UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DOS GENES IL-1b, FLI-1 e
MCP-1 COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA EM UMA POPULAÇÃO CASOCONTROLE DO ESTADO DO AMAZONAS, BRASIL
KAROLINA DA COSTA SABINO
MANAUS
2014
i
KAROLINA DA COSTA SABINO
ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DOS GENES IL-1b, FLI-1 e
MCP-1 COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA EM UMA POPULAÇÃO CASOCONTROLE DO ESTADO DO AMAZONAS, BRASIL
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Medicina Tropical da
Universidade do Estado do Amazonas em
Convênio com a Fundação de Medicina
Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para
obtenção do grau de Mestre em Doenças
Tropicais e Infecciosas.
Orientador: Prof. Dr. Rajendranath Ramasawmy
MANAUS
2014
ii
Ficha Catalográfica
S116e
Sabino, Karolina da Costa.
Estudo de associação de polimorfismos dos genes IL-1b, FLI-1 e
FOLHA DE JULGAMENTO
MCP-1 com leishmaniose cutânea em uma população caso-controle do
estado do Amazonas, Brasil / Karolina da Costa Sabino – Manaus:
Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical
Doutor Heitor Vieira Dourado, 2014.
xvii. 93 f.: il.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas – UEA/FMTHVD, 2014.
Orientador: Profº. Dr. Rajendranath Ramasawmy
1. Leishmaniose 2.Polimorfismo genético 3. IL-1b 4. MCP-1 5. FLI-1
I. Título.
CDU: 616.9
Ficha Catalográfica elaborada pela Bibliotecária Maria Eliana do N. Silva
lotada na Escola Superior de Ciências da Saúde - UEA
iii
ESTUDO DE ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DOS GENES IL1b, FLI-1 e MCP-1 COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA EM UMA
POPULAÇÃO CASO-CONTROLE DO ESTADO DO AMAZONAS,
BRASIL
KAROLINA DA COSTA SABINO
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Doenças
Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação
em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a
Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”.
Banca Julgadora:
______________________________________
Presidente
______________________________________
Membro
______________________________________
Membro
iv
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais, Maria Auxiliadora da Costa Sabino e
Mizael da Silva Sabino, pelo apoio constante e incondicional, sem os quais seria
impossível completar esta árdua caminhada.
v
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar a Deus, minha fonte de inspiração e sabedoria. Quem me sustentou
e me deu forças em todos os momentos dessa jornada. Mesmo nos dias em que eu
pensava em desistir e abandonar o sonho da pesquisa, Ele sempre colocava pessoas
em meu caminho que pudessem me aconselhar e alegrar meu dia, e me mostrar que
toda grande conquista requer uma árdua batalha. Obrigada meu Criador e
Consolador, sem Ti não estaria aqui.
Aos meus pais, Maria Auxiladora da Costa Sabino e Mizael da Silva Sabino meus
sinceros e eternos agradecimentos, pois se fui atrás dos meus sonhos, foi porque
vocês foram meus maiores incentivadores e patrocinadores. A vocês dedico todo meu
amor, carinho e gratidão, por me educarem tão bem e por serem meus referenciais
de caráter, honestidade, perseverança, mansidão e sabedoria. Por me ensinarem com
exemplos concretos que a vida é cheia de lutas e dificuldades, mas que com fé e
persistência sempre podemos vencer e tirar grandes lições de todas as adversidades.
Aos meus queridos irmãos Karinna Sabino e Alexandre Sabino. Obrigada por
existirem e por sempre torcerem por mim. Agradeço pelas palavras de incentivo e
apoio que sempre liberaram a mim, e por toda ajuda que vocês me deram nessa
etapa. Amo vocês de todo meu coração.
Ao meu orientador Rajendranath Ramasawmy pela oportunidade de fazer o mestrado.
À Dra Cintia Mara Costa de Oliveira, minha primeira e eterna orientadora. Quem me
ensinou a dar os primeiros passos na pesquisa e que me inspirou pelo seu exemplo
de caráter e seriedade. Obrigada pela amizade e oportunidade.
À gerência de Leishmaniose na pessoa do Dr. Jorge Guerra e aos técnicos Amélia
Bittencourt, Claudemir Félix e Rita pelo apoio na etapa de recrutamento dos pacientes.
À Universidade do Estado do Amazonas (UEA) e à Fundação de Medicina Tropical
Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT/HVD) pela excelência no ensino e por proporcionarem
aos seus alunos um ambiente favorável ao aprendizado.
vi
Aos colegas da turma de Pós-Graduação, que tornaram essa caminhada mais
agradável. Obrigada pelas risadas, trocas de conhecimentos, confraternizações e
convívio diário.
Às amigas Luciane Souza e Priscila Bentes, que caminharam lado a lado comigo nesta
jornada. Meninas, sem vocês esta caminhada teria sido muito mais árdua. De todo
coração agradeço por tê-las em meu caminho, por todas as conversas, lamentações,
incertezas, alegrias, gargalhadas e ajuda mútua. Levarei essa experiência para
sempre comigo, e vocês certamente farão parte dessas lembranças. É bem verdade
que cordão de três dobras não se rompe com facilidade, nós somos prova viva disso.
Às amigas de todas as horas Belisa Maia, Brigite Stela e Lorena Sabrina. Presentes
de Deus para minha vida e que nessa etapa tão crucial, foram muito mais que amigas,
foram irmãs, conselheiras, psicólogas e incentivadoras. Amigas queridas, obrigada
por acreditarem em mim, muitas vezes até mais do que eu. Amo vocês.
Às amigas e aventureiras Bárbara Yole e Larissa Morais que estiveram comigo desde
os tempos de graduação. Seguiram caminhos distintos dos meus, mas sempre
estiveram presente para me ouvir, encorajar e torcer pelo meu sucesso. Que eu possa
assistir de perto o sucesso de vocês também.
A todos os amigos e familiares, tanto presentes quanto ausentes, mas que de alguma
forma me deram uma palavra de incentivo e esperança. Que sempre mostraram estar
na torcida por mim, desejando que tudo acabasse bem.
À Geovana Broto, Heloísa Salomão e Helena D’Espindula por tão gentilmente terem
nos recebido e ajudado com a parte estatística do projeto. Agradeço de coração, pois
vocês nos receberam de modo tão acolhedor, e mesmo sabendo de nossas limitações
foram pacientes e atenciosas. You girls are the best!
Aos amigos do Laboratório de Pesquisa em Doenças Endêmicas (LPDE), pelos
momentos de descontração e gargalhadas. Em especial à dona Maria, pela amizade,
carinho, abraços apertados e pelos momentos de descontração, regado a muitas
risadas e deliciosos cafezinhos.
Às agências de fomento à pesquisa CNPq e CAPES pela bolsa concedida e pelos
recursos disponibilizados para a execução do estudo.
vii
Meu agradecimento mais do que especial aos pacientes e voluntários sem
leishmaniose, que por mais incômodo que fosse, aceitaram participar da pesquisa e
depositaram total confiança em nossa equipe, nos recebendo em seus lares de forma
tão acolhedora.
Por fim, agradeço a todos que contribuíram de alguma forma, direta ou indiretamente,
para que esse estudo fosse realizado.
viii
DECLARAÇÃO DAS AGÊNCIAS FINANCIADORAS
À Superintendência da Zona Franca de Manaus – SUFRAMA e Fundação de Apoio
Institucional Muraki-FMuraki pelo apoio na estrutura do Programa de Pós-Graduação
em Medicina Tropical.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela
concessão da bolsa de pesquisa.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo
financiamento desta pesquisa (MCTI/CNPq/MS-SCTIE) sob numeração: 04181/20120.
ix
“I have no special talent. I am only passionately curious.”
(Albert Einstein)
“Nothing worth having was ever achieved without effort.”
(Theodore Roosevelt)
x
RESUMO
As leishmanioses representam um complexo de doenças com importante espectro
clínico e diversidade epidemiológica, sendo causadas por um protozoário intracelular
obrigatório pertencente ao gênero Leishmania. Nas áreas onde a leishmaniose é
considerada endêmica, somente uma fração da população exposta ao parasita
desenvolve a doença, sugerindo que fatores genéticos tenham um papel fundamental
nesse contexto, associado a fatores ambientais, socioeconômicos, culturais, entre
outros. Assim, com o propósito de identificar polimorfismos que possam ter influência
no controle da susceptibilidade, o presente estudo teve como objetivo verificar o papel
de polimorfismos genéticos em IL-1b, FLI-1 e MCP-1 associados com leishmaniose
cutânea (LC) em uma população do estado do Amazonas. Para realização do estudo
foram recrutados um total de 774 indivíduos, sendo 392 indivíduos com leishmaniose
cutânea para compor o grupo caso, oriundos da demanda espontânea do ambulatório
de Dermatologia da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMTHVD); e 382 indivíduos sem a doença para o grupo controle, provenientes da mesma
área endêmica dos casos. O DNA genômico foi extraído a partir do creme leucocitário
com o kit comercial de extração de DNA, de acordo com as instruções sugeridas pelo
fabricante, ou pela técnica de “salting-out”. No que se refere aos SNPs IL1b_rs1143634 (IL-1b 3953 C/T), MCP1_rs1024611 (MCP-1 -2518 A/G),
FLI1_rs619521 e FLI1_rs531894, não foram observadas associações genéticas com
a susceptibilidade ou resistência à LC na população estudada. Para o SNP
IL1b_rs16944 (IL-1b -511 C/T), foram detectadas diferenças estatisticamente
significativas na distribuição alélica e genotípica do polimorfismo entre os grupos caso
e controle, sugerindo associação do alelo C com susceptibilidade [P=0.027, OR=1.42
IC95% (1.04 – 1.94)], e do alelo T com resistência [P=0.036, OR=0.66 IC95% (0.45 –
0.96)] para LC. Para o SNP rs7930515 de FLI-1 foi observado valor de P “borderline”,
podendo-se sugerir que o alelo C está associado com risco para LC [P=0.036,
OR=2.38 IC95% (1.07 – 5.32)]. Os resultados obtidos no presente estudo reforçam o
papel dos genes IL1-b e FLI-1 associados com resistência ou susceptibilidade a LC.
Descritores: Leishmaniose, polimorfismo genético, IL-1b, MCP-1, FLI-1.
xi
ABSTRACT
Leishmaniasis represents a complex of diseases with important clinical spectrum and
epidemiological diversity, being caused by an obligate intracellular protozoan
belonging to the genus Leishmania. In areas where leishmaniasis is considered
endemic, just a part of the population exposed to the parasite get sick, suggesting that
genetic factors have a key role in this context, associated with socioeconomic,
environmental and cultural factors. Thus, in order to identify polymorphisms that might
influence the control of susceptibility, this study aimed to determine the role of genetic
polymorphisms in IL-1b, FLI-1 and MCP-1 associated with cutaneous leishmaniasis
(CL) in a population of the state of Amazonas. To conduct the study were recruited 774
subjects, being 392 subjects with cutaneous leishmaniasis to compound the case
group, all of them derived from the spontaneous demand of the dermatology
ambulatory of Tropical Medicine Foundation Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD);
and 382 individuals without the disease to the control group, from the same endemic
area of case group. Genomic DNA was extracted from the buffy coat with the
commercial DNA extraction kit according to the instructions suggested by the
manufacturer or by the technique of salting-out. In regard to IL-1b_rs1143634 (IL-1b
3953 C/T), MCP1_rs1024611 (MCP-1 -2518 A/G), FLI1_rs619521 and FLI1_rs531894
SNPs, were not observed genetic associations with susceptibility or resistance to LC
in the studied population. For IL1b_rs16944 (IL-1b -511 C / T) SNP, statistically
significant differences were found in allele and genotype distribution of the
polymorphism between case and control groups, suggesting an association of the C
allele with susceptibility [P = 0.027, OR = 1:42 95 % (1.04 - 1.94)], and the T allele with
resistance [P = 0.036, OR = 0.66 95% (0.45 - 0.96)] to LC. For rs7930515 SNP of FLI1 was observed a borderline P-value, suggesting that the C allele is associated with
risk for LC [P = 0.036, OR = 95% 2:38 (1:07 to 5:32)]. The results obtained in this study
reinforce the role of IL1-b and FLI-1 genes associated with resistance or susceptibility
to LC.
Key-words: Leishmaniasis, genetic polymorphism, IL-1b, MCP-1, FLI-1.
xii
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ATP – Adenosina trifosfato;
C3 – Convertase 3;
CCC – Cardiomiopatia chagásica crônica;
CCL2 – quimiocina CC ligante 2 (gene);
CMSP - Células mononucleares do sangue periférico;
CMI anti-Leishmania – Imunidade mediada por células anti-Leishmania;
CR1 – Receptor de complemento 1;
CR3 – Receptor de complemento 3;
DLL1 – delta-like 1 (gene);
DMSO – Dimetilsulfóxido;
DNA – Ácido desoxirribonucleico;
dNTP – desoxirribonucleotídeo trifosfato;
EDTA – Ácido etilenodiamino tetra-acético;
ETS – E26 Transformation-Specific;
FLI-1 – friend leukemia virus integration 1 (gene);
GM-CSF – Fator estimulador de colônias de macrófagos e granulócitos;
GTP – Guanosina trifosfato;
Hae III – Haemophilus aegyptius III;
IFNGR1 – interferon gamma receptor 1 (gene);
IFN-γ – Interferon gama;
IL – Interleucina;
IL-1b – Interleucina 1 beta (gene);
LCD – Leishmaniose Cutâneo-Difusa;
LCL – Leishmaniose Cutâneo-Localizada;
LIT – Liver Infusion Triptose;
LMC – Leishmaniose Mucocutânea;
LTA – Leishmaniose Tegumentar Americana;
LV – Leishmaniose Visceral;
MCP1 – gene para proteína quimioatrativa de monócito tipo 1;
M-CSF – Fator estimulador de colônia de macrófago;
min – minuto;
xiii
mL – mililitro;
mm – milímetro;
mM – milimolar;
µL – microlitro;
ng – nanograma;
NNN – Mc Neal, Novy e Nicolle;
NRAMP1 – proteína 1 do macrófago associado à resistência natural (gene);
PCR - Reação em cadeia da polimerase;
pM – picomolar;
RFLP – Análise clássica de comprimento do fragmento de restrição;
RNA – Ácido ribonucleico;
rpm – rotações por minuto;
Sb+5 - Antimônio pentavalente;
seg – segundos;
SF – soro fisiológico;
SFM – Sistema fagocítico mononuclear;
SLA - Antígeno solúvel de Leishmania;
SNP – polimorfismo de nucleotídeo único;
TAE – tampão Tris-Acetato-EDTA;
TCLE – Termo de consentimento livre e esclarecido;
TGFB1 – fator transformador de crescimento beta 1 (gene);
TGF-β – Fator transformador de crescimento beta;
Th1 – T helper 1;
Th2 – T helper 2;
TLR4 – Receptor toll-like 4 (gene);
TNF-α – Fator de necrose tumoral alfa;
U – Unidades;
UV – Ultravioleta;
xiv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Características clínicas da leishmaniose humana....................................... 8
Tabela 2. Informações gerais dos marcadores polimórficos genotipados para MCP-1,
IL-1b e FLI-1. ............................................................................................................. 23
Tabela 3. Condições gerais de PCR usadas para o marcador MCP1_rs1024611. .. 23
Tabela 4. Condições gerais de PCR usadas para os marcadores IL1b_rs16944 e
IL1b_rs1143634. ....................................................................................................... 24
Tabela 5. Condições gerais de PCR usadas para os marcadores FLI1_rs7930515 e
FLI1_rs619521. ......................................................................................................... 24
Tabela 6. Condições gerais de PCR usadas para o marcador FLI1_rs145675082. . 24
Tabela 7. Condições gerais de PCR usadas para o marcador FLI1_rs531894 ........ 25
Tabela 8. Condições gerais usadas na reação de digestão. .................................... 26
Tabela 9. Condições gerais usadas na reação de PCR-RFLP. ................................ 29
Tabela 10. Características gerais da população caso-controle em estudo. .............. 30
Tabela 11. Comparação das distribuições das frequências genotípicas e alélicas para
os marcadores MCP1_rs1024611, IL1b_rs1143634, FLI1_rs619521 e FLI1_rs531894.
