55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
Centro de Convenções do Hotel Monte Real Resort • Águas de Lindóia • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
1
Tendência da evolução cariotípica na família
Heptapteridae (Telostei: Siluriformes)
Borba, RS1; Parise-Maltempi, PP1; Alves, AL1
¹Departamento de Biologia, Laboratório de Genética de Peixes, UNESP, Rio Claro, SP
[email protected]
Palavras-chave: Evolução Cariotípica, Siluriformes, Heptapteridae, Cariótipo, Ag-NOR.
Os Heptapteridae, uma das principais famílias da ictiofauna Neotropical, possuem cerca de 200 espécies
distribuídas em 26 gêneros. Representada por peixes de pequeno porte, vulgarmente conhecidos como bagres,
mandis ou mandizinhos. Estes peixes são caracterizados pela presença de uma longa nadadeira adiposa, três pares
de barbilhões, corpo alongado e de coloração acinzentada e uniforme. Embora, recentemente elevada ao status
de família, os Heptapteridae, apresentam dados citogenéticos disponíveis desde 1972, no entanto, dos 26 gêneros
pertencentes à família, apenas 7 possuem estudos citogenéticos, e das 200 espécies apenas 17 estão caracterizadas
citogeneticamente. A ausência de estudos sobre evolução do cariótipo de Heptapteridae motivou a realização deste
trabalho. Para tanto, foram analisadas citogeneticamente espécies dos gêneros mais representativos da família,
sobretudo na bacia do Alto rio Paraná, Imparfinis, Pimelodella e Rhamdia, além de comparações com as demais
espécies da família que possuem dados citogenéticos disponíveis. Foram caracterizados citogeneticamente de
três espécies: Imparfinis cf. schubarti (6M e 7F) do Ribeirão Claro (Rio Claro, SP) e do Rio Passa Cinco (Ipeúna, SP);
Pimelodella meeki (3M e 3F) do Ribeirão Claro (Rio Claro, SP) e Rhamdia quelen (2M e 1F) do Córrego Cantagalo
(Itirapina, SP), ambos da bacia do rio Corumbataí (bacia do Tietê). Os resultados obtidos mostram que Imparfinis cf.
schubarti apresentou o número diplóide 2n=58 (12M, 11SM, 6ST), as Regiões Organizadoras de Nucléolo (Ag-NOR)
são simples na região intersticial do braço longo do 2º par (SM), não havendo variações entre as duas populações.
Pimelodella meeki apresentou um número diplóide 2n=46 (13M, 8SM, 2ST), as Ag-NORs são simples na região
subterminal do braço curto de um cromossomo SM. Rhamdia quelen apresentou número diplóide 2n = 58 (16M,
9SM, 4ST), as Ag-NORs são simples na região subterminal do braço longo do 2º par (SM), observou-se a presença
de dois microcromossomos bs em um os indivíduos analisados. Na análise comparativa dos dados evidenciou-se
que o número diplóide mais frequente na família Heptapteridae é o de 2n= 58, presente em 10 espécies, enquanto
o número diplóide menos frequente é o de 2n= 42, presente apenas em Heptapterus hollandi. A predominância de
ocorrência de cromossomos de dois braços (M, SM, ST), e a baixa variação do número diplóide (2n=58-2n=42)
sugerem que eventos de fissão cêntrica foram menos importantes na história evolutiva do grupo, do que eventos
de inversão cêntrica. A possível condição plesiomórfica do cariótipo de Heptapteridae seria composta por 2n=58
cromossomos dos tipos M e SM, Ag-NORs simples em posição subterminal, com tendência na manutenção
deste número diplóide na maioria das espécies, enquanto, a redução deste 2n, se daria possivelmente através de
eventos sucessivos de fusão cromossômica. A ocorrência de cromossomos B é um evento derivado, de origem
possivelmente recente sem implicações filogenéticas.
Apoio Financeiro: FAPESP (proc. n. 07/58641-0)
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Análise citogenética de duas espécies simpátricas
do gênero Hypostomus (Siluriformes, Loricariidae),
da Bacia do Rio Paranapanema
Penteado, PR¹; Brandão, KO1,2; Kavalco, KF1; Almeida-Toledo, LF2; Pazza, R¹
Laboratório de Genética Ecológica e Evolutiva, Campus Rio Paranaíba – Universidade Federal de Viçosa
Laboratório de Ictiogenética, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo – USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: evolução cariotípica, Hypostomus, heterocromatina constitutiva, FISH, Loricariidae
A família Loricariidae, à qual pertencem os peixes popularmente conhecidos como cascudos, é a maior família da
ordem Siluriformes e uma das maiores famílias de peixes neotropicais. Apesar disso, ainda são poucos os dados
citogenéticos disponíveis para esse grupo. O gênero Hypostomus é um dos mais diversificados e um dos mais
estudados, apresentando uma variação no número cromossômico de 2n = 54 para H. plecostomus até 2n = 80 para
H. sp E. O presente trabalho teve como objetivo analisar populações das espécies simpátricas H. albopunctatus e
Hypostomus sp, coletadas no município de Angatuba (SP), bacia do Rio Paranapanema. Foram empregadas técnicas
de coloração convencional por Giemsa, detecção de heterocromatina constitutiva através de banda-C, bem como
Hibridação Fluorescente in situ (FISH) com sonda do gene ribossômico 18S. H. albopunctatus apresentou 2n = 74 (8M,
12SM, 54ST/A) e a FISH evidenciou um par de cromossomos ST/A com marcações no braço curto. Adicionalmente,
a heterocromatina constitutiva mostrou-se distribuída em pequenas regiões de 8 cromossomos ST/A. Por sua vez,
Hypostomus sp foi caracterizado com 2n = 76 (8M, 20SM, 48ST/A) e apresentou grandes blocos heterocromáticos
no braço maior de oito cromossomos ST/A e também pequenas marcações teloméricas em quatro cromossomos
acrocêntricos. A FISH localizou a sequência gênica 18S na região telomérica de quatro cromossomos meta/
submetacêntricos. Além de apresentarem número diplóide diferente, as duas espécies contrastam em sua fórmula
cariotípica, distribuição da heterocromatina constitutiva e localização do gene ribossômico 18S. A quantidade e a
distribuição de heterocromatina constitutiva em ambas as populações se dá de maneira completamente distinta,
tornando clara a importância da técnica de banda-C em estudos comparativos. Os dados obtidos contribuem
para o entendimento da evolução cromossômica divergente no gênero, tanto ao nível macroestrutural quanto
microestrutural e poderão fornecer subsídios para a compreensão de sua história natural.
Apoio financeiro: CNPq/FAPESP/FAPEMIG
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Estudos citogenéticos de duas espécies alopátricas de
Hypostomus (Siluriformes, Loricariidae)
Desordi, R1; Brandão, KO1,2; Kavalco, KF1; Almeida-Toledo, LF2; Pazza, R¹
Laboratório de Genética Ecológica e Evolutiva, Campus Rio Paranaíba – Universidade Federal de Viçosa
Laboratório de Ictiogenética, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo – USP
[email protected]
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2
Palavras-chave: Hypostomus, evolução cariotípica, bandamento-C, Regiões Organizadoras de Nucléolo, Loricariidae.
A família Loricariidae pertencente à ordem Siluriforme, possuiu cerca de 690 espécies, e está divida em seis
subfamílias, sendo Hypostominae, a mais complexa, dividida em cinco tribos. O gênero Hypostomus é dominante
nos rios brasileiros por apresentar uma grande adaptabilidade a mudanças ambientais. Com o objetivo de
contribuir para um melhor entendimento das relações entre as espécies de Hypostomus, foram realizadas análises
citogenéticas por meio da coloração convencional (Giemsa), impregnação por nitrato de prata e bandeamento-C
em duas populações. As populações estudadas foram: Hypostomus sp. (São Miguel Arcanjo – SP, bacia do rio
Paranapanema) que apresentou número diplóide de 2n=72 (34M/SM, 38ST/A) e a espécie Hypostomus margaritifer
(Terra Roxa – SP, bacia do rio Pardo), apresentando um número diplóide de 2n=72 (32M/SM; 40ST/A). A
heterocromatina constitutiva em Hypostomus sp. mostrou-se distribuída na região terminal do braço curto de
um par M/SM pequeno, marcações terminais no braço longo de um par acrocêntrico e marcação intersticial
grande no braço longo de um par de acrocêntricos. Para H. margaritifer o bandeamento C identificou um par
de acrocêntrico com o braço menor quase completamente heterocromático e mais três pares de acrocêntrico
com fortes marcações terminais. A impregnação por nitrato de prata evidenciou em Hypostumus sp. sítios de
Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs) em pares de acrocêntricos, sendo um par no braço curto e um par
no braço longo. Já H. margaritifer apresentou NOR intersticial, próximo ao centrômero do braço longo de um
par de subtelocêntricos e marcação terminal no braço longo de um par de acrocêntricos. Diante de uma breve
comparação dos dados obtidos neste trabalho, com outros trabalhos a respeito do gênero Hypostomus, verifica-se
para o gênero a existência de uma variação de números diplóides de 2n=52 a 2n=80 cromossomos, ocorrendo a
predominância de cromossomos dos tipos submetacêntricos e acrocêntricos. Apesar do mesmo número diplóide e
da similaridade da estrutura macrocariotípica, o bandamento-C e a impregnação por nitrato de prata se mostraram
excelentes marcadores para estas duas espécies.
Apoio financeiro: CNPQ/FAPESP/FAPEMIG
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Análise citogenética de Squaliforma emarginata
(Siluriformes, Loricariidae) do Rio Tocantins
Correia, VCS1; Santos, LP1; Silva, SVS1; Dias, AHC1; Morelli, S1.
Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia.
[email protected]
1
Palavras-chave: heterocromatina, NOR múltiplas, Hypostomus, cariótipo, citogenética evolutiva.
A família Loricariidae, com cerca de 683 espécies, esta dividida em 6 subfamílias, apresentando uma ampla variedade
de número e estrutura cromossômica, levando a diferentes fórmulas cariotípicas. Estima-se que aproximadamente
10% de espécies desta família já tenham sido estudadas citogeneticamente. Este grupo apresenta ampla variação
no número diplóide que vai de 36 cromossomos em Rineloricaria latirostris a 96 cromossomos em Upsilous sp.
Dentre esta família, a subfamília Hypostominae apresenta a maior quantidade de estudos citogenéticos, e para
acrescentar estes dados, este trabalho teve como objetivo caracterizar o cariótipo de Squaliforma emarginata,
que é reconhecida por alguns autores como Hypostomus emarginatus. O gênero Squaliforma é composto por 13
espécies e a classificação de Squaliforma emarginata é confirmada no Check list of the Freshwater Fishes of South
and Central America de 2003. Os quatros exemplares foram coletados em Palmas-TO, no reservatório formado com
o represamento das águas do rio Tocantins, com a implantação da Usina Hidrelétrica Luis Eduardo Magalhães. A
obtenção de cromossomos mitóticos foi feita a partir das células de rim anterior. Realizou-se a coloração convencional
por giemsa, bandeamento C para localização da heterocromatina constitutiva e as regiões organizadoras de
nucléolos foram identificadas pela impregnação de nitrato de Prata. Os indivíduos analisados apresentaram
número diplóide igual a 52 cromossomos, com cromossomos metacêntricos, submetacêntricos, subtelocênticos e
número fundamental (NF) igual a 104. Observou-se Ag-NORs múltiplas, localizadas nos telômeros do braço longo
de 5 cromossomos. O bandeamento C revelou bandas heterocromáticas dispersas na região terminal e intersticial
de alguns cromossomos. As variações morfológicas e numéricas entre os Hypostomus são muito freqüentes, por
isso a comparação entre as populações de Squaliforma e Hypostomus é de grande importância para a ampliação do
conhecimento da citogenética evolutiva de peixes de água doce da região neotropical.
Apoio financeiro: CNPq, FAPEMIG, CAPES, UFU.
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Variabilidade genética de seis populações de
Neoplecostomus (Teleostei: Loricariidae) coletadas nas
Bacias do Rio Grande e do Rio Paranaíba
Lucena, ALM1; Codognotto, FJ1; Zawadzki, CH2,3; Renesto, E1,3
Laboratório de Genética Animal – Depto de Biologia Celular e Genética. 2Depto de Biologia. 3Nupélia – Núcleo de Pesquisas em Limnologia,
Ictiologia e Aquicultura. Universidade Estadual de Maringá
[email protected]
1
Palavras-chave: aloenzimas, variabilidade genética, sistemática, Neoplecostomus.
Espécies podem ser morfologicamente muito similares, mas geneticamente bastante distintas. Assim a associação
de informações morfológicas e genéticas tem adicionado dados importantes para a identificação de espécies
ainda não descritas do gênero Neoplecostomus. O objetivo deste estudo foi analisar a variabilidade genética
de Neoplecostomus de seis populações; sendo uma coletada no rio Taquari (GO) e cinco (Cachoeira, Carandaí,
Tamborete, Espraiado, Sapucaí) coletadas em riachos da bacia do rio Grande do estado de Minas Gerais. Para isso
utilizou-se a técnica de eletroforese de isoenzimas em gel horizontal de amido a 15%. As amostras de Neoplecostomus
coletadas foram congeladas, armazenadas em nitrogênio liquido e posteriormente retirados fragmentos de tecidos
(músculo branco) para a análise genética. Foram analisados seis sistemas enzimáticos: G3PDH, GPI, LDH, IDH,
MDH e PGM. As amostras dos tecidos foram homogeneizadas e centrifugadas. O sobrenadante foi aplicado no
gel e este foi submetido à eletroforese durante 16 horas a uma tensão elétrica de aproximadamente 210V. Após a
corrida eletroforética, o gel foi cortado horizontalmente, incubado em soluções histoquímicas específicas para a
revelação das bandas de atividade enzimática. A interpretação genética foi baseada na estrutura quaternária das
enzimas e todas as estimativas estatísticas (heterozigosidade, identidade genética e distância genética de Nei)
foram calculadas usando o programa Popgene 1.31. Foram identificados um total de 10 loci e 24 alelos. Os alelos
Gpi-B(b), e Idh(b) foram exclusivos para população da região de Cachoeira e os alelos Gpi-A(e) e Gpi-A(a) para as
populações das regiões de Taquari e a de Espraiado, respectivamente. As duas localidades de todas as populações
analisadas apresentaram loci polimórficos e heterozigosidades esperadas maiores do que as observadas, indicando
um excesso de homozigotos. Os valores de identidade genética foram próximos a 0,85 em três populações (taquari,
tamborete e espraiado) podendo estas serem pertencentes à mesma espécie, enquanto as demais apresentaram
valores 0,35< I < 0,85 que supõe-se que sejam espécies diferentes dentro de um mesmo gênero. A menor identidade
genética I= 0, 44 foi encontrada entre a população de Tamborete e Cachoeira, enquanto que a maior I = 0,84 foi entre
taquari cachoeira. A partir do índice de identidade genética foi obtido um dendrograma de UPGMA expressando
as relações genéticas entre as espécies, na qual mostrou que as seis populações ficam agrupadas em 3 conjuntos,
(Cachoeira+Taquari+Espraiado), (Sapucaí), e (Carandai+Tamborete). Portanto, concluiu-se que as seis populações
de Neoplecostomus estudadas apresentam alta diferenciação genética entre elas indicando a existência de pelo
menos três espécies distintas.
Apoio: CNPq e Nupélia.
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Estudos citogenéticos em duas populações
de Hypostomus regani (Siluriformes, Loricariidae)
com a ocorrência de triploidia natural
Viana, GL1; Brandão, KO1,2; Kavalco, KF1; Almeida-Toledo, LF2; Pazza, R¹;
Laboratório de Genética Ecológica e Evolutiva, Campus Rio Paranaíba – Universidade Federal de Viçosa
Laboratório de Ictiogenética, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo – USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: triploidia, bandamento-C, evolução cariotípica, Siluriformes, Loricariidae.
Conhecidos popularmente como cascudos, os Loricariidae compreendem a segunda maior família de peixes em
número de espécies. São peixes neotropicais de pequeno porte, não migratórios, de hábito alimentar iliófago,
possuem habitats variados e facilidade de adaptação a mudanças ambientais. Neste grupo, são conhecidas mais
de 600 espécies, agrupadas em cerca de 70 gêneros. O gênero de cascudos dominante nos rios brasileiros é o
Hypostomus, que apresenta uma série de particularidades cromossômicas próprias, sendo de grande interesse
para a citogenética de peixes, apesar de poucas espécies terem sido estudadas até o momento. O objetivo deste
estudo foi caracterizar citogeneticamente duas população Hypostomus regani coletados na bacia do rio Pardo no
município de Terra Roxa-PR e também no município de Angatuba-SP bacia do rio Paranapanema. Foram usadas as
técnicas de coloração convencional com Giemsa e detecção de heterocromatina constitutiva através da banda-C.
Ambas as populações apresentaram 2n=72 (18M+20SM+12ST+22A). Adicionalmente, na população de Terra Roxa
foi encontrado um indivíduo triplóide (27M+30SM+18ST+33A). A heterocromatina constitutiva distribui-se em
quase todos os cromossomos do complemento, em regiões teloméricas e pericentroméricas. O número diplóide e
a distribuição da heterocromatina constitutiva observados é semelhante ao já descrito para a espécie em outras
localidades. A ocorrência de casos de triploidia natural em peixes é restrito a poucos casos, principalmente em
espécies da ordem Characiformes.
Apoio financeiro: CNPq/FAPESP/FAPEMIG
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Localização das regiões organizadoras nucleolares em
exemplares do bagre gigante piraíba Brachyplatystoma
filamentosum (Siluriformes, Pimelodidae)
do Rio Araguaia, GO
Gonçalves, ALM¹; Senhorini, JA²; Bortolozi, J¹; Oliveira, C³; Foresti, F³; Porto-Foresti, F¹
Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências, Universidade Estadual Paulista, 17033-360, Laboratório de Genética de Peixes,
Bauru, SP, Brasil;
2
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade, Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes Continentais, CEPTA/
ICMBIO, 13630-970, Pirassununga, SP, Brasil.
3
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, 18618-000, Laboratório de Biologia e Genética de
Peixes, Botucatu, SP, Brasil.
[email protected]
1
Palavras-chave: Brachyplatystoma filamentosum; NOR; cromomicina; Pimelodidae; Siluriformes.
Os genes que codificam o RNAr estão localizados em porções de fibras cromatínicas que, após sua compactação,
irão constituir as constrições secundárias de cromossomos específicos. Essas regiões foram denominadas
de organizadoras de nucléolos ou NORs. O número e a localização das NORs variam de espécie para espécie,
fazendo com que a identificação destas regiões seja um importante marcador citogenético. O presente trabalho
teve como objetivo identificar o número e a localização das NORs em exemplares de uma população da espécie
Brachyplatystoma filamentosum (Siluriformes, Pimelodidae) oriunda do Rio Araguaia, estado de Goiás. Para isso,
foram utilizadas as técnicas de impregnação pelo nitrato de Prata (AgNO3) e coloração por cromomicina (CMA3).
Os indivíduos da espécie em estudo, que apresentam número diplóide 2n=56 cromossomos, sendo sua fórmula
cariotípica 20m+20sm+6st+10a, apresentaram NORs simples e em posição terminal no braço curto de um par
de cromossomos do tipo subtelocêntrico, característica revelada por ambas as técnicas, indicando através da
cromomicina que as regiões organizadoras de nucléolos são ricas em pares de base CG. O número e a localização das
NORs encontrados para a espécie em estudo são os mesmos encontrados comumente para a família Pimelodidae,
demonstrando ser uma característica conservada para a família. Diante disso, esse primeiro relato dos estudos
citogenéticos para a espécie Brachyplatystoma filamentosum são necessários para auxiliar em futuros trabalhos de
conservação da mesma, por se tratar de uma espécie de grande porte que representa o topo da cadeia alimentar
de muitos rios da Bacia Amazônica e da Bacia Araguaia-Tocantins, participando do equilíbrio ambiental como
reguladora das populações de outras espécies, e que apresenta uma importância comercial por ser o maior bagre
de água doce existente.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq e CEPTA/ICMBio
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Evidência cromossômica da existência de espécies
crípticas em Hypostomus affinis (Pisces: Loricariidae)
Brandão, KO1; Kavalco, KF2; e Almeida-Toledo, LF1.
Laboratório de Ictiogenética, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Universidade de São Paulo – USP, São Paulo, SP, Brasil.
Laboratório de Genética Ecológica e Evolutiva, Campus Rio Paranaíba, Universidade Federal de Viçosa – UFV, Rio Paranaíba, MG, Brasil.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Hypostomus, rearranjos cromossômicos, rDNA 18S.
Os recentes estudos citogenéticos em peixes neotropicais mostram a ocorrência de uma grande diversidade
cariotípica, muitas vezes intra-populacional. Polimorfismos de heterocromatina e de RONs, presença de
cromossomos supranumerários e a ocorrência de quase todos os tipos de sistemas sexuais conhecidos, são
exemplos da grande variação encontrada. Essa variação é observada em especial no grupo dos Hypostomus, no
qual estabelecer as relações entre as espécies apresenta dificuldades tanto taxonômicas como citogenéticomoleculares. Populações de uma espécie endêmica de Hypostomus da bacia do Rio Paraíba do Sul foram estudadas
com o intuito de auxiliar na compreensão dessa enorme diversidade. Para tal, foram analisadas através de métodos
citogenéticos clássicos e moleculares duas populações de H. affinis; sendo uma proveniente da região de Cunha/
SP onde foram coletados oito indivíduos (um macho e sete jovens); e outra da região do Rio São José/RJ, com
seis indivíduos (uma fêmea e cinco jovens). Os exemplares de Cunha/SP apresentaram 2n=66 cromossomos,
NF=104 e fórmula cariotípica 14M+14SM+10ST+28A, enquanto os espécimes de Rio São José/RJ apresentaram
2n=66, NF=102 e 16M+20SM+10ST+20A. A impregnação por nitrato de prata mostrou para ambas as populações
um sistema múltiplo de RON. Nos indivíduos de Cunha/SP observaram-se marcações terminais em dois pares de
cromossomos acrocêntricos grandes, no braço longo, confirmadas pela hibridação in situ com sonda de rDNA
18S, que ainda revela mais dois sítios: marcações terminais em um cromossomo submetacêntrico e em um
cromossomo subtelocêntrico, totalizando seis sítios. Para a população do Rio São José, a impregnação por nitrato
de prata revelou a presença de cinco sítios terminais, quatro nos braços longos de dois pares de cromossomos
acrocêntricos e uma no braço curto de um cromossomo subtelocêntrico. Porém a hibridação com sonda de rDNA
18S confirmou apenas as marcações dos cromossomos acrocêntricos, não sendo visualizada a quinta marcação. O
bandeamento C mostrou padrões semelhantes de bandeamento, com pouquíssimas marcações pericentroméricas
e grandes e evidentes bandas terminais nos dois pares de cromossomos acrocêntricos condizentes com as RONs.
A marcante diferença cariotípica observada, com os exemplares da região de Cunha/SP apresentando 28M/
SM + 38 ST/A e os indivíduos do Rio São José apresentando 36M/SM + 30ST/A cromossomos e a diferença no
número de sítios de rDNA 18S entre as populações, são características recorrentes no gênero, sendo possivelmente
resultados de rearranjos cromossômicos não Robertsonianos, uma vez que o número diplóide é mantido, e no
caso do DNA ribossomal, pode estar correlacionado com ação de transposons, como identificado em outros
organismos. Com relação ao padrão semelhante de banda C, esse pode ocorrer devido à grande correspondência
entre RONS e heterocromatina no genoma de Hypostomus. Os dados apresentados corroboram as hipóteses de
evolução cariotípica postuladas para o grupo, indicando a importância de rearranjos como inversões nos processos
especiativos em peixes.
Apoio financeiro: Fapesp, CNPq e Fapemig
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Caracterização citogenética em Liposarcus anisitsi
(Loricariidae, Hypostominae) do Córrego do Onça,
afluente do Rio Taquari (Bacia do Alto Paraguai)
no município de Coxim, MS
Vieira, MMR1; Gindri, BS2; Melo, EAM1; Ferreira, GEB1; Silva, JL1; Martins-Santos, IC.
Núcleo de Estudo em Citogenética de Peixes, UEMS-Unidade Universitária de Coxim, MS. 2Laboratório de Citogenética de Peixes,
Departamento de Biologia Celular, UEM.
1
Palavras-chave: Loricariidae, Hypostominae, Evolução, NOR, Banda C.
A subfamília Hypostominae compreende peixes (cascudos) que apresentam ampla distribuição e diversidade
biológica, sendo de grande importância ambiental, uma vez que atuam como pré-mineralizadores da matéria
orgânica antes que essa reingresse na cadeia alimentar. Para o presente estudo foram analisados citogeneticamente
doze exemplares de Liposarcus anisitsi, sendo oito machos e quatro fêmeas, todos coletados no córrego do Onça,
um afluente do rio Taquari, município de Coxim, MS. A análise citogenética dos exemplares foi feita através
da através da coloração usual por Giemsa, pelo bandamento NOR (para detecção das regiões organizadoreas
nucleolares) e pela detecção da heterocromatina constitutiva (Bandamento C). A análise citogenetica revelou
a presença de 2n=52 cromossomos, fórmula cariotípica 20m+18sm+8st+6a, e NF=98, não sendo observada
diferenciação entre os sexos. Foi observado uma constrição secundária evidente intersticial no braço longo do par
de número 13. A impregnação pelo nitrato de prata (Bandamento NOR) revelou marcação em pelo menos dois
pares de cromossomos, caracterizando assim, NOR múltipla. Em um dos pares, o par número 13 a marcação foi
coincidente com a constrição secundária mostrando também um polimorfismo de NOR nesse par. Houve ainda
marcação total no braço curto de um dos cromossomos subtelocêntricos. A técnica de bandamento C revelou
marcação coincidente com os pares marcados pela prata, inclusive evidenciando a constrição secundária como
sendo NOR e Banda C positivas. Houve ainda marcações pericentroméricas na maioria dos pares de cromossomos.
Estudos citogenéticos no referido gênero para região do pantanal são raros, senão inexistentes, sendo importante
a continuação destes estudos em um bioma de importância indiscutível onde os peixes desempenham papel
fundamental para o equilíbrio ecológico.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
10
Caracterização citogenética de Pterygoplichthys
etentaculatus (Loricariidae) do Rio Pandeiros-MG
Barros, LC; Santos, U; Vieira, BG; Dergam, JA.
Departamento de Biologia Animal, Universidade Federal de Viçosa, Laboratório de Sistemática Molecular Beagle. Viçosa-MG, CEP
36570000, Brasil;
[email protected]
Palavras-chave: Pterygoplichthys etentaculatus, rio Pandeiros, citogenética.
São apresentados estudos preliminares de uma espécie de cascudo endêmica da bacia do rio São Francisco. Os
estudos foram feitos em 2 espécimes coletados na localidade-tipo da espécie, o rio Pandeiros. Estudos citogenéticos
de populações podem ser informativos em relação a processos de estabilidade e de diferenciação cromossômica
entre populações. Os loricarídeos são um dos grupos mais diversificados de peixes neotropicais e apresentam
amplos padrões de distribuição geográfica e de diversificação ecológica. As restrições características dos
ambientes aquáticos de água doce facilitam a fixação de rearranjos cromossômicos e por esse motivo, os peixes de
água doce são bons modelos para estudos evolutivos e biogeográficos. Dados relevantes para a compreensão da
evolução cariotípica da família Loricariidae são ainda escassos. Na literatura, os dados citogenéticos demonstram
uma variação no número diplóide de 64 a 80 cromossomos, sugerindo a necessidade de estudos que permitam a
elaboração de hipóteses sobre os fatores que permitiram esta alta diversidade cariotípica. P. etentaculatus, possui
habito bentônico e é encontrado em ambientes lênticos. A metodologia utilizada seguiu protocolos para obtenção
de cromossomos metafásicos de Bertollo et al. (1978) e regiões organizadoras de nucléolo (NORs) segundo Howell
e Black (1980). A classificação cromossômica em metacêntrico (m), submetacêntrico (sm) e subtelocêntricos (st)
foi realizada segundo Levan et al. (1964). As medidas cromossômicas para obtenção da fórmula cariotípica foram
realizadas em software Image Pro-Plus®. Foram avaliadas metáfases de dois espécimes, os quais apresentaram
2n = 52 cromossomos em 42 (98,66%) das metáfases avaliadas. A fórmula cariotípica encontrada foi de 13 m, 10
sm e 3 st. As regiões organizadoras de nucléolo ativas na ultima interfase celular foram registradas em um par de
cromossomos metacêntricos. Estudos envolvendo maior número de indivíduos e outras técnicas citogenéticas
estão sendo realizadas visando a melhor caracterização citogenética desta espécie no rio Pandeiros. Os dados
gerados poderão ser utilizados para posteriores estudos de comparação citogenética interpopulacional na bacia
do São Francisco.
Apoio Financeiro: CNPq e IEF.
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Diversidade genética de Cichla nos reservatórios
de Capivara, Taquaruçu e Rosana no Rio Paranapanema
Briñez, B; Júlio, HF; Prioli, SMAP; Bignotto, TS; Gomes, VN; Mota, TR; Prioli, AJ.
Departamento de Biología Celular e Genética - Núcleo de Pesquisa em Limnologia, Ictiologia e Aqüicultura (Nupelia) - Universidade
Estadual de Maringá.
[email protected]
Palavras-chave: diversidade genética, C.monoculus, D-loop, Tucunaré, introdução de espécies.
A introdução de espécies invasoras é a segunda maior causa de extinção de espécies, tanto de animais como
de vegetais, sendo suplantada apenas pelas alterações de habitat, como a construção de grandes barragens e o
desmatamento. As espécies do gênero Cichla (tucunarés) têm ocorrência restrita à região Neotropical e são os
representantes da família Cichlidae que alcançam maior porte, tendo importância econômica considerável na
região Amazônica, tanto na pesca comercial como esportiva. As espécies de tucunaré, principalmente devido às
suas características esportivas, de peixe lutador e que ataca tanto iscas vivas quanto artificiais, foram introduzidas
em inúmeras bacias hidrográficas da América do Sul e mesmo em outras regiões do planeta. Revisão recente
mostrou que as espécies do gênero Cichla introduzidas nos reservatórios das regiões Sul, Sudeste e Nordeste, são
duas espécies novas, descritas como Cichla kelberi (tucunaré amarelo) e Cichla piquiti (tucunaré azul), identificadas
erroneamente como C. monoculus e C. ocellaris. Com o objetivo de identificar as populações de Cichla presentes no
Rio Paranapanema, foram sequênciadas um total de 302 pares de bases (pb) da região controle D-loop obtidas de
cinquenta e cinco individuos de Cichla em três reservatórios do Rio Paranapanema (Capivara, Taquaruçu e Rosana).
As sequências foram comparadas no GenBank confirmando que os haplótipos presentes são de C. monoculus.
Foram identificadas 13 mutações, diversidade haplotípica de 0,556 e diversidade nucleotídica de 0,01867. Três
haplótipos foram encontrados nos reservatórios, dos quais, o primeiro foi encontrado em todos os locais de coleta
(Rosana, Capivara e Taquaruçu). O segundo haplótipo foi encontrado nos reservatórios de Capivara e Taquaruçu,
tem como diferença uma deleção e ocorre com frequência de 2,4%. O terceiro haplótipo foi encontrado em
Taquaruçu, Capivara e Rosana. Sua frequência foi de 31%. A inferência fenética (neighbor-joining) com 55 taxons
resultou em uma árvore com três grandes clados. Dentro de cada um dos três clados, observou-se baixa variação
genética, demostrando que C. monoculus está presente em todos os reservatórios do rio Paranapanema uma vez
que revisões recentes afirmam que apenas C. kelberi e C. piquiti se encontram nos nos reservatórios das regiões Sul.
O dendograma e as análises das populações revelaram fortes evidências de que Cichla monoculus foi introduzida
no reservatório de Capivara, e se dispersou para os reservatórios localizados a jusante (Taquaruçu e Rosana) Além
disso, a ocorrência dos mesmos haplótipos nos três reservatórios, sugerem a ocorrência de uma única introdução.
Apoio Financeiro: NUPELIA, CAPES e CNPq.
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Caracterização citogenética de Cichlasoma
sanctifranciscensis (Perciformes, Cichlidae)
em Bacias Hidrográficas da Bahia
Ferreira-Santos, M1; Figueiredo, PS1; Migues, VH1; Ferreira, JL1, Affonso, PRAM1; Carneiro, PLS1
LAGOA – Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos - Departamento de Ciências Biológicas - Universidade Estadual do
Sudoeste da Bahia. Jequié – BA.
[email protected]
1
Palavras-chave: Cariótipo, RON, peixes, Rio de Contas, Rio Itapicuru, ciclídeo.
Estudos citogenéticos em ciclídeos do estado da Bahia têm sido concentrados em populações de Geophagus
brasiliensis, espécie de peixe dominante nas bacias hidrográficas da região. No presente trabalho, são fornecidos
dados citogenéticos inéditos na espécie Cichlasoma sanctifranciscensis (Perciformes, Cichlidae) a partir de coloração
convencional com Giemsa, impregnação por nitrato de prata (Ag-RON) e bandamento C. Os exemplares foram
coletados no Rio Itapicuru (Bacia do Rio Itapicuru) e em dois pontos na bacia do Rio de Contas (calha principal
e Rio Criciúma), em Caldas do Jorro e Jequié, BA, respectivamente. Vale ressaltar que essa é a primeira ocorrência
registrada dessa espécie além da bacia do São Francisco. Todos os exemplares apresentaram 48 cromossomos,
sem diferenças entre os sexos ou localidades, com fórmula cariotípica de 12sm+36st/a. O maior par cromossômico
é do tipo subtelocêntrico, como tipicamente descrito para espécies dessa subfamília. Um único par de RONs
ativas foi detectado, com marcações nos braços curtos de um dos maiores pares st. Usualmente, os homólogos
portadores de RONs apresentaram acentuado heteromorfismo de tamanho das marcações. A heterocromatina
nas populações analisadas está distribuída pelas regiões centroméricas de todos os cromossomos. Os dados
apresentados corroboram o papel das inversões pericêntricas na evolução cariotípica dos ciclídeos neotropicais,
associadas ao conservadorismo numérico (2n=48) e presença de sítios ribossomais simples. A grande similaridade
cariotípica entre as populações indica a íntima história evolutiva entre as bacias hidrográficas da região, a despeito
das diferenças climáticas e de relevo entre elas atualmente.
Apoio Financeiro: FAPESB, UESB.
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Diferenciação cariotípica em população
de Australoheros facetus (Perciformes: Cichlidae)
do reservatório Soledade, Bacia do Rio Paraopeba
Silva, APA1; Belei, FA1; Scoss, LM2; Dergam, JA1
Laboratório de Sistemática Molecular Beagle, Departamento de Biologia Animal, Universidade Federal de Viçosa;
Instituto Terra Brasilis. Rua Rio Grande do Norte, 1560, sala 405, Funcionários, Belo Horizonte, CEP 30130-131.
[email protected];
1
2
Palavras-chave: Serra de Ouro Branco, Evolução cariotípica, Ciclídeos, Isolamento geográfico, Citogenética de peixes.
Os ciclídeos compreendem uma família rica em espécies com elevada taxa de especiação e que apresentam alto
grau de especialização. Atualmente, 25% do total de espécies de ciclídeos possuem dados cariotípicos. Existe um
consenso de que o cariótipo ancestral dos ciclídeos seria de 2n=48 cromossomos acrocêntricos; portanto, diferenças
no número diplóide e morfologia cromossômica podem representar apomorfias relevantes para a compreensão
das relações filogenéticas entre táxons desta família. No Brasil, os ciclídeos representam 6% da ictiofauna de água
doce. Sua distribuição é ampla, ocorrendo do norte ao Rio Grande do Sul. A Serra de Ouro Branco, complexo
do espinhaço é o divisor de águas entre as bacias hidrográficas do rio Doce e São Francisco. O reservatório
Soledade é um lago artificial formado na década de 60 e pertencente à bacia do São Francisco. O isolamento
geográfico de populações, mesmo resultando de ações antrópicas, é um fator que pode favorecer diferenciações
morfológicas, fisiológicas, moleculares e citogenéticas nas populações envolvidas. Uma espécie encontrada no
reservatório Soledade é o acará-camaleão, Australoheros facetus (Jenyns, 1842). O presente trabalho caracterizou
o cariótipo desta população. Os acarás coletados foram submetidos às técnicas de obtenção de cromossomos
mitóticos metafásicos segundo Bertollo et al. (1978) e analisados segundo Levan et al. (1964). E a analise foi feita
com auxílio do software de imagem, Photoshop CS2. Os cariótipos da população estudada apresentaram 2n=48
com cromossomos submetacêntricos (14m-sm+34st-t; NF96) e ausência de cromossomos sexuais. O aumento
do número de braços nos cromossomo pode ser o resultado de inversões pericêntricas indicando que rearranjos
cromossômicos estiveram presentes durante a história evolutiva do grupo. Estudos de A. facetus em outras
bacias mostram que embora o cariótipo se mantém estável (2N= 48), o número fundamental (NF) varia entre as
bacias do alto Paraná e a bacia do rio Ribeira. Estudos futuros permitirão determinar se o cariótipo observado no
reservatório de Soledade é o característico da bacia do São Francisco. A possível tendência evolutiva de aumento
do NF também é observada nas subfamílias: Cichlinae, Astronotinae, Geophaginae e Cichlasomatinae.A ausência
de cromossomos sexuais já foi indicada em estudos realizados em populações desta espécie na bacia do Paraná.
Apoio financeiro: Gerdau Açominas S.A, Instituto Terra Brasilis e Inbio - Empresa Jr. de Biologia.
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Análise citogenética em Apareiodon itapicuruensis
(Characiformes, Parodontidae) da Bacia do Rio Itapicuru,
Bahia, Brasil
Costa, MS1; Migues, VH1; Almeida, JS2; Carneiro, PLS1; Affonso, PRAM1
LAGOA – Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos - Departamento de Ciências Biológicas - Universidade Estadual do
Sudoeste da Bahia. Jequié – BA.
2
Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina, Londrina-PA.
[email protected]
1
Palavras-chave: Parodontidae, Peixes, Cromossomos, Bacias do Leste, Apareiodon.
O gênero Apareiodon mostra uma ampla distribuição por quase toda a América do Sul, exceto do lado ocidental
da Cordilheira dos Andes. São peixes de pequeno porte, adaptados a ambientes de corredeiras de rios e pequenos
riachos. Este trabalho tem como objetivo caracterizar citogeneticamente a espécie Apareiodon itapicuruensis
associada á área da bacia hidrográfica do rio Itapicurú, a qual encontra-se inserida região norte da Bahia destacandose em seu limite oeste os municípios de Jacobina, Campo Formoso e Jaguarari. Foram coletados 8 exemplares,
todas fêmeas, na calha principal do rio Itapicuru, município de Caldas do Jorro, BA. Após estimulação mitótica
com suspensão de levedura, os cromossomos mitóticos foram obtidos através da técnica de preparação in vivo,
utilizando tecido renal, e visualizados através das técnicas de coloração convencional com Giemsa, bandamento
C e impregnação por nitrato de prata (Ag-RON). Todos os espécimes apresentaram número diplóide modal de
54 cromossomos, com cariótipo constituído por cromossomos metacêntricos e submetacêntricos (NF= 108). As
regiões organizadoras de nucléolos (RONs) estão situadas no braço longo de um grande par de cromossomos
submetacêntricos. Por bandamento C, foram detectados blocos heterocromáticos nas regiões centroméricas de
todos os cromossomos e marcações conspícuas na porção terminal dos braços longos do par submetacêntrico
portador de RONs. Os resultados citogenéticos obtidos até o momento não indicam a presença de cromossomos
sexuais. Porém, indivíduos do sexo masculino precisam ser analisados em estudos complementares a fim de
confirmar tal observação. Os dados do presente trabalho permitem ampliar a caracterização citogenética da
ictiofauna com ocorrência no estado da Bahia, ainda pouco conhecida.
Apoio Financeiro: FAPESB, UESB.
55º Congresso Brasileiro de Genética
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Citogenética aplicada para diferenciação
de populações em Synbranchus marmoratus
(Teleostei, Synbranchidae)
Utsunomia, R; Paiva, LRS; Pansonato-Alves, JC; Pazian, MF; Oliveira, C; Foresti, F
Universidade Estadual Paulista - campus de Botucatu
Palavras-chave: Synbranchidae, citogenética, complexo de espécies, banda C, FISH.
A família Synbranchidae é relativamente pequena dentro da ordem Synbrachiformes, sendo composta pelos
gêneros Synbranchus, Ophisternon e Monopterus. O gênero Synbranchus compreende os animais conhecidos como
muçum ou cobra d’água e apresentam grande distribuição na América do Sul. Estudos citogenéticos anteriores
evidenciaram a existência de uma interessante organização cariotípica na espécie Synbranchus marmoratus, com
a ocorrência de uma variação do número diplóide de 2n=42, 44 e 46 cromossomos. No presente trabalho, duas
populações de Synbranchus marmoratus foram analisadas com a aplicação de técnicas citogenéticas clássicas
(Giemsa, NOR e Bandamento-C) e moleculares (FISH). Foram analisados oito exemplares capturados na região de
Igaraçu do Tietê – SP, bacia do rio Tietê e quatro exemplares provenientes do rio Pardo, município de Botucatu – SP,
bacia do rio Paranapanema. Ambas apresentaram cariótipo com 2n= 42 cromossomos (4 m + 6 sm + 8 st + 24 a). As
RONs foram identificadas em apenas um par cromossômico nas duas populações e localizadas em posição terminal
no quarto par nos exemplares do Pardo e em posição terminal no nono par cromossômico nos indivíduos de
Igaraçu. O bandamento C evidenciou que a heterocromatina constitutiva está presente nas regiões centroméricas
em todos os cromossomos dos indivíduos analisados nas duas populações, sendo ainda observada a presença
de blocos heterocromáticos em posição intersticial e terminal em sete pares cromossômicos para os exemplares
de Igaraçu, enquanto que para população do Pardo, foram observados em apenas três pares cromossômicos. A
hibridação fluorescente in situ (FISH) com a sonda de DNAr 5S identificou regiões de homologia presentes apenas
no braço longo do par acrocêntrico 11 para os exemplares de Igaraçu. Embora ambas as populações apresentem
uma estrutura cariotípica semelhante, os padrões de distribuição da heterocromatina constitutiva e a localização
das RONs em diferentes cromossomos no cariótipo dão indicações da existência de diferentes processos de
diversificação cariotípica nestas populações, determinando modificações estruturais internas nos cariótipos e
possibilitando a atuação dos agentes de especiação neste grupo.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP, CAPES.
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Análise citogenética da população de Leporinus fasciatus
(pIsces – anostomidae) do Rio Araguari na região
de Uberlândia, MG
Vieira, nr¹; Morelli, S¹
¹ Laboratório de Citogenética - Instituto de Genética e Bioquímica - Universidade Federal de Uberlândia
[email protected]
Palavras-chave: peixes, rio Araguari, citogenética, cromossomos, NORs e metáfases
A bacia hidrográfica do Rio Araguari localiza-se na mesorregião do Triângulo/Alto Paranaíba, a oeste do Estado de
Minas Gerais. O rio Araguari possui 475 km de extensão, é uma sub-bacia do rio Paranaíba que juntamente com
o rio Grande forma a bacia do rio Paraná. Devido a grande área que é ocupada pela bacia do Paraná e a grande
variabilidade de ambientes geograficamente isolados, a análise citogenética da ictiofauna é uma ferramenta
importante para estudos evolutivos neste grupo de espécies. Os peixes constituem mais do que a metade do
total de 54,711 vertebrados vivos, cerca de 5000 espécies desse total, pertencem à ictiofauna de água doce da
América do Sul. As ordens Characiformes e Siluriformes representam a maioria da diversidade da ictiofauna
neotropical. A família Anostomidae pertence à ordem Characiformes, com aproximadamente 12 gêneros e no
mínimo 137 espécies. Nos Anostomídeos, o gênero Leporinus é formado por cerca de 60 espécies. A espécie
Leporinus fasciatus é onívora, apresenta migrações reprodutivas, com desova uma vez por ano, além de ser
bastante apreciada na alimentação. Ainda que o gênero Leporinus seja um grupo muito diverso e abundante, os
trabalhos citogenéticos realizados com essa espécie ainda são escassos. O presente estudo teve como objetivo
contribuir para o enriquecimento das informações sobre a citogenética da população Leporinus fasciatus da bacia
do rio Araguari. A estrutura total macroscópica do cariótipo de Anostomidae constitui-se em 2n=54 pares de
cromossomos metacêntricos ou submetacêntricos. Todavia, apesar da grande estabilidade cariotípica da família
Anostomidae, já foram descritas em várias espécies de Leporinus, variações em padrões de heterocromatina, na
localização de NORs e em tipos de cromossomos sexuais. A análise dos espécimes coletados revelou, através
da técnica para a obtenção de cromossomos mitóticos, com coloração Giemsa convencional, 2n=54 pares de
cromossomos meta e submetacêntricos para machos e fêmeas. As metáfases observadas em microscopia óptica
apresentaram constrições secundárias nos braços maiores de um par de cromossomos submetacêntricos, essas
constrições estão diretamente relacionadas com a produção de RNA ribossomais, também sendo chamadas de
regiões organizadoras do nucléolo (NORs). Tais regiões foram evidenciadas pela técnica de impregnação com
nitrato de prata (Ag-NORs), foi encontrado um padrão simples de NOR, com marcações intersticiais em um par
de cromossomos submetacêntricos. Em outra espécie estudada da mesma região e gênero, Leporinus friderici,
foi observado um padrão cariotípico semelhante, mas que diverge quanto às NORs neste caso localizadas no
primeiro par de cromossomos metacêntricos variando entre posição telomérica e intersticial. Sendo assim, notase a importância da análise citogenética em Leporinus fasciatus, pois se trata de uma ferramenta para entender a
filogenia nos Anostomídeos, uma vez que estudos citogenéticos em populações de peixes contribuem muito para
a elucidação dos processos evolutivos das espécies neotropicais.
Apoio financeiro: FAPEMIG e UFU.
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Análise citogenética em populações de Characidium
Schubarti (Characiformes, Crenuchidae)
da Bacia do Rio Paranapanema
Oliveira, KC1; Garcia, C1; Buckup, PA2; Almeida-Toledo, LF1
Instituto de Biociências, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Universidade de São Paulo.
Museu Nacional, Universidade Federal do Rio de Janeiro.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Characidium, citogenética, variabilidade cariotípica, espécie críptica.
Peixes da família Crenuchidae são pouco estudados do ponto de vista citogenético, sendo que apenas algumas espécies
do gênero Characidium têm seu cariótipo conhecido. Essa falta de estudos provavelmente se deve à dificuldade
de coleta destes peixes que raramente excedem 10 cm de comprimento, e freqüentemente habitam cabeceiras de
pequenos riachos de montanha, formando populações pequenas e isoladas. Os estudos citogenéticos já realizados no
gênero Characidium mostram um número diplóide constante de 2n = 50, sendo a sua estrutura cariotípica bastante
variável. Essas variações são relativas às formulas cromossômicas, à presença de sistema de cromossomos sexuais,
ao número e posição das regiões organizadoras de nucléolo (RONs), aos blocos de heterocromatina constitutiva, e
à presença de cromossomos supranumerários. O objetivo do presente trabalho é analisar a diversidade citogenética
de indivíduos provenientes de três localidades de ocorrência da espécie Characidium schubarti, duas situadas na
margem esquerda e outra na margem direita do Rio Paranapanema, por meio de técnicas citogenéticas clássicas
e moleculares, a fim de entender as variações citogenéticas entre populações dessa espécie. Os resultados obtidos
evidenciaram, para as três populações analisadas, número diplóide de 2n=50 com fórmula cariotípica de 34M+16SM,
com a presença de RONs simples terminais no braço longo de um par de cromossomos metacêntricos, e a presença
de blocos de heterocromatina constitutiva apenas na região pericentromérica da maioria dos cromossomos do
complemento. Além disto, a técnica de FISH com sonda de DNAr 5S mostrou apenas um par de cromossomos
submetacêntricos marcados pericentromericamente nas três populações. Entretanto, a presença de RONs múltiplas
confirmada pela técnica de FISH com sonda de DNAr 18S foi detectada apenas na população da margem direita do
rio Paranapanema, e a presença de sistema de cromossomos sexuais heteromórficos do tipo ZZ/ZW foi detectada
apenas nas populações da margem esquerda do rio. Esses resultados revelam uma alta variabilidade cariotípica entre
populações de C. schubarti, separando as populações com base na sua localidade relativa à calha do rio principal. Como
já foi descrito na literatura um caso de espécies crípticas formadas por diferentes populações atribuídas a C. gomesi, é
possível que as populações agora estudadas também formem um grupo de espécies crípticas. Esta heterogeneidade
citogenética é consistente com o fato de que é característico do gênero formar populações pequenas e isoladas em
cabeceiras de pequenos riachos.
Auxílio financeiro: Capes, FAPESP e CNPq.
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Análise citogenética em espécies simpátricas
de Gymnotus: (Pisces, Gymnotiformes)
Scacchetti, PC1; Pansonato-Alves, JC1; Paiva, LRS1; Sene, VF1; Utsunomia, R1; Almeida-Toledo, LF2;
Oliveira, C1; Foresti, F1
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP
Laboratório de Genética de Peixes – Instituto de Biociências – USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Gymnotiformes, espécies simpátricas, RONs, heterocromatina, rearranjos cromossômicos.
Os peixes pertencentes à ordem Gymnotiformes, popularmente conhecidos como tuviras, constituem um grupo
amplamente distribuído na região Neotropical estando agrupados em 5 famílias: Gymnotidae, Rhamphichthyidae,
Hypopomidae, Sternopygidae e Aptenorotidae. Na família Gymnotidae, o gênero Gymnotus apresenta alta
diversidade cariotípica, desde 2n=54 cromossomos em G. carapo e G. inaequilabiatus até 2n=40 cromossomos
em G. sylvius. O objetivo do presente trabalho foi analisar citogeneticamente os exemplares de G.sylvius e
G.inaequilabiatus coletados em simpatria na cachoeira Véu de Noiva, rio Pardo, bacia do rio Paranapanema,
Botucatu – SP. As análises cromossômicas realizadas envolveram coloração convencional por Giemsa, identificação
das regiões heterocromáticas por bandamento C e localização das regiões organizadoras de nucléolos (RONs) por
nitrato de prata. As duas espécies analisadas apresentaram número cromossômico e morfologia cromossômica
distintas. Enquanto Gymnotus sylvius apresentou 2n= 40 cromossomos (22m+10sm+8st), Gymnotus inaequilabiatus
apresentou 2n= 54 cromossomos (42m+10sm+2a). Além da acentuada diferença no número diplóide, estas espécies
também possuem pares cromossômicos exclusivos, sendo observados pares subtelocêntricos somente em G. sylvius,
enquanto G. inaequilabiatus possui exclusivamente um par de cromossomos acrocêntricos. O bandamento C revelou
que as duas espécies possuem regiões heterocromáticas em posição centromérica e intersticial dos cromossomos.
As RONs foram observadas em posição final do braço curto do par 17 em G. sylvius e em posição intersticial nos
braços longos do par 1 de G. inaequilabiatus. Em ambas as espécies, nos pares cromossômicos portadores de sítios
ribossomais ativos, também foram observados blocos heterocromáticos. A existência de diferenças no número e
na morfologia dos cromossomos, no posicionamento das RONs e nos padrões de distribuição da heterocromatina
constitutiva, sugere a ocorrência de rearranjos estruturais e numéricos para a diferenciação entre estas espécies.
Estes resultados demonstram a utilização da citogenética na análise da macro e microestrutura cariotípica,
possibilitando o entendimento dos mecanismos evolutivos no processo de diversificação e especiação de peixes,
tendo como modelo a ocorrência de espécies do mesmo gênero em simpatria.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FAPESP.
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Karyotypic variability in killifishes Orestias
(Teleostei: Cyprinodontidae): C-band patterns and
quantification of nuclear DNA content in three
Chilean endemic species
Araya, C1; Valenzuela, F1; Lam, N1; Mendez, MA2 & Iturra, P1.
Programa de Genética Humana. ICBM. Facultad de Medicina Universidad de Chile
Laboratorio de Genética y Evolución. INTA. Universidad de Chile
Keywords: Killifish, C-banding, karyotype variability
The genus Orestias at present contains 44 species, grouped in 4 complexes, cuvieri, mullieri, gilsoni and agassizii. Its
distribution range extends from Lago Laska in Peru (9ºS) to the Salar de Ascotán in the north of Chile (22ºS). Six
species belonging to the agassizzii group have been described for the Chilean Altiplano. Cytogenetic studies have
shown diploid chromosome number variation in these species ranging from 2n=48 to 2n=55. The karyotypes present
a high number of telocentric and subtelocentric chromosomes, and also microchromosomes (mc) in some of these
species. This set of chromosomes defines a karyotype formula for each species. The species of Orestias studied in this
work are: O. ascotanensis, which presents the most southern distribution of the genus (Region of Antofagasta,22ºS),
O. piacotensis and O. chungarensis both living in isolated lacustrine systems in the river basin of the Lauca River
(Region of Parinacota,18ºS). Diploid number of these species range to 2n= 48 in O.ascotanensis (2m+4sm+4st+38t),
2n= 52 in O. piacotesis (2m+2sm+2st+34t+2mc) and 2n= 55 in O. chungarensis (2m+2sm+20st+24t+5mc). We
described the karyotype distribution of the constitutive heterochromatin (HC) detected by fluorescent C-banding
technique using propidium iodide, and the HC base composition studied by means of the CMA3 fluorescent
banding. The results showed two distribution patterns of the HC, which allows distinguishing between Orestias
species from the northern distribution, and O. ascotanensis. C-positive heterochromatin was C-G rich in all three
studied species. The quantification of the nuclear DNA content using optical densitometry showed significant
differences between O. ascotanensis and others Orestias species from the northern distribution. Our results suggest
1) the existence of two chromosomal lineages of Orestias in the South Altiplano and 2) the HC seems to play a
relevant role in the karyotype diversification in these species.
FONDECYT grant 1080390; Proyecto Domeyko, Universidad de Chile.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Descrição cariotípica da população de Hoplias
malabaricus (Teleostei – Erythrinidae) do Córrego
do Lage, Uberlândia-MG
Dias, AHC1; Correia, VCS2; Santos, LP2; Silva, SVS1;Morelli, S2
1
2
Instituto de Biologia, Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia-MG. [email protected]
Laboratório de Citogenética - Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia-MG.
Palavras-chave: Hoplias, citogenética, cromossomo, NOR, traíra.
A família Erythrinidae (Osteichthyes, Characiformes) compreende três gêneros: Erythrinus, Hoplerythrinus e Hoplias.
O gênero Hoplias é o que apresenta maior destruição geográfica, ocorrendo nas principais bacias hidrográficas do
Brasil e da América do Sul. A espécie Hoplias malabaricus é conhecida popularmente como traíra, está adaptada a
ambientes lênticos (água parada) caracterizando-a como tolerante a baixas concentrações de oxigênio dissolvido
na água, além disso, é considerada uma espécie carnívora de estratégia emboscadora. Esta espécie apresenta
um grande potencial para a piscicultura, visto que a carne tem boa aceitação pelo mercado consumidor, além
de ser uma espécie rústica de pouca exigência no manejo. Os estudos citogenéticos fornecem uma importante
contribuição para o conhecimento evolutivo da espécie e informações necessárias para o desenvolvimento da
piscicultura. Os espécimes já estudados de H. malabaricus apresentam divergências em relação ao número diplóide,
que varia de 2n=39 a 2n=42, e a presença ou ausência em algumas populações de cromossomos sexuais. Diante
destas informações, e dos poucos trabalhos realizados na região do Triângulo mineiro, o presente estudo tem
como objetivo caracterizar citogeneticamente esta população. Foram coletados espécimes no córrego Lage que é
um afluente da margem esquerda do rio Araguari. A análise citogenética foi realizada a partir dos rins anterior e
posterior, os espécimes caracterizam-se por apresentar um numero cromossômico de 2n = 40 para fêmeas e 2n=39
para macho sendo este número cromossômico também descrito em outras populações. O número fundamental
encontrado foi de 80 para fêmea e 78 para macho. As observações das Regiões Organizadoras de Núcleos (NORs)
foram realizadas através da técnica da impregnação de nitrato de Prata (AgNO3), os animais analisados demonstram
um sistema de NORs múltiplas na região telomérica. O presente trabalho confirma os dados descritos na literatura,
que a morfologia cromossômica e a presença de NORs múltiplas são conservadas em Hoplias malabaricus, apesar
da variação existente no número diplóide e do sistema cromossômico de determinação sexual.
