UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA
INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO
JACIARA FAGUNDES DE SOUZA MARTINS
IDENTIFICAÇÃO DO FUNGO PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS
POR NANOSSONDAS DE OURO
São José dos Campos, SP.
2012
JACIARA FAGUNDES DE SOUZA MARTINS
IDENTIFICAÇÃO DO FUNGO PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS POR
NANOSSONDAS DE OURO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação
em Engenharia Biomédica da Universidade do Vale do
Paraíba, como complementação dos créditos necessários
para obtenção do título de Mestre em Engenharia
Biomédica.
Orientador: Prof. Dr. Leandro José Raniero
Co-orientadora: Profa. Dra. Renata de Azevedo Canevari
São José dos Campos, SP.
2012
Martins, Jaciara Fagundes de Souza. Identificação do Paracoccidioides brasiliensis
por nanossondas de ouro. Jaciara Fagundes. Orientador Prof. Dr. Leandro José Raniero, Coorientadora: Profa. Dra. Renata de Azevedo Canevari. São José dos Campos, 2012.
1. Diagnóstico: teste positivo/negativo
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica do
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, 2012.
1. Paracoccidioides brasiliensis, paracoccidioidomicose, nanopartículas de ouro,
DNA.
CDU:
Autorizo para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial desta dissertação,
por processos foto copiadores ou transmissão eletrônica, desde que citada á fonte.
Assinatura da Aluna:
Data da defesa: 30/11/2012
JACIARA FAGUNDES DE SOUZA MARTINS
“IDENTIFICAÇÃO DO PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS POR NANOSSONDAS DE
OURO”
Dissertação de Mestrado aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em
Engenharia Biomédica, do Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, do
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, São José dos
Campos, SP, pela seguinte banca examinadora:
Presidente: Prof. Dr. Airton Abrahão Martin (UniVap):____________________
Prof. Dr. Leandro José Raniero (UniVap) ______________________________
Claudia Barbosa Ladeira de Campos (UNIFESP): __________________________________
Profª. Drª. Sandra Maria Fonseca da Costa
Diretora do IP&D - Univap
São José dos Campos, 30 de novembro de 2012.
DEDICATÓRIA
À Deus
Senhor, se eu não puder ser o desejo.
Que eu seja o que desejas de mim.
Se eu não puder ser a árvore que dá frutos.
Que eu seja o arbusto que dá sombra.
Se eu não puder ser o rio que inunda a terra.
Que eu seja a fonte de dá de beber.
Se eu não puder ser uma estrela no céu.
Que eu seja uma luz que anima as esperanças.
Se eu não puder ser o teto que abriga a todos.
Que eu seja a porta que se abre a quem bate.
Se eu não puder ser a roseira carregada.
Que eu seja o perfume de uma flor.
Se eu não puder ser o livro que ensina.
Que eu seja a palavra que comove.
Se eu não puder ser toda a bondade do mundo.
Que eu seja bom como todo mundo espera.
Se eu não puder ser o sorriso que encanta.
Que eu seja a impressão que ele deixa.
Padre Orlando Gambi
AGRADECIMENTOS
A minha família pelo apoio e compreensão das horas ausentes nestes dois anos de pesquisa.
Ao Prof. Dr. Leandro José Raniero, por me dar a oportunidade de aprender e de adquirir
conhecimento em diversas metodologias até então desconhecidas. Obrigada por confiar em
minha capacidade para desenvolver este trabalho e também por vibrar diante de cada
resultado e assim motivar o desenvolvimento deste. Obrigada pelo incentivo, confiança,
paciência, compreensão e respeito com que me tratou esses anos. Tenho profunda admiração
por você!
Aos professores do LEVB que carinhosamente me auxiliaram durante esses anos de pesquisa,
ao Prof. Dr. Airton A. Martin, que me apresentou ao seu laboratório e me auxiliou no
primeiro projeto me encorajando à pesquisa, à Prof. Dra. Juliana Ferreira, apoiando-me
emocionalmente e cientificamente, fazendo-me acreditar em minha capacidade, à Prof. Dra.
Priscila Fávero pelas aulas de Física e por acreditar em meu potencial, Prof. Dr. Cláudio
Tellez pelas lindas mensagens de seus livros e pela ajuda em Química e à minha Coorientadora Prof. Dra. Renata Canevari pela dedicação, paciência e por sempre me ajudar sem
medir esforços. Ao Prof. Dr. Anderson Lobo e a Prof. Dra. Fernanda Roberta Marciano, por
não terem me deixado desistir do sonho (Mestrado).
Aos amigos do IPD que sempre farão parte de minhas lembranças deste momento mágico e
importante que foi meu Mestrado.
A amiga Laís Vieira, pela ajuda nos momentos de dificuldade e Carolina da Silva Carvalho
que pacientemente me encorajou a cada etapa do meu projeto. Aos alunos de iniciação
científica, João Lucas Rangel Silva, Ana Célia Fernandes, Tatiano Pereira Job e Maiara
Castilho que gentilmente colaboraram na realização dos experimentos. As amigas, Inglid
Fontoura, Jéssica Camila da Silva e Luciana Marques de Paula, que me fizeram apaixonar por
Biologia, observando tanta dedicação.
A pesquisadora Andréa Porto Carreiro Campos, da Divisão de Metrologia de Materiais do
INMETRO, pelas análises HRTEM, à Prof. Dr. Cláudia Barbosa Ladeira Campos pela doação
das amostras do P. brasiliensis e a Rubia Gravito pela ajuda na construção das referências.
A FAPESP pelo apoio financeiro.
RESUMO
O Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico causador da
paracoccidioidomicose, doença granulomatosa crônica com grande variedade de
manifestações clínicas localizadas ou disseminadas que podem evoluir para a letalidade. Este
fungo tem a capacidade de aderir, invadir barreiras impostas pelos tecidos do hospedeiro. Os
dados epidemiológicos mostram que sua principal incidência se concentra nos países da
América do Sul. A similaridade histopatológica com outras infecções fúngicas torna o
diagnóstico do P. brasiliensis mais complexo. Portanto, o objetivo deste trabalho foi realizar a
identificação da presença do P. brasiliensis utilizando nanossondas de ouro e uma sequencia
de DNA como uma nova ferramenta para detecção. Para isso, nanopartículas de ouro foram
sintetizadas por redução de cloreto de ouro por citrato de sódio e deste procedimento resultouse em uma solução vermelho-vinho com um máximo de absorção em 524nm, com formato
quase esférico, com diâmetro médio de 23nm ± 2nm. As sequências gênicas específicas do
DNA do P. brasiliensis utilizadas para a fabricação das nanossondas foram os genes RIB.28S
e o RIB.5,8S. As metodologias de detecção colorimétrica de DNA baseados em nanopartícula
de ouro escolhidos para a identificação do P. brasiliensis foram cross-linking e non-crosslinking. O cross-linking utiliza duas populações de nanossondas, que foram: SACTCCCCCGTGGTC/ S-GCGCACAAGTAGAGT para o gene 28S, e S-TCAGTGA/ STCCGTAGGTGAA para o gene 5,8S. O non-cross-linking usa apenas uma população de
nanossonda, onde utilizou-se a sonda S-GCGCACAAGTAGAGT para o gene RIB.28S, e a
sonda S-TCAGTGA para o gene RIB.5,8S. No método cross-linking, a coloração azul
representa o teste positivo e vinho para o negativo e non-cross-linking o inverso. A
sensibilidade do teste, em presença da sequencia de DNA teste, para as duas metodologias
utilizadas demonstrou eficácia na identificação do DNA do P. brasiliensis.
Palavras-chave: Paracoccidioides brasiliensis, paracoccidioidomicose, nanopartículas de
ouro, teste positivo/negativo, DNA.
ABSTRACT
The Paracoccidioides brasiliensis (P. brasiliensis) is a thermo dimorphic fungus that causes
paracoccidioidomycosis (PCM), which is chronic granulomatous disease with a variety of
clinical manifestations localized or disseminated that could lead to lethality. This fungus has
the ability to adhere and break through the body's barriers to infection. Epidemiological data
show that its main focus is concentrated in the countries of South America The similarity with
other fungal infections turns the P. brasiliensis histopathologic diagnosis more complex. The
aim of this study was to identify the P. brasiliensis presence by using gold nanoprobes, which
combines the gold nanoparticles with a DNA sequence for a new detection tool. For this, the
gold nanoparticles were synthesized by gold chloride reduction with sodium citrate and this
procedure resulted in a red wine solution. The absorption spectrum showed a maximum at
524 nm and the Transmission Electronic Microscopy revealed a spherical shape with a
diameter average of 23 nm ± 2 nm. The specific gene sequences of P. brasiliensis DNA used
to manufacture the nanoprobes were RIB.28S and RIB.5, 8S. The colorimetric detection of
DNA was based on cross-linking and non-cross-linking methodologies. The cross-linking
uses two populations of nanoprobes that were built using the sequences: SACTCCCCCGTGGTC / S-GCGCACAAGTAGAGT for RIB.28S gene and TCAGTGA-S /
S-TCCGTAGGTGAA for RIB.5,8S gene. The non-cross-linking methodology was done
using only one population of nanoprobe for RIB.28S gene was S-GCGCACAAGTAGAGT,
and for RIB.5.8S gene was S-TCAGTGA. The cross-linking method, the blue color represents
the positive test and the red wine color for negative, but for and non-cross-linking it is the
opposite. The test sensitivity, in the presence of DNA test sequence for both methodologies,
demonstrates the efficacy of the test for the identification of DNA P. brasiliensis .
Key-Words: Paracoccidioides brasiliensis, paracoccidioidomycosis, gold nanoprobe, tests
positive / negative DNA.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Diagrama de uma escala manométrica. ................................................................... 15
Figura 2: Distribuição geográfica da paracoccidioidomicose (Adolfo Lutz, 1908). ............... 19
Figura 3: Estrutura fúngica e a multiplicação celular. ............................................................. 20
Figura 4: Ulceração e irregularidade na mucosa do esôfago ................................................... 24
Figura 5: A) Lesão mamária ulcerada B) Resultado da biópsia .............................................. 25
Figura 6: A) TCAR evidenciando nódulos irregulares. B) Áreas de aumento irregulares ..... 26
Figura 7: Sequencia de DNA evidenciando sua estrutura DNA. ............................................ 28
Figura 8: Mecanismo de detecção das nanossondas de DNA ................................................. 29
Figura 9: Mecanismo de detecção das nanossondas de DNA. ................................................ 30
Figura 10: ISIS ajoelhada sobre o hieróglifo nebu. ................................................................. 31
Figura 11: Odontologia no Egito A) e B). ............................................................................... 31
Figura 12: Máscara de ouro para rejuvenescimento................................................................ 32
Figura 13: A) Paracelso - Alquimista e médico suíço (1493-1541). B) Paracelsus: O Ouro
recebe sua influência do Sol. .................................................................................................... 32
Figura 14: A) Michel Faraday Físico-químico inglês (1791-1867). ....................................... 34
Figura 15: Esquema de processos de floculação, sedimentação e coagulação que podem
ocorrer em sistemas coloidais. .................................................................................................. 35
Figura 16: A repulsão estérica (esquerda) e a eletrostática (a direita) .................................... 35
Figura 17: O Espectro eletromagnético da luz. ....................................................................... 38
Figura 18: Cores complementares. .......................................................................................... 39
Figura 19: Transição de interbanda para alta energia. ............................................................ 40
Figura 20: Esquema de movimentação dos elétrons livres. .................................................... 41
Figura 21: Ressonância Plasmônica nos elétrons. ................................................................... 42
Figura 22: Máximos de absorção no espectro UV-vis de nano partículas de ouro com formas
de nano esferas, nano estrelas e nano varetas de ouro. ............................................................. 43
Figura 23: Taça de Licurgo ..................................................................................................... 44
Figura 24: Células de levedura do isolado do P. brasiliensis.................................................. 46
Figura 25: Extração de DNA. .................................................................................................. 47
Figura 26: Espectrofotômetro NanoDrop, ND- 1000.............................................................. 48
Figura 27: Eletroforese em gel de agarose. A) solidificação e colocação do pente no gel, B e
C) Aplicação da amostra no gel, D) Conexão dos eletrodos na fonte, E) Eletroforese e F)
Detecção do DNA amplificado no transluminador. ................................................................. 49
Figura 28: Sequência completa do gene RIB.5,8S incluindo regiões intergênicas e sequências
parciais das regiões 18S e 28S de P. brasiliensis . Os primers ITS1 e OL5 estão sublinhados e
a sonda está destacada em negrito ............................................................................................ 50
Figura 29: Sequência completa do gene RIB.28S. Os primers desenhados pelo programa
PRIMER3 estão sublinhados e a sonda está destacada em negrito. ......................................... 50
Figura 30: Exemplificação de uma nanossonda ...................................................................... 52
Figura 31: Agitador magnético utilizado para a funcionalização da nanopartícula ................ 53
Figura 32: Eletroforese em gel de agarose do DNA total do P. brasiliensis por PCR............ 56
Figura 33: Amplificação por PCR Eletroforese em gel de agarose das sequências gênicas. .. 57
Figura 34: Síntese da nanopartícula de ouro através da redução por citrato ........................... 58
Figura 35: Espectro de absorção de UV-vis de nanopartículas de ouro. ................................. 59
Figura 36: Simulação dos tamanhos das nanopartículas através do programa MIEPLOT. .... 60
Figura 37: Imagem de HRTEM com amplificações a) 50nm; b) 5nm. ................................... 61
Figura 38: Distribuição dos tamanhos das partículas segundo HRTEM................................. 61
Figura 39: Espectro de absorção característico de nanopartículas funcionalizadas ................ 63
Figura 40: Bases purinas e pirimidinas C=N, C=O e C=C. .................................................... 63
Figura 41: Esquema de transições eletrônicas entre diferentes orbitais moleculares. ............ 64
Figura 42: Teste non-cross-linking colorimétrico do fragmento RIB.5,8S ............................. 66
Figura 43: Espectro de absorção dos testes positivo/negativo. ............................................... 67
Figura 44: Teste positivo/negativo do fragmento RIB.28S: 27P e 28N 30ng/ μL de DNA; 13P
e 14N 10ng/ μL. ........................................................................................................................ 68
Figura 45: Amostras após a adição de cloreto de sódio (NaCl) de 0,7 μL a 1M. ................... 68
Figura 46: Teste colorimétrico positivo/negativo cross-linking. ............................................. 69
Figura 47: Teste colorimétrico ................................................................................................ 70
Figura 48: Espectrofotometria das amostras 127 e 128........................................................... 70
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Absorbância, comprimento de onda e as cores complementares. ........................... 39
Tabela 2: Sequência dos iniciadores e sondas utilizadas para de gene, tamanho do amplicon e
seus respectivos programas de amplificação. ........................................................................... 49
Tabela 3: Quantificação do DNA Pb. ..................................................................................... 55
Tabela 4: Comparação do valor de concentração pelas duas metodologias ............................ 62
LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS
Abs
Absorbância
a.C.