.................................................................................................................................. 34
Tabela 12. Comparação da distribuição das frequências genotípica, alélica e de
dominância para o marcador IL1b_rs16944 .............................................................. 34
Tabela 13. Comparação da distribuição das frequências genotípica, alélica e de
dominância para o marcador FLI1_rs7930515 .......................................................... 36
xv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Morfologia das duas principais formas de Leishmania ................................ 1
Figura 2. Ciclo parasita-hospedeiro das leishmanioses ............................................. 2
Figura 3. Distribuição da leishmaniose cutânea no mundo. ....................................... 4
Figura 4. Padrão eletroforético da PCR-RFLP para os SNPs IL1-B +3953 C/T e IL1-B
-511 C/T respectivamente. ........................................................................................ 31
Figura 5. Padrão eletroforético da PCR-RFLP para o SNP MCP1 -2518 A/G. ......... 31
Figura 6. Padrão eletroforético da PCR-RFLP para os SNPs FLI1_rs7930515,
FLI1_rs619521 e FLI1_rs531894 respectivamente. .................................................. 32
Figura 7. Análise de desequilíbrio de ligação entre os SNPs dos genes IL-1b e FLI-1
respectivamente.. ...................................................................................................... 32
xvi
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................... 1
1.1. Leishmaniose – Aspectos Gerais ......................................................................... 1
1.2. Leishmaniose Tegumentar Americana ................................................................. 6
1.3. Imunopatogênese da leishmaniose ...................................................................... 8
1.4. O Modelo experimental murino para leishmaniose ............................................ 11
1.5. Fatores genéticos na leishmaniose .................................................................... 13
1.5.1. IL-1b ................................................................................................................ 14
1.5.2. FLI-1 ................................................................................................................ 16
1.5.3. MCP-1 ............................................................................................................. 16
2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 18
2.1. Objetivo Geral .................................................................................................... 18
2.2. Objetivos Específicos ......................................................................................... 18
3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 19
3.1. Delineamento do estudo..................................................................................... 19
3.2. Área de estudo ................................................................................................... 19
3.3. População estudada ........................................................................................... 19
3.3.1. Definição de Caso ........................................................................................... 19
3.3.2. Recrutamento da população ........................................................................... 20
3.3.3. Grupo caso ...................................................................................................... 20
3.3.4. Grupo controle................................................................................................. 20
3.4. Coleta do material biológico ............................................................................... 21
3.5. Extração de DNA ................................................................................................ 21
3.6. Genotipagem ...................................................................................................... 22
3.6.1. PCR ................................................................................................................. 23
3.6.2.Digestão ........................................................................................................... 25
3.7. Análise estatística .............................................................................................. 27
3.8. Aspectos Éticos: ................................................................................................. 27
3.9. Suporte Financeiro: ............................................................................................ 27
xvii
4. RESULTADOS ................................................................................................... 30
4.1. Características Gerais da População em Estudo ............................................... 30
4.2. Genotipagem, HWE e DL ................................................................................... 31
4.2.1 Análise dos marcadores MCP1_rs1024611, IL1b_rs1143634, FLI1_rs619521 e
FLI1_rs531894 .......................................................................................................... 33
4.2.2. Análise do marcador IL1b_rs16944 ................................................................. 33
4.2.3. Análise do marcador FLI1_rs7930515............................................................. 33
5. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 37
5.1. MCP-1 ................................................................................................................ 38
5.2 FLI-1 .................................................................................................................... 39
5.3 IL-1b .................................................................................................................... 40
6. CONCLUSÃO ..................................................................................................... 43
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................. 44
8. ANEXOS............................................................................................................. 54
Anexo A – Fluxograma do Estudo ............................................................................. 54
Anexo B – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ......................................... 55
Anexo C – Questionário ............................................................................................ 59
Anexo D – Protocolo de Extração ............................................................................. 60
Anexo E – Minuta de Artigo ....................................................................................... 61
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Leishmaniose – Aspectos Gerais
As leishmanioses são consideradas um grande problema de saúde pública,
representando um grupo de doenças com importante espectro clínico e diversidade
epidemiológica (1,2). São uma das mais diversas e complexas doenças transmitidas
por vetores, sendo causadas por um protozoário intracelular obrigatório pertencente
ao gênero Leishmania (3).
Leishmania é um protozoário pertencente à família Trypanosomatidae, ordem
Kinetoplastidae, gênero Leishmania, subgêneros Leishmania e Viannia (4).
Sete espécies de Leishmania têm sido associadas como agentes causadores
da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) no Brasil: Leishmania (Viannia)
braziliensis, Leishmania (Viannia) guyanensis, Leishmania (Viannia) lainsoni,
Leishmania (Viannia) naiffi, Leishmania (Viannia) shawi, Leishmania (Viannia)
lindenberg, e Leishmania (Leishmania) amazonensis. Contudo, L. (V.) braziliensis é o
principal agente etiológico da LTA no Brasil (5).
Leishmania apresenta-se com duas formas principais: uma flagelada ou
promastigota, encontrada no tubo digestivo do vetor, e outra aflagelada ou amastigota,
observada nos tecidos dos hospedeiros vertebrados como parasita intracelular
obrigatório das células do sistema fagocitário mononuclear, conforme ilustrado na
figura 1 (1).
Figura 1. Morfologia das duas principais formas de Leishmania: a) Forma flagelada ou promastigota
do parasita. b) Forma aflagelada ou amastigota.
Fonte: Ministério da Saúde, 2010.
2
O flebotomíneo responsável pela transmissão do parasito da LTA na América
pertence à subfamília Phlebotominae e gênero Lutzomyia (4).
No ciclo epidemiológico da LTA (esquematizado na figura 2), o flebotomíneo
representa o elo entre os reservatórios e o homem, que se comporta apenas como
hospedeiro acidental da Leishmania. Este parasito é dimórfico, assim, ao picar os
reservatórios infectados, as fêmeas dos flebotomíneos adquirem as formas
amastigotas do protozoário, que rapidamente se transformam em formas
promastigotas no intestino dos vetores. Essas formas dividem-se ativamente e no
novo repasto, são injetadas na pele do hospedeiro. As promastigotas são as formas
infectantes do parasito que interagem com as células do sistema fagocitário
mononuclear, perdem o flagelo e, sob a forma amastigota, passam a se multiplicar no
interior das células, sendo a infecção combatida pelas defesas do hospedeiro,
evoluindo para a cura espontânea; ou evoluindo para uma das diversas manifestações
clínicas da leishmaniose (6,7).
Figura 2. Ciclo parasita-hospedeiro das leishmanioses
Fonte: http://dc236.4shared.com/doc/FeNBLQeC/preview.html
As formas clínicas da leishmaniose são diversas, sendo descritas em:
leishmaniose visceral (LV) - geralmente fatal quando não tratada; leishmaniose
mucocutânea (LMC) - doença mutilante; leishmaniose cutâneo-difusa (LCD) - doença
de longa duração devido à deficiência na resposta imune celular; e leishmaniose
3
cutânea (LC) que é incapacitante quando as lesões são múltiplas (2,8). Segundo
estudo realizado por Toleto et al, 2013, a LC afetou a qualidade de vida de todos os
pacientes com a doença, com 40% desses indivíduos sendo gravemente afetados LC.
Desse modo, puderam concluir que a LC teve um impacto negativo de moderado à
alto na qualidade de vida dos pacientes (9).
A cada ano, estima-se que 0,7 – 1,2 milhões de crianças e adultos desenvolvem
a forma sintomática da leishmaniose (cutânea 0,7-1,2 milhões; visceral 0,2-0,4
milhões), e ainda, que 350 milhões de pessoas estejam expostas ao risco. A incidência
da doença é ainda mais relevante quando as infecções assintomáticas são incluídas
(1,2,10).
Nas regiões onde a LTA ocorre de forma endêmica, as condições
socioeconômicas desfavoráveis da população facilitam uma maior exposição do
indivíduo ao vetor, favorecendo o desenvolvimento da doença. Isso explica, por
exemplo, a maior incidência da doença em homens brasileiros, trabalhadores rurais
ou exploradores de mata (4). Assim, Teles et al., 2013 observaram que 80% dos
pacientes estavam envolvidos com atividades que exigiam a permanência na floresta
(caça, pesca e exploração de madeira), evidenciando a natureza da transmissão
zoonótica da doença (11).
As leishmanioses são consideradas endêmicas em noventa e oito países. Os
dez países com a contagem mais alta de casos estimados são: Afeganistão, Algéria,
Colombia, Costa Rica, Norte do Sudão, Brasil, Irã, Peru, Etiópia e Síria, que juntos
correspondem a 70 – 75% da incidência global estimada de casos de LC, conforme
esquematizado na figura 3 (2,3,8,10).
A LTA é de ocorrência antiga no Brasil, e apresenta-se como uma doença com
diversidade de agentes, de reservatórios e de vetores que apresenta diferentes
padrões de transmissão e um conhecimento ainda limitado sobre alguns aspectos, o
que a torna de difícil controle (1,5).
A partir do início da década de 1980, foram notificados no Brasil casos de LTA
em 19 estados e, em 2003, todos os estados registraram autoctonia. A população do
Amazonas destaca-se como uma das mais acometidas por LTA no país (12).
4
Figura 3. Distribuição da Leishmaniose cutânea no mundo.
Fonte: http://www.who.int/en/
A partir da década de 90, o Ministério da Saúde notificou uma média anual de
32 mil novos casos de LTA. Analisando-se os dados pertinentes em 2003, verificouse a seguinte situação: a Região Norte notificou aproximadamente 45% dos casos,
predominando os estados do Pará, Amazonas e Rondônia; a Região Nordeste, 26%
dos casos, principalmente no Maranhão, Bahia e Ceara; a Região Centro-Oeste, 15%
dos casos, com maior frequência em Mato Grosso; a Região Sudeste, 11% dos casos,
predominantemente em Minas Gerais; e a Região Sul, 3,0%, destacando-se o Paraná
(6).
Em 2011, de acordo com o Ministério da Saúde, foram registrados, no Brasil,
15.731 casos de LTA. A região Norte apresentou novamente o maior número de
notificações, 7.362 casos, seguida das regiões Nordeste (5.234), Centro-Oeste
(1.732), Sudeste (986) e Sul (324). Dentre os 7.362 casos registrados na região Norte,
2.971 casos foram notificados no Estado do Pará, 1.752 no Amazonas, 781 no Acre,
704 em Rondônia, 504 no Amapá, 368 em Roraima e 282 no Tocantins (13).
A real prevalência das diferentes leishmanioses no continente americano é difícil
de ser estabelecida em vista das subnotificações, diagnósticos incorretos, infecções
inaparentes, variações de resposta do hospedeiro e multiplicidade de agentes
etiológicos envolvidos (6).
5
No último ano, a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMTHVD), centro de referência para o tratamento de LTA no estado do Amazonas,
registrou 679 casos da doença, sendo 667 dos casos relacionados com a forma
cutânea e 12 casos com a forma mucosa da doença. Registrando nos últimos 5 anos
aproximadamente 5 mil casos de LTA (14).
Quanto ao diagnóstico laboratorial para as leishmanioses, existem muitos
métodos de diagnóstico, incluindo parasitológico, imunológico, molecular e os que
utilizam animais de laboratório, todos usados na detecção do parasita (15).
O exame parasitológico é baseado na demonstração do parasito por meio de
exames diretos e indiretos (1,15). Quanto ao arsenal imunológico, pode-se destacar o
teste intradérmico (intradermorreação de Montenegro ou da leishmanina) e testes
sorológicos (1,16). Tem-se ainda o diagnóstico molecular que é atualmente utilizado
para a detecção de micro-organismos patogênicos e baseia-se no emprego de sondas
de DNA e/ou RNA espécie especificas e na reação em cadeia de uma polimerase de
DNA para aumento de sequências nucleotídicas especificas presentes em amostras
clínicas (15–18). Existem muitos estudos na literatura usando a PCR como técnica
alternativa com resultados promissores para melhorar o diagnóstico da leishmaniose
(19–22).
Em se tratando de arsenal terapêutico disponível para tratamento da
leishmaniose, este é bastante precário, existindo, até o presente momento, dois
grupos de medicamentos em uso: os antimoniais e os não-antimoniais. O tratamento
básico da doença consiste na administração de estibogluconato sódico (Pentostan®),
antimoniato de N-metil-glucamina (comercializado no Brasil como Glucantime®),
ambos drogas de primeira geração e pentamidina ou anfotericina B, ambos de
segunda geração (23,24).
Em um estudo clínico randomizado, Neves et al., 2011 constataram que a
pentamidina e o antimonial apresentam eficácias similares e não satisfatórias para o
tratamento da LTA ocasionada por L.(V.) guyanensis. Os baixos resultados de eficácia
do antimonial e pentamidina, bem como as dificuldades operacionais relacionadas à
anfotericina B, evidenciam a necessidade urgente de novas opções terapêuticas para
o tratamento da LTA (25).
6
A miltefosina foi a primeira droga de uso oral utilizada no tratamento da
leishmaniose visceral (LV). Existem poucos efeitos adversos, tais como vômito e
diarréia. Em relação à LTA, estudos utilizando a miltefosina no tratamento da forma
cutânea da doença resultaram em boa eficácia contra L (V.) panamensis, mas para L
(V.) braziliensis, não houve eficiência adequada (24).
No cenário atual de combate à leishmaniose, nota-se a existência de
importantes ferramentas que auxiliam na detecção e combate ao parasita. Podendose citar o diagnóstico, com a visualização de parasitas em tecidos e/ou sorologia
através da técnica de exame direto; cultura e detecção do DNA do parasita; além do
arsenal terapêutico, com destaque para o tratamento convencional com antimonial
pentavalente; contudo, a resistência da leishmaniose em alguns países tem gerado
novas abordagens de tratamento, com inserção de novas drogas, como anfotericina
B, paromicina injetável e miltefosina oral (1,2,16).
Apesar de consideráveis avanços no diagnóstico, tratamento e pesquisa
científica básica, a leishmaniose ainda é considerada uma doença negligenciada e
atrelada à pobreza. Obstáculos correntes encontrados na prevenção e manejo
adequado incluem controle inadequado do vetor, inexistência de vacinas e dificuldade
em desenvolver drogas mais acessíveis (2).
1.2 Leishmaniose Tegumentar Americana
Por leishmaniose tegumentar entende-se um conjunto de enfermidades
causadas por várias espécies de protozoários do gênero Leishmania, que acometem
a pele e/ou mucosas do homem, e de diferentes espécies de animais silvestres e
domésticos, com casos registrados mundialmente, destacando-se o Continente
Americano, onde há registro de casos desde o extremo sul dos Estados Unidos até o
norte da Argentina, com exceção do Chile e Uruguai. Na Amazônia Brasileira, a LTA
é considerada uma infecção zoonótica primária de mamíferos silvestres e
secundariamente de animais domésticos, em que o parasita é transmitido entre os
animais e o homem pela picada das fêmeas de diversas espécies de flebótomos
(Diptera, Psychodidae, Phlebotominae) do gênero Lutzomyia. A infecção caracteriza-
7
se pelo parasitismo das células do sistema fagocitário mononuclear (SFM) da derme
e das mucosas do hospedeiro vertebrado (monócitos, histiócitos e macrófagos)
(1,6,26,27).
No Brasil, há várias formas clínico-epidemiológicas relacionadas aos diferentes
subgêneros e espécies do parasita (28):
• Leishmania (Viannia) guyanensis: limitada ao norte da Bacia Amazônica
(Amapá, Roraima, Amazonas e Pará) e Guianas. É o agente predominante causador
da doença no estado do Amazonas, produzindo lesões menores e mais numerosas,
frequentemente localizadas acima da cintura. O acometimento mucoso é pouco
frequente.
• Leishmania (Viannia) braziliensis: ampla distribuição (sul do Pará ao Nordeste),
centro-sul do país e Amazônia oriental. A doença caracteriza-se por úlcera cutânea
(única ou múltipla) que pode evoluir para o acometimento mucoso (oro ou nasofaringe)
por disseminação hematogênica;
• Leishmania (Leishmania) amazonensis: distribuída pelas florestas da
Amazônia, Nordeste (Bahia), Sudeste (Minas Gerais e São Paulo) e Centro-Oeste
(Goiás). A doença humana é relativamente rara, podendo se manifestar como lesão
ulcerada (geralmente única) ou quadro de leishmaniose cutâneo-difusa.
Dependendo da espécie de Leishmania infectante e da resposta imune mediada
por células da pessoa infectada, o indivíduo pode desenvolver um espectro de formas
clínicas da doença, convencionalmente conhecidas como leishmaniose cutânea
localizada (LCL) e leishmaniose mucocutânea (LMC), representando o polo
responsivo, e leishmaniose cutâneo-difusa (LCD) que representa o polo não
responsivo (26,29). As principais características clínicas da leishmaniose estão
listadas na tabela 1.
8
Tabela 1. Características clínicas da leishmaniose humana.
CARACTERÍSTICAS
MUCOCUTÂNEA
CUTÂNEA
VISCERAL
Lesão única (ocasionalmente
Lesões
Destruição ulcerativa do
um pequeno número) ulcerada
septo nasal
com bordas elevadas e centro
Órgãos internos
necrótico
Histopatologia e número de
parasitas
Nível de anticorpos antiLeishmania
CMI anti-Leishmania (testes in
vivo e in vitro)
Acentuada proliferação de
Reação granulomatosa
Resposta inflamatória crônica
com pouquíssimos
com moderado número de
parasitas
parasitas
Baixo
Baixo
Alto
Fortemente positivo
Positivo
Negativo
macrófagos com intenso
parasitismo nos órgãos
hematopoiéticos
Fonte: Adaptado de Oliveira et al, 2004.