Apoio financeiro: UFU e FAPEMIG.
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Simpatria em Hoplias malabaricus
(Pisces, Characiformes): Evidência de hibridação natural
Sene, VF1; Pansonato-Alves, JC1; Paiva, LRS1; Utsunomia, R1; Scacchetti, PC1; Bertollo, LAC2; Oliveira, C1;
Foresti, F1.
1
2
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP
Departamento de Genética e Evolução - Universidade Federal de São Carlos - UFSCar
Palavras-chave: Hoplias malabaricus, banda-C, cromossomos sexuais, triploidia natural, Ag-RONs
Os peixes da família Erythrinidae estão amplamente distribuídos pela América do Sul e são representados por
três gêneros, Hoplias, Hoplerythrinus e Erythrinus. Hoplias é o gênero mais difundido pelos sistemas hidrográficos
brasileiros e também o mais estudado citogeneticamente, apresentando uma acentuada diversidade cariotípica.
No presente trabalho foram analisados citogeneticamente exemplares de peixes do gênero Hoplias coletados
na cachoeira Véu de Noiva, rio Pardo, pertencente à bacia do rio Paranapanema, Botucatu - SP. Foi observada
variação numérica interindividual de 2n= 39, 40 e 42 cromossomos, sugerindo a ocorrência de diferentes citótipos
vivendo em simpatria e sintopia nessa localidade. Foram analisados seis exemplares (5 machos e 1 fêmea) com
2n=42 cromossomos (28m + 14sm) para ambos os sexos e dez exemplares (3 machos e 7 fêmeas) com sistema
de diferenciação sexual do tipo X1X1X2X2-X1X2Y, no qual os machos possuem 2n=39 cromossomos (27m + 12sm)
e as fêmeas 2n=40 cromossomos (28m + 12sm). Além disso, um indivíduo com sexo não identificado apresentou
2n=3x=61 cromossomos, sugerindo a ocorrência de triploidia natural nesse exemplar. A impregnação pelo
nitrato de prata evidenciou que os exemplares com 2n=42 cromossomos possuem geralmente um cromossomo
submetacêntrico com RONs em posição final do braço longo e um cromossomo metacêntrico com RONs em
posição final nos dois braços. Já os exemplares com 2n=39-40 cromossomos possuem RONs múltiplas, com até seis
cromossomos apresentando sítios ribossomais. O exemplar triplóide, na maioria das metáfases, apresentou apenas
um cromossomo metacêntrico com RONs ativas. O bandamento C evidenciou marcações presentes nas regiões
centroméricas em todos os cromossomos dos dois citótipos analisados, sendo observada também a presença de
blocos heterocromáticos em posição terminal em alguns pares cromossômicos. As características geográficas e
climáticas da região de Botucatu sugerem que o exemplar triplóide de Hoplias malabaricus encontrado seja mais
um caso de triploidia natural em peixes. Nesse grupo, a ocorrência de fecundação externa e o fato da segunda
divisão meiótica só terminar após a desova, associados às variações de temperatura do ambiente, poderiam
facilitar a retenção do segundo corpúsculo polar e a formação natural de indivíduos triplóides. No exemplar com
61 cromossomos, as trincas cromossômicas não apresentam total homologia, neste sentido deve ser considerada
que a existência citótipos com 2n=39-40 e 42 cromossomos vivendo em simpatria poderiam determinar uma
origem hibrida para este indivíduo triplóide, como resultado da fecundação de um ovócito não reduzido 2n=40
cromossomos por um espermatozóide n=21 cromossomos.
Apoio financeiro: CNPQ, FAPESP, CAPES.
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Diversidade genética em peixes neotropicais da familia
Crenuchidae, gênero Characidium (Pisces, Characiformes):
inferências evolutivas por pintura cromossômica,
localização de sítios de DNAr 18S e 5S e distribuição
das sequências teloméricas
Pansonato-Alves, JC1; Paiva, LRS1; Pazian, MF1; Shimabukuro-Dias, CK1; Vicari, MR2; Oliveira, C1; Foresti, F1.
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP
Departamento de Biologia Estrutural, Molecular e Genética - UEPG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Evolução cariotípica, Characidium, ZZ/ZW, DNAr, microdissecção
Os peixes do gênero Characidium caracterizam-se como um interessante modelo para estudos genéticos e evolutivos.
Apesar dos dados citogenéticos disponíveis indicarem conservação no número diplóide (2n=50 cromossomos),
observa-se acentuada diversidade na microestrutura cariotípica. Buscando-se um entendimento das relações
evolutivas existentes entre os representantes desse grupo, foram analisadas oito espécies de Characidium utilizandose a hibridação fluorescente in situ com as sondas de DNAr 18S e 5S, sonda telomérica (TTAGGG)n e pintura
cromossômica, usando como sonda o cromossomo W de Characidium cf. gomesi da população do ribeirão Alambari,
Botucatu – SP, obtida por microdissecção. As sondas foram hibridizadas sobre os cromossomos das seguintes espécies:
Characidium cf. gomesi, de Botucatu e Avaré, SP; C. oiticicai e C. cf. zebra, Salesópolis, SP; C. schubarti, Jaguariaiva, PR;
C. pterostictum, Apiaí, SP; C. lanei, Morretes, PR; C. lauroi, Ubatuba, SP e Characidium sp., Itanhaém, SP. A aplicação da
técnica de FISH com o gene ribossômico 5S evidenciou características exclusivas para as espécies estudadas, sendo
que C. schubarti, C. pterostictum, C. oiticicai, C. lanei e Characidium sp. apresentaram apenas os cromossomos do par
21 como portadores desse gene, enquanto as populações de C. cf. gomesi, C. cf. zebra e C. lauroi apresentaram até
cinco cromossomos marcados. O DNAr 18S esteve sempre associado aos cromossomos sexuais ZW, com exceção
dos exemplares da população de C. cf. gomesi de Avaré, na qual o 18S foi observado no par 18. Com a sonda W, a
hibridação evidenciou o cromossomo W totalmente marcado em todas as espécies e o cromossomo Z com marcação
pericentromérica e terminal, além de pequenos sítios terminais marcados na maioria dos demais cromossomos do
cariótipo. Em C. cf. zebra, a sonda W marcou apenas pequenos sítios terminais na maioria dos cromossomos, talvez
por esta espécie não apresentar cromossomos diferenciados sexualmente. Estes resultados indicam a existência de
grande homologia entre o sistema ZW nas espécies estudadas, demonstrando uma possível origem comum. Por
outro lado, sugerem que a presença do DNAr 18S nos sexuais é anterior a formação dos cromossomos ZW e que
esse sítio pode ter sofrido eventos de transposição em uma das populações de C. cf. gomesi. Apenas para C. lanei e
C. pterostictum, a sonda telomérica não marcou todas as regiões terminais. Nestas espécies, foram observados sete
pares cromossômicos com marcações intersticiais, o que não indicaria necessariamente a ocorrência de eventos de
fusão dos cromossomos e sim que sequências homólogas às teloméricas poderiam fazer parte do DNA repetitivo
presente em alguns cromossomos. Estudos dessa natureza, além de trazerem valiosas informações acerca da
composição e papel da heterocromatina constitutiva, fornecem também subsídios para o entendimento do processo
de diferenciação cromossômica nestas espécies de Characidium.
Apoio financeiro: CNPQ, FAPESP, CAPES.
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Organização Molecular e mapeamento genômico
de duas classe de DNAr 5S em Potamotrygon motoro
(Chondrichthyes: Potamotrygonidae)
Cruz, VP1; Santos, NM1; De Rosa, LV1; Oliveira, C1; Foresti, F1
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista - UNESP, campus de Botucatu. 18618-000
Botucatu, SP, Brasil
[email protected]
1
Palavras-chave: Chondrichthyes, raias de água doce, DNAr 5S.
A organização de genes ribossômicos 5S tem sido objeto de crescente interesse, sendo estes segmentos genômicos
amplamente caracterizados em eucariotos e peixes ósseos. Ao contrário, entre os peixes cartilaginosos, tais
informações ainda são muito restritas, com estudos realizados em apenas algumas espécies. O DNA ribossômico
5S apresenta repetições geralmente estruturadas na forma de uma seqüência codificante e de um espaçador nãotranscrito (NTS), que é comumente variável em sua sequência nucleotídica. Embora a seqüência nucleotídica
deste gene seja altamente conservada mesmo entre espécies não relacionadas, as variações nos NTSs
geralmente tem características espécies-específicas e têm sido utilizadas com sucesso em estudos evolutivos. Na
presente investigação, a partir do DNA total da espécie de raia de água doce, Potamotrygon motoro, o segmento
correspondente ao DNAr foi clonado e sequenciado. Os dados obtidos evidenciaram que o gene para DNAr 5S em
Potamotrygon motoro é formado por duas classes de segmentos com diferentes tamanhos, sendo a menor com
cerca de 342pb (Classe I) e outra maior com 1900pb (Classe II). Uma sequencia consenso foi identificada para
cada classe e o alinhamento dos clones obtidos revelou poucas alterações nas seqüências da região codificadora
(5S). Já as sequências das regiões dos espaçadores não transcritos (NTS) mostraram maior número de alterações,
confirmando a característica destas regiões, que se apresentam sempre muito variáveis. Sequências TATA-like
foram encontradas nos NTS e um microssatélite (GCT10) foi identificado no segmento genômico do NTS II. A
aplicação da técnica de hibridação in situ fluorescente (FISH) usando como sondas os segmentos componentes
do gene ribossômico 5S de P. motoro marcadas com corantes fluorescentes permitiu mapear o genoma da
espécie,caracterizando sua localização nos cromossomos da espécie, nas regiões terminais dos braços curtos dos
cromossomos do par 2 e nos braços longos do par 6, sendo sintênicos nos cromossomos do par 2. Por se tratar
do primeiro estudo realizado em espécie de raias de água doce, considera-se que os resultados obtidos poderão
auxiliar na compreensão da organização e distribuição do DNAr 5S em peixes cartilaginosos, bem como nos
processos envolvidos na diversificação e evolução das espécies neste grupo.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq.
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Mapeamento físico comparativo do gene ribossomal
18S em cinco espécies de Rineloricaria (Siluriformes,
Loricariidae): evidência de rearranjos estruturais
Rodrigues, RM1; Fichberg, I2; Almeida-Toledo, LF1
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo – USP, São Paulo, SP, Brasil
Museu de Zoologia da Universidade de São Paulo – USP, São Paulo, SP, Brasil
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Rineloricaria, RONs, FISH, rDNA 18S e rearranjos estruturais.
Nos eucariontes superiores, os genes ribossomais estão organizados em duas famílias multigênicas compostas por
unidades que se repetem in tandem e estão divididos em dois conjuntos: rDNA 45S (que codifica os rRNAs 28S,
18S e 5,8S) e rDNA 5S. Sondas desses genes são fáceis de serem obtidas e visualizadas pela hibridação fluorescente
in situ, sendo excelentes marcadores citogenéticos no entendimento das relações de parentesco entre as espécies.
Já as Regiões Organizadoras de Nucléolo (RONs) são detectadas pela impregnação por nitrato de prata caso
ocorra atividade transcricional do rDNA 45S na intérfase precedente. O presente estudo mapeou fisicamente o
gene ribossomal 18S em cinco espécies do gênero Rineloricaria pertencentes às bacias do Leste-Sul e ParanáParaguai, objtetivando visualizar relações entre o cariótipo dessas espécies. Rineloricaria é o gênero mais especioso
da subfamília Loricariinae com 64 espécies e seu monofiletismo é sustentado por 12 sinapomorfias, sendo uma
exclusiva do gênero. Sua ampla distribuição (da Costa Rica à Argentina) e grande variação no número diplóide (de
36 a 70 cromossomos) refletem diretamente seu alto número de espécies. Rineloricaria cf. latirostris, da bacia do
rio Tietê (Ipeúna/SP), R. cf. pentamaculata, da bacia do rio Paranapanema (São Miguel Arcanjo/SP), R. cf. lima, da
bacia do rio Paraíba do Sul (Vassouras/RJ), R. sp., da bacia dos Rios Costeiros (Angra dos Reis/RJ) e R. sp. aff. lima,
de um rio costeiro que deságua diretamente na Baía de Paranaguá (Morretes/PR), apresentam, respectivamente,
2n=46 (8M+6SM+32ST/A), 2n=58 (2M+4SM+52ST/A), 2n=62 (2M+60ST/A), 2n=64 (4M+2SM+58ST/A) e 2n=68
(2M+66ST/A). O gene rDNA 18S está localizado no primeiro par de metacêntricos, em posição pericentromérica
do braço curto em R. cf. latirostris, apresentando um heteromorfismo de tamanho das RONs claramente detectável.
Conforme o obtido pela hibridação fluorescente in situ, esse heteromorfismo é causado por uma variação no
número de cópias desse gene entre os homólogos e pode ser originado por mecanismos como permutas desiguais,
transposições, deleções ou duplicações. Nas quatro últimas espécies, o gene rDNA 18S localizou-se em posição
terminal nos braços curtos do primeiro par de cromossomos ST/A, sendo as RONs ativas. Os pares de homólogos
portadores do gene rDNA 18S das espécies aqui estudadas possuem tamanhos semelhantes entre si, além da
mesma morfologia e localização desse gene, à exceção de R. cf. latirostris, que difere quanto à localização do gene
e morfologia, podendo essa diferença ser resultado de rearranjos estruturais tais como inversões pericêntricas,
duplicações ou deleções. Na literatura, esse padrão de semelhança entre tamanho, morfologia e localização do
rDNA 18S se repete para outras espécies do gênero, indicando que um possível par de cromossomos ancestral,
portador do gene rDNA 18S, possa ter originado esses pares nas espécies atuais do gênero. Porém, maiores estudos
citogenéticos em Rineloricaria são necessários para a confirmação dessa hipótese.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq
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Distribuição de cromossomos B em populações
de Prochilodus em diferentes Bacias Hidrográficas
Voltolin, TA1; Senhorini, JA2; Bortolozzi, J1; Foresti, F3; Porto-Foresti, F1
¹ Laboratório de Genética de Peixes - Faculdade de Ciências de Bauru - UNESP. 2Instituto Chico Mendes de Conservação da
Biodiversidade - Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes Continentais - ICMBio/CEPTA. 3Laboratório de Biologia e
Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP.
[email protected]
Palavras-chave: cromossomos supranumerários, Prochilodus nigricans, Prochilodus lineatus, fluxo gênico, fixação.
Os cromossomos B é alvo de grande interesse na comunidade científica em geral, pois são elementos genéticos
aparentemente dispensáveis, mas persistem na população e não são eliminados pela seleção natural. A composição,
função e origem destes elementos ainda não são completamente conhecidas. A abundância de cromossomos B
entre os peixes encontra-se dentro da ordem Characiformes onde 31 espécies são distribuídas em seis famílias,
representando 50,82% do total de indivíduos portadores. Entre Prochilodontidae destacam-se quatro espécies
com cromossomos B; Prochilodus marie, Prochilodus brevis, Prochilodus nigricans e Prochilodus lineatus. Dados
na literatura descrevem uma ocorrência variável de cromossomos supranumerários nestas espécies, mas pouco é
conhecido sobre os mecanismos determinantes desta frequência heterogênea. Diante disto, este trabalho objetivou
a realização de um estudo comparativo da frequência de cromossomos supranumerários entre Prochilodus lineatus
e Prochilodus nigricans com intuito de compreender os processos de dispersão e fixação desses microcromossomos
nestas populações selvagens. Coletou-se 20 exemplares de P. lineatus provenientes do rio Mogi-Guaçu, (SP) e 20
exemplares de P. nigricans oriundos do rio Tocantins-Araguaia (TO). Realizou-se análises citogenéticas por meio
de preparações cromossômica utilizando a técnica de estimulação de divisão celular e preparações diretas de
células renais in vivo. Os exemplares analisados em ambas as espécies apresentaram um número diplóide de
2n=54 cromossomos dos tipos meta/submetacêntricos. Todos os indivíduos P. lineatus apresentaram uma
frequência de 0 a 7 cromossomos B. Entre os 20 exemplares P. nigricans analisados citogeneticamente, somente 2
indivíduos apresentaram 1 cromossomo B. A ocorrência de frequência variável de cromossomos B nos indivíduos
coletados no rio Mogi-Guaçu pode estar associado a um processo invasivo não-recente, pois já existe relato destes
microcromossomos nesta população desde o ano de 1983 e estes elementos encontram-se fixados, pois todos
os indivíduos analisados neste trabalho possuíam B. No entanto, a escassa ocorrência de cromossomos B em
populações de P. nigricans deve-se ao fato de ser uma invasão recente e estes elementos parecem estar ainda em
um estágio de fixação, pois a maioria dos indivíduos analisados não apresentaram microcromossomos. Além disso,
o menor fluxo gênico dos cromossomos B em P. lineatus pode estar associado à existência de barreiras naturais,
possibilitando cruzamentos entre indivíduos portadores de cromossomos B e, consequentemente, disseminando
uma maior ocorrência no rio Mogi-Guaçu. A ausência destas barreiras naturais no rio Tocantins-Araguaia
auxilia um maior fluxo gênico dos microcromossomos em populações de P. nigricans possibilitado o cruzamento
ao acaso entre indivíduos portadores e não portadores, contribuindo, de forma mais lenta para o povoamento
destes cromossomos neste ambiente. Obter uma conclusão sobre a dinâmica de fixação dos cromossomos B
em populações portadoras torna-se complexa, pois mesmo considerados elementos dispensáveis ao genoma, os
cromossomos B quando presentes não são eliminados pela seleção natural e sempre se mantém nas populações.
Apoio Financeiro: CAPES, ICMBio, CNPq E FAPESP
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Análise da herança dos diferentes tipos de cromossomos
supranumerários em Prochilodus lineatus provenientes
de cruzamentos dirigidos no CEPTA/ICMBio
Penitente, M1; Voltolin, TA1; Senhorini, JA2; Bortolozzi, J1; Foresti, F3; Porto-Foresti, F1
¹ Laboratório de Genética de Peixes - Faculdade de Ciências de Bauru - UNESP. 2Instituto Chico Mendes de Conservação da
Biodiversidade - Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes Continentais - ICMBio/CEPTA. 3Laboratório de Biologia e
Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP.
[email protected]
Palavras-chave: cromossomos supranumerários, Prochilodus lineatus, morfologia cromossômica
Prochilodus lineatus, popularmente conhecido como curimbatá, é uma espécie de grande frequência na bacia superior
do rio Paraná, envolvendo, sobretudo, os rios Grande, Pardo e Mogi-Guaçu. Citogeneticamente, P. lineatus apresenta
número diplóide de 2n=54 cromossomos dos tipos meta/submetacêntrico com número fundamental igual a 108,
além da presença de 0 a 7 cromossomos supranumerários. Estes cromossomos supranumerários são uma modalidade
de cromossomos adicionais encontrados em espécies vegetais e animais. São frequentemente heterocromáticos e
geralmente não apresentam homologia com nenhum cromossomo do complemento normal (A), podendo variar
tanto no número quanto na morfologia. Em todas as populações de P. lineatus encontrou-se polimorfismo devido à
presença dos cromossomos B, onde pode-se constatar três tipos de microcromossomos B: acrocênctrico (pequeno),
metacênctrico (médio) e submetacênctrico (grande). Atualmente existem somente especulações a respeito de sua
função, origem, estrutura e herança, o que torna a análise da estrutura do DNA destes cromossomos B assim como o
estudo do seu padrão de herança extremamente importante. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a herança
dos cromossomos supranumerários quanto à frequência e morfologia através do estudo de 3 famílias de curimbatá
(P. lineatus) constituídas por reprodutores capturados da população natural do rio Mogi-Guaçu (Pirassununga, SP),
mantidos na piscicultura do CEPTA/ICMBio e descendentes produzidos através de técnicas de reprodução induzida.
Realizou-se análises citogenéticas por meio de preparações cromossômicas utilizando a técnica de estimulação de
divisão celular, para a obtenção de maior número de mitoses e preparações diretas de células renais in vivo e in
vitro. Foram analisadas a herança dos três diferentes tipos de cromossomos B encontrados nesta espécie, onde se
designou de pequeno (P) todos os cromossomos B acrocêntricos, médio (M) todos os metacêntricos e grande (G)
todos os submetacêntricos. Diante disso, observou-se os seguintes resultados: cruzamento 1 - parentais: macho 3B
(1P/2G) X fêmea 3B (1P/2M) – F1: 1B (1P), 1B (1G), 2B (2M), 2B (1P/1M), 3B (2P/1M), 3B (2M/1G), 3B (1M/2G),
3B (1P/2G), 4B (2M/2G), 4B (2P/1M/1G), 4B (2P/2G), 5B (1P/2M/2G); cruzamento 2 – parentais: macho 1B (1M)
X fêmea 2B (2G) – F1: 1B (1M), 2B (1M/1G), 2B (2G); cruzamento 3 – parentais: macho 5B (3M/2G) X fêmea 5B
(4M/1G) – F1: 3B (3M), 4B (2M/2G), 5B (2M/3G), 5B (3M/2G), 5B (4M/1G), 6B (3M/3G), 6B (4M/2G). Diante dos
dados observados pode-se concluir que cromossomos supranumerários da geração parental apresentaram intrínseca
relação com suas respectivas gerações filiais tanto em frequência quanto em morfologia. Estas análises prévias
parecem demonstrar uma forma de herança dos diferentes tipos de cromossomos B predominantemente materna.
Estes dados contribuirão para o entendimento sobre o processo de transmissão destes elementos extras estendendose a uma melhor compreensão da herança e fixação dos cromossomos B na espécie Prochilodus lineatus.
Apoio Financeiro: FAPESP, CEPTA/ICMBio E PROEX
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Ocorrência de um cromossomo supranumerário
em Astynax aff. hastatus (Teleostei, Characiformes)
Oliveira, AG¹; Kavalco, KF1; Almeida-Toledo, LF2; Pazza, R¹
Laboratório de Genética Ecológica e Evolutiva, Campus Rio Paranaíba – Universidade Federal de Viçosa
Laboratório de Ictiogenética, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo – USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Astyanax, heterocromatina constitutiva, Characiformes, evolução cariotípica, cromossomos supranumerários
O Gênero Astyanax também conhecidos popularmente como piabas ou lambaris possui ampla distribuição
geográfica sendo um dos gêneros dominantes na América do Sul. Devido a sua alta diversidade cariótipica e
variabilidade biológica, tem despertado grande interesse dos pesquisadores. No gênero, o número diplóide varia de
2n=36 para A. schubarti a 2n=50 para A. scabripinnis. Nos Astyanax já foram observados a presença não obrigatória
de cromossomos supranumerários ou cromossomos B de diferentes tipos e tamanhos em várias espécies, não
identificando sua verdadeira causa. Neste trabalho foram utilizadas a técnica convencional de coloração com
Giemsa e bandeamento C de alguns exemplares de Astyanax aff. hastatus provenientes da bacia do rio Ariró da
região de Angra dos Reis, RJ, com o objetivo de caracterizar citologicamente a população e comparar com outras
populações previamente estudadas. A análise cariotípica da população amostrada revelou número diplóide de 2n=50
cromossomos, sendo o cariótipo formado por 6M+8SM+4ST+32A, estando presente o grande par metacêntrico
considerado marcador dos Characidae. Em um indivíduo foi observada a ocorrência de um microcromossomo B
presente em 16% metáfases. No emprego da técnica de bandeamento C foi identificado uma pequena quantidade
de heterocromatina constitutiva, que se mostrou restrita às regiões pericentroméricas de vários cromossomos
do complemento. A caracterização cariotípica dessa população vem contribuir para um maior conhecimento da
estrutura cromossômica de Astyanax aff. hastatus bem como auxiliar na taxonomia e esclarecimento das suas
relações evolutivas. Microcromossomos supranumerários já foram descritos em três outras espécies do gênero
Astyanax – A. scabripinnis, Astyanax spB e A. mexicanus, embora os mecanismos para sua origem, bem como para
sua manutenção permaneçam incertas.
Apoio financeiro: CNPq/FAPESP/FAPEMIG
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Cromossomos B em Astyanax bockmanni:
análise da frequência em uma população da Bacia
do Rio Paranapanema, Região de Bauru, SP
Daniel, SN1; Hashimoto, DT1; Bortolozzi, J1; Foresti, F2; Porto-Foresti, F1
¹ Laboratório de Genética de Peixes - Faculdade de Ciências de Bauru – UNESP. 2Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Instituto
de Biociências de Botucatu - UNESP.
[email protected]
Palavras-chave: Cromossomo B, marcadores cromossômicos e A. bockmanni.
Em diversas espécies de animais e vegetais, além dos cromossomos do complemento padrão, elementos
genômicos também têm sido identificados, os quais são denominados supranumerários ou cromossomo B. Estes
cromossomos são freqüentemente heterocromáticos, e bastante variáveis quanto ao seu tamanho e morfologia.
A ocorrência de cromossomos supranumerários em peixes tem tido um avanço crescente nos últimos anos,
onde relata-se a ocorrência em cerca de 40 espécies de diferentes táxons. O gênero Astyanax é atualmente
composto por cerca de 85 espécies, das quais, apenas as espécie A. paranae, A. fasciatus, A. eigenmanniorum, A.
schubart e recentemente em A. altiparanae, têm descrição de ocorrência de cromossomo B. Pesquisas recentes
mostraram que A. bockmanni possui um número cromossômico de 2n=50 cromossomos, e que em alguns
espécimes analisados foi observado um cromossomo extra no seu complemento, resultando em um indivíduo
de 2n=51 cromossomos. Tendo em vista os recentes dados citogenéticos descritos nessa espécie, o presente
trabalho teve como objetivo verificar a frequência de ocorrência do cromossomo B em uma população da espécie
A. bockmanni. Para isso, foram coletadas e analisadas 30 exemplares, aos quais foram submetidas à técnicas
citogenéticas de Giemsa e Banda C. Os resultados obtidos mostraram a ocorrência de diferentes tamanhos de
cromossomos B nessa população: um de tamanho grande do tipo metacêntrico e outro de tamanho pequeno
do tipo acrocêntrico, onde todos se mostraram heterocromáticos. Das 30 amostras analisadas, sete continham
cromossomo B acrocêntrico (23%) e uma amostra continha cromossomo B metacêntrico (0,03%). Em nenhum
dos exemplares analisados foram encontrados os dois tipos de cromossomos B, simultaneamente. Os outros 22
exemplares não apresentaram ocorrência de cromossomo B no seu complemento padrão, sendo cariotipados
como 2n=50 cromossomos. O estudo da herança desses cromossomos nessa espécie poderá contribuir para o
melhor entendimento desse processo, podendo ainda contribuir com informações para a compreensão da sua
origem, herança e dispersão em outras populações de peixes.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP E PROEX
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Variação sexo-específico na freqüência
de cromossomos supranumerários em Corydoras
aeneus (Teleostei: Callichthyiedae)
¹Pacheco, ACS; ¹Parise-Maltempi, PP; ¹Alves, AL
¹Laboratório de Genética de Peixes, UNESP, Rio Claro, SP
[email protected]
Palavras-chave: Corydoras aeneus, Cromossomo B, Citogenética, variação sexo-específica, Ribeirão Claro.
Corydoras compreende atualmente 176 espécies nominais, das quais 143 são considerados válidas, amplamente
distribuído na porção cis-andina da América do Sul. Estudos citogenéticos em Callichthyidae mostram um intenso
número de rearranjos cromossômicos, incluindo eventos de poliploidia na sua história evolutiva, particularmente
do gênero de Corydoras, onde a variação do número diplóide é de 2n=40 a 2n=134 cromossomos. A ocorrência
de cromossomos Bs em Corydoras já foi descrita por diversos autores, no entanto a ausência de informação
sobre freqüência deste tipo cromossomo motivou a realização de uma análise populacional sobre a variação de
cromossomos Bs intrapopulacional e intraindividual na espécie de Corydoras aeneus proveniente do Ribeirão
Claro, bacia do rio Corumbataí (bacia do Tiête), em Rio claro, SP. Análises citogenéticas foram realizadas num
total de 20 indivíduos sendo 13 Machos e 7 Fêmeas, com 20 metáfases analisadas por indivíduo. O número diplóide
modal observado foi de 2n=60 cromossomos, com a ocorrência de 1 ou 2 cromossomos Bs, do tipo Acrocêntrico.
Nos resultados obtidos foi encontrada uma frenquência de cromossomos B muito maior nos machos do que nas
fêmeas. Entre os machos analisados, foi encontrado número diplóide de 2n=60, 61 e 62,sendo que estes números
diplóides ocorrem com frequência de 25%, 30%, 45%, respectivamente. Entre as fêmeas analisadas, o número
diplóide observado foi de 2n=60 e 61, sendo que 2n=60 foi o mais freqüente, aproximadamente 90%, e 2n = 61
aproximadamente 10%. A alta freqüência de Bs e a ocorrência de 2 Bs restrita aos machos, sugerem que estes
cromossomos podem estar ligados ao sexo masculino, enquanto a baixa freqüência de Bs em fêmeas pode sugerir
que este evento deva ser esporádico neste sexo. A origem deste tipo cromossômico ainda é controversa não
apenas em peixes como em outros animais e plantas, assim como a função dos cromossomos supranumerários
ainda é desconhecida. Hipóteses sugerem que estes cromossomos possam conferir algum tipo de adaptação
ambiental ao organismo ou ao sexo. Nesse sentido, novas análises estão sendo realizadas mensalmente nesta
população de Corydoras aeneus, buscando identificar se a freqüência de ocorrência de Bs está relacionada com
algum fator ambiental numa escala temporal e se ocorre a manutenção da maior freqüência de Bs entre os
machos desta população.
Apoio Financeiro: FAPESP (proc. n. 07/58641-0)
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Ocorrência de cromossomos sexuais do tipo ZZ/ZW
em Kronichthys heylandi (Siluriformes, Loricariidae)
Reis, DGS¹; Penteado, PR¹; Brandão, KO1,2; Kavalco, KF1; Almeida-Toledo, LF2; Pazza, R¹
Laboratório de Genética Ecológica e Evolutiva, Campus Rio Paranaíba – Universidade Federal de Viçosa
Laboratório de Ictiogenética, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo – USP
[email protected]
1
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Palavras-chave: evolução cariotípica, sistema cromossômico sexual, Kronichthys, ZZ/ZW, Loricariidae
Com um número estimado de aproximadamente 700 espécies de peixes descritas, a família Loricariidae é
considerada uma das maiores família de peixes de água doce do mundo, sendo conhecidos popularmente como
cascudos ou em algumas regiões como bodós. O número diplóide na família é bastante diversificado, variando
desde 2n = 36 para uma população de Rineloricaria latirostris até 2n = 96 de Hemipsilichthys gobio (descrito como
Upsilodus sp.). A sua distribuição ocorre em a toda região neotropical, ocupando habitats muito variados, o
que demonstra sua capacidade adaptativa. O gênero Kronichthys apresenta 3 espécies, K. heylandi, K. lacerta
e K. subteres e possui poucos dados citogenéticos disponíveis na literatura. Neste trabalho foi estudado uma
população de K. heylandi, provenientes da comunidade Serra d’água, Angra dos Reis, RJ, através de coloração
convencional por Giemsa e identificação de heterocromatina constitutiva através da técnica de banda-C. Foi
verificado para essa população 2n = 54 (42M/SM, 12ST), para ambos machos e fêmeas. Porém, as fêmeas possuem
um par heteromórfico subtelocêntrico, enquanto o mesmo par é idêntico nos machos, evidenciando a ocorrência
de sistema sexual cromossômico do tipo ZZ/ZW. A heterocromatina constitutiva está distribuída na região
telomérica de um par de cromossomos M/SM e também no braço maior de um par de cromossomos M/SM. Na
família Loricariidae já foram identificados sistema cromossômico sexual do tipo ZZ/ZW nas espécies Hypostomus
sp. G, Microlepdogaster leucofrenatus e Loricariichtys platymetopon. O gênero Hypostomus também apresenta
cromossomos sexuais do tipo XX/XY, na espécie H. Macrops. Os dados obtidos auxiliam na compreensão do
gênero, ainda pouco conhecido, e apontam caminhos para futuros estudos que busquem maiores caracteres de
diagnóstico do par cromossômico sexual.
Apoio financeiro: CNPq/FAPESP/FAPEMIG
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Mecanismo de herança das regiões organizadoras
de nucléolo em Prochilodus lineatus através
de cruzamentos intraespecíficos
Ponzetto, JM1; Voltolin, TA1; Senhorini, JA2; Bortolozzi, J1; Foresti, F3; Porto-Foresti, F1
¹ Laboratório de Genética de Peixes - Faculdade de Ciências de Bauru - UNESP. 2Instituto Chico Mendes de Conservação da
Biodiversidade - Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes Continentais - ICMBio/CEPTA. 3Laboratório de Biologia e
Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP.
[email protected]
Palavras-chave: Herança, Qui-quadrado, segregação mendeliana.
A ordem dos Characiformes inclui aproximadamente 2.000 espécies extremamente diversificadas, com ocorrência
na região neotropical. Dentro desta ordem destacam-se os peixes da família Prochilodontidae, os quais estão
restritos em suas distribuição à América do Sul. Dentro desta família é dado ênfase ao gênero Prochilodus por
englobar o maior número de espécies. Prochilodus lineatus, popularmente conhecido como curimbatá é considerado
um peixe de piracema. A espécie P. lineatus, caracteriza-se por apresentar 2n=54 cromossomos e apenas um par
cromossômico portador da Região Organizadora de Nucléolo (NOR), além da presença de microcromossomos
supranumerários. Tendo em vista um melhor entendimento do padrão de herança para a NOR desta espécie
realizou-se um estudo da transmissão desta região por meio das técnicas de impregnação por nitrato de Prata
e Cromomicina (CMA3), através de cruzamentos controlados. Foram selecionados 10 indivíduos, 6 machos e 4
fêmeas, formando 10 casais de reprodutores, os quais foram caracterizados citogeneticamente. Os resultados
desses cruzamentos deram origem à geração filial, sendo os indivíduos estocados separadamente para posterior
sacrifício. Foram realizadas preparações cromossômicas com o intuito de analisar o tipo de herança da NOR para os
indivíduos resultantes de cada cruzamento. Destacando-se um cruzamento realizado entre um macho heterozigoto
(portadores de uma NOR grande em um cromossomo e uma NOR pequena em seu respectivo homólogo) e uma
fêmea homozigota (portadora de NOR de tamanho pequeno em ambos os homólogos), onde 18 indivíduos da
geração F1 foram analisados, destes 10 foram considerados heterozigotos e 8 foram considerados homozigotos
para a NOR do tipo pequena. Visto que a distribuição para este cruzamento segue a proporção 1:1 testamos a
validade da hipótese referente ao padrão de transmissão do tipo segregação mendeliana, utilizando-se o método
do Qui-quadrado (X2). O resultado obtido mostrou que a probabilidade do observado concordar com o esperado,
está entre 50 e 80%, portanto a hipótese testada para o padrão de transmissão foi consistente com a expectativa de
segregação mendeliana, já que as diferenças não se mostraram significativas. Tanto a impregnação por nitrato de
Prata quanto a técnica de cromomicina foram considerados eficientes para a detecção dos polimorfismos da NOR
bem como para um prévio esclarecimento de seu mecanismo de herança.
Apoio Financeiro: FAPESP E CEPTA/ICMBio
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Análise da herança de cromossomos supranuméricos
em gerações filiais de Curimbatá (Prochilodus lineatus)
Stevanato, MC1; Voltolin, TA1; Senhorini, JA2; Foresti, F3; Bortolozzi, J1; Porto-Foresti, F1
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual Paulista.
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade, Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes Continentais, CEPTA.
3
Departamento de Morfologia, Universidade Estadual Paulista.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: cromossomos supranumerários, Prochilodus lineatus, cruzamento dirigido, herança, manutenção
Prochilodus lineatus é um iliófago caraciforme pertencente à família Prochilodontidae. O gênero Prochilodus é
amplamente distribuído pela América do Sul e no Brasil está presente em todas as principais bacias hidrográficas,
sendo a espécie que se apresenta com maior frequência na bacia superior do Rio Paraná. Do ponto de vista
citogenético, são animais que possuem número diplóide 2n=54 cromossomos e podem apresentar de 0 a 7
microcromossomos B. Supranuméricos ou cromossomos B são cromossomos adicionais, dispensáveis, presentes
em cerca de 15% de todas as espécies de plantas e animais, entretanto, sua estrutura, função e comportamento
é particular nos diferentes grupos, tornando difícil uma conclusão geral sobre sua importância para as espécies.
Estudos indicam que provavelmente os microcromossomos teriam surgido dos cromossomos A, porém não
seguindo seu caminho evolutivo e nem apresentando homologia com estes. São geralmente heterocromáticos,
podendo apresentar variações tanto no número quanto na morfologia. Partindo do fato de que existem controvérsias
sobre a função e o efeito da presença dos cromossomos B em plantas e animais, foram realizados cruzamentos
dirigidos entre os exemplares de Prochilodus lineatus, com o intuito de compreender o processo de manutenção
dos cromossomos B nesta espécie. Os cruzamentos compreenderam 4 famílias de curimbatás constituídas de
reprodutores, capturados da população natural do rio Mogi-Guaçu (Pirassununga, SP) e mantidos na piscicultura
do CEPTA/ICMBio e de seus descendentes, produzidos através de técnicas de reprodução induzida. A partir de
análises de cromossomos mitóticos, foram obtidos os seguintes resultados que permitiram identificar o número
de cromossomos supranuméricos da geração F1: Casal A (macho 1B x fêmea 2B) apresentou F1 com exemplares
possuindo 1B e 2B; Casal B (macho 6B x fêmea 5B) apresentou F1 com exemplares possuindo 3B, 4B, 5B, 6B e 7B;
Casal C (macho 6B x fêmea 4B) apresentou F1 com exemplares possuindo 3B, 4B, 5B e 7B e o ultimo casal analisado
Casal D (macho 5B x fêmea 4B) apresentou F1 com exemplares possuindo 2B, 3B, 4B e 5B. Os dados obtidos até
o presente momento sugerem que a herança desses cromossomos supranuméricos é bastante heterogênea e
aparentemente não segue um padrão comum de herança mendeliana e a soma das médias dos parentais nunca
excede suas respectivas gerações filiais.
Auxílio financeiro: FAPESP, CNPq E CEPTA/ICMBio
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Cromossomos sexuais e cromossomos B
em Characidium cf. gomesi (Characiformes, Crenuchidae)
análises por microdissecção e pintura cromossômica
Pazian, MF; Pansonato-Alves, JC; Shimabukuro-Dias, CK; Oliveira, C; Foresti, F
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP
[email protected]
Palavras-chave: Characidium, sistema ZZ/ZW, Characiformes, FISH, supranumerários.
Os estudos cromossômicos no gênero Characidium têm evidenciado características particulares para cada
espécie e/ou população analisada. Apesar dos dados citogenéticos disponíveis indicarem conservação no número
diplóide (2n=50 cromossomos), observa-se extensa variação estrutural no cariótipo das espécies, notadamente em
relação a eventos cromossômicos envolvendo as regiões de heterocromatina constitutiva. Em algumas espécies, a
ocorrência de cromossomos sexuais heteromórficos do tipo ZZ/ZW, com o W totalmente heterocromatinizado,
está associada à ocorrência de cromossomos B, evidenciando uma relação ZW/B pouco comum entre os peixes
Neotropicais. O desenvolvimento da técnica de microFISH permitiu a localização cromossômica de seqüências
específicas, a detecção de rearranjos cromossômicos e a pintura de cromossomos inteiros. Atualmente, a pintura
cromossômica tornou-se uma ferramenta importante em estudos citogenéticos evolutivos nos peixes neotropicais.
Considerando a existência de cromossomos sexuais ZW e cromossomos B heterocromáticos na população
de Characidium cf. gomesi do rio Pardo, bacia do rio Paranapanema, foi confeccionada uma sonda a partir dos
cromossomos B dessa população utilizando-se a metodologia de microdissecção cromossômica, com amplificação
por DOP-PCR. A aplicação da técnica FISH com a sonda produzida sobre os cromossomos de exemplares desta
população evidenciou marcação em todos os cromossomos B, conforme esperado. No entanto, foi constatado
que também o cromossomo W se apresentou totalmente hibridizado, bem como a região pericentromérica
do cromossomo Z. O fato dessa sonda hibridar tanto nos cromossomos sexuais como nos B sugere que estes
cromossomos compartilham seqüências, o que poderia indicar uma possível origem dos cromossomos B a partir
de elementos genômicos do complemento cariotípico A nesta espécie.
Apoio Financeiro: Capes, CNPq, Fapesp.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Análise de sequências dos cromossomos sexuais
do gênero Triportheus para busca de elementos
repetitivos associados a regiões heterocromáticas
Diniz, D1; Sobrinho-Scudeler, PE1; Alves, A1; Claro, FL2, Peixoto, MS2; Almeida-Toledo, LF2 Bertollo, LAC3;
Oliveira, C1; Foresti, F1.
Departamento de Morfologia, Universidade Estadual Paulista, UNESP - Botucatu-SP.
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Universidade de São Paulo, USP - São Paulo/SP.
3
Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, UFSCar - São Carlos - SP.
[email protected]
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Palavras-chave: microdissecção, sequenciamento, cromossomos sexuais, Triportheus nematurus.
O gênero Triportheus, pertencente à família Characidae, é representado por peixes de pequeno porte, com
ampla distribuição na América do Sul. Todas espécies analisadas, oriundas de diferentes bacias hidrográficas,
apresentaram número cromossômico diplóide 2n=52, com uma macroestrutura cariotípica muito semelhante,
além de um sistema de cromossomos sexuais do tipo ZZ/ZW, constituindo uma sinapomorfia para esse grupo.
A produção de sondas através da microdissecção cromossômica dos cromossomos sexuais e amplificação por
DOP-PCR (Degenerate Oligonucleotid Primer) já foi realizada e, atualmente vem sendo usada como uma poderosa
ferramenta para estudos em citogenética molecular nesse grupo. Posteriormente os fragmentos gerados através
da DOP-PCR foram clonados e sequenciados. Algumas diferenças encontradas no par sexual estão relacionadas
com heteromorfismo de tamanho e com a presença de blocos heterocromáticos, que geralmente funcionam como
marcadores espécie-específicos neste caso. Através das análises das sequências, será possível verificar a ocorrência
de elementos repetitivos associados exclusivamente aos cromossomos sexuais e com regiões heterocromáticas
presentes nesses pares cromossômicos. Dessa maneira, será possível uma melhor compreensão na dinâmica
evolutiva nessa porção do genoma bem como sua ancestralidade em Triportheinae. Portanto, através da hibridação
fluorescente in situ (FISH) com sondas dos cromossomos Z e W, análises dos sequenciamentos e posteriormente,
com a identificação de seqüências repetitivas (DNA satélite) no genoma de Triportheus, pretende-se contribuir
com informações relevantes no que diz respeito à ancestralidade, compreensão, provável origem e a diferenciação
no desenvolvimento do mecanismo do sistema de cromossomos sexuais, contribuindo assim, para elucidação
ainda controversa, da origem e evolução deste sistema em peixes da região Neotropical.
Apoio: FAPESP
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Microdissecção do cromossomo B de Astyanax
scabripinnis (Characiformes, Characidae) e estudo
estrutural por hibridação in situ
Santos, NM; Shimabukuro-Dias, CK; Pazian, MF; De Rosa, LV; Cruz, VP; Oliveira, C e Foresti, F.
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, 18618-000, Botucatu, SP, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Astyanax scabripinnis, cromossomo B, bandamento C, DOP-PCR e hibridação in situ.
A espécie Astyanax scabripinnis tem sido estudada de modo extensivo, pois além de possuir uma ampla
diversidade cariotípica, com números diplóides de 2n=46, 2n=48 e 2n=50 cromossomos e cariótipos diferenciados,
a espécie também tem mostrado um polimorfismo cromossômico caracterizado pela presença de cromossomos
supranumerários, sendo que diferentes tipos de cromossomos B foram relatados com base na morfologia ou no
padrão de heterocromatina constitutiva. A técnica de microdisseção cromossômica consiste num método eficiente
de investigação da composição molecular de segmentos genômicos ou de cromossomos, tendo sido utilizada em
várias espécies animais e vegetais. No presente trabalho, foi analisada uma população de Astyanax scabripinnis do
córrego do Cascatinha (bacia do rio Tietê, município de Botucatu). O número diplóide padrão caracterizado foi
de 2n=50 cromossomos (7M+16SM+2ST) e um cromossomo supranumerário encontrado apresentou morfologia
semelhante a do primeiro par de cromossomos metacêntricos no cariótipo dos indivíduos desta população. Para
procedimento da microdissecção deste elemento genômico, a suspensão de células foi gotejada em lamínulas limpas
e submetidas à técnica de bandamento C, para evidenciar o cromossomo B que se apresenta heterocromático.
Cerca de 6 cromossomos B foram microdissectados e submetidos à técnica de DOP-PCR para a amplificação
de seu DNA. O produto obtido foi marcado por PCR com Digoxigenina-11-dUTP e utilizado como sonda para
FISH. Os dados obtidos revelaram que a marcação foi específica para o cromossomo supranumerário, sugerindo
que o DNA repetitivo presente no B possui uma constituição distinta daquele das regiões de heterocromatina
presentes nos cromossomos do complemento A, como já havia sido detectado pelo bandamento C. Essa sonda
será posteriormente hibridada no complemento cariotípico de indivíduos de outras populações de A. scabripinnis
portadoras de cromossomos B, a fim de se obterem informações sobre a sua estrutura, bem como sobre a origem
e evolução, destes segmentos genômicos na espécie e, por conseguinte, nos peixes.
Apoio financeiro: FAPESP, CAPES, CNPq.
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Isolamento e caracterização de uma família de DNA
satélite em Moenkhausia sanctaefilomenae
(Teleostei, Characiformes, Characidae)
Sobrinho Scudeler, PE1; Diniz, D1; Peixoto, MS2; Claro, FL2; Wasko, AP3; Almeida-Toledo, LF2; Oliveira, C1 e
Foresti, F1
Departamento de Morfologia, Universidade Estadual Paulista, UNESP - Botucatu-SP.
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Universidade de São Paulo, USP - São Paulo/SP.
3
Departamento de Genética, Universidade Estadual Paulista, UNESP - Botucatu-SP.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Moenkhausia sanctaefilomenae, DNA satélite, Southern Blotting, FISH, Cromossomo B.
O gênero Moenkhausia apresenta uma variação no número diplóide entre 2n=48 e 2n=50, além de variações
interespecíficas quanto à presença ou ausência de cromossomos B. Esses cromossomos são caracterizados
através do bandamento C na maioria das espécies de peixes como fortemente heterocromáticos podendo,
entretanto, apresentarem-se eucromáticos ou parcialmente heterocromáticos. A aplicação de diferentes técnicas
cromossômicas associadas à técnicas de genética molecular tem possibilitado uma caracterização mais refinada
nos estudos dos cromossomos B, direcionando a um melhor entendimento sobre sua origem e função. Grande
parte do genoma dos eucariontes é representada por seqüências repetitivas de DNA. Neste trabalho foi possível
identificar, isolar e caracterizar essas seqüências presentes no genoma da espécie Moenkhausia sanctaefilomenae.
Na busca por seqüências repetitivas, uma triagem do genoma com a utilização de diversas endonucleases de restrição
foi realizada, evidenciando pela enzima HinfI, a presença de uma banda característica de aproximadamente 200
pares de bases visível em gel de agarose. A banda correspondente à espécie Moenkhausia sanctaefilomenae foi
extraída, clonada, seqüenciada e sua organização no genoma determinada através da hibridação em membrana em
cromossomos metafásicos. O seqüenciamento de dois clones recombinantes mostrou que o clone 04 é composto
por 249pb e o clone 07 é composto por 232 pares de base. O segmento de DNA isolado está organizado em tandem
no genoma, caracterizando uma seqüência de DNA satélite denominado Ms-HinfI. A hibridação nos cromossomos
(hibridação fluorescente in situ - FISH) indicou a presença do satélite isolado nas regiões pericentroméricas
na maioria dos cromossomos, coincidindo com as regiões heterocromáticas marcadas pelo bandamento C.
A variação da presença desse fragmento no genoma de outras espécies de Moenkhausia indica a existência de
um marcador molecular específico para o gênero, que poderá ser utilizado em estudos populacionais, ou ainda
envolvendo relações de espécies próximas. Além disso, poderá ser utilizado em estudos da organização estrutural
dos cromossomos, colaborando com a compreensão dos mecanismos ocorridos na evolução genômica desta
espécie de peixe e do grupo. Dessa forma, neste trabalho pela primeira vez realiza-se um estudo de DNA satélite
na espécie Moenkhausia sanctaefilomenae, o qual demonstra um interessante padrão em relação à distribuição,
tamanho e números de sítios encontrados nos cromossomos do complemento A das espécies analisadas.
Apoio: FAPESP.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
37
Identificação de espécies do gênero Astyanax (Pisces:
Characidae) através de PCR-RFLP do DNA mitocondrial
Marreta, ME1; Pozzobon, APB1; Parise-Maltempi, PP1; Alves, AL1
Laboratório de Genética de Peixes – Instituto de Biociências - UNESP Rio Claro.
[email protected]
1
Palavras-chave: Taxonomia molecular, Astyanax, PCR-RFLP, DNA mitocondrial, genética de peixes.
O gênero Astyanax, distribuído desde o México a Argentina, é um dos maiores em número de espécies entre os
peixes Neotropicais, apresentando cerca de 100 espécies válidas. Devido a sua sistemática complicada e ainda
não resolvida, o número de espécies é subestimado, resultado da falta de evidências morfológicas para corroborar
seu status monofilético e da ausência de uma chave taxonômica conclusiva sobre as espécies do gênero. Apesar
de sua grande complexidade, uma das maiores da ictiofauna Neotropical, ainda há pouca informação acerca da
diversidade genética, estrutura populacional e relações evolutivas entre espécies de Astyanax. Nesse sentido, estudos
moleculares que busquem fornecer ferramentas para uma correta identificação taxonômica são necessários.
Portanto, o presente trabalho teve como objetivo distinguir e caracterizar espécies de Astyanax da Bacia do Alto
rio Paraná, através da análise de PCR-RFLP de DNA mitocondrial. Foram amplificados completamente os genes
mitocondriais ATPase 6/8 (840pb) e Citocromo b (1140pb) para populações de Astyanax paranae, A. bockmanni, A.
fasciatus e A. altiparanae. As sequências foram submetidas à digestão com as endonucleases AluI, BamHI, HindIII,
HpaII e XbaI. Das enzimas utilizadas, descartou-se XbaI e HpaII, para ATPase 6/8, e XbaI e HindIII, para Citocromo
b, já que as mesmas não apresentaram sítios de restrição distintos para as espécies estudadas. Observou-se
que, para o gene ATPase 6/8, as enzimas BamHI, HindIII e AluI produziram um padrão espécie-específico de
fragmento de restrição de DNA mitocondrial capaz de separar apenas A. altiparanae das demais espécies. Para
o gene Citocromo b, a enzima AluI mostrou ser um potencial marcador para a diferenciação entre A. fasciatus, A.
paranae e A. altiparanae. Embora esta enzima gere fragmentos de restrição de tamanhos iguais para A. paranae
e A. bockmanni, a digestão com as enzimas HpaII e BamHI, foram eficientes na separação dessas duas espécies.
Polimorfismos intra-específicos foram observados para a população de Astyanax altiparanae e para um indivíduo
de A. fasciatus e A. bockmanni para ambos os genes, porém sem alterar o padrão espécie-específico, Esses resultados
sugerem que a utilização do gene Citocromo b e o tratamento combinado das enzimas AluI, HpaII e BamHI podem
se caracterizar em uma importante ferramenta na identificação de espécies do gênero Astyanax, na bacia do Alto
rio Paraná, identificando as quatro espécies de maior distribuição e abundância nesta bacia. Assim, marcadores
moleculares gerados pela análise de PCR-RFLP podem ser bastante informativos e eficientes na caracterização de
espécies de Astyanax, auxiliando estudos taxonômicos, filogenéticos e filogeográficos.
Apoio financeiro: Capes
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Taxonomia molecular sugere a redução da área
de distribuição de Astyanax fasciatus (Pisces: Characidae)
Corrêa, JW1; Parise-Maltempi, PP1; Alves, AL1
Laboratório de Genética de Peixes – LGP - Depto. de Biologia - UNESP Rio Claro.
[email protected]
1
Palavras-chave: Taxonomia molecular, Astyanax fasciatus, Citocromo b, DNA mitocondrial.
A taxonomia molecular vem se tornando nos últimos anos uma importante ferramenta de auxílio a taxonomia
clássica na identificação de espécies com difícil posicionamento taxonômico. Para tanto, o emprego de técnicas
moleculares como PCR-RFLP, microssatélites e principalmente a análise de sequências de DNA, sobretudo o
DNA mitocondrial, tem sido fundamentais para o êxito na identificação de espécies crípticas ou na evidência de
subestimativa de fauna. Esta última, se reflete no caso de Astyanax fasciatus, uma espécie de peixe de pequeno porte
com ampla distribuição geográfica, desde o México ao Sul do Brasil, com identificação de localidade tipo na bacia
do rio São Francisco. Devido a ampla distribuição geográfica na América Central+México e do Sul a questão de
subestimativa desta ictiofauna é questionada, evidências morfológicas sugerem que esta espécie possa constituir
um “complexo de espécies”. Nesse sentido, buscamos caracterizar a diversidade genética entre populações de
Astyanax fasciatus do México, da Guatemala, e do Brasil, através da análise parcial do gene mitocondrial Citocromo
b (400pb). Foram seqüenciados dez indivíduos representantes de duas populações de Astyanax fasciatus da bacia
do rio Paranapanema e rio Tietê, no Brasil, enquanto, as populações da America Central e do México foram obtidas
no GenBank, num total de vinte indivíduos. Após o alinhamento das sequências evidenciou-se que a relação entre
transição e transversão revela que não há saturação dos dados. Análises filogenéticas pelos métodos de NJ e MP
identificam dois clados monofiléticos altamente suportado, representando a América do Sul (caldo1) e América
Central+México (clado 2), a distância genética média entre os dois clados é de 5%. Aplicando-se o relógio molecular
com taxa de evolução de 1.2%/ma para o gene Citocromo b, estima-se que estes dois clados estão separados a
cerca de 4.1ma. A alta diversidade genética entre os clados sugere que Astyanax fasciatus seja composto, ao menos,
por duas espécies distintas, como a localidade tipo da espécie se encontra na América do Sul, sugerimos a redução
da sua área de distribuição apenas para esta região, onde ainda é considerada um “complexo de espécies”. Para
a América Central + México há evidências moleculares de que Astyanax fasciatus seja sinônimo de Astyanax
mexicanus, fortalecendo a hipótese de redução de sua distribuição geográfica para a América do Sul.
