M a n u a l Té c n i c o
Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina
Manual Técnico
1ª edição - outubro 2008
Por Vinícius Junqueira Hermont,
Médico Veterinário
Pesquisadores UFMG
Pesquisadores Hertape Calier
Agradecimentos
Leishmanioses
Introdução
Classificação e agentes etiológicos
Leishmaniose visceral
11
13
15
19
20
Leishmaniose tegumentar
Leishmaniose cutânea
Leishmaniose cutânea difusa
Leishmaniose mucocutânea
Leishmaniose visceral
Agentes etiológicos e vetores
Morfologia e ciclo biológico
Forma amastigota
Forma promastigota
Epidemiologia e distribuição geográfica
Aspectos clínicos da doença em cães
animais assintomáticos
animais oligossintomáticos
animais sintomáticos
Diagnóstico
Métodos sorológicos
Métodos parasitológicos
Métodos moleculares
Prevenção e controle
Controle do vetor no ambiente
Controle do vetor no animal
Imunoprofilaxia
Resposta Imune
21
22
24
27
29
30
31
32
Índice
Vacinas recombinantes
A proteína A2
Espaço científico
34
36
38
Desenvolvimento da Leish-Tec® - Fase I
40
42
Desenvolvimento da Leish-Tec® - Fase II
43
45
46
47
Produção da Leish-Tec®
50
53
54
58
Protocolo de vacinação/informações comerciais
Referências bibliográficas
61
62
66
70
Publicações sobre a proteína A2
Apresentações em congressos científicos
Introdução
Descrição do experimento
Relato
Resultados
Resultados e discussão
Conclusões
Objetivo geral
Objetivos específicos
Descrição do experimento
Resultados
Resposta Humoral
Resposta Celular
Conclusões
Biossegurança
Boas Práticas de Fabricação (BPF)
Processo produtivo
Hertape Calier Saúde Animal
Em 1944, partindo do ideal cientista, surge o Laboratório Hertape,
fundado por professores da UFMG e tendo sua estratégia empresarial
voltada para a viabilização comercial dos desenvolvimentos tecnológicos
voltados à saúde animal daquela universidade.
Com essa determinação, pôde oferecer ao mercado brasileiro a
atualização tecnológica oriunda da excelência existente na UFMG e em
seus laboratórios, disponibilizando fontes de pesquisa e desenvolvimento
à inspiração científica ao longo desses anos.
No início dos anos 2000, transferindo-se para a cidade de Juatuba, o
Laboratório Hertape inicia a construção do que é hoje o maior parque
científico de produção de medicamentos veterinários, alicerçando ainda
mais sua vocação científica.
Em 2004, com sua destacada atuação no segmento de saúde animal por
mais de meio século e dispondo de uma estrutura industrial comparável
às melhores plantas de produção de medicamentos veterinários do
mundo, o Laboratório Hertape une-se ao Laboratório Calier.
O Laboratório Calier pertence ao Grupo Indukern, da Espanha, que atua
mundialmente na indústria veterinária, farmacêutica, na distribuição
de produtos químicos e em vários outros segmentos mercadológicos,
mantendo forte presença nos continentes europeu e americano.
Surgiu, então, a Hertape Calier Saúde Animal S.A.
Com a certeza da manutenção de Pesquisa & Desenvolvimento
Tecnológico e da excelência industrial, uniram, assim, padrões
internacionais de Medicina Veterinária e expertise das necessidades do
mercado brasileiro, tudo a serviço da saúde animal.
Considerada a mais moderna indústria veterinária da América
Latina, a Hertape Calier é certificada em Boas Práticas de Fabricação
(BPF), elevando seu status de pesquisa, desenvolvimento, produção,
armazenamento e logística.
A estrutura industrial possibilita a produção de linha própria e de
terceiros, atendendo a laboratórios de renome mundial que atuam no
Brasil, assegurando a todos a garantia de qualidade exigida no mercado
mundial.
A planta industrial localizada próximo à capital do Estado de Minas
Gerais, na cidade de Juatuba, com área próxima a duzentos mil metros
quadrados, dispõe de excelente infra-estrutura de construção, dedicando
espaços suficientemente confortáveis e seguros ao desenvolvimento,
suprimento, produção, armazenamento, rotulagem e expedição dos
produtos.
As instalações existentes visam a assegurar as rigorosas exigências de
Boas Práticas de Fabricação (BPF), assim como respeito e preservação
ao meio ambiente, conforto e segurança aos seus colaboradores
e segurança em armazenamento de matérias-primas e produtos
acabados.
A constante evolução do mercado de reprodução assistida, fez com
que a Hertape Calier Saúde Animal S.A. se posicionasse de forma
decisiva para oferecer contribuição positiva ao desempenho produtivo e
lucratividade dos rebanhos.
De olho no atendimento às demandas futuras do mercado mundial,
mantém convênios com as universidades Federal de Minas Gerais
(UFMG), Católica (PUC-MG), Federal de Viçosa (UFV), Universidade de
Ouro Preto (Ufop), Fiocruz e Biomanguinhos. Participa do Instituto do
Milênio, criado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia, representando o
segmento destinado aos estudos e desenvolvimento de novas vacinas.
Tem por princípio a incessante busca de soluções que valorizem a
Medicina Veterinária no Brasil.
Com uma vasta rede de colaboradores, a Hertape Calier é capaz de
assistir técnica e comercialmente a todos os criadores de pequenos e
grandes animais, com uma vasta linha de produtos do seu portfolio,
oferecendo-lhes produtos veterinários produzidos com técnicas capazes
de valorizar o bem-estar e a saúde animal.
“A Hertape Calier é originalmente brasileira, fabricando produtos com
expertise mundial e desenvolvendo o futuro da Medicina Veterinária no
Brasil.”
Pesquisadores UFMG
Ana Paula Fernandes
Possui graduação em Ciências Biológicas (1986), mestrado em Microbiologia (1990)
e doutorado em Parasitologia pela Universidade Federal de Minas Gerais
(1997). Durante o mestrado e o doutorado, fez estágio sandwich na Harvard
Medical School (USA). Atualmente, é pesquisadora do Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico e professora associada da
Universidade Federal de Minas Gerais. Atua na área de Farmácia, com
ênfase em Biologia Molecular. Atualmente, desenvolve projetos nas linhas
de pesquisa de diagnóstico, vacinas e tratamento contra leishmaniose,
alterações genéticas associadas a estados de hipercoagulabilidade e no
diagnóstico e epidemiologia molecular de doenças infecciosas.
Participação no projeto
Identificação do antígeno A2 e caracterização da resposta imune e parasitológica
induzida pela imunização durante os estudos de Fase I em camundongos e Fase II em
cães.
Coordenação científica e da equipe de pesquisadores e técnicos envolvidos no
estudo de Fase II em cães.
Redação dos artigos científicos e da patente.
Orientação de estudantes de mestrado e doutorado envolvidos com os
projetos de pesquisa.
Delineamento, condução, avaliação e análise e interpretação de resultados
dos testes de Fase I e II.
11
Ricardo Tostes Gazzinelli
Possui graduação em Medicina Veterinária pela Universidade Federal de Minas Gerais
(1985), doutorado em Bioquímica e Imunologia pela Universidade Federal de Minas Gerais
(1989) e pós-doutorado pelo National Institutes Of Health, Estados Unidos (1994). Livre
Docência pela Universidade Federal de São Paulo, Brasil (1996). Atualmente, é pesquisador
titular da Fundação Oswaldo Cruz (CPqRR) e professor titular da Universidade Federal de
Minas Gerais (UFMG). Atuação na área de Bioquímica, com ênfase em Bioquímica dos
Microorganismos.
Participação no projeto
Caracterização da resposta imune e parasitológica induzida pela imunização durante os
estudos de Fase I em camundongos e Fase II em cães.
Coordenação científica e da equipe de pesquisadores e técnicos envolvidos no estudo de
Fase II em cães.
Redação dos artigos científicos e da patente. Orientação de estudantes de mestrado e
doutorado envolvidos com os projetos de pesquisa.
Delineamento, acompanhamento, avaliação e análise e interpretação de resultados dos
testes de Fase I e II.
12
Pesquisadores Hertape Calier
Christiane de Freitas Abrantes
Mestre em Microbiologia com ênfase em Biologia Molecular pela
UFMG, atua na Gerência de Produção e Desenvolvimento de
Vacinas
Recombinantes
da
Hertape
Calier
Saúde
Animal.
Atuou na definição e implantação do processo de produção industrial e
forneceu subsídios técnicos para o desenvolvimento do Projeto da Unidade
de Produção de Vacinas Recombinantes NB-2, hoje certificada e apta a
produzir em larga escala produtos a partir de Organismos Geneticamente
Modificados do nível 2 de biossegurança atendendo às normas de Boas
Práticas de Fabricação.
Participação no projeto
Avaliação do antígeno existente em testes na UFMG.
Determinação da formulação vacinal.
Viabilidade para transferência de tecnologia para a Hertape Calier.
Determinação e implantação do processo produtivo.
Determinação dos controles de qualidade necessários à fabricação.
Coordenação logística e científica de teste clínico de Fase II.
Depósito de patente – participação na formulação, processo produtivo e
estabilidade.
Produção da vacina.
13
Vinícius Junqueira Hermont
Possui graduação em Medicina Veterinária pela Pontifícia Universidade Católica de Minas
Gerais – Unidade Betim (2006). Coordenador e responsável do Laboratório pela elaboração
e execução dos testes Fase II, Fase III e dos Trabalhos de Campo realizados com a vacina.
Atualmente, é o gerente de produto - Leish-Tec® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose
Visceral Canina e o responsável técnico / comercial da Hertape Calier pela vacina.
Participação no projeto
Integrante da equipe responsável pelo delineamento e execução do projeto Fase II,
referentes ao desenvolvimento e testes da vacina Leish-Tec® - Vacina Recombinante
contra Leishmaniose Visceral Canina. Responsável pela documentação e procedimentos
necessários para implantação e execução dos testes, a fim de trabalhar dentro de parâmetros
adequados regidos pelo Ministério da Agricultura, Ministério da Saúde e COBEA e pela
manutenção da interface empresa/pesquisadores.
Determinação e aquisição de materiais para a execução dos testes, assim como seleção e
treinamento dos profissionais (equipe) envolvidos nas atividades.
Aquisição, preparação e manutenção clínica dos animais, análise de resultados e execução
dos procedimentos realizados nos animais durante o experimento.
Responsável pelo delineamento e execução do Trabalho de Campo realizado com a vacina
e coordenador da equipe envolvida.
Colaboração no delineamento e execução da Fase III.
14
Agradecimentos
Carlos Alberto Pereira Tavares
Possui graduação em Farmácia e Bioquímica pela Universidade Federal de Minas Gerais
(1968), mestrado em Microbiologia pela Universidade Federal de Minas Gerais
(1977), doutorado em Microbiologia e Imunologia pela Universidade Federal
de São Paulo (1980), e pós-doutorado pelo National Institute for Medical
Research, Londres. É professor titular do Departamento de Bioquímica e
Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG. Foi coordenador do
curso de pós-graduação em Bioquímica e Imunologia (1998-2002), diretor
do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG (2002-2006) e é pró-reitor
de Pesquisas da UFMG. Tem experiência na área de Imunologia, atuando
principalmente nos seguintes temas: identificação e isolamento de antígenos
parasitas com objetivo de induzir proteção e diagnóstico imunológico.
Participação no projeto
Contribuição durante os estudos de Fase I realizados em camundongos, dando apoio
às atividades de avaliação da resposta imune e protetora nos animais.
Eduardo Antonio Ferraz Coelho
Doutorando. Graduado pela Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF),
mestrado em Ciências Farmacêuticas pela Faculdade de Farmácia da
Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) e doutorado em Ciências,
ênfase em Imunologia, pelo Departamento de Bioquímica e Imunologia do
Instituto de Ciências Biológicas (ICB) da UFMG. Atualmente, é professor efetivo
da UFMG. Tem experiência científica aprofundada nas áreas de Parasitologia,
Imunologia Celular e de Vacinas, Diagnóstico de Doenças Parasitárias,
Imunoquímica, Bioquímica, Hematologia, Microbiologia e Biologia Molecular,
atuando, principalmente, nos seguintes temas: aprimoramento do diagnóstico
laboratorial e desenvolvimento de vacinas contra as leishmanioses; estudo de
15
anergia e tolerância imunológica nas leishmanioses; hemoglobinopatias e hemofilias. É,
atualmente, presidente do Comitê Interno de Biossegurança (CIBio) da Hertape-Calier
Saúde Animal S.A.
Participação no projeto
Avaliação da resposta imune humoral e celular e dos níveis de proteção nos testes de Fase
I em camundongos.