antes de Cristo
Ag
Prata
Au
Ouro
AuNPs
Nanopartículas de ouro
DNA
Ácido desoxirribonucleico
DVLO
DerjaguimVerwaye Landau e Overbeek.
eV
Elétron Volts
NPs
Nanopartículas
OLITS
Nome dado a sequências gênica do P. brasiliensis neste estudo
P. brasiliensis Paracoccidioides brasiliensis
pb
Pares de bases
PCM
Paracoccidioidomicose
PCR
Reação em cadeia da polimerase
RNA
Ácido ribonucleico
RIB.28S
Nome dado à sequência gênica neste trabalho
RIB.5,8S
Nome dado à sequência gênica também neste trabalho
Rpm
Rotações por minuto
RPS
Ressonância plasmônica de superfície
TCAR
Tomografia computadorizada de alta resolução
UV
Ultravioleta
UV-vis
Região espectral do ultravioleta ao visível
A230
Absorção no comprimento de onda de 230 nm
A260
Absorção no comprimento de onda de 260 nm
σext
Coeficiente de extinção
σesp
Coeficiente de espalhamento
R
Raio da nanopartícula esférica.
X
Índice de refração de espalhamento
Sumário
1
Introdução.......................................................................................................................... 15
2
Revisão de literatura .......................................................................................................... 19
3
4
5
2.1
Paracoccidioides brasiliensis .................................................................................... 19
2.2
Polimorfismo genético ............................................................................................... 21
2.3
Achados Clínicos ....................................................................................................... 23
2.4
Tipos de diagnóstico .................................................................................................. 25
2.4.1
Tomografia Computadorizada de Alta Resolução.............................................. 25
2.4.2
Teste diagnóstico ELISA clássico ...................................................................... 26
2.4.3
Diagnóstico Micológico ..................................................................................... 26
2.5
Nanossondas de DNA ................................................................................................ 27
2.6
A história do ouro ...................................................................................................... 30
2.7
Ouro coloidal ............................................................................................................. 34
Objetivos ........................................................................................................................... 45
3.1
Objetivo geral ............................................................................................................ 45
3.2
Objetivos específicos ................................................................................................. 45
Materiais e Métodos .......................................................................................................... 46
4.1
Cultura do Paracoccidioides brasiliensis .................................................................. 46
4.2
Extração do DNA....................................................................................................... 46
4.3
Qualidade e quantificação do DNA ........................................................................... 47
4.4
Reação em cadeia da polimerase (PCR) .................................................................... 48
4.5
Ativação dos oligonucleotídeos tiolados ................................................................... 50
4.6
Síntese das nanopartículas de ouro ............................................................................ 51
4.7
Síntese de Nanossondas de ouro ................................................................................ 51
4.8
Métodos cross-linking e non-cross-linking................................................................ 53
4.9
Diagnóstico para identificação do P. brasiliensis - Teste Positivo/Negativo ............ 54
Resultados e Discussão ..................................................................................................... 55
5.1
Nanopartículas de ouro .............................................................................................. 57
5.2
Síntese de caracterização de nanossonda ................................................................... 62
5.3
Teste Positivo/negativo para detecção do P. brasiliensis .......................................... 64
5.3.1 Método non-cross-linking ........................................................................................ 65
5.3.2 Teste com a sequência gênica RIB.5,8S .................................................................. 65
5.3.3 Teste com a sequência gênica RIB.28S ................................................................... 67
5.4
Método cross-linking para RIB.5,8S. e 28S. ............................................................. 68
5.5
Método cross-linking para o teste com a sequência gênica RIB.5,8S ....................... 69
5.6
Método cross-linking para o teste com a sequência gênica RIB.28S ........................ 69
6
Conclusões ........................................................................................................................ 72
7
Projetos futuros ................................................................................................................. 73
Referências ............................................................................................................................... 74
15
1 Introdução
O crescente interesse em materiais e dispositivos menores provocou na ciência uma
concentração de esforços a fim de se trabalhar na busca deste objetivo dando origem a uma
nova subdivisão para a tecnologia, a nanotecnologia. Esta nova tecnologia de produção e
aplicação de nanoestruturas em aparelhos, dispositivos e sistemas, explora as propriedades e
fenômenos envolvidos numa escala de 1 a 100 nm (1). A Figura 1 mostra alguns exemplos de
dimensões de estruturas conhecidas, onde podemos observar estes dispositivos são menores
que vírus.
Figura 1: Diagrama de uma escala manométrica.
Fonte: Escala (2).
O conceito de nanodiagnóstico incluso no ramo da bionanotecnologia aparece com o
desenvolvimento de novas metodologias e dispositivos em nanoescala com aplicações
biológicas, destacando-se os biossensores, que possibilitam a detecção de ácidos nucleicos,
entre outras aplicações (1).
Metais como o ouro, particularmente as nanopartículas (NPs), possibilitam o
desenvolvimento e o aprimoramento de métodos moleculares de diagnóstico revelando-se
bastante promissores (3). As NPs têm diâmetros entre 1-100 nm e podem ser encontradas
dispersas em meio sólido ou líquido (4). De todas as nanopartículas metálicas (Au, Pt, Ag,
etc), as de ouro (AuNPs) são as de maior interesse e há um estudo intensivo das suas
16
propriedades ópticas, elétricas e magnéticas. Geralmente nanopartículas magnéticas contidas
em um fluido magnético recebem atenção especial porque podem ser guiadas ou localizadas
em um alvo específico por campos magnéticos externos e são desejáveis em diversas
aplicações industriais como, por exemplo, nanossensores para monitoramento do solo (4,5).
Quando excitadas por um campo eletromagnético da luz incidente, estas
nanopartículas produzem o denominado efeito de ressonância plasmônica de superfície (SPR,
do inglês, Surface Plasmon Resonance), que consiste na oscilação coletiva de elétrons livres
na superfície da partícula, produzindo propriedades de absorção e dispersão elétricas intensas.
A ressonância plasmônica de superfície das nanopartículas de ouro é responsável pelas suas
cores intensas. Em solução, as nanopartículas de ouro monodispersas demonstram uma cor
vinho, com o pico da banda de SPR na região dos 520 nm. O oposto ocorre com uma solução
contendo nanopartículas de ouro agregadas demonstrando a cor azul, correspondendo a um
deslocamento do pico da banda de SPR para aproximadamente 600 nm (6, 7, 8).
Os principais métodos para síntese de nanopartículas de metais são: redução de
complexo organometálico (7), decomposição térmica ou fotoquímica do precursor (9),
redução do(s) ligante (s) (7) e síntese eletroquímica (8).
As nanopartículas (NPs) de ouro, com tamanhos e formas variadas, podem ser
sintetizadas em solução aquosa ou em solventes orgânicos (5). Em uma síntese típica, um sal
de ouro como, por exemplo, o AuCl3, é reduzido pela adição do citrato, agente redutor, que
conduz a nucleação dos íons às nanopartículas de ouro (10). Este método é o mais comum,
obtendo-se uma solução coloidal de NPs quase esféricas relativamente monodispersas com
um diâmetro entre 10 e 25 nm (10).
Estas nanopartículas podem ser ligadas a oligonucleotídeos tiolados por existir uma
interação química entre o enxofre e estas nanopartículas (11,12), obtendo assim as
nanossondas de ouro. As nanossondas são conhecidas também como nanossensores e suas
aplicações relacionadas à saúde são diversificadas como a integração entre nanotecnologia e
biologia produzindo excelentes resultados no diagnóstico molecular, na detecção de agentes
químicos/ biológicos e na bioengenharia (5,13). Para a fabricação das nanossondas é
necessário à funcionalização das nanopartículas. Esta ligação química entre o DNA e a
nanopartícula é feita através de grupamento tiol. Os tióis são semelhantes aos álcoois exceto
no fato de o átomo de oxigênio ser substituído pelo átomo de enxofre. Ao contrário dos
álcoois eles são ácidos, reagindo com bases e alguns metais, formando-se compostos
semelhantes a sais (11). Na fabricação das nanossondas utiliza-se uma sequência de DNA,
especifica a que se queria identificar ligada a um tiol. Geralmente usa-se um grupo com três
17
ou mais carbonos, fazendo com que o DNA fique afastado da nanopartícula mais dispersa no
meio líquido, facilitando esta combinação (6,11,14).
Um método de detecção colorimétrico de DNA baseado em nanossondas de ouro foi
descrito em 1996 por Mirkin e colaboradores (8). Estes autores utilizaram oligonucleotideos
de DNA de cadeia simples, que foram detectados por meio de duas nanossondas diferentes,
cada uma foi funcionalizada com um oligonucleotídeo complementar a uma das regiões do
DNA alvo (8).
Neste estudo foram utilizados dois métodos para a identificação do P. brasiliensis: o
cross-linking e o non-cross-linking. O método cross-linking consiste na hibridação do alvo
com duas nanossondas com sequências complementares a regiões adjacentes ao alvo de
interesse, em que uma das nanossondas estará ligada à extremidade 5’ de uma sequência e a
outra estará ligada à extremidade 3’. A ligação das nanossondas com o DNA alvo resulta na
formação de uma espécie de “rede”, promovendo assim a aproximação das nanopartículas de
ouro. Esta ligação altera a cor da solução de vermelho para azul, confirmando o resultado
positivo.
O método non-cross-linking utiliza uma única nanossonda (15). Esta ligação altera a
cor da solução de vermelho para azul, pois não há a ligação entre as fitas complementares, o
que caracteriza o teste negativo. Neste método, a presença em solução de ácidos nucleicos de
sequência complementar com a nanossonda mantém a estabilidade química do sistema e a
solução mantém a cor vermelha inicial. Esta metodologia de detecção colorimétrica, cuja
agregação das nanossondas de ouro é induzida pelo aumento da concentração de sal na
solução, é denominada non-cross-linking e atualmente é utilizado para a detecção de
sequências específicas de DNA. (6,14,15).
O P.brasiliensis é encontrado em regiões da América do Sul e Central, com casos
relatados do norte do México ao sul da Argentina e também com alta prevalência no Brasil
(3,19). A característica das lesões cutâneas causadas pela Paracoccidioidomicose é
consequência da interação parasita-hospedeiro, incluindo a sua patogênese. As múltiplas
lesões provocadas pelo P. brasiliensis sugerem que sua disseminação seja hematogênica e
este fato reflete a gravidade da doença. A dinâmica de evolução destas lesões e também o
critério dermatológico utilizado podem ser caracterizados por padrões morfológicos devido ao
polimorfismo clínico da Paracoccidioidomicose (19). Estas lesões frequentemente se
manifestam de outras formas, tais como a Paracoccidioidomicose pulmonar e a mastite.
A Paracoccidioidomicose pulmonar apresenta como via primária de infecção o trato
respiratório por meio da inalação de esporos ou partículas do fungo. Desse modo, vários sítios
18
anatômicos são acometidos pela disseminação linfohematogênica, inclusive a mucosa oral
(19,20). A manifestação pela mastite causada por Paracoccidioidomicose leva a uma maior
atenção ao diagnóstico mamário por não ser uma doença comum, uma vez que os testes
considerados de grande especificidade e sensibilidade não identificam a presença do P.
brasiliensis. Os exames clínicos de coagulação, ureia e creatinina, bem como a radiografia de
tórax podem ser encontrados sem a presença do fungo. Os testes de BAAR (exame de
escarro), ELISA e broncoscopia geralmente são eficientes ao diagnóstico da PCM, entretanto
há relatos na literatura de resultados negativos (20).
