Validação de Métodos e
Instrumentos em Análise Química
6 de Novembro de 2006
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Considerações Gerais sobre
Validação/Qualificação (1de2)
• É indispensável que os trabalhos executados num
laboratório mereçam confiança.
• Sendo qualquer actividade humana susceptível de erros,
devem ser tomadas precauções para diminuir as
probabilidades de que ocorram erros.
• Admitir-se-á que o laboratório deverá dispor de meios
humanos que, além de serem em número suficiente são
devidamente competentes e qualificados. Iremos discutir:
– Instrumentos de medida usados em ensaios.
– Sistemas de aquisição e tratamento de dados.
– Métodos de ensaio.
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Considerações Gerais sobre
Validação/Qualificação (2de2)
• Num laboratório, tem que se assegurar que os
meios materiais e humanos são adequados para a
realização dos ensaios (em qualificação e número).
• Para efeito de exposição destes assuntos serão
tratados em separado os vários componentes do
Laboratório: nesta aula vamos admitir que os
equipamentos do laboratório e os respectivos
operadores estão qualificados para a realização
dos ensaios e começaremos por apresentar e
discutir a validação de métodos de análise
química.
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Validação de Métodos de Ensaio
• A Validação dum Método de Ensaio (de Análise) é
o procedimento utilizado para provar que esse
método de análise é suficientemente rigoroso para
dar resultados dignos de confiança para o fim em
vista.
• Para isso, há que verificar a conformidade do
método com vários critérios para o que terá que se
proceder a ensaios de forma ajustada à natureza do
método e das amostras a analisar.
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Delineamento Experimental para
Ensaios de Validação
• Antes de começar o trabalho experimental há que
ter em conta a natureza das técnicas utilizadas bem
como o trabalho já realizado no desenvolvimento
do método de ensaio. Vai tomar-se como exemplo
um tipo de método para análise química.
• Para enquadrar a discussão deste assunto vai então
admitir-se que se usa uma técnica cromatográfica
e em que não é necessário ter preocupações com
pormenores relativos às fases de amostragem,
conservação de amostras e pré-tratamento das
amostras a ensaiar.
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Critérios de Validação e
Adequabilidade do Método
• Vamos avaliar o método de análise química utilizando
vários critérios mas no fim terá que ser feita uma avaliação
global do método para verificar se é adequado para os fins
em vista.
• Na realidade, um método de análise pode servir para
analisar um componente duma amostra e ser inadequado
para analisar outro tipo de amostra: pode considerar-se
como exemplo um método de análise de ferro num minério
em que o teor pode ser da ordem de 70% e, por outro lado,
a análise de ferro numa água natural em que a
concentração de ferro pode ser da ordem de 70ppm.
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Selectividade/Especificidade
(Interferências)
• Possibilidade do método fazer discriminação entre
o composto que está a ser analisado e outros
componentes (interferentes) eventualmente
existentes na amostra a analisar.
• No caso de técnicas cromatográficas, esta
verificação pode ser sistematizada em termos de:
•
•
•
•
•
Factor de capacidade do componente a analisar
Número de pratos teóricos da coluna cromatográfica
Factores de separação
Factores de resolução
Assimetria do pico cromatográfico.
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Linearidade (1de2)
• Como sugestão, ensaiar soluções de padrão em
diferentes concentrações situadas (por exemplo)
na gama de 10 a 150% da concentração que se
prevê existir nas amostras.
• Verificar se existe uma relação linear entre os
valores medidos e as concentrações:
– Observar o aspecto da curva de calibração.
– Cálculo de regressão linear.
Prestar atenção aos resíduos (em valores relativos) e
verificar se os desvios em relação à recta de mínimos
quadrados são superiores a 5%.
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Linearidade (2de2)
• Relativamente a este tratamento pode discutir-se:
– Inclusão ou não da origem nos pontos experimentais.
– No caso de haver indícios de desvios de linearidade,
experimentar ajustamentos não lineares pelo método de
mínimos quadrados e testar os resultados por critério
estatístico (existem normas como, por exemplo, ISO
Standards Compendium, First Edition, Geneva, 1994).
– Muitas vezes, opta-se por estabelecer a gama de de
trabalho em zona de linearidade e diluir amostras se for
necessário.
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Medição da Amplitude do Ruído
• Para calcular o limite de detecção interessa medir
o valor da amplitude de ruído de período curto
para o que há vários métodos como traçar só duas
rectas paralelas ou considerar segmentos e fazer a
média dos ruídos medidos para os segmentos.