1.3 Imunopatogênese da leishmaniose
A patogenia da LTA é fortemente influenciada pelo perfil imunogenético do
homem e ainda, pela virulência da espécie de Leishmania infectante. Como resultado
da interação entre as diferentes espécies de Leishmania e os mecanismos da
resposta imune do homem ocorre um espectro de manifestações clínicas,
histopatológicas e imunopatológicas (30).
Infecções por Leishmania podem permanecer completamente assintomáticas.
Esta observação chama a atenção para fatores do hospedeiro na susceptibilidade e
expressão da doença - idade, estado nutricional e a eficácia das respostas imunes
inata e adquirida dependentes de células T. Este último pode, por sua vez, ser afetado
por polimorfismos imunogenéticos (2).
Ao que parece, em humanos, o resultado da doença é influenciado pelo
balanço entre as respostas Th1, Th2 e também Th17, além da influência de fatores
genéticos do hospedeiro, tamanho do inóculo e a cepa do parasita. (31,32).
A resposta imune tem um papel importante na patogênese da leishmaniose
tegumentar. Na leishmaniose cutânea e na leishmaniose mucosa, uma intensa
resposta Th1, com alta produção de IFN-γ e TNF-α é observada, juntamente com IL17, produzida pelas células Th17, responsável pela amplificação da resposta
9
inflamatória. Esse tipo de resposta inflamatória, apesar de estar associada ao controle
da multiplicação e disseminação do parasita, se não modulada, pode causar dano
tecidual. Por outro lado, a diminuição ou ausência das respostas Th1/Th17 e presença
de citocinas regulatórias como IL-10, observada em indivíduos com leishmaniose
disseminada e leishmaniose cutânea difusa, favorece a multiplicação e disseminação
do parasita (32,33).
A infecção humana, pelas espécies de Leishmania que causam a LTA, tem seu
início logo após a inoculação das formas promastigotas do parasita na pele, o que
acontece durante a hematofagia pelas espécies de flebotomíneos vetores. A partir
desse momento, inicia-se um processo de escape do parasita frente às defesas do
organismo, o qual, quando vencido pelo parasita, resultará na sua fagocitose pelas
células do sistema fagocítico mononuclear (SFM), principalmente o macrófago (30).
As células T “helper” CD4+ tem uma função central no sistema imune,
promovendo respostas adaptativas adequadas a patógenos específicos. De acordo
com as citocinas que produzem após estimulação antigênica, estas células podem ser
separadas em subpopulações, das quais é de interesse mencionar: T “helper” 1 (Th1),
T “helper” 2 (Th2) e T ”helper” 17(Th17).
As células Th1 produzem IFN-γ e IL-12 e estão associadas à proteção contra
os patógenos intracelulares, como as leishmanias; células Th17 produzem IL-17A e
IL-17F, em adição a outras citocinas tais como IL-21 e IL-22. IL-17 realiza uma
importante função no recrutamento de neutrófilos, e uma vez que estas células tem
um papel importante na infecção por Leishmania, pode-se dizer que células Th17 tem
papel significativo nessa doença. Células Th2 produzem interleucina IL-4, IL-5 e IL-13
que estão envolvidas nos processos alérgicos e na proteção contra agentes
extracelulares. No caso das infecções por micro-organismos intracelulares, a ativação
das células Th2 leva ao agravamento (1,32,34).
Assim, a resistência do hospedeiro está associada à ativação seletiva e
diferenciação de células efetoras T “helper” CD4+ (Th1), as quais secretam um padrão
de citocinas específicas, tendo como principais indutores dessa resposta IFN-γ e IL12, conhecidos como citocinas guia. IL-4 é responsável pela indução da resposta de
10
células T CD4+ (Th2), além das citocinas IL-23, IL-1, IL-6 e TGF-β para células Th17
(7,34).
Considerando-se que a Leishmania é um parasita intracelular obrigatório, a
ativação do sistema complemento pode beneficiá-lo, pois ao serem gerados
fragmentos da cascata (C3 e C3bi) que se ligam aos receptores dos macrófagos (CR1
e CR3) e também se depositam na parede do parasito, tem-se facilitada sua
fagocitose. Além disso, sua entrada, utilizando esses receptores, promove baixo
metabolismo oxidativo no macrófago, o que favorece a continuidade do seu ciclo
biológico (6,35).
A fagocitose dos organismos patogênicos induz os macrófagos a produzir
citocinas que controlam vários aspectos da defesa do hospedeiro, incluindo fatores
quimiotáticos, tais como as quimiocinas, fatores de ativação tais como TNF-α, IL-12,
e IL-1, estimulantes de fase aguda, tais como IL-6, fatores moduladores, tais como a
IL-10, e citocinas estimuladoras da hematopoiese, tais como M-CSF e GM-CSF (35).
A modulação da resposta imune celular é definida com base no tipo de
interação entre a espécie de Leishmania e o perfil imunogenético do hospedeiro,
resultando no desenvolvimento de diferentes formas clínicas de leishmaniose. Na
leishmaniose cutânea e leishmaniose mucosa, existe uma forte resposta Th1, que
controla a multiplicação do parasita, porém há lesão tecidual. Enquanto que, na
leishmaniose disseminada e na leishmaniose cutânea difusa, a diminuição ou
ausência da resposta Th1 favorece a multiplicação e disseminação da Leishmania
(33).
Células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de pacientes com
leishmaniose cutânea secretam altos níveis de IFN-γ e TNF-α e baixos níveis de IL-5
e IL-10 quando estimuladas com antígeno solúvel de Leishmania (SLA), sendo a
célula T CD4+ o tipo celular que contribui com a maior parte da produção de IFN-γ
tanto no sangue periférico quanto nos tecidos, embora haja participação de células T
CD8+ na produção dessa citocina (33).
Nas formas cutaneomucosa e mucosa, associadas à forte resposta de
hipersensibilidade e proliferação de linfócitos, o perfil de linfócitos T CD8 e CD4 no
infiltrado das lesões tem mostrado predomínio de CD4. Desse modo, parece
11
significativo que na forma LCM/LM tenha sido identificado um perfil de células CD4
maior que nas outras formas da LTA, sugerindo a possibilidade de níveis significativos
de IFN-γ e TNF-α nessas formas, já que estas citocinas estão fortemente associadas
à resposta de hipersensibilidade (30).
Em um estudo realizado por Gonzalez-Lombana et al., 2013 foram observados
que níveis elevados de IFN-γ promoveram uma infiltração de monócitos aumentada,
enquanto IL-17 contribuiu para o aumento de neutrófilos. Contudo, foi constatado que
IFN-γ não contribuiu para o agravamento da patologia, ao invés, regulou a resposta
de IL-17. Assim, o bloqueio de IFN- γ levou a um aumento significativo de IL-17,
neutrófilos e agravamento da doença. Dessa maneira, nota-se que a resposta imune
inflamatória é critica no controle dos parasitas da leishmaniose, mas também, se não
balanceada, promove a exacerbação da doença (36).
Pacientes com leishmaniose cutânea difusa apresentam negatividade do teste
de Montenegro, baixa ou ausência de produção de IFN-γ para antígeno de
Leishmania, indicando um forte bloqueio da resposta imune celular, impossibilitando
aos pacientes o controle da infecção. Células mononucleares de pacientes com
leishmaniose cutânea difusa expressam grandes quantidades de IL-10 e IL- 4 e baixas
quantidades de IFN-γ durante a fase ativa da doença (30,33).
1.4 O Modelo experimental murino para leishmaniose
Modelos experimentais de infecção por Leishmania são modelos bem
estudados e apropriados para o entendimento da doença (37).
Dentre os modelos existentes, o camundongo oferece vantagens particulares
para estudos de biologia e doença humana (38):
i)
O
camundongo,
em
seu
desenvolvimento,
plano
corpóreo,
fisiologia,
comportamento e doenças, pode apresentar aspectos que são comuns aos seres
humanos; ii) A quase totalidade (99%) dos genes do camundongo tem homólogos em
seres humanos; iii) O genoma do camundongo suporta mutagênese direcionada e
específica, por recombinação homóloga em células estaminais embrionárias,
permitindo que os genes sejam alterados de forma eficiente.
12
A maior parte do que se conhece sobre a resposta de um indivíduo à infecção
por Leishmania e seus mecanismos imunológicos provêm de estudos em
camundongos. Algumas linhagens puras de camundongos são susceptíveis à
infecção por Leishmania, enquanto outras são extremamente resistentes (3,29).
Infecção subcutânea por L. major é um dos modelos mais bem estudados.
Acerca desse modelo, características distintas do espectro clínico da leishmaniose
humana são reproduzidas em linhagens puras de camundongos (29).
Camundongos da linhagem BALB/c são altamente susceptíveis, pois quando
infectados, estes desenvolvem grandes úlceras de pele, que expandem e metastizam,
levando à morte. Em contraste, camundongos das linhagens C3H/He, CBA, C57BL/6
e 129Sv/Ev são resistentes à infecção por L. major, desenvolvendo pequenas lesões
que curam em 10-12 semanas, e também são resistentes a reinfecção (29).
Um estudo realizado por Hezarjaribi et al., 2013 demostrou através do modelo
experimental murino que IL-22 leva a um aumento na produção de IFN-γ e diminuição
na produção de IL-4 e que portanto tem um papel importante na estimulação da
resposta do tipo Th1, resultando na cura das lesões (39).
A relevância do balanço Th1/Th2 na regulação do desfecho da doença tem sido
minuciosamente investigada (29).
A análise da resposta imune em camundongos BALB/c tem mostrado que estes
respondem de maneira diferente, com uma variação nas respostas Th1 e Th2,
dependendo da espécie pelo qual este é infectado, L. major ou L. braziliensis (40).
A resistência está ligada a resposta do tipo Th1, com produção de IL-12, IFN-γ
e inibição da produção de citocinas Th2, enquanto que a susceptibilidade está
relacionada com a predominância da resposta Th2, determinada pela presença de IL4. Citocinas Th2 levam ao desenvolvimento de lesões graves em camundongos
infectados com L. major, provavelmente inativando células infectadas (29).
Dependendo da espécie pelo qual o camundongo é infectado, a análise da
resposta imune mostra que este responde de maneira diferente, com uma variação
nas respostas Th1, Th2 e Th17 (40). Em camundongos infectados por L. (L.)
amazonensis, a definição da progressão e desfecho da infecção é feita com base no
13
conhecimento da genética dos camundongos, além de fatores adicionais como
tamanho do inóculo, sítio de inoculação, cepa de Leishmania usada e sua fonte de
isolamento, que também podem influenciar nessas características (37).
Em estudo realizado por Courret et al., 2003, um modelo para simular, em longo
prazo, o parasitismo natural foi proposto, onde baixas doses (10-1000 parasitas) de
promastigotas metacíclicas de L. (L.) amazonensis foram inoculadas na orelha de
camundongos BALB/c. Os resultados mostraram que as manifestações cutâneas da
lesão dependem do tamanho do inóculo, onde muito raramente, animais infectados
com apenas 10 parasitas desenvolveram lesão; a maioria dos animais infectados com
100 parasitas e todos com 1000 parasitas desenvolveram lesão progressiva (41).
1.5 Fatores genéticos na leishmaniose
Em genética, doenças complexas são aquelas que não apresentam padrão de
herança mendeliana clássica, em que há perfeita correlação entre genótipo e fenótipo.
A ocorrência dessas doenças é controlada por componente genético, resultado da
ação integrada de um número variado de genes, associado a fatores ambientais,
socioeconômicos, culturais, além de fatores inerentes ao hospedeiro, como estado
nutricional, idade, gravidez, infecção por HIV, etc. (42,43)
O fato de alguns indivíduos não apresentarem nenhum sinal ou sintoma de
infecção, enquanto outros desenvolvem formas crônicas ainda não foi claramente
elucidado. Acredita-se que a genética do hospedeiro, fatores ambientais ou do
parasito podem estar envolvidos na susceptibilidade à doença (44).
A resposta imune e o conhecimento da genética do hospedeiro podem ser
importantes no entendimento da patogênese da doença. Uma maneira de explorar o
papel de moléculas pró e anti-inflamatórias em humanos é determinar se
polimorfismos genéticos afetam a expressão ou função de proteínas, e se estas estão
associadas com o desfecho da doença (45).
Por exemplo, um estudo realizado em Danghã, uma área endêmica para
leishmaniose cutânea no norte do Irã demonstrou que mutações no gene TLR4
14
humano estão associadas com um risco aumentado de desenvolver leishmaniose
cutânea, podendo levar a um aumento da susceptibilidade e gravidade na infecção
por L. major (44).
Variantes alélicas de NRAMP1 estão fortemente associadas com leishmaniose
visceral, indicando que este é um importante gene de suscetibilidade em humanos
(46). Estudos sugerem que as variações genéticas deste gene afetam a
suscetibilidade na leishmaniose visceral (45–49).
A análise de polimorfismos de TNFα em uma população da Venezuela mostrou
que a susceptibilidade para a forma cutâneo-mucosa da doença pode ser diretamente
associada com polimorfismos do gene TNFα, evidenciando um alto risco relativo de
7,5 (P<0,001). (51)
Alguns estudos demonstraram associação do polimorfismo dos genes IL-6 e
CCL2 com o aumento da suscetibilidade para a forma mucosa da leishmaniose
(45,52).
Variantes do gene DLL1, localizado no cromossomo 6q27, apresentaram-se
associadas com a susceptibilidade para LV (53), bem como os polimorfismos do gene
TGFB1, uma citocina com uma função biologicamente relevante na história natural da
doença, que pode contribuir para a susceptibilidade global na infecção por leishmania
per se e para a gravidade da doença clínica na leishmaniose visceral (54). Ainda,
polimorfismo no gene IL-4 foi associado na susceptibilidade para leishmaniose
visceral, enquanto que
IFNGR1 está especificamente relacionado com a
susceptibilidade à leishmaniose dermal pós-kalazar (46,55).
1.5.1 IL-1b
Entre as citocinas pro-inflamatórias do tipo Th1, interleucina 1 (IL-1) tem papel
chave na resposta inflamatória com efeitos pleiotrópicos em muitas células e vias de
sinalização, tendo um papel importante no desenvolvimento da patologia. IL-1
consiste de um grupo de três moléculas nomeadas IL-1 alfa, IL-1 beta e IL-1 receptor
antagonista (56).
15
IL-1b é classificado como um dos mediadores solúveis mais importantes da
inflamação, sendo produzido principalmente por monócitos, macrófagos e células
dendríticas e medeia uma ampla gama de reações envolvidas na resposta de fase
aguda (57).
Polimorfismos genéticos em IL-1b estão associados com a susceptibilidade a
doenças autoimunes graves, inflamatórias e infecciosas tais como HIV, TB, gastrite
crônica associada com Helicobacter pylori, esclerose múltipla, lupus eritematoso
sistêmico, malária e leishmaniose (58–63).
Recentemente, um estudo realizado no México sugeriu que a IL-1b
possivelmente tem um papel chave na determinação da gravidade da doença em
pacientes com leishmaniose cutânea difusa (63). IL-1b é uma citocina com atividade
pirogênica que é normalmente ativada em resposta a uma infecção ou injúria (64).
Polimorfismo em IL-1b representa uma variável que influencia o risco de desenvolver
a doença, em pacientes infectados com o parasita (63).
Os inflamassomas tem importante papel na expressão de IL-1b, pois estes são
responsáveis por promover a ativação dessa interleucina através de diversos
estímulos durante as infecções por micro-organismos (65).
Resultados de Lima-Junior et al., 2013 sugerem que independentemente do
“background” genético do camundongo ou das formas parasitárias usadas na infecção
(parasitas mortos, atenuados ou vivos), o inflamassoma é de grande importância no
controle da infecção parasitária em LC (66).
NALP3, que pertence a uma larga família de receptores NOD-like
intracelulares, associa-se com outras proteínas por oligomerização para formar
NALP3-inflamassoma, que é responsável por ativar caspase-1, enzima responsável
por clivar precursor IL1-b inativo em IL1-b ativo (65–67).
Lima-Junior et al., 2013 observaram níveis significativos na produção de IL-1b
por macrófagos derivados de medula óssea obtidos de camundongos C57BL/6 em
resposta a infecção por L. amazonensis, mas o mesmo não foi observado em
camundongos que possuíam a deleção do gene produtor de caspase-1. Assim,
16
puderam afirmar que a secreção de IL-1b é dependente da ativação de caspase-1
(66).
1.5.2 FLI-1
Outro importante gene envolvido no controle da susceptibilidade da
leishmaniose e que apresenta participação no processo de cura das lesões é o FLI1.
Pertencente à família ETs de fatores de transcrição, é preferencialmente expresso em
linhagens de células hematopoiéticas e células endoteliais vasculares (68).
Resultados apresentados por Asano et al., 2009 estabelecem o gene FLI1
como um regulador chave na homeostase da expressão de colágeno na pele, e,
portanto, pode atuar na via de cicatrização das lesões. Além disso, o estudo
demonstra que o domínio C-terminal do FLI-1 tem um papel essencial no controle da
expressão de colágeno in vivo (69). Ainda, Castellucci et al., 2011 demonstraram
associação entre polimorfismos em FLI-1 e susceptibilidade para leishmaniose
cutânea causada por L. braziliensis (70).