O diagnóstico laboratorial micológico da Paracoccidioidomicose, assim como, em
outras micoses é considerado como padrão ouro, pois esses métodos isolam o agente
etiológico causador da doença em cultura para análise histológica. A sorologia evidencia a
necessidade do diagnóstico correto dos processos infecciosos, tendo importância no auxílio do
diagnóstico, bem como, na avaliação da resposta ao tratamento e as recidivas da doença (17).
O Elisa Clássico é o exame mais utilizado na prática clínica devido a sensibilidade e
especificidade superiores a oitenta por cento (80%) e noventa por cento (90%),
respectivamente (20,21).
A Tomografia Computadorizada de Alta Resolução (TCAR) pode ser utilizada na
identificação dos nódulos, mas não é empregada como única técnica, por não ser um
diagnóstico específico da paracoccidioidomicose. Desta forma tornam necessários testes
micológico e/ou sorológico para o correto diagnóstico (19).
Neste trabalho, as nanossondas de ouro serão utilizadas na detecção do P.
brasiliensis utilizando as cross-linking e o non-cross-linking, mostrando uma nova
possibilidade de detectar este fungo.
19
2 Revisão de literatura
2.1
Paracoccidioides brasiliensis
O P. brasiliensis é um fungo termo-dimórfico, ou seja, ele passa de micélio para
levedura a uma temperatura de 37ºC. Este fungo é o agente causador da PCM ou blastomicose
sul americana, que é uma micose sistêmica de alta prevalência no Brasil (3,22) (Figura 2). O
primeiro cultivo e isolado do P. brasiliensis foi apresentado por Adolf Lutz em 1908.
Utilizando as condições in vitro esta espécie foi classificada em Zynonema brasiliensis e no
gênero Zymonema. O P. brasiliensis pertence ao Reino Fungi; Gênero Paracoccidioides;
Espécie Paracoccidioides brasiliensis (23,24).
Figura 2: Distribuição geográfica da paracoccidioidomicose (Adolfo Lutz, 1908).
Fonte: Shikanai (25)
A variabilidade entre os isolados do P. brasiliensis pode ser evidenciada até mesmo a
olho nu, com diferenças morfológicas significativas no crescimento dos isolados, tais como,
20
tamanho das células, o aspecto macroscópico das culturas em meio sólido, e ainda a
velocidade de crescimento. A Figura 3 mostra a multiplicação celular deste fungo (23,24).
Figura 3: Estrutura fúngica e a multiplicação celular.
Fonte: Marques (26).
A infecção humana pelo P. brasiliensis ocorre normalmente através da inalação ou
contato de tecidos lesados com conídios de forma miceliana do fungo que crescem no solo,
água e plantas. O principal órgão afetado é o pulmão, podendo a doença ser disseminada,
posteriormente, pela via hematogênica.
As formas clínicas da doença são: aguda (juvenil) e crônica (adulta) (27). Na forma
aguda, a doença progride rapidamente disseminando-se pelo sistema reticulo-endotelial (baço,
fígado, linfonodos, medula óssea). Esses pacientes raramente apresentam lesões na pele ou
pulmão. A forma crônica pode afetar vários órgãos, principalmente os pulmões e a mucosa
orofaríngea, estes pacientes podem também apresentar granulomas epitelióides compactos
com poucos fungos nestes órgãos. Essa é a forma mais comum de apresentação da doença,
com contágio ocorrendo principalmente em indivíduos adultos do sexo masculino. Esses
pacientes são classificados como pertencentes ao polo hiperérgico ou positivo da doença.
(27).
21
2.2
Polimorfismo genético
A composição genética do P. brasiliensis é pouco conhecida e a informação sobre o
tamanho do seu genoma e a organização cromossômica é escassa. A caracterização do
genoma e a determinação do número de cromossomos deste fungo foram determinadas por
alguns estudos da literatura por meio das técnicas de eletroforese em campo pulsátil (Pulse
Field Gel Eletrophoresis-PFGE) e por microscopia de fluorescência confocal (MFC),
respectivamente. O tamanho do genoma estimado por PFGE foi de aproximadamente 30Mb e
os resultados obtidos por MFC forneceram forte evidência para a natureza haploide/diploide
ou mesmo aneuplóide do P. brasiliensis , sendo portanto inconclusivos (43). O padrão de
eletroforese revelou polimorfismo cromossomal no fungo que apresenta, de acordo com o
isolado analisado, de quatro a cinco moléculas de DNA cromossomais e marcadores
moleculares variando de 2 a 10 Mb (43, 44). Perfis distintos de cariótipos mostraram
tamanhos de bandamento (técnica) variáveis, caracterizando polimorfismo no comprimento
do cromossomo, o que torna difícil a comparação do padrão de bandamento entre os isolados
de P. brasiliensis (45). Em adição, a análise de RAPD (polimorfismo de DNA amplificado ao
acaso) tem mostrado uma grande variabilidade entre os diferentes isolados de fungos, com
grandes diferenças genotípicas apesar de possuírem a mesma correlação com respeito a
virulência, distribuição geográfica e suscetibilidade ou resistência a drogas (46).
Baseado no sequenciamento de DNA de aproximadamente 50 Kb, o genoma desta
espécie mostrou uma densidade de um gene a cada 3,5 a 4,5 Kb, sugerindo um total de cerca
de 7.500 a 9.000 genes (47). Estas observações foram posteriormente confirmadas com um
aumento da amostra, incluindo isolados ambientais (43). Com o objetivo de detectar os genes
diferencialmente expressos em P. brasiliensis, um estudo intitulado “Functional and
Differential Genome Project of P. brasiliensis ’’ desenvolvido por pesquisadores do Brasil,
revelou que sessenta e oito por cento (68,5%) dos genes do P. brasiliensis são relacionados a
genes do genoma de outros fungos e cinquenta e dois por cento (52,9%) são ortólogos aos
genes da espécie Aspergillus nidulans, refletindo a estreita relação filogenética deste fungo
filamentoso com o P. brasiliensis. Em adição, trinta por cento (30,2%) dos genes encontrados
no P. brasiliensis representa novos genes, os quais são únicos para este organismo (46).
Os métodos tradicionais para diagnóstico da PCM têm sido realizados por meio da
identificação microscópica do P. brasiliensis e do diagnóstico da sorologia que depende da
presença de anticorpos, entre eles o gp43, que consiste na principal glicoproteína antigênica
secretada pelo P. brasiliensis e é o anticorpo referência para Paracoccidioidomicose (48).
22
Contudo, este método de detecção apresenta alguns problemas, tais como o desaparecimento
do anticorpo gp43 da circulação durante o tratamento, resultados falsos negativos e
ocasionalmente reações cruzadas, provavelmente devido ao polimorfismo presente no gene
GP43 (48, 49). Desse modo, várias técnicas moleculares de identificação e diagnóstico do
fungo, principalmente a técnica de PCR sozinha ou em combinação com outras metodologias,
estão sendo incorporadas na rotina dos laboratórios clínicos com o objetivo de aumentar a
eficácia dos métodos microbiológicos e imunobiológicos correntes. Embora o diagnóstico
morfológico e sorológico do P. brasiliensis tem sido realizado, a técnica de PCR é uma
importante ferramenta para a detecção de fungos em pacientes com reações sorológicas
negativas, sendo a concentração de antígeno e/ou anticorpo se apresenta baixa, fazendo ser
difícil determinar o melhor método terapêutico para o paciente. Portanto, métodos
moleculares desenvolvidos para auxiliar no diagnóstico da Paracoccidioidomicose juntamente
com a descoberta de marcadores específicos na identificação do P. brasiliensis serão
extremamente uteis tanto no diagnóstico quanto na terapêutica e em estudos epidemiológicos.
O gene GP43 foi o primeiro gene caracterizado em P. brasiliensis (50), sendo o exon
2 a região polimórfica mais importante do genoma deste fungo. Recentemente, vários outros
genes têm sido estudados nesta espécie para a detecção de polimorfismos genéticos. No
estudo de Matute et al. (51), oito regiões de cinco genes nucleares foram analisadas de 65
isolados representando seis áreas endêmicas: genes CHS2 (promotor-exon 1 e exon 2-4), bglucan synthase (exons 2 e 3), a-tubulin (exons 2-4), FKS (exons 2-3) e GP43 (promotorexon1 e exon2). Entre essas regiões, os genes FKS e CHS2 não foram relevantes devido a seu
baixo polimorfismo. Este estudo indicou que P. brasiliensis consiste de no mínimo três
diferentes espécies filogenéticas previamente não conhecidas: PS1 (espécie 1), formada por
38 isolados; PS2 (espécie filogenética 2), incluindo seis isolados (cinco deles do Brasil e um
da Venezuela) e PS3 (espécie 3), composta por 21 isolados da Colômbia.
Outras regiões de DNA não codificantes também têm sido utilizadas com o propósito
de classificação, tais como a região do complexo de DNA ribossonal, internal transcribed
spacer (ITS) (52) e marcadores de microssatélites (53). As regiões ITS1 e ITS2 apresentam
baixo polimorfismo sugerindo que a maioria das sequências é consenso. Do mesmo modo, a
detecção de polimorfismos pela análise dos marcadores de microssatélites não discriminou as
diferentes espécies de fungos (53). Um estudo que avaliou sequências gênicas de 65 isolados
de P. brasiliensis revelou que os genes COB, RN1, RNS possuem alto polimorfismo,
permitindo assim descrever uma conexão filogenética mais precisa entre as espécies
relacionadas e os isolados.
23
Motoyama et al. (23) realizaram a clonagem e sequenciamento dos genes e regiões
intergênicas do DNA ribossomal 5,8S e 28S do P. brasiliensis , e a posterior identificação
molecular por PCR utilizando iniciadores específicos para estas regiões. Estes autores foram
capazes de discriminar entre P. brasiliensis e outros fungos patogênicos humanos. Com a
realização da PCR utilizando os iniciadores (primers) OL5 e ITS1 para o gene ribossomal
5,8S foi observado ausência de amplificação do DNA de todos os outros fungos, exceto o
DNA do P. brasiliensis, com um fragmento de 496 pb para todos os isolados analisados, e o
DNA do H. capsulatum, que apresentou amplificação de reação cruzada originando um
fragmento de aproximadamente 500 bp. Deste modo, com o objetivo de discriminar entre
essas duas espécies de fungo, estes autores utilizaram os iniciadores UNI-R e OL3, sendo este
último designado como específico para a sequência gênica 28S ribossomal do P. brasiliensis,
após análise de similaridade com sequências de outros fungos avaliados pelo GenBank. A
amplificação dessa sequência gerou um fragmento de 203 pb somente quando o DNA do P.
brasiliensis foi utilizado como molde. Os autores propuseram que deverá ser realizada duas
PCRs utilizando os pares de primers ITS1-OL5 e OL3-UNI-R para a identificação da espécie
P. brasiliensis (23,52-53).
2.3
Achados Clínicos
Existem inúmeros casos clínicos envolvendo a Paracoccidioidomicose, podendo ser
classificada de acordo com a região afetada.
-
Paracoccidioidomicose pulmonar;
A paracoccidioidomicose pulmonar crônica é frequentemente confundida com
neoplasia ou tuberculose. Os sintomas são de tosse crônica, fraqueza, disfagia, mal estar e
síndrome consumptiva (20). Nogueira et al. (20), descreve um quadro de PCM semelhante a
tuberculose. Durante a investigação clínica foi diagnosticada paracoccidioidomicose
pulmonar com fistula traqueo-esofágica, sinalizado com uma seta, conforme a (Figura 4)
mostrando a ulceração e irregularidade na mucosa do esôfago com orifício fistular nítido na
borda inferior.
24
Figura 4: Ulceração e irregularidade na mucosa do esôfago
Fonte: Nogueira (20).
-
Mastite por Paracoccidioidomicose.
A mastite por paracoccidioidomicose é uma patologia não frequente, com raros casos
relatados na literatura, mostrando a necessidade de uma melhor avaliação dos abscessos
mamários. Sendo a mastite queixa frequente nos ambulatórios de ginecologia, eles sugerem
atenção aos diagnósticos diferenciais (28).
O diagnóstico laboratorial pode ser realizado de três modos: demonstração
microscópica do seu agente etiológico em exame a fresco, biópsia ou exame histopatológico
(isolamento e identificação do fungo por meio do cultivo do material clínico) e por técnicas
sorológicas.
A Figura 5 A mostra a lesão mamária ulcerada e a Figura 5 B mostra o resultado da
biópsia indicando a presença do fungo semelhante a uma ”roda de leme”, sendo considerado o
tipo mais frequente na paracoccidioidomicose (28).
25
Figura 5: A) Lesão mamária ulcerada B) Resultado da biópsia
Fonte: Chambô (28).
2.4
Tipos de diagnóstico
Existem vários testes diferenciados para o diagnóstico da Paracoccidioidomicose,
sendo os mais citados: Tomografia Computadorizada de Alta Resolução, Teste diagnóstico
ELISA clássico e Micológico (25,28-30).
2.4.1
Tomografia Computadorizada de Alta Resolução
A Tomografia Computadorizada de Alta Resolução (TCAR) tem sido considerada o
melhor exame para a avaliação das doenças respiratórias ambientais e ocupacionais, com as
ressalvas de ser um método caro, menos disponível e que requer profissionais com formação
adequada para a correta interpretação dos achados de imagem, o que nem sempre é possível.