Apoio financeiro: FAPESP (proc. n. 07/58641-0)
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Citogenética clássica e molecular de Astyanax ribeirae
(Teleostei, Characidae), um lambari endêmico
da Mata Atlântica
Leite, LE¹; Kavalco, KF1; Almeida-Toledo, LF2; Pazza, R¹
Laboratório de Genética Ecológica e Evolutiva, Campus Rio Paranaíba – Universidade Federal de Viçosa
Laboratório de Ictiogenética, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo – USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Astyanax, FISH, evolução cariotípica, Mata Atlântica, DNA satélite
O gênero Astyanax abrange os peixes popularmente conhecidos como lambaris ou piabas, que possuem como
habitat sistemas aquáticos desde o sul dos Estados Unidos até o norte da Argentina, tornando o gênero Astyanax
um dos mais especiosos e mais bem estudados da ictiofauna neotropical. O número diplóide do gênero varia
entre 2n=36 e 2n=50 cromossomos, com o primeiro par cromossômico do tipo metacêntrico grande, característico
dos Characiformes. Neste trabalho, foram analisados exemplares de A. ribeirae endêmicos da bacia do rio Ribeira
de Iguape – SP, provenientes de três diferentes locais de coleta. Foram realizadas as análises convencionais de
bandamento-C para a localização da heterocromatina constitutiva, impregnação por nitrato de prata para
evidenciar as Regiões Organizadoras de Nucléolo, assim como a Hibridação Fluorescente in situ (FISH) utilizandose sonda de genes ribossômicos 18S, 5S e do DNA satélite As-51. As três populações apresentaram uma mesma
constituição cariotípica, constituindo em 2n=50 cromossomos, sendo 4M + 10SM + 6ST + 30A e número fundamental
NF=70. A impregnação por nitrato de prata identificou a ocorrência de RONs simples em cromossomos ST/A. O
bandeamento C revelou a presença de pequena quantidade de heterocromatina constitutiva, estando localizada
nas regiões pericentroméricas de alguns cromossomos. A FISH permitiu a identificação de quatro sítios de rDNA
18S e de seis sítios de rDNA 5S, todos localizados em cromossomos ST/A. A sonda do DNA satélite As-51 não
mostrou homologia com os cromossomos de A. ribeirae, indicando que essa espécie parece ser uma espécie única
no gênero. Ações conservacionistas são necessárias para que se preservem os poucos remanescentes de Mata
Atlântica do Brasil, único habitat deste lambari.
Apoio financeiro: CNPq/FAPESP/FAPEMIG
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Estudo do polimorfismo das regiões organizadoras
de nucléolos em quatro populações da espécie
Astyanax altiparanae de diferentes bacias hidrográficas
Monteiro, JR1; Hashimoto, DT1; Bortolozzi, J1; Foresti, F2; Porto-Foresti, F1
¹ Laboratório de Genética de Peixes - Faculdade de Ciências de Bauru - UNESP. 2Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Instituto
de Biociências de Botucatu - UNESP.
[email protected]
Palavras-chave: Regiões Organizadoras de Nucléolos; Astyanax altiparanae; Cromomicina; nitrato de Prata; polimorfismo.
As Regiões Organizadoras de Nucléolos (NORs) são regiões dos cromossomos envolvidas na transcrição dos genes
ribossômicos e podem ser visualizadas nos cromossomos através de algumas técnicas, o que as tornam importantes
marcadores citogenéticos. Em peixes tem sido relatados casos de variabilidade nos padrões das NORs, relacionadas
ao número, localização e polimorfismos de tamanho desta região no genoma. A família Characidae apresenta
NORs múltiplas, inclusive a espécie Astyanax altiparanae, analisada no presente estudo. Esta espécie apresenta
número diplóide conservado de 2n=50 cromossomos, porém há uma grande variação com relação à localização
das NORs. Com o intuito de observar a variação das NORs em diferentes populações de Astyanax altiparanae de
diferentes bacias hidrográficas, foram analisados exemplares pertencentes aos rios Batalha, Campo Novo e Sucuri,
pertencentes à bacia do Tietê, e exemplares do rio Alambari pertencente à bacia do Paranapanema. Para detectar
esta variação foram utilizadas as técnicas de coloração por nitrato de Prata e Cromomicina/DAPI sequencial. A
coloração por nitrato de Prata evidenciou NOR simples no braço curto de um par de cromossomo subtelocêntrico
nos indivíduos das quatro populações. Além disso, foram encontrados polimorfismos de tamanho das NORs em
indivíduos do rio Batalha e Sucuri. Também foram encontradas NORs múltiplas nos indivíduos do rio Campo
Novo, Batalha e Alambari que variaram intra e interpopulacionalmente. A utilização da técnica de Cromomicina
evidenciou duas marcações no braço curto de um par de cromossomo subtelocêntrico; duas marcações na região
telomérica do braço longo de um par submetacêntrico e uma marcação na porção telomérica do braço longo de
um cromossomo subtelocêntrico em indivíduos do rio Alambari; em exemplares do Campo Novo a Cromomicina
mostrou duas marcações no braço curto de um par de cromossomo subtelocêntrico e uma marcação centromérica
em um acrocêntrico. No rio Batalha os indivíduos apresentaram duas marcações no braço curto de um par
submetacêntrico e duas na região telomérica de um par metacêntrico. No conjunto cariotípico dos lambaris do rio
Sucuri foram encontradas duas marcações no braço curto de um par subtelocêntrico, uma marcação intersticial
no braço curto de um cromossomo submetacêntrico e outra no braço curto de um cromossomo subtelocêntrico.
Nas quatro populações foram encontrados polimorfismo de tamanho entre cromossomos homólogos. A marcação
com DAPI evidenciou marcações AT-positivas intersticiais nas quatro populações analisadas. De acordo com os
resultados obtidos, observou-se que o emprego da técnica de nitrato de Prata e Cromomicina foram coincidentes
com apenas um par de cromossomo subtelocêntrico, porém a Cromomicina marcou regiões que não foram
detectadas pelo nitrato de Prata. Sendo assim, a única técnica adequada para diferenciar as populações foi a
Cromomicina, já que a marcação por nitrato de Prata não foi específica para as diferentes populações.
Apoio financeiro: CNPQ E FAPESP
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Variabilidade genética em populações
de Astyanax paranae (Pisces: Characidae)
na Bacia do Rio Paranapanema
Pozzobon, APB; Marreta, ME; Alves, AL
Laboratório de Genética de Peixes – LGP – UNESP, Instituto de Biociências de Rio Claro, Rio Claro, SP
e-mail: [email protected]
Palavras-chave: Astyanax paranae, PCR-RFLP, genética de populações, Citocromo b.
A capacidade de dispersão é um fator determinante do fluxo gênico, afetando diretamente a distribuição da
variação genética entre as populações naturais. Espécies com alta capacidade de dispersão exibem baixos níveis
de estruturação populacional, enquanto aquelas com baixa dispersão, ou barreiras intransponíveis, apresentam
um grau significativo de estruturamento populacional. Astyanax paranae são peixes restritos a cabeceiras de rios e,
portanto apresentam barreiras que dificultam seu fluxo gênico, facilitando a formação de estrutura populacional.
Com o objetivo de verificar a diversidade genética populacional na bacia do Paranapanema, utilizamos a técnica
de PCR-RFLP para o gene Citocromo B, completamente amplificado (1140pb). Foram testadas 5 enzimas de
restrição (AluI, BamHI, HpaII, HindIII, XbaI), dentre elas 2 (XbaI e HindIII) não apresentaram polimorfismos entre
as 7 populações de Astyanax paranae e da população usada como grupo externo, Astyanax fasciatus. Duas enzimas
(HpaII e BamHI) mostraram baixa variabilidade interpopulacional, diferenciando apenas duas populações. A
enzima HpaII apresentou dois haplótipos distintos (Hpa-h1, Hpa-h2), o Hpa-h1 com três fragmentos de restrição
(500, 350, 250bp), foi o mais freqüente, presente em 7 populações; e Hpa-h2 não houve fragmento de restrição
(1140pb), presente em uma população. A enzima BamHI também apresentou dois haplótipos (Bam-h1, Bam-h2),
Bam-h1 com dois fragmentos de restrição (800, 300pb); foi o mais freqüente, presente em 7 populações; Bam-h2
não apresentou fragmentos de restrição (1140pb), obtido na mesma população com o padrão Hpa-h2. No entanto,
a enzima (AluI) se mostrou altamente informativa, apresentando seis haplótipos entre as sete populações de
Astyanax paranae e o grupo externo A. fasciatus. Entre os seis haplótipos (Alu-h1 a Alu-h6), o Alu-h1 apresenta
quatro fragmentos de restrição (400, 250, 200, 150pb), obtidos na população de fasciatus; o Alu-h2 apresenta três
fragmentos de restrição (500, 350, 250pb) obtidos em uma população de parane; o Alu-h3 apresenta dois fragmentos
de restrição (900, 200pb) observados em uma população de parane; o Alu-h4 apresenta quatro fragmentos de
restrição (400, 350, 200, 150pb) presente em duas populações de parane; o Alu-h5 apresenta dois fragmentos de
restrição (500, 100pb) presente em duas populações de parane; o Alu-h6 não apresenta fragmentos de restrição
(1140pb), tendo sido observado em uma população.de parane. A baixa variabilidade genética observada no gene
mitocondrial Citocromo b pelas enzimas BamHI, HpaII, HindIII, XbaI, indicam que estas endonucleases não são
informativas ao nível populacional, enquanto a enzima AluI, parece representar uma importante ferramenta
na identificação de variação populacional em Astyanax paranae, sendo altamente polimórfica nesta espécie.
Possibilitando assim, a realização de futuras análises filogeográficas e de estrutura populacional nesta espécie para
os principais rios da bacia do Alto rio Paraná.
Apoio Financeiro: FAPESP (proc. n. 07/58641-0)
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Localização da Heterocromatina constitutiva,
por coloração com cromamicina A3, de Astyanax
altiparanae (Uberlândia-MG)
Oliveira, DM1; Oliveira-Júnior, RJ1; Morelli, S1
Universidade Federal de Uberlândia – Instituto de Genética e Bioquímica
[email protected]
1
Palavras-chave: Characidae; GC específico; Córrego dos Caetano; Lambari; Região Neotropical.
Os peixes representam o grupo mais diversificado e um dos mais interessantes para estudos da variabilidade
genética e de evolução entre os vertebrados. A fauna de peixes neotropicais é constituída, principalmente, por
grupos bastante numerosos de Characiformes, Siluriformes e Perciformes. A família Characidae, pertencente à
ordem dos Characiformes, é uma das maiores e mais complexas entre as famílias da ordem, que compreende
aproximadamente 170 gêneros e mais de 885 espécies. O gênero Astyanax, pertencente à família Characidae,
compreende mais de uma centena de espécies e subespécies, muitas das quais ainda não foram descritas. Tal
gênero é um dos táxons de peixes de água doce mais amplamente distribuído nas Américas, sua distribuição vai
desde a Argentina até a fronteira do México com os Estados Unidos. Seu estudo se faz cada dia mais importante
para sua melhor classificação e subdivisão em subespécies. A variabilidade cariotípica entre as diferentes
populações de diferentes espécies de Astyanax é muito comum, sendo que o número diplóide varia de 2n=36 a
2n=50 cromossomos. A espécie Astyanax altiparanae é conhecida popularmente como lambari do rabo amarelo
e seu número diplóide é de 2n=50. O presente estudo objetivou determinar a localização da Heterocromatina
Constitutiva da espécie de Astyanax altiparanae, de uma população do Córrego dos Caetano, Uberlândia-MG,
por meio de técnicas de coloração com fluorocromos GC específicos. O fluorocromo usado para a realização de
tal técnica foi a Cromamicina A3 (GC específico). As marcações da Heterocromatina Constitutiva rica em G-C
ocorreram em mais de um par cromossômico. O primeiro cromossomo submetacêntrico foi marcado no braço
menor e em alguns outros cromossomos tais marcações ocorreram em regiões intersticiais e teloméricas. Os
dados citogenéticos obtidos no presente estudo permitem caracterizar a população de Astyanax altiparanae do
córrego dos Caetano, Uberlândia-MG.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, FAPEMIG e UFU.
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Caracterização cromossômica da espécie Astyanax
bimaculatus do Córrego Taboquinha (Porto Nacional – TO)
Santos, LP¹; Correia, VCS¹; Oliveira-Júnior, RJ¹; Morelli, S¹
¹ Instituto de Genética e Bioquímica, Universidade Federal de Uberlândia
[email protected]
Palavras-chave: Heterocromatina, NORs, cromossomos, cariótipo, Characidae.
O gênero Astyanax, juntamente com a maioria dos antigos Tetragonopterinae é considerado como Incertae Sedis
dentro da família Characidae. É um dos maiores gêneros e tem uma ampla distribuição geográfica na região
neotropical, sendo encontrado do sul dos Estados Unidos ao norte da Argentina. Os dados citogenéticos deste gênero
têm revelado uma diversidade cromossômica acentuada, cujos representantes apresentam uma variabilidade
cariotípica compreendida entre 2n=36 a 2n=50 cromossomos. A espécie Astyanax bimaculatus, conhecida como
lambari de rabo amarelo, caracteriza-se por apresentar uma mancha ovalada e escura na região umeral e outra na
base da nadadeira caudal. As espécies A. lacustris e A. altiparanae, ambas de bacias diferentes, eram consideradas
como uma única espécie (A. bimaculatus), por apresentarem padrão morfológico semelhante, porém estudos
recentes demonstraram particularidades suficientes para classificá-las como espécies distintas. Neste trabalho, é
apresentada a descrição cariotípica da espécie Astyanax bimaculatus, pertencente à bacia do Rio Tocantins. Este
rio, considerado o segundo maior no território brasileiro, tem sido marcado pela interferência humana através
da construção de barragens que influenciaram no seu curso natural. Devido a grande ação humana tornaram-se
necessários estudos que caracterizem a ictiofauna do rio Tocantins, avaliando assim os impactos resultantes das
pressões ambientais causadas às populações naturais. A espécie foi coletada no córrego Taboquinha na região de
Porto Nacional – TO e analisada citogeneticamente com técnica de coloração convencional por giemsa; banda
C para evidenciar blocos de heterocromatina constitutiva e impregnação por nitrato de prata para detecção das
Regiões Organizadoras de Nucléolos (AgNORs). Foi observado número cromossômico de 2n=50 para machos e
fêmeas, não apresentando dimorfismo sexual. As NORs se revelaram múltiplas com até três pares cromossômicos
envolvidos com a organização nucleolar. Entre estes, um par de cromossomos subtelocêntrico, com o braço
menor totalmente marcado, se mostrou presente em todas as metáfases analisadas. O estudo da heterocromatina
constitutiva revelou a presença de blocos heterocromáticos nas regiões intersticiais, centroméricas e teloméricas,
além do braço curto do par subtelocêntrico responsável pela organização nucleolar, o que corrobora com dados
observados em outras populações. Os dados aqui obtidos revelam variedade em relação ao número cromossômico
envolvido com a organização nucleolar, mostrando que os indivíduos desta população também apresentam uma
diversidade cariotípica em relação a outras populações. Sendo assim, acredita-se que estas informações poderão
auxiliar para melhor entender os mecanismos de evolução cariotípica ocorrido nesta espécie, bem como avaliar os
danos provocados pela ação antrópica.
Apoio financeiro: CNPq, FAPEMIG, CAPES, UFU.
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Citogenética molecular de duas espécies do gênero
Astyanax (Teleostei, Characiformes) da Bacia do Rio Tietê
Pazza, R1; Kavalco, KF1; Brandão, KO1,2; Almeida-Toledo, LF2.
Laboratório de Genética Ecológica e Evolutiva, Campus Rio Paranaíba – Universidade Federal de Viçosa
Laboratório de Ictiogenética, Instituto de Biociências – Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: FISH, biodiversidade, Astyanax, evolução cariotípica, citotaxonomia
O gênero Astyanax é um dos mais especiosos dentre os Characidae, e também é um dos mais estudados do
ponto de vista citogenético. Embora mais de 60 artigos tenham sido publicados com a descrição citogenética de
espécies/populações do gênero, o número de espécies nominais válidas com pelo menos cariótipo definido não
passa de 15%. Adicionalmente, o número de espécies válidas tem aumentado consideravelmente nos últimos anos.
Por outro lado, os dados citogenéticos, embora muito concentrados em grupos específicos, apontam para uma
diversidade ainda maior. Com o objetivo de contribuir para o estudo da diversidade cromossômica neste grupo,
foram analisados exemplares de duas espécies alopátricas de Astyanax provenientes da bacia do rio Tietê – Conchas
(SP) e Indaiatuba (SP), através da Hibridação Fluorescente in situ de sequências dos genes ribossômicos 18S e 5S e
também do DNA satélite As-51. Ambas as espécies apresentaram números diplóides de 50 cromossomos, sendo a
espécie proveniente de Indaiatuba com fórmula cariotípica 8M+20SM+10ST+12A, enquanto a espécie proveniente
de Conchas apresentou 8M+20SM+12ST+10A. A espécie de Indaiatuba apresentou o gene 18S localizado em cinco
cromossomos, aparentemente com apenas dois cromossomos homólogos, mas com heteromorfismo de tamanho
de sítio, e mais um com marcação bitelomérica, um com marcação intersticial e um cromossomo com marcação
terminal, todas elas em cromossomos M/SM. Por sua vez, a espécie de Conchas apresentou oito cromossomos
portadores do gene 18S, sendo um deles com marcação bitelomérica e os demais com marcações terminais em
cromossomos SM/ST. Em relação à localização do gene 5S, a espécie de Indaiatuba apresentou quatro cromossomos
portadores do sítio, sendo localizados na região intersticial de um par de metacêntricos e na região terminal de um
par de acrocêntricos. A espécie de Conchas apresentou apenas um par de acrocêntricos com marcações terminais.
Ambas as espécies apresentaram muitos sítios de homologia com o DNA satélite As-51. Na espécie de Indaiatuba
foram dez cromossomos portadores de sítios terminais, sendo um deles com marcação bitelomérica e um deles
o maior metacêntrico do complemento. Na espécie de Conchas, doze cromossomos mostraram homologia
com o DNA satélite em regiões teloméricas do braço longo de cromossomos subtelocêntricos e acrocêntricos.
Um cariótipo composto por 50 cromossomos é o mais frequentemente observado entre os Astyanax, como em
A. scabripinnis, A. altiparanae, A.aff. bimaculatus, A. bockmanni, entre outras. Por outro lado, a distribuição dos
sítios de DNA satélite somada à do gene ribossômico 5S são características distintas das demais espécies com
este número diplóide, o que sugere se tratar do relato de novas espécies ou ainda de distribuição não descrita de
espécies que ocorrem fora da bacia do Alto rio Paraná. A caracterização citotaxonômica neste grupo tão diverso é
importante em projetos de manejo visando à conservação da biodiversidade da ictiofauna.
Apoio financeiro: CNPq/FAPESP/FAPEMIG
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45
Diversidade cariotípica em Astyanax de bacias
hidrográficas do leste da Bahia, Brasil
Affonso, PRAM1; Ribeiro, MS1; Medrado, AS2; Carneiro, PLS1
Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos – LAGOA - Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste
da Bahia. Jequié-BA.
2
Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa
Cruz. Ilhéus-BA.
[email protected]
1
O gênero Astyanax é um dos mais especiosos da ordem Characiformes. Eles são muito semelhantes na forma, sendo
popularmente conhecidos como lambaris ou piabas. O objetivo desse trabalho foi caracterizar citogeneticamente
algumas espécies desse gênero de bacias hidrográficas da Bahia, definindo número diplóide, fórmula cariotípica
e localização de sítios organizadores nucleolares ativos (Ag-RONs). Foram coletados sete Indivíduos de Astyanax
aff. bimaculatus e um indivíduo de Astyanax sp. no rio Itapicuru (Bacia do Rio Itapicuru) e sete exemplares de
Astyanax sp. do rio Crisciúma (Bacia do Rio de Contas). Todos os indivíduos de Astyanax aff. bimaculatus
apresentaram número diplóide 2n=50 e fórmula cariotípica de 8M+26SM+10ST+6A (NF=94). Já as duas espécies
de Astyanax sp. apresentaram 2n=48 cromossomos, porém fórmulas cariotípicas distintas (6M+10SM+26ST+6A,
NF= 90 no rio Itapicuru e 10M+18SM+10ST+10A, NF=86 no rio Crisciúma). Quanto às regiões organizadoras de
nucléolos, os indivíduos de Astyanax aff. bimaculatus apresentaram 4 cromossomos subtelocêntricos marcados
na região telomérica no braço curto e uma marcação no braço longo de um cromossomo metacêntrico, enquanto
Astyanax sp. do rio Itapicuru apresentou 4 marcações teloméricas, incluindo os braços curtos de um cromossomo
submetacêntrico e três subtelocêntricos. Astyanax sp. do rio Crisciúma apresentou até 6 marcações terminais,
incluindo os braços longos de dois pares ST, o braço curto de um cromossomo SM e o braço longo de um cromossomo
M. Estes resultados demonstram a diversidade cariotípica apresentada por esse gênero, corroborando dados da
literatura onde múltiplas formas podem ocorrer em diferentes bacias hidrográficas com variações intra e interpopulacionais. Assim, os estudos citogenéticos nesse grupo de peixes são importantes, pois permitem verificar
que muitas espécies nominais são, na realidade, agrupamentos artificiais, ocorrendo diferentes taxa sob a mesma
denominação.
Apoio financeiro: FAPESB e UESB.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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46
Relação entre morfótipos e haplótipos D-loop
de Hoplias aff. malabaricus da planície de inundação
do alto rio Paraná
Mota, TR; Prioli, SMAP; Bignotto, TS; Júlio Jr, HF; Briñez, B; Gomes, VN; Prioli, AJ; Prioli, LM
Departamento de Biologia Celular e Genética – Núcleo de Pesquisa em Limnologia, Ictiologia e Aquicultura (Nupélia) – Universidade
Estadual de Maringá.
[email protected]
Palavras-chave: traíra, complexo de espécies, DNA mitocondrial, haplogrupos, diversidade genética
Hoplias aff. malabaricus, popularmente conhecida como traíra, possui ampla distribuição geográfica, ocorrendo em
grande parte das bacias hidrográficas da América do Sul. Atualmente, é consenso entre taxonomistas e geneticistas
que H. aff. malabaricus representa um complexo de espécies. Os estudos da diversidade cariotípica do grupo H. aff.
malabaricus permitiram a caracterização de, pelo menos, sete citótipos, com o número de cromossomos variando
de 39 a 42. Na planície de inundação do alto do rio Paraná H. aff. malabaricus está representada pelos citótipos
A, C e D. Possivelmente, antes da formação do reservatório de Itaipu (1982) o citótipo C ocupava apenas o médio
Paraná, enquanto no alto rio Paraná encontravam-se grupos com citótipos A e D ocorrendo em simpatia que.
Após a inundação dos Saltos das Sete Quedas, essa barreira foi deslocada 150 km abaixo e permitiu a dispersão
de espécies do médio Paraná para os trechos a montante. Dessa forma, o citótipo C pode ter sido introduzido
no alto rio Paraná. A análise da diversidade nucleotídica da extremidade hipervariável da região D-loop do DNA
mitocondrial de indivíduos da planície de inudação do alto rio Paraná, com citótipos definidos, permitiu associar
os citótipos A, C e D a três haplogrupos. Por correspondência, os três haplogrupos foram denominados A, C e D.
Aparentemente, são caracterizados três morfótipos com base em variações na forma da cabeça de indivíduos
identificados como H. aff. malabaricus. Neste trabalho, o objetivo foi relacionar os haplogrupos A, C e D com os
três morfótipos que ocorrem na planície de inundação do alto rio Paraná. As coletas foram realizadas na planície
de inundação do alto rio Paraná, na região do município de Porto Rico (PR). De cada indivíduo foram coletados
fragmentos de músculo, que foram identificados e armazenados em álcool. Em seguida, os indivíduos foram
identificados e fixados em formol. O DNA total foi extraído com o procedimento padrão baseado em fenol/
clorofórmio. O segmento da extemidade hipervariável da região D-loop foi amplificado por PCR. O produto da
reação de PCR foi purificado e utilizado diretamente para o sequenciamento. No total, foram obtidas sequências
D-loop de oito indivíduos, que foram analisados quanto à morfologia da cabeça. Foram identificados quatro
indivíduos do haplogrupo C e com o morfótipo “cabeça alongada”. Um indivíduo do haplogrupo D apresenta o
morfótipo “cabeça arredondada”. Finalmente, os três indivíduos identificados como sendo do haplogrupo A
exibiam o morfótipo “cabeça intermediária”. A amostragem está sendo ampliada, mas os resultados preliminares
indicam associação entre haplogrupos D-loop e morfótipos. A confirmação ampla dessa associação daria robustez
à identificação, com base em morfótipos, de grupos do complexo H. aff. malabaricus que atualmente ocorrem na
planície de inundação do alto rio Paraná.
Apoio Financeiro: Nupélia e CNPq-PELD.
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47
Evidência de estruturação genética de pirarucu
(Arapaima gigas, Schinz 1822) nos rios da calha
e principais tributários da Bacia Amazônica.
Leão, ASA1; Hrbek, T1,2; Porto-Foresti, F3; Foresti, F5; Crossa, M4; Sampaio, I5; Farias, IP1
Laboratório de Evolução e Genética Animal, Departamento de Biologia, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do
Amazonas, 69077-000, Manaus, AM, Brasil.
2
Universidade de Porto Rico, San Juan, USA.
3
Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP.
4
World Wide Fund for Nature, WWF.
5
Universidade Federal do Pará - UFPA, campus Bragança.
*[email protected]
1
Palavras-chave: Arapaima gigas, microssatélites, genética de populações, estruturação genética.
O conhecimento da composição genética de uma espécie, e de como ela está organizada em populações, é fundamental
para ações de manejo e conservação. As populações isoladas ou unidades de manejo (UM) são tipicamente
caracterizadas por diferenças na freqüência genotípica. Este conceito está bem inserido na biologia populacional e
é importante para a conservação, pois descreve as unidades de manejo fundamentais: as populações estruturadas.
O presente estudo tem como foco a espécie Arapaima gigas (pirarucu), um peixe de importância econômica usado
como fonte de alimento na bacia Amazônica, é um dos maiores peixes de água doce da América do Sul, mas com
uma longa história de exploração comercial. Com o objetivo de contribuir com dados para a criação de estratégias de
manejo foi investigada a estruturação genética da espécie em questão utilizando-se dados de 11 locos microssatélites
de 436 indivíduos coletados em rios da calha e principais tributários da bacia Amazônica. Os resultados de AMOVA
demonstraram que 76,46% de variância genética está dentro dos indivíduos e 20,28% está dentro das localidades
amostradas. Esse segundo valor retrata que há estruturação genética populacional. Para verificar de que maneira
essa estruturação encontrada está distribuída foi realizada análise Bayesiana usando o programa Structure. Através
dos valores de atribuições (Q), fornecido pelo programa para cada localidade, foram observados dois agrupamentos
genéticos distintos distribuídos na forma de gradiente onde as localidades extremas representam populações quase
puras para cada um dos dois grupos e as localidades entre os extremos são formadas por um grupo de indivíduos
misturados dos dois grupos genéticos. Esse resultado nos permitiu dividir a bacia Amazônica em três macroregiões
geográficas, onde as extremidades Amazônia ocidental e oriental devem ser consideradas como unidades diferenciadas
de manejo, para se mantenham suas particularidades genéticas. São elas Amazônia ocidental compreendendo as
localidades Iquitos, Letícia, Eirunepé, Mamirauá, Tapauá, Lábrea, Manuel Urbano (Alto Rio Purus) e Borba (Médio
Rio Madeira); Amazônia central, representada por indivíduos representantes da mistura genética dos dois grupos
extremos, compreendendo as localidades Carauarí (Médio Rio Juruá), Coarí, RDS Piagaçu-Purus (Baixo Rio Purus),
Manacapuru, Careiro da Várzea, Nhamundá, Santarém (Ilha de São Miguel) e Jacareacanga (Médio Rio Tapajós);
e Amazônia oriental e bacia do Araguaia/Tocantins compreendendo as localidades de Macapá, Ilha de Mexiana,
Marabá e Ilha do Bananal (rio Araguaia). Na análise de autocorrelação entre distância genética e distância geográfica
observou-se correlação significativa entre todos os pontos. A partir disso não foi possível definir regiões geográficas
geneticamente independentes. Indicando que há fluxo gênico entre as localidades amostradas e que a estruturação
genética encontrada é conseqüência de isolamento por distância. Sugere-se, então que as populações de Arapaima
gigas da bacia Amazônica devem ser manejadas respeitando-se a estruturação genética encontrada.
Apoio Financeiro: FAPEAM
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48
Caracterização da diversidade genética de populações
de Tabarana, Salminus hilarii (valenciennes, 1849) da
Bacia do Alto Rio Paraná por marcadores microssatélites
da Silva, JV1; Hilsdorf, AWS1
Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos e Aquicultura, Núcleo Integrado de Biotecnologia - UMC.
[email protected]
1
Palavras-chave: Tabarana, Salminus hilarii, microssatélites, conservação genética
Pertencente a família Characidae, a tabarana (Salminus hilarii) é uma espécie de piracema de grande importância
ecológia, que habita os rios das principais bacias hidrográficas brasileiras entre elas, a do Alto Paraná. Atualmente,
a espécie corre o risco de redução em suas populações em função de ações antrópicas como o barramento dos rios
e a poluição, resultando assim em perdas sobre a diversidade genética. Estudos utilizando marcadores genéticos
e moleculares têm sido aplicados na identificação da diversidade e estrutura genética das espécies de peixes
neotropicais. No presente estudo foram utilizados marcadores moleculares do tipo microssatélites para avaliar
a diversidade e a estrutura genética de populações de Salminus hilarii, distribuídas em três rios que compõem
a Bacia do Alto Paraná. Para isso, foram coletadas amostras de tecido muscular de 151 tabaranas, provenientes
dos rios Tietê, Paranapanema e Rio Grande (nas regiões de Igarapava e Lavras). O DNA total foi extraído com
o protocolo fenol/clorofórmio e amplificado utilizando cinco primers microssatélites (Sh01; Sh05; Sh10; Sh12
e Sh16) desenvolvidos para a espécie. Os produtos de amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de
poliacrilamida 9%, corado com nitrato de prata e fotodocumentado. Os alelos foram genotipados com o uso do
programa Alpha Index 6.5 e as análises estatísticas conduzidas por meio dos programas Arlequin 3.01 e FSTAT. Os
cinco locos estudados foram polimórficos para a espécie, apresentando de 10 a 19 alelos por locos. A diversidade
gênica encontrada variou de 0,860 a 0,933 para o Rio Grande, respectivamente, em Lavras e Igarapava. A análise de
AMOVA mostrou que a maior parte da variabilidade genética (98,08%) encontra-se dentro de cada local amostrado
e apenas 1,92% entre elas. O valor da Fst= 0,01921 (P< 0,05) demonstra que há uma baixa estruturação entre as
populações Nas análises par a par os valores de Fst mostraram que entre as localidades de Lavras e Tietê há maior
diferenciação genética em comparação as outras localidades. Apesar da separação geográfica e física, devido a
diversas barragens construídas ao longo da Bacia do Alto Paraná, as populações analisadas apresentam-se com
níveis de diferenciação genética significativa, contudo com valores baixos de Fst entre populações. Isto sugere que
os mecanismos de isolamento ainda não refletiram de forma acentuada em uma diferenciação mais acentuada
destas populações.
Apoio Financeiro: FAEP e FAPESP.
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49
Variação genética analisada no gene mitocondrial
citocromo b do peixe Salminus hilarii (Characiformes) da
região de influência da transposição do Rio Piumhi (MG)
Leite, SBP1; Galetti Jr, PM1
Laboratório de Biodiversidade Molecular e Citogenética, Departamento de Genética e Evolução - UFSCar
[email protected]
1
Palavras-chave: tabarana, transposição de águas, bacia do São Francisco, dna mitocondrial e genética da conservação.
No início dos anos 60, com a construção de um dique em Capitólio (MG) para conter as águas da represa de
FURNAS, represaram-se também as águas do rio Piumhi (afluente da margem direita do rio Grande). Em razão
disso, o rio Piumhi teve seu curso médio alterado, sendo desviado para afluentes da margem esquerda do rio São
Francisco. Assim, a transposição do rio Piumhi acarretou diversas alterações ambientais locais e o contato da
ictiofauna das bacias, até então isoladas há milhões de anos. O peixe tabarana (Salminus hilarii) é uma espécie
reofílica distribuída por diversas bacias brasileiras, entre elas a do São Francisco e a do Alto Paraná. Neste trabalho,
analisamos a variação genética em S. hilarii na região de influência da transposição do rio Piumhi, utilizando o
gene mitocondrial citocromo b. Ausência de recombinação e altas taxas evolutivas fazem do DNA mitocondrial
uma importante ferramenta no estudo das relações evolutivas entre indivíduos e populações. A coleta de S. hilarii
foi feita em fevereiro/2007 na foz do rio Piumhi (MG). Em laboratório, foram extraídas partes do tecido hepático
que foram usados para a extração do DNA de 14 indivíduos. Para a obtenção das seqüências do gene citocromo b
foram realizadas reações de polimeração em cadeia (PCR) com um par de primers universais para a amplificação da
região estudada. Os produtos de PCR foram purificados e sequenciados, totalizando 1012 pares de base para este
loco. Foram analisadas a diversidade haplótipica e nucleotídica, número de sítios polimórficos, razão transição/
tranversão, testes de neutralidade seletiva, distância genética e análise de agrupamento utilizando S. brasiliensis
(dourado) como grupo externo. Os resultados evidenciaram oito haplótipos, diversidade haplotípica de 0,868,
diversidade nucleotídica de 0,01077, 27 sítios polimórficos com 3 mudanças não-sinônimas e distância genética
de 1,8%. A análise de agrupamento evidenciou dois clados apoiados por altos valores de bootstrap, sugerindo a
existência de dois acervos populacionais nessa região, podendo significar uma sobreposição de populações
originalmente provenientes do rio Grande, bem como do rio São Francisco. Futuras análises ainda são necessárias
para conclusão mais definitiva sobre esse padrão observado, sobre a origem desses grupos na região do Piumhi e o
impacto da transposição sobre a Tabarana que habita o São Francisco, fornecendo bases para medidas de manejo
e conservação dessa espécie na bacia.
Apoio: CNPq
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50
Análise da estrutura genética de Loricarichthys
platymetopon (Pisces, Siluriformes) do reservatório
de Capivara, Medio Rio Paranapanema
Pires, CB1; Almeida, FS1; Orsi, ML2; Ashikaga, FY1; Sodré, LMK1
Laboratório de Genética e Ecologia Animal (LAGEA) – Depto. de Biologia Geral, 2Depto. de Biologia Animal e Vegetal – CCB,
Universidade Estadual de Londrina.
[email protected] ou [email protected]
1
Palavras-chave: variabilidade genética, estrutura populacional, RAPD, reservatórios e Loricarichthys platymetopon.
O avanço de construção de usinas hidrelétricas, dentre as ações antropogênicas, tem sido o grande causador de
impactos aos sistemas fluviais. A fragmentação desses ecossistemas aquáticos ocasiona inúmeras alterações no
ambiente represado impactando a fauna e a flora, em especial a ictiofauna local. Este trabalho tem por objetivo
estimar a variabilidade genética e estrutura populacional de Loricarichthys platymetopon, através de marcadores
de RAPD, espécie originária do médio rio Paraná. As amostras foram coletadas em três pontos diferentes do
reservatório Capivara (UHE Escola Engenharia Mackenzie) no ano de 2002, denominados de Cruzália, Sertanópolis
e Cinzas, cada grupo contendo 20, 21 e 23 exemplares, respectivamente. O DNA genômico foi extraído do músculo,
quantificado com fluorímetro e amplificado com 7 primers de RAPD. A análise dos perfis eletroforéticos permitiu
a identificação de 88 locos, os quais foram utilizados para as análises genéticas. Foram estimados, através de
diferentes programas computacionais, os seguintes parâmetros genéticos: variabilidade genética (`P), distância
(D) e identidade genética (I) (TFPGA 1.3); análise da variância molecular (AMOVA) e estimativa de FST (ARLEQUIN
3.0); construção do dendrograma de similaridade genética (NTSYS-PC). Os valores de variabilidade genética (`P)
estimados para L. platymetopon foram: 59,09% (Cruzália), 46,59% (Sertanópolis) e 53,40% (Cinzas). Esses valores
podem ser considerados como uma variabilidade genética de moderada a alta, quando comparados com os de
outras espécies estudadas no mesmo local. O dendrograma de similaridade genética mostrou a formação de três
agrupamentos principais formados cada um por espécimes de uma localidade. Os valores de distância genética (0,12
e 0,13) foram maiores nas comparações entre o grupo de Cruzália e os de Sertanópolis e Cinzas, respectivamente.
Os espécimes de L. platymetopon dos grupos de Sertanópolis e Cinzas apresentaram menor valor de D = 0,10 e
maior de I = 0,90. A AMOVA mostrou que embora maior porcentagem da variação encontrada esteja entre os
indivíduos de um mesmo grupo (68,16%), a variação entre os diferentes grupos (31,84%) é considerada muito alta,
assim como o valor do FST (0,32). Os valores de FST par a par corroboram com os dados de D, I e AMOVA, mostrando
que há uma maior diferenciação genética entre L. platymetopon de Cruzália com aqueles de Sertanópolis e Cinzas
(FST = 0,333 e 0,326, respectivamente), bem como com o dendrograma. Os valores de FST obtidos indicam que os
grupos apresentam alta diferenciação genética. Esses dados são coerentes com a distância geográfica existente
entre os pontos de coleta, e também com a biologia dessa espécie, que não é migradora, mesmo possuindo uma
grande capacidade de dispersão. Sendo assim, as análises desses parâmetros genéticos permitem concluir que os
três grupos de L. platymetopon analisados podem ser considerados como populações distintas da mesma espécie.
Apoio financeiro: UEL, Duke Energy, PIBIC-CNPq e FAUEL.
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51
As corredeiras do Rio Xingu não são barreira ao fluxo
gênico do curimatã (Prochilodus nigricans)
Lima, NF1,2*;Virgili, NS1,2; Machado, VN2; Boni, TA; 3 Farias, IP2
Bolsista PIBIC, CNPq Universidade Federal de Goiás
Universidade Federal do Amazonas, Laboratório de Evolução e Genética Animal
3
Colaborador, Universidade Federal de Goiás, Laboratório de Genética e Biodiversidade
* [email protected]
1
2
Palavras-chave: Curimatá, D-Loop, Xingu, Iriri, Diversidade.
O curimatá ou Prochilodus nigricans é uma espécie de peixe migratória da família Prochilodontidae que tem como
habitat principal os rios da Bacia Amazônica. Em determinadas épocas do ano, quando os cardumes migram,
chegam a dominar a produção em vários mercados pesqueiros da região amazônica. Sendo uma espécie de grande
importância econômica. O rio Xingu é conhecido por apresentar em seu curso uma série de corredeiras/cachoeiras
que são barreiras para várias espécies aquáticas, inclusive algumas espécies de peixes. O presente trabalho teve
como objetivo testar se essas estruturas geomorfológicas poderiam ser barreiras ao fluxo gênico para esta espécie.
Neste trabalho, seqüências nucleotídicas da região controle, ou D-loop (displacement loop) do mtDNA foram
utilizadas para analisar a diversidade genética entre 51 indivíduos de Prochilodus nigricans amostrados de duas
localidades da drenagem do Rio Xingu, 34 coletados na localidade de Vitória do Xingu (baixo das corredeiras)
e 17 no rio Iriri (acima das corredeiras). Este trabalho pretende contribuir para melhor caracterizar a espécie
Prochilodus nigricans e detectar evidências para verificação da hipótese de fluxo gênico entre as localidades citadas.
De cada indivíduo foram coletadas amostras de tecido muscular e estocados em tubos de 2,5 ml, contendo álcool
95%. Todas as amostras tiveram o DNA total extraído seguindo o protocolo de extração por CTAB. Em seguida
foram realizadas as amplificações via PCR, foram utilizados primers para região controle do DNA mitocondrial
específicos para a espécie. As amostras foram seqüenciadas no seqüenciador automático ABI 3130xl que produziu
seqüências nucleotídicas com em média 580 pares de bases. As seqüências obtidas foram então editadas no
programa BioEdit e alinhadas no programa ClustalX. As análises de genética de populações foram realizadas no
programa ARLEQUIN, onde através do teste de AMOVA constatou-se que não há variação significativa entre os
peixes provenientes de Vitória do Xingu e do rio Iriri (FST 0,00216 P>0,05). Onde a maior parte da variabilidade
genética se encontra distribuída dentro das populações 99.78%. Indicando que as populações não se encontram
estruturada geneticamente. Nas análises par a par do número de migrantes por geração (Nm) as comparações
apresentaram valores de Nm bastante altos. Tais dados obtidos indicam que as populações de Prochilodus
nigricans provavelmente constituem uma única população migrante na drenagem do rio Xingu. A construção de
hidroelétricas previstas para a região poderá ter um efeito bastante impactante nas populações migrantes desta
espécie. Desta forma amostras adicionais devem ser realizadas para o monitoramento das populações nesta região.
Apoio/Financiamento: CT-Amazônia/CNPq.
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52
Caracterização das espécies do gênero Trichomycterus
(Siluriformes; Trichomycteridae) encontradas em rios
das cabeceiras do rio Tietê, utilizando os marcadores
COI e Cyt B do DNA mitocondrial
Silva, CCF; Marceniuk, AP; Hilsdorf, AWS; Matta, SLSF
Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos e Aquicultura, Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi das Cruzes.
08780-911. Mogi das Cruzes, SP, Brasil; [email protected]
Palavras-chave: Trichomycterus iheringi, COI, Cyt. B.
O gênero Trichomycterus (Siluriformes; Trichomycteridae) é amplamente distribuído nas principais bacias
hidrográficas da América do Sul, e uma extraordinária diversidade de espécies é encontrada nas regiões sudeste
e sul do Brasil, com aproximadamente 33 espécies conhecidas, reconhecidamente pouco em relação a real
estimativa do número de espécies existentes. De forma geral, a identificação das espécies do gênero é problemática
e o reconhecimento de seus limites dificultado por descrições pouco informativas. A maioria das formas, senão
todas, ocorrem exclusivamente nas drenagens ou bacias onde foram descritas, sendo comum espécies encontradas
exclusivamente em regiões de cabeceiras de pequenos rios costeiros, apresentarem populações semi-isoladas com
pequeno grau de diferenciação morfológica. Com a intenção caracterizar os morfotipos do gênero Trichomycterus
com distintos padrões de coloração presentes no rio Itatinga (Bertioga-SP) e rio Claro (Salesopólis- SP), foi
realizada extração de DNA de partes da nadadeira com protocolo fenol-clorofórmio, feita a amplificação por PCR
do gene Citocromo c Oxidase Subunidade I (COI) e Citocromo b (Cyt. b) e realizado sequenciamento pelo método
de interrupção de cadeia. A análise de Neighbor-Joining do gene COI mostrou divergência genética de 0% a 1% entre
os espécimes coletados do rio Itatinga, e quando comparados estes aos do rio Claro, entre os espécimes do rio
Claro a divergência foi de 0%. A análise do Cyt. b revelou divergência de 0% a 2% entre os espécimes do rio Itatinga.
A partir de dados moleculares (gene COI e Cyt. b) e morfológicos (morfometria e merística) os distintos morfotipos
encontrados nos dois rios, foram identificados como pertencentes a uma mesma espécie, Trichomycterus iheringi
(Eigenmann, 1917), e os diferentes padrões de coloração podem ser explicados por assumirem coloração disruptiva,
os exemplares jovens (14,2 a 51,2 mm CP), exibem a coloração de fundo do corpo similar ao substrato arenoso onde
foram encontrados, total ou parcialmente enterrados, e possuem cromatóforos agrupados bem delimitados, já os
adultos (52,4 a 133,9 mm CP) e intermediários (36,7 a 68,9 mm CP) exibem cromatóforos dispersos e coloração de
fundo mais escura, e foram encontrados próximos as rochas. Este polimorfismo está claramente relacionado ao
estágio de desenvolvimento ontogenético e ao comportamento dos indivíduos no ambiente. O padrão de coloração
é considerado uma característica importante na diagnose das espécies do gênero e no estabelecimento de suas
relações de parentesco, sendo os resultados apresentados no presente estudo de grande relevância para o melhor
entendimento da sistemática das espécies de Trichomycterus.
Apoio: UMC e Faep.
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Caracterização de locos microssatélites em
Prochilodus nigricans
Lima, NE1; Resende, LV1; Silva-Júnior, NJ2; Gondim, SGCA1; Ramos, JR1; Telles, MPC¹
1
2
Laboratório de Genética e Biodiversidade – Universidade Federal de Goiás
Mestrado em Ciências Ambientais e Saúde- UCG
Palavras-chave: Papa-terra, SSR, STR, estrutura genética, ictiofauna.
Conhecido por Papa-terra, Prochilodus nigricans caracteriza-se pelo corpo alongado, coloração cinza prateada, boca
protrátil, em forma de ventosa com lábios carnosos. Habita fundos de lagos e margens de rios sendo uma espécie
dentritívora. Estudos genéticos em populações de peixes têm sido realizados utilizando-se marcadores moleculares.
O entendimento da estrutura genética populacional de uma dada espécie permite conhecer as diferenças
genéticas geradas por processos microevolutivos e suas relações com as diferenças genéticas neutras e adaptativas
das populações. Os marcadores microssatélites consistem em pequenas seqüências repetidas em tandem, que
são amplificadas individualmente através de PCR, ultilizando-se um par de iniciadores específicos. A limitação
básica para a aplicação mais ampla desta tecnologia na análise genética refere-se à grande quantidade de trabalho
envolvida, exigindo pessoal especializado e equipamento específico para seqüenciamento automático aliado ao
elevado custo, para o desenvolvimento de iniciadores. Diversos estudos têm mostrado sucesso na possibilidade de
redução desses custos ao se tentar transferir marcadores desenvolvidos para espécies evolutivamente próximas.
O objetivo do presente trabalho foi carcaterizar os locos transferidos para Prochilodus nigricans. Para tanto, foram
utilizados 45 indivíduos de oriundos do rio Caiapó, utilizando iniciadores de regiões microssatélites desenvolvidos
para outras espécies do gênero Prochilodus (P. argenteus e P. costatus). O DNA foi extraído a partir de tecido
muscular utilizando o protocolo fenol/clorofórmio e posteriormente submetido à eletroforese horizontal em gel
de agarose 2%, corado com brometo de etídio, para sua quantificação. A partir do DNA diluído foram conduzidas
reações em cadeia de polimerase (PCR). Foram testados 15 locos de microssatélites desenvolvidos para as espécies
Prochilodus argenteus (Par) e Prochilodus costatus (Pcos). Os produtos da amplificação foram separados em gel
de poliacrilamida 6% e visualizados por coloração com nitrato de prata. A maioria dos locos apresentaram alto
polimorfismo, totalizando 132 alelos, gerando em média 9,43 alelos por loco, variando entre 1 (Par05) e 18 (Par43).
Considerando o total de locos avaliados, a heterozigosidade média observada (Ho) e esperada (He) foram iguais a
0,45 e 0,67, respectivamente. A freqüência de alelos nulos foi igual a 0,12, a probabilidade de exclusão de paternidade
(PE), variou entre 0,0 e 0,75 com os valores combinados igual a 0,999. A PI variou entre 1,0 e 0,03, apresentado
valores combinados igual a 0,000000. A partir desses resultados, foi possível confirmar que os locos que estão
caracterizados neste estudo são altamente polimórficos e se constituem ótimas ferramentas para futuros estudos
genéticos populacionais para esta espécie.
Apoio Financeiro: Systema Naturae Consultoria Ambiental Ltda.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Estimativa da variabilidade genética da piramutaba
– Brachyplatystoma vaillantii (Valencines, 1840) no sistema Estuário-Amazonas-Solimões e em três
tributários
Larissa Melo-Neves, L¹; Formiga-Aquino, K²; Batista, JS³; Alves-Gomes, JA4
¹Bolsista PIBIC/CNPq; ²Orientador/LTBM/COPE/INPA; ³Co-orientador/LTBM/COPE/INPA; Pesquisador, Colaborador LFCE/CPBA/INPA.
Palavras-chave: bagres migradores; Região Controle; variabilidade genética.
A piramutaba, Brachyplatystoma vaillantii, é uma das espécies de bagres, mais importantes para a pesca na
Amazônia. Esta espécie pertence a família Pimelodidae e ordem Siluriformes. Para completar seu ciclo de vida,
a piramutaba migra mais de 5000 km no sistema Estuário-Amazonas-Solimões (EAS), desde as cabeceiras até o
estuário amazônico. Esta área compreende tanto a Amazônia brasileira quanto a internacional. Em conseqüência
da pesca comercial, verificou-se que o estoque pesqueiro encontra-se em sobrepesca de crescimento. A Biologia
molecular tem auxiliado bastante na identificação de estoques pesqueiros de espécies comerciais. Um dos
marcadores moleculares mais utilizados em estudos de genética populacional é o sequenciamento do DNA
mitocondrial (DNAmt), por possuir taxa de mutação dez vezes maior que a do DNA nuclear. A região do DNAmt
estudada neste trabalho é chamada “região controle”, sendo esta não-codificante, é a mais variável de o todo genoma
mitocondrial. Estudos de genética de populações revelam um único estoque pesqueiro com alta variabilidade
genética para a piramutaba na Calha principal do rio Solimões e no Rio Madeira. O objetivo principal deste estudo
foi caracterizar e estimar a variabilidade genética da piramutaba no Sistema Estuário-Amazonas-Solimões, no rio
Madeira, no rio Japurá e no rio Içá por meio da análise de seqüências da região controle do DNA mitocondrial.
O DNA foi extraído seguindo o protocolo de extração via CTAB. Para a amplificação (PCR) da região controle do
DNAmt foram utilizados os primers FTTF e F12R. As amostras foram seqüenciadas em seqüenciador automático
MegaBace 1000, editadas, alinhadas e analisadas com o auxílio dos programas Bioedit 5.0.9, Chromas 2.31, e Arlequin
3.1, respectivamente. Dentre os 52 indivíduos das localidades amostradas as análises apresentaram 51 haplotipos
sendo 50 haplotipos únicos e 1 haplotipo compartilhado por dois indivíduos provenientes de Belém. Após as
analises verificou-se alta variabilidade genética para os indivíduos de piramutaba nas localidades amostradas, a
qual é constatada pelos elevados índices de mutações, sítios polimórficos e número de haplotipos únicos. Com
a análise de variância molecular (Amova) foi possível verificar que estes indivíduos compõem um único estoque
genético (FST:0.01930) pois entre as localidades a variância foi de apenas 1,93% e dentro de cada localidade foi de
101.93%. As informações apresentadas anteriormente, sugerindo uma única população com alto fluxo gênico e
alta variabilidade genética para os indivíduos de piramutaba na calha do rio Amazonas, podem ser confirmadas
com as análises deste trabalho, além disso, sugere-se o mesmo contexto de variabilidade genética nos tributários.
Diante deste contexto, evidencia-se mais ainda a importância de estudos genético-populacionais na identificação
de estoques pesqueiros para, juntamente com outras informações científicas, possibilitar a caracterização do
ciclo de vida dos bagres migradores, representando informações cruciais para o estabelecimento de estratégias de
conservação dos estoques pesqueiros na Amazônia.
Apoio financeiro: CNPQ/FAPEAM/INPA.
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Determinação de unidades de estoques da Cavala
(Scomberomorus cavalla) na costa do nordeste
brasileiro através da técnica PCR-RFLP
Andrade,JKF1; Silva,DMF1; Leal, CAS1; Adrião,M2; Lessa,RP3
Laboratório de Fisiologia Molecular Aplicado (FAMA), Universidade Federal Rural de Pernambuco - UFRPE. 2Departamento de Morfologia
e Fisiologia Animal – Coordenador do FAMA - UFRPE. 3Departamento de Pesca – Laboratório Dinâmica de Populações Marinhas, UFRPE.
Autores para correspondência: [email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: mtDNA, cavala, peixe, PCR-RFLP, estoques.
A espécie (Scomberomorus cavalla) constitui um recurso pesqueiro importante sob o ponto de vista econômico e social
no nordeste do Brasil, sendo capturada por redes de emalhar e linha. Segundo o ESTAPESCA,IBAMA,anualmente
são pescados cerca de 3.600 t, no Nordeste brasileiro, sendo, os Estados do Ceará e da Bahia os responsáveis
pelos desembarques mais volumosos. Sendo assim, é necessário proceder a identificação das unidades de
estoque dessa espécie, a fim de que medidas de manejo possam ser corretamente implementadas. No presente
trabalho foram investigadas informações genéticas através da amplificação do gene do Citocromo b contidas no
mtDNA, referente aos estoques de Cavala (S cavalla),através da técnica PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction –
Restriction Fragment Lenght polymorfism),na costa da região do nordeste do Brasil. Foram constituídos 6 grupos
em diferentes Estados do Nordeste do Brasil: Maranhão, Ceará, Rio Grande do Norte, Pernambuco, Alagoas e Bahia,
sendo 50 amostras de cada Estado, onde foram coletados fragmentos de músculo. O mtDNA foi extraído com a
técnica Fenol-Clorofórmio-Álcool isoamílico e a região dos genes Citocromo b forma amplificadas com primers
específicos e submetido à enzima de restrinção HaeIII. Resultados preliminares utilizando a técnica PCR/RFLP
demonstram a existência de Polimorfismos nos diferentes estados da região nordeste do Brasil, como também se
mostrou polimorfismo em indivíduos de um mesmo local.
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Filogeografia e genética Pesqueira de guaiúbas
(Ocyurus chrysurus; Lutjanidae) na Costa Atlântica das
Américas
Vasconcellos, AV; Solé-Cava, AM
Laboratório de Biodiversidade Molecular
Departamento de Genética – Instituto de Biologia
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Palavras-chave: Genética Pesqueira, Filogeografia, Ocyurus Chrysurus, Lutjanidae, região controle, citocromo b.
A guaiúba é um peixe recifal normalmente encontrado em grandes cardumes no oeste do Oceano Atlântico desde
os Estados Unidos até o Sudeste do Brasil. A guaiúba é considerada um importante recurso pesqueiro devido à boa
qualidade da carne, sendo a principal espécie de peixe explorada em alguns estados do Nordeste do Brasil, além
de ser explorado por diversos países na América do Norte e Caribe. Por sua importância econômica, a guaiúba
vem sendo explorada intensamente. Para auxiliar nos planos de manejo e evitar sua exploração acima do limite
máximo sustentável, analisamos geneticamente a estrutura populacional de guaiúbas, ao longo de uma ampla
área geográfica que engloba quase toda a sua distribuição. Dois marcadores mitocondriais com diferentes taxas
de evolução (seqüências de DNA da região controle e do gene citocromo b). Foram usados em um estudo integrado
de genética pesqueira... Os dados foram subdivididos em três conjuntos: O primeiro é formado por seqüências de
682 nucleotídeos (pb) da região controle de 88 indivíduos de 4 localidades do Brasil (Ceará, Pernambuco, Bahia
e Espírito Santo) e uma de Belize; O segundo é composto por um fragmento de 222 pb da região controle de 389
indivíduos da Flórida (EUA), Porto Rico, Belize e Brasil; e por fim, o terceiro conjunto de dados é constituído de
um fragmento de 741 pb do gene do citocromo b de 49 indivíduos do Brasil e de Belize. Diferentes abordagens
analíticas (índice de endocruzamento FST, Análise Molecular de Variância (AMOVA), Análise Espacial Molecular de
Variância (SAMOVA), Análise de Clados Hierarquizados (Nested Clade Analysis), congruentemente identificaram
a existência de pelo menos quatro estoques geneticamente heterogêneos: 1) um estoque compartilhado entre a
Flórida e Belize; 2) um estoque restrito a Porto Rico; 3) um estoque restrito no mínimo ao Ceará; e 4) um estoque
distribuído desde Pernambuco até o Espírito Santo. Além disso, detectamos, a partir de uma análise da distribuição
das diferenças (mismatch distribution) uma série de expansões populacionais e geográficas que, aliadas à maior
variabilidade genética observada no Caribe, sugerem que aquela população é a mais antiga e que eventos de
colonização teriam ocorrido no sentido Norte-Sul, do Caribe para o Brasil. Esses possíveis eventos de expansão
populacional e colonização são suportados também pela análise filogeográfica. O conjunto de resultados rejeita a
hipótese nula de homogeneidade populacional para esta espécie e, dessa forma, sugerimos que a exploração desse
recurso pesqueiro deve ser feita levando em consideração as particularidades de cada um dos estoques ao longo
da sua distribuição.
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Comparação entre populações de Serrasalmus
maculatus com base nas sequências mitocondriais
D-loop e citocromo oxidase I
Bignotto, TS; Gomes, VN; Briñez, B; Mota, TR; Panarari-Antunes, RS; Maniglia, TC; Prioli, SMAP; Prioli, AJ.