Avaliação da resposta imune humoral e celular durante os testes de Fase II em cães.
Eloísa de Freitas
Veterinária.
Participação no projeto
Avaliação clínica dos animais.
Testes sorológicos para diagnóstico da leishmaniose.
Maria Norma Mello
16
Graduada em Farmácia Química pela Universidade Federal de Minas Gerais (1965), com
especialização em Engenharia Sanitária pela Universidade Federal de Minas Gerais (1966),
mestrado em Parasitologia pela Universidade Federal de Minas Gerais (1973), doutorado
em Parasitologia pela Universidade Federal de Minas Gerais (1983), pós-doutorado pela
Harvard University (1988) e pós-doutorado pela University of London (1992). Atualmente,
é professora titular da Universidade Federal de Minas Gerais. Tem experiência na área
de Parasitologia, com ênfase em Protozoologia de Parasitos. Atua principalmente nos
seguintes temas: Leishmania, Meio Quimicamente Definido, Estudos Nutricionais.
Participação no projeto
Isolamento e caracterização da cepa de Leishmania chagasi empregada.
Cultivo das formas promastigotas utilizadas no desafio dos cães.
Participação na condução dos testes moleculares para detecção de Leishmania, discussão
e interpretação dos resultados do teste de Fase II.
Marilene Suzan Marques Michalick
Graduada em Farmácia pela Universidade Federal de Minas Gerais (1972), com mestrado
em Parasitologia pela Universidade Federal de Minas Gerais (1977) e doutorado em
Parasitologia pela Universidade Federal de Minas Gerais (1996). É professora e orientadora
no Programa de Pós-Graduação em Parasitologia do Instituto de Ciências
Biológicas da UFMG. Atualmente, é professora-adjunta e vice-diretora da
Faculdade de Ciências da Saúde da FUMEC e aposentada da Universidade
Federal de Minas Gerais. Tem experiência na área de Parasitologia, com
ênfase em Protozoologia Parasitária Animal, Diagnóstico das Leishmanioses,
Tratamento da leishmaniose visceral canina, atuando principalmente nos
seguintes temas: Leishmania e Leishmanioses, Leishmaniose Visceral Canina,
Modelos Experimentais para Estudos da Relação Hospedeiro-Parasito e Teste
de Novas Drogas e Novas Formulações para o Tratamento das Leishmanioses.
Participação no projeto
Isolamento e caracterização da cepa de Leishmania chagasi empregada.
Infecção-desafio dos cães.
Participação na condução dos testes sorológicos para diagnóstico de leishmaniose
e discussão e interpretação dos resultados do teste de Fase II.
Miriam Maria da Silva Costa
Bacharel em Ciências Biológicas, com mestrado em Bioquímica pela
UFMG.
Participação no projeto
Avaliação da resposta imune humoral e celular durante os testes de Fase II
em cães.
Avaliação da infecção por Leishmania por PCR.
17
Wagner Luiz Tafuri
Possui graduação em Medicina Veterinária pela Universidade Federal de Viçosa (1989), título
de Mestre em Ciências pelo Curso de Patologia (área de Concentração Patologia Geral) da
Universidade Federal de Minas Gerais (1992), e título de Doutor em Ciências pelo Curso
de Parasitologia (área de concentração Protozoologia) da Universidade Federal de Minas
Gerais (1995). Realizou um pós-doutoramento na Universidade de Temple, Philadelphia,
USA, sob a supervisão do Prof. Dr. David Mosser. Atualmente, é professor associado II do
Departamento de Patologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal
de Minas Gerais. Tem experiência na área de Patologia Geral, atuando, principalmente,
nos seguintes temas: patologia e alguns aspectos imunológicos da leishmaniose visceral
canina e leishmaniose experimental murino.
Participação no projeto
Avaliação clínica dos animais ao longo de todas as etapas do teste.
Avaliação anatomopatológica dos animais.
Participação na condução dos testes imunocitoquímicos para diagnóstico de leishmaniose
e discussão e interpretação dos resultados do teste de Fase II.
Weverton Sampaio (in memoriam)
Veterinário.
Participação no projeto
Avaliação clínica dos animais.
18
Leishmanioses
Introdução
As leishmanioses constituem um grupo de doenças parasitárias de caráter zoonótico
de ampla distribuição geográfica, causadas por uma variedade de espécies de
protozoários pertencentes ao gênero Leishmania. A leishmaniose é considerada
a segunda principal doença causada por protozoário, perdendo somente
para a Malária em incidência e é considerada a quinta maior endemia
mundial, segundo a Organização Mundial de Saúde. A leishmaniose visceral
é uma doença de grande importância médico-veterinária e é transmitida
no Brasil pela picada da fêmea de Lutzomyia longipalpis, popularmente
conhecida como flebotomíneo, mosquito-palha ou birigui, infectada. Um
importante aspecto epidemiológico consiste no fato de que as fêmeas destes
flebotomíneos possuem caráter oportunista, no qual uma ampla variedade de
vertebrados faz parte de sua alimentação no meio ambiente, parasitando roedores,
carnívoros, marsupiais, edentados, insetívoros e, principalmente, cães e humanos,
sendo caracterizada em ambos por lesões na pele (leishmaniose tegumentar) ou
envolvimento visceral generalizado (leishmaniose visceral). Devido à elevada
prevalência de infecção canina, o cão é considerado o principal reservatório da
doença em ambientes domésticos.
19
Classificação e agentes etiológicos
Diversas espécies de Leishmania causam diferentes aspectos clínicos da doença, sendo
classificadas em:
Leishmaniose visceral – mais conhecida como “calazar”. É a forma mais grave da
doença, sendo fatal se não tratada. Ela pode ser causada pelas espécies L. donovani e L.
infantum no Velho Mundo e pela L. chagasi nas Américas (Muigai et al.,1987; Desjeux, 1996
e Matlashewski, 2001).
Leishmaniose tegumentar – compreende três manifestações clínicas da doença:
20
Leishmaniose cutânea – conhecida como “úlcera de Bauru”. A leishmaniose
cutânea é caracterizada por lesões localizadas, geralmente únicas. Normalmente,
as lesões apresentam cura própria, sem a necessidade de tratamento (Grimaldi &
Tesh, 1993, Desjeux, 2004). Ela pode ser causada pelas espécies L. tropica, L. major,
L. aethiopica, L. mexicana, L. amazonensis, L. guyanensis, L. peruviana, L. braziliensis
e L. panamensis.
Leishmaniose cutânea difusa – leishmaniose dérmica ocorrida após infecção com
calazar. Causa lesões dermatológicas extensas, disseminadas e de caráter crônico,
sendo de difícil tratamento (Grimaldi & Tesh, 1993). Ela pode ser causada pelas
espécies L. mexicana, L. amazonensis e L. venezuelensis, no Novo Mundo (Weigle &
Saravia, 1996) e pela L. aethiopica, no Velho Mundo (Dowlati, 1996).
Leishmaniose mucocutânea – inicia-se com lesões aparentemente simples na
pele e mucosas, principalmente, na boca e na cavidade nasal, podendo se estender,
causando graves lesões ulcerativas até destruição de todo o tecido afetado. Pode
ainda afetar faringe, laringe e traquéia, provocando quadros de desnutrição e
obstrução respiratória (Grimaldi & Tesh, 1993 e Weigle & Saravia, 1996). Ela pode
ser causada pelas espécies L. braziliensis, L. panamensis, L. guyanensis e L. major
(Desjeux, 2004).
Leishmaniose visceral
Agentes etiológicos e vetores
A Leishmaniose Visceral é causada por protozoários do gênero
Leishmania, pertencentes à família Trypanosomatidae,
ordem Kinetoplastida, filo Sarcomastigophora e subreino Protozoa. No Velho Mundo, a L. donovanni tem
sido incriminada como agente etiológico do calazar
indiano (Laveran & Mesnil, 1903). Na bacia do Mar
Mediterrâneo, o parasito incriminado é a L. infantum
(Nicolle, 1908) e no Novo Mundo, segundo
Cunha & Chagas (1937), a L. chagasi é a espécie incriminada como
agente causador da Leishmaniose Visceral e americana (LVA). Esses
parasitos são digenéticos e são transmitidos ao homem e aos animais
após a picada do inseto vetor do gênero Lutzomyia, em países do
Novo Mundo, e do gênero Phlebotomus, em países do Velho Mundo.
Os vetores pertencem à ordem Diptera, família Psychodidae e
subfamília Phlebotominae (Grimaldi & Tesh, 1993).
21
Morfologia e ciclo biológico
O ciclo biológico (Figura 1) do parasita Leishmania compreende duas formas
morfologicamente distintas: amastigota e promastigota.
Forma amastigota: forma arredondada, aflagelada e com aproximadamente, 5µm de
diâmetro. É responsável pelo desenvolvimento da doença no hospedeiro vertebrado.
Parasita intracelular obrigatório, sendo encontrado no interior de células fagocíticas,
como monócitos e macrófagos, do hospedeiro mamífero.
Forma promastigota: forma alongada que possui um núcleo central e um longo
flagelo. É encontrada no hospedeiro invertebrado, vetor da doença (Ashford, 2000).
Forma amastigota
Forma promastigota
O parasita é transmitido ao homem após a picada do inseto vetor infectado, que injeta,
na pele do hospedeiro vertebrado, as formas promastigotas metacíclicas. Cabe ressaltar
que apenas os vetores fêmeas são capazes de transmitir o parasita, pois apenas eles são
hematófagos. As formas promastigotas, na sua maioria, são fagocitadas pelos macrófagos,
formando-se organelas denominadas de fagolisossomos. Dentro dos fagolisossomos, elas
se transformam nas formas amastigotas que se replicam por divisão binária. Macrófagos
infectados podem então ser ingeridos por insetos vetores sadios durante o repasto
sanguíneo. No intestino dos vetores, as formas amastigotas são então liberadas após a lise
dos macrófagos. Os parasitas liberados se transformam rapidamente em promastigotas
procíclicas, não infectivas. Essas formas se multiplicam rapidamente e se aderem à parede
do intestino. Enquanto migram para a porção anterior do órgão, elas se diferenciam nas
formas promastigotas metacíclicas, não replicativas, mas altamente infectivas, que podem
22
ser transmitidas após a picada do inseto durante o seu repasto sanguíneo, completando o
ciclo biológico do parasita (Matlashewski, 2001 e Sacks & Noben-Trauth, 2002).
2
6
1
4
3
VL
CL
8
5
7
Adaptado da OMS - Organização Mundial da Saúde
Fig. 1 - Ciclo biológico do parasita Leishmania: 1 - Macrófagos infectados podem ser ingeridos por insetos
vetores fêmeas durante a refeição. 2 - No intestino do inseto vetor, as formas amastigotas se diferenciam até
promastigotas metacíclicas, que migram para a porção anterior do intestino e são transmitidas após a picada do
vetor. 3 - Fagocitose das formas promastigotas metacíclicas pelos macrófagos. 4 - Lise do macrófago, liberando
formas amastigotas que podem infectar outros macrófagos. 5 - Hospedeiros vertebrados. 6 - Hospedeiros
invertebrados (inseto vetor fêmea do gênero Lutzomyia, em países do Novo Mundo, e do gênero Phlebotomus,
em países do Velho Mundo). 7 - Manifestação clínica da leishmaniose tegumentar. 8 - Manifestação clínica da
leishmaniose visceral.
23
Epidemiologia e distribuição geográfica
A leishmaniose visceral e cutânea possui larga distribuição em áreas tropicais e subtropicais,
estendendo-se desde a América Central e do Sul até os países mediterrâneos como África,
Ásia Central, Índia e China, conforme demonstrado no mapa abaixo.
Distribuição Geográfica de Leishmaniose Cutânea
24
Distribuição Geográfica de Leishmaniose Visceral
Atualmente, as leishmanioses, além de prevalentes nos quatro continentes, são consideradas
endêmicas em 87 países (21 no Novo Mundo e 66 no Velho Mundo). Destes, 16 são países
desenvolvidos, 72 em desenvolvimento e 13 estão entre os menos desenvolvidos. Segundo
a Organização Mundial da Saúde (OMS), há uma prevalência de 12 milhões de casos
humanos no mundo. Estima-se que a incidência anual varie de 1 milhão a 1,5 milhão de
novos casos de leishmaniose tegumentar americana (LTA) e cerca de 500 mil casos novos
de leishmaniose visceral humana (LVH). Calcula-se que cerca de 350 milhões de pessoas
estejam em área de risco para desenvolver alguma forma de leishmaniose. Mais de 90%
dos casos de leishmaniose visceral (LV) no mundo estão notificados em Bangladesh,
Brasil, Índia e Sudão e mais de 90% dos casos de leishmaniose cutânea (LC) ocorrem no
Afeganistão, Irã, Arábia Saudita, República Árabe, Síria, Brasil e Peru (Desjeux, 1991; Arias
et al. 1996).