1.5.3 MCP-1
Uma maneira de explorar o papel das quimiocinas em humanos é determinar
se polimorfismos que afetam expressão/função estão associados com o desfecho da
doença. Assim, Ramasawmy et al., 2010 demonstraram, através de estudo casocontrole, uma associação entre SNP (polimorfismo de nucleotídeo único) em MCP-1
e susceptibilidade para leishmaniose mucosa por L. braziliensis. Os dados
apresentados pelos autores fornecem evidências de base populacional e familiar para
uma associação entre o alelo G do SNP na região promotora CCL2 -2518 pb e
susceptibilidade para LM. Esses dados foram correlacionados com elevados níveis de
MCP-1 no plasma de indivíduos homozigotos para o alelo G, e com alta liberação de
MCP-1 por macrófagos estimulados e não estimulados (45).
Ainda, dados gerados por De Moura et al., 2005 sugerem que a capacidade
leishmanicida de MCP-1 contribui para a cura das lesões causadas por L. braziliensis
17
(71). Também, Rovin et al., 1999 afirmam que variações genéticas ocorrem em
regiões reguladoras dos genes de quimiocina, e que tais polimorfismos afetam a
transcrição desses genes em resposta a estímulos inflamatórios. Esses polimorfismos
em MCP-1 podem, em parte, determinar a gravidade da inflamação nos órgãos em
doenças onde a infiltração leucocitária nos tecidos é dependente de MCP-1 (72).
Estudo realizado em uma população recrutada no Instituto do Coração no
Hospital das Clínicas em São Paulo demonstrou que a variante MCP-1 associada com
um baixo nível de transcrição de MCP-1 se comporta como um modificador genético
de desfecho clínico para infecção por T. cruzi, e os indivíduos com o genótipo MCP-1
-2518 AA tem um risco quatro vezes maior de desenvolver cardiomiopatia chagásica
crônica (CCC) do que aqueles sem esse genótipo, sugerindo que polimorfismos em
MCP-1 podem desempenhar papel importante na susceptibilidade a CCC,
dependendo do genótipo apresentado por cada indivíduo (73).
Diante do exposto, nota-se que a leishmaniose é uma doença infecciosa cuja
susceptibilidade é em parte controlada geneticamente. A participação de variantes dos
genes IL-1b, FLI-1 e MCP-1 no controle da suscetibilidade de populações humanas a
doenças infecciosas causadas por patógenos intracelulares de interesse, tais como a
leishmaniose, ainda precisa ser investigada.
Dessa forma, entende-se que esforços no sentido de se elucidar os
mecanismos moleculares de controle e interação patógeno/hospedeiro e os
mecanismos de desenvolvimento da doença tendem a contribuir de forma crítica para
um maior entendimento de sua patogênese, levando ao desenvolvimento de melhores
estratégias de diagnóstico, tratamento e prevenção.
18
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Verificar o papel dos polimorfismos genéticos em IL-1b, FLI-1 e MCP-1
associados com leishmaniose cutânea em uma população caso-controle do estado do
Amazonas, Brasil.
2.2. Objetivos Específicos
- Determinar a frequência dos alelos e genótipos dos SNPs dos genes IL-1b, FLI1 e MCP-1 entre os pacientes com leishmaniose cutânea e indivíduos sem a doença;
- Comparar as frequências encontradas dos SNPs e sua possível associação no
controle da susceptibilidade ou resistência à LTA.
19
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Delineamento do estudo
Trata-se de um estudo realizado em uma população caso-controle do estado
do Amazonas, recrutada no período compreendido entre novembro de 2008 e
dezembro de 2013.
3.2. Área de estudo
Consiste
de
regiões
endêmicas
para
leishmaniose
localizadas
nas
proximidades do município de Manaus, especificamente das rodovias AM-010, que
liga Manaus ao município de ltacoatiara; e BR-174, que liga Manaus a Boa Vista,
capital do estado de Roraima. Estas regiões endêmicas são áreas de floresta tropical
que ao longo dos anos sofreram desmatamento, dando lugar a assentamentos
populacionais, cuja principal fonte de renda é a atividade agropecuária. Sendo assim,
as principais atividades ocupacionais destes indivíduos e seu tipo de moradia, próximo
às áreas de mata, tornaram essa população altamente exposta à infecção por
Leishmania sp.
3.3. População estudada
Foram recrutados pacientes de ambos os sexos com diagnóstico confirmado
para leishmaniose cutânea provenientes da demanda espontânea do ambulatório de
Dermatologia da FMT-HVD para compor o grupo caso; e indivíduos sem sinal ou
histórico de leishmaniose, para compor o grupo controle, todos provenientes de áreas
endêmicas para leishmaniose no estado do Amazonas.
3.3.1 Definição de Caso
20
A leishmaniose cutânea é definida como a presença de uma ou mais lesões
ulceradas na pele, sem evidência clínica de comprometimento mucoso, além da
detecção do parasito através do exame direto do escarificado da lesão.
3.3.2 Recrutamento da população
No momento da inclusão dos indivíduos voluntários, foram explicados os
detalhes e potenciais consequências do estudo e os procedimentos aos quais estes
seriam submetidos em caso de concordância em participar. Todos os candidatos
foram solicitados a ler o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (Anexo
B), devidamente aprovado pelo(s) Comitê(s) de Ética (CEP) pertinente(s). Aos que
concordaram em participar, foi assinado o TCLE correspondente ao seu caso
específico, e aplicado questionário (Anexo C). Ao voluntário menor de idade, um
formulário próprio foi apresentado e assinado por um dos pais ou guardião legal. Para
o voluntário não alfabetizado, o TCLE foi lido e explicado e, em caso de aceite, sua
impressão digital foi coletada.
3.3.3 Grupo de indivíduos com LC (caso)
A população de estudo desse grupo foi recrutada exclusivamente no
ambulatório de dermatologia da FMT-HVD por demanda espontânea. Foram
admitidos apenas pacientes com leishmaniose cutânea que tiveram seu diagnóstico
confirmado através do exame direto do escarificado da lesão realizado por técnicos
microscopistas capacitados para este fim.
Após o diagnóstico positivo de LTA, os pacientes que concordaram em
participar do estudo, mediante assinatura do TCLE e aplicação de questionário
(Anexos B e C, respectivamente) foram submetidos a uma coleta de 5 mL de sangue
total.
3.3.4 Grupo de indivíduos sem a doença (controle)
21
Para compor este grupo, foram recrutados indivíduos sem história prévia ou
manifestação da LTA, levando-se em consideração ausência de citratrizes, não
exposição prévia ao tratamento e ausência de parentesco. Todos os indivíduos deste
grupo foram provenientes de áreas endêmicas adjacentes às rodovias AM-010 e BR174, de onde procedeu a maioria dos indivíduos do grupo caso.
A seleção dessas localidades foi realizada tendo como base a escolha de
regiões com casos confirmados de leishmaniose, podendo-se destacar as principais:
BR-174 - Ramal do Pau-Rosa e Ramal da Cooperativa e suas vicinais (Km 21); AM010 - Ramal Água Branca I (Km 32) e Ramal Água Branca II (Km 35), Ramal do Leão
(Km 37).
O recrutamento foi realizado por meio de visitas da equipe de investigadores a
essas localidades no mesmo período em que foram recrutados os indivíduos doentes,
percorrendo-se toda a extensão do ramal, com a finalidade de alcançar todas as
moradias.
3.4. Coleta do material biológico
Todos os indivíduos que concordaram em participar do estudo, foram
submetidos a uma punção venosa para coleta de 5 mL de sangue periférico. As
amostras de sangue foram coletadas em tubos tipo Vacutainer® contendo EDTA
como anticoagulante, em condições ideais de assepsia.
O sangue coletado foi centrifugado a 3.600 rpm durante 10 minutos para
obtenção do creme leucocitário (“buffy-coat”) que foi posteriormente aspirado e
transferido para um microtubo de 1,5 mL para extração do DNA genômico.
O processamento das amostras deu-se no Laboratório de Pesquisa em
Doenças Endêmicas (LPDE) da FMT-HVD.
3.5. Extração de DNA
22
O DNA genômico foi extraído a partir do creme leucocitário obtido conforme
descrito anteriormente. As extrações realizadas até o ano de 2011 foram feitas com o
kit comercial de extração de DNA (WIZARD®, Promega Corporation, EUA), de acordo
com as instruções sugeridas pelo fabricante. As amostras obtidas a partir do ano de
2012 foram extraídas pela técnica de “salting-out”, conforme protocolo de Sambrook
et al., 1989 com algumas modificações (Anexo D) (74).
Após a extração de DNA, sua concentração e pureza foram determinadas em
espectrofotômetro, através da razão das absorbâncias em 260nm e 280nm para
leitura de DNA e proteína, respectivamente. Dessa forma, esta razão pode fornecer
um parâmetro indicativo da qualidade do DNA, sendo a amostra considerada ideal
quando a razão das absorbâncias apresenta-se na faixa de 1,8 a 2,2. Excesso de
proteínas
valores
no
inferiores
material
extraído
a
e
1,8,
valores
é
indicado
superiores
por
a
2,2
indicam excesso de solventes orgânicos.
Sendo assim, as amotras extraídas que foram consideradas adequadas
(através dos parâmetros de concentração e pureza) foram armazenadas em freezer à
-80°C, localizados exclusivamente em laboratórios da FMT-HVD.
3.6. Genotipagem
Os marcadores do tipo Polimorfismo de Nucleotídeo Único (do inglês, SNP;
Single Nucleotide Polymorphism) dos genes MCP-1 e IL-1b foram selecionados
utilizando-se material disponível na literatura e a partir de bancos de dados de domínio
público para obtenção das sequências.
Para os SNPs de FLI-1, os iniciadores (rs7930515, rs619521, rs145675082,
rs531894) foram desenhados a partir de sequências disponíveis em base de dados
do NCBI.
A genotipagem foi realizada pela técnica de PCR-RFLP (Reação em Cadeia da
Polimerase - Análise clássica de comprimento do fragmento de restrição) para
descriminação alélica.
23
Tabela 2. Informações gerais dos marcadores polimórficos genotipados para MCP-1,
IL-1b e FLI-1.
CROMOSSOMO
GENE / dbSNP
17
2
2
11
11
11
11
MCP-1 / rs1024611
IL-1b / rs1143634
IL-1b / rs16944
FLI-1 / rs531894
FLI-1 / rs145675082
FLI-1 / rs619521
FLI-1 / rs7930515
POSIÇÃO
FÍSICA
34252769
112832813
112837290
128758861
128750108
128708262
128694899
VARIAÇÃO
[G/A]
[C/T]
[T/C]
[A/G]
[C/T]
[A/G]
[A/C]
3.6.1. PCR
Foi realizada a amplificação das sequências gênicas que incorporam as regiões
de mutação utilizando-se a técnica de PCR Convencional, de modo que cada PCR foi
realizada num volume final de 25 µL contendo 50 ng de DNA genômico, iniciadores
senso e antisenso, dNTP, taq polimerase e MgCl2 de acordo com as tabelas 3 a 7,
que descrevem especificamente as condições de concentração e temperatura para
cada marcador utilizado.
Tabela 3. Condições gerais de PCR usadas para o marcador MCP1_rs1024611
(MCP-1 -2518).
Reagentes
Concentração
Ciclo
Tampão de PCR
1x
95ºC – 5’
MgCl2
1,6 mM
15x
dNTP
40 µM
95ºC – 20’’
65ºC – 20’’
72ºC – 45’’
Iniciadores
0,2 µM
25x
Taq Polimerase
2,0 U
95ºC – 20’’
55ºC – 20’’
72ºC – 45’’
Volume final
25 µL
72ºC – 7’
4ºC – ∞
24
Tabela 4. Condições gerais de PCR usadas para os marcadores IL1b_rs16944 (IL1b -511) e IL1b_rs1143634 (IL-1b 3953).
Reagentes
Concentração
Tampão de PCR
1x
MgCl2
2,0 mM
dNTP
40 µM
Iniciadores
0,2 µM
Taq Polimerase
1,0 U
Volume final
25 µL
Ciclo
94ºC – 5’
94ºC – 30’’
53ºC – 30’’
72ºC – 30’’
40x
72ºC – 7’
4ºC – ∞
Tabela 5. Condições gerais de PCR usadas para os marcadores FLI1_rs7930515 e
FLI1_rs619521.
Reagentes
Concentração
Tampão de PCR
1x
MgCl2
4,0 mM
dNTP
40 µM
Iniciadores
0,2 µM
Taq Polimerase
1,0 U
Volume final
25 µL
Ciclo
94ºC – 5’
94ºC – 30’’
62ºC – 30’’
72ºC – 30’’
40x
72ºC – 7’
4ºC – ∞
Tabela 6. Condições gerais de PCR usadas para o marcador FLI1_rs145675082.
Reagentes
Concentração
Ciclo
Tampão de PCR
MgCl2
1x
3,0 mM
94ºC – 5’
dNTP
40 µM
Iniciadores
0,2 µM
Taq Polimerase
1,0 U
Volume final
25 µL
94ºC – 30’’
62ºC – 30’’
72ºC – 30’’
72ºC – 7’
4ºC – ∞
40x
25
Tabela 7. Condições gerais de PCR usadas para o marcador FLI1_rs531894.
Reagentes
Concentração
Tampão de PCR
1x
MgCl2
3,2 mM
dNTP
40 µM
Iniciadores
0,2 µM
Taq Polimerase
1,0 U
Volume final
25 µL
Ciclo
94ºC – 5’
94ºC – 30’’
62ºC – 30’’
72ºC – 30’’
40x
72ºC – 7’
4ºC – ∞
A PCR foi realizada em termociclador Mastercycler® ep gradient S, Eppendorf,
Germany.
A identificação do produto amplificado foi realizada pela técnica de eletroforese
em gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo, usando-se 5 μL de produto de
PCR, sendo visualizados e fotografados sob luz UV em um sistema de
fotodocumentação.
3.6.2 Digestão
Após a amplificação gênica através da técnica de PCR, foi realizada a digestão
com as enzimas de restrição específicas para a identificação dos SNPs. Os produtos
amplificados foram digeridos nas condições específicas de temperatura e tempo de
incubação, dependendo das condições ideais de cada enzima de restrição, e tampão
específico, de acordo com a tabela 8.
Após a clivagem do DNA através da digestão enzimática, os fragmentos obtidos
foram analisados por eletroforese em gel de agarose em diferentes concentrações,
dependendo do tamanho do fragmento produzido pela enzima de restrição, com
tampão TBE 1X, corado com brometo de etídeo e fotografados sob luz UV em um
sistema de fotodocumentação. O marcador de tamanho molecular utilizado para a
estimativa dos fragmentos gerados foi o ladder de 100 bp.
26
As enzimas e os respectivos tamanhos de fragmentos digeridos estão descritos
na tabela 9.
Tabela 8. Condições gerais usadas na reação de digestão.
REAGENTES
CONCENTRAÇÃO
TEMPERATURA (ºC) E
TEMPO DE
INCUBACAO (h)
ELETROFORESE CONCENTRAÇÃO DO
GEL DE AGAROSE
1x
2U
10 µL
25 µL
37ºC
4h
2,0%
1x
1x
2U
10 µL
25 µL
65 ºC
4h
2,5%
1x
2U
10 µL
25 µL
37 ºC
4h
2,0%
1x
2U
10 µL
25 µL
37 ºC
4h
3,0%
1x
1x
2U
10 µL
25 µL
37 ºC
4h
3,0%
1x
2U
10 µL
25 µL
37 ºC
4h
3,0%
1x
2U
10 µL
25 µL
37 ºC
4h
3,0%
IL1b_rs16944
Tampão de digestão
Enzima Ava I
H2O (qsp)
Volume final
IL1b_rs1143634
Tampão de digestão
BSA
Enzima Taqα I
H2O (qsp)
Volume final
MCP1_rs1024611
Tampão de digestão
Enzima Pvu II
H2O (qsp)
Volume final
FLI1_rs7930515
Tampão de digestão
Enzima Bfa I
H2O (qsp)
Volume final
FLI1_rs145675082
Tampão de digestão
BSA
Enzima Nla III
H2O (qsp)
Volume final
FLI1_rs619521
Tampão de digestão
Enzima Pvu II
H2O (qsp)
Volume final
FLI1_rs531894
Tampão de digestão
Enzima Alu I
H2O (qsp)
Volume final
27
3.7. Análise estatística
Análise estatística descritiva foi aplicada para os grupos caso e controle. Para
as variáveis qualitativas, calcularam-se as frequências juntamente com as
porcentagens em cada grupo; quanto as variáveis quantitativas, foi calculado média,
desvio padrão, valores mínimo e máximo.