A radiografia do tórax apresenta limitada capacidade de avaliar doenças pulmonares
difusas, tornando a TCAR do tórax essencial para a avaliação dos pacientes com
paracoccidioidomicose pulmonar (29).
A Figura 6 A e B mostra o diagnóstico por TCAR podendo observar a presença de
nódulos irregulares de tamanhos e áreas variados.
26
Figura 6: A) TCAR evidenciando nódulos irregulares. B) Áreas de aumento irregulares
Fonte: Muniz (29).
2.4.2
Teste diagnóstico ELISA clássico
O teste ELISA Clássico geralmente é escolhido por apresentar alta sensibilidade em
estudos sobre a Paracoccidioidomicose e por ser utilizado para triagem sorológica em serviços
de hemoterapia e não ser invasivo. Entretanto, tendo em vista a alta sensibilidade da técnica
de ELISA, não pode ser descartada a possibilidade de reações cruzadas especialmente com
histoplasmose, leishmaniose e doença de Chagas comuns em algumas regiões do Brasil (30).
2.4.3
Diagnóstico Micológico
O diagnóstico micológico da Paracoccidioidomicose consiste na identificação da
forma leveduriforme típica do P. brasiliensis através do exame direto de lesões cutâneas ou de
lavados brônquicos, escarros e biópsias de pulmão dos pacientes. Entretanto, muitas vezes o
exame micológico não é capaz de mostrar a presença do fungo, uma vez que os sintomas são
parecidos com o de outras doenças fúngicas ou de bactérias, como é o caso da Mycobacterium
tuberculosis causadora da tuberculose.
Com
o
objetivo
de
se
padronizar
a
identificação
dos
casos
com
Paracoccidioidomicose, sugerem-se as seguintes definições: paciente com uma ou mais das
seguintes manifestações abaixo durante pelo menos quatro semanas, excluída a tuberculose e
outras doenças que cursam com quadro semelhante (25):
27
-
Tosse com ou sem expectoração e dispneia;
-
Sialorréia, odinofagia, rouquidão;
-
Lesão (ulcerada) na mucosa nasal ou oral;
-
Lesões cutâneas (úlceras, vegetações, nódulos, placas etc;)
-
Adenomegalia cervical ou generalizada, com ou sem supuração e fistulização;
-
Criança ou adulto jovem com hepatoesplenomegalia e/ou tumoração abdominal.
Nesses casos, a detecção de anticorpos contra os antígenos do fungo é de grande
importância para o diagnóstico ou, ainda, acompanhamento do paciente.
O principal antígeno na Paracoccidioidomicose é uma glicoproteína exocelular de 43
KDa (gp 43), a qual é capaz de reagir com cem por cento (100%) dos soros de pacientes com
esse tipo de micose (31). Assim sendo, essa glicoproteína é o principal componente secretado
do fungo que se liga à laminina murina, o que acarretaria um aumento da capacidade de
invasão e destruição de tecidos infectados, e é abundantemente detectada na fase
leveduriforme (32).
A maioria dos métodos atuais de diagnóstico molecular para a caracterização de
DNA e RNA ainda demandam tempo e requerem reagentes, equipamentos caros e
laboratórios altamente especializados. Portanto em países com menos recursos, ainda não é
viável a utilização da biologia molecular em rotina clínica, limitando os benefícios da era pósgenômica que poderia melhorar o atendimento a pacientes através da prevenção da doença
com eficiência e terapias personalizadas (32).
2.5
Nanossondas de DNA
Existe um interesse crescente em desenvolver técnicas de análise e detecção de DNA
nas mais variadas áreas da biotecnologia. A fabricação das nanossondas de ouro é a fusão de
duas tecnologias. Por um lado temos a síntese de AuNPs, pelo método de redução por citrato,
evidenciando todas as suas propriedades físicas e ópticas bem conhecidas (33). Por outro lado,
Storhoff descreveu a tecnologia de funcionalização de superfícies de ouro com
oligonucleotídeos tiolados, permitindo a utilização das nanopartículas em sistemas de
detecção de ácidos nucleicos, ou seja, sistemas utilizados nos métodos de hibridação (34).
28
O primeiro passo na fabricação de nanossondas é a funcionalização das
nanopartículas. Esta ligação química entre o DNA e a nanopartícula é feita através de
grupamento tiol. O DNA, ácido desoxirribonucleico, é uma estrutura composta de duas
cadeias de nucleotídeos, lado a lado, retorcidas sob a forma de uma dupla hélice (35). Cada
nucleotídeo é composto de uma base nitrogenada, um grupo fosfato e um açúcar, Figura 7. O
nome DNA é dado pelo açúcar presente em sua molécula, a desoxirribose, formada por um
anel de átomos de carbono e oxigênio. As bases nitrogenadas são assim designadas, pois são
formadas por anéis de carbono e nitrogênio. Os quatro tipos de bases: citosina (C) e timina (T)
que tem a presença de ligações formando um anel simples; adenina (A) e guanina (G) com
dois anéis (36).
Figura 7: Sequencia de DNA evidenciando sua estrutura DNA.
Fonte: U. S. National Library of Medicine Citado por Craig Freudenrich. (37).
O DNA é um candidato particularmente promissor para servir como material de
construção em nanociências, devido a características muito atraentes deste ácido nucleico
como exibir uma relativa estabilidade físico-química (38).
Após o processo de extração, a avaliação da quantidade e qualidade do DNA é
realizada pela espectrofotometria e eletroforese em gel de agarose (38,39). A
espectrofotometria de gota utiliza uma tecnologia de retenção de amostra, usando somente a
tensão superficial do líquido para manter a amostra no local. Isto elimina a necessidade de
cubetas de quartzo, consequentemente possíveis contaminantes. Através dos espectros de
absorção é possível medir a concentração e a qualidade do DNA extraído, que são
frequentemente confrontados com os resultados da eletroforese (38,39). A eletroforese em gel
de agarose é uma forma simples e rápida, baseada na migração do DNA pela presença de uma
29
diferença de potencial. O DNA tem carga negativa em virtude do fósforo presente em todos
os nucleotídeos, assim suas moléculas são atraídas pelo polo positivo (ânodo). A migração do
DNA é feita em uma matriz (gel agarose) que apresenta resistência a sua difusão, os
fragmentos menores movem-se mais facilmente que os fragmentos maiores. Portanto, após
algum tempo de eletroforese acontece à separação que é visualizada em um transluminador
com luz ultravioleta. Dessa forma pode-se analisar a qualidade do DNA utilizando uma
amostra padrão (38,39).
Sistemas de detecção colorimétrica de DNA baseados em NPs vêm sendo
amplamente estudados (5). Mirkin e co-investigadores desenvolveram sistemas para detecção
colorimétrica de DNA baseado em AuNPs (34). Nesta dissertação os métodos utilizados
foram descritos por Baptista et al. (87).
No método cross-linking utiliza-se duas populações de Au-nanossondas com
sequências complementares a regiões adjacentes ao alvo de interesse, em que a AuNP se
encontra ligada à extremidade 5’ de uma sequência e a 3’ na outra. Ao promover a hibridação
dos alvos com as sondas, promove-se também a sua aproximação, resultando assim na
alteração de cor da suspensão (11, 34, 40, 41,) conforme está ilustrado na Figura 8.
Figura 8: Mecanismo de detecção das nanossondas de DNA
O fenômeno de agregação não resulta da hibridação dos alvos com a sonda, mas sim
pela indução do aumento da força iônica do meio após adição de eletrólito no método noncross-linking. A hibridação de alvos com a nanossonda aumenta a sua estabilidade, impedindo
30
a sua ligação no alvo não complementar e a aglomeração no alvo complementar (41,42)
conforme ilustrado na Figura 9.
Figura 9: Mecanismo de detecção das nanossondas de DNA.
A eficiência da hibridação é um comportamento difícil de explicar apenas pelo
cancelamento de repulsão de forças eletrostáticas nas AuNPs. Acredita-se que existe uma
interação específica entre duas fitas complementares. A observação por um microscópio de
força atômica (42) poderia talvez, permitir a resolução deste problema.
2.6
A história do ouro
A palavra alquimia é de origem egípcia e vem da expressão árabe “al Khen” de raiz
grega, “alkimya”, que significa “o país negro”, nome dado ao Egito na antiguidade. Outros
acham que está relacionado com o vocábulo grego “chyma”, que se relaciona com a fundição
de metais. Os alquimistas de Alexandria desenvolveram um elixir feito de ouro líquido, e
acreditavam que o ouro era um metal místico representando a perfeição da matéria, e que sua
presença no corpo prolongaria a vida, rejuvenesceria, e seria útil para curar grande variedade
de doenças, bem como restaurar a juventude e a saúde perfeita (55,56).
Os primeiros e mais antigos registros do uso do ouro na medicina antiga são de 5000
anos atrás, no Egito. Naquele tempo o ouro era reverenciado, não só pelos mortais, mas
acreditava-se que também era feito pelos deuses. Os egípcios ingeriam o ouro para terem
benefícios mentais, corporais, como também à de purificação espiritual. No tempo dos faraós
31
também acreditava-se que o ouro no corpo humano trabalhava estimulando as forças vitais
levando suas “vibrações” para todos os níveis. A Figura 10 representa a Deusa Isis ajoelhada
sobre o hieróglifo “Nebu”, que significa a palavra ouro.
Figura 10: ISIS ajoelhada sobre o hieróglifo nebu.
Fonte: ISIS (57)
Na odontologia, aproximadamente há 4.500 anos, os egípcios iniciaram os primeiros
tratamentos odontológicos que foram descobertos em uma múmia datada de 2000 a.C. O
trabalho apresenta uma forma de tratamento dental, onde podemos apreciar a existência de
duas próteses dentárias colocadas na arcada bucal e presas por arames de ouro como mostrada
na Figura 11 (55, 56).
Figura 11: Odontologia no Egito A) e B).
Fonte: A: Isis(57), B: Dias (58)
Na antiga Roma, bálsamos contendo ouro eram usados para o tratamento de grande
variedade de problemas de pele. O ouro era considerado como a chave da juventude na antiga
medicina chinesa, Figura12 (55, 56).
32
Figura 12: Máscara de ouro para rejuvenescimento
Fonte: Universidade (56).
Na Europa medieval, pílulas revestidas de ouro e "águas de ouro" eram
extremamente populares. Alquimistas misturavam ouro em pó nas bebidas, para confortar os
afetados por dores nas pernas. O uso do ouro em pó para combater dores causadas pela artrite
foi passado através dos séculos e, ainda hoje, é usado no tratamento da artrite reumatoide,
tendo sua eficácia confirmada por pesquisas da medicina moderna (39, 56, 59).
Durante a Renascença, o grande alquimista, considerado fundador da medicina
moderna, Paracelso, Figura 13, desenvolveu vários medicamentos, altamente bem-sucedidos,
partindo de minerais metálicos incluindo ouro. Um dos maiores alquimistas/químicos de
todos os tempos, fundou a escola de Iatroquímica, a química da medicina, a qual é precursora
da farmacologia (39, 59).
Figura 13: A) Paracelso - Alquimista e médico suíço (1493-1541). B) Paracelsus: O Ouro recebe sua influência
do Sol.
Fonte: Alquimista (60).
33
O ouro é conhecido desde a antiguidade, sendo certamente um dos primeiros metais
trabalhados e com diversas aplicações/metodologias de uso como o ouro coloidal, formação
de amálgamas na odontologia dentre outras aplicações desenvolvidas pelo homem (56).
O ouro coloidal (nanopartículas de ouro) é uma solução que está sendo pesquisada
para fins médicos e biológicos (56).
34
2.7
Ouro coloidal
Se o ouro metálico for dividido em finas partículas (tamanhos atingindo de um a uma
centena de bilionésimos do metro, portanto 1-100 nanômetros), motivo pelo qual estas
partículas estão permanentemente suspensas em solução, devido à ação da força de Van der
Waals/força gravitacional, o mineral torna-se conhecido como ouro coloidal, exibindo então,
novas propriedades devido o seu volume e área que contem grande quantidade de ouro (61).
Após estudar os trabalhos de Paracelso, o renomado químico inglês Michel Faraday
Figura 14 preparou o ouro coloidal em estado puro, em 1857, e muitas utilidades se
encontraram para suas preparações de "ouro ativado” (56,61).
Figura 14: A) Michel Faraday Físico-químico inglês (1791-1867).
Fonte: Universidade (56).
Pela grande aplicabilidade do ouro coloidal se faz importante mensurar as forças que
atuam neste sistema. Se a matéria apresenta um estado físico (sólido líquido e gasoso) e este
estado sofreu finamento disseminado dizemos que temos um sistema coloidal. Tintas e
soluções coloidais de nanopartículas metálicas exemplificam partículas sólidas finamente em
um meio líquido. A gravidade ou fatores externos, como a exposição a luz, podem fazer com
que partículas disseminadas formem agregados de tamanho maior pela adesão de uma nas
outras, conforme mostrado no diagrama da Figura 15 (62).
35
Figura 15: Esquema de processos de floculação, sedimentação e coagulação que podem ocorrer em sistemas
coloidais.
Fonte: Andrade (62).