Nas Américas, cerca de 90% dos casos humanos de LV têm sido registrados no Brasil,
onde foi observado um aumento progressivo no número de notificações dessa endemia.
Atualmente, o calazar está registrado em 19 dos 27 estados, atingindo quatro das cinco
regiões geográficas do País (Monteiro, 2002). Sua maior incidência é no Nordeste, com
92% do total das notificações, seguido pelas regiões Sudeste (4%), Norte (3%) e CentroOeste (1%) (Vieira & Coelho, 1998). Esses dados estão associados às precárias condições
socioeconômicas da população, evidenciadas nos locais de maior prevalência (AlmeidaSilva, 2002)
A leishmaniose visceral, inicialmente, era
Distribuição de Leishmaniose
considerada uma doença de caráter
Visceral no Brasil 1980 a 2003
exclusivamente rural. Entretanto,
RR: 296
Deane (1956) observou, no Brasil,
o fenômeno da urbanização
AP: 1
da doença e,
AM: 2
MA: 7171
CE: 6367
PA: 1416
RN: 1391
n o t a dam e n t e ,
PI: 6302
PE: 2904
AC: 0
desde a década
RO: 0
AL: 1857
TO: 1379
SE: 2153
de 70, esse fato
MT: 99
BA: 15.488
DF: 3
está
consolidado
GO: 262
em cidades de médio e grande
MG: 2.515
MS: 945
ES: 119 porte tais como Teresina, Fortaleza,
SP: 413
São Luís do Maranhão, Santarém,
RJ: 73
PR: 1
Recife, Salvador, Rio de Janeiro,
Belo
Horizonte
e Montes Claros, entre
SC: 0
outras (Marzochi et al., 1983; Badaró et al.,
RS: 1
Nº de casos/UF
1986c; Tavares, 2000; Mendes et al., 2000;
1980 a 2003
Oliveira
et al., 2001; Silva et al., 2001).
Fonte: MS/SVS; SES e
SINAM a partir de 1998
O crescimento desordenado das cidades,
ocasionando a destruição do meio ambiente, e o
aumento da crise social têm sido apontados como principais e determinantes
promotores das condições adequadas para ocorrência da leishmaniose
visceral humana (LVH) na área urbana. Além disso, a identificação da doença
nos centros urbanos é freqüentemente postergada, devido à carência de
informação e treinamento adequados para os profissionais da saúde (AlmeidaSilva, 2002).
25
No Brasil, a leishmaniose visceral canina tem precedido a ocorrência de casos humanos.
A infecção em cães tem sido mais prevalente, constituindo um severo problema de saúde
pública em todo o País.
A cadeia epidemiológica da leishmaniose visceral inclui a presença, concomitante, do
vetor, do reservatório, do parasita e do hospedeiro susceptível. Cada elo dessa cadeia tem
sido estudado em detalhes, objetivando obter maior compreensão da doença para otimizar
o seu controle (Almeida-Silva, 2002).
Número de casos e coeficiente de incidência de leishmaniose cutânea, Brasil - 1985 a 2005
Número de casos
20
30.000
25.000
15
20.000
10
15.000
10.000
5
5.000
0
1985 1988 1991 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
0
Incidência por 100 mil Habitantes
25
40.000
35.000
Nº de Casos 13.654 25.153 28.450 35.103 35.748 30.030 31.303 21.801 32.439 33.720 37.713 34.156 31.379 28.712 24.291
11,60 21,37 19,43 22,85 21,62 19,34 19,61 14,67 20,50 15,48 17,79 21,47 17,71 15,79 13,19
Incidência
Fonte: COVEV/ CCDT/ DEVEP/ SVS/ MS
Número de casos e coeficiente de incidência de leishmaniose visceral, Brasil - 1985 a 2005
Número de casos
3
5.000
2,5
4.000
2
3.000
1,5
2.000
1
1.000
0,5
0
1985 1988 1991 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
Nº de Casos 2.224 816 1.510 3.426 3.885 3.246 2.570 1.977 3.624 4.858 3.646 3.102 2905 3418 3481
Incidência
1,89 0,69 1,03 2,23 2,49 2,09 1,61 1.33 2,29 2,23 1,72 1,95 1,64 1,88 1,89
26
Fonte: COVEV/ CCDT/ DEVEP/ SVS/ MS
0
Incidência por 100 mil Habitantes
6.000
Aspectos clínicos da doença em cães
Os cães são importantes reservatórios no ciclo doméstico da leishmaniose visceral (LV)
(Deane e Deane, 1962; Keenan et al., 1984a; Marzochi, et al., 1985) e são considerados
a principal fonte de infecção dos flebotomíneos devido à forte prevalência da infecção
canina, quando comparada à infecção humana (Chagas et al., 1938; Deane, 1955
e 1956).
As manifestações clínicas da doença podem variar consideravelmente, sendo
dependentes da interação da espécie do parasita, da resposta imunológica
de cada hospedeiro e da fase atual da doença. O período de incubação da
doença pode variar de 1 mês a 4 anos (Lanotte et al., 1979).
Examinando cães infectados com L. infantum na Ilha de Elba (Itália), Mancianti
et al. (1988) classificou clinicamente esses animais como:
animais assintomáticos: ausência de sinais ou sintomas sugestivos de
infecção por Leishmania;
animais oligossintomáticos: adenopatia linfóide, pequena perda de peso e/ou
pêlo opaco;
animais sintomáticos: todos ou alguns dos sinais sugestivos da doença,
como: alterações cutâneas (alopecia, eczema furfuráceo, úlceras,
hiperqueratose), onicogrifose, emagrecimento, ceratoconjuntivite e
paresia dos membros posteriores.
Entretanto, cães infectados podem permanecer clinicamente normais por
um período muito longo de tempo.
As principais manifestações clínicas na fase aguda da doença são
linfadenomegalia generalizada, febre, apatia e ausência de lesões na pele
(Alvar et al., 1994; Ciaramella et al.,1997 e Ferrer, 2003).
As manifestações clínicas clássicas da leishmaniose visceral canina são
linfadenomegalia, caquexia (enfraquecimento crônico do animal), lesões
cutâneas como alopecia periocular, dermatite descamativa e seborréica,
hiperqueratoses, úlceras com aspecto de queimaduras, nódulos subcutâneos
27
(que podem ser pequenos ou grandes) e erosões (mais freqüentes na ponta da orelha
e nariz), onicogrifose, anemia, hepatoesplenomegalia, disfunção renal severa, aplasia de
medula, trombose, colites, hemorragia nasal, pneumonias, lesões oculares e poliartrites
(Abranches et al., 1991; Ciaramella et al., 1997 e Tafuri et al., 2001).
Aproximadamente 50% a 60% dos cães infectados são assintomáticos, o que sugere a
existência de animais resistentes ou com infecção recente na população. Cães infectados,
mesmo assintomáticos, podem apresentar grande quantidade de parasitos na pele, o que
favorece a infecção do inseto vetor, permanecendo um elo no ciclo biológico da doença.
28
Diagnóstico
O diagnóstico da leishmaniose visceral canina apresenta-se dificultado por vários fatores,
principalmente devido à presença de manifestações clínicas variadas e à ausência de
lesões características (patognomônicas) da doença.
O médico veterinário conta com uma série de métodos de diagnóstico para
auxiliá-lo na conclusão da suspeita clínica da doença. São eles:
Métodos sorológicos
São utilizados no diagnóstico da leishmaniose visceral e visam à
detecção de anticorpos específicos ao parasita. Em geral, as técnicas
mais utilizadas são a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI),
a Análise de Imunoadsorção por Ligação Enzimática (ELISA), o Teste
de Aglutinação Direta e o Western Blot, pois apresentam sensibilidade e
especificidade que alcançam entre 80 e 100%. Cabe ressaltar que, geralmente,
nos estágios iniciais da doença os cães são soronegativos, portanto, deve-se
estar atento quando exames sorológicos forem utilizados no diagnóstico da
doença.
Métodos parasitológicos
São métodos confirmativos por terem especificidade de 100% para o
diagnóstico da leishmaniose visceral, porém apresentam sensibilidade
relativamente baixa, em torno de 60 a 80%. Através deles, faz-se a
detecção do parasita a partir de biópsias de tecidos ou aspirados
de líquidos corporais.
O teste parasitológico mais simples e mais utilizado pelos veterinários
é a identificação microscópica das formas amastigotas, a partir da
confecção em lâminas de esfregaços de aspirados da medula óssea ou
de linfonodos, coradas com Giemsa (Deane e Deane, 1955). Esse teste
29
é rápido, barato e de alta especificidade, entretanto, exibe baixa sensibilidade, pois
estudos demonstram ser a sensibilidade menor que 60% em aspirados de medula
óssea e menor que 30% nos linfonodos.
Análises histológicas da pele e linfonodos também são técnicas freqüentemente
utilizadas para o diagnóstico da leishmaniose visceral, entretanto, deve-se procurar
dissociar as alterações histopatológicas, como inflamação ou granuloma de um
diagnóstico positivo da doença (Tafuri et al., 1996 e Tafuri et al., 2001). Este deverá
ser confirmado pela presença das formas amastigotas do parasita. Entretanto,
na maioria dos casos de leishmaniose visceral, poucas formas amastigotas estão
presentes, o que dificulta a avaliação. Nessas situações, a análise histológica deve
ser associada à imuno-histoquímica, que apresenta elevada sensibilidade e detecta o
parasita em cortes de tecidos, através do uso de anticorpos específicos (Bourdoiseau
et al., 1997 e Tafuri et al., 2004).
Outra forma de diagnóstico corresponde ao isolamento do parasito através de cultura,
in vitro ou pela inoculação de aspirados em animais de laboratório, como hamster
(Sundar e Rai, 2002).
Métodos moleculares
Com o avanço da tecnologia biomédica, técnicas moleculares vêm sendo também
empregadas no diagnóstico da leishmaniose visceral. A detecção do DNA do parasita,
pela técnica da PCR, é realizada através da coleta de amostra de vários tipos, como
aspirados de medula óssea, sangue, linfonodos e tecidos. Essa técnica, apesar do
custo elevado, apresenta alta sensibilidade e especificidade em torno de 100% e é
a mais utilizada em pacientes humanos (Mathis & Deplazes, 1995 e Reithinger &
Davies, 2002).
30
Prevenção e controle
O controle da leishmaniose visceral tem como objetivo principal interromper a cadeia de
transmissão da doença em uma população. Essa medida é de difícil execução, por exigir
uma perfeita integração das ações direcionadas ao ambiente e aos animais que nele
vivem.
A Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda o diagnóstico precoce
e tratamento dos casos humanos, diagnóstico e sacrifício dos animais
soropositivos e a identificação e eliminação do vetor como medidas de
controle da doença. Os cães são considerados infectados ao apresentar
resultados soropositivos em testes de diagnóstico sorológico, ELISA e RIFI,
conforme preconizado no Programa Nacional de Controle de Leishmaniose
Visceral no Brasil.
Dentre as medidas profiláticas contra a leishmaniose, o controle do vetor tem
se mostrado eficaz na prevenção da doença. Diversas ações podem ser adotadas,
visando a esse controle no animal ou no ambiente.
Controle do vetor no ambiente: recomenda-se borrifação com
inseticidas à base de piretróides, remoção de qualquer espécie de matéria
orgânica em decomposição, mantendo o ambiente limpo e plantio de
repelentes naturais, dentre outras.
Controle do vetor no animal: a utilização de inseticidas tópicos
ou repelentes naturais em loções ou incorporados em coleiras tem se
mostrado um método auxiliar eficaz contra a doença. Estes exercem
efeito repelente e letal sobre os flebótomos, minimizando a possibilidade
de ocorrência do repasto sanguíneo e, conseqüentemente, de infecção
dos animais.
31
Imunoprofilaxia: é considerada a forma mais eficaz no controle da leishmaniose
visceral canina por proteger o animal da doença e impedir que se torne um reservatório
potencial do parasita, servindo como fonte de infecção dos vetores. É recomendado
associar a outros métodos preventivos contra o vetor.
Resposta Imune
O desenvolvimento dos sintomas clínicos da leishmaniose visceral em animais infectados,
assim como a progressão da doença, está diretamente relacionado à fase atual da doença,
ao estado físico e ao sistema imune de cada indivíduo.