Quanto às frequências alélicas e genotípicas dos SNPs, inicialmente foi
realizado teste para verificar se estavam em equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE),
bem como a estimativa do grau de Desequilíbrio de Ligação (DL) entre alelos de pares
de marcadores usando o parâmetro r2. A análise foi realizada após implementação
do software Haploview v.4.2.
Dados genotípicos e fenotípicos obtidos para a população caso-controle foram
utilizados para análise de associação com leishmaniose cutânea, para obtenção da
significância das diferenças nas frequências observadas para o polimorfismo nos dois
grupos (caso e controle) através do teste de chi-quadrado (X2) e “Odds ratio” (OR)
utilizando-se o programa estatístico SPSS v.22.
3.8. Aspectos Éticos:
O presente estudo faz parte de um projeto maior intitulado “Polimorfismos
genéticos dos genes envolvidos na resposta imune e na cicatrização das lesões em
pacientes com leishmaniose cutânea”, aprovado pelo CEP sob numeração
CAAE:09995212.0.0000.0005.
3.9. Suporte Financeiro:
O estudo recebeu suporte financeiro através do financiamento do projeto
intitulado “Estudo da influência de polimorfismos genéticos na suscetibilidade à
leishmaniose tegumentar causada por Leishmania guyanensis em população de áreas
endêmicas de Manaus, estado do Amazonas”, pelo CNPq (MCTI/CNPq/MS-SCTIE)
28
sob numeração: 404181/2012-0 e coordenado pelo Prof. Dr. Rajendranath
Ramasawmy.
29
Tabela 9. Condições gerais usadas na reação de PCR-RFLP.
GENE
MARCADOR
POLIMORFISMO
INICIADORES
Ta
PRODUTO
DE PCR
ENZIMA / SÍTIO DE
RESTRIÇÃO
ALELOS:
PRODUTOS
DE DIGESTÃO
rs16944
-511C/T
F: 5' TGG CAT TGA TCT GGT TCA TC 3'
R: 5' GTT TAG GAA TCT TCC CAC TT 3'
53 °C
305 pb
AvaI
5'...C↓YCGRG...3'
3'...GRGCY↑C...5'
C: 190/115
T: 305
+ 3953 C/T
F: 5' GTT GTC ATC AGA CTT TGA CC 3'
R: 5' TTC AGT TCA TAT GGA CCA GA 3'
53 °C
250pb
TaqαI
5'...T↓CGA...3'
3'...AGC↑T...5'
C: 136/114
T: 250
rs1024611
-2518 A/G
F: 5' CCG AGA TGT TCC CAG CAC AG 3'
R: 5' CTG CTT TGC TTG TGC CTC TT 3'
65/55 °C
930 pb
Pvu II
5'...CAG↓CTG...3'
3'...GTC↑GAC...5'
G: 708/222
A: 930
rs7930515
A/C
F: 5' GGG TAA GTG GCC TCG TTG CAC GAG 3'
R: 5' GGC GCT AGG GAT CTG TGC GGA CGG 3'
62ºC
243 pb
BfaI
5'...C↓TAG...3'
3'...GAT↑C...5'
A: 139/97/7
C: 236/7
rs619521
A/G
F: 5' AGC TAG GCA CAG GTG CAC CTA GAC 3'
R: 5' CCT GAA GGT GGG TGC CTT GGT TTC 3'
62ºC
324pb
Pvu II
5'...CAG↓CTG...3'
3'...GTC↑GAC...5'
G: 180/144
A: 324
rs145675082
C/T
F: 5' GCC AAA ACT AGC GTG CTC CCT GTG 3'
R: 5' GCT TGG CTG GAG GTG TCT GGT GAA AG 3'
62ºC
171pb
NlaIII
5'...CATG↓...3'
3'...↑GTAC...5'
C: 156/15
T: 171
rs531894
A/G
F: 5' TAA GGA AGT GAA TAT CCC AGT CCT GTT 3'
R: 5' ATG AGG AAG GTG TCT ACC TTC CTG 3'
62ºC
286pb
Alu I
5'...AG↓CT...3'
3'...TC↑GA...5'
G: 147/97/42
A: 244/42
IL-1b
rs1143634
MCP-1
FLI-1
30
4. RESULTADOS
4.1. Características Gerais da População em Estudo
Foram recrutados 392 indivíduos com a manifestação clínica da doença para
compor o grupo caso. Desse total, 311 (79%) eram do masculino e 80 (20%) do sexo
feminino. A idade teve uma variação de 5-70 anos de idade com média de 32,0 anos.
Adicionalmente, analisou-se a média de idade de acordo com o sexo, tendo-se
observado a mesma média (32,0 anos) tanto para o gênero masculino quanto
feminino.
Para compor o grupo controle, foram recrutados 382 indivíduos sem sinais e
sintomas de LC, sendo 225 (59%) do sexo masculino e 157 (41%) pertencente ao
sexo feminino. A idade dos indivíduos do grupo controle variou de 5-89 anos de idade,
com uma média de 36,0 anos. Novamente, analisou-se a média de idade associada
ao gênero, obtendo-se média de 38,0 anos para o gênero masculino e 34,0 anos para
o gênero feminino.
A tabela 10 sumariza a análise descritiva da população caso-controle quanto
ao sexo e idade.
Tabela 10. Características gerais da população caso-controle em estudo.
Sexo (%)
Masculino
Feminino
Dado faltante
Média de idade – Anos (± DP)
Quanto ao sexo
Masculino
Feminino
DP = Desvio Padrão
CASO
CONTROLE
n= 392
311 (79)
80 (20)
1 (3)
n= 382
225 (59)
157(41)
...
32 ± 14.1
36 ± 17.7
32 ± 13.7
32 ± 15.5
38 ± 17.6
34 ± 17.5
31
4.2. Genotipagem, HWE e DL
Os marcadores analisados apresentaram-se em HWE, com exceção do
marcador FLI1_rs145675082, que por não estar em equilíbrio foi excluído da análise.
Quanto à genotipagem, esta foi realizada por PCR-RFLP conforme ilustrado nas
figuras 4, 5 e 6; e apresentou êxito ≥90% para todos os marcadores testados.
A
B
Figura 4. Padrão eletroforético da PCR-RFLP para os SNPs IL1-B +3953 C/T e IL1-B -511 C/T
respectivamente. A: Digestão do produto de PCR com TaqαI produz fragmentos de 136 e 114 pb (Alelo
T) ou 250 pb (Alelo C). Colunas 1 e 2 heterozigoto CT; Colunas 3 e 5 homozigoto CC; e Coluna 4
homozigoto CC. B: Digestão do produto de PCR com Ava I produz fragmentos de 190 e 115 pb (Alelo
C) ou 305 pb (Alelo T). Colunas 2, 3 e 5 homozigoto TT; Coluna 7 homozigoto CC, Colunas 1, 4 e 6
heterozigoto CT. M: marcador de 100 pb;
Figura 5. Padrão eletroforético da PCR-RFLP para o SNP MCP1 -2518 A/G. Digestão do produto de
PCR com Pvu II produz fragmentos de 708 e 222 pb (tipo selvagem) ou 930 pb (tipo mutante). Colunas
3 e 6 homozigoto mutante; Coluna 2 homozigoto do tipo selvagem, Colunas 1, 4 e 5 heterozigoto. M:
marcador de 100 pb;
32
Figura 6. Padrão eletroforético da PCR-RFLP para os SNPs FLI1_rs7930515, FLI1_rs619521 e
FLI1_rs531894 respectivamente. rs7930515: Digestão do produto de PCR com Bfa I produz
fragmentos de 139, 97 e 7 pb (Alelo A) ou 236 e 7 pb (Alelo C). Coluna 1A, produto de PCR de 243 pb;
Coluna 1B homozigoto CC; Coluna 1C heterozigoto AC; Coluna 1D homozigoto AA. rs619521:
Digestão do produto de PCR com Pvu II produz fragmentos de 180 e 144 pb (Alelo G) ou 324 pb (Alelo
A). Coluna 2A, produto de PCR de 324 pb; Coluna 2B homozigoto AA; Coluna 2C heterozigoto AG;
Coluna 2D homozigoto GG. rs531894: Digestão do produto de PCR com Alu I produz fragmentos de
147, 97 e 42 pb (Alelo G) ou 244 e 42 pb (Alelo A). Coluna 3A, produto de PCR de 286 pb; Coluna 3B
homozigoto AA; Coluna 3C heterozigoto AG; Coluna 3D homozigoto GG. M: marcador de 100 pb.
Análise para verificar o DL entre os SNPs dos genes IL-1b e FLI-1 foi realizada
utilizando-se para cálculo o parâmetro r2, conforme ilustra a figura 7. A análise do DL
confirmou independência para todos os SNPs testados. Para o gene MCP-1 não foi
possível gerar o ”plot” de DL, pois para este gene foi realizada a genotipagem de
apenas um marcador.
A
B
r2
r2
Figura 7. Análise de desequilíbrio de ligação entre os SNPs dos genes IL-1b e FLI-1 respectivamente.
O número no interior do quadrado indica a proporção de DL em porcentagem, calculado utilizando-se
o parâmetro r2. O código de cores reflete a intensidade de DL entre dois loci.
33
4.2.1 Análise dos marcadores MCP1_rs1024611, IL1b_rs1143634, FLI1_rs619521 e
FLI1_rs531894.
As frequências alélicas e genotípicas para os marcadores MCP1_rs1024611,
IL1b_rs1143634, FLI1_rs619521 e FLI1_rs531894 estão descritas na tabela 11.
Conforme análise, não foi observada evidência de associação desses
marcadores com leishmaniose cutânea na amostra populacional estudada, pois não
foram observadas diferenças estatisticamente significativas nas frequências alélicas
e genotípicas quando foram comparados os grupos caso e controle para os três
modelos de comparação que foram aplicadas (genotípico, alélico e de dominância),
todos com valores de P superiores a 0.05.
4.2.2. Análise do marcador IL1b_rs16944
Para o SNP IL1b_rs16944 do gene IL-1b, análise da distribuição das
frequências alélica, genotípica e de dominância foram aplicadas entre os grupos caso
e controle, observando-se evidência positiva de associação desse SNP (modelo
aditivo P=0.026 e dominante P=0.027) com leishmaniose cutânea na amostra
estudada, conforme descrito na tabela 12.
4.2.3. Análise do marcador FLI1_rs7930515
Para o marcador FLI1_rs7930515 do gene FLI-1, também foram aplicadas
análises da distribuição das frequências alélica, genotípica e de dominância entre os
grupos caso e controle, podendo-se observar valores de P “boderline” (modelo aditivo
P=0.075 e dominante P=0.036), com OR de 2.38 [IC 95% 1.07 – 5.32].
34
Tabela 11. Comparação das distribuições das frequências genotípicas e alélicas para
os marcadores MCP1_rs1024611, IL1b_rs1143634, FLI1_rs619521 e FLI1_rs531894.
GRUPO CASO
GRUPO
CONTROLE
n= 346 (%)
n= 324 (%)
AA
83 (24)
70 (22)
AG
179 (52)
157 (48)
GG
84 (24)
97 (30)
IL1b_rs1143634
345 (50)
347 (50)
n= 388 (%)
297 (46)
351 (54)
n= 371 (%)
Genótipo
CC
296 (76)
282 (76)
CT
85 (22)
78 (21)
TT
7 (2)
11 (3)
677 (87)
99 (13)
n= 354 (%)
642 (87)
100 (13)
n= 316 (%)
131 (37)
169 (48)
54 (15)
114 (36)
160 (51)
42 (13)
431 (61)
277 (39)
n= 337 (%)
388 (61)
244 (39)
n= 318 (%)
87 (26)
156 (46)
94 (28)
330 (49)
344 (51)
MCP1_rs1024611
P
X2
0.25
2.76
0.14
2.18
0.56
1.15
0.17
0.68
0.77
0.68
0.19
0.66
76 (24)
154 (48)
88 (28)
0.40
0.82
306 (48)
330 (52)
0.09
0.76
Genótipo
Alelo
A
G
Alelo
C
T
FLI1_rs531894
Genótipo
AA
AG
GG
Alelo
A
G
FLI1_rs619521
Genótipo
AA
AG
GG
Alelo
A
G
35
Tabela 12. Comparação da distribuição das frequências genotípica, alélica e de
dominância para o marcador IL1b_rs16944.
GRUPO
CASO
GRUPO
CONTROLE
IL1b_rs16944
Genótipo
n= 374 (%)
n= 352 (%)
CC
81 (22)
54 (15)
CT
183 (49)
167 (48)
TT
110 (29)
131 (37)
CC + CT
264 (71)
221 (63)
TT
110 (29)
131 (37)
CT + TT
293 (78)
298 (85)
CC
81 (22)
54 (15)
Alelo
C
T
345 (46)
403 (54)
275 (39)
429 (61)
P
OR [95% CI]
0.026
...
0.027
1.42 [1.04 – 1.94]
0.036
0.66 [0.45 – 0.96]
0.007
1.34 [1.084-1.646]
Dominância
36
Tabela 13. Comparação da distribuição das frequências genotípica, alélica e de
dominância para o marcador FLI1_rs7930515.
GRUPO
CASO
GRUPO
CONTROLE
FLI1_rs7930515
Genótipo
n= 347 (%)
n= 335 (%)
AA
9 (3)
20 (6)
AC
CC
144 (41)
194 (56)
142 (42)
173 (52)
AA + AC
CC
153 (44)
194 (56)
AC + CC
AA
Alelo
A
C
P
OR [95% CI]
0.075
...
162 (48)
173 (52)
0.28
0.84 [0.62 – 1.14]
338 (97)
9 (3)
315 (94)
20 (6)
0.036
2.38 [1.07 – 5.32]
345 (46)
403 (54)
275 (39)
429 (61)
0.10
1.23 [0.96 – 1.56 ]
Dominância
37
5. DISCUSSÃO
As leishmanioses ainda são consideradas um grande problema de saúde
pública, representando um complexo de doenças com importante espectro clínico e
diversidade epidemiológica. Nas áreas onde a leishmaniose é considerada endêmica,
somente uma fração da população exposta ao parasita desenvolve a doença (8,1,75).
O fato de alguns indivíduos não apresentarem nenhum sinal ou sintoma de
infecção, enquanto outros desenvolvem formas crônicas ainda não foi claramente
elucidado (44). Acredita-se que a patogenia da LTA é fortemente influenciada pelo
perfil imunogenético do homem, que se encontra igualmente associado à resposta
imune mediada por células T e pela virulência da espécie de Leishmania infectante,
além da ação integrada de fatores ambientais, socioeconômicos e culturais (8).
Para avaliar o impacto de fatores genéticos em leishmaniose cutânea, neste
estudo optou-se por analisar SNPs em IL-1b, MCP-1 e FLI-1 associados à LC,
provenientes da literatura, para replicação.
A população estudada neste projeto foi composta por pacientes com LC,
recrutados no ambulatório de Dermatologia da FMT-HVD por demanda espontânea,
provenientes de áreas endêmicas para leishmaniose no Amazonas, com destaque
para o ramal da Cooperativa e ramal do Pau-Rosa, com suas respectivas vicinais; e
indivíduos sem a doença, provenientes das mesmas áreas endêmicas dos casos.
De acordo com os achados no presente estudo, dos indivíduos acometidos com
LC, 79% eram do sexo masculino e 20% do sexo feminino. A média de idade para os
casos foi de 32 anos de idade. Nossos dados estão de acordo com os achados de
Benicio et al., 2011, onde foram observados 78% de indivíduos do sexo masculino e
22% do sexo feminino, com média de idade de 29 anos (76); e com os de Romero et
al., 2002, em que 82% dos indivíduos com leishmaniose eram do sexo masculino, com
média de idade 27 anos (77).
Segundo o Manual de Vigilância da Leishmaniose Tegumentar Americana, a
doença atinge indivíduos do sexo masculino principalmente, em fase produtiva, o que
caracteriza o acometimento de indivíduos cuja principal atividade ocupacional está
associada à penetração em áreas de mata, desflorestamento, agropecuária ou
38
exercícios militares, tornando essa população altamente exposta à infecção por
Leishmania sp (1).
Para o grupo controle, 59% dos indivíduos correspondiam ao sexo masculino e
41% ao sexo feminino, com idade média de 36 anos.
Ter um grupo controle com idade média superior ao caso é encarado como
fator positivo, pois dessa maneira tem-se uma maior segurança em trabalhar com um
grupo que ultrapassou a idade média do grupo caso, sob as mesmas condições de
risco, no entanto não desenvolveu a doença.
5.1. MCP-1
Polimorfismos genéticos em MCP-1 estão associados com diversas doenças
infecciosas, tais como hepatite B e C, tuberculose, leishmaniose mucosa, doença de
chagas, entre outras (45,73,78–81).
Estudo realizado por Flores-Villanueva et al., 2005 em populações do México e
Korea, demonstrou associação do alelo G do polimorfismo MCP1_ rs1024611 (MCP1
-2518 A/G) com suscetibilidade para desenvolver a forma ativa da tuberculose.