Departamento de Biologia Celular e Genética - Núcleo de Pesquisa em Limnologia, Ictiologia e Aqüicultura (Nupélia), Universidade
Estadual de Maringá.
[email protected]
Palavras-chave: Piranha, complexo de espécies, alto rio Paraná, alto Paraguai, rio Tocantins.
A espécie de piranha Serrasalmus maculatus (Pisces, Serrasalminae) encontra-se distribuída praticamente em
todo o território nacional, ocupando as bacias amazônica, do São Francisco, Paraná, Paraguai e Uruguai. Estudos
citogenéticos sugerem que S. maculatus constitui um possível complexo de espécies crípticas. O objetivo deste
trabalho foi avaliar a variabilidade dentro e entre populações, além de obter evidências sobre a possibilidade de S.
maculatus ser um complexo de espécies. Foram analisadas sequências mitocondriais de 257 pb da região D-loop
e 486 pb do gene citocromo oxidase I (COI). Sequências D-loop foram selecionadas no GenBank para servirem de
comparação. Outras espécies de piranha também foram incluídas para análise das sequências COI. As coletas
foram realizadas nas bacias do alto Paraná, alto Paraguai e Tocantins. Com os modelos selecionados HKY+G para
D-loop e K81+G para COI, foram construídos dendrogramas neighbor-joining e máxima-verossimilhança. Todos
os agrupamentos indicaram divergência entre os haplogrupos do Tocantins, Manso e Paraná. A diferenciação
entre os haplogrupos do Tocantins e Manso ou do Tocantins e Paraná é evidente e foi, algumas vezes, superior às
encontradas entre outras espécies de piranha. Considerando D-loop, os valores médios de distância-p foram 0,063
e 0,069 entre as populações de Tocantins e Paraná e de Tocantins e Manso, respectivamente. Para as populações
de Manso e Paraná, o valor foi de apenas 0,022. Os valores médios para COI foram menores, como esperado para
seqüência codificadora, variando de 0,035 entre Tocantins e Paraná, 0,028 entre Tocantins e Manso até 0,016 entre
Manso e Paraná. Entretanto, valores dessa magnitude encontrados para D-loop e COI também foram registrados
entre espécies diferentes. Estes dados sugerem que a população de Tocantins ou está em processo de especiação
ou tem sido identificada erroneamente como S. maculatus. Sequências D-loop de S. maculatus, obtidas no GenBank,
provenientes dos rios Uruguai e Madeira, agruparam com o haplogrupo do Manso. Como os rios Madeira e Tocantins
pertencem à mesma bacia hidrográfica, seria esperado que suas populações apresentassem valores baixos de
distância-p. Entretanto, foi encontrado um valor de 0,069 entre as duas populações, fortalecendo a hipótese de
que a população de Tocantins constitui uma outra espécie. Essa hipótese é favorecida pelo agrupamento de S.
maculatus do Tocantins mais próximo de S. elongatus e S. irritans, do que de S. maculatus de outras localidades.
As divergências encontradas sugerem que o isolamento da população da bacia do Tocantins ocorreu antes dos
eventos geológicos que isolaram as bacias do rio Madeira e do alto rio Paraguai. Finalmente, dada a diferenciação
entre as populações das bacias do Tocantins e do Madeira, é possível que amostragens amplas na bacia amazônica
evidenciem que S. maculatus compreende um complexo de mais de duas espécies.
Apoio: CNPq-PELD; Nupélia; Furnas Centrais Elétricas; CAPES.
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Diferenciação genética da pescada Plagioscion
squamosissimus (Sciaenidae, Perciformes) com base
em seqüências do mtDNA
Santos, SM¹; Sampaio, I²; Barros, MC¹; Fraga, EC¹.
¹Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA, Caxias-MA.
²Instituto e Estudos Costeiros/UFPA, Bragança-PA.
Palavras-chave: Pescada, haplótipos, mtDNA, Plagioscion squamosissimus, Conservação.
A espécie Plagioscion squamosissimus possui grande importância na pesca artesanal e comercial e tem sido
bastante utilizada para peixamento em barragens e açudes, por ter uma carne excelente e apresentar qualidades
para a pesca esportiva. É uma espécie carnívora predadora, conhecida popularmente como corvina ou pescada
sendo originária das bacias dos rios Amazonas, Orenoco e rios das Guianas e introduzidas nas bacias dos rios
Paraná, Paraguai e São Francisco, como também, em reservatórios da região Nordeste na década de 40. Este estudo
teve como objetivo a caracterização molecular de populações de P. squamosissimus utilizando-se um fragmento
do gene mitocondrial rRNA16S para se determinar os níveis de variabilidade genética da espécie e dessa forma
contribuir com informações para futuros programas de manejo e conservação. A amostragem constituiu-se de 34
espécimes obtidos em pontos estratégicos na bacia dos rios Itapecuru/MA, Pindaré/MA e Parnaíba/PI, que foram
identificadas utilizando-se literaturas específicas. O DNA total foi isolado a partir de tecido muscular, seguindo-se
o protocolo de fenol-clorofórmio. Um fragmento do gene mitocondrial rRNA16S foi amplificado através da técnica
de PCR utilizando-se primers específicos e seqüenciado através do método didesoxi terminal com Kit Big Dye
em seqüenciador automático ABI PRISM™ 377. As seqüências obtidas foram editadas e alinhadas usando-se o
programa Bioedit. Foram obtidas matrizes de divergência nucleotídica, cladogramas filogenéticos no programa
MEGA 4. A significância dos agrupamentos foi estimada pela análise de bootstrap e as análises populacionais
realizadas no programa DnaSP 4.10. A rede de Haplótipo foi construída no programa Network 4.5. Duas seqüências
retiradas do GenBank do gene rRNA 16S foram incluídas nas análises e usadas como grupo externo (Cynoscion
acoupa/AY603010 e Macrodon ancylodon/AY253536). A análise do polimorfismo de DNA do fragmento de 570 pb
do gene rRNA16S mostrou apenas três sítios polimórficos e a ocorrência de três haplótipos para os trinta e quatro
exemplares analisados, sendo cada haplótipo exclusivo para cada bacia amostrada. Observou-se ainda que, os
haplótipos I (Rio Itapecuru) e II (Rio Pindaré) são mais próximos divergindo apenas no sitio 329. Já o Haplótipo
III (Rio Parnaíba) diferencia-se do haplótipo I nos sítios 189 e 275 e do haplótipo II nos três sítios de variação. A
diferenciação haplotípica das populações de P. squamosissimus nestas três bacias estudadas fornece informações
importantes adotadas em decisões relacionadas a conservação de seus estoques. A partir destes dados, infere-se
que os estoques de P. squamosissimus apresentam pool gênico distinto, resultando assim, em uma diferenciação
genética quanto às bacias estudadas.
Apoio financeiro: UEMA, FAPEMA, BNB, UFPA.
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Caracterização molecular da espécie Hemisorubim
platyrhynchos (Pimelodidae) das bacias dos rios
Itapecuru e Pindaré, Maranhão
Macelo-Santos, S; Fraga, EC; Barros, MC
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
[email protected]
Palavras-chave: Hemisorubim platyrhynchos, Pimelodidae, rRNA 16S, Rio Itapecuru, Rio Pindaré
A família Pimelodidae, agrupa atualmente 30 gêneros aproximadamente 90 espécies, alguns de seus representantes
estão entre os maiores peixes de água doce da América do Sul e a maioria apresenta destacada importância na pesca
comercial ou de subsistência. Entre estas espécies a Hemisorubim platyrhynchos (Valenciennes, 1940) conhecida
popularmente como Jurupoca, lírio e bico de pato. É um peixe de corpo curto e distendido na região abdominal
com focinho muito achatado, de cor acinzentada para cinza-rosada no dorso e parte dos flancos, apresentando
cerca de oito máculas longitudinalmente. Esta espécie apresenta grande potencial de consumo com representativo
valor na produção pesqueira de águas interiores devido o seu tamanho e a qualidade de sua carne. Apesar da sua
ampla distribuição e da vasta gama de habitat explorados por esta espécie estudo relacionado à genética ainda é
bastante incipiente. Sendo assim objetivou-se caracterizar a espécie H. platyrhynchos em diferentes rios do Estado
do Maranhão por meio de sequências do gene rRNA 16S do DNA mitocondrial. As amostras foram obtidas em
pontos estratégicos das bacias dos rios Itapecuru e Pindaré no Estado do Maranhão. O isolamento e amplificação
da região genômica a partir do DNA total foi realizado através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR) usando-se iniciadores universais o produto da PCR foi seqüenciado usando-se o método didesoxiterminal,
as seqüências obtidas foram editadas e alinhadas usando-se o programa Bioedit. Um fragmento de 563 pares de
bases para o gene rRNA 16S foi obtido em 23 espécimes identificados como H. platyrhynchos, sendo quatorze da
bacia do Rio Itapecuru e nove da bacia do Rio Pindaré. Uma baixa variabilidade genética com apenas um sítio
polimórfico (243) ao longo do fragmento analisado foi verificado. Quando analisado apenas os espécimes dos
rios Itapecuru observou-se para esta bacia apenas um haplótipo, o mesmo ocorrendo para a bacia do Pindaré.
Nossos resultados apontam para uma única espécie ao longo das duas bacias corroborando com as informações
disponíveis na literatura através de estudos morfológicos o que confirma o status específico.
Apoio financeiro: BNB, UFPA, UEMA.
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Discriminação de Pseudoplatystoma corruscans e
Pseudoplatystoma reticulatum baseada em sequências
da região citocromo oxidase I
Gomes, VN; Bignotto, TS; Panarari-Antunes, RS; Maniglia, TC; Briñez, B; Mota, TR; Prioli, SMAP; Prioli, AJ
Departamento de Biologia Celular e Genética – Núcleo de Pesquisa em Limnologia, Ictiologia e Aqüicultura – Universidade Estadual de
Maringá
[email protected]
Palavras-chave: DNA mitocondrial, COI, divergência nucleotídica, taxonomia, peixe
Sequência parcial do gene citocromo c oxidase subunidade I (COI) presente no DNA mitocondrial (DNAmt)
foi recentemente padronizada como marcador molecular para elaboração de DNA barcodes com a finalidade
de auxiliar na identificação e descoberta de toda biodiversidade. Apesar de ser alvo de muitas críticas, vários
trabalhos confirmam a potencialidade da seqüência nucleotídica COI como metodologia para sistemática. Porém,
ainda são necessárias avaliações intensivas da sensibilidade do marcador para grupos de espécies muito próximas
taxonomicamente. No que se refere à ictiofauna, a complexidade das espécies representa um empecilho para o avanço
de estudos taxonômicos. Sendo o grupo com maior riqueza dentre os vertebrados, inúmeras espécies de peixes
apresentam morfologia similar, potencializando a dificuldade de discriminação por taxonomia. Pseudoplatystoma
corruscans (pintado) e Pseutoplatystoma reticulatum (cachara) são espécies migratórias com diferenças no padrão
das manchas no corpo, mas com características morfológicas semelhantes e suficientemente próximas para
produzir, em cativeiro, híbridos viáveis. No alto rio Paraná, indivíduos híbridos P. reticulatum x P. corruscans têm
sido encontrados em ambientes aquáticos naturais e, provavelmente, são sobreviventes de escapes de pisciculturas.
Identificação precisa dessas espécies é crucial para estudos gerais e monitoramento, já que as populações estão
expostas à hibridação, retrocruzamentos e introgressão genética. O presente trabalho teve como objetivo analisar
a diversidade nucleotídica de sequência parcial do gene mitocondrial COI e avaliar seu potencial como ferramenta
para discriminação de P. corruscans e P. reticulatum. Os exemplares de P. corruscans foram coletados na planície de
inundação do alto rio Paraná. Os espécimes de P. reticulatum foram coletados no rio Manso, na bacia do alto rio
Paraguai. Amostras de tecido muscular foram retiradas, identificadas individualmente e armazenadas em álcool.
O DNA foi extraído com fenol/clorofórmio. A sequência parcial do gene COI, utilizada como padrão barcodes, foi
amplificada por PCR. O produto da reação de PCR foi utilizado para sequenciamento direto das duas fitas. Foi
analisada uma sequência de 605 pares de base de dez indivíduos da espécie P. corrunscans e cinco de P. reticulatum.
Entre indivíduos da espécie P. corruscans a porcentagem de sítios nucleotídicos polimórficos foi 0,2%, enquanto
entre indivíduos P. reticulatum foi determinado 0,1% de polimorfismo. Esses valores estão em patamar frequente de
polimorfismo intraespecífico do gene COI em peixes e outros grupos animais. Em contraste, entre as duas espécies
foram encontrados 4,9% de polimorfismo. Este valor está acima dos menores valores interespecíficos encontrados
na literatura. Árvores neighbour joining e máxima-verossimilhança, baseadas no modelo HKY selecionado pelo
ModelTest, mostraram-se concordantes em revelar a diferenciação entre as duas espécies. Portanto, a diversidade
nucleotídica torna evidente a sensibilidade da sequência COI para discriminação entre P. corruscans e P. reticulatum
e indica potencial para discriminação de espécies de peixes próximas.
Apoio: CNPq-PELD; NUPELIA/UEM; Furnas Centrais Elétricas; CAPES.
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Análise genética de duas populações de Leporinus
amblyrhynchus (Garavello & Britski, 1987) coletados
à montante e a jusante de uma barragem no Rio
Laranjinha, bacia do Rio das Cinzas – PR
Fracasso, JF2; Ferreira, DG2; Silva, WF3; Nascimento, RHC1; Galindo, BA4; Carvalho, S5.
Acadêmico do curso de Licenciatura Plena em Ciências Biológicas da UENP-Campus Cornélio Procópio, 2Bolsista do Programa
Universidade Sem Fronteiras, 3Bolsista da Fundação Araucária, 4Docente do curso de Licenciatura Plena em Ciências Biológicas da
UENP- Campus Cornélio Procópio, 5Docente UENP- Campus Luiz Meneghel
[email protected]
1
Palavras-chave: RAPD, Leporinus amblyrhynchus, Rio Laranjinha, Rio das Cinzas, conservação.
O Rio Laranjinha é o principal afluente da margem esquerda do Rio das Cinzas que faz parte da bacia do Rio
Paranapanema. No município de Ribeirão do Pinhal seu leito sofre inteferência da barragem de uma Pequena Central
Hidrelétrica construída a mais de cinqüenta anos e nunca ativada. Atualmente estuda-se a eficiência de uma escada
de transposição inaugurada em 2006. A inserção de barragens acarreta impactos sobre a fauna e flora, interceptando
rotas migratórias, fragmentando populações e alterando o fluxo gênico. A genética da conservação utiliza a teoria e
as técnicas da genética para reduzir o risco de extinção das espécies que se encontram ameaçadas. Os marcadores
de RAPD têm se mostrado eficientes para a identificação, diversidade, similaridade e estrutura gênica de populações
naturais. Este trabalho tem como objetivo analisar a variabilidade e a divergência genética das populações de Leporinus
amblyrhynchus coletados à montante (M) e a jusante (J) da barragem. Foram utilizadas 43 amostras, sendo 21 da
montante e 22 da jusante. O DNA genômico dos peixes foi obtido a partir da musculatura, utilizando-se o protocolo
de extração baseado em NaCl (POVH 2005), e quantificado em um fluorímetro. As reações de amplificação foram
feitas em 15µL de solução contendo 8ng de DNA. O aplicativo computacional TFPGA 1.3 foi empregado nas seguintes
análises populacionais: estimativa da variabilidade genética, calculada pela proporção de locos polimórficos (P) e
estimativas da estrutura genética (índice de q) e distância genética de Nei; o Nm (número médio de migrantes por
geração), que estima o fluxo gênico, foi obtido a partir de q. O dendrograma de similaridade genética dos indivíduos,
obtido através do coeficiente de Jaccard e método UPGMA, foi calculado pelo programa NTSYS-PC. Para as análises
foram utilizados 9 primers dos kits OPA, OPD e OPW, os quais produziram ao todo 121 locos. Os resultados revelaram
os seguintes valores de`P para as duas populações: 34,71% (M) e 30,57% (J). O valor de similaridade genética foi
de 0,9891. O valor de distância genética foi de 0,0110. O valor obtido de q (0,0722) indicou, segundo Wright (1978),
haver moderada diferenciação genética. O valor de Nm foi de 3,21, indicando ocorrência de fluxo gênico entre os
indivíduos das diferentes populações. O dendrograma de similaridade genética mostrou que existe uma tendência de
formação de três grupos, sendo um com indivíduos da montante, um com indivíduos da jusante e um com indivíduos
de ambos. Podemos inferir que apesar de existir uma tendência de estruturação genética entre as populações o
tempo de isolamento de aproximadamente 50 anos provavelmente ainda não foi suficiente para provocar uma severa
diferenciação genética, e possivelmente esta diferenciação tende a diminuir visto que com a construção da escada de
transposição o fluxo gênico pode ter sido restabelecido.
Apoio: Fundação Araucária, IAP, Prefeitura Municipal de Ribeirão do Pinhal, UENP.
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Caracterização molecular de duas espécies da família
Pimelodidae de ocorrência no Rio Iapecuru/MA
Reis, LL1; Sampaio I2; Fraga, EC1; Barros, MC1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
Instituto de Estudos Costeiros/UFPA Bragança PA
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Pimelodidae, Pimelodus blochii, Sorubim lima, variabilidade genética, gene 16S.
A família Pimelodidae pertence à ordem Siluriformes, inclui cerca de 31 gêneros e 90 espécies. Os indivíduos
pertencentes a esta família apresentam corpo nu, sem placa ou escamas, apenas coberto por pele, são amplamente
distribuídos em toda região neotropical e apresentam grande importância na pesca comercial ou de subsistência,
como é o caso de Pimelodus blochii e Sorubim lima. Estudos que visem à caracterização molecular destas espécies
são inexistente para a bacia do rio Itapecuru/MA. Portanto, a presente análise objetiva a caracterização molecular
dos estoques de Pimelodus blochii e Sorubim lima da bacia do rio Itapecuru/MA, assim como, estimar os níveis
de variabilidade genética destes estoques por meio de seqüências do gene rRNA 16S do DNA mitocondrial. As
amostras foram obtidas ao longo do rio Itapecuru/MA e identificadas através de chaves específicas. O DNA foi
isolado utilizando-se o protocolo de fenol-clorofórmio e a amplificação do gene rRNA 16S foi realizada através
da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) usando-se primers específicos. O produto da PCR foi
seqüenciado usando-se o método didesoxiterminal. As seqüências geradas foram editadas e alinhadas no Clustal
W do programa Bioedit. A análise filogenética foi obtida através do programa MEGA 4.0. com matriz filogenética
estimada pelo algoritmo de Kimura 2-parâmetros, a significância dos agrupamentos foi verificada através do
bootstrap. Um fragmento de 459 pares de bases foi obtido em 26 amostras onde 422 sítios foram conservados, 37
variáveis e 34 informativos para a parcimônia. Foi incorporada na análise duas seqüência do GenBank (AY264132;
Y08337) sendo Hypostomus sp usado como grupo externo. A composição nucleotídica apresentada foi de 21,6% de
timina; 24,6% citosina; 32,4% adenina; 21,5% guanina. As árvores filogenéticas obtidas pelos Métodos de Máxima
Parcimônia e Agrupamento de Vizinhos apresentaram topologias similares, onde foi observada a formação de dois
clados fortemente apoiados. A divergência nucleotídica entre os gêneros foi de 7,8%. A magnitude da divergência
e a reconstrução filogenética para as espécies Pimelodus blochii e Sorubim lima confirmam a sua caracterização
quanto ao status de gênero, sendo assim, pode-se pensar em estratégias de manejo e conservação para este grupo.
Apoio financeiro: CNPq, BNB, UFPA;UEMA.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Caracterização de marcadores microssatélites para
Hypostomus gymnorhyncus com ocorrência no Rio
Caiapó
Resende, LV1; Soares, TN1; Brondani, RPV2; Silva-Júnior, NJ3; Gondim, SGCA1; Telles, MPC1
Laboratório de Genética e Biodiversidade – Universidade Federal de Goiás
Laboratório de Biotecnologia – Embrapa Arroz e Feijão
3
Mestrado em Ciências Ambientais e Saúde- UCG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Acari, ictiofauna, peixe, SSR, STR
A espécie Hypostomus gymnorhynchus pertence à família Loricariidae que possui mais de 600 espécies, divididas
em seis subfamílias, representando uma das maiores e complexas famílias de peixes. Atualmente, os marcadores
moleculares são ferramentas indispensáveis em estudos populacionais. Uma das classes mais utilizadas atualmente
são os microssatélites, considerados bons, por apresentarem padrão de herança codominante, potencialmente
multialélico, abundantes e bem distribuídos ao longo do genoma. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a
variabilidade genética presente em 15 locos desenvolvidos para Hypostomus gymnorhynchus e também 13 locos
transferidos a partir de iniciadores desenvolvidos para outras espécies da icitiofauna. Para tanto, foi extraído o
DNA de 14 indivíduos de Hypostomus gymnorhynchus, provenientes do Rio Caiapó. Os 28 locos foram inicialmente
testados com três indivíduos, os considerados padronizados foram avaliados na população natural, quanto aos
parâmetros genéticos básicos de diversidade genética. Para os testes de amplificação cruzada foram avaliados
53 locos das espécies de peixes Prochilodus argenteus (Par), Prochilodus lineatus (Pl), Prochilodus costatus (Pcos),
Astyanax fasciatus (Ast), Leporinus macrocephalus (Lmac), Poecilia reticulata (Pre) e Piaractus mesopotamicus
(Pme), destes, 13 locos foram considerados transferidos com sucesso. Com base nos 24 locos desenvolvidos, a
partir de uma biblioteca genômica “shotgun”, para a espécie Hypostomus gymnorhynchus, 15 locos apresentaram
resultados satisfatórios. A avaliação do polimorfismo presente na população natural foi realizada com as seguintes
temperaturas de anelamento dos iniciadores: Pre-13 (46°C), Par-12 (50°C), Hg-E17 (54°C), Par-14 (56°C), HgE16 (58°C), Hg-E04, Hg-E14 (62°C), Hg-E19, Hg-E24, Pcos-18 (64°C), Hg-E11, Hg-E08, Hg-E22, Hg-E12 (68°C). Os
produtos da amplificação foram separados em gel de poliacrilamida 6% e visualizados por coloração com nitrato
de prata. Dos 28 locos utilizados apenas somente 14 apresentaram produtos de amplificação na população passível
de ser analisado. Dos 14, seis monórficos (Par-14, Pre-13, Hg-E04, Hg-E11, Hg-E14, Hg-E24) e oito apresentaram
polimorfismo, totalizando 32 alelos, com uma média igual a 2,3 alelos nos locos, variando entre 2 (Pcos-18, Hg-E08,
Hg-E22, Hg-E16, Hg-E17, Hg-E12), 3 (Par-12) e 11 (Hg-19). A heterozigosidade observada (Ho) apresentou-se com
uma média igual a 0,10, variando entre 0,0 e 0,71 e a heterozigosidade esperada (He) mostrou valores médios igual
a 0,18, variando entre 0,0 e 0,18. A freqüência de alelos nulos apresentou valores próximos a zero, a probabilidade de
exclusão de paternidade (PE), variou entre 0,0 e 0,73, com PE combinada de 0,88. A PI variou entre 1,0 e 0,06, com PI
combinada de 0,00411. O número relativamente baixo de alelos encontrados e, consequentemente o polimorfismo
apresentado pode ser, em parte, explicado pela quantidade reduzida de indivíduos disponíveis para essa avaliação,
podendo ser modificado com uma análise que contenha um maior número de indivíduos e populações oriundas
de diferentes localidades.
Apoio Financeiro: Systema Naturae Consultoria Ambiental Ltda.
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Evidências de uma nova espécie de Australoheros sp.
(Perciformes: Cichlidae) encontrada no Alto Rio Tietê
com base em dados moleculares.
Matta, SLSF1; Hilsdorf, AWS1
Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos e Aquicultura, Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi das Cruzes.
08701-970. Mogi das Cruzes, SP, Brasil; [email protected]
1
Palavras-chave: Taxonomia molecular, Citocromo b, Alto Tietê, Cichlidae, Australoheros.
A taxonomia tem demonstrado um grande desenvolvimento nos últimos anos, devido ao advento de novas
técnicas moleculares, surgindo assim a Taxonomia molecular. Tais métodos permitem avaliar as relações entre
os táxons assim como sua história evolutiva. As abordagens da taxonomia molecular podem ser definidas como
métodos baseados na análise de DNA que permitem a distinção entre espécimes com base em suas variações
interespecíficas. Australoheros é um gênero que foi proposto recentemente por Rican & Kullander (2006) e que possui
quatro espécies válidas: Australoheros facetus (Jenys, 1842), Autraloheros kaaygua (Casciotta, Almirón & Gomez,
2006), Australoheros tembe (Casciotta, Gomez & Toresani, 1995) e Australoheros scitulus (Rican & Kullander, 2003).
Deste modo o objetivo do trabalho foi evidenciar uma possível espécie nova de Australoheros presente no Alto Rio
Tietê por meio de sequências do gene Citocromo b. Foram realizadas extrações de DNA utilizando kit de extração
IllustraTM Tissue&Cells genomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare Life Sciences). Após a extração foi amplificada a
região do Citocromo b, e posteriormente, a purificação utilizando o Kit “GFXTM PCR DNA e Gel Band Purification”
(GE Healthcare). O sequenciamento foi realizado utilizando o kit BigDye v.3 (Applied Biosystems). O material foi
analisado no equipamento de sequenciamento automático ABI Prism 377 Sequencer (Applied Biosystems). Para a
obtenção das sequências consenso foi utilizado o programa BIOEDIT e para as análises taxonômicas o programa
MEGA por meio do método Neighbor- Joining (modelo Kimura-2-parameter) com bootstrap de 3000 réplicas. Como
grupo externo foi utilizado a espécie Cichlasoma rhytisma (López, 1983). De acordo com os resultados obtidos
podemos observar divergência nucleotídica da espécie Australoheros sp. (Alto Tietê) para as demais, variando de 3%
a 7%, com menor divergência para a espécie Australoheros ribeirae e maior divergência para a espécie Australoheros
scitulus. A variação nucleotídica dentro do grupo de Australoheros sp. foi de 0%, mostrando que os exemplares
coletados pertencem a mesma espécie. Os clados foram bem sustentados com bootstrap de 98% a 100%. Perante
esses resultados podemos inferir que a entidade taxonômica presente no Alto Tietê trata-se de uma nova espécie.
Apoio: CNPq, FAEP
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Análise aloenzimática de Hypostomus ancistroides
(Siluriformes: Loricariidae) do córrego Jurumirim, Bacia
do Rio Tietê
Paiva, S1; Codognotto, FJ1; Zawadzki, CH2,3; Martins-Santos, IC1; Renesto, E1,3
Laboratório de Genética Animal – Depto de Biologia Celular e Genética. 2Depto de Biologia. 3Nupélia – Núcleo de Pesquisas em
Limnologia, Ictiologia e Aquicultura. Universidade Estadual de Maringá. [email protected]
1
Palavras-chave: aloenzimas, variabilidade genética, sistemática, Hypostomus, Loricariidae.
Os loricarídeos, conhecidos popularmente como cascudos, apresentam geralmente hábito bentônico, tendo como
característica básica o corpo coberto por placas ósseas dispostas em cinco séries laterais. O gênero Hypostomus
é o mais especioso desta família e apresenta uma ampla variação intraespecífica na morfologia e padrão de cores
dificultando sua identificação. Hypostomus ancistroides é uma espécie típica de riachos com vegetação marginal e
está distribuído por toda a bacia do alto rio Paraná. Quatorze exemplares desta espécie foram coletados no córrego
Jurumirim, afluente do rio Tatuhy (localidade tipo da espécie) para análise aloenzimática objetivando sua posterior
comparação com indivíduos da mesma espécie, porém, de outras localidades. Os exemplares tiveram amostras
de fígado, músculo e coração retiradas, maceradas e centrifugadas, sendo o sobrenadante destes materiais
aplicados em gel de amido (15%) para a eletroforese horizontal. A análise de 12 sistemas enzimáticos (AAT; ACP;
ADH; EST; GDH; GPI; G3PDH; IDH; LDH; MDH; PGM; SOD) permitiu a identificação de 24 locos com 28 alelos,
indicando a presença de 1,1250 alelos por loco. Somente os locos Est-2 e Idh-a ( fígado) apresentaram alelos em
heterozigosidade, enquanto nos outros locos os alelos estavam em homozigose. Desta forma, a heterozigosidade
média esperada (He) foi de 0,0119 e a heterozigosidade média observada (Ho) foi de 0,0062. O valor de He de
H. ancistroides está abaixo da heterozigosidade média (He = 0.051) para 195 espécies de peixes de várias partes
do mundo. Um provável processo de endogamia, devido aos seus hábitos sedentários, poderia explicar a baixa
presença de heterozigotos para os locos dessa espécie. Estudos subseqüentes serão realizados para comparar H.
ancistroides da localidade tipo com indivíduos que são morfologicamente parecidos com estes, para verificar a
presença de possíveis marcadores bioquímicos e comparar a varibilidade genética entre as populações.
Apoio: CNPq e Nupélia.
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Caracterização molecular e relações filogenéticas
entre espécies do gênero Brycon (characiformes:
characidae) de quatro bacias hidrográficas
Panarari-Antunes, RS1; Gomes, VN2; Prioli, AJ2; Prioli, SMAP2; Bignotto, TS2; Agostinho, CS3
Departamento de Ciências, Universidade Estadual de Maringá; 2Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Estadual de
Maringá; 3Núcleo de Estudos Ambientais, Universidade Federal de Tocantins.
[email protected]
1
Palavras-chave: Brycon, relações filogenéticas, ISSR, citocromo b, bacias hidrográficas.
As bacias hidrográficas brasileiras estão entre as mais ricas do mundo em termos de biodiversidade de espécies
de peixes. Brycon é um dos principais gêneros de peixes neotropicais de água doce. Possui cerca de 40 espécies,
amplamente distribuídas na América Central e do Sul. No Brasil, espécies do gênero Brycon podem ser encontradas
em diversas bacias hidrográficas, tais como a bacia Amazônica, do Paraná, do Paraguai e do Araguaia-Tocantins.
Esta pesquisa abrange seis espécies pertencentes às quatro bacias citadas. Teve como objetivo o estudo das
relações filogenéticas entre as espécies Brycon orbignyanus, B. hilarii, B. cf. pesu, B. cephalus, B. falcatus e B. gouldingi,
com o uso de marcadores moleculares mitocondrial e nuclear. Exemplares de B. orbignyanus foram coletados no
rio Paraná, na região de Guaíra. Espécimes de B. hilarii foram coletados no rio Manso. Espécimes de B. cephalus
foram obtidos de estação de piscicultura e exemplares das espécies Brycon cf. pesu, B. falcatus e B. goulding foram
coletados da bacia Araguaia-Tocantins. A extração do DNA genômico a partir de tecido muscular foi efetuada
com metodologia baseada em fenol/clorofórmio. Os estudos de polimorfismo molecular das espécies de Brycon
foram realizados pela técnica ISSR, com o emprego de quatro primers. A região do citocromo b do genoma
mitocondrial foi parcialmente amplificada via PCR, a partir do DNA total de três a cinco exemplares de cada
espécie. Os produtos de cada PCR foram usados diretamente em reações de sequenciamento. Cada primer ISSR
gerou de quatro a sete bandas nítidas e reproduzíveis. Os primers (GGAC)3A e (GGAC)3C produziram o maior
número de bandas espécie-específicas, sendo que o primer (GGAC)3C gerou bandas espécie-específicas em todas
as espécies de Brycon analisadas. Um fragmento de 264 pb, correspondente à região parcial do citocromo b do
DNA mitocondrial foi sequenciado e utilizado para análise. A espécie B. gouldingi foi excluída, pois não produziu
um bom sequenciamento. De acordo com a árvore filogenética obtida, as espécies de Brycon estudadas foram
agrupadas em dois grandes clados. O primeiro é formado apenas por B. cf. pesu, e o segundo clado é formado
pelas demais espécies: B. hilarii, B. orbignyanus, B. cephalus e B. falcatus. Os resultados obtidos demonstram que
primers ISSR podem ser úteis na identificação de bandas espécie-específicas em peixes, tais como o gênero Brycon.
A análise a partir do citocromo b revelou que entre as espécies de Brycon estudadas, B. hilarii e B. orbignyanus
apresentam o maior grau de parentesco, sendo B. cf. pesu pertencente a um grupo de origem mais antiga e com
menor grau de parentesco com as demais espécies. As relações filogenéticas entre as espécies de Brycon analisadas
são, aparentemente, congruentes com as similaridades morfológicas e podem estar relacionadas com as suas
distribuições geográficas.
Apoio: Nupélia e Furnas Centrais Elétricas.
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Analysis of microsatellite loci of Brycon sp. in Salminus
brasiliensis (Characiformes:Characidae)
Rossini, BC ¹; Galetti Jr, PM ¹; Freitas, PD ²
¹Department of Genetics and Evolution, Laboratory of Molecular Biodiversity and Cytogenetics, Federal University of São Carlos, São
Carlos, SP;
²Department of General Biology, Federal University of Bahia, Salvador, BA.
[email protected]
Keywords: Conservation, heterologous amplification, population genetics.
Salminus brasiliensis (dourado) is very appreciated in sporting fishing and gastronomy. It is distributed throughout
South America occurring in the Paraná, Paraguay and Uruguay River basins, besides the drainage of Laguna dos
Patos, upper Chaparé and Mamoré River basins, in Bolivia. This species is considered an excellent migratory fish,
however, with the growing human mediated activities, as exemplified by construction of dams, predatory fishing
and degradation of their habitats, many populations are under threat. For Rio Grande do Sul state, Brazilian
Ministry of the Environment classified this species as over-exploited. Inside this context, molecular analyses using
microsatellite markers, have been used for investigation of the genetic structure of several populations, looking
for the establishment of relationships pattern, identification of migrating individuals and access to the genetic
diversity intra - and inter-populations. As specific microsatellite loci has already not been described for this
important fish species, an approach that can be used, per hour, concerns the use of heterologous loci, described for
similar species. The gender Brycon is considered a sister group of Salminus, justifying the attempt of transferability
of microsatellite loci described for this species in the Salminus group. This way, the present study tested 13
microsatellite loci, six described for B. hilarii (Sanches & Galetti 2006) and seven for B. opalinus (Barroso et al. 2003)
in cross-species-amplification reactions. Seventy five DNA samples of S. brasiliensis were extracted and eight were
tested in different temperature gradient reactions, being the PCR conditions variable in the attempt to establish
the best reaction profile. Until the moment, five loci (two of B. opalinus and three of B. hilarii) were amplified with
success in S. brasiliensis, been confirmed polymorphism for at least two loci on 2% agarose gel. The continuity of
these studies will confirm the real potential of transferability of those heterologous loci for S. brasiliensis. Besides,
analyses looking for species-specific loci were also initiate for S. franciscanus (a new species described in the year
of 2007 and until then also considered like S. brasiliensis), seeking for the description of a group of efficient markers
for this important migratory fish species.
Support: FAPESP, CNPq.
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Ausência de estruturação genética da piraputanga
(Brycon hilarii) na Bacia do Alto Paraguai e sua
implicação para conservação e manejo
Hilsdorf, AWS¹, Okazaki, TI¹; Resende, EK de²
¹Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos e Aqüicultura, Núcleo Integrado de Biotecnologia, Universidade de Mogi das Cruzes,
Mogi das Cruzes, SP.
2
EMBRAPA Pantanal, Corumbá, MS.
[email protected]
Keywords: Piraputanga, Brycon hilarii, Microssatélites, Conservação.
A piraputanga é uma espécie pertencente a família Characidae, endêmica da Bacia Hidrográfica do Alto Paraguai.
É uma espécie importante tanto para pesca artesanal como para pesca esportiva da região. A manutenção dos
estoques de piraputanga em um nível de uso sustentável depende dentre outras da conservação da variabilidade
genética intra e interpopulacional. Para isso, é necessário o conhecimento do grau de diferenciação genética das
populações de piraputanga. Para o desenvolvimento de programas de manejo e conservação desta espécie, este
estudo objetivou a avaliação da variabilidade genética dentro e entre as populações da piraputanga, a partir do
uso de marcadores microssatélites. A análise AMOVA mostrou que mais de 98% do total da variação genética
encontra-se dentro dos indivíduos dentro das populações, indicando que não existe diferença genética entre estas.
Este dado foi corroborado pelos valores calculados de Rst e Fst (P>0,05) que sugerem uma total pan-mixia entre
as amostragens. A análise bayesiana também indicou que o mais provável número de populações existente seria
um (K=1). O número de migrantes encontrado foi de 5,68 indivíduos, mostrando um alto fluxo gênico entre os rios.
O valor médio de Fis ficou entre 0,034 e 0,205, indicando um déficit de heterozigotos e a presença de endogamia.
Entretanto, neste caso, este valor pode ser explicado pela presença de alelos nulos nas análises de alguns loci, como
mostrou a análise do software Microchecker. De acordo com esses resultados, não está havendo sobrepesca dos
estoques e para fins conservacionais, as populações devem ser manejadas como uma metapopulação.
Apoio financeiro: FAEP, CNPq e Embrapa Pantanal.
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Elevada divergência nucleotídica entre duas espécies
de jaraqui (Semaprochilodus) da Amazonia central
Escher, SK1; Pimentel, L2; Schneider, H2; Santos, S2 & Sampaio, I2
Instituto Esperança de Ensino Superior;
Universidade Federal do Pará, Campus de Bragança.
E-mail: [email protected]; [email protected]
1
2
Palavras-chave: Jaraqui, Semaprochilodus, Prochilodontidae, DNA mitocondrial, Divergência nucleotídica
O jaraqui (Semaprochilodus, Prochilodontidae, Characiformes) é um peixe de alta relevância comercial para a
região amazônica. A literatura registra seis espécies de Semaprochilodus para a América do Sul, e duas (S. taeniurus
de S. Insignis) são abundantes na calha e desembocadura dos principais afluentes do rio Amazonas. O gênero
tem sido negligenciado quanto aos estudos genéticos e o presente estudo teve como objetivo identificar através
de DNA as duas espécies predominantes da Amazônia central brasileira. Amostras foram obtidas nos estados de
Roraima (Boa Vista), Amazonas (Manaus e Parintins) e Pará (Santarém, Almeirim, Óbidos e Juruti). O alinhamento
de um fragmento do gene mitocondrial 16S, com 490 sítios mostrou 24 sítios com mutações que discriminam
Semaprochilodus taeniurus de S. insignis. As árvores de parcimônia e distância com táxons adicionais da família
Prochilodontidae mostraram topologias similares, com cinco ramos bem definidos: 1) Prochilodus lineatus; 2)
Prochilodus lineatus-P. nigricans); 3) Cyphocharax-Steindachnerina; 4) Semaprochilodus taeniurus; 5) Semaprochilodus
insignis. As divergências nucleotídicas intra-específicas foram inferiores a 1%, mas curiosamente, a divergência
nucleotídica entre as duas espécies de Semaprochilodus (jaraqui) foi de 5%, que é da mesma ordem de magnitude
da obtida entre jaraqui (Semaprochilodus) e curimatã (Prochilodus), e até maiores que entre Semaprochilodus
insignis e Cyphocharax. O valor de bootstrap para o ramo que une Semaprochilodus taeniurus e Semaprochilodus
insignis não é estatisticamente significante, em desacordo com a proposta taxonômica com base em morfologia
que aponta várias sinapomorfias em favor da monofilia do gênero Semaprochilodus. Nossos resultados sugerem
uma ampla revisão da taxonomia morfológica e molecular dos Prochilodontidae, visando desvendar as razões
pelas quais DNA mitocondrial e os caracteres morfológicos recuperam cenários diferentes sobre a evolução deste
grupo de peixes.
Apoio: CNPq, UFPA, IESPES.
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Estudo da Hibridação Interespecífica em espécies no
gênero Brycon (Characidae, Bryconidae)
Quaggio, ADNV1; Hashimoto, DT1; Voltolin, TA1; Senhorini, JA2; Foresti, F3; Bortolozzi, J1; Porto-Foresti, F1
¹Laboratório de Genética de Peixes - Faculdade de Ciências de Bauru - UNESP. 2Instituto Chico Mendes de Conservação da
Biodiversidade - Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes Continentais - ICMBio/CEPTA. 3Laboratório de Biologia e
Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP.
Palavras-chave: hibridação interespecífica, vigor híbrido, ginogênese.
A hibridação interespecífica é considerada por diversos autores um método de melhoramento genético de difícil
compreensão, uma vez que os produtos obtidos do acasalamento de diferentes espécies podem originar diversos
produtos genéticos tais como Ginogenéticos e Androgenéticos Haplóides ou Diplóides, Híbridos Diplóides
simples, Triplóides ou até indivíduos Tetraplóides. A aplicação da hibridação Interespecífica é utilizada no
sistema de manejo nas grandes Pisciculturas que visa produzir animais que possuam obter melhor desempenho
que as espécies parentais (vigor híbrido), como o aumento da taxa de crescimento, melhor qualidade da carne,
resistência a doenças e capacidade de tolerar variações ambientais, além do aperfeiçoamento de diversas outras
características a fim produzir peixes mais proveitosos para o cultivo. Dentre aproximadamente 40 espécies
de peixes de interesse comercial no Brasil, destaca-se o gênero Brycon, de grande interesse nos centros de
Pisciculturas devido à qualidade da carne, ao hábito alimentar, ao rápido crescimento e ganho de peso. Com o
objetivo de compreender o mecanismo de hibridação, foram analisados 10 exemplares de cada espécie parental
B. Amazonicos (Matrinxã) e B. hilarii (Piraputanga) e 10 exemplares de seus híbridos interespecificos. Através
da técnica de coloração com Giemsa, observou-se um conjunto diplóide 2n = 50 cromossomos em todos os
indivíduos. No entato, houve diferenciação na formação cariotípica dos parentais, onde o parental Matrinxã
apresentou a constituição cariotíca de 6 cromossomos do tipo metacêntrico, 9 cromossomos submetacêntrico
e 10 cromossomos subtelocêntrico e o outro parental Piraputanga apresentou uma constituição cariotípica de
10 cromossomos do tipo metacêntrico, 9 cromossomos submetacêntrico e 6 cromossomos subtelocêntrico. O
hibrído interespecífico deste cruzamento apresentou um cariótipo correspondente ao seu parental Matrinxã,
sendo de 6 cromossomos metacêntrico, 9 cromossomos submetacêntrico e 10 cromossomos subtelocêntrico. A
detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolos obtida pela técnica de impregnação pelo nitrato de Prata (AgRONs) demonstrou marcações na região telomérica de um par de cromossomo submetacêntricos em todos os
indivíduos analisados, tanto para as espécies parentais como no híbrido interespecífico. Os resultados obtidos
até o momento, podem sugerir que o processo de hibridação para esse grupo de peixes parece resultar em um
produto possivelmente Ginogênico, uma vez que apresenta o cariótipo igual ao cariótipo materno B. amazonicus.
Dados na literatura a respeito da hibridação interespecífica consideram o carácter Ginogenético um processo
frequente nos cruzamentos envolvendo diferentes espécies parentais e estes por sua vez podem ser identificados,
pela aplicação de marcadores cromossômicos. Diante da dificuldade de reconhecimento dos produtos resultantes
da hibridação interespecífica, e do entendimento do próprio processo de hibridação, a aplicação de outras técnias
de bandamento cromossômico contribuem para o melhor entendimento desse processo no grupo dos peixes.
Apoio financeiro: CEPTA/ICMBio, CNPQ E FAPESP.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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71
Ocorrência de hibridização entre as tilápias
Oreochromis mossambicus e Oreochromis niloticus
(pisces: cichlidae) nas bacias dos rios Limpopo, Sabié,
Incomate e Umbeluzi, em Moçambique, por meio de
PCR-RFLP da região 18s do RNA ribossomal
Simbine, L.1; Hilsdorf, AWS2
Instituto Nacional de Investigação Pesqueira – Ministério das Pescas - Moçambique
Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos e Aquicultura - Núcleo Integrado de Biotecnologia - Universidade de Mogi das
Cruzes.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: tilápia, hibridização, PCR-RFLP, 18S e conservação.
As tilápias são peixes de água doce originárias da África. Incluem-se entre os peixes mais importantes cultivados em
quase todo o mundo. Das mais de 70 espécies de tilápias existentes, apenas Oreochromis niloticus, O. mossambicus,
O. aureus, Tilapia rendalli e seus híbridos possuem importância mundial para aquicultura. Estudos voltados à
caracterização genética assim como a variabilidade genética são de grande importância para aqüicultura e
programas de conservação das espécies. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a ocorrência de hibridização
entre as espécies O. mossambicus e O. niloticus, existentes em Moçambique nas bacias dos Rios Limpopo, Incomati,
Sabié e Umbeluzi, por meio de marcadores moleculares PCR-RFLP. Foram coletadas 250 amostras: 100 da bacia do
Rio Limpopo (50 identificadas como O. niloticus e 50 como O. mossambicus) e 50 da bacia do Rio Umbeluzi, 50 do
Rio Incomati e 50 do Rio Sabié. Exemplares de O. niloticus puros foram coletados na Estação de Piscicultura Ponte
Nova. O DNA foi extraído do tecido muscular das tilápias. A extração foi feita de acordo com o protocolo descrito
por TAGGART et al. (1992) e com Kit de extração genômico. A determinação da hibridização entre O. mossambicus
e O.niloticus está sendo realizada por meio da análise do polimorfismo no comprimento dos fragmentos de
restrição (PCR-RFLP) da região 18S do RNA ribossomal. As reações de amplificação estão sendo conduzidas para
um volume final de 20µL, contendo 1µL de primer 18S, 0,2µL de Taq polimerase, 2µL de DNA (50ng/µl), 2,5mM
de MgCl2, 1µlLde dNTP, 1µLde buffer 10x e 12,8µL de H2O MilliQ. O produto de PCR foi purificado e seqüenciado.
A sequência de O. niloticus pura foi alinhada com a seqüência de O. mossambicus pura obtida do gene bank. O
alinhamento foi feito por meio do software Bioedit. A partir deste alinhamento obteve-se uma região do DNA, a
partir da qual se pesquisaram as enzimas que cortam seqüências da tilapia O. mossambicus e não de O. niloticus
e vice-versa. Cinco enzimas foram selecionadas: AseI, BmgBI, BstBI, EcoRI, NcoI e HpyCH4IV. Estas enzimas
possibilitaram via comparação do padrão de bandas por gel de agarose se identificar a presença de híbridos entre
O. niloticus e O. mossambicus em rios de Moçambique. Dados preliminares indicam a ocorrência de hibridização
entre estas espécies. Estes resultados são importantes para traçar programas de manejo e conservação dessas
espécies, assim como para a escolha de espécies puras para cultivo.
Apoio: FAEP, CNPq, WWF, MCT.
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Identificação de híbridos através de marcadores
moleculares espécie-específicos
Zaganini, RL1; Hashimoto, DT1; Senhorini, JA2; Bortolozzi, J1; Foresti, F2; Porto-Foresti, F1
¹Laboratório de Genética de Peixes - Faculdade de Ciências de Bauru - UNESP. 2Instituto Chico Mendes de Conservação da
Biodiversidade - Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes Continentais - ICMBio/CEPTA. 3Laboratório de Biologia e
Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP.
[email protected]
Palavras-chave: hibridação, PCR-multiplex, gene tropomiosina, piscicultura.
A manipulação genética através da hibridação interespecífica vem sendo amplamente utilizada nas pisciculturas,
visando principalmente o aumento da produtividade e obtenção de linhagens estéreis. Porém, a produção e
comercialização destes produtos híbridos sem o devido controle pode ser problemática, uma vez que há grande
semelhança morfológica entre eles e seus parentais, podendo gerar uma mistura ocasional entre as duas gerações.
Desta maneira, o monitoramento genético e a caracterização de linhagens híbridas produzidas artificialmente
nas pisciculturas são de extrema importância para o diagnóstico dos componentes das gerações parentais e
híbridas. Tendo em vista essa problemática existente atualmente, foi realizada uma compra de lotes de peixes
juvenis de piscicultura e o objetivo desse trabalho foi, analisar se esses peixes eram da espécie solicitada na compra
ou se poderíamos encontrar produtos misturados ou colocados erroneamente no lote solicitado. Para a análise
dos exemplares, foram utilizados marcadores de PCR-Multiplex com primers espécie-específicos de seqüências
parciais do DNA nuclear (gene α-tropomiosina) para a identificação dos peixes comprados da piscicultura. Os
resultados revelaram que no primeiro lote, onde foi solicitada a compra de juvenis somente da espécie Pacu
(Piaractus mesopotamicus), todos os indivíduos analisados se mostraram híbridos, podendo ser resultantes
do cruzamento de Pacu com Tambaqui ou um outro híbrido que nem envolve as espécies solicitadas, sendo
Tambaqui com Pirapitinga. Já no segundo lote, onde foi solicitada a compra de juvenis do híbrido “Tambacu”,
fruto do cruzamento dos parentais, Tambaqui com Pacu, as análises revelaram que além dos exemplares híbridos
solicitados, foi encontrado um exemplar de Tambaqui (espécie parental) e exemplares de outro produto híbrido
resultantes do cruzamento das espécies parentais Tambaqui com Pirapitinga. Portanto, os dados obtidos nesse
estudo, revelaram que os produtos que estão sendo solicitados na compra em pisciculturas, sendo estes, espécies
parentais ou produtos híbridos, não correspondem ao que está sendo vendido, após serem submetidos às análises
de diagnóstico molecular. Além disso, a rapidez e o baixo custo desta técnica poderão facilitar a implementação
rotineira dessa técnica como diagnóstico na comercialização de híbridos e espécies parentais para os piscicultores,
podendo ser utilizada para sua segurança e assim, ordenar a comercialização e delinear planos de conservação
biológica para um manejo adequado destes animais, de forma a minimizar os impactos negativos aludidos com a
implantação de projetos de hibridação interespecífica em pisciculturas.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq E ICMBio
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Identificação de híbridos entre os peixes neotropicais
pintado (Pseudoplatystoma corruscans) e cachara
(Pseudoplatystoma reticulatum) através de PCR-RFLP:
aplicações para a conservação genética
Prado, FD1; Hashimoto, DT1; Senhorini, JA2, Foresti, F3; Bortolozzi, J1; Porto-Foresti, F1
¹Laboratório de Genética de Peixes - Faculdade de Ciências de Bauru - UNESP. 2Instituto Chico Mendes de Conservação da
Biodiversidade - Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes Continentais - ICMBio/CEPTA. 3Laboratório de Biologia e
Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP.
[email protected]
Palavras-chave: hibridação interespecífica, PCR-RFLP, marcador molecular, genética forense, conservação genética.
A hibridação interespecífica em peixes é uma técnica amplamente utilizada em pisciculturas do Brasil, a fim de
obter indivíduos diferenciados e com melhor desempenho que as espécies parentais. Entretanto, um dos principais
problemas é a falta de informações sobre os produtos genéticos resultantes da hibridação. Os híbridos parcialmente
ou totalmente férteis são os que oferecem maiores riscos, pela possibilidade de retrocruzamentos e contaminação
genética dos estoques selvagens. Como exemplo podemos citar os híbridos das espécies Pseudoplatystoma
corruscans (pintado) e Pseudoplatystoma reticulatum (cachara), que apresentam fertilidade parcial e são capazes
de cruzar entre si e com as espécies parentais. Em longo prazo, as consequências são de difícil previsão, podendo
resultar em uma única população híbrida, ou até a extinção das espécies parentais. Desta maneira, torna-se
necessário desenvolver metodologias que identifiquem estes híbridos, evitando riscos para o meio ambiente. Neste
trabalho foram desenvolvidos marcadores moleculares do tipo PCR-RFLP para identificar as espécies parentais
P. corruscans e P. reticulatum, e seus híbridos interespecíficos “pintachara” (pintado fêmea x cachara macho) e
“cachapinta” (cachara fêmea x pintado macho). Inicialmente, foram criadas bibliotecas de seqüências parciais de
DNA nuclear (gene RAG2) e mitocondrial (gene ribossômico 16S) das espécies parentais, que permitiram verificar
diferenças nucleotídicas entre estas espécies e em seguida, mapas de restrição foram criados possibilitando a
seleção de enzimas com sítios de clivagem espécie-específicos para reações de PCR-RFLP. Os resultados obtidos
através da aplicação da técnica de PCR-RFLP do gene nuclear RAG2 e mitocondrial 16S, mostraram diferentes
perfis eletroforéticos entre as espécies parentais, evidenciados por fragmentos de DNA com diferentes tamanhos
e de padrões característicos para cada espécie. Para o gene nuclear RAG2 os híbridos foram identificados através
de bandas intermediarias, heterozigotas ao observado nos parentais. Através do gene mitocondrial foi possível
distinguir os híbridos recíprocos “pintachara” e “cachapinta” pela verificação do parental materno, característica
essa particular da herança do gene mitocondrial. Os resultados mostram que marcadores de PCR-RFLP nuclear e
mitocondrial são ferramentas eficazes na identificação precisa de híbridos interespecíficos de peixes, assim como
na distinção do parental materno envolvido no cruzamento. Tais estudos fornecem subsídios para um manejo
adequado, fiscalização e monitoramento de projetos que envolvam a hibridação, assim como em diretrizes de
conservação biológica, a fim de evitar os possíveis impactos destes híbridos nas populações naturais das espécies
pintado e cachara.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq e ICMBio.
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Marcadores cromossômicos aplicados à piscicultura:
identificação do híbrido interespecífico “cachandiá”
das espécies Pseudoplatystoma reticulatum (cachara)
E Leiarius marmoratus (jandiá) (pisces, siluriformes)
Dias, FN1; Prado, FD1; Senhorini, JA2; Foresti, F3; Bortolozzi, J1; Porto-Foresti, F1
¹Laboratório de Genética de Peixes - Faculdade de Ciências de Bauru - UNESP. 2Instituto Chico Mendes de Conservação da
Biodiversidade - Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes Continentais - ICMBio/CEPTA. 3Laboratório de Biologia e
Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP.
[email protected]
Palavras-chave: manipulação genética em peixes, hibridação interespecífica, marcadores cromossômicos, NOR, conservação genética
Dentre as metodologias clássicas de manipulação genética aplicadas nas pisciculturas brasileiras, destaca-se
a hibridação interespecífica, visando principalmente o aumento da produtividade e a obtenção de linhagens
estéreis. Os resultados obtidos, no entanto, são de difícil interpretação. Um importante aspecto diz respeito aos
riscos biológicos que os híbridos podem apresentar ao meio ambiente, podendo contaminar geneticamente
estoques cultivados ou selvagens, caso sejam férteis, ou competir com as linhagens parentais. No presente estudo
procurou-se identificar citogeneticamente as espécies parentais Pseudoplatystoma reticulatum (cachara) e Leiarius
marmoratus (jandiá) e o híbrido interespecífico “cachandiá” (resultante do cruzamento de fêmea de cachara com
macho de jandiá). Para isso, foram utilizadas as técnicas de coloração Giemsa para análise cariotípica e coloração
com nitrato de Prata para o estudo da NOR (Região Organizadora de Nucléolo) destes indivíduos. Os resultados
mostraram um número diplóide de 2n=56 cromossomos igualmente para os parentais, com diferenças na fórmula
cariotípica, composta por 20 cromossomos do tipo metacêntricos, 12 submetacêntricos, 12 subtelocêntricos
e 12 acrocêntricos para o parental cachara e 20 cromossomos do tipo metacêntrico, 10 submetacêntricos, 12
subtelocêntricos e 14 acrocêntricos para o parental jandiá. O híbrido “cachandiá” apresentou o número diplóide
de 2n=56 cromossomos e uma fórmula cariotípica intermediária à dos parentais, com cromossomos distribuídos
em 20 metacêntricos, 11 submetacêntricos, 12 subtelocêntricos e 13 acrocêntricos. Após a coloração com nitrato
de Prata, verificou-se marcações da NOR no braço curto de um par cromossômico do tipo subtelocêntrico
em ambas as espécies parentais. No híbrido a NOR estava localizada no braço curto de dois cromossomos
subtelocêntricos de diferentes tamanhos, onde, provavelmente, um cromossomo foi herdado do parental cachara
e o outro do parental jandiá. Tais resultados mostram que as diferenças citogenéticas observadas entre as espécies
parentais e o híbrido estudado podem ser consideradas importantes marcadores cromossômicos diagnósticos na
identificação destes indivíduos. Essas técnicas podem fornecer os primeiros subsídios para o monitoramento de
produtos de hibridação em pisciculturas e servirão para orientação de programas de conservação biológica desse
grupo de peixes.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq E ICMBio
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Caracterização citogenética do híbrido interespecífico
“Cachapira” utilizado na piscicultura brasileira
Souza, CA1; Prado, FD1, Senhorini, JA2; Foresti, F3; Bortolozzi, J¹; Porto-Foresti, F1
¹Laboratório de Genética de Peixes - Faculdade de Ciências de Bauru - UNESP. 2Instituto Chico Mendes de Conservação da
Biodiversidade - Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes Continentais - ICMBio/CEPTA. 3Laboratório de Biologia e
Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP.
