Área de Ciências da Saúde – Curso de Medicina
Módulo: Saúde do Adulto e Idoso II – GENÉTICA HUMANA
Professora: Dra. Juliana Schmidt
EXTRAÇÃO DE DNA
O genoma, composto por DNA, é nosso código hereditário. Este é o chamado projeto que controla grande
parte da nossa aparência, comportamento e tendências. A transferência deste projeto, de geração em geração, é
chamada hereditariedade. O código hereditário é “criptografado” dentro da seqüência das moléculas de DNA que
compõem o genoma. O genoma é composto por DNA associado a complexos de proteínas formando os
cromossomos. Procariontes, organismos sem um verdadeiro núcleo, têm apenas um cromossomo. Já os
eucariontes, como os seres humanos, tem um núcleo de célula definida que contém múltiplos cromossomos. O
número de cromossomos varia de acordo com o organismo - a partir de 2 ou 3 em algumas leveduras para até 100
ou mais em alguns peixes. Os seres humanos têm 46. Na maioria dos casos, os cromossomos vêm em pares quase
idênticos (um membro do par cromossômico de cada genitor). Em geral, os membros de um par diferem em
pequena proporção, mas são considerados homólogos.
Todas as células de organismos diplóides duplicam pares cromossômicos quando eles se dividem (exceto
quando espermatozóides e óvulos são formados), de modo que todas as células do corpo (células somáticas) de
um organismo são diplóides. O processo de divisão celular em que os cromossomos são duplicados e cada célulafilha recebe pares de cromossomos é chamado mitose, enquanto a meiose leva a formação dos gametas haplóides.
É através dos processos de mitose e meiose que o código hereditário é passado de célula para célula e de geração
para geração.
Estima-se que os 23 pares ou 46 cromossomos do genoma humano (23 cromossomos vêm da mãe e os
outros 23 vêm do pai) contêm cerca de 30.000-50.000 genes. Cada cromossomo contém uma série de genes
específicos. Os cromossomos maiores contêm mais DNA, genes e portanto mais genes, em comparação com os
cromossomos menores. Cada um dos pares de cromossomos homólogos contém genes similares.
Cada gene contém o código para uma proteína particular. Curiosamente, os 30.000-50.000 genes estimados
compreendem apenas 5% do DNA total. Os outros 95% correspondem a DNA não-codificante.
Este DNA não-codificante é encontrado não apenas entre, mas dentro dos genes, dividindo-os em segmentos. A
função exata do DNA não-codificante ainda não foi estabelecida. Quando o DNA é transcrito em RNA, o RNA
primário contém tanto sequencias codificantes quanto não-codificantes. Enquanto o RNA ainda está no núcleo, os
íntrons são removidos do RNA, enquanto o exons são emendados para formar a seqüência de RNA mensageiro
completo que codifica para a proteína (Figura 1). Este processo é chamado RNA splicing e é realizado por um
complexo de enzimas especializadas chamadas de Spliceossomo.
Íntrons muitas vezes variam de tamanho e seqüência entre os indivíduos, enquanto exons não. Esta
variação é resultado do acúmulo diferencial de mutações no DNA ao longo da evolução. Estas mutações no nosso
DNA não-codificante são silenciosamente passadas para os nossos descendentes, nós não notamos porque elas não
afetam nossos fenótipos. No entanto, essas diferenças em nosso DNA representam a base molecular de DNA
fingerprinting usado em identificação humana e estudos em genética de populações.
A seqüência alvo para estudo
O genoma humano contém pequenos elementos ou seqüências de DNA repetitivo (SINEs) que foram
aleatoriamente inseridas nele ao longo de milhões de anos. Um desses elementos repetitivos é
chamado de "seqüência Alu" (Figura 2). Esta é uma seqüência de DNA de cerca de 300 pares de bases que se
repete quase 500 mil vezes ao longo do genome. A origem e a função destas seqüências repetidas ainda não é
conhecida.
Algumas dessas seqüências Alu têm características que as tornam muito úteis para geneticistas. Quando
presentes dentro de íntrons de certos genes, elas podem ser associadas com uma doença ou ser usadas para
estimar parentesco entre os indivíduos. Nestas atividades de laboratório você vai pesquisar um elemento Alu na
região PV92 do cromossomo 16. Este elemento Alu particular é dimórfico, o que significa que o elemento está
presente em alguns indivíduos e outros não. Algumas pessoas têm a inserção em uma cópia do
cromossomo 16 (um alelo), outros podem ter a inserção em ambas as cópias do cromossomo 16 (dois
alelos), enquanto alguns podem não ter a inserção de cada cópia do cromossomo. A presença ou ausência destas
inserções podem ser detectadas usando PCR seguida de eletroforese em gel de agarose. Nessa atividade, a análise
de uma repetição Alu única é usado para estimar sua freqüência na população e como uma simples medida da
variação genética molecular - sem nenhuma referência à doença ou parentesco entre os indivíduos. Para obter DNA
para uso na reação em cadeia da polimerase (PCR), você irá extrair o DNA a partir do seu próprio células vivas. É
interessante notar que o DNA também podem ser extraídos de múmias e ossos de dinossauros fossilizados.