Indivíduos que possuíam os genótipos AG e GG apresentaram maior risco de
desenvolver tuberculose do que os portadores do genótipo AA. Assim, os achados
sugeriram que indivíduos que carregam o genótipo GG produzem maiores
concentrações de MCP-1, que inibe a produção de IL-12p40 em resposta ao M.
tuberculosis e aumenta a probabilidade de progressão da infecção pelo bacilo para
uma tuberculose pulmonar ativa (79).
Ramasawmi et al., 2010 realizaram estudo para verificar associação do
polimorfismo em MCP1 -2518 A/G com LC e LM. Os dados apresentados pelos
autores fornecem evidências de base populacional e familiar para uma associação
entre o alelo G desse SNP e susceptibilidade para LM causada por L. braziliensis, e
não para LC. Esses dados foram correlacionados com elevados níveis de MCP-1 no
plasma de indivíduos homozigotos para o alelo G, e com alta liberação de MCP-1 por
macrófagos estimulados e não estimulados (45).
39
Esses dados corroboram com os achados no presente estudo, em que não foi
possível encontrar associação entre o polimorfismo MCP1 -2518 A/G e LC por não
haver diferença estatisticamente significativa entre os grupos de caso e controle
(modelo aditivo P=0.25, X2=2.76).
Segundo análise realizada por Ramasawmy et al., 2010, a comparação do
grupo de indivíduos com LC e de indivíduos sem o fenótipo não foi estatisticamente
significativa tanto para os modelos aditivo e dominante, sugerindo que esse
polimorfismo não é agente influenciador para o fenótipo LC (45).
Apesar de a grande maioria dos casos notificados no estado do Amazonas
serem causados por L. guyanensis,
espécie que difere da observada por
Ramasawmy et al, 2010 (L. braziliensis), a semelhança no resultado encontrado pode
ser explicada pelo fato de ambas pertencerem ao subgênero Viannia, e também pelo
perfil genético bastante similar das duas populações estudadas.
No entanto, é importante ressaltar que outros estudos nesta população devem
ser conduzidos para outros fenótipos da leishmaniose, em especial LM a fim de melhor
elucidar o possível envolvimento desse gene com leishmaniose per se.
5.2 FLI-1
Polimorfismos em FLI-1 foram descritos pela primeira vez em associação com
L. major baseado em modelo murino (82). Sakthianandeswaren et al., 2010, validaram
a importância do FLI-1 na resolução e cicatrização das lesões e identificaram três
polimorfismos na região promotora deste gene, indicando-o como novo candidato
influenciando na resistência à L. major. Nesse estudo, observou-se que em
camundongos resistentes, o pico na expressão de FLI-1 em linfonodos na sexta
semana de infecção correspondia ao observado no pico fenotípico no mesmo período,
em que camundongos resistentes apresentaram estabilização e cicatrização da lesão.
Em contraste, as lesões presentes em camundongos susceptíveis, seis semanais
após infecção continuavam a crescer em tamanho e gravidade, possivelmente devido
à ausência de uma expressão aumentada de FLI-1.
40
Posteriormente, Castellucci et al., 2011, baseado no estudo citado
anteriormente, examinaram FLI-1 como um gene controlando LC causada por L.
braziliensis num estudo de associação baseado em família (70). No estudo de
Castelluci et al., 2011, os SNPs de FLI-1 foram genotipados inicialmente em 168
famílias nucleares compostas por 250 casos de LC e 87 casos de LM, todos
provenientes de Corte de Pedra, área de endemicidade para L. braziliensis, Bahia. Foi
demonstrado associação do alelo C (P=0.003; OR=1.64) no SNP FLI1_rs7930515 e
risco para LC, que após análise primária, foi replicada numa segunda amostra de 402
casos de LC em 157 famílias nucleares (P=0.014;OR=1.60) recrutadas na mesma
região.
No presente estudo, dentre os quatro SNPs genotipados para FLI-1, apenas
verificou-se tendência para associação com LC no SNP FLI1_rs7930515 (modelo
aditivo P=0.075 e dominante P=0.036). Esta tendência à associação pode ser
observada entre o alelo C e susceptibilidade para leishmaniose cutânea pelo modelo
de dominância [P=0.036 OR=2.38 (IC 95% 1.07 – 5.32)].
Os dados observados no presente estudo corroboram com os achados de
Castellucci et al., 2011, em que o alelo C estava associado com risco para LC, no
entanto nossos achados podem apenas sugerir uma associação, uma vez que o valor
de P apresentou-se “boderline”.
Esses dados, somados a outros estudos evidenciam a importância do gene FLI1 como candidato influenciando resistência/susceptibilidade na leishmaniose, além de
ter sido correlacionado com uma resposta de cura de lesão em modelo murino
(70,82,83).
Estudos posteriores devem ser conduzidos para o mesmo marcador
aumentando-se o tamanho de amostra, a fim de desvendar se a associação
encontrada no presente estudo se tornaria mais forte, a ponto de ser considerada
significativa (P<0.05); ou se este indício de associação desapareceria, podendo-se
descartá-lo como marcador associado a LC na polulação estudada.
5.3 IL-1b
41
Interleucina 1 (IL-1) pertence ao grupo de citocinas pro-inflamatórias do tipo
Th1, e tem papel chave como mediador da resposta inflamatória com efeitos
pleiotrópicos numa variedade de células e vias de sinalização, e tem função
importante no desfecho da condição patológica (56).
IL-1b é uma citocina com atividade pirogênica que é normalmente ativada em
resposta a uma infecção ou injúria (64). Os inflamassomas tem papel um importante
nesse contexto, devido sua função de promover a ativação de IL-1b através de vários
estímulos durante a infecção por micro-organismos (65).
Polimorfismos genéticos em IL-1b estão associados com susceptibilidade a
diversas doenças autoimunes, inflamatórias e infecciosas, dentre elas tuberculose,
gastrite crônica associada a Helicobacter pylori, HIV, esclerose múltipla, lupus
eritematoso sistêmico, malária e leishmaniose (58–63).
Existem dois polimorfismos bastante comuns no gene IL-1b influenciando a
expressão da citocina: um localizado no exon 5 (IL-1b 3953 C/T) e outro localizado na
região promotora (IL1-b -511 C/T) (84).
Fernández-Figueroa et al., 2012 demonstraram que o polimorfismo em IL-1b (511 C/T) está associado com um alto risco de contrair a doença em pacientes
infectados com L. mexicana. Também foram capazes de demonstrar que pacientes
com a forma mais grave da doença e que albergam um maior número de parasitas de
L. mexicana, apresentam uma produção aumentada de IL1-b por monócitos in vitro,
uma acentuada expressão sérica de IL-1b e uma distribuição difusa de IL-1b nas
lesões (63).
Estudo realizado para verificar associação do polimorfismo IL-1b -511 C/T com
LV, demonstrou que o alelo C pareceu conferir susceptibilidade a LV, enquanto a
presença do alelo T atuou como possível fator influenciador para resistência à doença
(84).
Esses achados corroboram com os do presente estudo, em que se observou
associação dos alelos C e T do polimorfismo IL-1b -511 C/T com susceptibilidade e
resistência, respectivamente, à LC. Pelo modelo de dominância, pode-se sugerir a
presença do alelo C conferindo risco [P = 0.027, OR=1.43 (IC 95% 1.04 – 1.94)] e o
42
contrário, do alelo T conferindo resistência [P = 0.036, OR = 0.66 (IC 95% 0.45 –
0.96)]. Moravej et al., 2012, que também obtiveram o mesmo perfil de associação
desse polimorfismo com LV, sugerem que indivíduos portadores do alelo IL-1b -511 C
produzem mais IL-1b do que os portadores do alelo T, resultando no desenvolvimento
da doença e resolução da lesão (84).
Ainda, segundo dados de Fernández-Figueroa et al., 2012, a distribuição de IL1b nos tecidos está associada à carga parasitária no hospedeiro, assim indivíduos
com a forma mais grave da doença, e que, portanto possuíam carga parasitária
maciça, apresentavam maiores níveis celulares de IL-1b. O oposto também foi
observado (63).
Associação de IL1b 3953 C/T foi observada conferindo risco para
desenvolvimento da forma grave de malária em uma população de Gambia (61). Da
mesma forma, associação desse polimorfismo foi observada com susceptibilidade
para infecção por HIV (85). Mas não para leishmaniose visceral em uma população
iraniana (84).
Dados de Moravej et al., 2012 corroboram com os achados deste estudo, em
que também não foi possível encontrar associação do polimorfismo em IL-1b 3953
C/T com LC (Modelo aditivo, P=1.15, X2=0.56).
Pesquisas conduzidas ao longo das últimas décadas vem resultando em sólido
corpo de evidências em favor da existência de fatores genéticos atuando no controle
da susceptibilidade do hospedeiro à leishmaniose através de polimorfismos em genes
indutores de citocinas ou quimiocinas com influência direta na resposta immune,
resultando num amplo espectro de manifestações da doença.
Dessa forma, a identificação dos genes e do mecanismo biológico por trás do
efeito genético observado pode significar um enorme avanço no entendimento da
patogênese de doenças complexas em geral.
Assim, os dados gerados no presente estudo, somados aos já existentes na
literatura, vem contribuir de modo crítico para um maior entendimento da patogênese
da LC, podendo-se, futuramente, levar ao desenvolvimento de melhores estratégias
de diagnóstico, tratamento e prevenção.
43
6. CONCLUSÃO
Através dos resultados gerados neste estudo pode-se concluir:
Não foram observadas associações genéticas com a susceptibilidade/resistência à LC
para os SNPs IL1b_rs1143634 (IL-1b 3953 C/T), MCP1_rs1024611 (MCP-1 -2518
A/G), FLI1_rs619521 e FLI1_rs531894 na população estudada.
Foram detectadas diferenças estatisticamente significativas na distribuição alélica e
genotípica do polimorfismo em IL1b_rs16944 (IL-1b -511 C/T) entre os grupos caso e
controle, sugerindo associação do alelo C com susceptibilidade, e do alelo T com
resistência para LC.
Para o SNP FLI1_rs7930515 foi observado uma tendência para associação, podendose sugerir que o alelo C estava associado com risco para LC.
Os resultados obtidos no presente estudo reforçam o papel dos genes IL1-b e FLI-1
associados com resistência a LC.
44
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54
8. ANEXOS
Anexo A – Fluxograma do Estudo
Recrutamento de
pacientes e indivíduos
controle
Entrevista e coleta
de material
Extração e
quantificação de
DNA
Genotipagem de
IL-1b
Genotipagem de
FLI-1
Processamento
dos dados
Análise
Estatística
Genotipagem de
MCP-1
55
Anexo B – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Número do Prontuário:_____________
Número da Ficha:______________
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
POLIMORFISMOS GENÉTICOS DOS GENES ENVOLVIDOS NA RESPOSTA IMUNE E NA
CICATRIZAÇÃO DAS LESÕES EM PACIENTES COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA EM UMA
POPULAÇÃO CASO-CONTROLE DE MANAUS, AMAZONAS.
Introdução: Você está sendo convidado para participar do projeto de pesquisa citado acima. Este
estudo será coordenado pelo Dr. Rajendranath RAMASAWMY pesquisador visitante sênior e professor
permanente do programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais e Infecciosas da UEA/FMT-HVD.
Antes de tomar qualquer decisão, é importante que você leia e compreenda as seguintes explicações
sobre o procedimento proposto. Esta declaração descreve o objetivo, procedimento, benefícios e riscos
do estudo, e o seu direito de sair do estudo a qualquer momento. Estas informações estão sendo dadas
para esclarecer quaisquer dúvidas sobre a pesquisa proposta, antes de obter o seu consentimento.
Justificativa: Leishmaniose tegumentar ou ferida braba é uma doença causada por um pequeno
parasita que fica na pele, mas existem diferentes espécies de parasito que podem causar a mesma
doença, assim sendo, é importante saber qual o tipo de parasito que pode estar causando sua doença,
ou se você não teve essa doença queremos saber se você tem mais possibilidade de contraí-la de que
outra pessoa.
Dessa forma, queremos que você participe deste estudo permitindo que seja retirada uma pequena
amostra de sangue da sua veia pra fazermos testes que vão nos dizer se você tem mais chance de ter
leishmaniose causada pela parasita Leismania guyanensis do que outra pessoa. Caso você tenha essa
doença queremos saber se você tem no seu organismo (na parte genética) capacidade de boa
cicatrização, após ter sido tratado com um medicamento específico para essa doença.
Métodos: Caso você concordar em participar desse estudo, você será submetido a um exame médico,
e uma coleta de 5 mL de sangue do seu antebraço, com uma agulha nova descartável, após a assepsia
local (limpeza). Se o médico suspeitar que você tenha leishmaniose, você poderá ser submetido ainda
a uma coleta para biópsia de pele realizada por um dos médicos (Dr. Jorge Guerra ou Dra Anette
Talhari) integrantes da equipe. Os indivíduos não afetados por leishmaniose e sem histórico de
leishmaniose, que procurem o ambulatório de dermatologia da FMT-HVD, serão selecionados para e,
caso aceitem participar, comporão o grupo controle. Os indivíduos que, depois de examinados pelo
dermatologista, forem caracterizados como não afetados por leishmaniose, e que não apresentarem
história de infecções crônicas, inflamação e doenças auto-imunes, serão considerados candidatos.
A biópsia será utilizada para identificação do parasita que está causando sua doença. A biópsia é um
procedimento no qual se colhe uma pequena quantidade de pele, isto é, uma amostra, de tecido ou
células, para posterior estudo em laboratório. A grande maioria dos pequenos procedimentos de biópsia
é muito segura, tendo apenas um pequeno risco de sangramento ou infecção no local da biópsia. Ela
é feita após anestesia local na borda local da ferida e depois de isso retirar um pequeno pedaço de
pele com auxilio de instrumento cortante esterilizado chamado de punch. A amostra de sangue servirá
para saber o que queremos através de testes feitos no laboratório, alem disso, com sua autorização,
informações de prontuários clínicos também poderão ser lidas pelos participantes do estudo para
comparar o resultado dos testes feitos em seu sangue e a resposta de seu tratamento.
1) Local do estudo
Os procedimentos descritos acima serão realizados no ambulatório de Dermatologia (avaliação
clínica e biópsia) sob a responsabilidade do Dr. Jorge Guerra ou Dra. Anette Talhari, médicos
integrantes da equipe de pesquisa e nos laboratórios da FMT-HVD sob a responsabilidade do Dr.
Rajendranath Ramasawmy.
Rubrica do pesquisador:_________________
Rubrica do participante:__________________
56
Número do Prontuário:___________________
Número da Ficha:_______________________
2) Permissão para estocagem
Está sendo solicitada a sua permissão para estocagem (guarda ou armazenamento) de sua
amostra de biópsia, soro e de DNA na FMT-HVD sob a responsabilidade do Dr. Rajendranath
Ramasawmy de acordo com a resolução CNS Nº441de 12 de maio de 2011 e da portaria
Nº00212/2012-GDP/FMT-HVD. Se assinar esse termo de consentimento, você está autorizando
estocagem de longo prazo das amostras para estudos futuros. Isso evitará procedimentos como nova
coleta de sangue bem como a diminuição de recursos financeiros para novos procedimentos.
A sua amostra de DNA será mantida indefinidamente. Isto significa que a sua amostra não será
destruída após um determinado período de tempo, mas sim será estocada pelo tempo que ela durar.
Amostras estocadas serão usadas exclusivamente para fins de pesquisas e poderão ser utilizadas
para outros estudos a respeito da susceptibilidade à leishmaniose. O uso de sua amostra estocada
terá como condição uma nova avaliação e aprovação do projeto de pesquisa pelo Comitê de Ética
pertinente. Sua permissão será solicitada. Se você concorda, você será pedir de assinar um novo
TCLE com as justificativas e especificidades.
3) Risco físico para saúde/desconfortos
Os riscos físicos para a saúde na participação deste estudo são limitados ao procedimento de
biópsia e coleta de sangue, ambos de rotina nos laboratórios clínicos. Em ambos os casos, você poderá
sentir um desconforto temporário devido à introdução da agulha. A grande maioria dos procedimentos
de biópsia é muito segura, tendo apenas um risco de sangramento ou infecção no local da biópsia. Ela
é feita após anestesia local na borda local da ferida e depois de isso retirar um pequeno pedaço de
pele com auxilio de instrumento cortante esterilizado chamado de punch. Durante a realização de
biopsia, pode ocorrer pequeno sangramento que acostuma regredir em seguida. Pode também
acontecer infecção se não haver cuidado de limpeza durante e depois desse procedimento. De
qualquer maneira, você receberá uma pomada de antibiótico para evitar infecção. Entretanto, caso
você tenha febre ou dor, "inchaço" (edema), rubor ou sangramento no local de biópsia deve procurar a
equipe da pesquisa (Dr. Jorge Guerra ou Dra Anette Talhari). Existe também a possibilidade de risco
de perda da confidencialidade tal como outras pessoas poderiam ter acesso aos seus dados e
identificá-lo. Entretanto, serão tomados cuidados especiais para que isso não aconteça pois, sua
identificação será feita por meio códigos. O seu nome não estará visível nos frascos contendo as
amostras biológicas, elas serão codificadas para evitar o risco de perda da confidencialidade.