A teoria DVLO recebe este nome pelas iniciais de seus criadores Derjaguin,Verwaye
Landau e Overbeek, em 1940. Esta teoria forneceu a ciência dos coloides e de superfície os
fundamentos de um modelo quantitativo para as interações entre macropartículas, onde
existem dois tipos de forças da natureza eletromagnéticas, ou seja, forças eletrostática de
dupla camada e forças atrativas de Van der Waals, agem entre as partículas em função da
distância entre elas. A estabilidade de um sistema coloidal é determinada pela soma destas
forças. A teoria DVLO propõe que uma barreira de energia resultante das forças repulsivas
impeça que duas partículas se aproximem e se juntem. Porém, se a partícula possui energia
suficiente para romper esta barreira a força atrativa irá puxá-las e colocá-las em contato
irreversivelmente. Existem dois mecanismos fundamentais que afetam a estabilidade coloidal:
a repulsão estérica e a repulsão eletrostática. De acordo com a Figura 16 (62).
Figura 16: A repulsão estérica (esquerda) e a eletrostática (a direita)
Fonte: Andrade (62).
36
A concentração inicial dos reagentes tem um papel importante na estabilidade e
concentração final do coloide, como a temperatura, velocidade de agitação e velocidade de
gotejamento que as são variáveis que aliadas á concentração inicial, determinam a
probabilidade de colisão e agregação dos átomos de ouro e prata metálicos que são formados.
Estas colisões levam a nucleação de nanopartículas cujo tamanho é limitado, a princípio, por
estas mesmas variáveis. A presença de impurezas e a exposição á radiação eletromagnética
(luz) induzem um aumento descontrolado das nanopartículas monocristal nas, mas também de
uma agregação das mesmas para proporções microscópicas, provocando uma desestabilização
total do coloide (63).
Os primeiros relatos científicos atribuem a Faraday, o desenvolvimento da síntese de
nanopartícula de ouro coloidal (AuNPs) (18). Em 1959, Richard Feyman apresentou a
manipulação de matéria à nanoescala, exprimindo uma possível utilização de unidades
atômicas a nível molecular igualando-os a blocos para sua construção (64). Atualmente a
bionanotecnologia envolve a engenharia de sistemas à nanoescala para aplicações
biotecnológicas. Sistemas como estes apresentam dimensões da ordem dos nanômetros
(<100nm), onde fenômenos únicos consequentes destas características permitem novas
aplicações (64).
Através de sistemas simples e menos dispendiosos, os diagnósticos laboratoriais e
clínicos de amostras biológicas podem ser melhorados com a aplicação da nanotecnologia,
possibilitando a quantificação de materiais com rapidez e viabilidade. A exploração do ácido
desoxirribonucleico (DNA) na identificação de doenças está sendo muito utilizado.
As propriedades ópticas (ressonância plasmônica) das nanopartículas metálicas são
influenciadas pela sua geometria e tamanho (3,65).
Diversas metodologias de síntese de nanopartículas de ouro descritas através de
redução de sais de ouro com uma grande variedade de agentes redutores orgânicos (18)
apresentavam uma estabilidade reduzida, dificultando assim a sua posterior aplicação. Através
de agentes tiolados conseguiu-se a estabilidade destas partículas. Estes compostos ligantes
espontaneamente a superfícies de ouro conferem um acréscimo de estabilidade. Um método
popularmente conhecido nos dias de hoje baseado em um controle do tamanho das AuNPs
sintetizadas, entre 10 e 40 nm, foi descrito por Turkevich, pela primeira vez em 1940. Neste
método recorre-se à redução do Au (III) por íons de Citrato (66,33).
As AuNPs estabilizadas por citrato possuem diversas aplicações (67), sendo nesta
metodologia utilizada a síntese em duas fases (42), desenvolvida por Schiffrin em 1994 (68).
Recorre-se na primeira fase a um agente redutor orgânico, formando AuNPs relativamente
37
estáveis em água, e na segunda fase este revestimento é substituído por compostos tiolados
(65). O processo possibilita a síntese de partículas suscetíveis de serem funcionalizadas com
diferentes ligantes, sendo sua escolha independente do processo de síntese (69,70). A
importância de modificar a superfície das NPs reside na possibilidade de modelar as
características dependentes do tamanho que estas partículas apresentam.
A agregação, por exemplo, é o processo pelo qual duas ou mais partículas se
agrupam (agregado), mas não se fundem numa partícula única.
A estabilidade das NPs define-se como a capacidade de partículas coloidais
permanecerem uniformemente distribuídas na amostra. Esta propriedade pode ser modelada
pela adição de compostos que interagem física ou quimicamente com cada uma das partículas
do sistema. Estas partículas encontram-se estabilizadas por uma camada de íons à superfície
que mantém uma carga fixa e do mesmo sinal, promovendo a repulsão eletrostática e
mantendo-as afastadas (cineticamente estáveis). No entanto, por adição de um eletrólito e
consequentemente o aumento de força iônica no meio, a repulsão eletrostática entre as
partículas é atenuado, e a suspensão coloidal passa a ser cineticamente instável, originando a
agregação.
A previsão teórica para propriedades ópticas de partículas esféricas foi feita por
Gustav Mie, conseguindo calcular o coeficiente de extinção molar para AuNPs. Baseada nas
equações de Maxwell sua teoria determina a dependência do tamanho e forma destes
agregados de átomos na interação com o campo eletromagnético de luz incidente, explicando
os efeitos de dispersão e absorção de luz por AuNPs com tamanhos inferiores a comprimentos
de onda incidentes. A observação mais relevante em NPs metálicas é a presença de uma forte
banda na região do visível associada à ressonância plasmônica, o que proporciona cores vivas
a estas suspensões (69,71).
A mecânica quântica explica os espectros de moléculas, a Ressonância plasmônica
de superfície destes sistemas de nanopartículas através da teoria de elétrons livres como será
citada posteriormente, modelos de sistemas eletrostáticos e polarização de partículas (71).
Tendo como base esta separação energética, a caracterização de substâncias se
realiza com espectrofotômetros diferentes: o UV-vis (Figura 17) para análise de amostras
entre 100 até 780nm, e o IR entre 15000 cm-1 até 30 cm-1 (72).
38
Figura 17: O Espectro eletromagnético da luz.
Fonte: Santos (73).
A técnica de caracterização e/ou de quantificação de substâncias baseia-se na
interação da radiação eletromagnética com a matéria. Perturbação é um conceito que neste
contexto tem um significado fundamental. As moléculas situam-se num estado fundamental
de equilíbrio eletrônico quando não recebem a “perturbação” de radiação (ou luz). Quando
são excitadas por radiação eletromagnética, muda à configuração eletrônica de acordo com a
radiação empregada. Se a radiação utilizada se situa na faixa espectroscópica do UV-vis, as
moléculas podem ir de um estado fundamental eletrônico a um estado excitado, com ou sem
acoplamento vibracional. Quando a energia de perturbação é menor e se situa na região do
infravermelho, não acontece uma excitação entre estados eletrônicos, porém, excitam-se
vibracionalmente. Sendo assim, os elétrons, átomos e moléculas podem ser excitados desde
um estado fundamental a outro estado de energia superior por absorção de radiação
eletromagnética. A transição de um elétron desde um estado de energia a outro é permitida
somente se a energia da radiação for igual à diferença de energia entre os estados (72, 74, 75).
A radiação eletromagnética aparece branca quando todos os comprimentos de onda
de radiação entre 350 nm a 750 nm estão presentes. A luz branca se compõe de vários tons de
vermelho, laranja, amarelo, verde, azul, índigo e luz violeta. Quando uma espécie absorve
porções selecionadas do espectro da luz visível, resulta a cor. Por exemplo, a solução de nano
partículas de ouro é uma solução vermelha que absorve luz a 520 nm (luz verde) e a 450 nm
(luz azul). A cor vermelha da solução é o resultado obtido quando as componentes verdes e
azuis da luz branca são removidas. A cor da solução representa, portanto, a composição de
39
todas as cores transmitidas (não absorvidas) pelas partículas. Em algumas vezes é possível
determinar a cor (ou o comprimento de onda) da luz absorvida por uma espécie tendo como
base a cor da solução e vice versa. Nos casos mais simples, quando a solução absorve luz em
uma única região do espectro visível, a cor da solução complementaria a cor da luz absorvida
pela solução (72). Cores e cores complementares (Figura 18) e seus comprimentos de onda
correspondentes se apresentam na Tabela 1.
Figura 18: Cores complementares.
Fonte: Cores (76).
Tabela 1: Absorbância, comprimento de onda e as cores complementares.
Comprimento de onda (nm)
Cor de absorção
Cor complementar
650-780
Vermelho
Azul-Verde
595-650
Laranja
Azul esverdeado
560-595
Amarelo-Verde
Roxo
500-560
Verde
Vermelho-Roxo
490-500
Verde azulado
Vermelho
480-490
Azul esverdeado
Laranja
435-480
Azul
Amarelo
380-435
Violeta
Amarelo-Verde
40
Para entendermos o espectro UV-vis de nanopartículas de Ag, Au, Cu e outras, e as
misturas possíveis que possam ser feitas, devemos ter presente a estrutura eletrônica dos
átomos em estado de oxidação zero (72). Nos casos de nanopartículas de Ag, Au e Cu, o
comprimento de onda da absorção está relacionada com as transições do tipo s-p, que
dependem da forma e tamanho da nanopartícula (72). Existem três tipos de absorção de luz
nos metais, sendo estes: Transição de interbanda para alta energia, elétrons livres e
Ressonância Plasmônica.
-
Transição de interbanda para alta energia
Os elétrons nas moléculas ou sólidos, no seu estado fundamental, estão situados na
última camada eletrônica. Segundo cálculos das estruturas de banda e matriz de transição
óptica, os elétrons possuem uma probabilidade de transitar para estados de maior energia
quando excitados por luz (fótons) com energia ressonante à diferença de estados conforme
(Figura 19) (77).
Figura 19: Transição de interbanda para alta energia.
Fonte: Transição (78)
Para o caso do Au, esta transição pode ocorrer em alta energia, ou seja,
aproximadamente 4 a 5 eV. Sendo metálica, as interações com luz visível são principalmente
relacionadas aos elétrons livres e ressonância plasmônica.
41
-
Elétrons livres
Em metais, os átomos possuem uma alta coordenação, ou seja, interagem fortemente
com os primeiros vizinhos compartilhando elétrons, conforme ilustrado na Figura 20. As
funções de onda são ditas delocalizadas e, por isso, pertencem ao material como um todo, e
não, a um determinado átomo. Em metais volumosos, estes elétrons interagem com o campo
eletromagnético da luz produzindo as oscilações eletrônicas descritas nas pelas equações de
Drude (77).
No caso em que os elétrons estão confinados em nanopartículas, o movimento
oscilatório é restrito às paredes, geometria e tamanho da nanopartícula (Figura 20).
Para partículas de ouro coloidal, a dependência da forma e tamanho sobre o
comprimento de onda de absorção é tal que a cor das partículas depende da sua preparação.
As partículas maiores e assimétricas absorverão em comprimentos de onda maiores
comparando-as à absorção de nanopartículas menores e mais esféricas (72,77).
Figura 20: Esquema de movimentação dos elétrons livres.
Fonte: Transição (78).
-
Ressonância Plasmônica
Muitos metais, como prata e ouro, exibem forte absorção na região do visível do
espectro chamada SPR (Ressonância plasmônica de superfície), Figura 21. A origem dessa
absorção é atribuída à oscilação coletiva de elétrons, em resposta ao campo elétrico de
42
radiação eletromagnética de luz (75). A principal diferença entre a interação da luz com
elétrons livres e ressonância plasmônica é o fato de, neste último, os elétrons estarem sob a
forte influência do “caroço” nuclear. Neste caso, a movimentação elétron-núcleo induzido
pelo campo eletromagnético da luz induz a formação de dipolos, conforme representado na
Figura 21. Novamente, o efeito depende de um número de parâmetros, tais como tamanho da
partícula, carga na superfície, natureza do meio em que elas se encontram (72, 74, 77).
Figura 21: Ressonância Plasmônica nos elétrons.
Fonte: Pereira (80).
A Figura 22 ilustra o deslocamento dos máximos de absorção no espectro UV-vis de
nano partículas de ouro com formas de nano esferas, nano estrelas e nanobastão. O espectro
de absorção das três formas de nanopartículas de ouro mostram no UV-vis suas respectivas
bandas. A nanoesfera apresenta o máximo de absorção na região de 520nm. A nanoestrela e o
nanobastão possuem dois picos de absorção em 532nm e 675nm e 515nm e 735nm,
respectivamente (81).
43
Figura 22: Máximos de absorção no espectro UV-vis de nano partículas de ouro com formas de nano esferas,
nano estrelas e nano varetas de ouro.
Fonte: Esquema (81).
Os comprimentos de onda maiores correspondem às frequências mais baixas,
significando que os elétrons confinados em uma nanopartícula maior oscilam com frequências
menores que aquelas que estão numa nanopartícula menor. Quando temos a agregação de
nanopartículas, os comprimentos de onda da luz absorvida mudam. Isso acontece quando
adicionamos um eletrólito à solução coloidal de ouro já que é possível a formação de clusters
de partículas, ou ainda de monocamadas de partículas sobre uma superfície. A dimensão das
partículas muda sobre a superfície, e assim muda a cor de uma forma similar à mudança de
cor associado ao tamanho e forma das partículas.