[email protected]
Palavras-chave: Hibridação interespecífica, marcadores cromossômicos, genética aplicada à piscicultura, conservação genética, genes
ribossômicos.
O produto da hibridação interespecífica, sendo favorecido pelo seu “vigor híbrido”, pode representar um risco
ao meio ambiente, podendo competir pelos recursos do ambiente com os parentais. Caso sejam férteis, podem
causar impacto sobre a integridade genética das populações selvagens já existentes num ambiente natural. Em
contrapartida, abre-se a possibilidade de uso de indivíduos com boas características qualitativas, oferecendo
produtos diferenciados para as pisciculturas, destinados ao consumo alimentar, pesca esportiva, e criação de peixes
ornamentais. Considerando estes fatores, tornam-se necessários programas de monitoramento genético, para a
identificação, caracterização e posterior monitoramento destes híbridos produzidos nas estações de reprodução
de peixes, para fins de manejo seguro e correto. O presente estudo tem como objetivo analisar a estrutura cariotípica
dos parentais Cachara (Pseudoplatystoma reticulatum) e Pirarara (Phractocephalus hemeliopterus) e de seu híbrido
interespecífico “Cachapira”, e buscar os possíveis marcadores citogenéticos que permitam a identificação precisa
das populações parentais assim como dos híbridos. Observou-se nos parentais e no híbrido número cromossômico
constante de 2n=56 e NOR com polimorfismos de tamanho nos parentais, presentes em um par de cromossomos
submetacêntricos e no produto híbrido, a NOR foi observada em um par cromossômico submetacêntrico, em
alguns casos aparecendo somente uma marcação em um par cromossômico. A heterocromatina constitutiva
(Banda C) revelou-se em blocos heterocromáticos nas regiões pericentroméricas e teloméricas nos parentais e no
híbrido. A técnica de Cromomicina (CMA3) revelou regiões ricas em pares de base GC exclusivamente nos locais
marcados pela Prata em todos os indivíduos analisados. A ampliação dos estudos com a aplicação de técnicas de
hibridação in situ com sondas fluorescentes para o gene rDNA 18S e rDNA 5S, permitirão ampliar a identificação
e caracterização das espécies estudadas, além de proporcionar um melhor entendimento sobre a estrutura e a
evolução cariotípica da espécie parental Phractocephalus hemeliopterus e seu híbrido interespecífico Cachapira
ainda não descrito na literatura.
Apoio Financeiro: FAPESP E CNPq.
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Identificação molecular do bacalhau vendido em
supermercados
Cavaleiro, NP1,2; Macedo, AGA1; Solé-Cava, AM1
Laboratório de Biodiversidade Molecular, Departamento de Genética, Instituto de Biologia – UFRJ
Pós-Graduação em Biologia (Biociências Nucleares), Universidade Estadual do Rio de Janeiro, UERJ
[email protected]
1–
2–
Palavras-chave: bacalhau, citocromo b, Gadus.
O bacalhau é um tradicional peixe comercializado mundialmente cuja produção alcançou quase 9 milhões de
toneladas em 2006 (dados da FAO). No mesmo ano, sua importação no Brasil atingiu cerca de 32000 toneladas
(IBAMA 2006), atrás somente das sardinhas e filés de merluza, evidenciando o alto valor desse peixe no mercado
interno. No entanto, bacalhau é um nome genérico que tem sido impropriamente usado para pelo menos cinco
principais espécies comercializadas como peixe seco e salgado no Brasil, por ordem decrescente de preço:
Gadus morhua (“bacalhau autêntico”), G. macrocephalus (“bacalhau cod”), Molva molva (“Ling”), Brosme brosme
(“Zarbo”) e Pollachius virens (“Saithe”). Como existe uma grande similaridade morfológica entre peixes salgados
comercializados, e como há uma diferença de mais de 100% entre o preço do “bacalhau” Saithe e do bacalhau
autêntico, investigamos a possibilidade de que existam erros de rotulagem nos peixes secos comercializados nos
principais supermercados do Rio de Janeiro. Os erros de rotulagem têm como conseqüência não só o engodo do
consumidor, mas também a dificuldade no controle sanitário (em casos de problemas espécie-específicos) e na
conservação das espécies, por dificultar o controle correto da sua comercialização. Nesse trabalho, analisamos
seqüências do citocromo b de 45 amostras de bacalhau salgado e seco inteiro de cinco diferentes supermercados
do Rio de Janeiro. As seqüências obtidas, devidamente editas e alinhadas, foram usadas, juntamente com
seqüências do GenBank, para construir uma árvore filogenética (Kimura 2-parâmetros/Neighbor-joining) a fim
de estabelecer os limites entre a diferenciação intra e interespecífica nas espécies estudadas. Baseado nesses
resultados, observamos uma variação na taxa de erro de rotulagem de zero a 30% nos diversos supermercados.
Os erros encontrados foram, em todos os casos, substituições de espécies mais caras por outras mais baratas,
rejeitando a hipótese nula de que os erros seriam aleatórios (P<0,01). Foram detectadas a substituição de Gadus
morhua (bacalhau do Atlântico Norte; R$ 50/kg) por G. macrocephalus (bacalhau do Pacifico; R$ 38/kg), G.
macrocephalus por Ling, e de Ling e Zarbo (R$ 28 e R$ 23/kg, respectivamente) por Saithe (R$ 18/kg). Todas as
espécies apresentaram algum tipo de rotulagem equivocada, exceto a Saithe, que é justamente a mais barata.
A taxa de erros de rotulagem global, a partir de amostras de bacalhau inteiro, foi de 15%. É muito provável que
essa taxa de erros (possivelmente fraudes) será muito maior na venda de bacalhau em formatos que dificultem
ainda mais a identificação morfológica, como pequenos pedaços ou desfiados, que facilitam a substituição das
espécies e a possibilidade de mistura da carne de espécies diferentes. O estudo desses outros tipos de material
comercializado constituirá a próxima etapa do estudo.
Apoio Financeiro: CNPQ E FAPERJ
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Análise da estrutura genética de estoques reprodutores
e repovoadores de Piaractus mesopotamicus (Pisces,
Characiformes) da Estação de Hidrobiologia e
Aquicultura de Salto Grande – SP
Penha, RES1; Tsuchiya, MTN1; Sodré, LMK1; Almeida, FS1
Universidade Estadual de Londrina, CCB - Departamento de Biologia Geral.
[email protected]
1
Palavras-chave: Piaractus mesopotamicus, repovoamento, estrutura populacional, aquicultura, microssatélites.
A estação de Hidrobiologia e Aquicultura de Salto Grande-SP pertence a Duke Energy International, empresa de
produção de energia elétrica, que possui como um de seus objetivos a produção de alevinos para repovoamento
de reservatórios e afluentes dos rios onde se localizam as suas hidrelétricas. Porém, para que este repovoamento
seja realmente efetivo, é necessário que se realizem estudos sobre a biologia e a genética populacional dos peixes
existentes no ambiente que se deseja repovoar, além de um manejo genético correto dos espécimes cultivados.
Este trabalho teve como objetivo, comparar a estrutura genética de um lote de matriz e seis de alevinos de P.
mesopotamicus (oriundos da Estação de Hidrobiologia e Aquicultura de Salto Grande – SP) com um grupo da
população natural (proveniente do rio Paranapanema), através das técnicas de RAPD e microssatélites, a fim
de verificar se estes grupos são compatíveis. Os dados obtidos por marcadores de RAPD indicam valores de
variabilidade genética (`P) de 47,11% a 58,94% para o grupo AL (alevinos), de 45% para M (matrizes) e 62,91% para
N (população natural). Os valores de FST obtidos a partir da comparação entre o grupo M e os AL (0,23 a 0,03)
indicam uma diferenciação genética que varia de alta a baixa, e o dendrograma nesta comparação apresentouse formado por um único agrupamento, com similaridade genética superior a 0,8. Já na análise comparativa
considerando o agrupamento AL em relação ao grupo N, obteve-se um valor de FST significativo (0,21), indicando
uma alta diferenciação genética; no dendrograma, houve a formação de dois grandes agrupamentos: um do grupo
AL e outro do grupo N, os quais tem similaridade de 0,75. O mesmo tipo de resultado foi obtido na comparação
entre os grupos M e N, sendo o FST estimado em 0,29. Os dados de microssatélite indicam que o grupo M e 3
lotes de alevinos tem valor de FIS mais altos do que o observado na população natural; e os valores de FST assim
como observado com RAPD indicam uma alta diferenciação genética entre o grupo N com os grupos M e AL. Os
valores de heterozigosidade observado foram baixos para o grupo M (0,11) e semelhantes nos demais grupos. Os
resultados obtidos indicam que a estrutura genética do lote alevinos (estoque repovoador) e do lote de reprodutores
apresenta-se diferente daquela da população natural do rio Paranapanema, a sugestão seria o agrupamento desses
lotes antes de uma reintrodução, e como forma de manejo aumentar o número de exemplares nos cruzamentos e
reavaliar todo o estoque de matrizes.
Apoio Financeiro: Duke Energy International, FAUEL, UEL
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78
Molecular systematic of fishes of genus Leporinus
(Characiformes: Anostomidae)
Gualter, PKC1; Sucupira, IG1; Santana, M das GGM1; Silva, LMM2; Barros, MC2; Fraga, CE2
1
2
Universidade Federal do Piauí - UFPI
Laboratório de Genética e Biologia Molecular CESC – UEMA, Caxias-MA.
Palavras-chave: rRNA 16S, Piau, Rio Itapecuru, GenBank, Anostomidae
O conhecimento da sistemática é essencial ao desenvolvimento de qualquer ramo da biologia, assim incertezas
quanto ao status taxonômico pode comprometer a tomada de decisões em relação a programas de manejo e
conservação de espécies. A família Anostomidae agrupa 12 gêneros e 140 espécies de peixes de ocorrência na
região Neotropical. Nesta família o gênero Leporinus com 87 espécies é o mais diversificado, integrando espécies
de taxonomia complexa. Desta maneira, o presente trabalho objetivou analisar seqüências do gene mitocondrial
rRNA 16S de espécies do gênero Leporinus, afim de contribuir com sua sistemática. Foram obtidos 31 exemplares
de Leporinus piau na bacia do Rio Itapecuru/MA. No GENBIMOL fez-se extração de DNA a partir do tecido
muscular utilizando-se o protocolo de fenol-clorofórmio. A amplificação do gene rRNA 16S foi realizada via PCR
e seqüenciado usando-se o método didesoxiterminal com o Kit Big Dye. As seqüências geradas foram editadas e
alinhadas no programa BioEdit. Ao banco de dados foram adicionadas oito seqüências do Genbank classificadas
como L. piau (EU181563 e EU181564), L. friderici (EU181574 e EU181602), L. reinhardti (EU181562 e EU181565) e L.
taeniatus (EU181631 e EU181632) oriundas da bacia do São Francisco e do La Plata. A espécie Schizodon dissimilis
da bacia do rio itapecuru foi utilizado como grupo externo. A análise filogenética foi realizada no programa MEGA
4.0. A significância dos agrupamentos foi estimada pela análise de bootstrap. Um fragmento de 483 pb foi obtido
para o gene mitocondrial rRNA 16S. A reconstrução filogenética pela análise de Máxima Parcimônia e NeighborJoining gerou árvores com topologia similar mostrando quatro clados fortemente suportados. O Clado I agrupou
os dez haplótipos de L. piau obtido a partir dos 31 espécimes seqüenciados da bacia do Itapecuru (bootstrap
99%). O clado II agrupou as duas seqüências de L. taeniatus (100% bootstrap). Já o clado III agrupou seqüências
de L. friderici, L. reinhardti e L. piau (bootstrap 100%) obtidas do Genbank e o clado IV agrupou seqüências de
L. reinhardti e L. piau (bootstrap 100%). Observou-se elevados índices de distância genética entre a seqüência
de L. piau (EU181564) e os haplótipos desta mesma espécie oriundos da bacia do Itapecuru (4,3 a 5,1%), como
também, entre a outra seqüência de L. piau (EU181563) e os haplótipos do Itapecuru (6,8 a 7,3%). Observou-se
ainda, valores elevados de distância genética entre as duas seqüências de L. piau, como também, entre as outras
duas seqüências de L. reinhardti retiradas do Genbank (6,6%). No entanto, entre as seqüências de L. reinhardti e
L. piau a distância foi de 0,2%. Portanto, estes resultados apontam uma problemática na identificação a partir de
caracteres morfológicos neste gênero, reforçando a necessidade do uso de marcadores moleculares na resolução
de incertezas taxonômicas.
Apoio: UEMA, UFPA, BNB, FAPEMA.
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Análise filogenética de subfamílias de Characidae
(Ostariophysi: Characiformes) com base nos genes
mitocondriais 16s e Citocromo B e nos genes
nucleares rag1, rag2, myh6, trop e sia
Avelino, GS1, Mariguela, TC1, Foresti, F1, Castro, RMC2, Oliveira, C1
Instituto de Biociências, Departamento de Morfologia, UNESP – Botucatu – SP
Departamento de Biologia, FFCLRP - Universidade de São Paulo – Ribeirão Preto – SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Filogenia, Sistemática molecular, DNA mitocondrial, peixes, sequenciamento
A família Characidae é o grupo mais especioso entre os Characiformes, abrangendo cerca de 65% das espécies da
ordem. O conhecimento das relações filogenéticas entre as subfamílias de Characidae e dessas com as demais famílias
de Characiformes é ainda bastante limitado e a família não é considerada monofilética. Várias reestruturações
recentes na sua classificação têm sido propostas e, como conseqüência da última revisão geral, uma grande parte
de sua diversidade (88 gêneros e 620 espécies) foi considerada incertae sedis em Characidae, sendo mantidas
somente treze subfamílias com alguma evidência de monofilia, porém suas relações permanecem desconhecidas.
Este trabalho faz parte de um projeto cujo objetivo é estudar as relações entre os membros da família Characidae.
Neste trabalho foram estudados representantes de todas as subfamílias reconhecidas em Characidae, exceto da
subfamília Rhoadsiinae, são elas: Aphyocharacinae, Bryconinae, Characinae, Cheirodontinae, Clupeacharacinae,
Glandulocaudinae, Iguanodectinae, Serrasalminae, Stethaprioninae, Stevardiinae, Tetragonopterinae e Agoniatinae,
um gênero de incertae sedis (Engraulisoma) e, como grupos externos exemplares das famílias Acestrohhynchidae,
Alestidae, Anostomidae, Chilodontidae, Citharinidae, Crenuchidae, Ctenoluciidae, Curimatidae, Cynodontidae,
Distichodontidae, Erythrinidae, Gasteropelecidae, Hepsetidae, Hemiodontidae, Lebiasinidae, Parodontidae,
Prochilodontidae, Hypopominae e Gymnotidae. Foram amplificados e seqüenciados parte dos genes mitocondriais
16S e Citocromo b e parte dos genes nucleares Rag1, Rag2, MYH6, Trop e Sia. As seqüências foram alinhadas
usando o programa ClustalW implementado no programa DAMBE versão 4.0.65 e BIOEDIT e analisadas pelo
método de máxima parcimônia (MP) com o programa Mega 4.1. A confiabilidade dos nós internos foi testada pelo
método de bootstrap utilizando 1000 réplicas. O alinhamento final resultou em uma matriz de 5610 caracteres dos
quais 2005 foram conservados, 3466 foram variáveis e 2038 foram filogeneticamente informativos para as análises
de parcimônia. A análise por máxima parcimônia (MP) resultou em uma árvore final com comprimento de 11537
passos, índice de consistência 0.46 e índice de retenção 0.42. Através dessa análise, o monofiletismo da família
Characidae, só não é confirmado, devido à presença da família Gasteropelecidae como grupo-irmão de Bryconinae,
as demais subfamílias formam um grupo monofilético. A obtenção de dados adicionais para os representantes das
subfamílias já analisadas, assim como o sequenciamento de representante da subfamília Rhoadsiinae e de outras
famílias de Characiformes, em andamento, serão fundamentais para uma melhor resolução das relações entre
esses grupos.
Apoio financeiro: FAPESP
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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80
Molecular systematic of the subfamily
Aphyocharacinae (Characiformes, Characidae)
Tagliacollo, VA 1; Roxo, FF; Britzke, R; Foresti, F; Oliveira, C.
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu.
[email protected]
1
Keywords: Phylogeny, Molecular, Aphyocharacinae, Aphyocharax nattereri, synonymous.
The subfamily Aphyocharacinae comprises only the genus Aphyocharax. Morphological evidences suggest that this
group is monophyletic. However, nowadays, some discussions about its monophyly and new arrangements have
been proposed, like the inclusion of the Aphyocharax into the subfamily Paragoniatinae. Since the monophyly of
Aphyocharacinae is still uncertain and there is no evidence on the light of cladistic methodology, a phylogenetic
analysis will be helpful in order to understand the inter-relations of the group and, in the future, it can make
clear some relations within the family Characidae. Thus, based on nuclear and mitochondrial genes, we show a
preliminary phylogeny to the subfamily Aphyocharacinae and we focused our analysis in Aphyocharax nattereri. This
way, DNA from nine ethanol preserved tissue samples were extracted with the Wizard Genomic DNA Purifications
Kit (Promega) and, after that, the Myh6 nuclear gene and 16S mitochondrial gene were amplified using the PCR
technique. In the next step, the PCR products were purified with Exosap enzyme and sequencing reactions were
loaded on an automatic sequencer. The sequences were aligned manually using a sequence alignment editor
(BioEdit 5.0.9) and Data analysis in Molecular Biology and Evolution (DAMBE 4.1.27). Finally, the evolutionary
history was inferred using the Maximum Parsimony method, which was conducted in Molecular Evolution
Genetics Analysis (Mega 4.0). As results, we verified that the sequence length of Myh6 nuclear gene showed, on
average, 840 pb and 16S mitochondrial gene around 650 pb. Our dataset resulted in a total of 1206 characters from
which 152 were phylogenetically informative. The consensus tree was rooted in Iguanodectes geisleri (outgroup),
subfamily Iguanodectinae, and Phenagoniates macrolepis appear as most basal ingroup. Furthermore, our results
show that genus Aphyocharax and Prionobrama related as a sister group however, due to Aphyocharax nattereri,
the monophyly of Aphyocharax can not be corroborated. In order to keep its monophyletic status, it is necessary
to move the specie Aphyocharax nattereri to the genus Prionobrama, which is allocated now as incertae sedis in
Characidae. Therefore, based on morphological evidences and, now, in molecular phylogeny Aphyocharax nattereri
should be synonymized to Prionobrama nattereri.
Financial support: CNPq and FAPESP
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Identificação molecular (DNA Barcode) de peixes
pertencentes aos rios litorâneos do estado de São
Paulo
Henriques, JM¹; Foresti, F¹; Oyakawa, OT2; Oliveira, C¹
¹Departamento de Morfologia, Universidade Estadual Paulista - UNESP – Distrito de Rubião Jr. s/n, Instituto de Biociências, Cep 18600000, Botucatu - SP, Brasil;
2
Seção de Peixes, Museu de Zoologia, Universidade de São Paulo - USP, São Paulo – SP, Brasil;
[email protected]
Palavras-chave: DNA Barcode, COI, peixe, sequenciamento, Bacias Costeiras
O conjunto de drenagens atlânticas, denominado rios litorâneos, corresponde a diversos cursos d’água que nascem
na Serra do Mar e desembocam no mar. Com exceção dos riachos contidos no complexo do Parque Estadual
da Serra do Mar, os rios da região sofrem há algum tempo um intenso impacto resultante do desmatamento e
produção de lixo e esgotos domésticos não tratados, associados à ocupação imobiliária intensa e desordenada, com
fins de turísticos e de lazer. Embora em termos numéricos seja taxonomicamente menos diversa que outras bacias,
é a mais rica em formas endêmicas, já que a longa história evolutiva independente de suas bacias componentes
gerou um bom número de formas endêmicas conhecidas, número este que deverá aumentar significativamente
quando a região for melhor explorada ictiofaunisticamente. Estudos recentes propõem o uso de um segmento do
gene mitocondrial Citocromo Oxidase subunidade I (Cox I) como um sistema global de identificação de plantas
e animais. Seqüências desse gene são interpretadas como um código de barras (barcode), com as espécies sendo
delimitadas por uma seqüência particular ou por um conjunto de seqüências muito similares. Em vista do potencial
uso das seqüências de DNA barcode para a identificação de espécies, o presente trabalho tem por objetivos:
obter seqüências parciais do gene Cox I para as espécies de peixes dos rios litorâneos e avaliar o potencial dessas
seqüências para discriminação e identificação das espécies. Os exemplares coletados tiveram um fragmento de
tecido retirado e posteriormente foram fixados em formol e depositados na coleção de peixes do Laboratório de
Biologia e Genética de Peixes (LBP) de Botucatu. O fragmento de tecido retirado foi utilizado para extração de
DNA total, o qual foi submetido a PCR para amplificação do gene Cox I e posteriormente seqüenciado por um
seqüenciador automático. Os programas ATGC, Bioedit, Dambe e Mega 4.0 são utilizados para edição e análise
das seqüências obtidas. Nesse trabalho foram analisados 27 espécimes de peixes pertencentes a dez espécies,
dez gêneros, seis famílias e cinco ordens. Todas as espécies analisadas foram discriminadas corretamente. As
divergências genéticas médias encontradas foram de 0,21% dentro das espécies, 6,9% dentro das famílias, 14,15%
dentro das ordens. Os valores de divergência obtidos são similares aos encontrados em outros trabalhos para os
mais variados grupos. A separação de todas as espécies analisadas indica a eficácia do sistema de identificação por
DNA barcode. Assim acreditamos que nosso trabalho possa contribuir para uma melhor identificação da ictiofauna
dos rios costeiros do estado de São Paulo.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq.
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Determinação de relações evolutivas e ocorrência
de complexos de espécie em Rhamdia (Siluriformes,
Heptapteridae) com base no sequenciamento de genes
Mitocondriais
Garcia, C1; Trajano, E2; Oliveira, C3, Almeida Toledo, LF1
Instituto de Biologia, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Universidade de São Paulo
Instituto de Biologia, Departamento de Zoologia, Universidade de São Paulo
3
Instituto de Biociências, Departamento de Morfologia, UNESP-Botucatu
[email protected]
1
2
Palavras-chave: DNAmt, filogenia, haplótipo, sistemática molecular, Rhamdia.
O gênero Rhamdia é composto, atualmente, por 12 espécies, e compreende um dos grupos de Heptapteridae que
possui a maior distribuição na região Neotropical. Os dados citogenéticos e moleculares disponíveis demonstram
uma grande variabilidade genética para o gênero, reforçando a hipótese da ocorrência de complexos de espécie
em Rhamdia, principalmente na espécie mais estudada até o momento, R. quelen. O presente trabalho buscou
testar a hipótese da ocorrência de complexos de espécie no gênero, bem como inferir as relações evolutivas entre
algumas das espécies de Rhamdia encontradas na América Central e América do Sul, através do sequenciamento
de genes mitocondriais. Nas análises foram utilizadas cinco regiões mitocondriais (ATPase 6 e 8, Citocromo b, ND2
e D-loop), totalizando 3047 caracteres analisados para 131 exemplares de sete espécies de Rhamdia, representando
48 drenagens ao longo da região neotropical. As análises filogenéticas demonstraram que o gênero Rhamdia não é
monofilético, assim como a espécie R. quelen, para qual foi confirmada a ocorrência de um complexo de espécies.
A equivalência dos grupos Cis-Andinos e Trans-Andinos, propostos em trabalhos anteriores, foi recuperada. As
análises também identificaram a existência de linhagens haplotípicas bem diferenciadas e que apresentaram
estruturação filogeográfica, indicando que eventos de especiação alopátrica possuem importante papel na
diversificação do gênero. Dentro do que até o momento era reconhecido como R. quelen foram identificados 15
grupos bem definidos, sustentados por altos valores de bootstrap e índice de Bremer, e a esses grupos podem
ser atribuídas nomenclaturas de outras espécies do gênero que hoje encontram-se sinonimizadas em R. quelen,
indicando a necessidade de uma nova revisão taxonômica para o gênero Rhamdia, baseada não apenas em dados
morfológicos, mas também em dados genéticos.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq e FAPESP
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Sistemática molecular de peixes da ordem
Gymnotiformes
Silva, SCR1; Sampaio, I2; Barros, MC1; Fraga, E
[email protected]
1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA, Caxias, MA
2
Instituto de Estudos Costeiros/UFPA, Bragança-PA
Palavras-chave: Gymnotiformes, Filogenia, rRNA16S, Pindaré, Itapecuru.
A ordem Gymnotiformes é consideravelmente mais diversificada do que foi reconhecida anteriormente, distribuídos
em sete famílias (Sternopygidae, Gymnotidae, Eletrophoridae, Rhamphichthyidae, Hypopomidae, Eignmannidae
e Apteronotidae), com o número de espécies válidas tendo aumentado de 94 para 135 nos últimos 10 anos. São
conhecidos popularmente como peixes elétricos, sarapó, tubi, itui, e constitui um grupo taxonomicamente confuso
devido à pequena variação morfológica entre as espécies. Diante deste cenário, nosso objetivo foi investigar a
posição dos táxons dentro da ordem Gymnotiforme utilizando um fragmento do gene mitocondrial rRNA 16S. A
amostragem foi constituída de espécimes obtidas ao longo dos rios Itapecuru e Pindaré. O DNA total foi isolado
a partir de tecido muscular, utilizando-se o protocolo de fenol-clorofórmio, a amplificação da região genômica foi
realizada utilizando-se primers específicos por meio da técnica de PCR. Os produtos da PCR foram purificados e
seqüenciados utilizando-se o método didesoxiterminal com o Kit Big Dye. As seqüências obtidas foram editadas e
alinhadas usando-se o programa Bioedit, os cladogramas filogenéticos foram obtidos através do programa MEGA4.
Uma seqüência de Siluriformes foi usada como grupo externo. Um fragmento de 561 pares de bases do gene
mitocondrial rRNA 16, foi obtido de 17 espécimes de Gymnotiformes (Rhamphichthys marmoratus, Eignmannia
cf. virescens, Sternopygus macrurus). A análise filogenética mostrou que os espécimes de Sternopygus marcrurus
das Bacias do Pindaré e Itapecuru estão fortemente agrupados (100% bootstrap) com distância genética menor
que 1%. E. cf. virescens mostrou estar proximamente relacionados com S. macrurus do que com R. marmoratus. As
seqüências de E. cf. virescens e S macrurus estão separados com distância genética variando de 8 a 9% enquanto
que com R. marmoratus é cerca de 11%. Estes resultados sugerem que as espécies E. cf. virescens e S. macrurus
filogeneticamente pertencem a famílias diferentes não corroborando com a morfologia.
Apoio financeiro: BNB, UEMA e UFPA.
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84
Identificação molecular de espécies de Achirus
(Pleuronectiformes) da costa norte brasileira
Coimbra, YL1; Freitas, A1; Ramos, RT2; Sampaio, I1; Schneider, H1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular, Instituto de Estudos Costeiros, Universidade Federal do Pará, Campus de Bragança.
Departamento de Sistemática e Ecologia, Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Universidade Federal da Paraíba, Campus I,
Joao Pessoa, PB.
E-mail: [email protected].
1
2
Palavras-chave: Peixes, Pleuronectiformes, Achiridae, DNA mitocondrial, rRNA 16S
Peixes da ordem Pleuronectiformes podem ser facilmente reconhecidos pela anatomia dos juvenis e adultos, pósmetamorfose. Como outros grupos, iniciam seu ciclo de vida como larvas pelágicas, bilateralmente simétricas e
no decorrer do desenvolvimento as larvas sofrem metamorfose, na qual um olho migra de um lado para outro
da cabeça. Em algumas espécies o olho migra exclusivamente para o lado direito da cabeça (dextrais), em outros
migra para o lado esquerdo (sinistrais), e existem espécies que apresentam indivíduos com as duas formas. Os
Pleuronectiformes são os únicos vertebrados a desviar tanto de um corpo bilateralmente simétrico, sendo que
após a metamorfose abandonam o estilo de vida pelágico para adotarem o estilo bentônico, associando-se ao
fundo dos ambientes onde vivem (lama, areia, etc.). Podem ser marinhos, estuarinos e dulcícolas em menor
proporção, com distribuição mundial, sendo algumas espécies de alto valor econômico. A literatura reporta mais
de 50 espécies para a costa brasileira, alocadas nas famílias Paralichthyidae, Pleuronectidae, Bothidae, Achiridae e
Cynoglossidae, mas a taxonomia das espécies do Atlântico ocidental tem sido bastante negligenciada. O presente
estudo utilizou seqüências de DNA do gene mitocondrial rRNA 16S para identificar espécies de Achirus de
estuários da costa norte brasileira. As amostras foram coletadas em Soure e Bragança, e a identificação com base
em morfologia sugere a ocorrência de duas ou três espécies na área. A literatura tem registrado Achirus achirus,
A. lineatus e A. declivis para esta região, mas a chave de identificação mostra superposição nos dados merísticos,
o que dificultou a discriminação das referidas espécies com base apenas na taxonomia tradicional. Para a análise
genética foi utilizado um fragmento de DNA com cerca de 500 pares de bases, isolado via PCR e seqüenciado no
ABI 3130. As seqüências geradas foram alinhadas no BioEdit, e árvores filogenéticas foram geradas por Máxima
Parcimônia, Distância ou Máxima Verossimilhança. As três espécies de Achirus são claramente distintas com base
nas sequências de DNA mitocondrial. As divergências nucleotídicas foram menores entre A. lineatus e A. declivis
(cerca de 4%), e mais elevadas entre A. achirus e as duas (cerca de 9%). Os resultados desta análise demonstram a
importância do marcador molecular para auxiliar na análise taxonômica neste grupo de peixes.
Apoio: CNPq, CAPES, FINEP e UFPA.
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Evolutionary relationships Between species of the
genus Astyanax (Pisces: Characidae) - the sequence
analysis with a cytogenetic background
Kavalco, KF1; Pazza, R1; Garcia, C2; Brandão, O1,2; Malabarba, LR3; Almeida-Toledo, LF2
Laboratório de Genética Ecológica e Evolutiva, Campus Rio Paranaíba, Universidade Federal de Viçosa – UFV.
Laboratório de Ictiogenética, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo – USP.
3
Departamento de Zoologia, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFRGS.
1
2
Keywords: Astyanax, filogenia, phylogeny, ATPase6/8, gene tree.
Sequences of the regions comprising the subunits 6 and 8 of the ATPase gene were used to infer evolutionary
relationships among species and different cytotypes of Astyanax from the hydrographic basins of Iguaçu, Ribeira
de Iguape, Guapirimim, Paranapanema, Tietê, Paraíba do Sul, Mogi-Guaçu, Grande and São Francisco rivers,
representing the main Brazilian hydrographic systems. Additionally, a species from Central America, A. mexicanus,
was also analyzed. Sequences were obtained for 118 specimens of 13 species. In case of groups composed of cryptic
species according to chromosomal studies, such as A. altiparanae, A. aff. fasciatus and A. hastatus, more than a single
population was included in the analysis. In the phylogenetic analysis we used the Maximum Parsimony method
with CNI algorithm. Neighbor-Joining distance trees were constructed by Maximum Likelihood Composite (MCL),
using Tamura-Nei substitution model. We verified the occurrence of 110 haplotypes, with haplotype diversity (Hd)
= 0.99. In this work, 874 characters were analyzed and 442 bp show to be informative to parsimony. The nucleotide
frequencies found were: 0.287 (A); 0.300 (T/U); 0.275 (C); 0.138 (G) and transition/transversion ratio was k1=5.662
(purines) and k2=5.502 (pyrimidines). Transition/transversion deflection was R=2.324 and the alpha parameter of
the gamma distribution was α=0.73. Structured branches supported by high bootstrap values discriminated the
restricted coastal species A. giton, A. hastatus, A. intermedius, and A. ribeirae from the remaining ones, following the
trends observed by chromosomal evolution. Other two relatively well structured clusters separated A. mexicanus,
A. altiparanae, A. aff. bimaculatus and A. lacustris from A. bockmanni, A. aff. fasciatus, A. aff. janeiroensis, A.
scabripinnis and Astyanax sp. B ( from Iguaçu river basin). However, among and within these groups, several cases of
paraphyly and polyphyly are observed in relation to haplotypes from the same geographic area. The genus showed
to be a monophyletic unit using the out-groups Roeboides occidentalis, Bryconamericus iheringii e Mimagoniates
microlepis. Data analysis of the ATPase6/8 region reveals that the genus Astyanax comprises artificial taxonomic
groups, mainly observed within those characterized by a remarkable karyotypic diversity. Moreover, some clusters
suggested by cytogenetic characters could be confirmed, particularly in relation to the chromosomal distribution
of the 5S ribosomal gene, diploid number and the amount of acrocentric chromosomes in the karyotype. The
estimated divergence time of the genus Astyanax is around 19 Ma, with a high adaptedness radiation in the last 5
Ma. Chromosomal variation appears to be initiated approximately to 1Ma, increasing in the last 500 thousands of
years.
Financial Support: CNPq, FAPESP and FAPEMIG.
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Estudos sobre as relações biogeográficas das espécies
do gênero Pimelodella Eigenmann & Eigenmann, 1888
do Alto Paraná
Peixoto, MS1; Trajano, E2; Oliveira, C3; Bockmann, FA4; Toledo, LF1
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo.
Departamento de Zoologia, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo.
3
Departamento de Morfologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho.
4
Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: biogeografia, Pimelodella, mtDNA, Siluriformes, bacias hidrográficas.
São conhecidos atualmente aproximadamente 1 milhão e 800 mil espécies de organismos vivos dos quais
aproximadamente 28.000 são peixes. A maior parte dessa riqueza e diversidade encontra-se em águas tropicais,
particularmente nas águas doces Neotropicais. Na bacia do Alto Paraná com 900.000 km2 há estimativa da
ocorrência de 130 espécies de peixes, sendo que as ordens Siluriformes e Characiformes correspondem a cerca
de 80% das espécies. Os representantes da ordem Siluriformes são popularmente conhecidos como bagres,
cascudos, entre outros. Os Siluriformes Neotropicais compreendem oito grupos monofiléticos: Diplomystidae,
Cetopsidae, Loricaridae, Doradeidae, Aspredinidae, Pimelodidae, Heptapteridae e Pseudopimelodidae. Pimelodella
é um dos gêneros pertencentes à família Heptapteridae, contando com cerca de 60 espécies distribuídas desde
o sul da América do Sul até o Panamá e América Central. Os dados citogenéticos existentes para este gênero
demonstram uma grande variabilidade cariotípica, marcada por variações no número diplóide, presença de um
sistema de cromossomos sexuais diferenciados morfologicamente e de cromossomos B. Em 2005 foram isolados e
caracterizados microssatélites de Pimelodella chagresi na tentativa de investigar a existência de espécies crípticas e
estudar a estrutura populacional desta espécie. No presente trabalho, estudos moleculares de diferentes espécies de
Pimelodella que ocorrem nos principais rios da bacia do Alto Paraná foram realizados, utilizando-se amplificação e
análise combinada de quatro genes mitocondriais para uma abordagem cladística baseada na análise simultânea
para buscar resolver as relações evolutivas para o gênero. Os produtos de PCR foram seqüenciados em seqüenciador
automático, modelo ABI-PRISMA 3100, e as seqüências obtidas foram verificadas no GenBank para confirmação
da similaridade com seqüências mitocondriais de outros peixes. As seqüências foram alinhadas no programa
PAUP pelo método de Máxima Parcimônia. Nossos dados sobre as seqüências sugerem que, apesar do isolamento
geográfico, ocorrem agrupamentos entre populações que se encontram separados em sub-bacias hidrográficas. Os
gêneros Ancestronychthys, Imparfinis, Microglanis e Rhamdia foram utilizados como grupos externos.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq e CAPES.
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87
Estudo citogenético comparativo ente espécies de uma
região de divisor de águas
Neto, MF1; Moreira-Filho O1
Universidade Federal de São Carlos,Rodovia Washington Luis km 235, CEP:13565-905, São Carlos, SP
[email protected]
1
Palavras-chave: Citogenética de peixes, Characidae, Gymnotidae, Perciformes, cromossomos.
A importância de se estudar os ambientes de cabeceiras dos rios é que estes permitem investigar espécies de
peixes isoladas geograficamente por de barreiras físicas, químicas ou bióticas. O ribeirão do Feijão está inserido na
região de São Carlos, oeste do Estado de São Paulo. Trata-se de umas das principais sub-bacias do alto do JacaréGuaçu, sendo a principal fonte de abastecimento de água da cidade. O ribeirão do Pântano também nasce na
região de São Carlos, a cerca de 900m de altitude, atravessa os municípios de São Carlos e Descalvado, percorrendo
cerca de 45Km. Os ribeirões, que têm suas nascentes protegidas pela APA Estadual de Corumbatai, foram incluídos
em toda a extensão contida no município, até desembocar no Rio Mogi-Guaçu. O objetivo do presente trabalho
foi de caracterizar cromossomicamente espécies da ictiofauna dos dois ribeirões e comparar as características
das populações através de técnicas de citogenética básica e molecular, identificando diferenças entre as mesmas
espécies dos dois ribeirões, que foram separados no passado por um divisor de águas, restringindo o fluxo gênico
e possibilitando o aparecimento de alterações cromossômicas. Foram comparadas três espécies de peixes de
três ordens distintas: Gymnotiformes (Gymnotus carapo); Characiformes (Astyanax altiparanae) e Perciformes
(Geophagus brasiliensis). A espécie Astyanax altiparanae, apresentou um mesmo número diplóide, 2n=50
cromossomos, com fórmulas cariotípicas e número de regiões organizadoras de nucléolos (RONS) divergentes. Em
Geophagus brasiliensis o número diplóide foi de 2n=48 cromossomos com mesma fórmula cariotípica, diferindo
na distribuição da heterocromatina costitutiva. Para Gymnotus carapo que apresentou 2n=54 cromossomos, foi
identificado um heteromorfismo de tamanho em um par portando uma região de constrição secundária pela
hibridação in situ com sonda de rDNA 18S. As demais características como constituição cariotípica e distribuição
heterocromática demonstraram-se conservadas em Gymnotus carapo. Os resultados obtidos indicam que as
espécies estudadas nas duas populações analisadas apresentaram diferenças em seu cariótipo, demonstrando que
cada espécie segue sua própria evolução, como conseqüência de um processo restritivo ao fluxo gênico.
Financiamento: FAPESP, CNPQ
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88
Filogenia molecular de Characiformes da bacia do
Itapecuru, Maranhão
Fraga, E; Schneider, H; Barros, MC; Sampaio, I.
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA, Caxias-MA.
Laboratório de Genética e Biologia Molecular/IECOS – Campus de Bragança/UFPA, Bragança-PA.
[email protected]
Palavras-chave: Filogenia, DNA mitocondrial, rRNA 16S, Maranhão, Itapecuru
Dentre os Characiformes, cerca de 14 famílias, 240 gêneros e aproximadamente 1460 espécies ocorrem na região
Neotropical. Estes peixes são dominantes em ambientes de água doce da América do Sul ocorrendo mais da metade
de suas espécies na Amazônia. Na bacia do rio Itapecuru representantes desta ordem pertencentes às famílias
Anostomidae (gêneros Leporinus e Schizodon), Characidae (gêneros Colossoma, Myloplus, Metynnis e Pygocentrus)
Curimatidae (gêneros Psectrogaster, Curimata e Steindachnerina) Erythrinidae (gênero Hoplias) e Prochilodontidae
(gênero Prochilodus) ocorrem com freqüência, no entanto, informações sobre suas relações filogenéticas são
inexistentes. O objetivo deste foi caracterizar molecularmente os espécimes destas famílias fornecendo dados que
contribuam para sistemática da ordem usando como ferramenta o gene rRNA 16S. Os espécimes analisados foram
obtidos na bacia do Rio Itapecuru e o DNA foi extraído a partir do tecido muscular utilizando-se o protocolo de
fenol-clorofórmio. A amplificação do fragmento do gene rRNA 16S foi realizada via PCR usando primers específicos
e o produto da PCR seqüenciado usando-se o método didesoxiterminal. As seqüências geradas foram editadas e
alinhadas no programa Bioedit e as análises filogenéticas realizadas no programa MEGA4. Três seqüências foram
incorporadas à análise (duas do Genbank - U15239-Hypostomus sp/U15247-Corydoras sp e uma Pseudoplatystoma
fasciatum da bacia do rio Itapecuru) e usadas como grupo externo. Um fragmento de aproximadamente 600 pb do
gene mitocondrial rRNA 16S foi obtido para 110 espécimes de Characiformes. A reconstrução filogenética gerou
árvores com topologia similar pela análise de distância e de máxima parcimônia mostrando três clados fortemente
suportados (95 a 100% de bootstrap). O primeiro agrupou os espécimes da família Anostomidae (Leporinus piau
e Schizodon dissimilis), o segundo agrupou os gêneros Myloplus e Metynnis, dois haplótipos Pygocentrus nattereri
e a seqüência de Colossoma macropomum (Família Characidae). O terceiro clado agrupou os três haplótipos de
Hoplias malabaricus (Família Erythrinidae). As famílias Curimatidae e Prochilodontidae mostraram-se muito
próximas constituindo-se o grupo irmão da família Anostomidae. A menor distância genética foi observada entre
as famílias Curimatidae e Prochilodontidae (6%) e valores bem mais elevados foram encontrados entre a família
Erythrinidae e Characidae (17%). Observou-se ainda, elevados valores de distância genética entre os gêneros
Leporinus e Schizodon (10%) e valores menores (4,5%) entre Myloplus e Metynnis (Characidae), como também,
entre Psectrogaster e Curimata (Curimatidae). A maior diversidade haplotipica (Hd=0,72) foi observada para o
gênero Leporinus (Anostomidae). Portanto, nossos resultados mostram que dentre os Characiformes, Curimatidae
e Prochilodontidae estão fortemente relacionados com baixo índice de distância genética, como apontado pela
morfologia, e confirmam a introdução de Colossoma macropomum na bacia do rio Itapecuru.
Apoio Financeiro: FAPEMA, UEMA, BNB e UFPA.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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89
Filogeografia de traíras Hoplias malabaricus (Bloch,
1794) no sudeste do Brasil
Santos, U; Belei, FA; Völcker, CM; Dergam, JA
Departamento de Biologia Animal, Universidade Federal de Viçosa, Laboratório de Sistemática Molecular Beagle. Viçosa-MG, Brasil.
[email protected]
Palavras-chave: DNA mitocondrial, filogeografia, dispersão.
A fauna de peixes neotropicais é considerada a mais rica do mundo. Toda essa diversidade foi proporcionada
pela complexa história paleohidrológica dos rios Sul Americanos, os quais promoveram vicariância e dispersão
da fauna aquática nos últimos 120 milhões de anos. Hoplias malabaricus é um complexo de espécies no qual até
o momento foram reconhecidos sete cariomorfos, indicados por números diplóides e letras conforme Bertollo
et al. (2000). Neste trabalho exploramos a informação biogeográfica de dados citogenéticos e moleculares (DNA
mitocondrial) de 16 populações de H. malabaricus de 12 bacias hidrográficas do sudeste do Brasil. As inferências
filogeográficas foram realizadas usando neighbor joining (NJ), máxima parcimônia (MP), máxima verossimilhança
(ML) e inferência Bayesiana (MB). O melhor modelo de evolução molecular para ML e MB foi encontrado usando
Modeltest e Mrmodeltest, respectivamente. O sinal filogenético em NJ, MP e ML foram obtidos com 1.000
repetições de bootstrap. A inferência Bayesiana foi feita com cinco milhões de gerações. Os resultados encontrados
sugerem um longo isolamento reprodutivo entre os cariomorfos de traíras 2n=42A e 2n= 40F, um haplogrupo
basal constituído por traíras de cariomorfo 2n=42A, e outro haplogrupo que reúne traíras que apresentam os dois
cariomorfos. Em termos biogeográficos, o cladograma sugere uma expansão recente das traíras 2n=42A da bacia
do rio Grande (rio Jacaré) para a bacia do rio São Francisco (córrego Tombadouro). Entretanto, este cariomorfo
apresentou dois haplótipos bem definidos no córrego Tombadouro, um deles estreitamente aparentado com as
bacias costeiras dos rios Macacu, Ribeira e Paranaguá. O outro haplótipo é aparentado com as populações dos rios
Jacaré e as bacias costeiras do Paraíba do Sul, São João, Macaé e Itabapoana. Os espécimes 2n=40F encontrados
na bacia do rio São Francisco formaram um clado de baixa variabilidade e estreitamente relacionado à bacia
costeira do rio Itapicuru, o qual apresenta cariomorfo 2n=40F. As populações das bacias do rio Doce (2n=42B) e
São Mateus (2n=42A) formaram outro clado estreitamente relacionado, sugerindo uma recente diferenciação do
cariomorfo 2n=42B com cromossomos sexuais do tipo XX/XY. Conforme o cladograma, o uso do número diplóide
para classificar as traíras resultaria em parafiletismo. A ocorrência nas bacias dos rios Grande e São Francisco, de
haplótipos simpátricos aparentados com diferentes bacias costeiras indicam que pelo menos parte dos cariomorfos
42A do rio Grande e do São Francisco tem origem em bacias costeiras.
Apoio financeiro: CNPq e IEF.
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Estudos filogenéticos na Superfamília Loricarioidea
(Teleostei: Siluriformes) com base em sequências do
DNA nuclear e mitocondrial
Soares, AA; Foresti, F; Oliveira, C
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu.
[email protected]
Palavras-chave: Genética, Filogenia, DNA mitocondrial, DNA nuclear, Loricarioidea e Siluriformes
A superfamília Loricarioidea, o maior grupo de Siluriformes da região Neotropical, é composta por seis famílias:
Astroblepidae, Callichthyidae, Loricariidae, Nematogenyidae, Scoloplacidae e Trichomycteridae. Estudos
morfológicos têm sugerido que as famílias Trichomycteridae e Nematogenyidae formam um grupo monofilético
que é irmão do clado formado pelas demais famílias. As famílias Astroblepidae e Loricariidae formam um grupo
monofilético que é irmão de Scoloplacidae, e essas três famílias formam um grupo monofilético que é irmão de
Callichthyidae. Com o objetivo de testar as hipóteses de relacionamento descritas acima, foram seqüenciados
segmentos dos genes mitocondriais 16S rRNA ribossômico (16S), citocromo oxidase I (COI) e citocromo b (cyt
b) e os genes nucleares codificadores de proteínas recombination activating protein (rag1 e rag2), totalizando
cinco genes de 48 espécies de Siluriformes, incluindo representantes de Diplomystidae, Nematogenyidae,
Trichomycteridae, Callichthyidae, Scoloplacidae, Loricariidae e Astroblepidae. Ainda que as diferentes filogenias
obtidas pelos métodos de máxima parcimônia não tenham sido todas congruentes, foi confirmada a monofilia
de Loricarioidea, foi corroborado Nematogenyidae como grupo-irmão das demais famílias que constituem a
superfamília Loricarioidea, bem como sua posição basal em relação aos demais Loricarioidea. Essas hipóteses
haviam sido propostas em estudos morfológicos do grupo. Por outro lado, os dados moleculares sustentaram a
existência de um clado formado pelas famílias Scoloplacidae e Callichthyidae que apareceram como grupo-irmão
do clado formado pelas famílias Loricariidae, Trichomycteridae e Astroblepidae. Considerando as diferenças
observadas entre as filogenias obtidas com dados morfológicos e moleculares conclui-se que uma ampliação
dos dados (moleculares e morfológicos), será fundamental para um melhor entendimento das relações entre as
famílias de Loricarioidea.
Apoio Financeiro: FAPESP e CAPES.
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Identificação de um elemento transponível do tipo SINE
associado ao rDNA 5S no gênero Gymnotus
Claro, F. L.; Almeida-Toledo, L. F.
Instituto de Biociências, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: Gymnotus, Gymnotidae, SINE, rDNA, 5S
Nos eucariotos superiores, os genes ribossomais são organizados em duas famílias multigênicas, cujos genes
apresentam taxas de repetição moderadas. Composto de inúmeras repetições em tandem o rDNA 5S é formado por
uma região altamente conservada do DNA, com aproximadamente 120pb, seguida de um espaçador não transcrito
(NTS) de tamanho variável, cuja variação relaciona-se com a ocorrência de inserções/deleções, pequenas repetições
ou a presença de pseudogenes. A região do NTS, quando comparada com a parte transcrita, possui uma evolução
muito rápida, apresentando, uma maior quantidade de sítios informativos, sendo, portanto, utilizada com sucesso
em estudos evolutivos entre espécies próximas. Dessa forma, o gene ribossômico 5S mostra-se como uma excelente
ferramenta na compreensão da evolução destas famílias multigênicas, bem como, devido à sua intensa dinâmica
evolutiva, pode atuar como um marcador genético entre espécies e populações. O gênero Gymnotus é composto
por 18 espécies, sendo ele o mais diverso e de mais ampla distribuição dentre os Gymnotiformes. Até o momento,
poucos estudos acerca do rDNA 5S bem como a análise molecular de seu NTS foram levados a efeito na família
Gymnotidae, permanecendo disponíveis na literatura apenas estudos referentes à citogenética do grupo. Diante
disso, pode-se afirmar que é necessária a utilização de análises citogenético-moleculares nas espécies pertencentes
à família Gymnotidae, auxiliando a compreensão da evolução dessa família gênica. No presente trabalho o
seqüenciamento do rDNA 5S juntamente com seu NTS em duas espécies do gênero Gymnotus, G. carapo (2n=54)
e G. sylvius (2n=40) e sua posterior análise com o programa RepeatMasker levou a identificação de um elemento
transponível do tipo SINE (Short Interspersed Nuclear Element) associado ao gene ribossômico 5S de ambas as
espécies. Verificou-se nas seqüências identificadas, uma elevada similaridade entre si de aproximadamente 98%
e de aproximadamente 83% quando comparadas ao SINE3-1, elemento transponível identificado em Danio rerio,
apresentando alterações pontuais, caracterizadas por transversões/transições e inserções/deleções. A hibridação
in situ dessas seqüências evidenciou uma interessante diferença entre as espécies em estudo, uma vez que em
G. sylvius foram detectados apenas dois sítios, enquanto que para a espécie G. carapo esse número se mostrou
sete vezes maior, totalizando quatorze sítios encontrados. Nota-se, portanto, uma não conservação do padrão
de distribuição dos sítios entre as espécies, fato que pode estar associado a rearranjos cromossômicos, os quais
podem estar associados à perda dessa seqüência em G. sylvius, espécie com menor número cromossômico (2n=40).
Estudos futuros com outras espécies do gênero são necessários para que seja possível delinear tanto a dinâmica
evolutiva como a caracterização completa desse elemento transponível.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq e CAPES.
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Isolamento e caracterização de um elemento
transponível Tc1-like em Corydoras aeneus
(Siluriformes, Callichthyidae)
Shimabukuro-Dias, CK; Ferreira, DC; Foresti, F; Oliveira, C
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes, Instituto de Biociências, UNESP/Botucatu.
[email protected]
Palavras-chave: DNA repetitivo, transposons, hibridação in situ, Callichthyidae, Siluriformes.
Os transposons são elementos genéticos móveis, amplamente distribuídos nos genomas de procariotos e
eucariotos. Esses elementos utilizam um mecanismo de transposição do tipo copy and paste e são caracterizados
por repetições terminais invertidas que flanqueiam o gene para a transposase. No presente trabalho, amostras
de DNA genômico de exemplares de Corydoras aeneus de Marapoama (SP) foram submetidas à fragmentação
por restrição enzimática para a identificação e isolamento de sequências repetidas de DNA. Foram testadas
inicialmente 10 enzimas (AluI, HindIII, HinfI, BsuI, BamHI, HaeIII, MspI, EcoRI, EcoRV e KpnI), sendo que apenas a
enzima HinfI permitiu a identificação de um fragmento de restrição com aproximadamente 300 pares de bases.
Posteriormente, esse fragmento foi ligado ao plasmídeo pMOS, que foi inserido em linhagens de E. coli competentes
DH5α. Dez clones positivos foram obtidos e sequenciados. A sequência consenso dos clones, denominados
CaHinfI, apresentou 306pb, das quais 52% correspondem às bases AT. Essa sequência foi analisada no Genbank,
sendo encontrada similaridade de 85% com o transposon Tc1-like de Salmo salar. A hibridação in situ fluorescente,
utilizando como sonda as sequências CaHinfI, resultou num padrão de hibridação disperso ao longo de todos
os cromossomos do complemento cariotípico de C. aeneus. Os resultados da hibridação em membrana com
digestões parciais do DNA genômico de C. aeneus mostraram que o fragmento isolado representa uma sequência
de DNA repetitivo disperso no genoma, corroborando os dados de FISH, e permitindo sugerir que essa sequência
corresponde a um fragmento de um transposon da superfamília Tc1, já que houve similaridade com esse elemento
transponível de Salmo salar. Os elementos Tc1-like apresentam 1200-2500pb e pertencem a uma superfamília de
transposons amplamente distribuída, de protozoários a vertebrados, tendo sido isolados em várias espécies de
peixes. Essa imensa distribuição pode estar ligada a eventos de transferência horizontal, permitindo sua presença
entre todos os organismos, mesmo pertencentes à taxa muito distantes.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Mapeamento cromossômico do gene RAG 2
(Recombination Activating gene) em Pseudoplatystoma
corruscans (Siluriformes, Pimelodidae)
Hashimoto, DT1; Ferguson-Smith, MA2; Rens, W2; Bortolozzi, J1; Foresti, F3; Prado, FD1; Porto-Foresti, F1
¹Laboratório de Genética de Peixes - Faculdade de Ciências de Bauru - UNESP. 2Department of Veterinary Medicine, University of
Cambridge, Cambridge, United Kingdom. 3Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP.
[email protected]
Palavras-chave: mapeamento físico, gene RAG 2, Pseudoplatystoma
Estudos de mapeamento físico cromossômico em peixes têm demonstrado que seqüências de DNA podem ser
instrumentos extremamente úteis para um conhecimento apurado da estrutura e organização do genoma das
espécies. Neste contexto, a maioria dos dados disponíveis atualmente é relacionada à localização cromossômica
de genes ribossomais 18S e 5S e, em alguns trabalhos, a distribuição de seqüências repetitivas específicas no
genoma. Na literatura ainda não existe informações sobre a distribuição e localização dos genes RAG 1 e RAG 2 em
cromossomos de peixes. Entretanto, devido ao aspecto conservativo, as sequências de DNA destes genes têm sido
amplamente aplicadas em estudos filogenéticos e também na identificação de híbridos de peixes. As proteínas
RAG 1 e RAG 2 são mediadores chaves de um processo de rearranjo gênico conhecido como recombinação V(D)J,
responsável pela diversidade dos receptores de antígeno no sistema adaptativo imune de vertebrados. No presente
trabalho, com o objetivo de realizar o mapeamento físico do gene RAG 2 na espécie de peixe Pseudoplatystoma
corruscans (Siluriformes, Pimelodidae), conhecida popularmente como pintado, fragmentos de cerca de 1200 pb
deste gene foram isolados através de PCR e posteriormente, utilizados como sondas para hibridação cromossômica
in situ. Pseudoplatystoma corruscans apresentou número diplóide de 56 cromossomos e os resultados mostraram
marcações terminais nos cromossomos distribuídas em vários loci do genoma, demonstrando clusters de RAG 2
em cerca de 20 cromossomos. Sugere-se que a característica de localização deste gene em múltiplos loci possa ser
explicada pela presença de elementos de retrotransposon, uma vez que diversos fragmentos de SINEs e LINEs já
foram caracterizados entre a região intergênica dos genes RAG 1 e RAG 2 no genoma de algumas espécies. Com a
identificação de possíveis marcadores genéticos através desta caracterização cromossômica do gene RAG 2 em P.
corruscans, os resultados obtidos até o presente contribuem com dados citogenéticos relevantes para um melhor
conhecimento do genoma das espécies de peixes. Por fim, uma vez que P. corruscans possui grande importância
biológica e econômica para a aquicultura, devido a crescente produção de híbridos interespecíficos envolvendo
esta espécie, marcadores genéticos relacionados ao gene RAG 2 tornam-se bastante promissores para estudos de
fins aplicados e citogenética básica.