4) Indenização e compensação por danos
Se você desenvolver uma infecção localizada devido ao procedimento de coleta de sangue ou
biópsia, você será assistido pelo Dr. Jorge Guerra ou a Dra Anette Talhari, médicos integrantes da
equipe de pesquisa no FMT-HVD. O custo desse tratamento será totalmente coberto pelo projeto.
Qualquer dano decorrente de sua participação somente neste estudo referente a qualquer
procedimento relacionado, você será assistido na FMT-HDV e terá direito a indenizações ou
ressarcimentos em casos de danos decorrentes de sua participação no estudo.
5) Desligamento
A sua participação neste estudo é voluntária e sua recusa em participar ou seu desligamento
do estudo não envolverá penalidades ou perda de benefícios os quais você tenha direito.
Se você estiver afetado pela leishmaniose, acesso a procedimentos médicos para diagnósticos
e tratamento da doença será providenciado mesmo que não queira participar deste estudo.
Se você não estiver afetado pela leishmaniose, você está sendo convidado a participar do
estudo como parte do grupo controle ou como familiar do afetado. Neste caso, sua decisão de participar
ou não, ou de cessar sua participação a qualquer momento, não irá interferir de nenhuma forma nos
procedimento médicos para diagnóstico ou tratamento da leishmaniose que você possa necessitar no
futuro. Da mesma forma, sua decisão não irá refletir no acesso a procedimentos médicos necessários
a algum familiar ou contato afetado pela leishmaniose.
Rubrica do pesquisador: __________________
Rubrica do participante:__________________
57
Número do prontuário:____________________
Número da Ficha:_______________________
6) Custo para os participantes
No caso de você decidir participar do estudo, você não terá nenhum custo. Custos com testes
laboratoriais e análises de suas amostras na pesquisa serão cobertos pelo estudo.
7) Benefícios
Em longo prazo, os procedimentos médicos e laboratoriais aos quais você será submetido
poderão facilitar a detecção de resistência à leishmaniose e seu tratamento, tornando possível evitar
tratamentos inadequados. Além disso, espera-se que conhecimentos científicos adicionais sejam
alcançados, com consequente melhoria do tratamento de pessoas afetadas pela leishmaniose.
8) Reembolso
Já que não haverá gastos adicionais de transporte e alimentação devido a sua participação no
estudo, você não será reembolsado por participar deste estudo.
9) Exclusividade de uso de material genético e biológico
Amostras de DNA serão utilizadas apenas para pesquisa de susceptibilidade à leishmaniose.
Todos os resultados obtidos no estudo, após análise do conjunto completo dos dados, serão publicados
em artigos científicos. É importante reafirmar que o alvo de nossos estudos é a identificação do fator
de risco genético à leishmaniose e contribuição no entendimento do mecanismo da doença
10) Confidencialidade dos dados
Os registros de sua participação neste estudo serão mantidos confidencialmente até onde é
permitido por lei e todas as informações estarão restritas à equipe responsável pelo projeto. Nenhuma
informação genética individual será tornada pública. As informações serão codificadas e
mantidas em local protegidas o tempo todo. Somente os pesquisadores envolvidos neste estudo terão
acesso às informações. Após o término deste estudo, as informações serão transcritas dos
questionários para os arquivos de computador, mantidos em local restrito com acesso permitido apenas
aos mesmos pesquisadores. Os dados deste estudo poderão ser discutidos com pesquisadores de
outras instituições, mas nenhuma identificação será fornecida. Você tenha direto de conhecer os
resultados dos testes laboratoriais que serão realizados. Os resultados da pesquisa em nenhum
momento irão interferir no tratamento já preconizado.
POLIMORFISMOS GENÉTICOS DOS GENES ENVOLVIDOS NA RESPOSTA IMUNE E NA
CICATRIZAÇÃO DAS LESÕES EM PACIENTES COM LEISHMANIOSE CUTÂNEA EM UMA
POPULAÇÃO CASO-CONTROLE DE MANAUS, AMAZONAS.
Você receberá uma cópia deste Termo de Consentimento para mantê-lo consigo. Se você tiver
qualquer dúvida no futuro sobre sua participação neste estudo, você pode e deve utilizar os seguintes
meios de contato com os pesquisadores responsáveis:
Dra Anette TALHARI
Dr Jorge GUERRA
Dr Rajendranath RAMASAWMY
Telefone: (92) 2127 3429
(92) 2127 3429
(92) 2127 3447
Email:
[email protected] [email protected]
[email protected]
Para quaisquer informações, fica disponibilizado o endereço do CEP/FMT-HVD, sito à Av. Pedro
Teixeira nº25 Dom Pedro I, Cep 69040-000, Manaus-AM, que funciona de 2ª a 6ª feira, das 08:00 às
14:00 horas, telefone (92)2127-3572, e-mail: [email protected]
58
Consentimento
Li e entendi as informações precedentes. Tive a oportunidade de fazer perguntas e todas as minhas
dúvidas foram respondidas a contento. Este formulário está sendo assinado voluntariamente por mim,
indicando o meu consentimento em participar do estudo, até que eu decida o contrário.
Assinatura ou impressão digital do voluntário
Nome completo e nº do prontuário
Assinatura do entrevistador
Nome do entrevistador
Assinatura testemunha 1
Data: ____/____/_____
Assinatura testemunha 2
59
Anexo C – Questionário
FMT-HVD
Fundação de Medicina Tropical Dr Heitor Vieira Dourado
Instrumento de Coleta de Dados
Projeto Genética da Leishmaniose
Identificação do voluntário:
1.
2.
3.
4.
5.
Nome: ___________________________________________________________
Gênero: Masc ( ) Fem ( )
D/N:___/___/_____
Idade:_____________
Etnia: Branco: ( ); Misto: ( ); Índio: ( );
Outro(qual):_____________________________
6. Tipo e local de trabalho:_____________________________________________
Dados para contato:
1.Telefone:_______________________________________
2. Endereço:______________________________________________________
________________________________________________________________
3. Referência:_____________________________________________________
4. Tempo de Residência:______________________________
5. Histórico de Residência (onde já morou e por quanto tempo):_____________
________________________________________________________________
Dados Clínicos:
7. Já teve Leishmaniose? Sim ( )
Não ( )
a. Se Sim ( grupo caso):
i.
Caso ativo ou histórico? Ativo ( ) Histórico ( )
ii.
Teve mais de uma vez (se sim, responder iii a viii para cada episódio):
Sim ( )
Não ( )
iii.
Data de diagnóstico:____/____/_______
iv.
Forma clínica: cutânea ( ) Mucosa ( )
v.
Local provável de infecção:____________________________________
vi.
Tratamento:_________________________________________________
vii.
Resposta ao tratamento: Sim ( )
Não ( )
viii.
Se caso histórico – cicatriz? Sim ( ) Não ( )
b. Se não (grupo controle) - confirmado por ausência de cicatriz
8. Já teve malária? Sim ( )
Não ( )
a. Se Sim quantas:_______________________
9. Já teve outras doenças? _____________________________________________
10. Prontuário da FMT-HVD: __________________________
60
Anexo D – Protocolo de Extração
a) Após centrifugação das amostras de sangue total para separação do plasma, o
“buffy-coat” será retirado e transferido para microtubo de 2,0 mL. b) Ao “buffy-coat”
serão adicionados 160 µL de tampão de proteinase K 5X (NaCl 5M; EDTA 0,5M pH
8,0), 40 µL de proteinase K, 40 µL de SDS 20% e 300 µL de H 2O destilada. Em
seguida, os tubos serão incubados em banho-maria a 37°C durante toda a noite.
Retirar os tubos do banho-maria e esperar resfriar a temperatura ambiente. c)
Adicionar 200 µL de NaCl 6M para precipitação de proteínas, centrifugando-se em
seguida a 13.000 rpm por 20 minutos, e após, transferir o sobrenadante para um
microtubo de 1,5 mL. Centrifugações adicionais (13.000 rpm durante 10 e 5 minutos
respectivamente) serão realizadas até a remoção completa das proteínas residuais,
sendo o sobrenadante dividido em dois novos tubos de 1,5 mL. d) Adicionar em cada
tubo 900 µL de etanol 99,5% (temperatura ambiente). Deixar o DNA precipitar
invertendo o tubo gentilmente por, no máximo, 2 minutos. Após esta etapa, o DNA
precipitado será lavado mais uma vez com etanol a 70%. e) Após remover o etanol,
com as paredes do tubo já secas, ressuspender o DNA em 200 µL de H 2O destilada.
f) Em seguida, realizar leitura para quantificação do DNA, e aliquotar as amostras,
armazenando-as em temperatura de -70 °C.
61
ANEXO E – Minuta de Artigo
Associação Genética de Polimorfismos em IL-1b e FLI-1 com Susceptibilidade
para Leishmaniose Cutânea numa População Caso-Controle do Estado do
Amazonas
Karolina da Costa Sabino1, Luciane Macedo de Souza1, Priscila Bentes Sousa1,
Rajendranath Ramasawmy2.
1Mestre
em Doenças Tropicais e Infecciosas - Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical; Universidade do Estado do Amazonas/ Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado.
2Doutor
em genética, Pesquisador da Fundação de Medicina Tropical Doutor Heitor Vieira Dourado.
Resumo
Nas áreas onde a leishmaniose é considerada endêmica, somente uma fração da
população exposta ao parasita desenvolve a doença, sugerindo que fatores genéticos
tenham um papel fundamental nesse contexto. Esse estudo teve como objetivo
verificar o papel de polimorfismos genéticos em IL-1b e FLI-1 associados com
leishmaniose cutânea (LC) em uma amostra populacional do estado do Amazonas.
Amostras de 774 indivíduos, sendo 392 indivíduos com leishmaniose cutânea e 382
indivíduos sem a doença foram genotipadas para os SNPs IL-1b_rs1143634,
IL1b_rs16944, FLI1_rs619521, FLI1_rs531894 e FLI1_rs7930515 pela técnica de
PCR-RFLP. Não foram encontradas diferenças significativas nas frequências alélicas
e genotípicas para os SNPs IL-1b_rs1143634, FLI1_rs619521 e FLI1_rs531894 entre
os grupos estudados. No entanto, para o SNP IL1b_rs16944, foram detectadas
diferenças significativas na distribuição alélica e genotípica do polimorfismo entre os
grupos caso e controle. Para o SNP rs7930515 de FLI-1 foi observada uma tendencia
à associação para LC (P=0.036). Os resultados obtidos no presente estudo reforçam
o papel dos genes IL1-b e FLI-1 associados com resistência ou susceptibilidade a LC.
Introdução
A leishmaniose, causada por um parasita celular obrigatório pertencente ao
gênero Leishmania, representa um grupo de doenças com um amplo espectro clínico
e diversidade epidemiologica (1,2). As manifestações variam de úlceras cutâneas
leves à forma letal, com acometimento visceral (2–4).
No estado do Amazonas, as formas mais comuns de manifestação são
leishmaniose cutânea (LC) e mucosa (LM), que são causadas principalmente por
Leishmania guyanensis. Em áreas endêmicas para leishmaniose, apenas uma
pequena fração dos indivíduos expostos desenvolve a doença, sugerindo que fatores
62
genéticos tenham um papel fundamental nesse contexto, somado a a fatores
ambientais, genética do hospedeiro e cepa do parasita possam estar envolvidos na
susceptibilidade à doença (5–7).
Nos últimos anos, muito se tem focado na função dos polimorfismos de
nucleotídeo único (SNPs) em citocinas e sua associação com doenças em humanos
(8).
A interleucina-1 (IL-1) pertence ao grupo de citocinas pro-inflamatórias (IL-1)
do tipo Th1, e tem papel chave na resposta inflamatória com efeitos pleiotrópicos em
muitas células e vias de sinalização, tendo um papel importante no desenvolvimento
da patologia. IL-1 consiste de um grupo de três moléculas nomeadas IL-1 alfa, IL-1
beta e IL-1 receptor antagonista (9).
Polimorfismos genéticos em IL-1b estão associados com a susceptibilidade a
doenças autoimunes graves, inflamatórias e infecciosas tais como HIV, TB, gastrite
crônica associada com Helicobacter pylori, esclerose múltipla, lupus eritematoso
sistêmico, malária e leishmaniose (8,10–14).
Polimorfismo em IL-1b -511 C/T foi associado com risco para desenvolver a
doença em pacientes infectados por L. mexicana (14).
Outro importante gene envolvido no controle da susceptibilidade da
leishmaniose e que apresenta participação no processo de cura das lesões é o FLI-1.
Pertencente à família ETs de fatores de transcrição, é preferencialmente expresso em
linhagens de células hematopoiéticas e células endoteliais vasculares (15).
Resultados apresentados por Asano et al. estabelecem o gene FLI-1 como um
regulador chave na homeostase da expressão de colágeno na pele, e, portanto, pode
atuar na via de cicatrização das lesões. Além disso, o estudo demonstra que o domínio
C-terminal do FLI-1 tem um papel essencial no controle da expressão de colágeno in
vivo (16). Ainda, Castellucci et al. demonstraram associação entre polimorfismos em
FLI-1 e susceptibilidade para leishmaniose cutânea causada por L. braziliensis (17).
A importância de IL-1b e FLI-1 na resposta imune sugere que polimorfismos
nesses genes podem influenciar na resistência ou susceptibilidade de um indivíduo
para desenvolver a doença. Dessa maneira, SNPs em IL-1b e FLI-1 foram
investigados com associação para LC em uma população caso-controle do estado do
Amazonas.
Metodologia
63
- Pacientes e controles
Para
análise
dos
SNPs
IL-1b_rs1143634,
IL1b_rs16944,
FLI1_rs619521,
FLI1_rs531894 e FLI1_rs7930515, um total de 392 indivíduos com a manifestação
clínica da doença para compor o grupo caso, recrutados exclusivamente no
ambulatório de dermatologia da FMT-HVD por demanda espontânea. Foram
admitidos apenas pacientes com leishmaniose cutânea que tiveram seu diagnóstico
confirmado através do exame de escarificação da lesão; e 382 indivíduos sem sinais
e sintomas de leishmaniose cutânea para o grupo controle, provenientes de áreas
endêmicas adjacentes às rodovias AM-010 e BR-174, de onde procedeu a maioria
dos indivíduos do grupo caso.
- Coleta da amostra e extração de DNA
Amostras de sangue periférico (5 mL) foram coletadas de pacientes e controles em
tubo contendo ácido etilenediaminetetraacetico (EDTA) como anticoagulante. O DNA
genômico foi extraído a partir do creme leucocitário com o kit comercial de extração
de DNA (WIZARD®, Promega Corporation, EUA), de acordo com as instruções
sugeridas pelo fabricante ou pela técnica de “salting-out”, conforme protocolo de
Sambrook et al. com algumas modificações(18).
- Genotipagem
A genotipagem foi realizada pela técnica de PCR-RFLP (Reação em Cadeia da
Polimerase - Análise clássica de comprimento do fragmento de restrição) para
descriminação alélica. Foi realizada a amplificação das sequências gênicas que
incorporam as regiões de mutação utilizando-se a técnica de PCR Convencional. Os
pares de iniciadores usados, bem como as enzimas de restrição, os produtos de PCR,
Temperatura de anelamento e concentração de MgCl2 estão descritos na Tabela 1. A
PCR foi realizada num volume final de 25 µL contendo 50 ng de DNA genômico, 1X
PCR buffer, MgCl2, 40uM de dNTP, 0,2 µM de cada iniciador e 1U de Taq polimerase.
As condições de PCR incluíram um passo inicial de desnaturação por 5 min a 94ºC,
seguido de 40 ciclos de desnaturação por 30s a 94ºC, anelamento por 30s à
temperatura específica, extensão por 30s a 72ºC; e uma extensão final por 7 min. Um
64
volume de 10µL de PCR foi digerido com a enzima de restrição correspondente. Os
fragmentos foram identificados em gel de agarose 2% contendo brometo de etídio sob
luz ultravioleta.
- Análise Estatística
Foi realizado o cálculo das frequências de cada polimorfismo nos grupos caso e
controle e analisou-se o valor de P pelo teste exato de Fisher e X2 através do programa
estatístico SPSS, considerando um valor de p<0.05 como estatisticamente
significativo.
Tabela 1. Condições gerais usadas na reação de PCR-RFLP.