Em animais saudáveis e sem outras doenças intercorrentes, o aparecimento dos sintomas
clínicos pode demorar longos períodos. Em contrapartida, animais debilitados estão mais
sujeitos a apresentar sintomatologia clínica da doença mais rapidamente e de forma mais
grave. Estudos em animais infectados com Leishmania mostram que a resistência ou a
susceptibilidade à doença estão associadas ao desenvolvimento de uma resposta imune
Th1 (resposta imune celular) ou Th2 (resposta imune humoral), respectivamente (Tabela
1).
O desenvolvimento de resposta imune do tipo Th1 é essencial para resistência e proteção
à infecção por Leishmania chagasi. A produção de níveis elevados de IFN-γ é fundamental
e constitui um marcador desse tipo de resposta. Níveis de IgG2 específicos contra
antígenos do parasita correlacionam também com esse tipo de resposta que é favorável
para o combate da doença no organismo. Na resposta Th1, citocinas como interferongama (IFN-γ), interleucina 2 (IL-2), interleucina 12 (IL-12) e o fator de necrose tumoral alfa
(TNF-α) são produzidas e atuam combatendo o parasita invasor. A elevação dos níveis
de IgG2 também está associada a proteção, sendo encontrada em animais resistentes
à infecção (Oliveira da Silva et al., 2001). Sendo, assim, esse o perfil imunológico ideal
favorável à proteção do animal.
Por outro lado, a resposta Th2 está envolvida com um aumento na produção de citocinas
como interleucina 4 (IL-4), interleucina 5 (IL-5), interleucina 6 (IL-6), interleucina 10 (IL-10)
e interleucina 13 (IL-13), as quais favorecem o desenvolvimento da doença em animais
32
infectados e com o aumento de anticorpos do subtipo IgG1, sendo assim desfavorável para
o controle da leishmaniose visceral (Heinzel et al., 1989; Heinzel et al., 1993; Scharton &
Scott, 1993; Sypek et al.; Belkaid et al., 2001; Jones et al., 2002 e Ji et al., 2003).
Desenvolvimento da doença
Resposta imune humoral
Resposta Th2
Níveis baixos de IFN-γ
Aumento dos níveis de IL-10
Aumento dos níveis de IgG1
Proteção contra a doença
Resposta imune celular
Resposta Th1
Níveis altos de IFN-γ
Aumento dos índices de IL-2 e IL-12
Aumento dos níveis de IgG2
Tabela 1: Resposta Imune Leishmaniose Visceral Canina
33
Vacinas recombinantes
34
As atuais estratégias utilizadas para o controle da leishmaniose visceral consistem na
detecção dos cães infectados, seguida do seu sacrifício, no controle do vetor e no tratamento
dos casos humanos. Entretanto, tais medidas não têm se mostrado eficazes. Dessa forma,
o desenvolvimento de vacinas caninas surge como uma estratégia importante no controle
da doença (Tesh, 1995).
As vacinas convencionais, em sua maioria, são compostas por partículas íntegras de
microrganismos, contendo inúmeras proteínas não relacionadas com a resposta imune ou
até mesmo relacionadas à imunossupressão do indivíduo.
Enormes vantagens foram trazidas pela Tecnologia do DNA Recombinante. As vacinas
recombinantes são derivadas de modificações genéticas em microrganismos. Elas podem
ser compostas por proteína ou por vírus recombinante e apresentam a vantagem de
permitir uma avaliação detalhada da resposta imune induzida pela imunização. Outra
vantagem das vacinas recombinantes está associada ao fato de que é possível empregar
antígenos extremamente bem caracterizados, em que todas as propriedades imunogênicas
(epítopos) das diferentes porções da molécula possam ser identificadas e caracterizadas.
Com isso, resolvem-se os inconvenientes das vacinas constituídas por porções purificadas
diretamente do parasita e da presença de epítopos que possam estar associados a
mecanismos supressores da resposta imune e de evasão típicos do microrganismo. Em
ambos os casos, tem-se a eliminação do patógeno para dar lugar a um ativo que não tem
relação com a doença, tornando o produto altamente seguro e capaz de induzir resposta
imune protetora.
Diversas preparações vacinais têm sido estudadas em camundongos e/ou cães contra a
infecção com Leishmania, incluindo formas promastigotas mortas, promastigotas vivas
atenuadas ou irradiadas (revisto por HANDMAN, 2001). Estudos recentes têm empregado
antígenos na forma de vacinas recombinantes. Dentre os antígenos que têm sido avaliados,
encontra-se o antígeno A2, que atualmente é considerado o antígeno de Leishmania melhor
caracterizado, capaz de induzir uma resposta imune protetora contra leishmaniose visceral
canina. Esse antígeno é um fator de virulência de Leishmania, associado à capacidade de
visceralização dos parasitas.
Artigo científico publicado demonstrando a caracterização do antígeno A2.
Vaccine, v.26, p.4585 - 4593, 2008. Epitope mapping and protective immunity elicited by
adenovirus expressing the Leishmania amastigote specific A2 antigen: Correlation
with IFN-g and cytolytic activity by CD8+ T cells. RESENDE, D. M., CAETANO, B,
DUTRA, M., BRUNA-ROMERO, O, FERNANDES, A. P., GAZZINELLI, R. T.
35
A proteína A2
36
O antígeno A2 é uma proteína específica do estágio amastigota de várias espécies
de Leishmania e foi identificado inicialmente na espécie L. donovani por Charest &
Matlashewski (1994). Análises cariotípicas realizadas por Southern-blot de várias espécies
de Leishmania revelaram que os genes A2 são conservados nas espécies L. donovani, L.
infantum, L. chagasi, L. amazonensis e L. mexicana, o que é importante para indução da
proteção cruzada entre espécies diferentes (Ghedin et al., 1997).
A vacina é composta pelo ativo A2 (proteína recombinante), adjuvante e excipiente. A
proteína recombinante foi obtida a partir de gene de Leishmania donovani e sua identidade
foi confirmada por meio de testes laboratoriais, frente à proteína existente na forma
amastigota nativa. Esta comprovação é importante, uma vez que se pretende utilizar esta
proteína como antígeno em imunizações contra leishmaniose visceral canina e é sabido
que a forma amastigota é a mantida pelo protozoário no hospedeiro mamífero.
Vários estudos demonstraram que o antígeno A2, específico do estágio amastigota de Leishmania, tem grande potencial como antígeno vacinal, pois anticorpos anti-A2 foram detectados
em amostras de soro de pacientes e cães acometidos pela leishmaniose visceral, mostrando
que a proteína A2 é altamente antigênica (Ghedin et al., 1997 e Carvalho et al., 2002).
A proteína A2 representa o primeiro fator de virulência amastigota-específico identificado
em L. donovani (Zhang & Matlashewski,1997). Ao avaliarem a infecção de macrófagos in
vitro e de camundongos BALB/c por amastigotas deficientes na produção da proteína A2
(obtidas pela inibição da expressão do gene A2), observaram que houve uma diminuição na
proliferação dos parasitas no interior dos macrófagos e da carga parasitária avaliada pela
LDU, através de esfregaços por aposição do fígado dos animais infectados. A introdução
do gene A2 de L. donovani em L. major resultou num aumento significativo do tamanho
do baço e do número de parasitas neste órgão (LDU) nos camundongos estudados. Esse
achado pode estar relacionado com a diferença que existe na estrutura do gene A2 entre
as espécies causadoras da infecção visceral e cutânea. Essa diferença na estrutura do
gene pode ser uma possível explicação para o variado tropismo entre as espécies (Zhang
& Matlashewski, 2001).
Alguns trabalhos foram realizados utilizando o antígeno A2 como candidato à vacina. Em
geral, esses antígenos são testados primeiramente em camundongos e posteriormente em
cães.
Estudos conduzidos pela equipe de pesquisadores da UFMG permitiram identificar nesse
antígeno o epítopo responsável pela indução da produção de anticorpos em
camundongos vacinados e, talvez mais importante, os epítopos associados
à indução de resposta celular e que, nesse antígeno, estão associados à
indução de resposta do tipo Th1 e, portanto, proteção.
A imunização com o antígeno A2 foi capaz de induzir proteção significativa
contra a infecção por L. donovani e L. amazonensis e L. chagasi em
camundongos (estudos de Fase I) e em cães (estudos de Fase II e trabalhos
de campo). Os níveis de proteção observados foram associados à resposta
imune Th1, caracterizada por altos níveis de IFN-γ específica à proteína A2,
bem como reduzida produção de IL-4 e IL-10 em animais imunizados. Além disso,
apresentaram redução significativa da carga parasitária, quando comparados aos
grupos controle (Ghosh et al, 2001; Ghosh et al., 2002; COELHO et al., 2003; COELHO,
2004).
Portanto, o antígeno A2 recombinante induziu uma resposta imune protetora e se
mostrou eficaz contra a leishmaniose visceral canina.
Proteína A2 codificada
37
Espaço científico
Publicações sobre a proteína A2
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 94, p. 8807–8811, (Aug) 1997 Loss of virulence in Leishmania
donovani deficient in an amastigote-specific protein, A2 Wen-Wei Zhang e Greg
Matlashewski.
Molecular and Biochemical Parasitology,v. 78, p.79-90, (Mar) 1996 Identification and
overexpression of the A2 amastigote-specific protein in Leishmania donovani WenWei Zhang, Hugues Charest, Elodie Ghedin e Greg Matlashewski.
BMC Infectious Diseases, v. 5, n. 18, (Mar) 2005 A2 gene of Old World cutaneous
Leishmania is a single highly conserved functional gene Yves JF Garin, Pascale
Meneceur, Francine Pratlong, Jean-Pierre Dedet, Francis Derouin e Frédéric Lorenzo
The Journal of Biological Chemistry, v. 278, n. 37, p. 35508–35515, (Sep) 2003 Comparison
of the A2 gene locus in Leishmania donovani and Leishmania major and its control
over cutaneous infection Wen-Wei Zhang, Susana Mendez, Anirban Ghosh, Peter Myler,
Al Ivens, Joachim Clos, David L. Sacks e Greg Matlashewski
Infection and immunity, v. 74, n. 12, p. 6940–6948, (Dec) 2006 Leishmania chagasi T-cell
antigens identified through a double library screen Daniella R. A. Martins, Selma M.
B. Jeronimo, John E. Donelson, e Mary E. Wilson
38
Vaccine, v. 20, p. 59–66, (Jul) 2002 Immunization with A2 protein results in a mixed
Th1/Th2 and a humoral response which protects mice against Leishmania donovani
infections Anirban Ghosh, Wen Wei Zhang e Greg Matlashewski
Journal of Bioscience and Bioengineering, v. 101, n. 3, p. 203-211, (Nov) 2006. REVIEW
- Immunogenic and allergenic potentials of natural and recombinant innocuous
proteins Tsukasa Matsuda, Takeski Matsubara e Shingo Hino
Infect Immun., v. 71, n. 7, p. 3988–3994, (Jul) 2003. Immune responses induced by the
Leishmania (Leishmania) donovani A2 Antigen, but not by the LACK antigen, are
protective against experimental Leishmania (Leishmania) amazonensis infection
Eduardo Antonio Ferraz Coelho, Carlos Alberto Pereira Tavares, Fernando Aécio Amorim
Carvalho, Karina Figueiredo Chaves, Kadima Nayara Teixeira, Rafaela Chitarra Rodrigues,
Hugues Charest, Greg Matlashewski, Ricardo Tostes Gazzinelli, e Ana Paula Fernandes
Microbes and Infection, v. 9, n. 9, p. 1070-1077, (Jul) 2007 Evaluation of immune responses
and protection induced by A2 and nucleoside hydrolase (NH) DNA vaccines against
Leishmania chagasi and Leishmania amazonensis experimental infections Francisca
H.C. Zanin, Eduardo A.F. Coelho, Carlos A.P. Tavares, Eduardo A. Marques-Da-Silva, Miriam
Maria Silva Costa, Simone A. Rezende, Ricardo T. Gazzinelli e Ana Paula Fernandes
Vaccine, v.26, p.4585 - 4593, 2008. Epitope mapping and protective immunity elicited by
adenovirus expressing the Leishmania amastigote specific A2 antigen: Correlation
with IFN-g and cytolytic activity by CD8+ T cells. RESENDE, D. M., CAETANO, B,
DUTRA, M., BRUNA-ROMERO, O, FERNANDES, A. P., GAZZINELLI, R. T.
Vaccine (2008), doi:10.1016/j, in press. Protective immunity against challenge with
Leishmania (Leishmania) chagasi in beagle dogs vaccinated with recombinant A2
protein.Ana Paula Fernandes, Miriam Maria Silva Costa, Eduardo Antonio Ferraz Coelho,
Eloisa de Freitas, Christiane de Freitas Abrantes, Vinícius Hermont; Wagner Luiz Tafuri,
Maria Norma Melo, Marilene Suzan Marques Michalick and Ricardo T. Gazzinelli.