Apoio financeiro: CNPq E FAPESP
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Obtenção e caracterização de uma biblioteca
genômica enriquecida com regiões de microssatélites
para Brachyplatystoma Capapretum (Siluriformes:
Pimelodidae), um bagre migrador amazônico de
importância comercial
Lira-Cordeiro, A¹; Formiga-Aquino, K²; Batista JS²; Alves-Gomes, JA³
¹ Iniciação Científica, LTBM/INPA
² Pesquisador, LTBM/CPBA/INPA
³ Pesquisador LFCE/CPBA/INPA
E-mail: [email protected]
Palavras-chave: filhote capapreta, microssatélites, Amazônia, biblioteca genômica, Bagres migradores.
A captura de bagres é uma das fontes de renda para populações ribeirinhas da Amazônia desde a década de 70,
fazendo destes um importante alvo do comércio local. O gênero Brachyplatystoma representa boa parte desses bagres
capturados e o filhote capapreta (Brachyplatystoma capapretum), incluso nesse gênero, é umas das espécies-alvo da
pesca local. Esta espécie realiza longas migrações para completar seu ciclo de vida. Descrita recentemente a partir
de caracteres morfológicos e osteológicos. O presente trabalho teve como objetivo a construção e caracterização de
uma biblioteca genômica enriquecidas em microssatélites (SRRs) para posterior caracterização de locos SSRs para B.
capapretum. A biblioteca enriquecida foi gerada segundo protocolo proposto por Billote et al (1991) com modificaçõesO
DNA genômico de um indivíduo foi extraído com o método utilizando fenol-clorofórnmio e clivado com com enzima
de restrição Rsa I, com sítio de corte GT ↓ AC. Foi feita a ligação dos fragmentos gerados à adaptadores por uma DNA
T4 Ligase. O material foi amplificado por PCR e purificado seguindo protocolo do fabricante. A seleção das regiões de
SSRs foi realizada por hibridização de sondas, com seqüências nucleotídicas de repetição (CT)8 e (GT)8, utilizando
micro-esferas magnéticas. Os fragmentos selecionados foram ligados em vetor pGEM-T (ProMega). A transformação
bacteriana foi realizada por choque-térmico e em seguida colocada para cultura com a adição de IPTG e X-GAL, seguindo
o protocolo de Avi Levy, 1991. Foram selecionadas as colônias com coloração branca, as quais foram colocadas para
cultura individualmente. Foi realizada uma PCR das colônias selecionadas para verificação de insertos e destas realizouse extração do DNA plasmidial. O DNA plasmidial foi seqüenciado com kit de seqüenciamento Big Dye Terminator e
eletro-injetado em seqüenciador automático ABI 3130. As seqüências foram analisadas nos programas CHROMAS 2.33
e BIOEDIT 7.0.9.0. O programa WEBSAT fora utilizado para caracterização da biblioteca e desenho de Primers para
PCR. Das duas placas de bactérias recombinantes para montagem da biblioteca genomica de B. capapretum, 54 clones
(28,12%) foram seqüenciados, observando-se quatro clones sem SSRs, duas redundâncias e dois clones sem insertos na
biblioteca. Foi observada a presença de 70 SSRs, sendo que 73% apresentaram composição perfeita, 12.8% imperfeitos,
5.6% compostos perfeitos, 4.3% compostos imperfeitos e 4.3% compostos interrompidos e. Quanto ao motivo de
repetição, 91% são dinucleotídeos, 2,6% Trinucleotídeos, 1,2% Tetranucleotídeos, 1,3% Pentanucleotídeos e 1,3%
Hexanucleotídeos. A partir das seqüências obtidas, foram desenhados 36 pares de primers e até o momento, 15 destes
amplificaram satisfatoriamente com temperatura de anelamento de 60ºC. Analises posteriores visam a otimização e
caracterização desses locos, viabilizando o uso desses marcadores em estudos populacionais de B. capapretum.
Financiamento: CNPq, PROCAD/CAPES e INPA
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Desenvolvimento de iniciadores de regiões
microssatélites para a espécie migradora Hoplias
malabaricus (Bloch, 1974)
Gondim, SGCA1,2; Resende, LV2; Brondani, RPV3; Borba, TCO3; Silva-Júnior, NJ4; Telles, MPC1,2
Mestrado em Genética, Universidade Católica de Goiás.
Laboratório de Genética & Biodiversidade, Universidade Federal de Goiás.
3
Laboratório de Biotecnologia, EMBRAPA-CNPAF.
4
Mestrado em Ciências Ambientais e Saúde- UCG.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: primers, shotgun, SSR, STR, traíra
A traíra (Hoplias malabaricus) é uma espécie da família Erythrinidae de ampla distribuição geográfica ocorrendo
em todas grandes bacias hidrográficas brasileiras, com pequena diferenciação morfológica, comportamento
sedentário e grande variabilidade cariotípica. Os marcadores microssatélites constituem a classe de marcadores
moleculares mais polimórficos conhecidos atualmente. Para serem utilizados, dependem do desenvolvimento de
iniciadores, espécie-específicos para a amplificação de regiões genômicas através da PCR. Neste contexto, o objetivo
desse trabalho foi desenhar iniciadores que amplificam regiões microssatélites do genoma de Hoplias malabaricus.
Este estudo utilizou uma estratégia de desenvolvimento de iniciadores que se baseia no seqüenciamento aleatório
de fragmentos provenientes de uma biblioteca genômica shotgun para o isolamento de diferentes tipos de regiões
microssatélites. O DNA das amostras foi extraído, a partir de tecido muscular, em seguida foi quantificado e diluído
para a fragmentação em sonicador. Após o tratamento das extremidades dos fragmentos de qualidade e tamanho
adequados, foram realizadas reações de ligação ao vetor de clonagem. As células transformadas foram aplicadas
em placas de petri, contendo meio LB sólido com ampicilina e tetraciclina, que foram incubadas (37ºC/12h) e
estocadas (4°C). As colônias positivas foram transferidas para uma placa (96 poços) contendo meio líquido LB
para o crescimento e extração dos plasmídios (minipreps). O seqüenciamento foi realizado no seqüenciador
automático ABI3100. As seqüências foram depositadas no Sistema Genoma BioFoco, que realizou a busca por
regiões microssatélites e o desenho dos iniciadores. Das 864 seqüências geradas, foram encontradas 77 seqüências
repetitivas com regiões flaqueadoras adequadas para a síntese dos pares de iniciadores. Do total de iniciadores
desenhados foram escolhidas 25 para testar a padronização, contendo motivos de repetição entre dois e cinco
nucleotídeos e alelos com tamanhos entre 135 e 248pb. Para os testes de padronização foram utilizandos três
indivíduos da espécie. Os produtos de amplificação foram submetidos à eletroforese vertical em gel de poliacrilamida
6%, corados com nitrato de prata. Do total de locos testados, 23 apresentaram sucesso na amplificação e foram
padronizados com as seguintes temperaturas de anelamento: 42ºC (Hmal_49); 52ºC (Hmal_40); 54ºC (Hmal_46);
56ºC (Hmal_67); 58ºC (Hmal_9, Hmal_18, Hmal_22, Hmal_72); 60ºC (Hmal_71); 62ºC (Hmal_15, Hmal_45); 64ºC
(Hmal_69); 66ºC (Hmal_17, Hmal_23, Hmal_33, Hmal_34, Hmal_39, Hmal_47, Hmal_54, Hmal_60); 68ºC (Hmal_11,
Hmal_26, Hmal_55). Posteriormente, esses locos serão caracterizados, quanto à variabilidade genética, a partir de
análises com um número maior de indivíduos, oriundo das populações naturais da espécie H. malabaricus.
Apoio Financeiro: Systema Naturae - Consultoria Ambiental LTDA.
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96
Amplificação cruzada de iniciadores de regiões
microssatélites em Squaliforma emarginata
(Siluriformes, Loricariidae)
Costa, CF1; Resende, LV1; Gondim, SGCA1; Lima, NE1; Silva-Júnior, NJ2; Telles, MPC1
1
2
Laboratório de Genética & Biodiversidade, Universidade Federal de Goiás.
Mestrado em Ciências Ambientais e Saúde- UCG.
Palavras-chave: primers, SSR, transferibilidade, Cascudo-chicote, STR.
A variabilidade genética é extremamente importante para determinar a sobrevivência de uma espécie frente às
possíveis mudanças no ambiente. Conhecer a estrutura genética de uma espécie é essencial para o desenvolvimento
de estratégias de preservação, por fornecer informações relevantes sobre o fluxo gênico entre as populações,
divergência genética e sucesso reprodutivo. Os marcadores microssatélites baseiam-se na amplificação de
fragmentos distribuídos no genoma entre regiões repetitivas do DNA, são codominantes e permitem, acessar níveis
de polimorfismo genético mais elevado, quando comparado à outras classes de marcadores moleculares. Porém, o
desenvolvimento desses marcadores é um processo trabalhoso e oneroso. A amplificação cruzada de iniciadores
desenvolvidos para outras espécies dentro do mesmo gênero, ou mesmo entre outros níveis taxonômicos, tem sido
realizada com sucesso em várias espécies, tornando-se uma boa alternativa. A espécie Squaliforma emarginata
tem sua distribuição na região da Bacia Amazônica e apesar de não ser considerada em alta vulnerabilidade de
extinção, necessita de estratégias de preservação, principalmente devido ao alto índice de exploração de espécies
da família Loricariidae para ornamentação. Este estudo teve como objetivo testar a amplificação cruzada de
iniciadores que amplifiquem regiões microssatélites no genoma de Squaliforma emarginata, a partir de iniciadores
desenvolvidos para as seguintes espécies da ictiofauna: Prochilodus argenteus (Par), Prochilodus costatus (Pcos),
Prochilodus lineatus (Pl), Leporinus macrocephalus (Lmac), Astyanax fasciatus (Ast), Hypostomus gymnorhynchus
(Hg), Poecilia reticulata (Pre) e Colossoma macropomum (Pme). Foram testados 77 iniciadores com o DNA extraído
do tecido de três indivíduos da espécie Squaliforma emarginata. Os testes de amplificação foram iniciados com uma
temperatura de anelamento igual a 54ºC. Os produtos da amplificação, via PCR, foram submetidos à eletroforese
vertical em gel de poliacrilamida 6 %, corados com nitrato de prata. Para os locos que apresentaram muita
amplificação inespecífica, foram testadas temperaturas de anelamento acima e abaixo da primeira tentativa, a fim
de possibilitar a individualização dos alelos no loco e a obtenção dos genótipos. As temperaturas de anelamento
avaliadas variaram entre 40ºC e 64ºC. Do total de locos utilizados, seis foram descartados por não apresentarem
produtos de amplificação, 60 amplificaram muitos fragmentos inespecíficos e 11 foram considerados transferidos
com sucesso. Esses locos ficaram padronizados com as seguintes temperaturas de anelamento e tamanho dos
alelos em pares de bases: Hg_E14 (60°C e 219), Hg_E11 (54°C e 418), Hg_E10 (54°C e 158), Ast2 (54º C e 200), Par26
(60°Ce380), Pme20 (54°C e 210), Hg_E16 (48°C e 278), Hg_E05 (48°C e 220), Ast4 (46°C e 120), Par15 (44 ºC e 330),
Par13 (44 ºC e 235). O próximo passo que deverá ser realizado é a caracterização desses locos transferidos em
populações naturais, o que permitirá a estimativa dos parâmetros genéticos básicos que possibilitarão o uso desses
marcadores para estudos genético-populacionais.
Apoio Financeiro: Systema Naturae - Consultoria Ambiental LTDA.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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97
Amplificação cruzada de marcadores microssatélites
em Panaque nigrolineatus
Martelli-de-Paula, V¹; Peixoto, FP¹; Boni, TA¹; Resende, LV1; Olivatti, AM1; Silva-Júnior, NJ2; Telles, MPC¹.
¹Laboratório de Genética e Biodiversidade - Instituto de Ciências Biológicas - UFG.
2
Mestrado em Ciências Ambientais e Saúde- UCG.
[email protected]
Palavras-chave: primers, transferibilidade, marcador molecular, ictiofauna
Aproximadamente 25% de todas as espécies de peixes do planeta encontram-se na região Neotropical. Esta
diversidade biológica está sendo rapidamente perdida em função da antropização que influencia na perda da
variabilidade genética nas específicas. A espécie Panaque nigrolineatus, pertencente à família Loricariidae e à
ordem Siluriforme, é endêmica da bacia Amazônia e encontra-se atualmente com moderada vulnerabilidade.
Embora os marcadores moleculares sejam bastante utilizados para acessar a diversidade genética de diversas
espécies, estudos dessa natureza para P. nigrolineatus são ainda quase inexistentes. Os marcadores de regiões
microssatélite são ferramentas de grande importância para estudos de estrutura populacional e fluxo gênico. Além
de serem codominantes, os microssatelítes estão amplamente distribuídos nos genomas e apresentam grande
potencial de amplificação cruzada entre espécies evolutivamente próximas, o que pode permitir pular a etapa de
desenvolvimento de marcadores espécie-específico, que é muito laboriosa e de custo ainda elevado. O objetivo
desse trabalho foi testar a amplificação cruzada de iniciadores desenvolvidos para diversas espécies da ictiofauna
neotropical para o genoma de Panaque nigrolineatus. Para tanto, após a extração do DNA das nadadeiras, utilizando
o Kit de purificação,foram testados 77 iniciadores por meio da amplificação por PCR de iniciadores desenvolvidos
para as espécies Poecilia reticulata (AG), Piaractus mesopotamicus (Pme), Hypostomus gymnorhynchus (Hg),
Prochilodus argenteus (Par), Astyanax fasciatus (Ast) e Leporinus macrocephalus (Lmac). Para a visualização dos
fragmentos amplificados os mesmos foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida 6%, corado com
nitrato de prata. Dos iniciadores testados, 13 foram considerados transferidos para P. nigrolineatus e padronizados
com as seguintes temperaturas de anelamento: AG-4 (48ºC); Pme_5 (50ºC); Hg_E 23 (56ºC); Par-04 e Ast-02 (58ºC);
Par_15, Lmac_4 e Pme_32 (60ºC), Hg_E03 a 62ºC; Hg_E08 e Hg_E14 (64ºC) e, Hg_E12 e Hg_E 22 (68ºC). Esses
locos amplificam regiões microssatélites cujos motivos de repetição que variam entre di e pentanucleotídeo.
Considerando todos os locos, os alelos variaram entre 74 e 285 pares de bases, sendo que alguns iniciadores já
apresentaram polimorfismo entre os três indivíduos testados. Seis desses iniciadores transferidos (46%) foram
desenvolvidos para a espécie H. gymnorhynchus, da mesma ordem da espécie P. nigrolineatus, mostrando que a
maior taxa de amplificação cruzada foi entre espécies mais próximas evolutivamente. O uso desses marcadores
e as informações por ele geradas poderão ser utilizadas para estudos genético-populacionais e filogeográficos
visando colaborar com a conservação dessa espécie endêmica da região Neotropical.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPEG, SECTEC/PRONEX (66.0015/2003-0) e Systema Naturae Consultoria Ambiental
Ltda.
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Caracterização de locos microssatélites transferidos
para Leporinus friderici
Olivatti, AM1; Boni, TA1; Gouveia, FO1; Resende, LV1; Martelli-de-Paula, V¹; Silva-Júnior, NJ2; Telles, MPC1
Laboratório de Genética & Biodiversidade, Universidade Federal de Goiás.
Mestrado em Ciências Ambientais e Saúde- UCG.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Leporinus friderici, microssatélites, PCR, peixe, transferibilidade.
Leporinus friderici, popularmente conhecido com piau-três-pintas, é uma espécie de peixe da família Anostomidae
encontrada nas bacias Amazônica, Araguaia-Tocantins e Prata que habita, preferencialmente, as margens de rios,
lagos e igapós e se alimenta de insetos, frutos e sementes. A análise da variabilidade genética das espécies nativas
é importante no planejamento de manejo sustentável. Os marcadores moleculares têm contribuído muito nas
análises de estimativa de variabilidade genética, principalmente devido à facilidade com que o polimorfismo
pode ser detectado. Estudos de genética de populações devem ser feitos, pois a partir deles é possível elucidar
questões relativas à estruturação populacional bem como características próprias de cada população como
estratégia reprodutiva, variabilidade genética de indivíduos e populações, fluxo gênico e tamanho populacional.
Muitos pesquisadores tem tido sucesso com a amplificação cruzada de iniciadores desenvolvidos originalmente
para outras espécies, diminuindo assim os custos de seus projetos e o tempo para a realização dos mesmos. O
presente trabalho teve como objetivo a caracterização dos locos microssatélites transferidos para Leporinus
friderici. Para tanto, foram utilizados oito indivíduos originários do rio Caiapó, bacia do rio Araguaia e 23 coletados
em uma piscicultura em Goiânia, Goiás. Os produtos de amplificação dos oitos locos transferidos (Ast 09, Lmac
3, Lmac 5, Lmac 6, Lmac 8, Lmac 9, Pcos 14 e Pcos 18) foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida
6% e corados com nitrato de prata. Esses oito locos foram desenhados para amplificar regiões microssatélites
com motivos de repetição contendo dois nucleotídeos. Os genótipos obtidos foram utilizados para a analise
descritiva da varibilidade genética. Para tanto, os softwares Identity e TFPGA foram utilizados. As temperaturas
de anelamento desses iniciadores variaram entre 47°C e 66°C e o tamanho de seus alelos variou entre 127 a 318
pares de bases. Do total de locos avaliados dois apresentaram-se monomórficos (Pcos18 e Ast 09) e os demais
apresentaram polimorfismo. O número de alelos variou entre 3 e 12, por loco, totalizando 45 alelos bem definidos.
A heterozigose média esperada e observada foi igual a 0,699 e 0,566, respectivamente. O valor médio do PIC para os
locos polimórficos foi igual a 0,750. As probabilidades combinadas de exclusão (PE) e identidade (PI) foram 0,983
e 0,000054, respectivamente. Esses valores podem ser considerados altos, mostrando que existe uma considerável
variabilidade genética entre os indivíduos analisados. Além disso, os marcadores microssatélites transferidos
para a espécie Leporinus friderici mostraram-se eficientes para a detecção de variabilidade genética, podendo ser
utilizados em futuros programas de manejo, monitoramento e conservação da espécie.
Apoio financeiro: Systema Naturae - Consultoria Ambiental Ltda, CNPq, FAPEG..
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Transferibilidade de locos microssatélite de espécies
da Ictiofauna para Astyanax altiparanae
Boni, TA¹; Gouveia, FO; Resende, LV; Silva-Júnior, NJ2, Telles, MPC¹
¹Laboratório de Genética e Biodiversidade - Instituto de Ciências Biológicas - UFG.
2
Mestrado em Ciências Ambientais e Saúde- UCG.
[email protected]
Palavras-chave: conservação, ictiofauna, marcador molecular, transferibilidade, SSR.
Considerando as características biológicas dos peixes, a grande diversidade da ictiofauna neotropical e a importância
da pesca em diversas regiões do mundo, a utilização de marcadores genéticos pode auxiliar os programas de
manejo e conservação de recursos pesqueiros através da análise do componente genético. Os peixes do gênero
Astyanax, conhecidos como lambaris, são componentes importantes da teia alimentar do ambiente aquático,
além de bons bio-indicadores da qualidade ambiental, sendo organismos adequados para o monitoramento dos
cursos d’água onde ocorrem. O objetivo deste trabalho foi testar a transferibilidade de marcadores microssatélites
desenvolvidos para Prochilodus argenteus, Prochilodus lineatus, Prochilodus costatus, Astyanax fasciatus, Leoporinus
macrocephalus e Poecilia reticulata para Astyanax altiparanae. Onze locos foram transferidos com sucesso para a
espécie. Na análise populacional de A. altiparanae, os cinco melhores locos foram analisados com 50 indivíduos. Dos
cinco locos, dois foram desenvolvidos para Astyanax fasciatus (Ast- 01 e Ast-10), dois para Leporinus macrocephalus
(Lmac-04 e Lmac-07) e um par para Prochilodus argentus (Par-14). Os quatro primeiros locos amplificam regiões
microssatélites cujos motivos de repetição são dinucleotídeos. Além disso, esses locos apresentaram muitos
indivíduos heterozigotos, mostrando que são informativos para análises de divergência genética, enquanto o
Par-14 apresentou-se monomórfico. O número de alelos, por loco polimórfico, variou entre 11 e 22, totalizando
59 alelos bem definidos e de fácil obtenção dos genótipos no gel de acrilamida. As temperaturas de anelamento
variaram de 54º à 57ºC e a amplitude dos alelos variou de 93 a 265 pares de bases. A heterozigosidade esperada e
observada, considerando o conjunto de locos foi igual a 0,6057 e 0,6129, respectivamente, e o valor médio de PIC
para os locos polimórficos foi de 0,7570. Esses valores podem ser considerados altos, mostrando que existe uma
considerável variabilidade genética entre os indivíduos. Os valores de probabilidade de exclusão (PE) e identidade
(PI) indicam potencial para análises de vínculo genético. Portanto, esses marcadores microssatélites mostraram-se
eficientes na a avaliação da variabilidade genética presente na população natural de Astyanax altiparanae. Esses
locos podem, ainda, ser usados em futuros programas de monitoramento da variabilidade genética de populações
de A. altiparanae em regiões que sofrem com a antropização, como as fragmentadas pela presença de grandes das
barragens das Usinas Hidrelétricas. Portanto, trabalhos que avaliem o potencial de transferibilidade de marcadores
de regiões microssatélites, como os realizados nesse estudo são importantes para viabilizar estudos de conservação
da variabilidade genética presente nas populações de espécies da ictiofauna.
Apoio Financeiro: CNPq, FAPEG, Sistema Naturae Consultoria Ambiental.
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100
Construção e caracterização de bibliotecas genômicas
enriquecidas em marcadores microssatélites
tri e tetranucleotídeos para espécie Colossoma
macropomum (Tambaqui)
Hamoy, IG1; Cidade, FW2; Barbosa, MRS3; Schneider, MPC3; Santos, SEB1
Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Laboratório de Genética Humana e Médica, Belém, Pará, Brasil.
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, Universidade Estadual de Campinas
3
Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Laboratório de Polimorfismo de DNA, Belém, Pará, Brasil.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Colossoma macropomum, Tambaqui, microssatélites, trinucleotídeos, tetranucleotídeos.
O Tambaqui (Colossoma macropomum), é o segundo maior peixe de escamas da ictiofauna amazônica, é de grande
importância econômica para pesca comercial e para a criação em cativeiro, porém existem poucos estudos genéticos
a respeito da variabilidade genética dentro desta espécie. Quando se pretende averiguar a variabilidade genética de
uma espécie (natural ou isolada), os marcadores microssatélites podem ser extremamente úteis, devido ao elevado
polimorfismo apresentado por seus loci. Esses marcadores estão sendo extensivamente utilizados no estudo de
variabilidade e estrutura genética de populações naturais e cultivadas de peixes. Recentemente foram publicados
marcadores microssatélites dinucleotídeos para o Tambaqui. A genotipagem de microssatélites dinucleotídeos
apresenta freqüentemente artefatos de PCR (stutters) que dificultam a diferenciação entre heterozigotos e homozigotos
levando a genótipos errados, gerando dados não confiáveis sobre a real diversidade genética de uma espécie, assim
o objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de bibliotecas genômicas enriquecidas em microssatélites
tri e tetranucleotídeos para C. macropomum, pois estes marcadores não apresentam as dificuldades técnicas dos
dinucleotídeos. Inicialmente foram selecionadas na literatura sondas tetranucleotídeos utilizadas no isolamento
de microssatélites na ordem Characimorme, a qual pertence o Tambaqui. O DNA genômico foi extraído do tecido
muscular de um indivíduo seguindo o método padrão de fenol/clorofórmio, 10 microgramas do DNA foram digeridos
com a enzima SAU3AI e fragmentos de 300 a 1000pb selecionados e ligados a adaptadores da enzima. Esses fragmentos
foram enriquecidos via PCR com um reduzido número de ciclos. O produto amplificado foi denaturado e hibridizado
com sondas de seqüências repetidas tetranucleotídeos (GAAA6, ACAG6, ACTG6, ACCT6,) marcadas com biotina. Os
fragmentos enriquecidos foram recuperados com esferas magnéticas revestidas por streptavidina. Foi conduzida uma
PCR utilizando o iniciador direto dos adaptadores para promover a conformação dupla-fita nos fragmentos. O produto
da PCR foi ligado ao vetor pGEM-T Easy Vector e introduzido em bactérias E coli cepa TOP10 por eletroporação. As
bactérias transformadas foram plaqueadas em 2XYT/agar/ampicilina/X-gal e decorrido o período de crescimento, as
colônias positivas foram repicadas em placas de 96 poços contendo caldo nutritivo Tartoff-Hobbs Broth/ampicilina. As
bibliotecas foram glicerolizadas e estocadas a -20 °C. Foram seqüenciados 384 clones, foi utilizado o programa Websat
para localizar os microssatélites tri e tetranucleotídeos, perfeitos e com mais de seis repetições. Foram encontrados 21
motivos (5 %), a sonda GAAA apresentou maior eficiência com sete motivos, seguida da sonda ACTG com seis repetições.
Os microssatélites encontrados foram editados e alinhados com o programa Bioedit, e os iniciadores foram desenhados,
baseados nas regiões flanqueadoras dos microssatélites, com o programa Primer 3. Os iniciadores serão otimizados
e utilizados na genotipagem de populações naturais e cultivadas de Tambaqui, gerando subsídios para elaboração de
planos de manejo e conservação para esta espécie.
Órgãos CNPQ UFPA FINEP
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101
Frequência de micronúcleos como um protocolo
rápido e preciso para avaliar ambientes aquáticos sob
influência das megacidades: um estudo de caso em
Rhamdia quelen (Siluriformes) do Rio Iguaçu
Arantes, ACR1; Torres, RA1; Adam, ML2, 3; Souza, JRB4; Bastos, LP5
Laboratório de Genômica Evolutiva e Ambiental - Departamento de Zoologia - UFPE.
Núcleo de Biologia - Centro Acadêmico de Vitória de Santo Antão - UFPE.
3
Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas - Centro de Ciências Biológicas -, UFPE.
4
Laboratório de Comunidades Marinhas - Departamento de Zoologia - UFPE.
5
Instituto de Tecnologia para o Desenvolvimento – LACTEC – Curitiba-PR.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: micronúcleo, genotoxicidade, impacto ambiental, Rhamdia quelen
A perda de diversidade biológica é o reflexo da degradação e poluição ambiental, sendo portanto, grandes causadores de impactos ambientais. Atualmente, metodologias mais sensíveis têm sido usadas para detectar alterações
em organismos devido à ação de poluentes. Entre estes métodos, estudos de genotoxicidade com análises de danos
ao genoma têm sido muito úteis. O objetivo do presente estudo foi usar a frequência de micronúcleos (FMNs)
como protocolo rápido e preciso para avaliar e predizer as condições ambientais no alto Rio Iguaçu, o qual está
sob influência de uma megacidade do Sul do Brasil (Curitiba, PR). Espécimes nativos de Rhamdia quelen de 10
localidades foram analisados e a frequência de células micronucleadas computadas. Os resultados foram comparados ao grupo controle com valor de referência de zero MNs na ausência de quaisquer circunstâncias alteradas. A
ANOVA e o teste à posteriori de Tukey (p ≤ 5%) foram aplicados para determinar a robustez estatística da variação
observada. Contagens básicas revelaram elevado número médio e frequência de células micronucleadas em 3 das
10 localidades analisadas. As contagens também determinaram as 2 localidades amostradas com os menores valores indicando melhor qualidade ambiental. O Teste de Tukey revelou a existência de diferenças estatisticamente
significativas em 18 das 55 possíveis comparações par à par. Os resultados sugerem que a espécie está sob impacto genotóxico, com considerável variação de intensidade dependendo da localidade que habita. Como drásticas
mudanças no material genético reduzem o potencial evolutivo da biota, os resultados aqui obtidos sugerem que
Rhamdia quelen exige programas de manejo específicos a fim de preservar a espécie e seus ecossistemas.
Apoio financeiro: Secretaria de estado da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior do Paraná e Programa Prodoc/
Capes for RAT (proc. no 00197/03-3).
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102
Monitoramento da pesca e comercialização da carne
de tubarões capturados no litoral de São Paulo
utilizando PCR-multiplex
Silvério, J1,2; Mendonça, FF1; Hashimoto, DT2; Oliveira, C1; Foresti, F1; Porto-Foresti, F2
Laboratório de Biologia e Genética de Peixes - Instituto de Biociências de Botucatu - UNESP. 2Laboratório de Genética de Peixes - Faculdade de Ciências de Bauru - UNESP
[email protected]
1
Palavras-chave: Pesca de Tubarões, PCR-multiplex, Citocromo Oxidase I, Conservação Genética e finning.
As dificuldades na identificação morfológica de muitas espécies de tubarões exploradas pela pesca, associada
à prática bastante usual de remoção da cabeça e das nadadeiras dos animais, na maioria das vezes antes do desembarque, tem resultado em uma escassez global de informações sobre captura e comercialização, tornando
quase impossível a avaliação de seus efeitos. De acordo com o último relatório de pesca apresentado pelo IBAMA
a respeito da produção pesqueira no ano de 2006, o Brasil capturou 18.389,5 toneladas de elasmobrânquios sendo
11.149 toneladas pertencentes ao grupo dos tubarões e cerca de 20% deste total foi capturado pelas frotas paulistas. Entretanto, na maioria dos casos, estes animais recebem como classificação apenas um nome popular que em
muitos casos refere-se a mais de uma espécie. Assim, considerando à grande exploração pesqueira que tem afetado as populações de tubarões em todo o mundo e a grande dificuldade na identificação morfológica de espécies,
marcadores genéticos estão sendo aplicados buscando avaliar a captura e comercialização de tubarões oriundos
da pesca costeira e oceânica no litoral de São Paulo. Foram coletadas até o momento 509 amostras onde 435 foram
identificadas e os resultados obtidos mostraram a freqüência das espécies capturadas com predominância de
Prionace glauca (48%), talvez por ser um dos tubarões mais abundantes do planeta com grande capacidade de deslocamento, Sphyrna lewini (19%), Rhizoprionodon lalandii (15%), Alopias vulpinus (10%) e Isurus oxyhrinchus (8%)
para as amostras não amplificadas há a necessidade do desenvolvimento de novos primers para identificar mais
espécies. As espécies P. glauca, A. vulpinus e I. oxyhrinchus são capturadas quase que exclusivamente em pescas
oceânicas e S. lewini são capturadas em áreas oceânicas e costeiras. A metodologia utilizada é eficaz e viabiliza a
identificação das espécies de tubarões a partir da carne comercializada em feiras e supermercados e avalia a captura por espécies exercidas por diferentes tipos de pesca, possibilitando assim a aplicação de planos de manejo e a
ordenação da exploração pesqueira.
Apoio Financeiro: CNPq E FAPESP
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103
DNA satélite como marcador citogenético para
estudo de espécies do grupo de Physalaemus cuvieri
(Leiuperidae, Anura)
Vittorazzi, SE¹; Andrade, GV²; Lourenço, LB¹; Recco-Pimentel, SM¹
¹Departamento de Anatomia, Biologia Celular, Fisiologia e Biofísica, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas,(UNICAMP).
²Departamento de Biologia, Universidade Federal do Maranhão (UFMA).
[email protected]
Palavras-chave: Citogenética, DNA satélite, Hibridação in situ, Physalaemus, ANURA.
O gênero Physalaemus é atualmente constituído de 41 espécies, distribuídas em sete grupos, e espalhadas por
quase toda extensão do continente sul-americano, todas com número diplóide 2n=22 cromossomos. No grupo de
Physalaemus cuvieri estão incluídas as espécies P. albonotatus, P. centralis, P. cicada, P. cuqui, P. cuvieri, P. ephippifer,
P. erikae, P. fischeri e P kroyeri. Muitas dessas espécies são crípticas e de difícil identificação com base apenas em
morfologia externa. Estudos citogenéticos disponíveis até momento para Physalaemus cuvieri não permitiram o
reconhecimento dos possíveis rearranjos responsáveis pelas diferenças entre populações dessa espécie e entre
espécies do grupo, observadas principalmente em relação aos cromossomos portadores de NORs. Neste trabalho,
objetivou-se desenvolver novos marcadores citogenéticos para o estudo desse grupo de Physalaemus, em especial
P. cuvieri, P. albonotatus e P. centralis, consideradas crípticas com P. cuvieri. Para tanto, três sequências de DNA
repetitivo foram isoladas de indivíduos de P. cuvieri de Palmeiras-BA, após digestão enzimática do DNA genômico
com as enzimas EcoRI e PstI. Tais sequências, denominadas Sat194EcoRI, Sat883EcoRI e Sat174PstI, foram clonadas, sequenciadas e localizadas in situ nos cariótipos de P. cuvieri (Palmeiras - BA e Tocantins - TO), P. centralis (Palestina - SP) e P. albonotatus (Lambari d´ Oeste - MT). Interessantemente o Sat194EcoRI possui 62,5% de similaridade com o DNA ribossomal 5S, mostrando que sua origem pode estar ligada a esse gene repetitivo. No cariótipo de
P. cuvieri de Palmeiras-BA, as três sequências satélites foram detectadas predominantemente nas regiões centroméricas dos pares cromossômicos 1 a 5. No cariótipo de P. cuvieri de Porto Nacional-TO, as três sequências foram
localizadas nas regiões centroméricas dos pares cromossômicos 1 a 9 e pericentroméricas, predominantemente,
dos pares 2, 3, 5 e 7. No cariótipo de P. centralis, a sonda Sat194EcoRI hibridou nos centrômeros dos pares 1 a 5, 8 e
9, e na região pericentromérica do par 3, sendo este também o sítio de hibridação da sonda Sat174PstI. No cariótipo
de P. albonotatus, as sondas Sat194EcoRI e Sat174PstI hibridaram na região telomérica no par 9 e na região centromérica do par 4, esse último homeólogo ao par 3 dos demais cariótipos aqui em estudo. Todas as regiões cromossômicas reveladas nos experimentos de hibridação são coincidentes com blocos de heterocromatina, detectados
por bandamento C em estudo prévio. Os dados aqui apresentados revelam que as sequências repetitivas isoladas
representam bons marcadores cromossômicos, já que permitiram verificar tanto variações interpopulacionais em
P. cuvieri como também algumas diferenças interespecíficas.
Apoio Financeiro: CAPES e FAPESP
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104
Estudos Citogenéticos de 23 Espécies de Anfíbios
Anuros do Cerrado do Estado de Goiás, Brasil
Pereira, RR1,2; Bastos, RP3; Cruz, AD1,2,4; Oliveira, HHP2; Nunes, HF2; Villela, RF2; Silva, DM2,4; Ayres, FM1,2,4
Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia,
GO, Brasil.
2
Universidade Católica de Goiás, Departamento de Biologia, Núcleo de Pesquisas Replicon, Goiânia, GO, Brasil.
3
Universidade Federal de Goiás, Instituto de Ciências Biológicas, Laboratório de Comportamento Animal, Goiânia, GO, Brasil.
4
Suleide/LaGene - Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular, Superintendência Leide das Neves Ferreira, Secretaria de
Saúde do Estado de Goiás, Goiânia, GO, Brasil.
[email protected]
1
Palavras-chave: Cerrado, Citogenética, Anfíbios, Anuros, RON.
Os anfíbios anuros são animais que apresentam grande importância ecológica e várias espécies vêm sendo utilizadas no ensino e pesquisa em Biologia. O escasso conhecimento sobre a anurofauna brasileira torna comum a
descoberta de novas espécies, inclusive no Cerrado brasileiro. Em Goiás, atualmente, poucos grupos de pesquisas
trabalham com estes animais. No geral, os anuros apresentam características morfológicas conservadas, o que
dificulta o uso de tais características em investigações taxonômicas e filogenéticas, exigindo assim outros métodos
de análises. Uma das maneiras de se estudar a variabilidade desse grupo é através da citogenética, ciência que constitui uma ferramenta adicional aos estudos dos mecanismos envolvidos nos processos evolutivos das espécies.
Sua aplicação é considerada cada vez mais importante para estudos de filogenia, taxonomia, mecanismos de especiação, evolução e da variabilidade genética. No Brasil, os estudos sobre citogenética de anuros são relativamente
recentes, e a grande maioria deles limita-se à descrição do cariótipo das espécies. Neste estudo foram estabelecidos
e analisados os cariótipos de 23 espécies de seis famílias distintas de anfíbios anuros do bioma Cerrado (Hypsiboas lundii, Trachycephalus venulosus, Hypsiboas raniceps, Phyllomedusa azurea, Scinax constrictus, Leptodactylus
mystacinus, Pleurodema fuscomaculatum, Physalaemus centralis, Dermatonotus muelleri, Scinax similis, Hypsiboas
albopunctatus, Hypsiboas multifasciatus, Scinax fuscovarius, Leptodactylus furnarius, Leptodactylus fuscus, Elaschistocleis ovalis, Rhinella schneideri, Rhinella rubescens, Barycholos ternetzi, Scinax centralis, Dendropsophus soaresi,
Hypsiboas goianus e Leptodactylus labyrinthicus), totalizando 49 espécimes procedentes de sete localidades do
estado de Goiás, Brasil. Os cromossomos metafásicos foram obtidos a partir de suspensões celulares de medula
óssea, baço e fígado, tratadas, in vivo, com fitohemaglutinina e colchicina. As lâminas foram submetidas à técnica
convencional de coloração (Giemsa) e diferencial (Ag-RON). Os números diplóides variaram entre 2n= 22, 24, 26
e 30, e encontramos a tetraploidia 4n=44 em Rhinella rubescens. Foram observados que espécies de uma mesma
família, ou de um mesmo gênero, podem apresentar cariótipos bastante conservados, como ocorreu na maioria
dos casos estudados neste trabalho, ou com grandes variações numéricas e/ou morfológicas dos cromossomos.
A respeito da similaridade cromossômica, nenhuma das 23 espécies estudadas apresentou o mesmo cariótipo,
considerando a morfologia, número cromossômico, posição do centrômero e em alguns casos, a localização das
regiões organizadoras de nucléolos. Além de um caso de tetraploidia, encontramos evidências da presença de
cromossomos sexuais (do tipo XY) na espécie Barycholos ternetzi (2n=22, NF=36). Foram descritos pela primeira
vez, os cariótipos de cinco espécies típicas do Cerrado goiano, Scinax constrictus (2n=22, NF=40), Scinax centralis (2n=24, NF=48), Dendropsophus soaresi (2n=30, NF=52), Leptodactylus furnarius (2n=22, NF=40) e Hypsiboas
goianus (2n=24, NF=48). Nesse contexto, o presente estudo contribuiu quanto à biologia, evolução e genética dos
anfíbios anuros do Cerrado do Estado de Goiás.
Apoio Financeiro: CNPq.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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105
Análise cariotípica comparativa das espécies
Phyllomedusa burmeisteri E Phyllomedusa bahiana
(Anura: Hylidae) do estado da Bahia
Barth, A1; Solé, M2; Costa, MA1
1-Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular – Universidade Estadual de Santa Cruz – UESC. [email protected]
2-Programa de Pós Graduação em Zoologia - Universidade Estadual de Santa Cruz - UESC
Palavras-chave: citogenética, heteromorfismo, cromossomo, variabilidade.
A espécie Phyllomedusa bahiana tem sido submetida a diferentes classificações taxonômicas. Esta espécie já foi
descrita como subespécie de Phyllomedusa burmeisteri e novamente como espécie válida. Neste trabalho foi desenvolvido um estudo cariotípico comparativo das espécies P. bahiana e P. burmeisteri encontradas no estado da
Bahia com base em diferentes técnicas de citogenética clássica e molecular. Os cromossomos metafásicos foram
obtidos a partir da suspensão de células do intestino e as lâminas tratadas com as técnicas de coloração convencional, bandeamento C, bandeamento Ag-NOR e coloração por fluorocromos CMA3/DAPI. Foram analisados
sete indivíduos de P. bahiana coletados no município de Feira de Santana e dez de P. burmeisteri dos municípios
de Ituberá, Camacan e Ilhéus. Ambas as espécies apresentaram 2n=26 cromossomos com fórmula cariotípica de
2K=18SM+6M+2ST. O bandeamento NOR revelou que em P. burmeisteri e P. bahiana as regiões organizadoras de
nucléolos (NOR) localizaram-se próximas ao centrômero, no braço longo dos cromossomos do par nove. Essa
região apresentou-se heteromórfica em P. bahiana devido a uma amplificação do segmento da NOR em um dos
homólogos. Os estados homomórficos de ambas as formas de NOR também foram observados na população. O
bandeamento C revelou heterocromatina centromérica nos pares 1-5, 8, 12 e 13 e centromérica e pericentromérica
dos pares 6, 7, 9-11, além da região da NOR em ambas as espécies. Em P. bahiana observou-se ainda, uma banda
heterocromática localizada na região intersticial do braço curto do par cinco, não observada em P. burmeisteri. A
análise combinada do bandeamento C com fluorocromos CMA3 e DAPI revelou que, para ambas as espécies, a heterocromatina centromérica apresentou-se rica em pares de bases GC e a pericentromérica rica em pares de base
AT. As regiões da NOR e as regiões teloméricas apresentaram marcações CMA3 positivas. A banda de heterocromatina encontrada na região intersticial do braço curto do cromossomo cinco de P. bahiana apresentou marcação
DAPI negativa. Embora P. burmeisteri e P. bahiana tenham apresentado semelhanças cariotipícas, a diferença estrutural da NOR e a banda de heterocromatina intersticial encontrada no par cinco, exclusivamente em P. bahiana,
evidenciaram a ocorrência de diferenciação cariotípica entre as duas espécies.
APOIO: UESC, CAPES
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Caracterização citogenética de anfíbios anuros do
bioma cerrado do estado de Goiás
Villela, RF1; Oliveira, HHP1; Sousa, CCN1; Carvalho, WF1; Gonçalves, MW¹; Ribeiro, CL1; Silva, DM1; Bastos,
RP2;
Núcleo de Pesquisas Replicon - Universidade Católica de Goiás.
Universidade Federal de Goiás.
1
2
Palavras-chave: citogenética, anuros, RONs, cariótipo, cromossomos
A família hylidae normalmente apresenta número diplóide 2n = 24, sendo uma importante sinapomorfia. A espécie Hypsiboas lundii está distribuída por todo Cerrado central e do sudeste, pertencendo à família Hylidae, a
segunda maior dentre a ordem de Anuros, possuindo mais de 800 espécies. A espécie Physalaemus centralis pertence à família Leiuperidae, constituída por sete gêneros, estando distribuída no México, América Central e sul da
América do Sul. O objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização citogenética das espécies descritas acima,
assim como identificar por nitrato de prata, as regiões organizadoras de nucléolo (RONs). Para o estudo citogenético, foi coletado um espécime de H. lundii e P. centralis, e utilizou-se a técnica de obtenção de cromossomos a
partir do baço, fígado e medula óssea devido à alta atividade mitótica de todas essas estruturas. Foram aplicados
por três dias consecutivos Fitohemaglutinina M (10%) intraperitonialmente, na proporção 0,1 ml para cada 10 g
do peso do animal, visando à proliferação dos linfócitos T. Ao quarto dia foi aplicada colchicina (16 ug/ml) para a
interrupção do ciclo celular. Suspensões celulares de baço, fígado e medula óssea foram hipotonizadas em KCl a
0,075 M, por uma hora e centrifugadas com fixador de Carnoy (metanol + ac. acético na proporção de 3:1) por pelo
menos três vezes para retirada de restos celulares. Os materiais obtidos foram gotejados em lâminas limpas e em
seguida hidrolisados com HCl a 10%. Posteriormente foram coradas com Giemsa a 8% para a determinação do
número diplóide e morfologia cromossômica. Para a identificação das RONs foram adicionadas às lâminas 1 gota
de solução coloidal reveladora e 2 gotas de nitrato de prata 50%. As lâminas foram submetidas a câmara úmida a
60 °C durante 5 minutos. Para a captura e pareamento das metáfases foi utilizado o programa Ikaros, versão 4.0
(Metasystem). A espécie H. lundii apresentou número diplóide 2n = 24 e em relação à morfologia cromossômica,
apresentou os pares de cromossomos 2, 4, 7, 9, 10, 11, 12 como metacêntricos, os pares 1, 3, 5 e 8 como submetacêntricos e o par 6 como acrocêntrico, e a RON não foi identificada. A espécie P. centralis apresentou 2n = 22 e os pares
cromossômicos 1, 5, 6, 8, 9 e 11 foram classificados como metacêntricos e os pares 2, 3, 4, 7 e 10 como submetacêntricos e a RON também não foi identificada.
Apoio Financeiro: CNPQ; FAPEG
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Análise citogenética de Rhinella boulengeri (Anura:
Bufonidae)
Lantyer Silva, ASF¹; Nery, CS¹; Galy, MC¹; Siqueira, S¹
¹Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos (LAGOA), Depto de Ciências Biológicas (DCB), Universidade Estadual do Sudoeste
da Bahia (UESB), Jequié, BA. [email protected]
Palavras-chave: Rhinella boulengeri, Bufonidae, Citogenética, Ag-NOR, bandamento C
A Família Bufonidae possui atualmente 528 espécies distribuídas em 46 gêneros e vem passando por uma série de
revisões taxonômicas e sistemáticas. Dentre estes, o gênero Rhinella, representado por 77 espécies, é encontrado
em praticamente todos os continentes e possui uma grande variação na morfologia e tamanho dos seus representantes. Entretanto, para muitas espécies, ainda não existem dados suficientes para sustentar seus agrupamentos. Rhinella boulengeri é uma espécie raramente encontrada e pouco conhecida, com distribuição registrada apenas para quatro localidades: Salvador, Uruçuca e Arataca (BA) e Almenara (MG). O atual gênero Rhinella apresenta
2n=22 cromossomos e morfologia altamente conservados. Rhinella boulengeri é uma espécie deficiente em dados
ecológicos e possui características morfológicas muito distintas de outras espécies. No presente trabalho, foram
analisadas metáfases de um espécime macho de Rhinella boulengeri, proveniente de Uruçuca (BA), depositado na
coleção científica da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC). As preparações cromossômicas foram obtidas
a partir de suspensão celular do epitélio intestinal e foram analisadas por meio de coloração convencional com Giemsa e técnica de Ag-NOR e bandamento-C. Este espécime apresentou 2n=22 cromossomos, número fundamental
NF=40, com os pares 1, 5 a 8, metacêntricos, 2 a 4 e 9 submetacêntricos e os pares 10 e 11 telocêntricos. A NOR está
localizada intersticialmente no braço maior do par 3. O padrão de bandamento C revelou a presença de heterocromatina na região centromérica de todos os cromossomos. Embora o cariótipo analisado neste trabalho apresente
o mesmo número cromossômico de outras espécies analisadas de Rhinella, nenhuma outra espécie deste gênero
estudada citogeneticamente até o momento, apresentou cromossomos telocêntricos. Além disso o padrão de localização da NOR também é distinto das outras espécies. À medida que os Bufonidae apresentam cariótipos altamente conservados dentro dos grupos, tanto em número e morfologia cromossômica, os dados aqui apresentados
sugerem que R. boulengeri possa pertencer a outro táxon e, indicam a necessidade de uma revisão taxonômica para
esta espécie.
Apoio Financeiro: FAPESB, CNPq e UESB.
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Estudo citogenético de Rhinella arenarum Hensel, 1867
e Rhinella dorbignyi Duméril & Bibron, 1841 (Anura,
Bufonidae) do município do Rio Grande, RS, Brasil
Ximenez, SS1; Born, GG1
Instituto de Ciências Biológicas, Laboratório de Genética,Universidade Federal do Rio Grande; Avenida Itália km 8, CEP 96201-900 – Rio
Grande (RS), Brasil.
1
Palavras-chave: citogenética, amphibia, cariótipo, citotaxonomia, Bufonidae.
A família Bufonidae é um dos grupos mais representativos da ordem Anura, com 528 espécies distribuídas em 68
gêneros. Apresenta distribuição cosmopolita exceto para a Austrália, Madagascar e regiões oceânicas, apesar de
amplamente introduzida. O gênero Rhinella é representado por 62 espécies e o presente trabalho teve como objetivo estudar, do ponto de vista citogenético, as duas espécies representantes deste grupo em Rio Grande, RS: Rhinella
arenarum e R. dorbignyi. Os exemplares foram coletados manualmente e com o auxílio de armadilhas de queda instaladas nas dunas da praia do Cassino e os cromossomos mitóticos foram obtidos a partir da medula óssea. Para
tanto, injetou-se intraperitonealmente solução de colchicina 0,1%. Após quatro horas, o animal foi sacrificado, em
seguida o fêmur foi lavado com solução hipotônica de KCl 0,075 M, a solução celular foi fixada com fixador Carnoy
e armazenada em freezer para posterior análise. Foram estudados até o momento 4 machos de Rhinella arenarum
e 3 machos de R. dorbignyi através de coloração convencional (Giemsa). As duas espécies de Rhinella apresentaram
2n = 22, sendo 8 pares de cromossomos metacêntricos e 3 pares de cromossomos submetacêntricos. R. arenarum
apresentou constrição secundária no braço menor do sétimo par e, ambas espécies, em alguns exemplares, apresentaram dimorfismo de pares cromossômicos. Os resultados obtidos são inéditos e encorajam novos estudos
nestas e em outras espécies de anfíbios da região sul do Rio Grande do Sul, mostrando que a citogenética pode ter
um papel importante, não só para a caracterização cariotípica dessas populações, mas também como ferramenta
efetiva para estudos taxonômicos.
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Hibridação in situ fluorescente (FISH) com sonda
telomérica nos cromossomos dos anuros Haddadus
binotatus (Craugastoridae) e Holoaden luederwaldti
(Strabomantidae)
Campos, JRC; 2Haddad, CFB; 1Kasahara, S
1
Departamento de Biologia e 2Departamento de Zoologia, UNESP, Rio Claro, SP
[email protected]
1
Palavras-chave: citogenética, anfíbios, FISH, sonda telomérica, cromossomos
As sequências teloméricas tem a repetição (TTAGGG)n, são altamente conservadas entre os eucariotos e sua
localização por técnica de FISH pode ser útil em estudos de evolução cromossômica. De fato, além da hibridação
nos telômeros, podem aparecer marcações intersticiais (ITS), as quais correspondem eventualmente a remanescentes de telômeros funcionais, indicativos de rearranjos estruturais, tais como inversões e fusões durante a diferenciação cariotípica. Por outro lado, há casos comprovados de reordenamentos cromossômicos em que ITS não
foram observadas. Em anfíbios anuros, técnicas de FISH com sondas teloméricas têm sido pouco empregada e
em algumas espécies, além de marcações exclusivamente teloméricas, aparecem ITS que podem corresponder a
regiões repetitivas de DNA satélite. No presente trabalho, empregamos a técnica de FISH com sonda telomérica
em cromossomos de Haddadus binotatus (Craugastoridae) com 2n=22 e em Holoaden luederwaldti (Strabomantidae) com 2n=18. Na primeira espécie, foram observados vários pares de cromossomos heteromórficos e cadeias
de multivalentes em células de diplóteno/metáfase I, sugerindo uma série de translocações recíprocas entre os
cromossomos de maior tamanho. Na segunda, os cromossomos do par 8 são subtelocêntrico ou submetacêntrico,
muito provavelmente resultado de uma inversão, podendo os dois tipos aparecer na condição homomórfica ou
heteromórfica. A sonda foi construída com primers teloméricos TLF (TTAGGG)5 e TLR (CCCTAA)5 e verificada
em gel de agarose 1%. Foi, então, marcada por PCR com dois diferentes marcadores: com 11-dUTP-digoxigenina,
quando hibridada em Haddadus binotatus; e com 16-dUTP-biotina quando em Holoaden luederwaldti. A técnica
de FISH foi feita com a desnaturação do DNA em formamida 70% a 68ºC, desidratação em série alcoólica, seguida
de hibridação overnight em câmara úmida a 37ºC. A detecção dos sinais foi realizada com antidigoxigenina para
Haddadus binotatus ou com avidina-FITC e antiavidina biotinilada para Holoaden luederwaldti, e as lavagens feitas
em banhos de 2xSSC, com e sem detergente. As lâminas foram montadas com antifading e DAPI, quando a sonda
foi marcada com digoxigenina, ou com iodeto de propídio, quando marcada com biotina, e fotografadas em microscópio de fluorescência com captura digital. Em ambas as espécies, apenas as regiões teloméricas mostraram
sinais de hibridação, não tendo sido observada nenhuma ITS, nem em Haddadus binotatus nem em Holoaden
luederwaldti. Tal fato, porém, não exclui a possibilidade da ocorrência de rearranjos estruturais presumidos na
evolução dessas espécies, pois regiões teloméricas intersticiais podem ter sido eliminadas do genoma. Sem dúvida,
para melhor esclarecer essas questões em ambas as espécies, será necessário o emprego de outras técnicas citogenéticas, como a diferenciação longitudinal dos cromossomos pela incorporação do BrdU e a microdissecção
total ou parcial de cromossomos. FAPESP, CNPq.