De fato, quando duas partículas se aderem à absorção produzida é similar a aquela de
forma de bastão tendo um comprimento igual à soma dos diâmetros das duas partículas. Em
adição aos comprimentos de onda de energia absorvidas e emitidas pelas nano partículas, a
luz dispersada pelo coloide também pode ser estudada pelo brilho da luz branca (contendo
todos os comprimentos de onda de energia) sobre a amostra e detectando a luz dispersada
desde a amostra num ângulo de 90º. Esta luz dispersada vem desde uma absorção incompleta
da energia de transição s-p, e tem, portanto, uma cor diferente da luz transmitida e observada
como a cor da solução (18, 72, 81). Uma das técnicas analíticas mais usadas na identificação e
quantificação de moléculas é a espectroscopia de absorção, ou seja, a separação energética
que lhe é inerente, isto é: na faixa de energia entre 100 nm 400 nm está à região do
ultravioleta. Entre 400 até 780 nm se situa a região do visível. Abaixo de 780 nm se encontra
44
a região do infravermelho próximo, logo vem o infravermelho médio entre 5000 cm-1 até 400
cm-1. Abaixo de 400 cm-1 até 30 cm-1 se encontra o infravermelho distante (72, 81).
Em 1857, Michael Faraday compreendeu que o avermelhado da coloração ou
amarelado dos vitrais das catedrais era motivado pela presença de partículas pequenas de ouro
ou prata, respectivamente, dispersas em matrizes de vidro. Entretanto, uma explicação
concreta em bases teóricas ainda não havia sido demonstrada. Tentando explicar a coloração
de uma amostra de água contendo pequenas partículas de ouro, em 1908, Gustav Mie,
resolveu de forma plena as equações de Maxwell para uma partícula esférica submetida a um
campo eletromagnético, explicando e formalizando a proposta de Faraday (82).
O formato e diâmetros em nanoescala fazem das nanopartículas estruturas também
conhecida como “pontos quânticos”. Vasos e cores de vitrais de igrejas europeias são
exemplos do uso de nanopartículas. Apresentam cores laranja, roxo, vermelho ou verde,
dependendo do seu tamanho. Podemos dizer que os primeiros a trabalharem com
nanotecnologia foram os manipuladores de vidro medievais (83).
Nessa época, por que o ouro produzia essas cores ainda não era sabido. Hoje um
exemplo do efeito das nanopartículas é a Taça de Licurgo, que se encontra no British
Museum, em Londres (Figura 23). Essa taça do século IV aparece verde quando vista por luz
refletida e vermelha com luz transmitida. Portanto, dependendo de como é iluminada muda de
cor. Nanopartículas de ouro de aproximadamente 70 nm dispersas em matrizes de vidro
observadas por microscopia eletrônica têm propriedade de refletir a luz (no verd e) e transmitir
(no vermelho) em diferentes comprimentos de onda (83).
Figura 23: Taça de Licurgo
Fonte: Liu e Lu (83).
45
3 Objetivos
3.1
-
Objetivo geral
Identificar o fungo Paracoccidioides brasiliensis por meio da utilização de
nanossondas de ouro.
3.2
Objetivos específicos
- otimizar o protocolo de síntese de nanossonda em dois tipos de sondas complementares a
sequências específicas dos genes ribossomais RIB.5,8S e RIB.28S do fungo P. brasiliensis .
- desenvolver um método de diagnóstico simples, rápido e de alta sensibilidade para a
identificação do fungo Paracoccidioides brasiliensis em comparação aos testes atualmente
utilizados em rotina clínica;
46
4 Materiais e Métodos
4.1 Cultura do Paracoccidioides brasiliensis
Células leveduriformes do isolados 18 do P. brasiliensis previamente crescidas por
quatro a cinco dias em meio sólido YPD (1% de extrato de levedura, 2% de peptona, 2% de
dextrose) à 36ºC, foram inoculadas em 800 ml de YPD líquido para obtenção de massa
celular. A suspensão foi mantida sob agitação (125 rpm), na mesma temperatura por mais
quatro a cinco dias para posterior extração de DNA (Figura 24),(6).
Figura 24: Células de levedura do isolado do P. brasiliensis
4.2 Extração do DNA
Para extração de DNA, a cultura foi filtrada em filtro de papel duplo para separar as
células do sobrenadante das células fúngicas que foram conservadas a –80ºC ou
imediatamente processadas pelo método descrito por Cisalpino et al. (50). Na Figura 25 é
ilustrado alguns passos do protocolo de extração que esta descrito a seguir:
47
Aproximadamente 10 ml de células úmidas do fungo foram lisadas mecanicamente
por maceração em gral, na presença de nitrogênio líquido, até a formação de um pó. Este foi
ressuspendido em 25 ml de uma solução 50 mM de Tris, 100 mM de EDTA, 5 % de sarcosil,
20 mg/ml de proteinase K. A solução foi homogeneizada por 10 min. em um Potter-Elvehjen
para completar a lise celular, incubada por 2 h a 56ºC e centrifugada para deposição dos
debris celulares. O DNA do sobrenadante foi purificado com pelo menos duas extrações de
fenol : clorofórmio : álcool isoamílico (50 : 49 : 1). Um volume de isopropanol foi adicionado
ao sobrenadante e mantido durante a noite a –20 ºC para facilitar a precipitação do DNA. O
precipitado seco foi ressuspendido em TE (0,5 ml), dissolvido a 65ºC por 10 min, e tratado
com RNAse (100 mg/ml) por 1 h, a 37ºC. Nova extração com fenol-clorofórmio foi realizada
seguida pela precipitação do DNA com isopropanol, como descrito anteriormente.
Figura 25: Extração de DNA.
A) massa celular do fungo, B) maceração em nitrogênio liquido C) extração finalizada.
4.3 Qualidade e quantificação do DNA
A quantificação do DNA foi avaliada utilizando-se o NanoDrop (ND-1000
Spectrophotometer v.3.0.7, Labtrade) Figura 26 que faz a leitura de absorbância do DNA a
260 a 280 nm para avaliar a pureza das amostras em relação à contaminação com proteínas
(razão deve estar em torno de 1,8 a 2,0) e a pureza em relação à contaminação com reagentes
que foram utilizados durante o processo de extração (razão 260/230 , deve estar entre 1,7 e
2,2).
48
Aproximadamente 200ng de DNA foram utilizados para a avaliação da integridade
em eletroforese em gel de agarose a 1,5% em Tris-Borato-EDTA 1X (TBE) e corado com
brometo de etídeo.
Figura 26: Espectrofotômetro NanoDrop, ND- 1000.
4.4 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Neste estudo, dois genes foram analisados por meio da complementaridade dos
oligonucleotídeos da nanossonda de ouro com as sequências específicas, pertencentes a cada
gene analisado, amplificadas pela PCR. A reação em cadeia da polimerase foi utilizada para
amplificar segmentos específicos dos genes RIB.5,8S (Figura 28) e RIB.28S (Figura 29),
conforme os parâmetros mostrados na tabela 2. As sequências dos iniciadores para o gene
RIB.5,8S foi descrita por Motoyama et al. (23) e para o gene RIB.28S foi desenhada pelo
programa PRIMER3. Na Tabela 2 estão descritos as sequências dos iniciadores e sondas para
cada gene, o tamanho do amplicon e seus respectivos programas de amplificação.
A reação foi realizada num volume de 50µL contendo 200 ng/µl de DNA genômico,
44µL de PCR SuperMix,10 mM de Tris-HCl, 50 mM de KCl, 1,5 mM de MgCl2,, 0,01% de
gelatina; 100 µM de cada dNTPs, 2µL de cada sequência iniciadora e 1 unidade de Taq DNA
polimerase (InvitrogenTM).
Após a reação de amplificação, a quantidade e a qualidade dos produtos amplificados
foram analisadas através da eletroforese em gel de agarose a 1%, corados com brometo de
49
etídeo (0,5µg/mL) e posterior visualização em luz ultravioleta. Para a realização da
eletroforese utilizou-se 4 μL da amostra que foram misturadas com 1 μL de bluejuice gel
loading buffer e 1 μL do tamp
ão de carregamento 100pb (Invitrogen). A confirma
ção da
especificidade do fragmento de DNA amplificado foi analisada por meio de sua comparação
com um marcador de peso molecular conhecido (100pb) Figura 27.
A)
B)
C)
D)
E)
F)
Figura 27: Eletroforese em gel de agarose. A) solidificação e colocação do pente no gel, B e C) Aplicação da
amostra no gel, D) Conexão dos eletrodos na fonte, E) Eletroforese e F) Detecção do DNA amplificado no
transluminador.
Tabela 2: Sequência dos iniciadores e sondas utilizadas para o gene, tamanho do amplicon e seus respectivos
programas de amplificação conforme explicações do ítem 4.4.
Condições de
Gene
Sequência dos iniciadores
Sondas
Amplicon
amplificação
35 ciclos: 1’ a
RIB.28S
5’-GCGCACAAGTAGAGTGATCG-3’
ACTCCCCCGTGGTC
5’- CTATAAGACGCCCCGAGAGG-3’
GCGCACAAGTAGAGT
216 pb
95ºc, 2’ a
40ºC e 2’ a
72ºC.
5’- TCCGTAGGTGAACCTGCGG – 3’ – ITS1
RIB.5,8S
5’- TGTGACGAAGCCCCATACG- 3’ – OL5
35 ciclos: 1’ a
TCAGTGA
TCCGTAGGTGAA
496 pb
95ºc, 2’ a
45ºC e 2’ a
72ºC.
50
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAACGCGCCGTGGGGGGACGGGCCCGATCGGGTTCCC
CGACCCTCTCACCTGGCCACCCTTGTCTATCCTACCTGTTGCTTCGGCGGGCCTGCAGCGATGCTGC
CGGGGGGGCTTGGCCTCCCGGGCTCGTGCCCGCCGGGGACACCGTTGAACTTCTGGTTCGGAGCTT
TGACGTCTGAGACCCACATAATCAGTGAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGACATCGAT
GAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGA
ACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGC
GCGGCTTGTGTGTTGGGCCCGCGTCCCCCCATGGACGTGCCCGAAAAGCAGCGGCGGCGTCGCGTT
CCGGTCGCCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACA
Figura 28: Sequência completa do gene RIB.5,8S incluindo regiões intergênicas e sequências parciais das
regiões 18S e 28S de P. brasiliensis . Os primers ITS1 e OL5 estão sublinhados e a sonda está destacada em
negrito
Fonte: Motoyama et al.(23)
GCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGCATGTGAAA
TTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGCGACCAGAGTCGGCCGCGGGGGCTCAGCGGGCACTCGTTGCCCGT
GCACTCCCCCGTGGTCGGGCCAGCGTCGGTTTCGACGGCCGGTCAAAGGCCCCCGGAATGTGTCGC
CTCTCGGGGCGTCTTATAG
Figura 29: Sequência completa do gene RIB.28S. Os primers desenhados pelo programa PRIMER3 estão
sublinhados e a sonda está destacada em negrito.
4.5 Ativação dos oligonucleotídeos tiolados
A ativação dos oligonucleotídeos foi realizada por meio da remoção da camada
protetora por uma solução de 100 mM de DTT [HSCH2CH(OH)CH(OH)CH2SH)] feita com
uma solução tampão de fosfato de sódio (pH 8.4), durante o período de 60 minutos a 25ºC.
Para os oligonucleotídeos entre 0 a 12,5 A260 unidades foi utilizado 125µl desta solução.
Acima destes valores de A260 unidades foi utilizada a razão de 1:10 para cada A260 unidade
excedente.
A purificação dos oligonucleotídeos ativados foi feita por uma coluna de gel (NAP10,GE Healthcare). Neste processo, ambas as tampas da coluna foram removidas, permitindo
o líquido protetor fluir através da coluna. Uma solução tampão de fosfato de sódio (15 ml) foi
utilizada na estabilização da coluna, antes da passagem dos mesmos. Após a estabilização da
coluna foi adicionada a amostra, permitindo então que o conteúdo fluísse completamente
através do gel.
Para a eluição da amostra purificada, foi acrescentado uma fração desejada de
tampão para obtenção de um bom rendimento, ou seja, eluição da amostra em 1mL de
tampão, conservando a amostra purificada a -20ºC. Após a remoção da camada protetora, os
51
oligonucleotídeos estão ativos, ou seja, com uma ponta de enxofre livre podendo assim reagir
com as nanopartículas de ouro, que é devido a afinidade química entre o ouro e o enxofre.
A ativação dos oligonucleotídeos foi confirmada através do protocolo de Ellman (G.
L. Ellman, 1959), que utiliza o ácido 5,5’-ditiobis-2-nitrobenzóico (DTNB, Sigma). Este
reagente solubilizado numa solução em pH adequado muda a coloração, pela reação química
do enxofre livre. A solução foi feita por meio da diluição de 8µg/mL de DTNB em etanol
absoluto. Num volume de 3 mL de DTNB foi adicionado 20µL de cada oligonucleotídeo na
concentração de 2mM. A reação química foi detectada através de um espectrômetro UV-vis
(LAMBDA 25, PerkinElmer).
