MEDEIROS, G.D.A.; RÊGO, M.M.; REGO, E.R.; DIAS, J.A.; BARROSO, P.A.; PESSOA, A.M.S.; CRISPIM, J.G.; Identificação
molecular de alelos-s do maracujazeiro amarelo (Passiflora edulis Sims.). In: II Simpósio da Rede de Recursos Genéticos Vegetais do
Nordeste, 2015, Fortaleza. Anais do II Simpósio da RGV Nordeste. Fortaleza, Embrapa Agroindústria Tropical, 2015 (R 106).
Identificação molecular de alelos-s do maracujazeiro amarelo (Passiflora edulis
Sims.)
Gláucia Diojânia Azevêdo Medeiros1; Mailson Monteiro do Rêgo3; Elizanilda Ramalho do Rêgo3;
Jefferson Alves Dias1; Priscila Alves Barroso1; Angela Maria dos Santos Pessoa1, Joelson
Germano Crispim2
1
Pós-graduação em Agronomia. Universidade Federal da Paraíba, 58397-000,; e-mail: [email protected],
[email protected], [email protected], [email protected].
Bolsista de iniciação Científica, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal da Paraíba, Areia – PB,
Brasil.. e-mail: [email protected].
2
Docente. Universidade Federal da Paraíba, Areia - PB; e-mail: [email protected], [email protected].
Palavras Chave: Autoincompatibilidade, Locus-S, SLG, Passifloraceae
Introdução
O maracujazeiro (Passiflora edulis Sims), embora apresente flores hermafroditas férteis,
normalmente é incapaz de fertilizar suas próprias flores ou flores de plantas que possuem a mesma
constituição genética, devido à presença da autoincompatibilidade (Bruckner et al., 1995). A
autoincompatibilidade em P. edulis é do tipo homomórfica esporofítica, controlada por um loco-S
multialélico, que codifica para enzimas que interrompem a formação do tubo polínico no processo de
polinização de plantas autoincompatíveis, impedindo a fecundação (Rego et al., 2000). A identificação de
alelos-S é um processo demorado, pois um grande número de cruzamentos testes é necessário. Além
disso, o fenótipo da autoincomptibilidade é influenciado tanto por fatores ambientais quanto pelo estado
fisiológico das plantas. Neste sentido, a identificação molecular dessa característica permitiria uma análise
mais rápida e acurada da diversidade genética tanto em coleções de trabalho quanto em bancos de
germoplasma de Passifloraceaes. Assim como, o conhecimento dos alelos-S de cada cultivar torna-se de
fundamental importância para o manejo dos pomares quanto à adequada polinização das flores, além de
ser crucial para o entendimento da base genética da autoincompatibilidade em maracujazeiro (Takayama e
Isogai, 2005). O objetivo deste trabalho foi identificar a nível molecular alelos-S do sistema de
autoincompatibilidade do maracujazeiro amarelo (P. edulis Sims), visando identificar genótipos com
suficiente diversidade genética.
.
Material e Métodos
O experimento foi realizado no Laboratório de Biotecnologia Vegetal da Universidade Federal da
Paraíba, Areia, PB. Foram utilizadas vinte plantas do híbrido BRS Gigante Amarelo (GA), coletadas no
município de Remígio, PB. As quais apresentam fenótipos distintos com base nos alelos da
autoincompatibilidade. O DNA genômico de cada planta foi extraído a partir de 200 mg de folhas jovens,
usando o método descrito por Doyle e Doyle (1990). Para reação de amplificação, 2,5 μL do DNA genômico
das plantas foi misturado com 2,5 μL de cada iniciador específicos de SLG de Brassica, descritos por Nishio
et al. (1996), utilizando cinco combinações distintas (PSA+PSB, PS3+PS4, PS3+PS21, PS5+PS15 e
PS15+PS18). A condição de PCR foi de 30 ciclos térmicos de 1 min a 93 °C, 2 min a 55 °C, e 3 minutos a
72 °C. Para as combinações PS3+PS4 e PSA+PSB as temperaturas de anelamento foram de 50 °C e 58
°C, respectivamente. Os produtos de PCR foram analisados por electroforese em gel de agarose 1,5%, em
tampão TBE 0,5X, 60V por 60 minutos, usando como padrão o marcador de massa molecular o DNA
Ladder 1 kb (Ludwig Biotecnologia LTDA). Os géis foram corados com brometo de etídio e
fotodocumentados.
