50 e 10 pares de bases (50 bp
e 10 bp ladder). Foram encontrados seis alelos que apresentavam uma diferença
entre eles de 18 pares de bases de tamanho correspondendo ao número variável
de motivos repetidos. Os alelos foram numerados arbitrariamente, de acordo com
o seu tamanho, sendo o de menor tamanho denominado alelo 1.
Tabela 2. Relação dos oligoiniciadores (primers) utilizados.
Primer
DGAT K232A - Forward
DGAT K232A - Reverse
DGAT VNTR - Forward
DGAT VNTR - Reverse
Seqüência
5’-GCACCATCCTCTTCCTCAAG-3’
5’- GGAAGCGCTTTCGGATG-3’
5’-TCAGGATCCAGAGGTACCAG-3’
5’-GGGGTCCAAGGTTGATACAG-3’
28
2.4. Análises Populacionais
A análise estatística dos dados consistiu em: (1) cálculo das freqüências
alélicas e genotípicas; (2) cálculo das heterozigozidades observadas e esperadas
sob equilíbrio de Hardy-Weinberg; (3) cálculo do Teste de Déficit de heterozigotos
(por meio do Teste Exato de Fisher) e finalmente; (4) cálculo da distância genética
de Nei entre as raças.
As freqüências alélicas e genotípicas para ambos os polimorfismos foram
calculadas utilizando o software gratuito TFPGA, versão 1.3 (Miller, 1997),
disponível on-line no site http://www.marksgeneticsoftware.net.
Os cálculos de déficit de heterozigotos, por meio do Teste Exato de Fisher
foram realizados utilizando o programa GENEPOP ON THE WEB v3.4 (Raymond
and
Rousset,
2004)
disponível
on
line
no
site
http://wbiomed.curtin.edu.au/genepop/.
Segundo Miller (1997), o Teste Exato é o teste mais indicado para o teste
quando um ou mais genótipos têm baixos valores esperados. Entretanto o cálculo
do teste exato se torna complexo quando existem mais de dois alelos por locus.
Para contornar este contratempo estatístico, Guo e Thompson (1992) descrevem
duas soluções. A primeira consiste no uso do método convencional de Monte
Carlo, que envolve a construção de novos grupos de dados aleatóriamente
contendo as mesmas frequências alélicas dos dados originais. A probabilidade
condicional de cada grupo de dados construído é então comparada à
probabilidade condicional da amostra observada. A segunda alternativa, que foi
utilizada neste trabalho, é a utilização do método de Cadeias de Markov que
envolve o uso do Algoritmo de Metrópolis para obter amostras aleatórias de
possíveis grupos de dados através de uma série de modificações de um único
passo nos dados originais. Miller (1997) comentou que o uso de Cadeias de
Markov possibilita o cálculo com um número maior de observações do que o
método de Monte Carlo. Todos os cálculos de teste de equilíbrio de HardyWeinberg foram conduzidos utilizando o programa TFPGA (Miller, 1997).
29
As distâncias genéticas entre as raças analisadas foram calculadas
considerando cada locus separadamente e também utilizando a informação dos
dois loci. Os resultados foram apresentados graficamente através de um
dendrograma gerado pelo programa TFPGA (Miller, 1997).
30
3. Resultados e Discussão
A adição de DMSO às reações de PCR permitiu a igual amplificação de
ambos os alelos do polimorfismo DGAT1 K232A. A genotipagem do polimorfismo
DGAT1 K232A foi realizada com sucesso através da técnica de PCR-RFLP para
todas as amostras, mostrando uma clara separação dos três diferentes genótipos
(Figura 1). Os controles positivos incluídos nas rodadas de genotipagem foram
importantes para a verificação da efetiva digestão das amostras e os controles
negativos confirmaram a inexistência de contaminação das amostras. Para a
genotipagem do polimorfismo DGAT1 VNTR, a utilização de DMSO e de um
tampão de PCR diferenciado (VIB Special Buffer - Fabricante: Phoneutria) permitiu
uma perfeita amplificação dos alelos. A utilização de géis com uma concentração
de acrilamida 12% para a genotipagem de DGAT1 K232A conferiu uma melhor
separação dos alelos do que as concentrações inferiores testadas (Figura 2).