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110
Análise citogenética de espécies de Microhilídeos
(Amphibia, Anura)
Gazoni, T1; Campos, JRC1; Haddad, CFB2; Kasahara, S1
Departamento de Biologia1, Departamento de Zoologia2, Instituto de Biociências, UNESP – Rio Claro, SP
[email protected]
Palavras-chave: cromossomo, técnicas de bandamento, cariótipo, evolução cromossômica, coloração diferencial
Os cromossomos de microhilídeos da fauna brasileira foram submetidos às técnicas de coloração convencional,
Ag-RON e de bandamento C, bem como às de fluorocromos base-específicos DAPI e CMA3, FISH com sonda de
DNAr e bandas de replicação após incorporação de BrdU, no caso de algumas das espécies, com o objetivo de
se detectar marcadores citológicos para caracterizar espécies ou populações distintas da mesma espécie. Foram
encontrados 2n=22 em Elachistocleis cf. ovalis e Arcovomer passarellii, de todas as localidades amostradas, 2n=24
em Chiasmocleis albopunctata e Chiasmocleis carvalhoi, e 2n=26 em Myersiella microps. Um dos exemplares da
amostra com fenótipo intermediário entre espécies do gênero Chiasmocleis, no que se refere ao tamanho da membrana interdigital dos membros posteriores, mostrou grande variação no número de cromossomos, de modo que o
cariótipo modal e o nível de ploidia não puderam ser estabelecidos. De fato, as células tinham constituição próxima
de um diploide, triploide ou tetraploide. As espécies com 2n=22 têm cariótipos similares, mas diferem em relação
à morfologia de um dos pares cromossômicos e provavelmente na posição da RON. As espécies com 2n=24 têm
cariótipos idênticos e a constituição básica x é a mesma apresentada pelo exemplar de Chiasmocleis sem identificação. Nesse exemplar, a Ag-RON está nos braços curtos dos cromossomos 2, assim como em C. carvalhoi. Myersiella microps tem cariótipo considerado o mais ancestral para a família e Ag-RON múltiplas, com marcações nos
braços curtos dos cromossomos 2 e 8. O padrão de banda C é predominantemente centromérico, com marcações
intersticiais esporádicas em cromossomos de algumas das espécies. Levando-se em conta as similaridades e diferenças nos cariótipos dos microhilídeos analisados, há indicações de que a redução nos números diploides ocorreu
principalmente por fusões, mas outros rearranjos não são afastados. Considerando as características morfológicas
e o local de coleta (Biritiba Mirim, SP), o exemplar com fenótipo intermediário poderia ser resultado de hibridação,
na qual um dos parentais seria C. carvalhoi e o outro poderia ser Chiasmocleis leucosticta, cuja constituição cariotípica é tipicamente tetraploide, embora tenha sido até o momento encontrado em região mais ao sul. As análises
citogenéticas sugerem que o indivíduo em questão seja produto de um cruzamento fortuito de um triploide não
completamente estéril com um representante de uma das espécies parentais presumidas, com eliminação de cromossomos durante as sucessivas divisões celulares, desde a formação do zigoto. É importante enfatizar que nas
preparações citológicas dos testículos foram observadas células espermatogoniais com diferentes 2n e em fases
de diplóteno e metáfase I, essas com números variáveis de bivalentes, trivalentes, tetravalentes e univalentes. O
presente trabalho mostra variabilidade cariotípica nos microhilídeos, a qual deve ser melhor investigada, com a
ampliação das amostras de exemplares e o estudo de novas espécies.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq
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111
Diferenciação cromossômica de populações de
Phyllomedusa de espécies afins de P. hypochondrialis
(Anura, Hylidae, Phyllomedusinae)
Bruschi, DP¹; Busin, CS²; Siqueira, S³; Strüssmann, C4; Recco-Pimentel, SM¹
¹Departamento de Anatomia, Biologia Celular e Fisiologia e Biofísica. Universidade Estadual de Campinas (Unicamp), Campinas, SP
²Instituto de Ciências Biológicas, Universidade de Passo Fundo (UPF), Passo Fundo, RS
³Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (UESB), Jequié, BA
4
Departamento de Ciências Básicas e Produção Animal, Universidade Federal do Mato Grosso (UFMT), Cuiabá, MT
[email protected]
Palavras-chave: Phyllomedusa, Cariótipo, Heterocromatina, NOR
Representantes do gênero Phyllomedusa relacionados à P. hypochondrialis (Daudin, 1800) podem apresentar grande
semelhança na morfologia externa. Isto dificulta, muitas vezes, sua correta identificação e o entendimento das
relações taxonômicas nesse grupo de espécies aparentadas. No presente trabalho, analisamos citogeneticamente
populações de anuros cujos representantes são morfologicamente semelhantes à Phyllomedusa hypochondrialis,
buscando esclarecimentos sobre sua posição taxonômica. Foram analisados e comparados doze espécimes de P.
hypochondrialis de Porto Nacional/TO, oito espécimes de P. hypochondrialis de Urbano Santos/MA, seis espécimes
de Phyllomedusa cf. hypochondrialis provenientes da Chapada dos Guimarães/MT e oito espécimes de P. azurea de
Uberlândia/MG. Pertencente ao grupo de P. hypochondrialis, esta última espécie ocorre com freqüência, também,
em áreas da Bacia do Alto Paraguai, incluindo a Chapada dos Guimarães. As preparações cromossômicas foram
submetidas à coloração com Giemsa, ao bandamento C e à impregnação pela prata (Ag-NOR). Todos os cariótipos analisados apresentaram 2n=26, com fórmulas cromossômicas muito semelhantes, exceto pelo par 7, que em
P. azurea é subtelocêntrico e em Phyllomedusa cf. hypochondrialis e populações de P. hypochondrialis de Urbano
Santos e Porto Nacional é submetacêntrico. Heterocromatina centromérica foi evidenciada em todos os cromossomos com pequenas variações em blocos teloméricos e/ou pericentroméricos, porém em P. azurea foi detectado,
adicionalmente, um bloco de heterocromatina na região intersticial do braço longo de um dos homólogos do par
1. A NOR foi detectada na região pericentromérica dos braços longos do par 8 em Phyllomedusa cf. hypochondrialis
e na região pericentromérica dos braços curtos do par 3 em P. azurea, enquanto que em populações de P. hypochondrialis de Urbano Santos e de Porto Nacional ela está localizada na região intersticial dos braços curtos do
par 6. Recentemente separada de P. hypochondrialis e elevada a espécie plena, P. azurea está relacionada a áreas de
influência do Cerrado e do Pantanal, enquanto P. hypochondrialis distribui-se em regiões sob influência do Bioma
Amazônia. Chapada dos Guimarães situa-se em área de transição entre o bioma amazônico e do Cerrado e poderia
abrigar tanto populações de P. azurea e de P. hypochondrialis, ou ainda de um táxon distinto, ainda inominado,
como indicado pela posição da NOR. Efetivamente, embora a população de Phyllomedusa cf. hypochondrialis de
Chapada dos Guimarães/MT apresente morfologia externa, cariótipo e padrão de bandamento C semelhantes a P.
hypochondrialis do TO e MA, a localização da NOR indica tratarem-se, de fato, de espécies distintas. Os dados aqui
apresentados sugerem a necessidade de reavaliar taxonomicamente a população de Phyllomedusa cf. hypochondrialis de Chapada dos Guimarães.
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Estudo citogenético de três espécies de Scinax (Anura,
Hylidae) no município de Jequié-BA
Neri, TS1; Medrado, AS2; Oliveira, RV1; Freire, IV1; Costa, MA2; Siqueira, S1
Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos (LAGOA), Depto de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da
Bahia. CEP 45.204-410 Jequié-BA, Brasil
2
Departamento de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Estadual de Santa
Cruz. CEP 45.662-000 Ilhéus-BA, Brasil.
1
Palavras-chave: Citogenética, Amphibia, Anura, Hylidae, Scinax
Mais de 5.500 espécies de anfíbios são descritas, sendo que aproximadamente metade destas ocorrem em regiões
Neotropicais. No Brasil, a Bahia possui uma alta riqueza de espécies de anfíbios anuros. A família Hylidae, em virtude do grande número de espécies (cerca de 620) caracteriza-se por espécies de difícil identificação e carentes de
dados sistemáticos e taxonômicos, como por exemplo aqueles pertencentes ao gênero Scinax. Com vistas à caracterização citogenética de anfíbios do referido gênero em Jequié, BA, foram analisadas neste trabalho três espécies:
Scinax fuscovarius, S. x-signatus e S. kautskyi, definindo o número diplóide, fórmula cariotípica, estabelecimento
de padrões de distribuição da heterocromatina (banda C) e localização de sítios ativos de NOR (Ag-NOR). Todas
espécies apresentaram a mesma fórmula cariotípica, com número diplóide 2n=24 e NF=48, sendo os pares 1, 2, 7,
8, 9, 11 e 12 metacêntricos, pares 3, 4, 6,10 e 12 submetacêntricos e o par 5 subtelocêntrico. Em S. fuscovarius e S. xsignatus, a banda C revelou marcações nas regiões centroméricas de todos os cromossomos e intersticialmente no
braço maior do par 10, coincidente com a NOR. Scinax kautskyi apresentou marcações centroméricas e teloméricas em todos os cromossomos, sendo, uma marcação conspícua adjacente ao telômero no par 3 e uma forte banda
coincidente com a região da NOR no par 12. Os dados apresentados para S. fuscovarius, principalmente em relação
à posição da NOR e classificação dos cromossomos, são diferentes dos já descritos na literatura. Essas diferenças
podem, contudo, estar relacionadas com artefatos de técnica e/ou com o sistema de classificação dos cromossomos. Scinax fuscovarius e S. x-signatus são crípticas e consideradas, por alguns autores, uma única espécie. O
fato de ambas apresentarem o mesmo citótipo pode indicar um relacionamento muito próximo entre elas, o que é
comum em alguns grupos de anfíbios. No entanto, estes dados cromossômicos podem também sugerir que ambas
pertençam a uma mesma espécie, tornando necessária uma revisão taxonômica. A despeito da similaridade macrocariotípica entre as três espécies analisadas, a variação dos padrões de posicionamento da NOR e das regiões de
heterocromatina de S. kautski, sugere uma evolução cromossômica diferenciada para cada grupo.
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Análises citogenéticas de seis espécies do Gênero
Aplastodiscus (Anura, Hylidae)
Gruber, SL1, Zina, J2, Haddad, CFB2 e Kasahara, S1
Departamento de Biologia, Instituto de Biociências, UNESP, Rio Claro, SP
Departamento de Zoologia, Instituto de Biociências, UNESP, Rio Claro, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: anfíbios, cromossomo, cariótipo, Ag-RON, banda C, FISH
O gênero Aplastodiscus, reconhecido anteriormente como Hyla, conta atualmente com 15 espécies, das quais
apenas oito tiveram seus cariótipos descritos, alguns deles com coloração diferencial e técnicas de citogenética
molecular. A análise de seis espécies mostrou 2n=24 em Aplastodiscus perviridis (grupo A. perviridis), 2n=22 em
A. arildae, A. ehrhardti e A. eugenioi, (grupo A. albofrenatus), 2n=20 em A. callipygius e 2n=18 em A. leucopygius
(grupo A. albosignatus). Apesar das diferenças nos 2n, os seis primeiros pares, grandes e médios, são similares em
todas as espécies, apresentando a mesma morfologia e tamanho relativo, sendo equivalentes ao observado para os
hilídeos em geral: o par 1 e 2 são metacêntricos e os demais, de 3 a 6, submetacêntricos. O par 7 é submetacêntrico,
porém, enquanto em A. perviridis e A. arildae é pequeno, nas demais tem tamanho muito próximo ao do par 6. Na
primeira espécie, os pares de 8 a 12 são também pequenos, metacêntrico ou submetacêntricos, e o mesmo pode
ser dito para os pares de 8 a 11 de A. arildae, A. ehrhardti e A. eugenioi, de 8 a 10 em A. callipygius e os pares 8 e 9 de
A. leucopygius. É interessante notar que o par 8, embora submetacêntrico, apresenta braços curtos relativamente
menores nas quatro últimas espécies. As Ag-RON estão na região terminal dos braços longos dos cromossomos
11 em A. perviridis, 10 em A. arildae e 9 em A. callipygius e A. leucopygius, sendo provavelmente homeólogos nessas
espécies. A localização mais discrepante foi observada em A. ehrhardti e A. eugenioi, na região terminal dos braços
longos dos cromossomos 6. Aplastodiscus arildae, A. leucopygius e A. callipygius tem bandas C centroméricas e leves
marcações teloméricas em alguns cromossomos. A sonda telomérica hibridou nos telômeros dos cromossomos de
A. callipygius, A perviridis e A. leucopygius e na região pericentromérica dos cromossomos 3 da última espécie. Tal
marcação pode ser inespecífica, mas não se pode descartar a possibilidade de ser um remanescente de região telomérica devido a uma fusão, já que esse tipo de rearranjo deve ter sido responsável pela redução do número diploide
nas espécies de Aplastodiscus. É provável que o reordenamento dos cromossomos pequenos esteja primariamente
envolvido na diferenciação dos cariótipos, porém, as análises das bandas de replicação após incorporação de BrdU
nos cromossomos de A. callipygius, A. leucopygius e A perviridis não foram conclusivas. Até o presente, os dados
citogenéticos corroboram a recente filogenia proposta para o gênero, bem como a distribuição das espécies em
seus respectivos grupos, já que os cariótipos parecem ter evoluído independentemente. Será de grande importância aprofundar os estudos citogenéticos para uma comparação mais efetiva com o objetivo de promover um maior
entendimento da evolução cariotípica no gênero.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Construção de bibliotecas genômicas parciais
enriquecidas em sequências microssatélites na
espécie Dendropsophus Nanus (Hylidae - Amphibia)
Morielle-Versute, E1; Arruda, MP1; Schneider, MPC2; Silva, A2; Gonçalves, EC2
Laboratório de Chiroptera, Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista
Laboratório de Polimorfismo de DNA, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará
[email protected]
1
2
Palavras-chave: microssatélites, variabilidade genética, Amphibia, conservação
Os microssatelites são regiões genômicas caracterizadas pela presença de motivos compostos por 1-6 nucleotídeos repetidos em tandem, presentes no genoma especialmente de eucariotos. Pelo elevado nível polimórfico
informativo, essas regiões tem sido empregadas como marcadores moleculares no acesso à variabilidade genética
das populações. Dendropsophus nanus é uma espécie de anfíbio abundante e largamente dispersa na América do
Sul, estendendo-se da bacia de La Plata na Argentina e Uruguai, passando pelo Paraguai central e Bolívia oriental
até o nordeste brasileiro. Coloniza diversos tipos de ambientes como florestas tropicais e áreas abertas incluindo
regiões com perturbação antropogênica. Espécies generalistas podem servir como organismos-modelo para elucidar processos de fragmentação de paisagens e da perda de hábitats. Com base nessas considerações, o estudo
construiu duas bibliotecas (CAn e CTn) genômicas parciais enriquecidas em SSRs pelo método de hibridização seletiva com contas magnéticas revestidas por estreptavidina, conjugadas a sondas biotiniladas repetidas do tipo CA15
e CT12. Após a hibridização, os insertos enriquecidos em sequências microssatélites foram amplificados via PCR,
ligados ao vetor pGEM-T Easy Vector e transformados em bactérias eletrocompetentes Escherichia coli TOP10 por
eletroporação. As bactérias transformadas foram plaqueadas em meio sólido 2XYT-ágar contendo ampicilina + Xgal, e após crescimento, as colônias brancas (positivas) foram transferidas e crescidas em placas de 96 poços com
caldo nutritivo Tartoff-Hobbs Broth/Ampicilina. As placas foram glicerolizadas e acondicionadas à -20ºC. Foram
sequenciados 384 clones positivos (288 clones CAn/96 clones CTn). O programa Tanden Repeats Ocurrence Locator “Troll” foi utilizado para rastrear os microssatélites nos clones. As sondas foram equivalentes na habilidade de
isolar SSRs (48% CA e 54% CT), e nos tipos prevalentes de motivos repetidos capturados (monodinucleotídeos
e dinucleotídeos), a exceção dos motivos tipo tetranucleotídeos que foram mais pronunciados nas bibliotecas
CAn (19% CAn/0% CTn). No conjunto das bibliotecas, os microssatélites foram classificados como: puros (95%),
interrompidos (4%) e compostos (1%), não sendo detectadas sequências compostas interrompidas nas bibliotecas
analisadas. 18% do total dos microssatélites encontrados exibiram repetições longas (> 15 nucleotídeos), potencialmente polimórficas. Esses microssatélites foram editados e alinhados no software Bioedit, os clones redundantes removidos e os iniciadores desenhados pelo programa Primer 3. Os iniciadores serão otimizados e utilizados
para posterior genotipagem de populações naturais dessa espécie. Esses locos poderão ser empregados na avaliação da diversidade gênica populacional.
Apoio Financeiro: FAPESP, CNPq.
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Estudo citogenético de Hypsiboas raniceps (Anura,
Hylidae), da Baia de Camamu - BA
Lessa, LTP1; Silva, SP1; Zanoni, JB1; Siqueira, S1; Silva Jr, JC1
Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos (LAGOA), Depto de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da
Bahia, Jequié, BA
[email protected]
1
Palavras-chave: Anfíbios, Citogenética, Hypsiboas raniceps, Cariótipo, Cromossomo
O gênero Hypsiboas pertence à família Hylidae e possui atualmente 80 espécies. Este grande grupo de anfíbios
passou recentemente por uma extensa reformulação sistemática com base em dados moleculares. Entretanto
um grande número de espécies não foi incluída nestas análises. Até o momento, poucos estudos citogenéticos
foram realizados para estes táxons. No presente trabalho, com vistas ao fornecimento de dados que auxiliem na
conservação de espécies de anuros da baia de Camamu, Barra Grande, BA, foram analisados citogeneticamente,
5 espécimes de Hypsiboas raniceps, grupo albopunctatus. As preparações cromossômicas foram obtidas por meio
de suspensão celular de epitélio intestinal e coradas com Giemsa, submetidas à técnica bandamento-C e Ag-NOR.
Hypsiboas raniceps apresentou 2n=24 cromossomos com os pares 1, 7, 8 e 11 metacêntricos, 2, 3, 5, 6, 9, 10 e 12 submetacêntricos e 4 subtelocêntrico. O bandamento C evidenciou um grande bloco proximal de heterocromatina no
braço longo do par 11. A NOR foi detectada no telômero do par 11 adjacente à região de heterocromatina. A pouca
quantidade de heterocromatina observada neste citótipo é muito diferente da encontrada em H. albopunctatus
(2n=24) que é representante do agrupamento obtido por dados moleculares e apresenta heterocromatina centromérica em todos cromossomos. Visto que H. raniceps é considerado mais basal em relação a H. albopunctatus, estas
diferenças na quantidade e no padrão de distribuição de heterocromatina possivelmente resultam de um processo
de heterocromatinização em H. albopunctatus. Além disso, os dados de H. raniceps analisados no presente trabalho
são semelhantes aos da mesma espécie proveniente de Brasilândia, MS. Nesse sentido a presença de um citótipo
muito semelhante destas duas populações, separadas cerca de 2000 Km, indica um cariótipo altamente conservado nesta espécie.
Apoio Financeiro: FAPESB E UESB.
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Confecção e caracterização de duas bibliotecas
genômicas parciais enriquecidas em microssatélites
de Hypsiboas Raniceps (Hylidae - Amphibia)
Arruda, MP1; Gonçalves, EC2; Silva, A2; Schneider, MPC2; Morielle-Versute, E1
Laboratório de Chiroptera, Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, Universidade Estadual Paulista
Laboratório de Polimorfismo de DNA, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará
[email protected]
1
2
Palavras-chave: microssatélites, estruturação genética, Amphibia, conservação, SSRs
Uma parcela importante da anurofauna tem sido extinta nas décadas recentes devido a uma combinação de fatores que afetam suas comunidades naturais. Hypsiboas raniceps é um hilídeo comumente presente nas regiões
amazônicas e formações abertas, estendendo-se ao sul até o Paraguai e o nordeste argentino. Os microssatélites
ou sequências simples repetidas (SSRs) são unidades de repetição em tandem compostos de 1 à 6 nucleotídeos,
dispersos amplamente no genoma dos eucariotos e caracterizados pelo elevado nível polimórfico e padrão codominante. Atribuído dessas apreciáveis particularidades, os microssatélites tem sido empregados extensamente
em estudos populacionais. Esses marcadores genéticos permitem a avaliação da estrutura genética populacional,
fornecendo dados sobre a dinâmica populacional, podendo auxiliar no entendimento dos processos intrínsecos
envolvidos na redução da classe Amphibia. Assim, o atual estudo confeccionou duas bibliotecas genômicas parciais
enriquecidas (CAn/GTn e CTn/GAn) em SSRs para H. raniceps. 10 microgramas de DNA genômico foram digeridos
com Sau3AI e fragmentos de 300-1000 bp selecionados e ligados a adaptadores da enzima. Esses fragmentos foram
enriquecidos via PCR com um número reduzido de ciclos, para minimizar a presença de clones redundantes. O
produto amplificado foi desnaturado e hibridizado com sondas de sequências repetidas (CA15 e CT12) marcadas
com biotina. Os fragmentos enriquecidos foram recuperados utilizando contas magnéticas revestidas por estreptavidina. Foi conduzida uma PCR utilizando o iniciador direto dos adaptadores para promover a conformação de
dupla-fita nos fragmentos. O produto da PCR foi ligado ao vetor pGEM-T Easy Vector e introduzido em bactérias
eletrocompetentes Escherichia coli cepa TOP10 por eletroporação. As bactérias transformadas foram plaqueadas
em 2XYT/agar/Ampicilina/X-gal e decorrido o período de crescimento, as colônias positivas foram repicadas em
placas de 96 poços acrescidas de caldo nutritivo Tartoff-Hobbs Broth/Ampicilina. As bibliotecas foram glicerolizadas e estocadas à -20ºC. Do total dos 576 clones submetidos ao sequenciamento (288 clones de cada biblioteca),
486 apresentaram boa confiabilidade na leitura e foram exportados para o aplicativo Troll que encontrou 57% de
regiões ricas em microssatélites. A sonda CA15 obteve maior eficiência no número de microssatélites capturados
(171 motivos/76%) em relação à sonda CT12 (108 motivos/41%). As bibliotecas exibiram uniformidade quanto
aos tipos de motivos prevalentes (mononucleotídeos e dinucleotídeos), bem como na arquitetura das sequências
que foram classificadas como puras em 86% dos casos (no conjunto das bibliotecas). Os microssatélites contendo
maior número de unidades repetidas foram editados e alinhados pelo programa Bioedit. Os iniciadores foram desenhados baseados nas regiões flanqueadoras dos SSRs no aplicativo Primer 3. Os iniciadores referentes a 16 locos
SSRs serão otimizados e utilizados na genotipagem e avaliação da estrutura genética populacional de H. raniceps.
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Isolamento, caracterização e localização cromossômica
de sequências de DNA repetitivo de Physalaemus
ephippifer (Anura Leiuperidae)
Nascimento, J1; Lourenço, LB1
Instituto de Biologia - Departamento de Biologia Celular, Anatomia, Fisiologia e Biofísica da Universidade Estadual de Campinas- SP
[email protected]; [email protected]
1
Palavras-chave: sequências repetitivas, hibridação in situ,cromossomos, marcadores e Physalaemus ephippifer
Cinco espécies do grupo Physalaemus cuvieri já foram analisadas citogeneticamente, dentre elas Physalaemus
ephippifer, que apresentou um interessante heteromorfismo cromossômico ligado ao sexo. No entanto, as técnicas citogenéticas convencionais não foram suficientes para esclarecer os mecanismos envolvidos na evolução
cromossômica desses anuros, já que poucos caracteres citogenéticos foram evidenciados e também uma grande
variação em relação às NORs foi encontrado. Com a intenção de utilizar novos marcadores citogenéticos que colaborem para a análise citogenética no grupo P. cuvieri, foram estudadas sequências de DNA repetitivo isoladas
de P. ephippifer. Para tanto, o DNA genômico extraído de duas fêmeas de P. ephippifer, provenientes de Belém
(Pará), foi digerido com a enzima de restrição Bam HI e os fragmentos gerados foram separados por eletroforese
em gel de agarose. Fragmentos de 194 pb, 165 pb e 321 pb isolados a partir desse gel foram clonados, sequenciados
e localizados in situ no cariótipo de P. ephippifer. O fragmento PEF165BamHI mostrou 87% de similaridade com
a sequência AC149893.2 isolada de Xenopus tropicalis e o fragmento PEF321BamHI, 94% de similaridade com a
sequência EU343727.1 de Physalaemus cuvieri. Os três fragmentos, denominados PEF194BamHI, PEF165BamHI
e PEF321BamHI, não apresentaram homologia entre si quando analisados no programa de edição de sequências
BioEdit. Porém, nos experimentos de hibridação in situ, as sondas PEF194BamHI e PEF165BamHI evidenciaram
a mesma região pericentromérica do braço curto do par 3, reconhecida como heterocromática em estudos anteriores. A sonda Sat194BamHI evidenciou também duas regiões terminais, uma no braço longo dos cromossomos
identificados como Z e W, e outra no braço curto do cromossomo W. A sequência PEF321BamHI foi localizada no
braço curto de apenas um dos homólogos do par 3, em uma região pericentromérica coincidente com um bloco
heterocromático. A diferença no padrão de localização do fragmento PEF194BamHI nos cromossomos Z e W corrobora a presença de um heteromorfismo entre esses cromossomos, previamente proposto com base nas técnicas
de bandamento C, coloração com DAPI e impregnação por prata. As três sequências aqui isoladas apresentaramse eficientes marcadores citogenéticos e poderão ser utilizadas para futuros estudos comparativos entre espécies
do gênero.
Apoio Financeiro: CAPES/FAPESP
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Análise citogenética de Physalaemus olfersii (Anura,
Leuriperidae): novo padrão interpopulacional de NOR e
um caso de cromossomo extranumerário
Milani, M1; Cassini, CS2; Recco-Pimentel, SM1, Lourenço, LB1
Laboratório de Citogenética Animal – Departamento de Anatomia, Biologia Celular e Fisiologia - Instituto de Biologia – UNICAMP
Museu Nacional – Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
1
2
Palavras-chave: citogenética, anura, Physalaemus,NOR, cariótipo.
O gênero Physalaemus (Anura, Leiuperidae) é composto por 41 espécies distribuídas em 7 grupos. A análise citogenética do grupo de P. cuvieri detectou vários polimorfismos e caracteres que podem diferenciar espécies e ser
de grande ajuda na análise evolutiva do gênero. A escassez de dados citogenéticos para outros grupos, entretanto,
impede uma análise mais elucidativa sobre a evolução cromossômica nesse gênero. No presente trabalho, é apresentada uma análise mais detalhada do cariótipo de P. olfersii, espécie anteriormente pertencente ao grupo de P.
cuvieri, com o intuito de prover dados cromossômicos para estudos comparativos futuros. Já que intrigante variação morfológica foi observada entre exemplares de P. olfersii de Viçosa (MG) e de Teresópolis (RJ), três indivíduos
da primeira localidade e dois da segunda foram utilizados em nossas análises. Preparações cromossômicas de
células intestinais foram submetidas à coloração convencional com Giemsa, bandamento C, impregnação por
prata pelo método de AgNOR e coloração com o corante fluorescente DAPI. As metáfases foram fotografadas e
os cromossomos medidos com o auxílio do software Micromeasure 3.3. Todos os indivíduos apresentaram um
cariótipo com 2n=22, muito semelhante morfologicamente àquele previamente descrito para exemplares de Ribeirão Branco (SP). Uma NOR próxima ao centrômero foi detectada no braço longo do cromossomo 3 em todos os
indivíduos analisados. No cariótipo dos exemplares de Teresópolis, além dessa NOR, foi também observada uma
NOR no braço longo do cromossomo 4. Já nos cariótipos dos indivíduos de Viçosa, além do cromossomo 3, aparentemente o cromossomo 7, e não o 4, é portador de NOR. Tal diferença corrobora a variação entre as populações
em análise, previamente inferida por análises morfológicas. Outro interessante resultado foi a presença de um
cromossomo extranumerário em um dos indivíduos de Viçosa, que apresentou 23 cromossomos nas 37 metáfases
analisadas. Ele era um dos menores do complemento e seu braço longo era praticamente todo heterocromático
e DAPI-positivo. O cariótipo de P. olfersii apresenta grande semelhança morfológica com o dos demais Physalaemus. Entretanto, os sítios de NORs presentes nos cariótipos aqui reportados diferem daqueles observados nos
cariótipos das demais espécies já analisadas citogeneticamente, em que as NORs estão geralmente localizadas em
pequenos cromossomos do complemento.
Apoio financeiro: FAPESP.
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Isolamento, caracterização e localização cromossômica
do gene ribossomal 5S de Engystomops petersi e
Engystomops sp. (Anura, Leiuperidae)
Rodrigues, DS; Recco-Pimentel, SM; Lourenço, LB
Departamento de Anatomia, Biologia Celular, Fisiologia e Biofísica – Instituto de Biologia - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), Campinas – SP.
[email protected]
Palavras-chave: Citogenética, Anura, cromossomo, marcador, gene ribossomal 5S.
Atualmente os Engystomops da Amazônia estão divididos em E. petersi, que inclui as populações encontradas no
Equador, e E. freibergi, que se refere às populações localizadas mais ao sul da Amazônia, inclusive as brasileiras e
bolivianas. No entanto, as questões taxonômicas envolvendo essas espécies amazônicas ainda não estão completamente resolvidas, sendo provável a existência de espécies crípticas ainda não descritas nesse grupo. A análise
citogenética de populações brasileiras e equatorianas separou os exemplares em cinco grupos cariotípicos. Apesar
disso, a grande variação observada dificultou o reconhecimento de homologias cromossômicas entre os cariótipos encontrados. Acreditamos que uma caracterização mais aprofundada desses cariótipos poderia auxiliar no
reconhecimento de tais homologias e, consequentemente, na elucidação de processos evolutivos envolvidos na
diferenciação desses anuros. Portanto, no presente trabalho, foram isoladas sequências do gene ribossomal 5S de
E. freibergi da Foz do Rio Tejo, no Estado do Acre (Brasil) e de E. petersi da Estación Científica de Yasuní (Equador),
com o intuito de obter novos marcadores citogenéticos para as análises das diferentes populações em estudo. Para
tal isolamento, fragmentos contendo o gene ribossomal 5S foram amplificados por PCR, com primers específicos
para essa região, e os produtos obtidos foram clonados e sequenciados. Foram obtidos 4 clones de exemplares do
Acre e 3 clones de exemplares de Yasuni, cujos insertos diferiram por apresentar regiões intergênicas com tamanho
e composição variáveis. Assim, as sequências clonadas foram divididas em dois grupos, de acordo com o tamanho:
tipo I ( fragmentos de 722 a 774 pb), presente nas populações do Acre e de Yasuni, e tipo II ( fragmento de 201 pb),
presente somente na população de Yasuni. A sequência correspondente à região codificadora do RNAr 5S foi muito
semelhante em todos fragmentos clonados. Porém, a região codificadora presente no fragmento do tipo II apresentou maior homologia com as sequências do gene ribossomal 5S disponíveis no GenBank do que aquelas presentes
nos fragmentos do tipo I. Quando utilizada como sonda em experimentos de hibridação in situ, a sequência do tipo
I evidenciou fortemente as regiões subterminais do braço curto dos cromossomos do par 5 do cariótipo de Yasuni.
Já a sequência do tipo II evidenciou fortemente uma região proximal no braço curto dos cromossomos do par 4 e as
regiões subterminais do braço curto dos cromossomos do par 6 do cariótipo encontrado no Acre. Nenhum desses
sítios coincide com NORs ou com regiões heterocromáticas. Esses dados mostraram que os cariótipos em questão
também diferem na localização dos genes ribossomais 5S, comprovando que essa família gênica é um importante
marcador para estudos no gênero Engystomops.
Agência financiadora: FAPESP
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Citogenética comparativa das espécies Leptodactylus
labyrinthicus, Leptodactylus fuscus e Leptodactylus
ocellatus de áreas do bioma cerrado do estado de
Goiás
Oliveira, HHP1; Sousa, CCN1; Villela, RF1; Carvalho, WF1; Ribeiro, CL1; Nunes, HF1; Bastos, RP2; Silva, DM1.
[email protected]
1
Núcleo de Pesquisas Replicon - Universidade Católica de Goiás. 2Universidade Federal de Goiás.
Palavras-chave: Citogenética, Anuros, Cariótipo, RONs e Leptodactylus
Os cariótipos de anfíbios em sua grande maioria podem ser caracterizados pela grande quantidade de heterocromatina constitutiva, que está preferencialmente distribuída nas regiões centroméricas, pericentroméricas e teloméricas dos cromossomos, e algumas vezes associadas às regiões organizadoras de nucléolo (RONs). Os anuros
possuem cariótipo com números diplóides baixos e com pouca ocorrência de cromossomos sexuais diferenciados.
O gênero Leptodactylus representa 89,7% da família Leptodactylidae apresentando em seu cariótipo cromossomos
predominantemente metacêntricos, submetacêntricos, além de um cariótipo padrão 2n=22. Este estudo teve
como objetivo caracterizar por citogenética convencional e coloração diferencial por nitrato de prata as espécies
Leptodactylus labyrinthicus, Leptodactylus ocellatus e Leptodactylus fuscus, analisando numericamente e morfologicamente o cariótipo e a presença das RONs. Para isso, foi coletado um indivíduo de Leptodactylus labyrinthicus e
Leptodactylus fuscus no município de Serranópolis e dois indivíduos de Leptodactyus ocellatus, um em Rio Verde e
outro em Bela Vista, todos machos. Foram aplicados por três dias consecutivos Fitohemaglutinina M (10%) intraperitonialmente, na proporção 0,1 ml para cada 10 g do peso do animal visando à proliferação dos linfócitos T. Ao
quarto dia foi aplicado colchicina para a interrupção do ciclo celular. Foram obtidas suspensões celulares de baço,
fígado e medula óssea que foram hipotonizadas em KCl a 0,075 M por uma hora e centrifugadas com fixador de
Carnoy (metanol + ac. acético na proporção de 3:1) por pelo menos três vezes para retirada de restos celulares. Os
materiais obtidos foram gotejados em lâminas limpas e em seguida hidrolisados com HCl a 10%. Posteriormente
foram coradas com Giemsa a 8% para a determinação do número diplóide e morfologia cromossômica. Para a
identificação da RONs foram adicionadas as lâminas 1gota de solução coloidal reveladora e 2 gotas de nitrato de
prata 50% e as lâminas submetidas a câmara úmida a 60 °C durante 5 minutos. Para a captura e pareamento das
metáfases foi utilizado o programa Ikaros, versão 4.0 (Metasystem). A análise das lâminas revelou que as espécie
L. labyrinthicus e L. ocellatus apresentaram um número diplóide de 2n=22 e número fundamental NF=42. Quanto a
morfologia cromossômica, apresentaram os pares 1, 5, 6, 8, 10 e 11 metacêntricos, os pares 2, 3, 7 e 9 submetacêntricos e o par 4 acrocêntrico, sem marcações para as RONs. Já a espécie L. fuscus apresentou o número diplóide de
2n=22 e NF=44 com cariótipo com os cromossomos 1, 5, 6, 8 e 10 metacêntricos e 2, 3, 4, 7, 9 e 11 submetacêntricos
e a marcação para as RONs no par cromossômico 8. Assim sendo, as espécies analisadas apresentaram cariótipos
numericamente idênticos e morfologicamente semelhantes.
Apoio: CNPQ
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Filogenia molecular de Leptodactylus (Anura,
Leptodactylidae), com base em inferência bayesiana
Silva, APZ1; Haddad, CFB2; Silva, MJJ1
Laboratório Especial de Ecologia e Evolução – Instituto Butantan, SP.
Departamento de Zoologia – UNESP, Rio Claro, SP.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Leptodactylus, sequenciamento, genes mitocondriais, filogenia
Na família Leptodactylidae incluem-se atualmente os gêneros Leptodactylus, Paratelmatobius, Scythrophrys e Hydrolaetare. As 87 espécies conhecidas de Leptodactylus têm ampla distribuição geográfica, com ocorrência desde o
sul dos Estados Unidos na América do Norte, América Central e Antilhas, até a Argentina na América do Sul, com
predominância nas regiões tropicais. No Brasil, o número de espécies registrado é de 65, com tendência a aumentar, uma vez que novos representantes têm sido descritos nos últimos anos. Os gêneros Adenomera e Lithodytes
foram incluídos recentemente em Leptodactylus; entretanto, embora esta nomenclatura seja seguida pela maioria
dos pesquisadores, existem algumas restrições por parte de outros, que não adotam a inclusão desses dois gêneros
em Leptodactylus. No presente trabalho, foram obtidas sequências parciais dos genes mitocondriais citocromo b
e 16S, totalizando 971 pares de bases, provenientes de 65 exemplares de Leptodactylus, representando 22 espécies,
provenientes de 36 localidades de 14 estados do Brasil. Paratelmatobius sp. 1 (aff. cardosoi) foi utilizado como grupo
externo. As sequências foram alinhadas utilizando-se o CodonCode Aligner 3.0.1 (CodonCode Corporation), empregando o algoritmo Muscle com a opção de alinhamento múltiplo. As análises filogenéticas, utilizando programa
MrBayes 3.1.2, foram realizadas com as sequências de cada fragmento gênico separadamente e concatenadas. O
modelo evolutivo (GTR+I) foi selecionado no MrModeltest 2.3, utilizando-se o AIC (Akaike Information Criterio)
como critério de escolha. A análise recuperou um clado (probabilidade a posteriori = PP = 89) composto por L.
linneatus, L. cf. hylaedactylus, L. marmoratus e L. martinezi — a primeira incluída, até recentemente, no gênero
Lithodytes, e as três últimas, em Adenomera. Dois clados foram recuperados para as demais espécies do gênero
Leptodactylus (PP = 99), um deles, com PP = 83, formado por sete subclados, nos quais incluem-se, majoritariamente, as espécies dos grupos de L. fuscus e de L. pentadactylus; no outro, formado por quatro subclados, com PP
= 83, incluem-se as espécies do grupo de L. ocellatus e de L. melanonotus. A presente análise, embora preliminar,
coloca em questionamento o monofiletismo de Leptodactylus (quando Adenomera e Lithodytes são sinonimizados
ao gênero) e aponta relações filogenéticas entre as espécies que corroboram dados já publicados na literatura, com
base em caracteres ecológicos e comportamentais.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Fatores de influência na evolução do cariótipo em
Squamata: histórias evolutivas ou pressões seletivas?
Andrade, F1; Kohlsdorf, T1
Departamento de Biologia, FFCLRP – Universidade de São Paulo. Laboratório de Evolução e Eco-fisiologia de Tetrápodes
[email protected]
1
Palavras-chave: evolução, Squamata, cariótipo, sinal filogenético e método comparativo
O cariótipo foi utilizado por biólogos apenas como uma característica de classificação taxonômica por muito tempo, porém atualmente seu potencial evolutivo, como característica dinâmica, tem recebido um enfoque singular,
particularmente voltado para a identificação de padrões evolutivos como aumento e diminuição no conteúdo
genético ou reorganizações do mesmo, sem que, entretanto, sejam estabelecidas relações com fatores extrínsecos,
como pressões seletivas ou efeitos fenotípicos. Ocasionalmente, alterações no cariótipo podem resultar em alterações no fenótipo, afetando eventualmente a adaptabilidade de um organismo em um determinado contexto
ecológico. Em conjunto com as mutações pontuais e as duplicações de genes, as reorganizações do conteúdo
genético têm um papel extremamente importante na geração de variabilidade fenotípica, que é o substrato para a
evolução. Dada a relevância do cariótipo na evolução dos organismos, o objetivo desse trabalho foi testar formalmente a presença de sinal filogenético durante a evolução dos cariótipos em Squamata. Enquanto a presença de
sinal filogenético em uma característica sugere que sua evolução ocorreu sob forte influência da história evolutiva
das linhagens, sua ausência pode indicar uma resposta a pressões seletivas (extrínsecas a eventos de cladogênese).
Dados referentes ao cariótipo foram coletados para diversos representantes do grupo Squamata, o qual apresenta
grande variabilidade tanto fenotípica quanto cariotípica. Para tal, utilizamos artigos publicados e a base de dados
ChromoRep. A análise de sinal filogenético foi realizada com base em filogenias moleculares recentes. Os resultados
sugerem que o número médio de cromossomos evoluiu sob forte influência da história evolutiva das linhagens de
Squamata, pois apresenta sinal filogenético significativo. Em outras palavras, grupos-irmãos tendem a apresentar
valores médios de cariótipos similares. Surpreendentemente, não foi detectado sinal filogenético significante nas
variâncias e coeficientes de variação dos cariótipos na filogenia de famílias de Squamata. Em conjunto, esses resultados sugerem que, embora a quantidade média de cromossomos tenha evoluído acompanhando a história filogenética de Squamata, a variação em torno da média pode diferir entre famílias, mesmo que próximas filogeneticamente. Tal cenário pode ser considerado um indicativo de que, além dos fatores intrínsecos (i.e. história evolutiva),
os fatores extrínsecos (relacionados com diferentes pressões seletivas) também podem influenciar diretamente o
padrão evolutivo do cariótipo em Squamata.
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Convergência cariotípica em lagartos do gênero
Gymnodactylus, endêmicos do Brasil (Squamata,
Gekkonidae)
Santos, RML1; Yonenaga-Yassuda, Y1; Laguna, M1; Rodrigues, MT2; Pellegrino, KCM3
¹Laboratório de Citogenética de Vertebrados – IBUSP/SP. 2Depto de Zoologia – IBUSP/SP. 3Depto de Ciências Biológicas – UNIFESP,
Diadema/SP.
[email protected]; [email protected]
Palavras-chave: conservação genética, lagarto, citogenética, ITS, cromossomos B, Gekkonidae, Gymnodactylus
Devido as grandes dificuldades envolvidas na sistemática convencional de geconídeos, técnicas moleculares tem
sido empregadas como ferramenta principal para a identificação de espécies crípticas, muito comuns no grupo.
Apesar de controvérsias envolvendo vantagens de dados moleculares sobre dados morfológicos na identificação
de taxa em nível específico, a citogenética tem fornecido importantes contribuições para a identificação de espécies crípticas. A espécie endêmica da Mata Atlântica Gymnodactylus darwinii apresentou duas raças cromossômicas que corroboraram dados moleculares na separação da espécie em duas entidades taxonômicas ainda não
descritas (citótipo A, 2n = 38; e citótipo B, 2n = 40) cujas distribuições são delimitadas ao norte e ao sul da Baía de
Todos os Santos. Neste estudo buscamos investigar a composição cariotípica de G. amarali (endêmico do cerrado)
e de G. geckoides (endêmico da caatinga) e compará-las com G. darwinii. Nossos resultados revelam que G. amarali
apresentou 2n=38, 38 + 1B, 38 + 2Bs, 39, 40, 40 + 1B, 40 + 2Bs cromossomos devido a um mecanismo de rearranjo
robertsoniano entre os dois maiores cromossomos do complemento (pares acrocêntricos 1 e 2 nos citótipos com
2n=40), evidenciado por bandas RBG e caracterizado pela presença de ITS nas regiões pericentroméricas e cromossomos supernumerários. Também observamos duas formas cromossômicas para o par rearranjado (metacêntrica e submetacêntrica) oriundas de mecanismo não elucidado, mas que pode indicar diferentes eventos de fusão
entre o par 1 e o par 2, uma vez que mecanismo convergente esteve presente na diversificação cariotípica de G.
darwinii. G. geckoides apresentou 2n=40, 40 + 1B cromossomos, com polimorfismo no par 5 devido a evento de
inversão pericêntrica (com 2 cromossomos submetacêntricos distintos) detectado por bandamento RBG. Zero,
um ou dois cromossomos Bs tardios e heterocromáticos foram encontrados em ambas espécies estudadas. Neste
contexto, os dados cromossômicos tem se mostrado uma excelente ferramenta para investigações sobre real diversidade de lagartos geconídeos brasileiros, assim como contribuir para a proposição de hipóteses filogenéticas e
sobre a evolução cromossômica do grupo.
Apoio Financeiro: FAPESP E CNPq.
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Scriptosaura catimbau, novo gênero e espécie de
lagarto microteídeo (Squamata, Gymnophthalmidae) do
nordeste do Brasil: o que revelam seus cromossomos?
Laguna, M.M.1; Pellegrino, K.C.M. 1,2; Rodrigues, M.T. 3; Yonenaga-Yassuda, Y. 1
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Universidade de São Paulo – SP [email protected]
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal São Paulo – Diadema-SP
3
Departamento de Zoologia,Universidade de São Paulo – SP
1
2
Palavras-chave: cariótipo, evolução cromossômica, FISH telomérica, Scriptosaura catimbau.
Scriptosaura catimbau, um novo gênero e espécie de lagarto microteídeo descrito recentemente do estado de Pernambuco, pertence à tribo Gymnophthalmini e foi sugerido como grupo-irmão de Calyptommatus com base em
caracteres morfológicos. Esta tribo reúne atualmente nove gêneros e, com exceção de Scriptosaura, todos possuem espécies com cariótipos descritos: Gymnophthalmus pleii com 2n= 34 (12M+22m); Vanzosaura rubricauda
e duas espécies de Procellosaurinus apresentaram 2n= 40 (16M+24m); duas espécies do gênero Tretioscincus, 2n=
42 (18M+24m); em Psilophthalmus paeminosus e em cinco espécies de Gymnophthalmus, o número diplóide encontrado foi 2n= 44 (20M+24m); três espécies de Calyptommatus apresentaram machos com 2n= 57 e fêmeas com
2n= 58 (com mecanismo múltiplo de determinação sexual X1X1X2X2:X1X2Y), Micrablepharus maximiliani exibiu 2n=
50-51, M. atticolus 2n= 50-53; e Nothobachia ablephara 2n= 60-62 (nas três últimas espécies, a variação no número
diplóide ocorre devido a presença de cromossomos supernumerários). A partir da suspensão de células de fígado
e intestino de 13 indivíduos de S. catimbau, obtidos no Parque Nacional de Catimbau (PE), foram estabelecidos o
número diplóide e a morfologia dos cromossomos em coloração convencional, a localização das Ag-RONs, o padrão de distribuição de heterocromatina constitutiva pela técnica de bandamento C e de regiões teloméricas com
FISH. O número diplóide encontrado foi 2n= 48, os quatro primeiros pares com dois braços, os demais na maioria
acrocêntricos, mostrando redução gradual de tamanho. As Ag-RONs foram localizadas em um par acrocêntrico de
tamanho intermediário a pequeno; a banda C mostrou-se pericentromérica, com grandes blocos nos centrômeros
dos cromossomos de dois braços e dos acrocêntricos de tamanho intermediário, e, pela técnica de FISH foram
evidenciados sinais nos telômeros de todos os cromossomos além de pequenos sinais pericentroméricos (ITS)
nos quatro primeiros pares de cromossomos de dois braços. Em alguns cromossomos acrocêntricos existe correspondência entre o tamanho do bloco heterocromático com a marcação da sonda telomérica, o que não ocorre
com as marcações observadas nos pares de 1 a 4 com dois braços. A técnica de FISH também foi aplicada para
duas espécies dos gêneros mais relacionados Calyptommatus leiolepis e Nothobachia ablephara. Foi possível observar uma marcação pericentromérica no par 1 metacêntrico e no braço curto do par 2 subtelocêntrico de Calyptommatus e marcação conspícua nos telomeros de um par subtelocêntrico de Nothobachia ablephara, o que pode
indicar a ocorrência de possíveis eventos de fusão/fissão cêntricas na evolução dessas três espécies. Utilizando
como grupo externo microteídeos da tribo Heterodactylini, cujas espécies com cariótipos descritos apresentam
2n= 42 (18M+24m), uma hipótese para explicar a enorme variação cariotípica na tribo Gymnophthalmini seria
uma série de eventos de fissão de um cariótipo ancestral hipotético como o de Tretioscincus, que apresenta esta
mesma fórmula cariotípica.
Apoio financeiro: FAPESP, CNPq
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Identificação por DNA de espécies de tartarugas
marinhas brasileiras
Vargas, SM; Martins, EM; Araújo, FCF; Santos, FR
Laboratório de Biodiversidade e Evolução Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brasil
Palavras-chave: barcodes, tartarugas marinhas, subunidade 1 da Citocromo c Oxidase (COI), identificação por DNA, Testudines
Dentre as sete espécies de tartarugas marinhas existentes, cinco ocorrem no litoral brasileiro: a tartaruga de couro
Dermochelys coriacea, a verde Chelonia mydas, a cabeçuda Caretta caretta, a oliva Lepidochelys olivacea e a de
pente Eretmochelys imbricata. Todas as cinco espécies são consideradas “em perigo” ou “criticamente em perigo”
de extinção pela IUCN. No presente estudo foram geradas sequências de DNA mitocondrial (DNAmt) para o gene
da subunidade 1 da Citocromo c Oxidase (COI) nas cinco espécies que ocorrem no Brasil. Vinte e seis indivíduos
das cinco espécies (L. olivacea n=3, C. mydas n=3, C. caretta n=4, E. imbricata n=8 e D. coriacea n=8), representando
populações de diferentes estados foram amostrados para a realização deste trabalho, sendo que foram selecionados indivíduos com seqüências divergentes da região controle (HVSI) do DNAmt. Com as seqüências de 589 pb
de COI geradas, todas as espécies puderam ser discriminadas, sendo que para C. mydas, L. olivacea e D. coriacea,
apenas um haplótipo foi observado, para E. imbricata quatro haplótipos e para C. caretta três haplótipos distintos
foram encontrados. Os níveis de divergência genética encontrados entre espécies foram altos (variando de 6,3%
entre L. olivacea e C. caretta a 13,9% entre C. mydas e D. coriacea), mas condizentes com aqueles observados para
outros grupos de vertebrados. A divergência média interespecífica foi igual a 8,2%, a divergência entre as duas famílias (Dermochelyidae e Cheloniidae) foi de 11,7% e a divergência intra-específica média foi de 0,34% e a distância
média dentro da família Cheloniidae foi igual a 6,4%. O trabalho de identificação da espécie por DNA em tartarugas
marinhas do Brasil mostrou que os “barcodes” de COI podem ser usados como uma ferramenta eficiente de identificação taxonômica, assim como para a caracterização de indivíduos híbridos. Isto possibilitará o uso da ferramenta de identificação de espécies por grupos especialistas ou não em genética forense, permitindo a identificação dos
híbridos e das espécies a partir de qualquer tecido, de animais em decomposição, restos de tecidos, ovos, embriões,
carapaças etc. Além disto, associado ao uso do segmento HVSI é possível também, em alguns casos, determinar a
população de origem, ou seja, a área de desova correspondente ao indivíduo analisado.
Órgãos financiadores: Capes, CNPq
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Descrição cariotípica da espécie partenogenética
ameaçada de extinção Cnemidophorus nativo (Teiidae,
Squamata)
Costa, PL1; Santos, RML1; Rodrigues, MT2; Yonenaga-Yassuda, Y1;
¹Laboratório de Citogenética de Vertebrados – IBUSP/SP. 2Depto de Zoologia – IBUSP/SP.
[email protected]; [email protected]
Palavras-chave: conservação, lagarto, citogenética, Cnemidophorus, Teiidae
Nos últimos 15 anos o número de espécies de Cnemidophorus duplicou, com 10 novas espécies descritas. A maioria
destas novas espécies encontra-se no território brasileiro e pertencem ao complexo ocellifer, refletindo a carência
de revisões e estudos dos animais dessa região. C. nativo está na lista do Ministério do Meio Ambiente do Brasil de
animais ameaçados de extinção e ocorre nas restingas do litoral norte do Espírito Santo até a região do Recôncavo
Baiano, uma área de intensa pressão antrópica. Neste contexto, tornam-se imprescindíveis e urgentes pesquisas
genéticas envolvendo tal espécie. As implicações deste tipo de pesquisa para estudos de conservação também
são muito importantes: se uma espécie ameaçada se apresenta estruturada, então a estratégia de conservação
deve procurar preservar toda a diversidade genética naquela determinada área, uma vez que já podem existir
adaptações locais específicas que se perderiam no caso de cruzamento com outras populações. Por outro lado, se
a população da espécie é homogênea ao longo de toda a área de ocorrência, então é viável concentrar a proteção
da espécie em apenas uma área, usando indivíduos dessa área para a recolonização das outras quando necessário.
A idéia geral é que, ao se manejarem populações de espécies ameaçadas, deve-se procurar preservar também sua
diversidade geográfica. A espécie C. nativo é partenogenética e somente um espécime foi previamente analisado
citogeneticamente que, apesar dos dados de morfologia cromossômica e de coloração diferencial serem pouco
conclusivos, apresentou 2n=48 cromossomos. Assim, neste trabalho analisamos 9 exemplares de diferentes regiões
do litoral do Espírito Santo e Bahia e os dados obtidos até o momento apontam 2n=48 cromossomos, com o par 1,
2 e 4 submetacêntricos; 3, 5, 6, 9 e 11 subtelocêntricos e demais pares acrocêntricos. Tais dados incluem a espécie
C. nativo no complexo ocellifer, que compreendem seis espécies distribuídas pelo sul do rio Amazonas e nordeste
brasileiro até o norte da Argentina e apresentam 2n=50 ou 48, com a maioria dos pares apresentando dois braços
cromossômicos, originados por eventos múltiplos de inversão pericêntrica e Ag-RONs na região distal do braço
longo do par 5. Dados envolvendo coloração diferencial estão em andamento e devem fornecer importantes contribuições para o conhecimento acerca da diversidade nesta espécie em extinção.
Apoio Financeiro: FAPESP E CNPq.
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Marcadores nucleares revelam introgressão entre
tartaruga de pente e cabeçuda na costa brasileira
Vilaça, ST1; Vargas, SM1; Lara-Ruiz, P1; Soares, L2; Santos, FR1
1
2
Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais
Fundação Pró-Tamar, Salvador, Bahia
Palavras-chave: Eretmochelys imbricata, Caretta caretta, hibridização, introgressão, marcadores nucleares
A tartaruga de pente, Eretmochelys imbricata, ocorre em mares tropicais dos oceanos Atlântico, Índico e Pacífico.
É considerada criticamente ameaçada pela IUCN, e pelo IBAMA. No Brasil, devido à pesca e captura para peças
de artesanato, são poucas as desovas remanescentes. Já a tartaruga cabeçuda, Caretta caretta, ocorre nos oceanos
Atlântico, Índico, Pacífico, e águas temperadas do mar Mediterrâneo e é considerada em perigo pela IUCN e pelo
IBAMA. Há décadas existem relatos de hibridização entre essas duas espécies a partir de evidências morfológicas
e mais recentemente, através de análises moleculares. Para melhor caracterizar a hibridização entre essas duas
espécies, foram analisados 53 indivíduos híbridos do litoral norte da Bahia e de Sergipe, anteriormente identificados morfologicamente como E.imbricata, mas com DNAmt de C.caretta. Como controles foram tipados indivíduos de C.caretta (com DNAmt de C.caretta) e E.imbricata (com DNAmt de E.imbricata). Foram usados no total
13 marcadores nucleares, sendo três loci de PCR-RFLP, cinco loci de microssatélites e cinco loci de seqüências
nucleares dos genes Rag1, Rag2, C-mos, BNDF e do íntron R35. Os resultados foram analisados através do programa STRUCTURE para verificar o nível de introgressão em cada indivíduo. Dos 53 híbridos, nove apresentaram
indício de introgressão com E.imbricata para as análises de PCR-RFLP. Para as seqüências nucleares, foram identificados 13 SNPs diagnósticos em 4 segmentos gênicos, sendo que o locus BNDF não se mostrou polimórfico nas
duas espécies. Foram encontrados nove indivíduos com sinal de introgressão, sendo que três indivíduos exibiram
introgressão com C.caretta e seis com E.imbricata. Nos cinco loci de microssatélites, foram identificados 21 alelos
exclusivos de C.caretta e 18 exclusivos de E imbricata, mas na população híbrida foram encontrados 12 alelos exclusivos de C.caretta e 13 exclusivos de E.imbricata. Foram identificados sete indivíduos com sinal de introgressão,
sendo cinco com E.imbricata e dois com C.caretta. No total dos 12 loci, foram identificados 16 híbridos com sinal de
introgressão, sendo que a maioria apresentou esse padrão em mais de um locus. Apenas dois indivíduos exibiram
introgressão com ambas as espécies parentais. Nas análises com o programa STRUCTURE apenas um indivíduo
parental apresentou sinal de introgressão. Para os híbridos, a maioria foi identificada como F1, e o maior nível de
introgressão se deu com E.imbricata. A descoberta de introgressão na costa brasileira é de especial importância,
pois pode dirigir estratégias de conservação e manejo diferenciadas para essas espécies no Brasil. É fundamental
investigar as causas de introgressão e suas conseqüências na viabilidade e comportamento dos híbridos. Caso
sejam detectadas, futuramente, conseqüências deletérias deste processo de hibridização, medidas de conservação
devem ser tomadas no sentido de diminuir o impacto deste evento para garantir a integridade destas duas espécies
ameaçadas de extinção.
Financiamento: CNPq e ProBio/MMA
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Genética Populacional de Podocnemis sextuberculata,
Cornalia 1849 (Testudines, Podocnemididae) de cinco
localidades da Bacia Amazônica
Viana, LS1; Fantin, C1; Farias, IP1; Vogt, RC2; Viana, MNS1
Laboratório de Evolução e Genética Animal (LEGAL) – UFAM, Manaus – AM.
Coordenação de Pesquisa em Biologia Aquática (CPBA) – INPA, Manaus – AM.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: quelônios, iaçá, Podocnemis sextuberculata, microssatélites, conservação.
Podocnemis sextuberculata encontra-se distribuída geograficamente na drenagem do rio Amazonas no Brasil, Peru
e Colômbia. Atualmente, apresenta-se classificada como vulnerável na lista vermelha da IUCN, tendo como principal ameaça o intenso consumo humano, pois seus ovos e carne são bastante apreciados na culinária local, além de
representarem uma fonte protéica importante para as comunidades ribeirinhas. A exploração deste recurso pode
causar profundas modificações na densidade e estrutura populacional da espécie, bem como, em sua razão sexual.