Resultados e Discussão
Nos ensaios de amplificação realizados foi observado em quase todos os genótipos, o fragmento de
1,3 kb com os iniciadores da classe II de SLG de Brassica (Figura 1). Os iniciadores específicos da classe I
de SLG (PS5+PS15 e PS15+PS18) não amplificaram o DNA genômico das plantas testadas, provavelmente
em decorrência da falta de homologia na região de anelamento, visto que a semelhança entre alelos de
classe I e classe II de Brassica é em torno de 70% (Nishio et al., 1994). Segundo Nishio et al. (1996), não
existe sequência espécie-específica em alelos SLG, portanto, possivelmente os alelos-S analisados neste
trabalho, estão incluídos apenas na classe II de SGL de Brassica. Rêgo (2001), trabalhando com outras
progênies de maracujazeiro, verificou que, em ensaios de amplificação utilizando os iniciadores da classe I
de SLG (PS5+PS15) e da classe II (PS3+PS21) de Brassica, incluíram seus alelos-S na classe I de SLG.
II Simpósio da Rede de Recursos Genéticos Vegetais do Nordeste
Fortaleza, 10-13 de novembro de 2015
Valorização e Uso das Plantas da Caatinga
Os perfis eletroforéticos dos fragmentos amplificados pela reação de PCR mostraram-se complexos, pois
além do fragmento esperado de 1,3 kb, ocorreu a amplificação de bandas adicionais (Figura 1A e 1B).
Fragmentos adicionais podem ser amplificados simultaneamente com estas combinações de iniciadores,
pois os mesmos apresentam semelhança de sequência com os genes SRK, SLR2 e SRLI (Nishio et al.,
1996).
Figura 1. Análise em gel de agarose dos ensaios de amplificação via PCR realizados com amostras de DNA
genômico de vinte plantas de P. edulis Sims, variedade híbrida, BRS-Gigante Amarelo, utilizando
iniciadores para SLG da classe II. (A) Iniciadores PSA+PSB. (B) Iniciadores PS3+PS21. (C) Iniciadores
PS3+PS4. As setas indicam o fragmento de tamanho esperado. M: Marcador Molecular
Conclusões
O fragmento correspondente ao gene SLG do loco-S (1,3 kb), foi amplificado na maioria dos
genótipos de Passiflora edulis Sims. Fragmentos adicionais também foram amplificados, provavelmente,
devido à semelhança de sequência do gene SLG com os genes SRK, SLR2 e SRLI. A partir desses
resultados, será possível analisar e comparar a diversidade genética dos alelos relacionados ao loco-S de
forma mais rápida e precisa.
Referências
BRUCKNER, C. H.; CASALI, V. W. D.; MORAES, C. F. DE; REGAZZI, A. J.; SILVA, E. A. M. Selfincompatibility inpassion fruit (Passiflora edulis Sims). Acta Horticulturae. The Hague, n. 370, p. 45-57,
1995.
DOYLE, J. J.; DOYLE, J. L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, v.1, p.13-15. 1990.
NISHIO, T.; KUSABA, M.; WATANABE, M.; HINATA, K. Registration of S alleles in Brassica campestris L by
the restriction fragment sizes of SLGs. Theoretical and Applied Genetics, v. 92, p. 388-394. 1996.
NISHIO, T.; SAKAMOTO, K.; YAMAGUCHI, J. PCR-RFLP of S locus for identification of breeding lines in
cruciferous vegetables. Plant Cell Rep, v. 13. 1994
RÊGO, M. M. Indução in vitro de Haploides e de Poliploides e Detecção Molecular de Alelos da Autoincompatibilidade em Maracujazeiro (Passiflora edulis f. flavicarpa Deg). 75 f. Tese (Doutorado em
Genética e Melhoramento), Universidade Federal de Viçosa, Minas gerais, 2001.
RÊGO, M. M. DO; RÊGO, E. R.; BRUCKNER, C. H.; SILVA E. A. M. DA; FINGER, F. L.; PEREIRA, K. J. C.
Pollen tube behavior in yellow passion fruit following compatible and incompatible crosses. Theoretical and
Applied Genetics, v. 101, p. 685-689. 2000.
TAKAYAMA, S.; ISOGAI, A. Self-Incompatibility in Plants. Annual Review of plant Biology, Palo Alto CA,
USA, v. 6, p. 467-489. 2005.
II Simpósio da Rede de Recursos Genéticos Vegetais do Nordeste
Fortaleza, 10-13 de novembro de 2015