Apesar de Sanders e cols. (2006) não terem conseguido amplificar a região
abrangendo o polimorfismo de VNTR utilizando os primers descritos por Kuhn e
cols. (2005), em nosso laboratório após etapas de otimização, os primers descritos
por Kuhn e cols. (2005) funcionaram perfeitamente para todas as raças. Devido à
distância evolutiva existente entre zebuínos e taurinos (raças para as quais os
primers foram primariamente desenhados) e também pelo fato do polimorfismo
DGAT1 VNTR estar numa região não traduzida, poderia existir a possibilidade de
ocorrerem bases variantes nas seqüências de anelamento dos primers,
comprometendo a amplificação.
31
Figura 1. Gel de poliacrilamida mostrando os genótipos do polimorfismo DGAT1
K232A (KK, AK e AA). Colunas: M: Marcador de peso molecular (100 pb); 01 a
12: amostras; C: controle positivo (genótipo AA).
FIGURA 2. GEL DE POLIACRILAMIDA MOSTRANDO GENÓTIPOS DO POLIMORFISMO DGAT1 VNTR. COLUNA
M: MARCADOR DE PESO MOLECULAR (50 BP); 01 A 20: AMOSTRAS E ABAIXO SEUS RESPECTIVOS
GENÓTIPOS ; C1 E C2: CONTROLES POSITIVOS.
As análises populacionais dos polimorfismos DGAT1 K232A e DGAT1
VNTR são apresentados nas tabelas 3 e 4. Não houve diferenças significativas
entre as freqüências alélicas do polimorfismo DGAT1 K232A nas amostras das
raças zebuínas. Por outro lado, observou-se uma substancial diferença entre as as
32
amostragens das raças zebuínas e a raça taurina Holandesa, na qual o alelo A foi
encontrado numa freqüência alta.
Com relação às freqüências alélicas do polimorfismo DGAT1 VNTR, foram
encontrados seis alelos (alelo 1 a alelo 6). De uma maneira geral, os alelos 3, 4 e
5 foram os mais freqüentes em todas as amostragens e por conseqüência os
genótipos formados por estes alelos foram também os mais freqüentes.
Por meio de comparações com a seqüência da região amplificada
depositada no GenBank, estimou-se que o alelo de numero 1 de DGAT1 VNTR
apresenta 2 motivos repetidos; o alelo 2 apresente 3 motivos repetidos e assim
sucessivamente. Baseado nesta estimativa acredita-se que o alelo 6 deste estudo
corresponda ao alelo VNTR5 descrito por Kuhn e cols. (2004) e ao alelo E descrito
por Sanders e cols. (2006), todos apresentando sete motivos repetidos.
A presença do alelo 1 nas amostras das raças zebuínas Nelore e Guzerá
chama a atenção pelo fato deste alelo não ter aparecido em estudos anteriores
para a espécie Bos taurus. Outro fato relevante foi a ausência do alelo com sete
repetições na amostra da raça Gir. Estudos anteriores com a população alemã da
raça Holandesa haviam registrado a presença do alelo com sete repetições em
freqüência relativamente alta (Winter, 2003 e Kuhn e cols., 2004), além deste alelo
estar presente nas amostras das demais raças analisadas.
Os valores de heterozigosidade para o polimorfismo DGAT1 K232A foram
relativamente baixos se comparados com os valores encontrados por Kaupe e
cols. (2005) para algumas raças taurinas e também se comparados com outros
polimorfismos de genes candidatos para características leiteiras (Rincón e cols.,
2006). Por outro lado, o polimorfismo DGAT1 VNTR apresentou valores
relativamente altos de heterozigosidade para todas as amostras das raças
analisadas, sendo que a amostragem da raça Guzerá apresentou os maiores
valores de heterozigosidade (Ho e He).
