Anais do XIX Encontro de Iniciação Científica – ISSN 1982-0178
Anais do IV Encontro de Iniciação em Desenvolvimento Tecnológico e Inovação – ISSN 2237-0420
23 e 24 de setembro de 2014
IDENTIFICAÇÃO TAXONOMICA DE CUPINS COHABITANTES
DE MONTÍCULOS DE SOLO NA REGIÃO DE CAMPINAS
COM BASE EM SEQUENCIAS DE DNA
João H. P. Giudice
Faculdade de Ciências Biológicas
Centro de Ci6encias da Vida
[email protected]
Resumo: A espécie Cornitermes cumulans é também
conhecida como cupim de montículo e já foi descrita
como praga de cultura de cana-de-açúcar. Ninhos de
C. cumulans podem ser utilizados como habitat de
várias outras espécies, incluindo outras espécies de
cupins e formigas. Uma vez que o gênero Cornitermes
já foi descrito como praga de cana-de-açúcar por alguns autores, sua presença no agroecossistema poderia estar correlacionada com a ocorrência e distribuição de outras espécies co-habitantes, também com
potencial de praga. Assim, é fundamental conhecer as
espécies que se associam a esse gênero para avaliar
o potencial de risco que esses cupins podem trazer à
agricultura. O presente trabalho teve como objetivo
identificar, através de sequencias de DNA, as espécies de cupins que co-habitam ninhos epígeos na região de Campinas. Para a identificação molecular foram extraídos DNA de amostras de cupins provenientes de diferentes regiões no distrito de Campinas, seguido de amplificação por PCR e sequenciamento do
gene COII destas mesmas amostras. A identificação
foi realizada por comparação de similaridade entre
sequencias obtidas no presente trabalho e sequencias
depositadas no GenBank. A identificação por DNA
provou ser eficiente na classificação de espécies, em
vários graus taxonomicos, desde que o banco de dados possua sequencias de DNA para comparação.
Sendo assim, em alguns casos, este tipo de identificação foi capaz jikde confirmar as espécies já classificadas anteriormente pela taxonomia clássica como foi o
caso para Procornitermes araujoi. Em outros casos,
por exemplo Rynchotermes nasutissimos, este método foi incapaz de identificar o gênero e espécie da
amostra devido ao fato do banco de dados não possuir sequencias similares para comparação; num outro
exemplo, onde a taxonomia clássica não conseguiu
identificar a espécie do gênero Velocitermes, por
comparação em banco de dados, as sequencias de
Edmilson Ricardo Gonçalves
Grupo de pesquisa: ecologia, biologia Molecular e
Filogenia de cupins
Centro de Ciências da Vida
[email protected]
DNA obtiveram resultado positivo, sendo capazes de
indicar a espécie em análise.
Palavras-chave: cupim, código de barra de DNA, taxonomia.
Área do Conhecimento: Ciências Biológicas
Sub-área: Biologia Molecular
1. INTRODUÇÃO
A espécie Cornitermes cumulans é também
conhecida como cupim de montículo. Embora freqüente nos pastos da região sudeste e centro-oeste
de nosso pais, muitos aspectos da biologia dessa
espécie permanecem obscuros, tais como comportamento e alimentação [1]. Os estudos sobre essa
espécie, no que se refere ao seu potencial como praga ainda é controverso [2,3]. Assim como a maioria
das espécies do gênero Cornitermes, C. cumulans
constrói ninhos epígeos e são consumidores de serrapilheiras [4]. Os ninhos de C. cumulans podem ser
utilizados como habitat de várias outras espécies,
incluindo outras espécies de cupins e formigas. Sendo que já foi registrada a presença de duas a 14 espécies em um mesmo ninho [5,6.7].
Além das diferentes espécies de térmitas, outros insetos têm sido encontrados como co-habitantes
dos ninhos, em especial formigas, como o relatado na
literatura [8,9} . Diversos fatores podem determinar a
ocorrência ou não de co-habitantes, entre eles a capacidade da espécie de construir ninhos; as características do ninho; os mecanismos de defesa e a quantidade de soldados das colônias; as características de
outras espécies presentes na área de estudo e, por
fim, a densidade com que estas aparecem.