39
Apresentações em congressos científicos
Immunization with the A2 antigen against Leishmania (L.) amazonensis infection:
comparison of the protection induced by protein or DNA vaccination. COELHO, E.A.F.;
FERNANDES, A.P.S.M.; GAZZINELLI, R.T.; CARVALHO, F.A.A.; TEIXEIRA, K.N.; GOMES, B.A.;
Costa, J.P.; TAVARES, C.A.P. ESTE TRABALHO FOI ELEITO COMO O MELHOR TRABALHO
NA ÁREA DE IMUNOLOGIA, TENDO SIDO PREMIADO NO REFERIDO CONGRESSO. XXX
ANNUAL MEETING ON BASIC RESEARCH IN CHAGAS DISEASE. XIX MEETING OF THE
BRAZILIAN SOCIETY OF PROTOZOOLOGY. Caxambu, 10 a 12/11/2003.
Immune responses induced by Leishmania (L.) donovani A2, but not by LACK
antigen, are protective against experimental Leishmania (L.) amazonensis
infection. COELHO, E.A.F.; FERNANDES, A.P.S.M.; GAZZINELLI, R.T.; CARVALHO, F.A.A.;
TEIXEIRA, K.N.; TAVARES, C.A.P. XXX ANNUAL MEETING ON BASIC RESEARCH IN CHAGAS
DISEASE. XIX MEETING OF THE BRAZILIAN SOCIETY OF PROTOZOOLOGY. Caxambu, 10 a
12/11/2003.
Assessment of the efficacy of immunization with a recombinant antigen expressed
in Leishmania amazonensis amastigotes. COELHO, E.A.F.; FERNANDES, A.P.S.M.;
GAZZINELLI, R.T.; CARVALHO, F.A.A.; CHAVES, K.F.; RODRIGUES, R.C.; TEIXEIRA, K.N.;
TAVARES, C.A.P. ESTE TRABALHO FOI ELEITO COMO O MELHOR TRABALHO NA ÁREA DE
IMUNOLOGIA, TENDO SIDO PREMIADO NO REFERIDO CONGRESSO. ENAPEBI - ENCONTRO
ANUAL DE PESQUISA EM BIOQUIMICA E IMUNOLOGIA DA UFMG. Belo Horizonte, 03 a
06/06/2003.
40
Assessment of the efficacy of immunization with a recombinant antigen expressed
in Leishmania amazonensis amastigotes. COELHO, E.A.F., TAVARES, C.A.P.; GAZZINELLI,
R.T.; CARVALHO, F.A.A., CHAVES, K.F., RODRIGUES, R.C.; TEIXEIRA, K.N.; FERNANDES,
A.P.S. M. XXIX ANNUAL MEETING ON BASIC RESEARCH IN CHAGAS DISEASE. XVIII
MEETING OF THE BRAZILIAN SOCIETY OF PROTOZOOLOGY. Caxambu, 04 a 06/11/2002.
Assessment of the efficacy of immunization with a recombinant antigen expressed
in Leishmania amazonensis amastigotes. COELHO, E.A.F., TAVARES, C.A.P.; GAZZINELLI,
R.T.; CARVALHO, F.A.A., CHAVES, K.F., RODRIGUES, R.C.; TEIXEIRA, K.N.; FERNANDES,
A.P.S.M. XXVII MEETING OF THE BRAZILIAN SOCIETY OF IMMUNOLOGY. V INTERNATIONAL
SYMPOSIUM ON ALLERGY AND CLINICAL IMMUNOLOGY. Bahia, 20 a 23/11/2002.
Assessment of the efficacy of immunization with recombinant antigens expressed
in amastigotes of Leishmania amazonensis. COELHO, E.A.F., FERNANDES, A.P.;
CARVALHO, F.A.A., CHAVES, K.F., GAZZINELLI, R.T., RODRIGUES, R.C.; TEIXEIRA, K.N.;
TAVARES, C.A.P. I ENCONTRO DA PÓS-GRADUAÇÃO ENTRE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA E
CIÊNCIAS BIOLÓGICAS FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA. Belo Horizonte, 17 a 21/06/2002.
Avaliação da capacidade da proteína A2 recombinante de induzir proteção contra
a infecção por Leishmania amazonensis em camundongos. RODRIGUES, R.C.;
COELHO, E.A.F.; TAVARES, C.A.P.; CARVALHO, F.A.A.; CHAVES, K.F.; FERNANDES, A.P., ESTE
TRABALHO FOI SELECIONADO ENTRE OS MELHORES TRABALHOS DA ÁREA DE CIÊNCIAS
DA SAÚDE. X SEMANA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA. Belo Horizonte, 21 a 23/02/2002.
Assessment of immunization efficiency using recombinant antigens from
amastigotes of Leishmania amazonensis. COELHO, E.A.F., CARVALHO, F.A.A., CHAVES,
K.F., GAZZINELLI, R.T., TAVARES, C.A.P., FERNANDES, A.P. XXVI MEETING OF THE
BRAZILIAN SOCIETY OF IMMUNOLOGY. Campos do Jordão, 07 a 10/10/2001.
Th1 adjuvants are required to induce a protective response against Leishmania
amazonensis infection. COELHO, E.A.F., TAVARES, C.A.P.; GAZZINELLI, R.T.; CARVALHO,
F.A.A., CHAVES, K.F., RODRIGUES, R.C.; TEIXEIRA, K.N.; FERNANDES, A.P.S. M. XXVII
MEETING OF THE BRAZILIAN SOCIETY OF IMMUNOLOGY. V INTERNATIONAL SYMPOSIUM
ON ALLERGY AND CLINICAL IMMUNOLOGY. Bahia, 20 a 23/11/2002.
41
Desenvolvimento da Leish-Tec® - Fase I
Para o desenvolvimento de vacinas contra leishmaniose, é exigida pelo Ministério da
Agricultura, Abastecimento e Pecuária a realização de testes para a comprovação de
resultados.
Introdução
As propriedades imunogênicas do antígeno A2 recombinante foram demonstradas no
trabalho de Fase I, tendo como resultado a capacidade de conferir proteção em camundongos
BALB/c contra a infecção desafio com L. donovani, L. chagasi e L. amazonensis. A proteção
foi associada à elevada resposta imune Th1, específica ao parasita e caracterizada pela
grande produção de IFN-γ.
Descrição do experimento
Estudos conduzidos pelos doutores Ricardo Tostes Gazzinelli e Ana Paula Fernandes
realizados na Universidade Federal de Minas Gerais.
Foi avaliada a proteção conferida pela imunização com o antígeno A2 vacinal em
camundongos BALB/c como modelo experimental.
Grupos de animais utilizados como controle negativo e positivo da doença e o grupo
vacinado.
Desafio via endovenosa ou subcutânea com elevada carga de protozoários.
Relato
Em nossos estudos, realizamos a clonagem em plasmídeos de expressão em células
eucariotas e procariotas do gene codificador do antígeno A2 e avaliamos a proteção
conferida pela imunização com esse antígeno, sob a forma de proteína recombinante
associada à adjuvante de resposta imune Th1 ou de DNA, contra a infecção desafio com
42
L. amazonensis, em camundongos BALB/c. A imunização com o antígeno A2, tanto sob a
forma de proteína quanto de DNA, foi capaz de conferir proteção contra o desafio com
L. amazonensis. Os animais vacinados apresentaram níveis significativamente
maiores de IFN-γ e menores de IL-4 e IL-10 quando comparados aos animaiscontroles infectados. Observaram-se baixos níveis de anticorpos específicos
ao parasita (Coelho et al., 2003) e também a presença de anticorpos IgG2
específicos à proteína A2.
Os resultados indicaram, portanto, o potencial de utilização da proteína
A2 como candidata à vacina contra leishmaniose, principalmente, contra
espécies que apresentam seus genes conservados, como L. donovani, L.
infantum, L. chagasi, L. amazonensis e L. mexicana.
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
Fígado
Log of parasite numbers
Log of parasite numbers
Resultados
9
8
7
6
5
4
3
2
Baço
PBS
DNA pCDNA3
DNA A2
1
0
As setas indicam a redução de carga parasitária, determinada pelo método de diluição limitante, em camundongos BALB/c vacinados com DNA A2 e desafiados com Leishmania chagasi. Como controles, animais receberam
apenas DNA controles (DNA pCDNA3) ou solução salina.
43
Log of parasite numbers at skin
10
Redução de parasitos na pele de camundongos BALB/c
vacinados com DNA A2
e infectados com Leishmania amazonensis
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
PBS
rIL-12
rA2
rA2/rIL-12
rA2/ C.
parvum
DNA A2
DNA A2/
DNA IL-12
Redução do número de parasitos na pele de camundongos BALB/c vacinados com DNA A2 ou com proteína recombinante A2,
associados a Corynebacterium parvum ou interleucina-12 (rIL-12) e infectados com Leishmania amazonensis.
9000
IFN-gamma (pg/mL)
8000
7000
6000
5000
PBS
rIL-12
rA2
rA2/rIL-12
rA2/ C. parvum
DNA A2
DNA A2/ DNA IL-12
4000
3000
2000
1000
0
Meio
44
A2
SLA LLa
Níveis de IFN-γ produzidos por esplenócitos de camundongos BALB/c vacinados com DNA A2 ou proteína A2, associados a Corynebacterium parvum ou interleucina-12 (rIL-12) em resposta ao estímulo com A2 ou com extrato total de antígenos de Leishmania.
Níveis de anticorpos IgG no soro de animais imunizados, antes e após a
infecção, que reagem em ELISA com extrato de antígenos totais do parasita.
1,2
Abs 492 nm
1
0,8
PBS
rlL-12
rA2
rA2/rIL-12
C. parvum
rA2/C. parvum
SLA/rIL-12
0,6
0,4
0,2
0
Antes do desafio
Após o desafio
Níveis de anticorpos IgG no soro de animais imunizados, antes e após a infecção, que reagem em ELISA com extrato de antígenos totais do parasita. Neste teste, camundongos BALB/c receberam vacinas contendo a proteína A2
em associação ao Corynebacterium parvum (C. parvum) ou interleucina 12 (rIL-12) como adjuvantes. Como controles,
camundongos BALB/c receberam solução salina (PBS) ou somente C. parvum ou rIL-12 ou ainda extrato total de antígenos de formas promastigotas de Leishmania associado a IL-12 (SLA/rIL-12). Anticorpos IgG foram dosados no soro dos
animais antes e após a infecção.
Resultados e discussão
a) Nos testes apresentados, é bem definida a resposta Th2 em
camundongos que desenvolveram a doença.
b) Todos os controles positivos infectados desenvolveram a doença e
apresentaram níveis elevados de parasitas em órgãos como fígado,
baço e pele.
c) Os camundongos vacinados apresentaram redução expressiva da
carga parasitária e a resposta imune desenvolvida por estes tem perfil
Th1.
d) Os elevados níveis de IFN-γ foram encontrados em animais
vacinados.
e) Os camundongos mantiveram, após vacinação, sorologia não reativa
contra anticorpos de antígeno total do parasita.
45
Conclusões
a) A imunização com o antígeno A2-HIS foi capaz de conferir proteção contra o desafio
com L. amazonensis e L. chagasi.
b) Os animais vacinados apresentaram níveis significativamente maiores de IFN-γ e
menores de IL-4 e IL-10, quando comparados aos animais controles infectados.
c) Observaram-se baixos níveis de anticorpos específicos ao parasita (Coelho et al.,
2003), reafirmando a manutenção da soronegatividade para leishmaniose dos animais
vacinados.
d) Observada a presença de anticorpos IgG2 específicos à proteína A2, caracterizando a
resposta Th1 protetora.
Artigos científicos publicados referentes à Fase I
Infect Immun., v. 71, n. 7, p. 3988–3994, (Jul) 2003. Immune responses induced by the
Leishmania (Leishmania) donovani A2 Antigen, but not by the LACK antigen, are
protective against experimental Leishmania (Leishmania) amazonensis infection
Eduardo Antônio Ferraz Coelho, Carlos Alberto Pereira Tavares, Fernando Aécio Amorim
Carvalho, Karina Figueiredo Chaves, Kadima Nayara Teixeira, Rafaela Chitarra Rodrigues,
Hugues Charest, Greg Matlashewski, Ricardo Tostes Gazzinelli e Ana Paula Fernandes.