33
Tabela 3. Freqüências alélicas e genotípicas e heterozigosidade para o lócus
DGAT1 K232A.
Freq. Alélica (%)
Freq. Genotípica (%)
A
K
AA
AK
KK
Holandesa 53
73,0
27,0
60,0
26,0
14,0
Gir
53
4,0
96,0
1,9
3,8
94,3
Sindi
62
2,5
97,5
5,0
95,0
Nelore
60
0,0
100,0
1,0
Guzerá
50
0,0
100,0
1,0
§Valores de P para o teste de déficit de heterozigotos.
*Valores significativos de P (< 0,05)
Raça
N
Fis
0.35
0.49
0.02
-
Heterozigosidade
Ho
He
P§
0,26 0,39
0,01*
0,04 0,07
0,06
0,05 0,05
1
-
As amostras da raça Holandesa apresentram a maior freqüência do alelo A
(73%) entre todas as amostras das raças genotipadas para o polimorfismo DGAT1
K232A. Este valor foi maior que a freqüência do alelo A nas populações da raça
Holandesa da Nova Zelândia (40%) e Alemanha (42%) (Spelman e cols., 2002;
Kaupe e cols., 2004). Esta freqüência, entretanto, é menor que a encontrada por
Hori-Oshima & Barreras-Serrano (2003) para uma amostra da população
mexicana da raça Holandesa (82%) e também é inferior às encontradas para as
raças taurinas leiteiras Pardo Suíço (98%) e Ayrshire (78%) (Spelman e cols.,
2002; Kaupe e cols., 2004). Além disso, o teste de déficit de heterozigotos indicou
níveis significativos de deficiência de heterozigotos para a amostragem da raça
Holandesa. Estes valores levantam a idéia da ocorrência de endogamia na
população brasileira da raça Holandesa, talvez pelo uso intenso de semên de um
número reduzido de reprodutores.
De uma maneira geral, a alta freqüência do alelo A no gado Holandesa
brasileiro está em conformidade com as freqüências encontradas nos vários
estudos em populações européias, refletindo as origens do gado Holandesa
brasileiro que foi formado por intensa importação de sêmen de origem européia e
norte-americana. Nenhuma informação foi encontrada sobre as freqüências
alélicas do polimorfismo DGAT1 K232A na população Holandesa norte-americana;
pode-se supor que as freqüências sejam similares às encontradas neste estudo já
que a população brasileira foi formada em grande parte por sêmen importado
deste país (Costa e cols., 2001).
34
Tabela 4. Freqüências alélicas e genotípicas e heterozigosidade para o lócus
DGAT1 VNTR.
Raça
N
A
1
0,0
0,0
0,0
0,8
2,9
2
1,1
7,4
0,0
0,0
3,9
Freq. Alélica (%)
3
4
5
20,7 41,3 23,9
22,2 55,6 14,8
15,8 28,3 47,5
32,5 37,5 27,5
28,4 30,4 32,4
Holandesa 53 5
Gir
53 4
Sindi
62 4
Nelore
60 5
Guzera
50 6
A = número de alelos
§
Valores de P para o teste de déficit de heterozigotos.
*Valores significativos de P (< 0,05)
6
13,0
0,0
8,3
1,7
2,0
Fis
0.13
0.04
0.13
0.04
0.03
Heterozigosidade
Ho
He
P§
0,63
0,71
0,02*
0,59
0,61
0,47
0,58
0,66
0,13
0,72
0,68
0,75
0,71
0,72
0,06
A tabela 4 mostra que a raça Holandesa foi a que apresentou a maior
freqüência do alelo 6 (13%), alelo com sete repetições, descrito por Kuhn e cols.
(2004), cujas freqüências foram altas (22%) nos touros avôs formadores das
famílias do Granddaughter design delineado por estes autores. Além disso,
valores significativos de deficiência de heterozigotos para o locus DGAT1 VNTR
foram observados.