4.6
Síntese das nanopartículas de ouro
Todo o processo de limpeza das vidrarias utilizadas no processo de síntese das NPs
foi feito com uma solução de ácido nítrico em ácido clorídrico na proporção de 1:3. A síntese
de nanopartículas de ouro foi baseada na metodologia de Lee e Meisel (33). Onde 240mg de
HAuCl4 foram diluídos em 500mL de água ultra pura e foram aquecidos até o ponto de
ebulição. Citrato de sódio (50 mL) foi adicionado ao sistema e o aquecimento foi mantido por
cerca de mais 1 hora. A solução formada foi resfriada em temperatura ambiente e
armazenada.
4.7
Síntese de Nanossondas de ouro
As sequências de DNA ligada a um grupo tiol, especificadas na tabela 2 foram
adquiridas da empresa Sigma Aldrich. A fabricação das nanossondas teve como referência as
concentrações inicias de nanopartículas e oligonucleotídeos encontradas na literatura (15,
34,38, 84, 85).
Em um frasco de vidro foram adicionados 3ml de nanopartículas de ouro sintetizadas
e 9µL do oligonucleotídeos ativo a 1mM. O processo de funcionalização das nanopartículas
de ouro com o fragmento de DNA foi feito da incubação desta solução, por 16 horas sob
agitação constante. Após este período foi adicionado 30µL de fosfato de sódio a 10mM e
300µL de cloreto de sódio a 0,1M, e homogeneizado com movimentos suaves. Novamente, a
52
solução foi incubada por mais 24 horas, no escuro. Decorridas às 40 horas as nanossondas
estão prontas, conforme Figura 30.
Figura 30: Exemplificação de uma nanossonda
Entretanto, fragmentos de DNA livres e demais reagentes devem ser removidos antes
da utilização das nanossondas. O processo de limpeza foi executado com o seguinte
procedimento:
-
500µL de nanossonda foi pipetado em um tubo de 1,5mL;
-
A solução foi centrifugada a 13000rpm por 4 minutos;
-
O sobrenadante foi removido cuidadosamente;
-
Foram adicionados 200µL de uma solução composta por 0,1M de cloreto de sódio
(NaCl) e 10mM de fosfato de sódio, na proporção de 1:4 para a nanossonda da
sequência RIB.5,8S e 1:10 para RIB. 28S (as nanossondas com outras proporções
aglomeravam);
-
A solução foi novamente centrifugada a 13000rpm por 3 minutos;
-
O sobrenadante foi removido cuidadosamente;
-
Foi repetido o passo 4 e armazenado a -4ºC até a sua utilização.
53
Figura 31: Agitador magnético utilizado para a funcionalização da nanopartícula
4.8
Métodos cross-linking e non-cross-linking
Os métodos que foram utilizados para os testes foram: cross-linking e non-crosslinking que prevê os estados de agregação das nanossondas, construídas com nanopartículas,
descritos na literatura (12, 14-15).
No método cross-linking é utilizada duas populações de Au-nanossondas com
sequências complementares a regiões adjacentes ao alvo de interesse, em que a AuNP se
encontra ligada à extremidade 5’ de uma sequência e a 3’ na outra. Ao promover a hibridação
dos alvos com as sondas, promove-se também a sua aproximação, resultando assim na
alteração de cor da suspensão. As sondas utilizadas neste método foram as do gene RIB.28S
S-ACTCCCCCGTGGTC/ S-GCGCACAAGTAGAGT, e para o gene o RIB.5,8S foram STCAGTGA/ S-TCCGTAGGTGAA.
No método non-cross-linking o fenômeno de agregação não resulta da hibridação dos
alvos com a nanossonda, mas sim pela indução do aumento da força iônica do meio após
adição de eletrólito, neste método apenas uma nanossonda foi utilizada. A hibridação de alvos
com a nanossonda aumenta a sua estabilidade, impedindo a sua ligação no alvo não
complementar e a aglomeração no alvo complementar. A nanossonda utilizada neste método
para RIB.28S, teste complementar foi a S-GCGCACAAGTAGAGT. O gene RIB.5,8S a
sonda utilizada foi a S-TCAGTGA. Na adição da sequência gênica complementar as
nanossondas de ouro permanecem uniformemente distribuídas, traduzindo-se numa cor
vermelha da suspensão (resultado positivo), na ausência da sequência gênica complementar as
54
nanossondas de ouro agregam-se, traduzindo-se numa cor azul da suspensão (resultado
negativo).
Nestes testes foram utilizados duas sequencias de DNA teste, uma complementar e a
outra não complementar as sequências das nanossondas. Para o negativo, o DNA teste não
complementar ao fragmento RIB.28S foi o RIB.5,8S e vice-versa. Para o positivo, o DNA
teste complementar ao fragmento RIB.28S foi à própria sequencia amplificada RIB.28S, que
permitiram a formação da estrutura de dupla hélice.
Para análise dos resultados durante este estudo, foi utilizado o espectrofotômetro
para comparar diferentes medidas obtidas, possibilitando a verificação de desvios de picos,
presença de DNA e contaminações que poderiam ser observadas nos resultados. Foram feitos
154 testes positivo/ negativo, destes 100 foram cross-linking e 54 non-cross-linking. Todos os
resultados foram satisfatórios após a otimização dos protocolos. O teste colorimétrico perde a
cor após alguns dias, a fixação da cor ainda é motivo de vários parâmetros, como: tipo de sal,
temperatura, entre outros (6).
4.9 Diagnóstico
para
identificação
do
P.
brasiliensis
-
Teste
Positivo/Negativo
Após as nanossondas serem sintetizadas e purificadas, conforme o protocolo citado
anteriormente foram realizados os testes positivo/negativo. Para a realização destes testes, 20
µL da nanossonda foi adicionado a 20 µL de cada gene amplificado. Dois testes para cada
gene foram realizados: 1) teste de positivo, nanossondas complementares à sequência gênica
amplificada foram adicionadas à solução e, 2) teste negativo, as nanossondas foram
adicionadas a uma sequência gênica amplificada não complementar. Em ambos os testes, as
concentrações das sondas e dos produtos amplificados foram utilizadas nas mesmas
proporções. As amostras foram colocadas em um termociclador automático com bloco de
aquecimento com gradiente linear (Biocycler, modelo MJ96G) e submetidas a aquecimento
de 95°C por 10 minutos e 25°C por 30 minutos. Após este ciclo, 0,7 µL de 1mM NaCl ou
5mM MgCl2 foi adicionado a ambos os testes.
55
5 Resultados e Discussão
A cultura do fungo foi realizada e após cinco dias observou-se a presença de
leveduras com coloração esbranquiçada e aspecto cremoso.
Após a identificação da presença do fungo na placa e a fim de realizar os testes
positivo/ negativo do P. brasiliensis. O DNA do fungo foi extraído, conforme citado
anteriormente, e os resultados são mostrados na Tabela 3, onde a concentração alta de DNA
extraída pode ser explicada pela presença de vários núcleos neste microorganismo.
A pureza do DNA pode ser quantificada por valores relacionados a banda de
absorção (A260/A280) que deve ser entre 1,8 e 2,1(u.a), indicando a relação entre DNA
(banda de absorção a 260nm) e proteína (tirosina e resíduos de triptofano fortemente
absorvido em 280nm) (42,86).
Tabela 3: Quantificação do DNA P. brasiliensis.
Os resultados da eletroforese de gel agarose, demonstram o tamanho específico das
sequências dos genes quando comparados ao marcador de peso molecular. O
desenvolvimento de um marcador de peso molecular específico para o P. brasiliensis é de
grande utilidade para o diagnóstico de doenças ou estudos epidemiológicos. A PCR pode
identificar a clonagem e a sequência gênica, sendo feita por um sequenciador automatizado
(87). Estes resultados onde o DNA total do P. brasiliensis é a banda representada pelo
número dois que pode ser observado na (Figura 32). Este resultado era esperado, uma vez que
o peso molecular do DNA do fungo diminui sua mobilidade através do gel de agarose
formando uma banda larga. O gel também revela um rastro de RNA que é explicado pelos
vários núcleos encontrados nos fungos.
56
Figura 32: Eletroforese em gel de agarose do DNA total do P. brasiliensis por PCR
A Figura 33 mostra os resultados das amplificações por PCR utilizando os
parâmetros mostrados na Tabela 2. A primeira coluna desta figura representa o marcador
padrão de peso molecular, que possibilita quantificar as sequências gênicas amplificadas. Os
números representam: 165 se refere ao controle negativo (No); 166 e 167, as amostras de
RIB.28S; e, 168 e 169, as amostras de RIB.5,8S.
Este resultado de eletroforese de gel de agarose mostrou que foram amplificados
fragmentos de 216 pares de base (pb), que representa a sequência RIB.28S e 496 pb para a
sequência RIB.5,8S. Para o teste positivo foram utilizadas sequências gênicas amplificadas do
fungo. As sequências gênicas RIB.28S e RIB.5,8S provaram serem específicas para a
identificação do fungo Paracoccidioides brasiliensis (99% de similaridade) de acordo com o
banco de dados do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).
57
Figura 33: Amplificação por PCR Eletroforese em gel de agarose das sequências gênicas.
A maior dificuldade no desenvolvimento de métodos moleculares para a
diferenciação e identificação de espécies de fungos é a similaridade genética. No entanto, a
região específica deve ter informação única para cada espécie que pode ser usado como uma
“digital” para a fabricação de nanossondas. Após a amplificação, as sequências foram
padronizadas com um volume de 100 ng/μL, nas concentrações adequadas para os testes de
detecção.
5.1 Nanopartículas de ouro
A figura 34 mostra o processo de síntese de nanopartículas de ouro, que parte com
uma solução de coloração amarelada, contendo cloreto de ouro em água ultrapura. Após a
adição de citrato, a coloração muda até se estabilizar numa coloração de vinho tinto,
formando uma solução coloidal.
58
Figura 34: Síntese da nanopartícula de ouro através da redução por citrato
As pequenas partículas no líquido são separadas por uma força iônica devido à
camada de citrato absorvida na superfície (67). Para a construção das nanossondas é
necessário à determinação da concentração da solução de nanopartículas.
O cálculo da concentração está relacionado com o diâmetro das nanopartículas foram
obtidas de duas formas. Na primeira utilizaram-se os espectros de UV-vis das nanopartícula
de ouro para comparação com uma simulação dos espectros de absorção, baseados na teoria
de MIE, por meio do programa "MIEPLOT" e a segunda pela microscopia eletrônica de
transmissão de alta resolução (HRTEM -TITAN, FEI).
O espectro de UV-vis da solução coloidal é mostrado na Figura 35, obtidos pelo
espectrofotômetro NanoDrop®, mostram um pico de absorção na região do visível por volta
de 524 nm.
59
Absorbância (u.a.)
Banda de absorçao (~524 nm)
400
500
600
700
Comprimento de onda (nm)
Figura 35: Espectro de absorção de UV-vis de nanopartículas de ouro.
Através do programa MIEPLOT foram feitas simulações dos tamanhos médios das
nanopartículas de ouro dispersas em água, calculado por meio das equações abaixo:
(1)
(2)
A resposta óptica das nanopartículas metálicas pode ser descrita por uma soma de
ondas parciais. O índice do somatório indica a ordem de onda parcial descrita pelo harmônico
esférico vetorial, correspondente ao campo elétrico ou magnético, e também refere-se a ordem
da excitação multipolar na nanopartícula.
Desta forma, n=1 corresponde a campos de dipolo, n=2 quadrupolo e assim
sucessivamente, com as respectivas excitações coletivas multipolares nas partículas. Nessas
equações a e b são constantes, R, o raio da nanopartícula esférica e, x, o índice de refração.
A Figura 36 mostra os espectros de absorção calculados para nanopartículas de
diâmetro de 15, 20 e 25nm.
Absorbância (a.u.)
60
1,10
0,55
0,00
Absorbância (u.a.)
500
Comprimento de onda (nm)
Diâmetro de Nanopartícula:
15nm
600
20nm
25nm
1,0
524 nm
520
530
Comprimento de onda (nm)
Figura 36: Simulação dos tamanhos das nanopartículas através do programa MIEPLOT.
Comparando a (Figura 35) com a (Figura 36) observa-se que o pico de ressonância
plasmônica está relacionado com o tamanho das nanopartículas (88-90), onde o pico próximo
a 524 nm esta relacionado com nanopartículas de 15nm.
A segunda forma de determinação da concentração foi feita por meio de medidas de
nanografias do HRTEM, (Figura 37 A e B), onde se observa a geometria das nanopartículas e
a distribuições de tamanhos.
61
Figura 37: Imagem de HRTEM com amplificações a) 50nm; b) 5nm.
A Figura 37 (A) mostra nanopartículas distribuídas com tamanhos homogêneos
próximos de 23nm ± 2nm. As nanopartículas tem sua forma geométrica quase esférica. A
Figura 37 (B) Mostra o contraste de preto dentro das partículas pelas franjas de interferências.
A partir da imagem de HRTEM o software “Image J” fez a distribuição do tamanho
das nanopartículas de ouro como mostra a Figura 38.
Figura 38: Distribuição dos tamanhos das partículas segundo HRTEM.
62
O tamanho médio das nanopartículas, com base nos resultados da (Figura 38) foi de
21,38 nm.