Microbes and Infection., v.9, p.1070 - 1077, 2007. Evaluation of Immune Responses
and Protection Induced by A2 and Nucleoside Hydrolase (NH) DNA vaccines
Against Leishmania chagasi and Leishmania amazonensis Experimental
Infections. .ZANIN, F. H. C., COELHO, E. A. F., MARQUES-DA-SILVA, E., REZENDE,
S. A., COSTA, M. M. S., TAVARES, C. A. P., GAZZINELLI, R. T., FERNANDES, A. P.
46
Desenvolvimento da Leish-Tec® - Fase II
Objetivo geral
Avaliar a imunogenicidade da proteína recombinante A2-HIS, sob a forma da vacina
comercial Leish-Tec® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral
Canina na proteção de cães da raça Beagle contra a infecção desafio com L.
chagasi.
Objetivos específicos
a) Imunizar grupos de cães com a vacina Leish-Tec® - Vacina
Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina e grupos controle
com PBS e com adjuvantes.
b) Avaliar a resposta imune humoral através dos níveis de anticorpos IgG
total e dos isotipos IgG1 e IgG2 específicos à proteína A2 recombinante e ao
extrato solúvel do parasita (LcPA) em amostras de soro dos animais antes e após
as imunizações e após a infecção desafio com L. chagasi.
c) Avaliar a resposta imune celular através da dosagem de IFN-gama, por
ELISA de captura, após a coleta e cultivo de PBMC (Peripheral blood
mononuclear cells) e o estímulo com a proteína A2-HIS e com o extrato
solúvel dos parasitos, antes da infecção desafio com L. chagasi.
Descrição do experimento
a) Executado em canil experimental da Hertape Calier em parceria
com a UFMG.
b) Utilizados cães da raça Beagle, mantidos por doze meses nos canis.
Durante esse período, os animais, foram submetidos a um programa
de vermifugação e imunização de rotina (vacinas contra parvovirose,
47
48
cinomose, hepatite infecciosa canina, parinfluenza, coronavirose e leptospiroses).
Foram também investigados por meio de exames laboratoriais a respeito de seu
perfil imunológico geral, clínico e soro-negatividade para leishmaniose.
c) Os animais receberam três doses de Leish-Tec® - Vacina Recombinante contra
Leishmaniose Visceral Canina, com intervalos de 21 dias entre elas, conforme
programa vacinal previsto.
d) Grupos de cães utilizados:
f vacinados e desafiados;
f vacinados e não desafiados;
f adjuvante e desafiados;
f placebo e desafiados;
f placebo e não desafiados.
e) Os cães foram monitorados mensalmente por meio de exames laboratoriais, com
o objetivo de verificar o estado geral do cão e a evolução sorológica distinta entre
grupo vacinado e não vacinado. Exames executados:
f hemograma completo;
f dosagem da taxa de uréia;
f dosagem da taxa de creatinina;
f proteínas totais e frações;
f relação albumina/globulina;
f exames sorológicos, ELISA e RIFI, contra antígeno total do parasita (SLA) e
contra o antígeno vacinal A2 recombinante.
f) O perfil da resposta imune humoral e celular nos animais vacinados e/ou desafiados
por L. chagasi.
f Avaliados através da produção de anticorpos e citocinas específicas,
respectivamente, para a proteína A2-HIS e ao extrato solúvel de L. chagasi.
f As dosagens sorológicas e de citocinas foram conduzidas antes e após a
infecção desafio.
f A avaliação sorológica dos cães foi realizada através de reação de
imunofluorescência (RIFI) e ELISA.
f Nas reações de ELISA foram utilizados como antígenos o extrato solúvel de L.
chagasi ou a proteína A2-HIS com amostras de soro dos cães coletadas
antes das imunizações, após cada dose das vacinas e periodicamente
após a infecção desafio.
f Foram determinados os níveis dos anticorpos IgG total e dos
isotipos IgG1 e IgG2, que se correlacionam com a resposta celular
do tipo Th2 e Th1, respectivamente.
f A resposta celular das citocinas IFN-γ, IL-4 e IL-10, foi avaliada em
amostras de RNA extraídas de PBMC (Peripheral Blood Mononuclear
Cells) dos cães imunizados, antes e após o desafio, conforme descrito
por Ramiro et al. (2003).
f Análises por ELISA de captura das citocinas também foram realizadas
através da coleta do sangue e da separação e cultura de PBMC, com posterior
estímulo com a proteína A2-HIS ou com o extrato solúvel de L. chagasi.
49
RESPOSTA HUMORAL
IgG Total Anti-A2
ANTI-A2
VI
VNI
I
Imunização
8º Mês
6º Mês
1º Mês
3ª Dose
2ª Dose
AD
1ª Dose
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
IgG Total Anti-A2
Antes da
Imunização
Abs (492 nm)
Resultados
Resposta Humoral
Após o desafio
IgG Total Antipromastigota
50
ANTI-TOTAL PROMASTIGOTE
ANTIGENIC EXTRACT
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
VI
VNI
I
Imunização
Após o desafio
8º Mês
6º Mês
1º Mês
3ª Dose
2ª Dose
1ª Dose
AD
Antes da
Imunização
Abs (492 nm)
IgG Total Anti-promastigota
IgG 2 Total Anti-A2
IgG total 2 Anti-A2
ANTI-A2
2,5
Abs (492 nm)
2
VI
1,5
1
VNI
I
0,5
AD
Imunização
8º Mês
6º Mês
1º Mês
3ª Dose
2ª Dose
1ª Dose
Antes da
Imunização
0
Após o desafio
IgG 2 Total Antipromastigota
ANTI-TOTAL PROMASTIGOTE
ANTIGENIC EXTRACT
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
VI
VNI
I
Imunização
8º Mês
6º Mês
1º Mês
3ª Dose
2ª Dose
1ª Dose
AD
Antes da
Imunização
Abs (492 nm)
IgG 2 total Anti-promastigota
Após o desafio
51
IgG 1 Total Anti-A2
ANTI-A2
VI
VNI
I
Imunização
8º Mês
6º Mês
1º Mês
3ª Dose
2ª Dose
AD
1ª Dose
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Antes da
Imunização
Abs (492 nm)
IgG 1 total Anti-A2
Após o desafio
IgG1 Anti-A2
IgG 1 Total Antipromastigota
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
VI
VNI
I
52
Imunização
Após o desafio
8º Mês
6º Mês
1º Mês
3ª Dose
2ª Dose
1ª Dose
AD
Antes da
Imunização
Abs (492 nm)
IgG 1 total Anti-promastigota
Resposta Celular
7000
6000
Control
rA2
5000
4000
3000
2000
1000
0
Vaccinated
PBS
Produção de IFN-γ por células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) de cães da raça Beagle imunizados com a
vacina Leish-Tec®, antes da infecção desafio por L. chagasi.
4000
IFN-g(pg/mL)
3500
3000
Medium
rA2
LcPA
2500
2000
1500
1000
500
0
Vaccinated/Infected
Infected
Produção de IFN-γ por células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) de cães da raça Beagle imunizados com
a vacina Leish-Tec®, após a infecção desafio por L. chagasi.
53
300
250
200
A2
LcPa
ConA
Medium
150
100
50
0
Vaccinatedand Infected
Infected
Produção de IL-10 por células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) de cães da raça Beagle imunizados com a vacina
Leish-Tec®, após a infecção desafio por L. chagasi.
Conclusões
a) Os dados obtidos através dos marcadores de resposta imune empregados (dosagem
de anticorpos IgG total, IgG1 e IgG2 e das citocinas IFN-γ e IL-10) indicam que essa
formulação vacinal é capaz de induzir resposta imune do tipo Th 1 (níveis elevados
de IgG2 e IFN-gama) e, portanto, associada com desenvolvimento de proteção em
todos os animais vacinados, antes da infecção desafio.
b) Animais imunizados com a vacina Leish-Tec® apresentaram elevada produção de
IFN-γ antes da infecção desafio em cultivo de PBMC estimulados com a proteína
recombinante A2, quando comparados aos grupos de cães tratados com PBS
(“Controle”) e Adjuvante, sob o mesmo estímulo.
c) No grupo de cães imunizados com a vacina Leish-Tec®, houve aumento significativo
na produção de anticorpos específicos à proteína recombinante A2 quando
comparados ao grupo “Adjuvante”, após a segunda e terceira doses da vacina, e,
quando comparados aos grupos “Adjuvante” e “Controle”, após a infecção desafio.
d) A produção de anticorpos anti-LcPA mostrou-se significativamente maior somente
após a infecção desafio, nos grupos “Controle” e “Vacinado”, quando comparados à
produção que ocorreu após as imunizações.
54
e) Os animais do grupo “Vacinado” apresentaram uma produção significativamente
maior de IgG2, específico à A2, quando comparado à IgG1, antes e após a infecção
desafio com L. chagasi.
f) Animais vacinados mantêm sorologia negativa, frente aos testes de rotina, por RIFI
ou por ELISA, onde é empregado o SLA como antígeno de captura.
g) A vacina mostrou-se inócua nos testes referenciados em Relatório
Técnico submetido ao MAPA: em modelo animal e na espécie a que se
destina, uma vez que animais vacinados permanecem soronegativos
após a imunização.
De acordo com os estudos conduzidos e os dados apresentados, conclui-se que a
vacina Leish-Tec induz resposta imune protetora contra a doença leishmaniose
visceral canina.
55
Canil de Experimentação 1
Área externa
Lateral externa
Canil de Experimentação 1
Seis baias / Isolamento / Clínica / Quarentena / Sala de paramentação / Banhos / Telas / Aeração
Canil de Experimentação 2
Área externa
56
Cinco baias / Isolamento / Clínica / Sala de paramentação /
Banhos / Telas / Aeração / Acesso a estranhos dificultado
Clínica - Acompanhamento de quadro clínico, coleta
de sangue para análises clínicas, vacinação e vermifugação
Artigo científico publicado referente à Fase II
Vaccine (2008), doi:10.1016/j, in press. Protective immunity against challenge with
Leishmania (Leishmania) chagasi in beagle dogs vaccinated with recombinant A2
protein. Ana Paula Fernandes1, Miriam Maria Silva Costa2, Eduardo Antônio Ferraz Coelho2,
Eloísa de Freitas3, Christiane de Freitas Abrantes5, Vinícius Hermont5; Wagner Luiz Tafuri4,
Maria Norma Melo3, Marilene Suzan Marques Michalick3 and Ricardo T. Gazzinelli2,6,7
Department of Clinical and Toxicological Analysis, School of Pharmacy, Federal University
of Minas Gerais – Belo Horizonte, MG, Brazil
2
Department of Biochemistry and Immunology, Institute of Biological Sciences Federal
University of Minas Gerais – Belo Horizonte, MG, Brazil
3
Department of Parasitology, Institute of Biological Sciences, Federal University of Minas
Gerais – Belo Horizonte, MG, Brazil
4
Department of Pathology, Institute of Biological Sciences, Federal University of Minas
Gerais – Belo Horizonte, MG, Brazil
5
Hertape-Calier Saúde Animal – Juatuba, MG, Brazil
6 René Rachou Research Center, Oswaldo Cruz Foundation – Belo Horizonte, MG, Brazil
7
Department of Medicine, University of Massachusetts Medical School, Worcester,
Massachusetts, USA
1
57
Produção da Leish-Tec®
Christiane de Freitas Abrantes, bióloga
A fabricação de vacinas recombinantes envolve a manipulação de um Microrganismo
Geneticamente Modificado (OGM). Dessa forma, faz-se necessário seguir rigorosos critérios
que atendam às Normas de Biossegurança e às Normas de Boas Práticas de Fabricação
(BPFs).
58
Biossegurança
As primeiras normas são ditadas pela Lei de Biossegurança no 11.105, de
março de 2005. Esta lei, em conjunto com suas Instruções Normativas e
outras normatizações, rege os critérios a serem adotados em toda e qualquer
manipulação de Organismos Geneticamente Modificados (OGMs), incluindo
as estruturas da área de fabricação.
A unidade produtiva de vacinas recombinantes foi projetada e construída de forma a atender
esses critérios, sendo hoje uma moderna unidade de produção.
A premissa para áreas biosseguras é garantir que o OGM não possa escapar para o
meio ambiente e que os colaboradores não tenham contato direto com o microrganismo
manipulado, eliminando riscos. Assim, a
unidade de produção possui características
especiais:
f 14 diferentes sistemas de ar, segregados por
dutos e filtros absolutos, impedindo qualquer
tipo de liberação ou contaminação;
f diferentes pressões de ar aplicadas às salas
que possuem níveis maiores ou menores de
risco de acordo com o processo executado;
f autoclaves de fronteira (equipamento que
descontamina e esteriliza por calor úmido),
garantindo que todo o material que deixar
a área biossegura está descontaminado,
inclusive a paramentação utilizada pelos
colaboradores;
f a rede de efluentes, coletora de
resíduos líquidos provenientes das salas de
manipulação de OGM, está segregada da
rede coletora de efluentes do restante do
prédio. A tubulação proveniente da área viva
é designada à ETE. É importante ressaltar que
todo o efluente é descontaminado no interior
das salas da área biossegura, antes de ser descartado na rede de efluentes
específica;
f o acesso a essa área se faz por meio de vestiário interno, masculino e feminino.