MARCADOR
INICIADORES
Ta
(°C)
MgCl2
(mM)
PRODUTO
FRAGMENTOS
ENZIMA
DE PCR
DA DIGESTÃO
IL1b
rs16944
(C/T)
F: 5' TGG CAT TGA TCT GGT TCA TC 3'
R: 5' GTT TAG GAA TCT TCC CAC TT 3'
53
2,0
305 pb
AvaI
C: 190/115
T: 305
IL1b
rs1143634
(C/T)
F: 5' GTT GTC ATC AGA CTT TGA CC 3'
R: 5' TTC AGT TCA TAT GGA CCA GA 3'
53
2,0
250pb
TaqαI
C: 136/114
T: 250
FLI1
rs7930515
(A/C)
F: 5' GGG TAA GTG GCC TCG TTG CAC GAG 3'
R: 5' GGC GCT AGG GAT CTG TGC GGA CGG 3'
62
4,0
243 pb
BfaI
A: 139/97/7
C: 236/7
FLI1
rs619521
(A/G)
F: 5' AGC TAG GCA CAG GTG CAC CTA GAC 3'
R: 5' CCT GAA GGT GGG TGC CTT GGT TTC 3'
62
4,0
324pb
Pvu II
G: 180/144
A: 324
FLI1
rs531894
(A/G)
F: 5' TAA GGA AGT GAA TAT CCC AGT CCT GTT 3'
R: 5' ATG AGG AAG GTG TCT ACC TTC CTG 3'
62
3,2
286pb
Alu I
G: 147/97/42
A: 244/42
Resultados
- Características Gerais da População em Estudo
Foram recrutados 392 indivíduos com a manifestação clínica da doença para compor
o grupo caso. Desse total, 311 (79%) eram do masculino e 80 (20%) do sexo feminino.
A idade teve uma variação de 5-70 anos de idade com média de 32,0 anos.
Adicionalmente, analisou-se a média de idade de acordo com o sexo, tendo-se
65
observado a mesma média (32,0 anos) tanto para o gênero masculino quanto
feminino. Para compor o grupo controle, foram recrutados 382 indivíduos sem sinais
e sintomas de leishmaniose cutânea, sendo 225 (59%) do sexo masculino e 157 (41%)
pertencente ao feminino. A idade dos indivíduos do grupo controle variou de 5-89 anos
de idade, com uma média de 36,0 anos. Novamente, analisou-se a média de idade
associada ao gênero, obtendo-se média de 38,0 anos para o gênero masculino e 34,0
anos para o gênero feminino. A tabela 2 sumariza a análise descritiva da população
caso-controle quanto ao sexo e idade.
Tabela2. Características gerais da população caso-controle em estudo.
Sexo (%)
Masculino
Feminino
Dado faltante
Média de idade – Anos (± DP)
Quanto ao sexo
Masculino
Feminino
CASO
CONTROLE
n= 392
311 (79)
80 (20)
1 (3)
n= 382
225 (59)
157(41)
...
32 ± 14.1
36 ± 17.7
32 ± 13.7
32 ± 15.5
38 ± 17.6
34 ± 17.5
DP = Desvio Padrão
- Genotipagem, HWE e DL
Os marcadores analisados apresentaram-se em HWE, com exceção do
marcador FLI1_rs145675082, que por não estar em equilíbrio foi excluído da análise.
Quanto à genotipagem, esta foi realizada por PCR-RFLP conforme ilustrado nas
figuras 1 e 2; e apresentou êxito ≥90% para todos os marcadores testados.
66
1
2
Figura 1. Padrão eletroforético da PCR-RFLP para os SNPs IL1-B +3953 C/T e IL1-B -511 C/T
respectivamente. M: marcador de 100 pb;
Figura 2. Padrão eletroforético da PCR-RFLP para os SNPs FLI1_rs7930515, FLI1_rs619521 e
FLI1_rs531894 respectivamente. M: marcador de 100 pb;
Análise para verificar o DL entre os SNPs dos genes IL1B e FLI-1 foi realizada
utilizando-se para cálculo o parâmetro r2, conforme ilustra a figura 3. A análise do DL
confirmou independência para todos os SNPs testados.
As frequências alélicas e genotípicas para os marcadores IL1b_rs1143634 e
IL1b_16944 do gene IL-1b estão descritas na tabela 3.
Conforme análise, não foi observada evidência de associação do marcador
IL1b_rs1143634 com LC na amostra populacional estudada, pois não foram
observadas diferenças estatisticamente significativas nas frequências alélicas e
genotípicas quando foram comparados os grupos caso e controle para os três
modelos de comparação que foram aplicados (genotípico, alélico e de dominância),
todos com valores superiores a 0.05.
67
A
B
r2
r2
Figura 3. Análise de desequilíbrio de ligação entre os SNPs dos genes IL-1b e FLI1 respectivamente.
Para o SNP IL1b_16944, análise da distribuição das frequências alélica,
genotípica e de dominância foram aplicadas entre os grupos caso e controle,
observando-se evidência positiva de associação desse SNP (modelo aditivo P=0.026
e dominante P=0.027) com LC na amostra estudada.
Tabela 3. Comparação das distribuições das frequências genotípicas e alélicas para
os marcadores IL1b_rs16944 e IL1b_rs1143634.
GRUPO
CASO
n= 374 (%)
GRUPO
CONTROLE
n= 352 (%)
81 (22)
54 (15)
CT
183 (49)
167 (48)
TT
110 (29)
131 (37)
CC + CT
TT
264 (71)
110 (29)
221 (63)
131 (37)
CT + TT
CC
Alelo
C
T
IL1b_rs1143634
Genótipo
CC
293 (78)
81 (22)
IL1b_rs16944
Genótipo
CC
P
X2
OR (IC 95%)
0.026
...
...
Dominância
CT
TT
Alelo
C
T
0.027
1.42 [1.04 – 1.94]
298 (85)
54 (15)
0.036
0.66 [0.45 – 0.96]
345 (46)
403 (54)
n= 388 (%)
275 (39)
429 (61)
n= 371 (%)
0.007
1.34 [1.084-1.646]
296 (76)
282 (76)
85 (22)
7 (2)
78 (21)
11 (3)
677 (87)
99 (13)
642 (87)
100 (13)
1.15
0.56
...
0.17
0.68
...
68
Para o gene FLI1, não foram observadas evidências de associação dos
marcadores FLI1_rs531894 e FLI1_rs619521 com LC na amostra populacional
estudada (P>0.05) para os três modelos de comparação que foram aplicadas
(genotípico, alélico e de dominância).
Tabela 4. Comparação das distribuições das frequências genotípicas e alélicas para
os marcadores FLI1_rs7930515, FLI1_rs531894 e FLI1_rs619521.
GRUPO
CASO
GRUPO
CONTROLE
n= 347 (%)
n= 335 (%)
AA
9 (3)
20 (6)
AC
144 (41)
142 (42)
CC
194 (56)
173 (52)
Dominância
AA + AC
CC
153 (44)
194 (56)
162 (48)
173 (52)
338 (97)
9 (3)
315 (94)
20 (6)
345 (46)
403 (54)
n= 354 (%)
275 (39)
429 (61)
n= 316 (%)
131 (37)
169 (48)
54 (15)
114 (36)
160 (51)
42 (13)
0.77
0.68
...
431 (61)
277 (39)
388 (61)
244 (39)
0.19
0.66
...
n= 337 (%)
n= 318 (%)
87 (26)
156 (46)
94 (28)
76 (24)
154 (48)
88 (28)
0.40
0.82
...
330 (49)
344 (51)
306 (48)
330 (52)
0.09
0.76
...
FLI1_rs7930515
P
X2
OR (IC 95%)
Genótipo
AC + CC
AA
Alelo
A
C
FLI1_rs531894
Genótipo
AA
AG
GG
Alelo
A
G
FLI1_rs619521
Genótipo
AA
AG
GG
Alelo
A
G
0.075
...
0.28
0.84 [0.62 – 1.14]
0.036
2.38 [1.07 – 5.32]
0.10
1.23 [0.96 – 1.56 ]
69
Para o SNP FLI1_rs7930515 também foram aplicadas análises da distribuição
das frequências alélica, genotípica e de dominância entre os grupos caso e controle,
podendo-se observar valores de P “boderline” (modelo aditivo P=0.075 e dominante
P=0.036), com OR de 2.38 [IC 95% 1.07 – 5.32], conforme tabela 4.
Discussão
As leishmanioses ainda são consideradas um grande problema de saúde
pública, representando um complexo de doenças com importante espectro clínico e
diversidade epidemiológica. Nas áreas onde a leishmaniose é considerada endêmica,
somente uma fração da população exposta ao parasita desenvolve a doença
(4,19,20).
Como a leishmaniose é uma doença infecciosa cuja susceptibilidade é em parte
controlada geneticamente, entende-se que esforços no sentido de se elucidar os
mecanismos moleculares de controle e interação patógeno/hospedeiro e os
mecanismos de desenvolvimento da doença tendem a contribuir de forma crítica para
um maior entendimento de sua patogênese, levando ao desenvolvimento de melhores
estratégias de diagnóstico, tratamento e prevenção.
Para avaliar o impacto de fatores genéticos em leishmaniose cutânea, neste
estudo optou-se por analisar SNPs em IL-1b e FLI-1 associados à LC, provenientes
da literatura, para replicação.
A população estudada neste projeto foi composta por pacientes com LC,
recrutados no ambulatório de Dermatologia da FMT-HVD por demanda espontânea,
provenientes de áreas endêmicas para leishmaniose no Amazonas, com destaque
para o ramal da Cooperativa e ramal do Pau-Rosa, com suas respectivas vicinais; e
indivíduos sem a doença, provenientes das mesmas áreas endêmicas dos casos.
De acordo com os achados no presente estudo, dos indivíduos acometidos com
LC, 79% eram do sexo masculino e 20% do sexo feminino. A média de idade para os
casos foi de 32 anos de idade. Nossos dados estão de acordo com os achados de
Benicio et al., onde foram observados 78% de indivíduos do sexo masculino e 22%
do sexo feminino, com média de idade de 29 anos (21).
Segundo o Manual de Vigilância da Leishmaniose Tegumentar Americana, a
doença atinge indivíduos do sexo masculino principalmente, em fase produtiva, o que
caracteriza o acometimento de indivíduos cuja principal atividade ocupacional está
70
associada à penetração em áreas de mata, desflorestamento, agropecuária ou
exercícios militares, tornando essa população altamente exposta à infecção por
Leishmania sp (19).
Para o grupo controle, procurou-se realizar emparelhamento por sexo e idade
de acordo com o grupo caso, obtendo-se 59% de indivíduos do sexo masculino e 41%
do sexo feminino, com idade média de 36 anos.
Ter um grupo controle com idade média superior ao caso é encarado como
fator positivo, pois dessa maneira tem-se uma maior segurança em trabalhar com um
grupo que ultrapassou a idade média do grupo caso, sob as mesmas condições de
risco, no entanto não desenvolveu a doença.
Polimorfismos em FLI-1 foram descritos pela primeira vez em associação com
L. major baseado em modelo murino (22). Sakthianandeswaren et al. validaram a
importância do FLI-1 na resolução e cicatrização das lesões e identificaram três
polimorfismos na região promotora deste gene, indicando-o como novo candidato
influenciando na resistência à L. major. Nesse estudo, observou-se que em
camundongos resistentes, o pico na expressão de FLI-1 em linfonodos na sexta
semana de infecção correspondia ao observado no pico fenotípico no mesmo período,
em que camundongos resistentes apresentaram estabilização e cicatrização da lesão.
Em contraste, as lesões presentes em camundongos susceptíveis, seis semanais
após infecção continuavam a crescer em tamanho e gravidade, possivelmente devido
à ausência de uma expressão aumentada de FLI-1.
Posteriormente, Castellucci et al., baseado no estudo citado anteriormente,
examinaram FLI-1 como um gene controlando LC causada por L. braziliensis num
estudo de associação baseado em família (17). No estudo de Castelluci et al., os SNPs
de FLI-1 foram genotipados inicialmente em 168 famílias nucleares compostas por
250 casos de LC e 87 casos de LM, todos provenientes de Corte de Pedra, área de
endemicidade para L. braziliensis, Bahia. Foi demonstrado associação do alelo C
(P=0.003; OR=1.64) no SNP rs7930515 e risco para LC, que após análise primária,
foi replicada numa segunda amostra de 402 casos de LC em 157 famílias nucleares
(P=0.014;OR=1.60) coletadas na mesma região.
No presente estudo, dentre os quatro SNPs genotipados para FLI-1, apenas
verificou-se tendência para associação com LC no SNP rs7930515 (modelo aditivo
p=0.075 e dominante p=0.036). Esta tendência à associação pode ser observada
71
entre o alelo C e susceptibilidade para leishmaniose cutânea pelo modelo de
dominância [p=0.036 OR=2.38 (IC 95% 1.07 – 5.32)].
Os dados observados no presente estudo corroboram com os achados de
Castellucci et al., em que o alelo C estava associado com risco para LC, no entanto
nossos achados podem apenas ser considerados como sinal positivo de associação,
uma vez que o valor de P apresentou-se “borderline”.
Esses dados, somados a outros estudos evidenciam a importância do gene FLI1 como candidato influenciando resistência/susceptibilidade na leishmaniose, além de
ter sido correlacionado com uma resposta de cura de lesão em modelo murino
(17,22,23).
Interleucina 1 (IL-1) pertence ao grupo de citocinas pro-inflamatórias do tipo
Th1, e tem papel chave como mediador da resposta inflamatória com efeitos
pleiotrópicos numa variedade de células e vias de sinalização, e tem função
importante no desfecho da condição patológica (9).
IL-1b é uma citocina com atividade pirogênica que é normalmente ativada em
resposta a uma infecção ou injúria (24). Os inflamassomas tem papel um importante
nesse contexto, devido sua função de promover a ativação de IL-1b através de vários
estímulos durante a infecção por micro-organismos (25).
Polimorfismos genéticos em IL-1b estão associados com susceptibilidade a
diversas doenças autoimunes, inflamatórias e infecciosas, dentre elas tuberculose,
gastrite crônica associada a Helicobacter pylori, HIV, esclerose múltipla, lupus
eritematoso sistêmico, malária e leishmaniose (8,10–14).
Existem dois polimorfismos bastante comuns no gene IL-1b influenciando a
expressão da citocina: um localizado no exon 5 (IL-1b 3953 C/T) e outro localizado na
região promotora (IL1-b -511 C/T) (26).
Fernández-Figueroa et al. demonstraram que o polimorfismo em IL-1b (-511
C/T) está associado com um alto risco de contrair a doença em pacientes infectados
com L. mexicana. Também foram capazes de demonstrar que pacientes com a forma
mais grave da doença e que albergam um maior número de parasitas de L. mexicana,
apresentam uma produção aumentada de IL-1b por monócitos in vitro, uma acentuada
expressão sérica de IL-1b e uma distribuição difusa de IL-1b nas lesões (14).
Estudo realizado para verificar associação do polimorfismo IL-1b -511 C/T com
LV, demonstrou que o alelo C pareceu conferir susceptibilidade a LV, enquanto a
72
presença do alelo T atuou como possível fator influenciador para resistência à doença
(26).
Esses achados corroboram com os do presente estudo, em que se observou
associação dos alelos C e T do polimorfismo IL-1b -511 C/T com susceptibilidade e
resistência, respectivamente, à LC. Pelo modelo de dominância, pode-se sugerir a
presença do alelo C conferindo risco [P = 0.027, OR=1.43 (IC 95% 1.04 – 1.94)] e o
contrário, do alelo T conferindo resistência [P = 0.036, OR = 0.66 (IC 95% 0.45 –
0.96)]. Moravej et al., que também obtiveram o mesmo perfil de associação desse
polimorfismo com LV, sugerem que indivíduos portadores do alelo IL-1b -511 C
produzem mais IL-1b do que os portadores do alelo T, resultando no desenvolvimento
da doença e resolução da lesão (26).
Ainda, segundo dados de Fernández-Figueroa et al., a distribuição de IL-1b nos
tecidos está associada à carga parasitária no hospedeiro, assim indivíduos com a
forma mais grave da doença, e que, portanto possuíam carga parasitária maciça,
apresentavam maiores níveis celulares de IL-1b. O oposto também foi observado (14).
Associação de IL1b 3953 C/T foi observada conferindo risco para
desenvolvimento da forma grave de malária em uma população de Gambia (12). Da
mesma forma, associação desse polimorfismo foi observada com susceptibilidade
para infecção por HIV (27). Mas não para leishmaniose visceral em uma população
iraniana (26).
Dados de Moravej et al. corroboram com os achados deste estudo, em que
também não foi possível encontrar associação do polimorfismo em IL-1b 3953 C/T
com LC (Modelo aditivo, P=1.15, X2=0.56).
Conclusão
Não foram observadas associações genéticas com a susceptibilidade/resistência à LC
para os SNPs IL-1b_rs1143634, FLI1_rs619521 e FLI1_rs531894 na população
estudada.
Foram detectadas diferenças estatisticamente significativas na distribuição alélica e
genotípica do polimorfismo em IL-1b -511 C/T (rs16944) entre os grupos caso e
controle, sugerindo associação do alelo C com susceptibilidade, e do alelo T com
resistência para LC.
73
O SNP rs7930515 de FLI-1 foi considerado como sinal positivo de associação,
podendo-se sugerir que o alelo C estava associado com risco para LC.
Os resultados obtidos no presente estudo reforçam o papel dos genes IL1-b e FLI-1
associados com resistência a LC.
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