A identificação de espécie utilizando como
princípio a comparação de sequencias de DNA teve
início nos anos 1990 com o desenvolvimento da téc-
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nica de PCR [10]. Desde então, esta técnica vem facilitando e ajudando o trabalho de taxonomistas uma
vez que espécimes danificadas, imaturas ou mesmo
larvas e ovos são muito difíceis ou impossíveis de
serem classificados até mesmo por um profissional
experiente
(http://www.barcodeoflife.org/content/about/what-dnabarcoding). Mais tarde o DNA barcoding (Código de
barra de DNA) foi introduzindo por Paul Hebert.
O presente trabalho apresenta uma primeira
etapa na compreensão da Biologia das espécies de
cupins cohabitantes de ninhos de Cornitermes cumulans, abrindo possibilidades de novos estudos com
foco no controle e dispersão das espécies pragas.
2. Material e Métodos
Coleta de cupins e extração de DNA
Foram escolhidas 9 áreas aleatórias na região
de Campinas que apresentavam pastos com ninhos
epigeos (Figura 1 e Quadro 1).
Todas as áreas foram delimitada em uma fração de 100 X 100 metros compreendida entre 4 pontos, cada qual georreferenciados (Quadro 1). Foram
coletadas amostras de cupins de todos os cupinzeiros
visíveis no interior dessa área selecionada.
Quadro 1: Informações das coletas: áreas de coleta,
data das coletas , coordenadas geográficas e a indicação na Figura 1.
Data
Área de coleta
29/10/2012
Bela Aliança
09/01/2013
Viracopos
14/03/2013
Taquaral
14/03/2013
18/03/2013
18/03/2013
D. Pedro (Rossi)
Escola de Cadetes (Circulo
Militar)
Parque Ecólogico
21/03/2013
Balão Iguatemi
27/03/2013
San Conrado
15/01/2014
Trilha Joaquim
Egídio
Coorda
S22º56’50”
W47º08’115”
S23º02’345”
W047º08’244”
S22º52'351"
W047º02'958"
S22º50'911"
W047º03'556"
S22°52'305"
W047°04'787"
S22°54'546"
W047°00'938"
S22°53'767"
W047°01'786"
S22°51'114"
W046°58'336"
S22°52'410''
Indicação no
Mapa
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Figura 1 . Áreas de coletas de cupins de ninhos epigeos
na região de Campinas, SP representados por pontos
amarelos. (imagem:Google Earth)
Coleta e triagem
Primeiramente, os montículos (cupinzeiros)
foram georreferenciados, tendo seus pontos
marcados e anotados, a data da coleta e o número do
ninho foram postos a frente do monte para registro
fotográfico (Figura 2). Os ninhos encontrados foram
caracterizados quanto ao diâmetro e altura da porção
epígea, medindo-se o diâmetro da porção superior,
média e inferior (Figura 3).
Com uma picareta o ninho foi quebrado e os fragmentos tirados foram levados em sacos plásticos com
identificação do ninho e da porção escolhida. O material coletado foi levado para laboratório para identificação das espécies presentes de acordo com a porção
no ninho de onde foram coletados. Em uma segunda
triagem, o material foi separado, tendo uma parcela
encaminhada para analise de DNA, outra com térmitas (cupins) e possíveis térmitas co-habitantes (encontrados no mesmo cupinzeiro) e uma ultima com não
térmitas co-habitantes . Todos os dados obtidos foram
registrados em planilha de Excel e identificados. O
material foi armazenado a -20° em etanol 80%
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Identificação
morfológicas
com
base
em
características
A identificação taxonômica com base em
características morfológicas (identificação clássica) foi
realizada com base em chave dicotômicas disponíveis
na literatura pelo grupo da pesquisora Luciane Kern
Junqueira da Pontifícia Universidade Católica de
Campinas.
Extração e purificação de DNA
Apos a extração e purificação de DNA de cupins de acordo com protocolo descrito em literatura
[11]. Após a purificação, todas amostras de DNA foram mantidas sob refrigeração à 8ºC.