• Em alternativa a este método “pico a pico”, pode usar-se
método de cálculo RMS (Root Mean Square) que também
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existe em muitos sistemas de dados.
Limites de Detecção e de Quantificação.
Sensibilidade do Método
• Limite de detecção corresponde à concentração
mínima que é detectável nas condições do ensaio:
– Pode considerar-se igual à concentração correspondente
a 2 ou 3 vezes o ruído de período curto.
• Limite de quantificação corresponde à
concentração mínima que é quantificável nas
condições do ensaio:
– Pode considerar-se igual à concentração correspondente
a 10 vezes o ruído de período curto.
• Sensibilidade do método: declive da recta de
calibração.
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Precisão (1de2)
• A precisão corresponde a uma medida da
concordância entre os valores obtidos por
aplicação do método em análises (repetidas) para
mesma amostra.
• Nos ensaios para estudar a precisão há várias
etapas e começa-se por avaliar a Repetibilidade:
resultados obtidos em sequência de análises
realizadas para a mesma amostra no mesmo dia
pelo mesmo operador com os mesmos reagentes e
no mesmo equipamento.
• Se os resultados forem considerados satisfatórios,
passa-se para o estudo da precisão intermédia.
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Precisão (2de2)
• Para avaliar a precisão intermédia faz-se um estudo intralaboratorial (no mesmo laboratório) em que análises da
mesma amostra vão ser realizadas em dias diferentes por
diferentes operadores, com reagentes de origem diferente
e, eventualmente, com equipamentos diferentes.
• Finalmente a precisão do método terá de ser avaliada
mediante ensaios inter-laboratoriais organizados por
instituições dignas de confiança e em que se parte de uma
quantidade suficientemente grande de amostra que é
enviada a diferentes laboratórios onde vai ser analisada
pelos métodos usados nesses laboratórios. No fim, é feita
uma análise estatística do conjunto de resultados que é
dada a conhecer aos participantes mas mantendo
confidencial a identidade dos participantes.
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Exactidão (1de2)
• A exactidão vai corresponder a uma medida da
concordância entre o valor obtido por aplicação do
método de análise e o “valor verdadeiro”.
• Modos de proceder:
– São muito usados os ensaios de fortificação de
amostras. Parte-se de uma amostra que não contém o
composto que se pretende dosear e adiciona-se à
amostra uma quantidade conhecida desse composto
pelo que se fica a conhecer a respectiva concentração.
Aplica-se o método de análise e compara-se o valor
medido com o valor teórico. Geralmente o valor é
expresso na forma de percentagem de recuperação.
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Exactidão (2de2)
– No caso de existir um método de referência, a mesma
amostra é analisada pelos dois métodos e os resultados
são comparados.
– Havendo material de referência certificado (ou
equivalente), pode analisar-se esse material pelo
método que está a ser estudado e comparar o resultado
obtido com o valor que consta do certificado.
– A participação em ensaios de intercalibração também
permite avaliar a exactidão pois quando se recebe o
relatório final fica-se a conhecer um valor credível para
a concentração na amostra analisada.
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Robustez
• A robustez do método é uma medida da influência
que pequenas variações de condições
experimentais podem ter nos resultados.
• Para avaliar a influência de variações nos vários
parâmetros, pode testar-se um a um ou então
variar simultaneamente vários mas de acordo com
programação cuidadosa dos ensaios.
• Para uso de amostradores automáticos deve ter-se
em conta a estabilidade das soluções: 16 ou 64
horas.
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Conformidade com Normas
Internacionais de Validação
• Existem normas de validação de método bem
como guias para interpretação de resultados dos
ensaios de validação de que são exemplos:
– USP - United States Pharmacopeia
– ICH – International Conference on Harmonization.
• Os trabalhos de validação de métodos já se
encontram facilitados por software de sistemas
cromatográficos: executam automaticamente tarefas
usando valores previamente especificados para os
parâmetros e verificam se valores calculados estão em
conformidade com os requisitos, produzem documento
(relatório) e fazem registo electrónico dos resultados.
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Considerações Finais sobre
Validação de Método
• Pode aligeirar-se este trabalho de validação de
métodos de análise se os métodos a adoptar no
laboratório forem normalizados ou aceites por
instituições dignas de confiança.
• Outra observação a fazer é que se torna necessário
revalidar um método de ensaio se vão ser feitas
alterações significativas no método.
• Como conclusão final, pode afirmar-se que não
vale a pena fazer análises de rotina com método
que não esteja validado.
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