Cada um possui entrada e saída segregadas fisicamente, para paramentação adequada
e diferenciada, de uso exclusivo;
f equipamentos dotados de automação para certificar que, durante o processo,
todos os passos sejam seguidos corretamente e, ainda, que qualquer tipo de
acidente ou escape seja registrado;
f treinamentos constantes em biossegurança são ministrados à equipe de
vacinas recombinantes;
f vistoria semestral por Comissão Interna de Biossegurança (CIBio).
Dessa forma, é assegurado que todas as normas estejam sendo aplicadas à
produção.
O principal propósito da biossegurança é assegurar que os processos que
envolvem OGMs sejam executados sem que exista risco de contaminação
para o meio ambiente. A Hertape Calier cuida para que essas normas sejam
praticadas em sua totalidade.
59
Todos os critérios que regulamentam a biossegurança em OGMs são normatizados por um
órgão governamental denominado Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio).
Este tem poderes para liberar ou interditar uma produção, de acordo com a legislação.
É preciso obter certificados para fabricar produtos à base de OGMs. A Hertape Calier já
possui as certificações necessárias, uma vez que a área produtiva foi fiscalizada e aprovada
pelo órgão competente.
A seguir, o caminho percorrido para a área produtiva ser certificada para a produção
utilizando OGMs:
OGM
CQB
nção
Exte QB
de C
Scale
aixa
ta b
Plan ayout
eL
de
idas
Med enção
t
n
co
-up
l
oria
Mem ritivo
Desc
É observado que, dentre as exigências, encontra-se a descrição de todos os processos que
envolvem a fabricação. Os equipamentos, processos e controles de qualidade aplicados
devem ser descritos e planejados anteriormente ao início da produção. Para essa definição,
torna-se imprescindível a execução de projeto piloto, onde todos os processos serão
testados. Caso aprovados, segue o delineamento do projeto para produção comercial. A
Hertape Calier seguiu esses passos e hoje se encontra com a unidade de produção ativa e
de acordo com as exigências biosseguras e de processo.
60
Boas Práticas de Fabricação (BPF)
A Leish-Tec® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina é um produto
injetável e de elevado padrão de qualidade. Para assegurar que será obtido um produto
puro, livre de qualquer tipo de impureza, são seguidas normas de BPFs. Estas resguardam
a qualidade durante todo o processo produtivo.
Da mesma forma, a área produtiva atende a critérios severos de boas práticas
de produção, sendo construídas salas limpas de classe ISO 8 e ISO 7. Estas
possuem características especiais como:
f linhas de utilidades, dutos de ar e outros sob piso técnico, permitindo
manutenção externa à área de produção;
f reatores e linhas de aço inox 316L eletropolido;
f água para fabricação de injetáveis, produzida por estação de tratamento de
água dedicada;
f salas com cantos arredondados, piso, parede e teto com revestimento impermeável
e resistente a químicos;
f equipamentos que garantam a biossegurança para o operador e para o meio
ambiente;
f intertravamento de portas
automático, de forma a garantir
que o ar de uma sala não seja
misturado ao de outra;
f fluxo de pessoas e materiais
sem cruzamentos. Fluxo de
processo em linha contínua,
sem cruzamentos;
f treinamentos programados
para
colaboradores
em
processos, operação e BPFs;
61
f implantação de Plano de Validação para qualificação de equipamentos e funcionários,
bem como para a validação de processos produtivos e de limpeza;
f manutenção da qualidade do ar das salas limpas por certificação semestral por empresa
terceirizada.
Outra característica importante da unidade de produção de vacinas recombinantes é a
presença de todos os setores de apoio necessários à produção. Torna-se ágil e auxilia a
manutenção da biocontenção. A unidade possui setores de almoxarifado, sala de lavagem
e esterilização e preparo de meios. Além de área de envase e revisão. Toda essa estrutura
foi construída com o objetivo de agilizar a produção e não inchar a atual produção da
Hertape Calier. O crescimento planejado é sempre duradouro e oferece maior retorno.
Processo produtivo
A Produção de Leish-Tec® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina
envolve o cultivo de bactérias Escherichia coli modificadas geneticamente em suas
características próprias e pela inserção de parte de um gene de Leishmania. Essas bactérias
foram geradas em laboratório e, dessa forma, são únicas. Não existem sementes para serem
adquiridas no mercado. A semente utilizada
na confecção de cada lote é produzida pela
Hertape Calier. Utilizando-se de modernas
técnicas em biologia molecular, as sementes
produzidas são testadas e armazenadas a
baixas temperaturas. Um roteiro de produção,
de testes e de documentações é seguido, de
forma a garantir que a semente produzida
possua qualidade e, o mais importante, que
preserve todas as características da primeira
bactéria gerada. São clones idênticos em
diversas gerações. A produção certificada
de sementes é cuidadosamente executada
62
por profissionais treinados e assegurada por
técnicos “expertises” em biotecnologia.
A implantação do processo produtivo da
linha Leish-Tec® - Vacina Recombinante
contra
Leishmaniose
Visceral
Canina no formato moderno em
que se encontra foi viabilizada
pela visão empreendedora do
Hertape Calier. A metodologia
de obtenção de proteínas
recombinantes pelo cultivo de
E. coli é de domínio científico,
mas em nossa produção alguns
passos foram alterados, objetivando reduzir etapas químicas do processo e
melhorar a qualidade do produto final obtido.
É importante reduzir o número de reagentes químicos adicionados durante a fabricação
de um produto. Tem-se melhor qualidade e maior pureza com menor número de etapas.
É uma melhoria importante, pois sempre que um agente químico é adicionado,
o ideal é que este seja retirado do produto final e testes comprobatórios
são indispensáveis. No caso de Leish-Tec® - Vacina Recombinante contra
Leishmaniose Visceral Canina, foi implantada em sua linha produtiva um
equipamento que substitui uma etapa química de produção. Essa forma de
trabalho é amplamente divulgada em indústrias européias e, no Brasil, somos
a primeira indústria farmacêutica a utilizar esse processo. Outras importantes
otimizações foram implantadas com sucesso ao longo do desenvolvimento
produtivo. Temos o orgulho de poder dizer que a linha de produção de LeishTec® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina é moderna,
utiliza tecnologia avançada mesmo no que tange à biotecnologia e é executada
com o aconselhamento de grandes “expertises”. Todo o sistema trabalha em
regime de contenção, utiliza válvulas e tubulações de padrão farmacêutico e
63
obedecendo a normas de biocontenção.
Outro diferencial importante diz respeito às parcerias firmadas, pois, através dessas
relações, temos acesso fácil a novas tecnologias de mercado e podemos testar sua
implantação no desenvolvimento. Atualmente, a linha produtiva está pronta, mas testes
de qualidade sempre são bem-vindos. Quanto mais puder controlar sua produção, melhor
a qualidade do produto final obtido.
O sistema de produção de Leish-Tec® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral
Canina é muito tranqüilo. Uma vez entendido que a bactéria E. coli é nossa biofábrica,
entende-se que ela produzirá a proteína, antígeno para essa vacina. Pensando em linhas
gerais, é importante que seja fornecida todas as
Produção da proteína
condições ideais de crescimento para que nossa
recombinante A2
bactéria cresça e expresse a proteína-alvo. Após
a produção da semente certificada, esta será
encaminhada a fermentadores, contendo meios
de cultura ricos em aminoácidos, sais especiais e
outros nutrientes importantes ao desenvolvimento
celular. Para tanto, diversos estudos foram
realizados e muitas culturas foram crescidas até que
se pudessem encontrar condições ideais. Depois
de desvendados os parâmetros que envolvem o
crescimento dessas células, estava encerrada uma
etapa de desenvolvimento de processo.
As etapas que sucedem o cultivo celular
promoverão a retirada das proteínas das células
e a limpeza de todas as impurezas restantes.
Essas etapas também envolvem tecnologia no
desenvolvimento. É importante obter um produto
intermediário livre de substâncias indesejáveis e
que possa ser encaminhado ao próximo passo de
purificação. O termo tecnologia neste caso refereFormas amastigotas de
Leishmania sp.
Plasmídio vetor
Isolamento do DNA e extração
do gene que codifica a proteína A2
Inserção do gene A2
ao plasmídio vetor
Bactéria Escherichia coli
recombinante
Inserção do plasmídio vetor
com o gene A2
na célula receptora
Replicação da
E. coli recombinante
Cultura de E. coli
recombinante com
proteína A2
Ruptura mecânica das células
e extração da proteína A2
do citoplasma
Proteína A2 codificada
64
se a equipamentos implantados e forma de processo diferenciada, que permite eliminar
agentes possivelmente alergênicos e irritantes.
Nesta etapa, possui-se a proteína-alvo misturada a outras inúmeras proteínas, principalmente
de origem celular. É preciso selecionar apenas a proteína que comporá a vacina. Leish-Tec®
é composta por uma única proteína recombinante como antígeno, com elevado
teor de pureza. O método mais indicado para a separação específica de uma
proteína é denominado cromatografia. Essa é uma metodologia que exige
muito conhecimento agregado e equipamentos dedicados, de alta tecnologia.
Todos os passos foram cuidadosamente desenvolvidos e testados para que a
cromatografia fosse capaz de selecionar uma única proteína de uma mistura
de proteínas. Com a finalização desse processo, tem-se a proteína-alvo pura,
podendo ser dosada e encaminhada à formulação de Leish-Tec® - Vacina
Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina.
Importante ressaltar que todo o processo produtivo é acompanhado por testes
de controle em processo. Foi criado um laboratório no interior da área biossegura
apenas para essa finalidade. Um técnico devidamente treinado é responsável por
garantir que o processo siga o caminho que
Semente
Controle
se espera. Esse laboratório de controle,
Certificada
Molecular
apesar de estar dentro de uma área
Cultivo de OGM
Controle
produtiva, é um braço da Garantia
Microbiológico
Separação de
da Qualidade. Assegurando, mais
Proteínas
uma vez, a qualidade do produto
Purificação da
Proteína-Alvo
produzido, não apenas no produto
Controle
final, mas durante os processos
Formulação
Físico-químico
produtivos.
Envase
A produção e seus devidos
controles de qualidade podem ser
Leish ec
verificados conforme esquema ao
lado.
Controle
Controle
Controle
®
Físico-químico
Biológico
Microbiológico
65
Protocolo de vacinação/informações comerciais
Indicação: Imunização contra leishmaniose visceral canina.
Observações: Não é indicado para animais
portadores de leishmaniose por não ter caráter curativo.
A Leish-Tec® - Vacina Recombinante contra
Leishmaniose Visceral Canina será comercializada exclusivamente para médicos veterinários.
A vacina deverá ser aplicada em cães acima
de 4 meses de idade.
A vacinação deverá ser precedida de um
minucioso exame clínico realizado por um
médico veterinário.
A vacina deverá ser aplicada somente em
cães assintomáticos com resultados sorológicos negativos para leishmaniose
visceral canina.
Via de administração: subcutânea.
Posologia: três doses com intervalo de 21
dias entre as aplicações. Em caso de atraso,
iniciar novo protocolo.
O animal apresentará a resposta imunológica 21 dias após a terceira dose.
Revacinação anual a partir da primeira dose.
Em caso de atraso até 15 dias, administrar
66
duas doses com intervalo de 21 dias entre
as aplicações. Prazo superior a 15 dias,
iniciar novamente todo o protocolo vacinal
proposto.
Como no uso de todos os produtos biológicos, podem surgir reações de hipersensibilidade, que deverão ser imediatamente tratadas de acordo com a orientação do médico
veterinário.
A vacinação não é o único instrumento de
prevenção e controle dessa enfermidade.
Outras medidas também devem ser adotadas, conforme normatização do Ministério
da Saúde.
Os animais vacinados que apresentarem sinais clínicos de leishmaniose visceral, reações sorológicas positivas estarão passíveis
de adoção das medidas sanitárias vigentes.
O médico veterinário deverá, obrigatoriamente, manter sob sua guarda, durante no
mínimo 3 (três) anos após a última dose da
vacina, cadastro e registro contendo nome
do produto, data de fabricação, data de validade, nº de partida, nº de doses; o endereço completo e identificação completa do
animal vacinado, do responsável civil pelo
animal e datas de vacinação.