Para a avaliação da qualidade e quantidade
de DNA, 5 mL de cada amostra extraída e purificada
com os diferentes métodos foram submetidas à eletroforese em gel de agarose 1 % em TAE 1X (Trisacetate-EDTA) e corados com blue Green Loading
dye (Figura 2) de acordo com as especificações do
fabricante (LAB TRADE).
o
ciclos de 1 minuto a 94oC, 1 minuto a 46 .C e 1 minuo
to a 72 .C, 35 ciclos de de 1 minuto a 94oC, 1 minuto
o
o
a 52 C e 1 minuto a 72 .C, seguidos de 3 minutos a
o
72 .C.
Escolha das amostras para sequenciamento de DNA
Utilizou-se amostras de todas as áreas e
abrangendo famílias, gênero e espécies diferentes
para se obter uma variedade maior de resultados e
possibilitar a comparação entre eles.Uma vez escolhidas as amostras para identificação molecular, seus
respectivos DNAs foram utilizados para amplificar o
gene mitocondrial COII. Os produtos dessas amplificações foram purificadas com a enzima Exo-sap para
remover qualquer remanescente de primer e/ou
dNTPs do PCR e encaminhadas ao Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho (LACTAD)
da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP).
Os resultados do sequenciamento foram analisados com o auxilio de três programas, BioEdit; Sequence Scanner 2 e Gene Runner. Uma vez verificada a qualidade das sequencias de DNA obtidas, essas
foram submetidas a comparação com sequencias depositadas no Genbank por Blastn (NCBI) para identificação das espécies.
3. Resultados e discussões
Figura 2: Eletroforese em gel de agarose 1% com amostras de DNA de cupim
Escolha dos primers para amplificação das subunidades de citocromo oxidase.
Artigos descrevendo a amplificação dos genes
CO1, CO2, CO3 em insetos foram avaliados em busca dos melhores primers (iniciadores). De acordo com
as descrições dos resultados nos artigos encontrados
foram selecionados 5 primers. Os primers para amplificação do gene mitocondrial COI, COI, HCO e LCO
foram sintetizados de acordo com as sequências descritas por Miura et al. (1998), Liu & Beckenbach
(1992) e Folmer et al. (2007) respectivamente.
No presente trabalho o gene amplificado foi o
gene CO2 (Citocromo oxidase subunidade 2) utilizando os primers P2 (2B-Lys) e P3 (1-C1-J-2773). As de
amplificação por PCR foram efetuadas em volume
final de 25 microlitros nas seguintes condições: 1 mio
nuto a 94 .C de desnaturação incial. Seguido por 5
Identificação Taxonômica Das amostras de cupins coletadas em ninhos
epigeos na região de Campinas, com base em características morfologicas, puderam ser identificadas algumas espécies e, em alguns casos, até gêneros, por
ausencia de chave de classificação do grupo em
questão (Quadro 2). A partir desses dados, as amostras foram selecionadas para análises de Biologia Molecular, buscando a identificação da espécie ou a confirmaçao dos dados de taxonomia clássica.
No presente trabalho, amostras de cupins das
espécies Procornitermes araujoi e Cornitermes cumulans puderam ser identificadas com similaridade acima
de 98% com sequencias de DNA depositadas no
Genbank. Entretanto, amostras de espécies do gênero
Rynchotermes não puderam ser identificas corretamente, apresentando similaridade máxima de 89%
com o gênero Embiratermes. O mesmo foi encontrado
para a amostra 402 de Labiotermes longilabius. O
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DNA dessa amostra apresentou 91% de similaridade
com Embiratermes transandinus. Em ambos os casos,
se deve ao fato de não haver, até o momento, nenhuma sequencia depositadas de gene mitocondrial
COII de espécies do gênero Rynchotermes ou Labiotermes no Genbank.