O cálculo da concentração foi feito por meio da equação descrita abaixo:
C
onde Ntotal é o número total de átomos de ouro na solução, D é o diâmetro médio dos núcleos
das partículas,
é a densidade do ouro, M é o massa atômica do ouro, V o volume da solução
e Na a constante de Avogrado.
O tamanho das nanopartículas dispersas no líquido está relacionado com o pico
máximo de absorção pela comparação dos resultados experimentais com os teóricos verificouse que o tamanho médio está por volta dos 15 nm. Entretanto, o tamanho médio calculado
pelas análises de HRTEM mostrou um diâmetro maior, de 21,38 nm conforme mostrado na
Figura 38. A Tabela 4 compara os resultados do cálculo de concentração pelas duas
metodologias.
Diluição
10:0
Tabela 4: Comparação do valor de concentração pelas duas metodologias
Concentração HRTEM (mol)
Concentração MIE (mol)
4,037 x 10-6
1,17 x 10-5
A comparação dos resultados mostra que os valores experimentais e teóricos não
apresentaram diferenças relevantes devido ao erro do NanoDrop ser 2 nm, em comparação as
curvas de absorção geradas pelo programa MIEPLOT.
5.2
Síntese de caracterização de nanossonda
As nanossondas sintetizadas e caracterizadas foram avaliadas pela sua capacidade de
identificação das respectivas sequências complementares, neste caso, de fragmentos do gene
RIB.28S e RIB.5,8S do P. brasiliensis amplificados por PCR. (A Figura 39) mostra o
espectro de absorção UV-vis das nanossondas de DNA.
63
Banda de absorçao das nanossondas
sem aglomeramento (~522 nm)
Absorbância (u.a.)
Banda de absorçao
do DNA (260 nm)
300
400
500
600
Comprimento de onda (nm)
700
Figura 39: Espectro de absorção característico de nanopartículas funcionalizadas
Na constituição do DNA encontramos as bases purinas e pirimidinas, que apresentam
ligações duplas contendo elétrons π, sendo elas C=N, C=O e C=C (Figura 40). A banda de
absorção em 260 nm, que é típico do DNA, devido a bases purinas e pirimidinas (90).
Figura 40: Bases purinas e pirimidinas C=N, C=O e C=C.
Fonte: (90)
Portanto, no espectro UV-vis encontra-se diferentes transições eletrônicas que podem
ser classificados como π →π:* e n →π*, entre as mais prováveis. Um esquema destes trânsitos
eletrônicos se ilustra na (Figura 41).
64
Figura 41: Esquema de transições eletrônicas entre diferentes orbitais moleculares.
Fonte: Esquema (90).
5.3
Teste Positivo/negativo para detecção do P. brasiliensis
Para os testes non-cross-linking utilizou-se uma nanossonda seguindo o protocolo
descrito abaixo:
-
DNA teste complementar (teste positivo)
-
DNA teste não complementar (teste negativo).
Para possibilitar a reação química entre a nanossonda e o DNA teste, seguiu-se o
seguinte programa, utilizando o termociclador:
-
95,0°C por 10 minutos, para desnaturar o DNA.
-
25°C por 30 minutos, para permitir a ligação química entre as bases.
Para os testes cross-linking utilizou-se duas populações diferentes de nanossondas
seguindo o protocolo descrito abaixo:
-
DNA teste complementar (teste positivo)
-
DNA teste não complementar (teste negativo).
65
Para possibilitar a reação química entre a nanossonda e o DNA teste, seguiu-se o
seguinte programa, utilizando o termociclador:
-
95,0°C por 10 minutos, para desnaturar o DNA.
-
25°C por 30 minutos, para permitir a hibridização.
5.3.1 Método non-cross-linking
Foram assim testados dois tipos de sal: cloreto de sódio (NaCl) e cloreto de magnésio
(MgCl2), para os ensaios de estabilidade das Au-nanossondas em função da força iônica das
amostras a seguir. A adição de 0,7
μL de NaCl a 1M ou 0,7 μL de Mg
Cl2 a 5mM se fez
necessária para uma concentração mínima para a indução de agregação e intensificação da
coloração do líquido.
5.3.2 Teste com a sequência gênica RIB.5,8S
Numa primeira fase, a fim de determinar uma concentração de DNA teste adequada
para a obtenção de um sinal discriminatório, ocorreram ensaios de detecção com diferentes
quantidades de DNA. Foi determinada uma concentração mínima de 20ng/μL de DN A teste
capaz de estabilizar cada nanossonda, com mudança de coloração perceptível a olho nu
conforme o modelo apresentado na (Figura 9). Após a respectiva hibridação, o aumento da
força iônica do meio foi otimizada para 0,7 μL de MgCl2 a 5mM possibilitando a detecção
colorimétrica específica do teste non-cross-linking . Após a hibridação das nanossondas com
os respectivos DNA testes, foi determinado o espectro UV-vis da suspensão para análise dos
picos 260nm típico do DNA e 524nm das nanossondas sem aglomerações. De acordo com os
resultados obtidos, pode-se observar que a nanossonda para o fungo P. brasiliensis é capaz de
diferenciar entre o complementar e não complementar para quase todas as concentrações
testadas. Entretanto, a melhor diferenciação foi obtida com a concentração de 30ng/ μL de
DNA teste. Este resultado pode ser observado na (Figura 42), onde as amostras 131 e 132 da
66
sequência gênica RIB.5,8S foram feitas com 20 μL de nanossondas e 20μL de DNA teste
complementar e não complementar, respectivamente, com concentração de 30ng/ μL e adição
de 0,7 μL de MgCl2 a 5mM.
Figura 42: Teste non-cross-linking colorimétrico do fragmento RIB.5,8S
com adição 0,7 μL de ClMg2 a 5mM e concentração de DNA de 30 ng/ μL.
A (Figura 43) mostra o espectro de absorção para os testes positivo e negativo, onde
pode ser observado o pico das nanopartículas, ao redor de 524 nm e do DNA
aproximadamente em 260 nm. A linha cinza representa o teste positivo associado ao DNA
teste complementar. A linha preta representa o teste negativo associado ao DNA teste não
complementar. Este resultado era esperado porque a ligação das nanossondas com o DNA
teste complementar não altera a estabilidade coloidal, assim, o teste positivo mantém a mesma
cor vermelho vinho da solução original da nanossonda para o teste positivo. No entanto, o
DNA teste não complementar altera a estabilidade coloidal, o que conduz a uma formação de
clusters de nanossondas, fazendo com que o pico de absorção em 524 nm se desloque
mudando a cor do vermelho para o azul.
67
Figura 43: Espectro de absorção dos testes positivo/negativo.
5.3.3 Teste com a sequência gênica RIB.28S
Os testes de detecção nas amostras 27 e 28 da sequência gênica RIB.28S foram feitos
com 10 μL de nanossondas e 10 μL de DNA teste complementar e não complementar,
respectivamente, com concentração de 30ng/ μL de DNA e com a adição de 0,7 μL de NaCl a
1M. Porém, as amostras 13 e 14 da sequência gênica RIB.28S foram feitos com 10 μL de
nanossondas e 10μL de DNA teste complementar e não complementar, com uma
concentração menor, de 10ng/ μL, e 0,7 μL de NaCl a 1M. O decréscimo da concentração de
DNA teste deixa a solução com uma cor mais pálida, com uma menor diferenciação, como
pode ser observado na Figura 44.
68
Figura 44: Teste positivo/negativo do fragmento RIB.28S: 27P e 28N 30ng/ μL de DNA; 13P e 14N 10ng/ μL.
Para a sequência gênica RIB.28S foram utilizados 10 μL de nanossonda e 10 μL de
DNA teste complementar e não complementar, com concentração de 30ng/ μL de DNA teste
e 0,7 μL de NaCl a 1M. As amostras 21 e 22 também apresentaram um resultado
colorimétrico como mostra a figura 45, podendo confirmar a concentração de DNA teste
otimizado para qualquer volume testado.
Figura 45: Amostras após a adição de cloreto de sódio (NaCl) de 0,7 μL a 1M.
5.4 Método cross-linking para RIB.5,8S. e 28S.
Foram utilizados 10 µL de cada nanossonda para RIB.5,8S e 20 µL de DNA teste
complementar e não complementar previamente padronizado com concentração de 30 ng/ µL
de DNA. Para a sequência 28S foram utilizados 20 µL de nanossonda e 20 µL de DNA teste
69
complementar e não complementar, também previamente padronizado com concentração de
30 ng/ µL de DNA e 0,7 μL de MgCl2, a 5mM.
5.5 Método cross-linking para o teste com a sequência gênica RIB.5,8S
Foram utilizados 10 µL de cada nanossonda para RIB.5,8S e 20 µL de DNA teste
complementar e não complementar previamente padronizado com concentração de 30 ng/ µL
de DNA. As amostras 25/26, 33/34, 35/36, apresentaram um resultado colorimétrico melhor
devido à valência do cloreto de magnésio ser maior que a de cloreto de sódio, embora o teste
cross-linking não necessite adição de sal para a finalização dos testes. O mecanismo desta
detecção é explicado na figura 8.
Figura 46: Teste colorimétrico positivo/negativo cross-linking.
5.6
Método cross-linking para o teste com a sequência gênica RIB.28S
A figura 47 mostra o resultado das amostras 127 e 128 e a (Figura 48) os espectros
de absorção, onde a linha preta representa a solução de cor azul associadas ao DNA teste
complementar, onde é possível evidenciar uma banda larga para os comprimentos de onda
70
menos energéticos. A linha cinza representa a solução vermelha associada ao DNA teste não
complementar.
Figura 47: Teste colorimétrico
Figura 48: Espectrofotometria das amostras 127 e 128.
Apesar dos resultados serem registrados a olho nu, a detecção da ocorrência da
agregação ou aglomeração das nanossondas torna-se bastante eficiente e quantificável através
da análise no espectrofotômetro. Nesta análise, cada amostra (1,5 μL) necessita apenas de
alguns segundos para ser analisada. A influência dos sais (NaCl e MgCl2) causam diferentes
efeitos na coloração caracterizando variações nas amostras analisadas de acordo com o sal
adicionado. As sequências gênicas RIB.28S e RIB.5,8S apresentaram melhores respostas
colorimétricas com a adição do cloreto de magnésio nos testes non-cross-linking. De acordo
71
com os ensaios de estabilidade efetuados, verificou-se que a utilização do MgCl2 induziu um
maior poder de agregação das nanopartículas comparado ao NaCl, devido ao fato do Mg2+ ser
um íon bivalente, enquanto o Na+ é um íon monovalente. Deste modo, o MgCl2 foi o sal
selecionado para a otimização do resultado após a hibridação das nanossondas com
sequências de DNA.
72
6 Conclusões
A síntese de nanopartículas foi realizada com distribuição de tamanho quase esférico,
com diâmetro médio de 23nm ± 2nm. O DNA do P. brasiliensis foi extraído com pureza
adequada e sem contaminações. Os iniciadores conduziram as amplificações das regiões
específicas do P. brasiliensis, de 496 pares de bases para a sequência gênica RIB.5,8S e 216
pb para outra sequência gênica RIB.28S com 496 pb. As nanossondas foram projetadas com
sequências de nucleotídeos capazes de detectarem a presença do P. brasiliensis pelas
alterações no espectro de UV-vis. Em ambas as metodologias foram necessárias a
concentração mínima de 10ng/µl, na proporção de 1:1, para possibilitar uma detecção a olho
nu.
Os sais utilizados (0,7 μL de NaCl a 1mM e 0,7 μL de ClMg2 a 5Mm) também foram
satisfatórios nos testes. Porém o cloreto de magnésio foi o sal escolhido para a finalização
dos testes positivo/negativo pelo fato do Mg2+ ser um íon bivalente e intensificar melhor a
cor. Os métodos escolhidos non-cross-linking e cross-linking permitiram a eficácia dos
resultados, porém o cross-linking apresentou respostas colorimétricas melhores, após o
termociclador, devido o uso de duas populações de nanossondas que aumentaram a força
iônica do meio, e não necessitaram adição de sal uma vez que já saem do termociclador com
cores diferentes, azul para o positivo e vinho para o negativo, entretanto com a adição do
cloreto de magnésio a cor do teste foi potencializada. Em ambas as metodologias de detecção
observou que o menor fragmento amplificado RIB.28S, 216 pb, apresentou melhores
resultados que o RIB.5,8S que possui 496 pb. Este fato deve-se a facilidade do menor
fragmento de se difundir e combinar na solução, possibilitando uma maior eficiência na
diferenciação da coloração.
O teste positivo non-cross-linking e cross-linking revelaram-se promissores para um
diagnóstico rápido e específico da Paracoccidioidomicose por serem simples acessíveis e de
baixo custo.
73
7 Projetos futuros
Desenvolver esta técnica diretamente a partir de amostras biológicas, que
primeiramente poderia ser feita em ratos contaminados com P. brasiliensis .
Desenvolver um protocolo que poderá ser utilizado não somente no diagnóstico da
paracoccidioidomicose, mas também no diagnóstico de outras doenças, tais como pessoas
portadoras de doenças genéticas monogênicas ou nos tumores benignos e malignos já com
perfis genéticos definidos previamente por técnicas de biologia molecular.
74
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