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Holstein
Gir
Alelo A
Sindi
Nelore
Guzera
Alelo K
Figura 3. Freqüências alélicas para o polimorfismo DGAT1 K232A.
35
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Hols tein
Gir
AA
Sindi
AK
Nelore
Guz erá
KK
Figura 4. Freqüências genotípicas do polimorfismo DGAT1 K232A.
Todos os animais amostrados das raças Nelore e Guzerá genotipados para
o polimorfismo DGAT1 K232A foram homozigotos para o alelo K. Resultados
similares para a raça Nelore foram encontrados por Kaupe e cols. (2004) que
encontrou uma freqüência de 99% para o alelo K. Pappas e cols. (2004),
avaliando o polimorfismo na raça Nelore e alguns mestiços, encontraram uma
freqüência de 100% do alelo K para a raça Nelore, 56% para o mestiço Nelore x
Canchim e 55% para o mestiço Nelore x Angus, indicando que o alelo A nestas
populações de gado mestiço eram provavelmente originárias do germoplasma
taurino. Já para a raça Guzerá, que no Brasil é utilizada para fins de corte e leite,
não há registro na literatura de análise dos polimorfismos de DGAT1. Assim, sugese que genotipagens adicionais devem ser realizadas com maior amostragem da
população da raça Guzerá, para confirmação da fixação do alelo K.
Em contrapartida, a raça Guzerá foi a que mostrou, em relação ao
polimorfismo DGAT1 VNTR, maiores valores de heterozigosidade, maior número
de alelos (seis alelo ao todo) e também a maior diversidade de genótipos (Figura
4).
A raça Nelore apresentou também altos níveis de heterozigosidade e de
diversidade alélica, sendo uma das duas raças a apresentar o alelo 1. Estes
resultados sugerem que, mesmo não havendo variação no gene DGAT1 para o
polimorfismo DGAT1 K232A, a variação encontrada no polimorfismo DGAT1
36
VNTR pode ser responsável pela variação fenotípica das características de
produção e composição do leite nas raças Nelore e principalmente na Guzerá que
é considerada uma raça de dupla aptidão.
100%
80%
60%
40%
20%
0%
Holstein
Gir
Sindi
Nelore
Guzera
Alelo 1 Alelo 2 Alelo 3 Alelo 4 Alelo 5 Alelo 6
Figura 5. Freqüências alélicas do polimorfismo DGAT1 VNTR.
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
Holstein
Gir
Sindi
Nelore
Guzerá
6/6
6/5
6/4
6/3
5/5
5/4
5/3
5/2
5/1
4/4
4/3
4/2
4/1
3/3
3/2
2/2
Figura 6. Freqüências genotípicas do polimorfismo DGAT1 VNTR.
37
Uma baixa freqüência do alelo A foi encontrada para as amostras da raça
Sindi (2%) na genotipagem do polimorfismo DGAT1 K232A. Uma vez que a raça
Sindi é comumente utilizada para a produção de leite no Nordeste do Brasil,
nossos resultados apontam a possibilidade da condução de trabalhos no sentido
de se aumentar a freqüência do alelo A na população brasileira da raça Sindi, por
meio de MAS, embora a freqüência alélica muito baixa constitua uma dificuldade
na implementação de tais programas. Vale ressaltar que os programas de MAS
sugeridos devem sempre monitorar a perda de diversidade genética, pois, ainda
que os resultados do teste de déficit de heterozigotos não tenham apontado
presença de endogamia na raça,
Faria e cols. (2001) mostram que esta
população corre riscos de extinção devido aos altos níveis de endogamia e baixo
tamanho efetivo populacional.
Na amostragem da população Gir, foi encontrada uma freqüência de 4% do
alelo A e apenas um animal era homozigoto para tal alelo (Figura 3). Pappas e
cols. (2004) encontraram também uma freqüência de 4% numa outra amostra da
população de Gir Leiteiro brasileira. A verificação da presença do
alelo A na
população de Gir Leiteiro é de grande interesse para programas de MAS que
possam ser implementados futuramente na raça Gir. Por outro lado, a presença do
alelo A na população de Gir Leiteiro permite levantar a hipótese de introgressão de
genes taurinos da raça Holandesa na população da raça Gir nos primórdios de
sua formação.