A Hertape Calier Saúde Animal S.A. deve:
manter obrigatoriamente, durante 3 (três)
anos após a data de distribuição do produto,
informações completas sobre os médicos
veterinários responsáveis pela aplicação da
vacina.
Em casos de animais vacinados com outra
vacina contra leishmaniose visceral canina,
diferente da Leish-Tec® - Vacina Recombinante
contra Leishmaniose Visceral Canina, o
proprietário deverá assinar uma declaração
específica e cumprir todo o protocolo proposto
da Leish-Tec® - Vacina Recombinante contra
Leishmaniose Visceral Canina para imunização
do animal. O atestado de vacinação anterior
deverá ser mantido anexo ao atual pelo fato
da imunização com a Leish-Tec® - Vacina
Recombinante contra Leishmaniose Visceral
Canina não ter o condão de reverter uma
eventual sorologia positiva decorrente da
vacinação anterior do cão com produto distinto
desta vacina.
Estocagem: entre 2ºC e 8ºC.
Validade: 12 meses.
Composição: Cada 1 mL contém:
Proteína recombinante (A2-HIS) .... 0,10 mg
Saponina ........................................ 0,50 mg
Timerosal 1:10.000 .......................... 0,01mL
Solução salina tamponada q.s.p. .. 1,00 mL
Comercialização: Caixa com 10 frascos com
uma dose vacinal de 1mL.
Venda sob prescrição e aplicação
obrigatória do médico veterinário.
Produto licenciado no Ministério da Agricultura sob nº 9270
em 24/01/2007.
Proprietário e Fabricante
Hertape Calier Saúde Animal
S.A.
Rodovia MG 050, nº 2001
Distrito Industrial, Juatuba - MG.
CEP: 35675-000
CNPJ 07.086.487/0001-16
Indústria Brasileira.
www.hertapecalier.com.br
Responsável Técnico:
Dr. Eduardo Souto Bernardez
CRMV-MG 4339
INDÚSTRIA BRASILEIRA
67
Certificado de Vacinação
®
(Consulte as orientações para preenchimento contidas no verso.)
Dados do Animal
Vacina recombinante contra leishmaniose visceral canina
Nome:
Raça:
Sexo: M
Nascimento:
F Pelagem:
Sorologia (preenchimento obrigatório somente antes da 1ª dose)
Laboratório:
Elisa
Resultado Positivo:
IFI
FC
Negativo:
Outro:
Data de Emissão do resultado negativo
O animal foi vacinado com outra vacina?
Sim
Não
Caso o animal tenha sido vacinado com outra vacina contra a leishmaniose e por este motivo esteja soropositivo, assine a declaração abaixo:
Declaração
O proprietário, abaixo qualificado, declara que o animal acima qualificado foi vacinado em data anterior à presente, com vacina contra a “leishmaniose visceral canina” diferente da LeishTec®. Declaro, ainda, que me foi esclarecido, quando da compra/administração da Leish-Tec®, que a vacinação anterior de meu animal, em razão da forma de indução de imunidade pelo
produto então utilizado, faz com que exame sorológico eventualmente feito em meu cão, ainda hoje, possa indicar um resultado positivo para a doença que a vacina visa a prevenir, mesmo
que o animal não esteja doente.
Declaro, por fim, que me foi esclarecido que a vacina Leish-Tec® não tem o condão (capacidade) de modificar a eventual sorologia positiva decorrente da vacinação anterior do cão com
produto distinto desta vacina, devendo os testes pertinentes, que permitam diferenciar sorologia positiva por infecção e sorologia positiva por vacinação, ser desenvolvidos na forma, por
quem e no prazo definidos pela Instrução Normativa Interministerial n.º 31/2007.
Por ser verdade, firmo a presente.
____________________________, ________, de ______________ de 2__________.
Comprador/Proprietário_________________________________
Dados do Proprietário
Nome Completo:
RG
CPF
Endereço Residencial:
-
CEP
Bairro:
UF
Cidade:
e-mail
Tel.:
Dados da Clínica
Nome da Clínica
RG
CPF
Endereço da Clínica:
-
CEP
Bairro:
UF
Cidade:
e-mail
Tel.:
1ª Dose
2ª Dose
Preencha aqui a previsão da próxima vacinação
Data:
3ª Dose
Preencha aqui a previsão da próxima vacinação
Obs.: preencha os campos abaixo antes de
colar a etiqueta no espaço sombreado
Preencha aqui a previsão da próxima vacinação
Revacinação Anual
Data:
Data:
Obs.: preencha os campos abaixo antes de
colar a etiqueta no espaço sombreado
Obs.: preencha os campos abaixo antes de
colar a etiqueta no espaço sombreado
Preencha aqui a previsão da próxima vacinação
Data:
Obs.: preencha os campos abaixo antes de
colar a etiqueta no espaço sombreado
Lote
Lote
Lote
Lote
Fabr.
Fabr.
Fabr.
Fabr.
Venc.:
Venc.:
Venc.:
Venc.:
Caso seja necessária a utilizacão de novo cartão de
vacinação, cite abaixo o número do cartão anterior
Caso seja necessária a utilizacão de novo cartão de
vacinação, cite abaixo o número do cartão anterior
Caso seja necessária a utilizacão de novo cartão de
vacinação, cite abaixo o número do cartão anterior
Caso seja necessária a utilizacão de novo cartão de
vacinação, cite abaixo o número do cartão anterior
Carimbo e assinatura do médico veterinário
responsável pela vacinação em todas as vias
Carimbo e assinatura do médico veterinário
responsável pela vacinação em todas as vias
Carimbo e assinatura do médico veterinário
responsável pela vacinação em todas as vias
Carimbo e assinatura do médico veterinário
responsável pela vacinação em todas as vias
Obs.: caso a segunda e/ou terceira doses ocorram em clínica(s) distinta(s), preencha novo formulário, enviando a terceira via para a Hertape Calier S.A. - Não é necessário selar.
Caso seja uma revacinação anual, cite abaixo o
número do último certificado de vacinação utilizado.
68
Hertape Calier Saúde Animal S/A.
Rodovia MG 050 - Km 4 Distrito Industrial Juatuba - MG
CEP 30675-000 - Tel.: (31) 3537-4300
Nº 000001
1ª via: Proprietário
Descrevemos a seguir as exigências da Instrução Normativa Interministerial Nº 31, de 09 de julho de 2007,
publicada no Diário Oficial da União de 10 de julho de 2007, Seção 1, Pág. 1, que prevê no seu art.:
Art. 6º O conteúdo e o uso da vacina fora das áreas de risco
delimitadas pelo Ministério da Saúde não exime as empresas e
os profissionais de responsabilidade.
§ 1º Os municípios nos quais a leishmaniose visceral canina é
endêmica, segundo o Ministério da Saúde, só poderão utilizar
vacinas que permitam diferenciar cães vacinados de cães
infectados.
§ 2º Para realizar a comercialização de vacinas que permitem
a diferenciação entre cães vacinados e cães infectados nos
municípios indenes, deverá haver disponibilidade de kits para
diagnóstico registrados no MAPA para tal fim.
§ 3º A indicação de uso do produto deverá ser atribuição
exclusiva de um médico veterinário, salvo casos de interesse
público conforme normatização do Ministério da Saúde.
§ 4º O médico veterinário deverá emitir atestado ou preencher
cartão de vacinação que contenha todos os dados sobre a
identificação do animal, sobre o responsável civil pelo animal,
inclusive endereço completo, e informações completas do produto
(nome, data de fabricação, data de validade, nº de partida, nº
de doses). Essas informações devem ficar armazenadas por 5
(cinco) anos.
§ 5º O proprietário do registro do produto deve manter
obrigatoriamente, durante, no mínimo, 3 (três) anos após a data
de distribuição do produto, informações completas sobre os
médicos veterinários responsáveis pela aplicação da vacina.
§ 6º O fabricante deverá encaminhar para o Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento relatórios trimestrais
de produção, distribuição e os municípios nos quais o produto
esteja sendo comercializado, como também o número de doses
vendidas por município. Cabe ao Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento remeter trimestralmente os dados ao
Ministério da Saúde.
§ 7º A vacina deverá ser usada somente em cães com diagnóstico
sorológico negativo para leishmaniose visceral, utilizando kits
para diagnóstico registrados no MAPA.
ORIENTAÇÕES PARA PREENCHIMENTO DO CERTIFICADO
DE VACINAÇÃO
Dados do Animal, Dados do Proprietário, Dados da Clínica Preencher com letra de forma, legível e observando a qualidade
nas cópias da segunda e terceira vias - se necessário, coloque o
formulário sobre uma superfície dura.
Sorologia - Anote os dados do atestado obtido junto ao
laboratório que o executou.
Oriente o proprietário do animal a guardar em local seguro o Certificado de
Vacinação.
1ª Dose - Após a aplicação da vacina Leish-Tec®, escreva nos
campos reticulados os dados contidos na etiqueta do frasco da
vacina, assegurando sua leitura nas outras vias e, somente após
este procedimento, cole-o no local indicado.Indique no campo
“próxima vacinação” as datas previstas da segunda e terceira
doses.
Importante - Carimbe e assine todas as vias do Certificado de
Vacinação.
2ª Dose - Quando a aplicação da dose seguinte for executada
pelo mesmo médico veterinário, é importante, antes de
colar o selo do frasco vacinal, escrever os dados nos campos
sombreados, verificando sua leitura na segunda e terceira vias.
Neste caso, NÃO será necessário enviar a informação para a
Hertape Calier. Oportunamente, será destinado espaço no site
www.hertapecalier.com.br para a atualização do Certificado.
No caso da 2ª dose ser executada por outro médico veterinário,
o novo profissional deverá, obrigatoriamente, abrir NOVO
FORMULÁRIO, indicando no campo destacado o número do
formulário que o antecedeu. Indique no campo apropriado a
data prevista para a 3ª dose. Importante - carimbe e assine todas
as vias do Certificado de Vacinação.
Destaque as vias deixando a 1ª com o Cliente, mantendo a 2ª
via em seu poder por 5 anos. Dobre, cole e coloque em qualquer
agência da ECT ou caixa coletora a 3ª via. Não é necessário selar
- o selo será pago pela Hertape Calier Saúde Animal.
Oriente o proprietário do animal a mantê-lo junto com o
Certificado de Vacinação anterior.
3ª Dose - Quando a aplicação da 3ª dose for executada pelo
mesmo médico veterinário que executou a 2ª dose, é importante,
antes de colar o selo do frasco vacinal, escrever os dados nos
campos sombreados, verificando sua leitura na segunda e terceira
vias. Neste caso, NÃO será necessário enviar a informação para
a Hertape Calier. Oportunamente, será destinado espaço no site
www.hertapecalier.com.br para a atualização do Certificado.
INDIQUE NO CAMPO APROPRIADO, NA ÚLTIMA LINHA DO
CERTIFICADO, A DATA DE REVACINAÇÃO ANUAL.
No caso da 3ª dose ser executada por médico
veterinário
distinto do que efetuou o procedimento da
2ª dose, o profissional que a estiver executando deverá,
obrigatoriamente, abrir NOVO FORMULÁRIO, indicando no
campo destacado o número do formulário que o antecedeu.
Importante - carimbe e assine todas as vias do Certificado de
Vacinação.
Destaque as vias deixando a 1ª com o Cliente, mantendo a 2ª
via em seu poder por 5 anos. Dobre, cole e coloque em qualquer
agência da ECT ou caixa coletora a 3ª via. Não é necessário selar
- o selo será pago pela Hertape Calier Saúde Animal.
Oriente o proprietário do animal a mantê-lo junto com o
Certificado de Vacinação anterior.
Com o objetivo de cumprimento das normas previstas para a realização
da quarta fase de desenvolvimento da vacina Leish-Tec®, a Hertape
Calier Saúde Animal terá assegurado o direito de acesso aos dados
contidos nos Certificados de Vacinação, sendo que a mesma garante
ao responsável toda a segurança quanto a sua confidencialidade
para usos distintos àqueles destinados à pesquisa científica.
A Hertape Calier Saúde Animal S.A. declara que a veracidade das
informações contidas no Certificado de Vacinação deverá ser
atribuída ao proprietário do animal que as forneceu e ao médico
veterinário responsável pelo preenchimento do mesmo.
Destaque as vias deixando a 1ª com o Cliente, mantendo a 2ª
via em seu poder por 5 anos. Dobre, cole e coloque em qualquer
agência da ECT ou caixa coletora a 3ª via. Não é necessário selar
- o selo será pago pela Hertape Calier Saúde Animal.
1ª via: Proprietário
69
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