Extração de DNA
Para a análise de DNA a primeira etapa importante é o seu isolamento. A extração de DNA de células
eucariontes consta fundamentalmente de três etapas:
•
ruptura das membranas celulares para liberação do material genético;
•
desmembramento dos cromossomos em seus componentes básicos: DNA e proteínas;
•
separação do DNA dos demais componentes celulares.
Nesta atividade de laboratório, você vai isolar o DNA de células epiteliais que revestem o interior de sua
bochecha. Para fazer isso, você vai lavar a boca com um solução salina e recolher as células usando uma
centrífuga. Então você vai ferver as células para rompê-las e liberar o DNA que contêm. As células da mucosa da
bochecha são transferidos para um microtubo contendo a matriz InstaGene ™. Esta matriz de partículas é
constituído por carga negativa, capaz de sequestrar íons metálicos da solução, tais como Mg2 +, que são
necessários como catalisadores ou co-fatores em reações enzimáticas. Suas células bochecha serão então lisadas
por aquecimento para liberar todos os seus constituintes celulares, incluindo enzimas que já estiveram contidas nos
lisossomos das células da bochecha. Lisossomos são sacos no citoplasma que contêm enzimas poderosas, como
DNases, que são usados pelas células para digerir o DNA. Quando ocorre a ruptura das células, esses DNases
podem digerir o DNA liberado. No entanto, quando as células são lisadas na presença de quelantes, os cofatores
são adsorvidas e não estão disponíveis para as enzimas. Isso inibe degradação enzimática do DNA
extraído, para que você possa usá-lo como o modelo em sua reação de PCR, na atividade seguinte.
Você primeiro irá suspender as células da mucoda da sua bochecha na matriz InstaGene e incubar
-las a 56 ° C por 10 minutos. Esta etapa pré-incubação ajuda a suavizar membrana plasmática
e
aglomerados
liberação
de células do
outro.
O
calor também
inativa enzimas,
como
a
DNases, o que pode degradar o modelo de DNA. Após este período de incubação de 10 minutos,
as células são levadas a ebulição (100 ° C) em banho-maria por 5 minutos, para promover a ruptura das
membranas e liberar o DNA de seus núcleos. Você vai usar o DNA genômico extraído, como o molde para
amplificação PCR na próxima aula prática.
Também nesta atividade podem ser usadas células epiteliais que revestem a base do seu cabelo. Para fazer
isso, você irá coletar dois fios de cabelos. Bons lugares para a obtenção de cabelo são a cabeça, braço ou perna.
Então você vai ferver as células para rompê-las e liberar o DNA que contêm. Para obter DNA puro para PCR
você irá usar o seguinte procedimento: cortar 2 fios com uma bainha visível (uma camada de células em torno da
base do cabelo) ou uma raiz de grande porte (a estrutura em forma de bulbo na base do cabelo) de cerca de 2 cm
e depois transferi-los para um microtubo contendo a matriz InstaGene e uma protease (Proteinase K).
Abaixo é mostrado um esquema dos procedimentos a serem realizados nesta prática:
OBJETIVO
Conhecer os princípios básicos para o isolamento de material genético, a partir da extração de DNA de células da mucosa da
bochecha.
MATERIAL NECESSÁRIO
-
Matriz InstaGene (Biorad)
-
Microtubos de 1,5mL
-
Proteinase K (20mg/mL)
-
micropipetas de 20, 200 e 1000µL
-
copinho de plástico com 10mL de solução salina 0,9%
-
Ponteiras de 200 e 1000µL
-
vortex
-
microcentrífuga
-
Suporte para microtubos
-
Banho-maria a 56°C e outro a 100°C
PROCEDIMENTO
A extração de plasmídeos será feita segundo o método a seguir:
1.
Separar 2 microtubos e identificá-los.
2.
Coletar as células da mucosa da bochecha fazendo um bochecho vigoroso com solução salina por 30 segundos;
3.
Transferir 1mL desse lavado da mucosa para um dos microtubos e centrifugar a 6000 rpm por 2 minutos;
4.
Descartar o sobrenadante e verificar a quantidade de células obtida, se necessário repetir a etapa anterior;
5.
Ressuspender o sedimento de células no vortex e transferir 20uL para o outro microtubo contendo a matriz (200uL);
6.
Agitar no vortex e depois incubar a 56°C por 10 minutos (agitando na metade do tempo);
7.
Transferir o microtubo para o BM a 100°C e incubar por 5 minutos;
8.
Agitar o microtubo no vortex e depois centrifugar a 13.000rpm por 5 minutos;
9.
Coletar o sobrenadante tendo o cuidado de não coletar a matriz, e transferi-lo para um novo microtubo identificado;
10. Armazenar a -20°C até a aula de PCR.
Obs: caso sejam usadas células do folículo capilar, coletar 2 fios com bulbo, cortar no tamanho de aproximadamente 2cm e
transferir para o microtubo contendo a matriz + 0,7uL de proteinase K (p/ 66ug/mL), procedendo do mesmo modo que o anterior a
partir do item 4.
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Módulo: Saúde do Adulto e Idoso II – GENÉTICA HUMANA
Professora: Dra. Juliana Schmidt
EXTRAÇÃO DE DNA
Relatório de aula prática – Data:____/____/____ - Turma:____
Nota:
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QUESTÕES
1. Quais fontes de material biológico podem ser usadas para obtenção de DNA?
2. Qual o objetivo da etapa de lise na extração de DNA?
3. Por que é importante quelar íons metálicos na etapa de lise?