A amostra 474, identificada por características morfológicas como Cornitermes cumulans apresentou similaridade de 95% com sequencia dessa mesma espécie depositada no Genbank. Esse resultado é interessante, pois 5% de divergência pode significar uma
espécie diferente dentro do gênero Cornitermes. Hebert et al (2003) trabalhando com espécies de borboletas, encontrou variação menor que 1% entre indivíduos de uma mesma espécie e variações entre 5 e
10% entre espécies de um mesmo gênero. O resultado encontrado com Cornitermes pode representar duas espécies distintas muito semelhante morfologicamente ou uma mesma espécie com grande variação
na sequencia do gene COII analisado. Outras amostras de Cornitermes cumulans precisam ser analisadas para verificar essa dúvida.
A amostra 122 de velocitermes sp apresentou 91% de
similaridade com a espécie Velocitermes velox. Esse
valor é insuficiente para que a amostra seja classificada como Velocitermes velox. O valor está num nível
aceitável para a confirmação do gênero, mas não para
a espécie.
Em todos os casos, a correta identificação
depende de um banco de sequencias consistente e
baseado em uma correta identificação taxonômica
clássica. Em outras palavras, quanto mais amostras
corretamente classificadas forem depositadas no banco, maior o sucesso na classificação molecular de trabalhos posteriores. É importante que espécies brasileiras de cupins também sejam analisadas e depositadas nesse banco, permitindo a correta identificação
das espécies de cupins por diferentes grupos de pesquisa, passo essencial para a compreensão da biologia desses insetos.
4. REFERÊNCIAS
[1]
SANTOS
et al. (2011). Comunicação
sobrevivência de operários do cupim-de-montículo
Cornitermes cumulans ( kollar , 1832 ) ( Isoptera  :
Termitidae ) alimentados, 151–154.
[2] VALÉRIO et al. (1998). Controle Químico e
Mecânico de Cupins de Montículo ( Isoptera  :
Termitidae ) em Pastagens, 27 (1): 125–131.
[3] WILCKEN, C.F. (1992). Anais da Sociedade
Entomológica do Brasil, 21: 329-338.
[4] CONSTANTINO, R. (1999). Papéis Avulsos de
Zoologia, v. 40: 387-448.
[5] DOMINGOS et al. (1996). Rev. Bras. Biol., v. 56:
717-723.
[6] DOMINGOS, et al. (1996). Rev. Bras. Biol., v. 56:
717-723.
[7]
FLORENCIO et al. (2002).
Leopoldensia, v.24: 205-207.
Acta
Biologia
[9] DIEHL et al.. (2005). Brazilian journal of biology =
Revista Brasileira de Biologia, 65(3), 431–7.
[10] ROSA, A. J. de M.; SONODA, K. C.. 2010. Disponível
em:
<http://www.cpac.embrapa.br/noticias/artigosmidia/
publicados/217/>. Acesso em: 22 jul. 2010.
[11] DONNAN LABORATORIES. Disponível em:
http://www.genomics.liv.ac.uk/animal/RESEARCH/I
SOLATIO.PDF. Acesso em 19/01/2011.
[12] MIURA et al. (1998). Annals of Entomology Society of America, 91: 515 – 523.
[13] LIU. H. & BECKENBACH, A.T. (1992). Molecular
and Phylogenetic Evolution, 1: 41 – 52.
[14] FOLMER et al. (1994). Molecular Marine Biology
and Biotechnology , 3 , 294 – 299 .
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Quadro 2: Comparação entre a taxonomia clássica e
molecular de amostras de Cupins
Amostra
Identificação Taxonômica com
base em características morfológicas
Identificação Molecular
Gênero
Espécie
Gênero
171
Rynchotermes
nasutissimos
474
165
Cornitermes
Orthagnathotermes
219
% Similaridade
com GenBank
Embiratermes
Espécie
transandinus
89%
cumulans
Cornitermes
sp
95%
mirim
Orthagnathotermes
sp
92%
Procornitermes
araujoi
Procornitermes
araujoi
98%
487
Cornitermes
cumulans
Cornitermes
cumulans
99%
499
Cornitermes
cumulans
Cornitermes
98%
412
Labiotermes
longilabius
Embiratermes
cumulans
transandinus
215
Procornitermes
araujoi
Procornitermes
araujoi
99%
122
Velocitermes
sp
Velocitermes
velox
91%
418
Cornitermes
cumulans
Cornitermes
cumulans
99%
91%