Com relação ao polimorfismo DGAT1 VNTR, as amostragens das raças
Sindi e Gir apresentaram os menores valores de heterozigosidade e menor
número de alelos, mas os valores de déficit de heterozigotos não foram
significativos.
O grau de polimorfismo verificado para o locus DGAT1 VNTR, dão suporte
para a possibilidade de futuros estudos de associação entre os alelos de DGAT1
VNTR e a variação nas características de produção e composição do leite nas
raças analisadas.
38
Finalmente, os valores das distâncias genéticas de Nei entre as amostras
das raças estão apresentados nas tabelas 5 e 6, estando também representados
esquematicamente por meio de dendrogramas (Figuras 5 e 6). Verificou-se que
os valores de distância genética variam consideravelmente quando se analisam os
dois loci combinados ou separadamente. As análises feitas com os dois loci em
conjunto agrupam as amostragens das raças Holandesa e Gir, provavelmente
devido à presença do indivíduo homozigoto para o alelo A presente na raça Gir e
as raças Nelore e Guzerá se agrupam devido à ausência do alelo A em ambas as
raças (Figura 5). Quando se considera apenas o polimorfismo DGAT1 VNTR, mais
uma vez as raças Nelore e Guzerá estão mais próximas (Figura 6). Esta estreita
relação entre Nelore e Guzerá também foi observada por Machado e cols. (2003)
utilizando um grupo de nove marcadores microssatélites.
Tabela 5. Distância genética de Nei (1972) calculada a partir das freqüências dos
polimorfismos DGAT1 K232A e DGAT1 VNTR
Raça
Hosltein
Sindi
Gir
Guzerá
Nelore
Hosltein
*****
0,656
0,058
0,695
0,666
Sindi
*****
1,391
0,018
0,032
Gir
*****
1,397
1,300
Guzerá
*****
0,004
Nelore
*****
Tabela 6. Distância genética de Nei (1972) calculada a partir das freqüências do
polimorfismo DGAT1 VNTR
Raça
Hosltein
Sindi
Gir
Guzerá
Nelore
Hosltein
*****
0,128
0,066
0,071
0,049
Sindi
Gir
Guzerá
Nelore
*****
0,317
0,073
0,130
*****
0,151
0,093
*****
0,016
*****
As discrepâncias entre os valores de distância genética para os dois
polimorfismos mesmo estando eles num mesmo gene, podem ser explicadas tanto
pelo contexto genômico no qual cada polimorfismo está inserido (DGAT1 K232A
está num éxon enquanto que DGAT VNTR está numa região promotora não
39
traduzida) quanto pelos mecanismos de mutação pelos quais cada tipo de
polimorfismo evolui.
Figura 7. Dendrograma (UPGMA) baseado nas distâncias genéticas de Nei
calculadas a partir freqüências dos polimorfismos DGAT1 K232A e DGAT1 VNTR
Figura 8. Dendrograma (UPGMA) baseado nas distâncias de Nei calculadas a
partir das freqüências do polimorfismo DGAT1 VNTR.
40
5. Conclusões
Os resultados do presente trabalho permitem concluir que para o
polimorfismo DGAT1 K232A, as freqüências alélicas do alelo K para as amostras
das raças Holandesa, Gir e Sindi foram de 27%, 96% e 97,5% respectivamente.
Nas amostras das raças Nelore e Guzerá verificou-se que o locus era
monomórfico (ausência do alelo A).
O locus DGAT1 VNTR se mostrou polimórfico em todas as raças, sendo
número de alelos variável entre os grupos. Entretanto, os três alelos mais
freqüentes são os mesmos nas cinco amostras das raças. O significativo déficit de
heterozigotos em ambos os locus, na raça Holandesa, indica a ocorrência de
endogamia.
41
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