Portanto, o presente estudo analisou o nível de variabilidade genética de P. sextuberculata em cinco localidades ao
longo da bacia amazônica, a fim de conhecer o padrão genético das populações e fornecer informações que auxiliem o planejamento de projetos adequados de manejo e conservação. Amostras de sangue foram coletadas de
indivíduos provenientes do rio Purus – AM (19), rio Juruá – AM (20), rio Nhamundá – AM (14), rio Trombetas – PA
(19) e rio Branco – RR (17). Os indivíduos foram genotipados para cinco locos microssatélites, os quais se mostraram polimórficos. Os resultados de AMOVA indicaram maior variação genética dentro das populações (94,28%) do
que entre as populações (5,72%), e evidenciaram estrutura genética (FST = 0,08474; P < 0,001). As estimativas par a
par de FST foram significativas para todas as comparações envolvendo a localidade do rio Branco, sugerindo que a
mesma se encontra geneticamente diferenciada das demais. Tais estimativas também indicam que a população do
rio Nhamundá apresenta-se diferenciada em relação às localidades dos rios Purus e Juruá. A divergência genética
encontrada não está relacionada à distância geográfica considerando-se que o teste de Mantel não indicou correlação significativa. No caso da população do rio Branco, a estruturação genética pode ser atribuída à ausência de
continuidade da amostragem entre essa localidade e as demais. Dessa forma, estes resultados fornecem informações para que projetos de manejo e conservação de P. sextuberculata sejam desenvolvidos adequadamente, uma
vez que as populações dos rios Branco e Nhamundá devem ser tratadas cada qual como uma unidade de manejo,
por terem se mostrado geneticamente estruturadas, a fim de promover a manutenção de suas características genéticas, as quais podem representar adaptações desenvolvidas para tais regiões.
Financiamento: CNPq.
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Mitochondrial DNA composition of green sea turtle
feeding grounds in Cananéia, São Paulo, Brazil
Bondioli, ACV1,2; Naro-Maciel, E3; Toledo, LFA4
Laboratório de Biologia Molecular - MZUSP.
Projeto Tartarugas – IPeC.
3
Sackler Institute for Comparative Genomics - AMNH.
4
Laboratório de Ictiogenética – Instituto de Biociências da USP.
[email protected]
1
2
Keywords: Chelonia mydas, population genetics, mitochondrial DNA
The green turtle, Chelonia mydas, is an endangered marine reptile that nests and forages along the Brazilian coast
and oceanic islands, among other tropical areas. Due to the highly migratory and oceanic nature of these animals,
ecological studies are many times difficult to carry out, and many questions about their biology remain. Molecular
genetic analysis is a powerful tool for bridging these gaps, providing valuable information about population structure, phylogeography, and genealogy. This study analyzes mitochondrial DNA sequences (tRNA-Pro + D-loop) from
green sea turtles of the Cananéia regional juvenile feeding ground over a four-year period. Significant differences
were found between annual samples (p< 0,05), however no significant differences were found between seasons (p>
0,05). The sample was composed primarily of individuals of haplotypes CM-08 (63%) and CM-05 (26%). All other
haplotypes (n = 8) were relative rare, with frequencies lower than 5%. The analysis revealed the area to be a “mixed
stock”, composed of animals drawn from at least six different nesting areas. Because Cananéia is connected to other nesting and feeding grounds throughout the Atlantic Ocean, the health of these populations is interdependent,
and threats in one area will likely impact connected sites. This connectivity underscores the importance of understanding regional population dynamics using genetic analysis, with conservation applications. These data will be
included in the management plans for the Ilha do Cardoso State Park and the Environmental Protection Area of
Ilha Comprida, so that Cananéia will be considered a priority area for the preservation of green sea turtles in Brazil.
Support: FAPESP
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Variação genética macrogeográfica em populaçoes de
Jacaré-de-papo-amarelo (Caiman latirostris)
Villela, PMS; 1Ninov, K; 1Coutinho, LL; 2Verdade,LM
2
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Departamento de Zootecnia, Universidade de São Paulo.
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade de São Paulo.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Caracterização genética, marcadores moleculares, conservação, manejo de animais silvestres
O Caiman latirostris apresenta a mais extensa distribuição geográfica entre todos os crocodilianos. A espécie apresenta uma extensa distribuição latitudinal, de 5° S para 34° S e abrange um grande número de pequenas bacias
costeiras a partir de Natal, no nordeste do Brasil, até o nordeste do Uruguai. No Brasil tem populações afastadas
por mais de 3.500 km (em linha reta; Rio Grande Norte até Rio Grande do Sul). Esta grande variação latitudinal
afeta o clima no qual as populações evoluem (de uma situação sem inverno no Norte, até um inverno bem marcado
nas populações do Sul). A presença destas diferenças climáticas afetam a taxa de crescimento dos animais, e pode
influenciar na mortalidade dos filhotes, gerando pressões evolutivas diversas neste amplo gradiente latitudinal e
espacial. Neste estudo utilizamos doze populações selvagens de Caiman latirostris para analisar a relação entre
distância geográfica e diferenciação genética, utilizando doze marcadores microssatélites e seqüências do gene
mitocondrial Citocromo b. Em uma escala global, a variação genética interpopulacional indica uma forte diferenciação (RST = 0,407; FST = 0,271; P < 0,001). Os resultados sugerem que há uma relação entre distância geográfica e
diferenciação genética, porém outros fatores de biogeografia parecem ser pertinentes. A Serra do Mar parece ser
uma barreira geográfica efetiva, restringindo o fluxo genético entre populações do litoral e continente. A análise de
variância molecular (AMOVA) de uma região do citocromo b do DNA mitocondrial mostrou que 71,84% (P<0,001)
da variabilidade total está entre as populações do litoral e do interior. Isto pode ser devido ao fato que no Pleistoceno (16.000 anos atrás), o nível do mar era mais baixo ao longo da costa Brasileira. Durante este período os cursos
d’água ao longo da costa do Rio Grande do Norte e Rio Grande do Sul eram conectados formando assim uma vasta
área de drenagem litoral, sem barreira aparente para fluxo genético do jacaré de papo-amarelo e estas populações
estavam relativamente isoladas de bacias de rios continentais. Este padrão de maior semelhança genética ainda
permanece em populações do litoral, mas no cenário atual percebemos a ausência de fluxo gênico em uma escala
geográfica grande, com altos índices de diferenciação provavelmente pelo isolamento por distância, estando vulnerável a deriva. Em populações onde a escala geográficas é menor, como no caso de Rio Grande do Norte e Paraíba
e Ilha do Cardoso e Cubatão, esta semelhança ainda é encontrada e não temos a subdivisão destas populações.
O programa Structure atribuiu as doze populações em dez grupos, indicando a existência de uma grande diferenciação genética e pouco fluxo entre a maioria das populações. Os resultados contribuem para o conhecimento da
estrutura genética destas populações e estes dados podem ser utilizados para manejo e conservação da espécie.
Apoio financeiro: FAPESP
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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131
Endogamia e hibridismo em Cebus libidinosus
(Primates: Cebidae) no Centro de Primatologia da UnB,
Brasília
Oliveira, CG1; Gaiotto, FA1; Martinez, RA1
Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular, Universidade Estadual de Santa Cruz- UESC
[email protected]
1
Palavras-chave: Cebus, microssatélites, endogamia, hibridismo, primatas
Os cebídeos constituem a maioria dos primatas neotropicais. Dentre estes se destaca a subfamília Cebinae, a qual
pertence à espécie Cebus libidinosus. As pesquisas biomédicas com primatas não-humanos recebem grande atenção devido às similaridades filogenéticas destes com a espécie humana. De acordo com as recomendações internacionais, todos os animais utilizados em pesquisas biomédicas devem ser bem definidos em termos taxonômicos
e de constituição genética. Assim, os objetivos deste trabalho foram avaliar a variabilidade genética nos Cebus
libidinosus em cativeiro no Centro de Primatologia da UnB. Essa colônia é mantida com objetivos de pesquisa,
gerenciada pelo Departamento de Ciências Fisiológicas. As análises foram realizadas a partir da genotipagem, com
6 loci microssatélites, de 18 indivíduos coletados no Centro de Primatas da UnB. Os valores de heterozigosidade
observada (Ho), heterozigosidade esperada (He), e o coeficiente de endogamia foram calculados pelo programa
Genetix 4.0. A variabilidade genética também foi avaliada através de comparação com três espécies de Cebus
pelo programa STRUCTURE 2.1, visando identificar quanto de variabilidade pertencente a cada espécie estava
presente nos animais daquela colônia. O valor de He (0,7888) maior que Ho (0,5394), indica a existência de déficit
de heterozigotos na população, sugerindo consangüinidade que foi confirmada a partir do índice de endogamia
calculado (f=0.32). Foi identificada a presença de 3 animais potencialmente híbridos na colônia. Diante da identificação de animais híbridos e da detecção de possibilidade de depressão endogâmica nessa população, algumas
recomendações são feitas para impedir o aparecimento de alterações genéticas que são inevitáveis em populações
em condições de cativeiro. Para diminuir a perda da diversidade genética ao longo da vida no cativeiro é necessário
maximizar a heterozigosidade inicial, aumentar o intervalo de gerações através da reprodução dos indivíduos mais
velhos, maximizar o tamanho da população e, a proporção Ne/N. Desta forma, retardar o processo evolutivo em
populações cativas.
Apoio financeiro: Fapesb, Margot Mash e CEPF
55º Congresso Brasileiro de Genética
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Transferibilidade e caracterização da variabilidade
genética em regiões microssatélites de Cebus
libidinosus
Silva-Júnior, NJ2; Souza-Neto, AC1; Guedes, LBS1; Lima, JS1; Resende, LV1; Rosa, FF2; Telles, MPC¹;
¹ Mestrado em Ciências Ambientais e Saúde- UCG
2
Laboratório de Genética e Biodiversidade - Instituto de Ciências Biológicas - UFG
[email protected]
Palavras-chave: Macaco prego, transferibilidade, SSR, STR, primatas
O gênero Cebus (Primates, Cebidae) é amplamente distribuído na região Neotropical. Cebus libidinosus possui
distribuição concentrada nos biomas Cerrado e Caatinga. Conhecidos como macacos-prego possuem a característica comportamental interessante, porém esse comportamento só ocorre em condições ambientais que influenciem maior hábito terrestre e forrageio extrativista. Várias técnicas foram desenvolvidas para acessar a variabilidade genética, sendo uma delas os microssatélites que têm se destacado, principalmente devido à característica
codominante e a possibilidade de detecção de alto polimorfismo. Entretanto, o desenvolvimento desse tipo de
marcador ainda possui custo elevado, sendo a amplificação heteróloga uma alternativa para o acesso aos dados
genéticos com um custo mais baixo. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi testar a amplificação cruzada de
iniciadores para regiões microssatélites no genoma de Cebus libidinosus, utilizando iniciadores desenvolvidos para
Alouatta belzebul (Ab), Alouatta caraya (Ac), Cebus capucinus (Ceb), Callithrix jacchus (Cj) e Homo sapiens (D5S e
D8S). Além disso, objetivou-se a caracterização dos locos transferidos a partir da avaliação de amostras de 17 indivíduos oriundos de São Salvador do Tocantins- TO. As amostras de DNA foram extraídas do sangue através do kit
GFX (Amersham) e quantificadas com o auxílio do marcador de peso molecular Low DNA Mass. Foram testados,
via amplificação por PCR, 17 locos. A padronização dos locos foi feita pela busca da temperatura de anelamento
dos iniciadores que apresentasse o mínimo de amplificações inespecíficas e o máximo de nitidez dos alelos. Os
fragmentos foram submetidos a eletroforese vertical, utilizando-se gel de poliacrilamida 6%, corados com nitrato
de prata. A obtenção dos genótipos foi realizada pela comparação com o padrão de peso molecular 10bp (InvitrogenTM). Dos 17 locos testados, até o momento, 10 foram considerados padronizados, sendo 2 desenvolvidos
para Alouatta caraya (Ac-14/58ºC e Ac-17/62ºC), 4 para a espécie Cebus capucinus (Ceb-03/58ºC; Ceb-09/62ºC;
Ceb-10/60ºC e Ceb-127/60ºC), 2 para a espécie Alouatta belzebul (Ab-07/64ºC e Ab-10/58ºC) e 2 para a espécie
Homo sapiens (D5S117/58ºC e D8S165/55ºC). Dos 10 locos padronizados, seis foram caracterizados na população, sendo 2 deles monomórfico (Ab-10 e D8S165) e 4 polimórfico (Ceb-10; D5S117; Ceb-03 e Ceb-127). Dentre os
polimórficos, o número de alelos variou entre 2 e 6. A freqüência de alelos nulos apresentou valores próximos a
zero. A diversidade observada (Ho) e esperada (He) foram iguais a 0,352 e 0,354, respectivamente. A probabilidade
de exclusão de paternidade (PE) variou entre 0,0 e 0,49, com PE combinada igual a 0,795. A PI variou entre 1,0 e
0,2, com valores combinados de 0,0018. Os resultados mostraram uma boa proporção no sucesso de amplificação
cruzada. Entretanto, a busca por um maior número de locos torna-se necessário para a obtenção de estimativas
mais robustas para a avaliação de parentesco e estruturação genética populacional.
Apoio Financeiro: Systema Naturae Consultoria Ambiental LTDA.
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Amplificação heteróloga e caracterização da
variabilidade genética em regiões microssatélites de
Alouatta caraya
Souza-Neto, AC1; Guedes, LBS1; Resende, LV1; Silva-Júnior, NJ2; Lima, NE1; Telles, MPC¹
¹Laboratório de Genética & Biodiversidade – Departamento de Biologia Geral - UFG.
2
Mestrado em Ciências Ambientais e Saúde- UCG.
[email protected]
Palavras-chave: Bugio, Primatas, SSR, STR, Transferibilidade.
O gênero Alouatta (Primates, Atelidae) é considerado o mais basal de sua família, tendo divergido dos demais
membros a cerca de 15 milhões de anos. A espécie Alouatta caraya possui ampla distribuição, sendo encontrada
no Brasil, Paraguai, Bolívia e Argentina. De hábito florestal, é encontrada no Brasil principalmente nos biomas do
Cerrado e do Pantanal. A utilização de marcadores microssatélites para analises de parentesco e populacionais
têm se destacando devido à característica codominante e a possibilidade de alto polimorfismo. Entretanto, o desenvolvimento dos mesmos ainda possui custo elevado, sendo a amplificação heteróloga uma alternativa para o
acesso aos dados genéticos. O objetivo deste trabalho foi testar a amplificação cruzada de iniciadores para regiões
microssatélites do genoma de Alouatta caraya, utilizando iniciadores desenvolvidos para Alouatta belzebul (Ab),
Cebus capucinus (Ceb), Callithrix jacchus (Cj) e Homo sapiens (D5S e D8S). Além disso, objetivou-se a caracterização desses locos bem como a padronização dos desenvolvidos para Alouatta caraya (Ac), a partir da avaliação da
caracterização da variabilidade genética em 54 indivíduos oriundos de uma área de São Salvador do TocantinsTO. As amostras de DNA foram obtidas do sangue e extraídas através do kit GFX (Amersham). Logo após foram
quantificadas para utilização em reações de PCR para testar 17 locos. A padronização da amplificação dos locos
foi feita pela busca da temperatura de anelamento ideal para os iniciadores que apresentasse o mínimo de amplificações inespecíficas, o máximo de nitidez dos alelos e padrão de segregação mendeliano. Os fragmentos foram
separados por eletroforese vertical, em gel de poliacrilamida 6%, corado com nitrato de prata e a obtenção dos
genótipos ocorreu por comparação com o padrão de peso molecular 10bp. Dos 17 locos testados, até o momento,
13 foram padronizados, sendo 2 desenvolvidos para a própria espécie (Ac-14/60ºC e Ac-17/66ºC), 3 para a espécie
Cebus capucinus (Ceb-03/62ºC; Ceb-10/60ºC e Ceb-127/58ºC), 5 para a espécie Alouatta belzebul (Ab-07/57ºC; Ab09/58ºC; Ab-10/60ºC; Ab-12/66ºC e Ab-20/54ºC) e 3 para a espécie Homo sapiens (D5S111/50ºC; D5S117/52ºC e
D8S165/52ºC). Os resultados parciais de caracterização de cinco destes locos, avaliados na população, apresentaram-se monomórficos para os locos Ab-10 e Ceb-127 e houve polimorfismos nos locos Ceb-10; Ab-09 e Ac-17. Os
locos polimórficos apresentaram 3 e 5 alelos e a heterozigosidade média observada (Ho) e esperado (He) foi igual a
0,38 e 0,37, respectivamente e a freqüência de alelos nulos apresentou valores próximos a zero. A probabilidade de
exclusão de paternidade (PE), variou entre 0,0 e 0,4, com PE combinada igual a 0,726. A PI variou entre 1,0 e 0,28,
com valor combinada igual a 0,0039. Os resultados mostraram uma boa proporção no sucesso de amplificação
heteróloga. Entretanto, a busca por um maior número de locos torna-se necessário para a obtenção de estimativas
mais robustas para a avaliação de parentesco e estruturação genética populacionaApoio Financeiro: Systema Naturae Consultoria Ambiental LTDA.
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Variabilidade cromossômica em diferentes populações
de Alouatta guariba clamitans (Atelidae, Platyrrhini)
sugere revisão da taxonomia
Gifalli-Iughetti, C1; Fries, BG2; Summa, MEL2; Silva, AMJ2; Vieira, RG3; Koiffmann, CP1
1- Centro de Estudos do Genoma Humano, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São
Paulo, São Paulo/SP, Brasil; 2- DEPAVE, Departamento de Parques e Áreas Verdes do Estado de São Paulo, Divisão Técnica de Medicina
Veterinária e Manejo da Fauna Silvestre, São Paulo/SP, Brasil; 3- CEMAS, Centro de Estudo e Manejo de Animais Silvestres, Fundação
Florestal, São Paulo/SP, Brasil.
[email protected]
Palavras-chave: Alouatta guariba clamitans, citogenética de primatas não-humanos, variabilidade cromossômica, evolução
cromossômica, Platyrrhini.
Alouatta guariba clamitans apresenta variabilidade no número diplóide de 2n = 45-46, 48-50 e 52 e parece estar em
processo ativo de especiação cromossômica. Esta variabilidade e a presença de espécimes com 52 cromossomos,
associada à tendência de diminuição do número diplóide, sugere que este seja o cariótipo mais primitivo e que a
partir de 2n = 52 diferenciaram-se os outros citotipos por fusões cêntricas, fusões in tandem e inversões pericêntricas, com o envolvimento dos cromossomos sexuais formando sistemas múltiplos em decorrência de translocação
Y-autossomo. Estudamos a variabilidade cariotípica de A. g. clamitans em doze machos (2n = 45 e 49) e doze fêmeas
(2n = 46, 48 e 50) de diferentes regiões geográficas. A identificação da subespécie se deu pela presença do par cromossômico característico, o par 1, e pela região geográfica de procedência dos exemplares. Os cromossomos X
eram submetacêntricos de tamanho médio; pares heteromórficos foram observados em todos os cariótipos. Nos
machos, observamos translocações Y-autossomo e heteromorfismos nos pares 4 dos cariótipos com 49 cromossomos e no par 7 do cariótipo com 45 cromossomos como consequência desta translocação. Uma fêmea com
48 cromossomos foi descrita pela primeira vez e mostrou o mesmo complemento cromossômico de um macho
descrito na literatura, com exceção dos cromossomos sexuais: dois cromossomos X submetacêntricos na fêmea
e um cromossomo X submetacêntrico e um Y acrocêntrico no macho. Até hoje só foram encontrados estes dois
exemplares com 48 cromossomos, ambos na mesma região geográfica. Este cariótipo pode ser resultante do acasalamento de indivíduos com 50 e 46 cromossomos e o “fitness” reduzido do híbrido com 48 cromossomos resultaria
em poucos indivíduos naturais. Alternativamente, este pode ser um cariótipo intermediário entre as populações
do sul com 45/46 cromossomos e as do sudeste com 49/50 cromossomos e a progressiva fragmentação da Mata
Atlântica reduziu drasticamente e isolou estas populações com 2n = 48. Com o conhecimento da procedência
dos exemplares deste estudo corroboramos a tendência, orientada no sentido norte-sul, de redução do número
diplóide em A. g. clamitans. As diferenças cromossômicas entre as populações do sul e sudeste sugerem que A. g.
clamitans compreende duas subespécies ou duas espécies separadas, evidenciando a necessidade de uma revisão
taxonômica. Os diferentes números diplóides e fórmulas cromossômicas indicam a grande variabilidade inter e
intrapopulacional em A. g. clamitans, decorrente de processos de inversão pericêntrica, translocação Y-autossomo
e outros rearranjos complexos, o que poderia levar ao isolamento reprodutivo e, consequentemente, à especiação.
Apoio Financeiro: FAPESP, CEPID/FAPESP, CNPq.
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Identificação de juvenis de Mugil da Bacia do rio
Itapecuru/MA
Silva, MML; Barros, MC; Fraga, E.
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA, Caxias-MA.
[email protected]
Palavras-chave: Tainha, DNA mitocondrial, PCR, Mugilideos, rRNA16S
A família Mugilidae agrupa 14 gêneros e 64 espécies válidas, sendo a maioria delas encontrada nos gêneros Liza
(23) e Mugil (12). Os Mugilideos estão mundialmente distribuídos nos mares tropicais e temperados, em todas
as latitudes, exceto nas regiões polares. O gênero Mugil (subfamília Mugilinae) agrupa 12 espécies e o único que
ocorre na Costa Norte da América do Sul. No Brasil, as espécies desta família são conhecidas como tainhas e paratis na região Sudeste e Sul, e como tainhas e curimãs no Norte e Nordeste. A família Mugilidae tem sofrido várias
revisões taxonômicas, pois apresenta morfologia externa altamente conservada dificultando principalmente a
correta identificação dos juvenis. O presente estudo teve como objetivo a identificação genética dos espécimes
de Mugil sp., obtidos no baixo curso da bacia do rio Itapecuru/MA por meio de seqüências do DNA mitocondrial.
A amostragem foi constituída de espécimes obtidos no baixo curso da bacia do rio Itapecuru (MA). Para a identificação dos exemplares, utilizaram-se chaves específicas, seguindo com a extração de DNA a partir do tecido
muscular, utilizando-se o protocolo de fenol-clorofórmio. O isolamento e amplificação da região genômica, a partir
de DNA total foi realizada através da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) usando-se primers específicos. Uma seqüência do GenBank (EF397108) foi incorporada na análise para verificar a similaridade genética
com as seqüências dos espécimes da bacia do rio Itapecuru. As seqüências geradas foram editadas e alinhadas no
programa Bioedit e os cladogramas gerados no programa MEGA4. Um fragmento de 560 pares de base foi obtido
a partir de seqüências do gene rRNA 16S em espécimes analisados onde mostrou a ocorrência de único haplótipo
para a bacia do rio Itapecuru, agrupando com 100% de bootstrap com a sequências de Mugil incilis obtida do Genbank. Portanto observou-se que, a espécie encontrada para a bacia do rio Itapecuru é Mugil incilis, que até então
não tinha sido registrada para esta bacia. Portanto os resultados da presente análise, contribuem para o conhecimento da taxonomia de Mugil evidenciando a eficácia do gene rRNA 16S na identificação destes importantes
recursos pesqueiros.
Apoio Financeiro: UEMA, UFPA, BNB, CNPq.
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Prospecção de microssatélites de queixada (Tayassu
pecari)
Vecchia, ACD1; Biondo, C2; Sanches, A2; Keuroghlian, A3; Miyaki, CY4; Galetti Jr., PM1
Laboratório de Biodiversidade Molecular e Citogenética, Departamento de Genética, Universidade Federal de São Carlos
Laboratório de Biologia da Conservação, Departamento de Ecologia, Universidade Estadual Paulista, UNESP-Rio Claro
3
Wildlife Conservation Society, Brasil
4
Laboratório de Genética e Evolução Molecular de Aves, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Palavras-chave: microssatélites, status populacional, queixada, primers, prospecção
As queixadas, Tayassu pecari, vivem em bandos que facilmente excedem 100 indivíduos e necessitam de uma
grande área de vida para sobreviver. São consideradas espécie de paisagem e, portanto, vulneráveis às ameaças
decorrentes de atividades humanas. T. pecari apresenta um importante papel como predadora de sementes e sua
extinção representa uma grande perda na biodiversidade. Suas populações têm se tornado cada vez mais raras na
Mata Atlântica sendo, portanto, necessário a avaliação do status populacional, bem como o seu acompanhamento.
Os microssatélites são sequências curtas de DNA, de um a seis pares de bases, repetidas em tandem e caracterizam-se por um alto grau de polimorfismo, o que permite que cada indivíduo de uma população seja caracterizado
por um genótipo multiloco único. Este trabalho teve como objetivo prospectar sequências de microssatélites para
a espécie T. pecari, que poderão servir de subsídio para o estudo demográfico da mesma. Para tal foi construída
uma biblioteca enriquecida para tetranucleotídeos seguida da captura por meio de beads magnéticos. A partir de
96 clones sequenciados (94.042 pb), foram obtidos 38 microssatélites. Dos locos identificados, 12 (31,6%) são tetranucleotídeos; um (2,6%) trinucleotídeo; sete (18,4%) dinucleotídeos; oito (21,1%) mononucleotídeos e dez (26,3%)
compostos. Foi possível a construção de primers para 13 dos locos. Estes marcadores serão utilizados na análise
demográfica das populações de queixadas do Parque Estadual da Serra do Mar e da Ilha do Cardoso. Além disso,
trata-se de marcadores potencialmente úteis para diversos outros estudos genéticos dos pecarídeos.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP
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Origem e diversificação dos roedores Hystricognathi do
novo mundo
Loss-Oliveira, L; 1Schrago, CG.
1
Lab. Biodiversidade Molecular, Dep. Genética, IB, Universidade Federal do Rio de Janeiro
[email protected]
1
Palavras-chave: Caviomorpha, América do Sul, biogeografia, Eoceno-Oligoceno, relógio molecular relaxado
Os Hystricognathi incluem os roedores Phiomorpha (Velho Mundo) e Caviomorpha (Novo Mundo), que são grupos
irmãos. As espécies do Novo Mundo são encontradas na América Central e do Sul. Há registros fósseis de Hystricognathi na África, Eurásia e América do Sul, e estima-se que eles chegaram nesse continente na barreira EocenoOligoceno, enquanto a separação entre as Américas e a África teria ocorrido no Cretáceo Inferior. Algumas hipóteses têm sido propostas para explicar o aparecimento dos Caviomorpha no Novo Mundo, sendo a mais aceita a
que propõe uma origem africana do grupo e migração transatlântica. Como a evolução morfológica dos roedores é
caracterizada por apresentar altos níveis de homoplasia, diversos autores propuseram filogenias de Caviomorpha
com o uso de marcadores nucleares e mitocondriais. Esses trabalhos, entretanto, se baseiam em níveis taxonômicos supragenéricos, de maneira que as relações entre os gêneros ainda não estão bem esclarecidas. Nosso objetivo
é gerar uma filogenia dos gêneros desses roedores do Novo Mundo através dos marcadores nucleares GHR (éxon
10), vWF (éxon 28), Adra2b e do mitocondrial CYTB, já demonstrados como eficazes na resolução de problemas
filogenéticos no nível em questão. Até o momento, foram obtidas as sequências de dezessete gêneros, algumas
de bancos de dados e outras geradas por sequenciamento. As topologias estão sendo geradas através do método
de máxima verossimilhança e análise Bayesiana através do modelo CAT, que sabidamente reduz artefatos como
atração dos ramos longos. Até o momento, as árvores obtidas corroboram com as filogenias de níveis taxonômicos
supragenéricos encontradas por diversos autores. Além das relações filogenéticas, estabeleceremos uma escala
cronológica da diversificação aplicando o relógio molecular relaxado, segundo os modelos de evolução de taxas
disponíveis nos programas Multidivtime (lognormal com taxas correlacionadas e aproximação da curva de verossimilhança por distribuição normal multivariada) e BEAST (lognormal com taxas independentes).
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Caracterização cariotípica de alguns roedores da
família Echimyidae
Araújo, NP1; Lopes, MOG2; Godinho, RM1; Svartman, M1;
Universidade Federal de Minas Gerais
Biodiversity Salvation
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Echimyidae, Cromossomos, Bandeamento
A família Echimyidae, comumente conhecidos como ratos de espinho, caracteriza-se pela presença de pêlos espinhosos ou eriçados na maioria dos representantes do grupo. Esta família é bastante diversa, possuindo 20 gêneros
e 78 espécies viventes. Apesar da diversidade de características morfológicas nos representantes de Echimyidae,
algumas espécies são semelhantes e sua distinção através de caracteres morfológicos e/ou dados morfométricos
é difícil. A análise cariotípica de equimídeos é de extrema importância para a identificação taxonômica diferencial dentro dos gêneros estudados. Neste trabalho, analisamos citogeneticamente 20 espécimes de equimídeos
coletados em Minas Gerais e 13 coletados em outros cinco estados brasileiros (Pará, Maranhão, Bahia, Tocantins
e Goiás). A análise incluiu padrões de bandeamentos G e C e a marcação das regiões organizadoras de nucléolos
(RON) de exemplares dos gêneros Proechimys, Thrichomys, Trinomys e Phyllomys. Os espécimes estudados eram
provenientes de áreas que englobavam os biomas Mata Atlântica e Cerrado. Estudamos dez exemplares de Proechimys roberti (2n=30, NF=54), um de Minas Gerais, três de Goiás, quatro do Maranhão e dois do Pará; oito exemplares de Thrichomys apereoides de Minas Gerais (2n=28, NF=50) e dois do Tocantins (2n=26; NF=48); oito exemplares de Trinomys coletados em Minas Gerais (2n=56, NF=106; 2n=56, NF=108; 2n=60, NF=116) e um na Bahia (2n=60,
NF=116). Foi analisado também um exemplar de Phyllomys pattoni de Minas Gerais (2n=80, NF=112). Além das
diferenças de 2n e NF, variações na morfologia dos cromossomos sexuais em Trinomys também são observadas.
Com esse trabalho demonstramos que a distribuição de Thrichomys apereoides estende-se ao estado do Tocantins
e a de Proechimys ao município de Santa Bárbara – MG.
Apoio financeiro: FAPEMIG
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Análise filogenética, entre roedores Neotropicais
(Criceridae) e espécies de Muridae europeus e
africanos, baseada em homeologias cromossômicas
obtidas por ZOO-FISH com sondas de Mus musculus.
Hass, I1,2; Müller, S2; Sbalqueiro, IJ1
Departamento de Genética, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Brasil
Department Biology II, Human Genetics, Ludwig-Maximilians University, Munich, Germany
Correspondente: [email protected]
1)
2)
Palavras-chave: ZOO-FISH, citogenética, roedores, homeologia, filogenética.
As espécies sul-americanas de roedores apresentam uma identificação taxonômica complexa, sendo considerados
uma das maiores diversidades cariotípicas entre os mamíferos, e por esse motivo tem sido alvo de estudos citogenéticos, na tentativa da elucidação dos mecanismos cromossômicos responsáveis por essas variabilidades. A
técnica citogenética ZOO-FISH, têm sido empregadas na detecção de homeologias cromossômicas nas mais diversas espécies de mamíferos. Para verificarmos as homeologias, analisamos os cariótipos de 5 espécies de roedores
Neotropicais: Akodon cursor (ACU), A. montensis (AMO), A. paranaensis (APA), A. serrensis (ASE) e Oligoryzomys flavescens (OFL), utilizando sondas cromossomo-específicas de Mus musculus (MMU), e mais 6 espécies de roedores
Europeus e Africanos dados provenientes da literatura: Apodemys sylvaticus (ASY); Cricetulus griseus (CGR); Mus
platythrix (MPL); Otomys irroratus (OIR); Rattus norvegicus (RNO) e Rhabdomys pumilio (RPU). O objetivo deste
estudo consistiu na construção de uma árvore filogenética das espécies em questão, a partir da determinação
de ocorrência de homeologias, sintenias cromossômicas e associações sintênicas entre elas. A matriz de dados
foi composta por 88 caracteres, sendo que 42 caracteres foram informativos para a obtenção da parsimônia, a
espécie MMU foi utilizada como grupo externo e a análise feita com auxílio do programa PAUP. Como resultado
da busca heurística, obtivemos uma árvore com 128 passos, CI=0,6719, RI=0,6216 e HI=0,3281. A filogenia apresenta uma evidente separação dos roedores neotropicais (Bootstrap=60%) das demais espécies (Bootstrap=89%),
com a formação de dois clados distintos, estando a espécie MPL externa aos dois clados. No clado neotropical o
maior Bootstrap (74%) foi verificado entre ACU e AMO, já no outro clado o ramo mais derivado uniu CGR e RPU
com Bootstrap de 72%. Os resultados indicam que, apesar das espécies dos dois clados principais, terem seguido
caminhos de diversificação e evolução distintos, existem certos rearranjos e segmentos cromossômicos que permanecem muito conservados, podendo ser indicadores de regiões ricas em genes de fundamental importância
para o desenvolvimento e manutenção das espécies.
Apoio financeiro: UFPR, LMU, CNPq, DAAD.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
140
Testando o rio Doce como barreira geográfica ao
fluxo gênico entre populações do norte e sul da Mata
Atlântica em Akodon cursor (Rodentia, Cricetidae)
Colombi, VH1,2; Lopes, SR1,3; Fagundes, V1
Laboratório de Genética Animal, Departamento de Ciências Biológicas, Centro de Ciências Humanas e Naturais, Universidade Federal
do Espírito Santo.
2
Programa Institucional de Iniciação Científica (PIBIC/CNPq-UFES)
3
Doutoranda do Programa de Pós Graduação em Biologia Animal, Universidade Federal do Espírito Santo;
[email protected], [email protected], [email protected]
1
Palavras-chave: Akodon cursor, Mata Atlântica, fluxo gênico, divergência genética, barreira geográfica, rio Doce.
Dentre as 45 espécies reconhecidas em roedores do gênero Akodon, A. cursor Winge, 1889 está distribuída na encosta atlântica da Paraíba ao Paraná e apresenta alto polimorfismo cariotípico intra e interpopulacional, variando
no número diplóide (2n=16, 15 e 14) e no número de braços autossômicos (NF=18-26). Essa espécie revela 29 citótipos em 411 animais analisados, um dos maiores exemplos de variabilidade cariotípica entre os roedores. Os três
números diplóides coexistem em algumas regiões geográficas, e existe variação clinal da freqüência de ocorrência
do 2n=16 ( forma primitiva): 100% nas populações do extremo nordeste, tendendo a diminuir gradativamente em
populações do sul-sudeste; e da forma 2n=14 (mais derivada) em situação oposta. Apesar de alguns autores sugerirem que 2n=16 fosse um táxon distinto de 2n=14 e 15, dados de polimorfismos dos fragmentos de restrição
(RFLP) revelaram dois clados distintos, representados pelos três números diplóides, sugerindo que populações do
NE (sul da Bahia à Paraíba) se diferenciam geneticamente de populações do sul-sudeste (centro do Espírito Santo
ao Paraná), e que o número diplóide não distingue os clados, tratando-se, portanto, de uma única espécie. Ainda,
foi sugerido que o norte do ES e sul da BA fosse uma área de diferenciação interpopulacional nessa espécie. Nessa
região ocorrem dois rios que poderiam atuar como barreiras geográficas: Doce, no norte do ES, e Jequitinhonha,
no sul da BA. No presente estudo, para testar se as populações do norte e sul do ES mantêm fluxo gênico entre si
e avaliar se o rio Doce atua como barreira, analisamos seqüências do gene citocromo b (~801pb) geradas com os
primers MVZ5/MVZ16 de 56 espécimes de oito localidades, sendo seis abaixo e duas acima do rio Doce (Águia
Branca e Governador Lindenberg). Una (BA) foi usada como população no limite norte, acima do Jequitinhonha.
Análises de estrutura e de divergência genética interpopulacional (FST, ARLEQUIN v,2.0.) e número de migrantes
(Nm=1-FST/2FST) foram usados para estimar o fluxo gênico entre as populações acima e abaixo do rio Doce. Uma
rede revelando as relações hierárquicas dos haplótipos foi construída (NETWORK v.4.5). Ausência de divergência
foi conferida a valores Fst<0,6 e Nm>1. Valores de divergência genética par-a-par para todas as populações acima e
abaixo do rio Doce foram Fst<0,255 e Nm>1,460, exceto para análises entre Una (BA) e qualquer população do ES
(Fst>0,7900 e Nm<0,132). A rede de haplótipos revelou pouca diferenciação entre os haplótipos do ES (1-15 passos)
e grande diferenciação entre os haplótipos do ES e Una (24-59 passos). Nossos dados refutam a hipótese do rio
Doce ser uma barreira efetiva para separar populações do norte e sul do ES e redirecionam a pergunta para o rio
Jequitinhonha ser a barreira efetiva entre populações do norte do ES e sul da Bahia.
Apoio Financeiro: FAPES/ES, FACITEC/ES, CNPq e CEPF/Conservation International.
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Estimativa dos tempos de divergência das tribos de
sigmodontinae baseada nos genes citocromo B e IRBP
Cardoso, CAC1; Vilela, JF1,2; Russo, CAM1; Schrago, CG1
Laboratório de Biodiversidade Molecular – Instituto de Biologia – UFRJ
Programa de Pós Graduação em Genética – IB - UFRJ
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Filogenia, Sigmodontinae, Relógio Molecular, IRBP, Citocromo b
A subfamília Sigmodontinae (Rodentia: Cricetidae) é composta por roedores endêmicos da América do Sul. Até recentemente, a hipótese mais aceita da origem desta subfamília era a migração de ancestrais cricetídeos da América do Norte que cruzaram o Istmo do Panamá. Entretanto, estudos moleculares recentes estimaram um tempo de
divergência para o clado bem mais antigo que 3 milhões de anos (Ma), data de formação completa do istmo. Além
disto, a descoberta de um fóssil cricetídeo na Argentina do Mioceno superior (5,7 Ma) forneceu subsídios para
a rejeição da hipótese de colonização da América do Sul após o soerguimento do Istmo do Panamá. Porém até
agora não foi estimada uma escala cronológica das tribos dentro de Sigmodontinae. Nesse sentido, analisamos um
conjunto de dados formado por sequências de 63 indivíduos (representando 26 gêneros de Sigmodontinae, sendo
o grupo externo representado por outras subfamílias de Cricetidae: 1 gênero de Arvicolinae, 1 de Cricetinae, 1 de
Tylomyinae e 6 de Neotominae) disponíveis no GenBank do gene nuclear IRBP e do mitocondrial Citocromo b. O
alinhamento foi feito com o Clustal W e as matrizes foram submetidas ao Modeltest. Como o modelo GTR+G+I foi
escolhido para os dois genes, uma matriz de dados concatenada foi usada a partir de então. A escala temporal foi
estimada com o programa BEAST v1.4.8 usando o modelo de taxas evolutivas não-correlacionado, onde as taxas
em cada ramo seguem uma distribuição lognormal. Como informação para calibração, a idade da raiz do clado Sigmodontinae foi limitado a seguir uma distribuição gama com parâmetro de forma =1,0 e parâmetro de taxa =5,0. O
valor mínimo permitido foi a idade do fóssil Sigmodontinae mais antigo conhecido de gênero não identificado: 5,7
Ma. BEAST utiliza inferência bayesiana com algoritmo de Markov Chain Monte Carlo, que amostra árvores usando
o processo de Yule. O tempo de divergência para a raiz da árvore (Cricetidae) foi inferido a 7,7 Ma, o que é anterior
às estimativas de estudos prévios. O nó dos Sigmodontinae foi datado a 6,2 Ma, muito próximo da estimativa de
Steppan et al. (2004). As estimativas para os grupos monofiléticos dentro de Sigmodontinae são aproximadamente
4 Ma para os Akodontini, 3 Ma para os Phyllotini, 2,5 Ma para os Oryzomini e 2,9 Ma para os Abrothricini. Apesar
da tribo Akodontini ser ligeiramente mais antiga que as outras, as datações de todas compartilham um mesmo
intervalo de confiança, sugerindo uma radiação rápida dentro de Sigmodontinae.
Apoio Financeiro: CNPq, PIBIC - UFRJ
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Estudo genético populacional do atobá marrom Sula
leucogaster nas Ilhas Tamboretes e Moleques do Sul
(SC) por marcadores RAPDs
Carvalho, LJ1; Weber, LI1; Branco, JO2; Bernardes Jr, JJ2; Manoel, FC2
Laboratório de Genética Molecular, NUPEM/UFRJ, Macaé, RJ,
Laboratório de Ciências Ambientais, CTTMar, UNIVALI
[email protected], [email protected], [email protected]
1
2
Palavras-chave: genética populacional, aves marinhas, Brasil, RAPDs., atobá-marrom
O Arquipélago de Moleques do Sul é o principal sítio de reprodução das aves marinhas da costa catarinense e
pertence ao Parque Estadual da Serra do Tabuleiro. O Arquipélago dos Tamboretes constitui o limite norte do
Estado com colônias reprodutoras e está localizado nas proximidades da foz da Baía da Babitonga, São Francisco
do Sul. Estudos genéticos em aves marinhas mostram que algumas espécies, ainda com sua grande capacidade de
dispersão, apresentam divisão populacional entre ilhas próximas, quando estas constituem sítios de reprodução.
Por tanto, o objetivo deste trabalho foi testar a hipótese de homogeneidade genética do atobá marrom nas ilhas
de Santa Catarina mencionadas anteriormente. Foram coletadas amostras de sangue (40 µL) de S. leucogaster em
cartões FTA®Elute (Whatman) de 51 indivíduos de Tamboretes (42 juvenis e 9 adultos) e 60 de Moleques do Sul (26
juvenis e 34 adultos). A extração de DNA seguiu o protocolo do fabricante, a partir de discos de sangue dissecada
extraídos com aparelho de 3 mm Harris Uni-core (Whatman). Foram obtidos marcadores moleculares RAPDs utilizando o primer P2 (5’-GTTTCGCTCC-3’) e a reação em cadeia da polimerase. Testes padrões de diluições de DNA
(1:1, 1:5, 1:15, 1:20, 1:50 e 1:100) foram realizados para estabelecer a faixa de diluições que permitem um mesmo
padrão de bandas para um mesmo indivíduo, estabelecendo-se a diluição de 1:5 como óptima para este fim em
todos os indivíduos. Os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5% por 1h
a aproximadamente 80 mA e visualizados com brometo de etídeo. Sete fragmentos foram analisados como correspondentes a 7 locos bialélicos (presença e ausência do sítio amplificável), os quais foram analisados sob o pressuposto do equilíbrio de Hardy-Weinberg. A diversidade genética foi maior em Moleques do Sul (He=0,416±0,114) e os
adultos de Tamboretes mostraram a menor heterozigosidade esperada (He=0,254±0,238), possivelmente devido ao
baixo número amostral. Ambas populações foram homogêneas em suas freqüências alélicas de acordo com o teste
G (G=3.066; p=0.079), sendo também constatado pelo baixo valor do parâmetro de diferenciação populacional,
GST=0,012 e a alta identidade genética, I=0,988. No entanto esta homogeneidade genética é explicada apenas pela
homogeneidade entre os juvenis de ambas localidades (I=0.995), já que ao comparar os adultos, e analisando suas
freqüências alélicas, observa-se que os adultos de Moleques do Sul diferem dos adultos e juvenis de Tamboretes,
como de seus próprios juvenis, sendo isto explicado pelos locos P2-1(p=0.002), P2-4 (p=0.041) e P2-7 (p=0.018),
onde ao comparar todos os juvenis com todos os adultos se detecta uma diferenciação genética explicada pelo loco
P2-7 (p=0.010). Estes resultados sugerem que a diferenciação dos adultos de Moleques do Sul, sítio mais austral da
reprodução da espécie, esteja relacionada à migração de adultos de outras populações.
Apoio financeiro FAPESC
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Comparação entre Estrutura populacional genética e
fluxo gênico em populações de Larus dominicanus
Santos, FA1,2; Dantas, GPM1; Morgante, JS1
Laboratório de Biologia Evolutiva e Conservação de Vertebrados – Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo – IB/USP
[email protected]
1
2
Palavras chave: Larus dominicanus, microssatélites, estrutura populacional, taxas de migração, gaivotão
A crescente ocupação da costa brasileira tem provocado impactos sobre as populações de aves marinhas, resultando no declínio populacional de algumas espécies e no crescimento de outras. Larus dominicanus (gaivotão) é
amplamente distribuída no Hemisfério Sul. O hábito generalista confere vantagem adaptativa à espécie, provocando seu crescimento populacional acelerado. Este crescimento tem sido prejudicial às comunidades costeiras.
O conhecimento da estrutura populacional genética e das taxas de migração de L. dominicanus pode fornecer
importantes informações para a elaboração de planos de manejo. Nos últimos anos, o FST e seus análogos têm
sido utilizados para estimar estrutura populacional e fluxo gênico entre as populações. Estes índices assumem o
pressuposto de que as populações se encontram em equilíbrio entre mutação e deriva genética. Populações que
divergiram há pouco tempo, podem não ter alcançado o equilíbrio e compartilham semelhanças devido ao fluxo
gênico e ao isolamento recente. Assim, a utilização apenas do FST e seus análogos pode levar a conclusões enviesadas a respeito do fluxo gênico. Este trabalho faz uma comparação entre estimativas de estrutura populacional
genética e estimativas de taxas de migração. Para isso foram utilizados oito microssatélites e genotipados 206 indivíduos amostrados em dez ilhas, nove da costa brasileira e uma da Península Antártica. As estimativas de estrutura
populacional foram realizadas através dos índices FST e RST e as estimativas de taxas de migração, através do
programa Bayesass+, que utiliza métodos de coalescência, Bayesiana e cadeia de Markov Monte Carlo para estimar
taxas de migração recente. A maioria das populações apresentou diferenciação significativa entre si, concordante
com as baixas taxas de migração encontradas (taxas inferiores a 0,1). A população amostrada na ilha da Península
Antártica apresentou, em direção a todas as populações, taxas de migração inferiores às taxas observadas entre
as populações da costa brasileira, o que é condizente com os valores de diferenciação genética e com a distância
que a ilha se encontra das demais, correspondente a uma distância superior à capacidade de vôo de L. dominicanus. Todas as populações, embora em baixas taxas, apresentam mais de uma fonte de migrantes. A concordância
entre a diferenciação genética significativa e as baixas taxas de migração recente pode ser um indicativo de que as
populações já divergiram a tempo suficiente para alcançarem o equilíbrio entre mutação e deriva, no entanto, para
a obtenção de resultados mais acurados, é necessário o aumento do tamanho amostral, maximizando o poder de
teste do programa Bayesass+. Além disso, é importante a aplicação de métodos que estimem o fluxo gênico a longo
prazo e considerem isolamento e fluxo gênico simultaneamente.
Apoio financeiro: FAPESP, CAPES.
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Variabilidade genética de Gaivotões (Larus
Dominicanus) através de SNPs na costa brasileira
Cardoso, GM1; Almeida, VS2; Milo, ACM2; Morgante, JS3; Dantas, GPM3
UNIP- Universidade Paulista, Campus Cidade Universitária 2- Mackenzie – Universidade Presbiteriana Mackenzie, Campus São Paulo- 3IB-USP- Instituto de Biociências, Campus Cidade Universitária.
Palavras-chave: Larus dominicanus, estrutura populacional, SNPs, variabilidade genética, costa brasileira.
Larus dominicanus (Gaivotões) é uma espécie de ave marinha de ampla distribuição no Hemisfério Sul, que possui
hábito alimentar generalista, sendo capaz de se adaptar facilmente às novas condições ambientais criadas pelas
atividades antrópicas. Consequentemente, essa espécie tem apresentado grande expansão populacional e deslocado outras espécies de aves marinhas de seus sítios reprodutivos. A biologia da conservação é importante para o
estudo de casos como este, que gera preocupação de conservacionistas e pesquisadores. Dentro desse contexto,
este estudo buscou avaliar a variabilidade genética de L. dominicanus na costa Brasileira, tentando estimar sua
estrutura populacional e taxa de migração para delinear futuros planos de manejo. Para isso foram usados 3 SNPS
(Single Nucleotideos Polymorphims) localizados em regiões nucleares distintas, sendo estas o β-Fibrinogênio, o
ACL e o LRPP. Os SNPs foram analisados através das enzimas de restrição PstI, EcoR1 e Hinf1. Ao todo foram
genotipados 211 indivíduos de 9 ilhas da costa Brasileira e uma localidade da Península Antártica. Os dados revelaram que todas as populações se encontram em Equilíbrio de Hardy-Weinberg e que as populações apresentam-se
estruturadas geneticamente (FST= 0,055, por lócus FFIB= 0,048; FLRPP=0,068; FACL =0,021). Os dados indicam que as
populações da Antártica e do Rio de Janeiro são as mais diferenciadas, e que as populações presentes em São Paulo
e Santa Catarina são semelhantes entre si. Esses resultados indicam que as diferenças genéticas encontradas não
estão associadas ao isolamento por distância. Dessa forma, concluímos que as populações de gaivotões da costa
brasileira apresentam estrutura genética, o que implica na criação de planos de manejo que levem em conta essa
diferenciação. Os SNPs apresentaram-se como uma alternativa interessante para a elucidação da estrutura populacional de Larus dominicanus na costa brasileira, uma vez que os trabalhos anteriores com dados mitocondriais
apresentam um único haplótipo em toda a costa.
Apoio Financeiro: FAPESP, CAPES, IB-USP E UNIP
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Fluxo gênico e diversidade genética do gavião-real
(Harpia harpyja) no Brasil
Banhos, A1,4; Sanaiotti, TM2; Hrbek, T3; Farias, IP4
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade. 2Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia. 3Universidade de Puerto Rico.
Laboratório de Evolução e Genética Animal - Universidade Federal do Amazonas.
[email protected]
1
4
Palavras-chave: microssatélites; DNAmt; biogeografia; dispersão; conservação
O gavião-real ocorre nas florestas neotropicais do México à Argentina e possui distribuição mais ampla no Brasil,
onde existem registros principalmente na Amazônia e Mata Atlântica. Algumas questões foram levantadas no
cenário de sua distribuição: existem duas populações diferenciadas de gavião-real, uma na Amazônia e outra na
Mata Atlântica? A região de vegetação aberta entre esses biomas impede o fluxo gênico dessa ave? As mudanças na
paisagem no Pleistoceno afetaram essa espécie? As ameaças atuais ao gavião-real atingiram sua diversidade genética? Para responder a estas questões, foi realizada uma análise conjunta de 200pb da região controle do DNAmt
e oito locos microssatélites nucleares em uma amostragem histórica e atual de 166 indivíduos de gavião-real. As
análises com DNAmt mostraram diferenciação genética significativa entre as amostras da Amazônia e Mata Atlântica, enquanto que os microssatélites mostram alto nível de mistura populacional. Ambos os marcadores apresentaram altas taxas de fluxo gênico do gavião-real entre as regiões. O fluxo gênico com base nos dados de DNAmt foi
unidirecional da Mata Atlântica para o leste da Amazônia, enquanto que para microssatélites foi bi-direcional, embora com maior taxa na direção do leste da Amazônia. Esses resultados sugerem panmixia e ausência de barreira
para o fluxo gênico da espécie entre as regiões. As diferenças nos resultados dos marcadores sugerem uma maior
dispersão dos machos e residência das fêmeas, um viés oposto ao padrão geral de dispersão em aves. As análises
de coalescência evidenciaram que durante o Pleistoceno o gavião-real passou por longo período de redução populacional, seguido de expansão após a última glaciação, possivelmente relacionado à retração e expansão das florestas, respectivamente, promovida pelas mudanças climáticas. A diversidade genética encontrada para o gavião-real
foi similar a de aves ameaçadas, incluindo Falconiformes. Uma grande redução da diversidade genética ao longo do
tempo foi detectada entre o passado (1911-1953) e o período recente da Mata Atlântica (1967-2008). A diversidade
genética da amostragem da região do arco do desmatamento foi menor que da região com melhores condições de
floresta da Amazônia (2000-2008) e similar ao período recente da Mata Atlântica. A diversidade genética da espécie da região com melhores condições de floresta da Amazônia foi similar a do passado da Mata Atlântica. Esses
resultados sugerem que a perda de habitat e a remoção de indivíduos da natureza impactaram negativamente a
diversidade genética do gavião-real. Nas análises com microssatélites, o fluxo gênico dessa espécie foi mais limitado comparando a Amazônia central com o período mais recente da Mata Atlântica do que com o passado da
Mata Atlântica. Isso se deve possivelmente à diminuição das conexões de floresta no corredor de vegetação aberta
entre esses dois biomas. As respostas obtidas nesse estudo podem contribuir para as estratégias de conservação
do gavião-real.
Apoio Financeiro: Fundação O Boticário de Proteção a Natureza; Cleveland Metroparks Zoo; Capes; Fapeam
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Monitoramento genético da reprodução do papagaioverdadeiro (Amazona aestiva, Psittaciformes: Aves)
no Distrito Federal com base em marcadores
microssatélite
Rocha AV1; Caparroz, R2
Programa de pós-graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília. [email protected]
Laboratório de Genética e Biodiversidade - Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Goiás, Campus II. [email protected]
1
2
Palavras-chave: Amazona aestiva, Psittaciformes, microssatélite, monogamia
O papagaio-verdadeiro (Amazona aestiva) apresenta ampla distribuição geográfica, ocorrendo do noroeste do Brasil, passando pelo leste da Bolívia e do Paraguai, até o norte da Argentina. Apesar de não considerada ameaçada de
extinção, é uma das espécies de aves mais capturada na natureza para abastecer o tráfico ilegal de animais silvestres. Além disso, a destruição de seu ambiente natural, em particular nos locais para reprodução, vem contribuindo
para o declínio populacional. Informações sobre a biologia e a ecologia de uma espécie são fundamentais para
subsidiar programas de conservação. No presente trabalho, foi realizado o monitoramento genético da reprodução
do papagaio-verdadeiro no Distrito Federal. Nós avaliamos a hipótese de monogamia e a fidelidade dos casais aos
ninhos pela análise genética da relação de parentesco entre ninhegos encontrados no mesmo ninho com base em
seis locos microssatélite. No período de 2004 a 2008, foram coletadas amostras de sangue de 43 ninhegos, de 18
ninhadas, em 12 ninhos naturais e um artificial (caixa ninho de madeira) em três unidades de conservação do Distrito Federal, Brasil. Em três ninhos estudados foram encontradas ninhadas em dois ou três anos consecutivos. A
extração de DNA foi feita a partir das amostras de sangue pela digestão com proteinase K e purificação com fenol/
clorofórmio. A amplificação dos locos microssatélite foi feita via PCR e genotipagem dos ninhegos realizada em
um seqüenciador automático ABI 377 com auxílio dos programas GeneScan e Genotyper. A hipótese de relação
de primeiro grau (irmãos) entre os ninhegos foi avaliada pelo teste de proporção de probabilidades com o auxilio
do programa Kinship 1.2. A hipótese de monogamia foi aceita em 16 ninhadas estudadas. Para as duas restantes,
a rejeição da hipótese pode ser atribuída a erro tipo II. Os ninhegos encontrados no mesmo ninho, mas em anos
consecutivos, apresentaram relação de parentesco em primeiro grau, evidenciando a utilização do ninho pelo
mesmo casal durante dois ou três anos consecutivos. As informações obtidas nesse trabalho são importantes, considerando a dificuldade de obtenção das mesmas por monitoramento dos adultos em campo, e poderão auxiliar na
elaboração de estratégia para conservação dessa espécie.
Apoio financeiro: CNPQ
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Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Filogeografia mitocondrial e nuclear de Basileuterus
leucoblepharus (Passeriformes: Parulidae) e
simulações coalescentes do efeito do último máximo
glacial na avifauna da Mata Atlântica
Batalha-Filho, H; Miyaki, CY
Laboratório de Genética e Evolução Molecular de Aves – LGEMA, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, USP, São Paulo – SP.
[email protected]
Palavras-chave: Mata Atlântica, Basileuterus leucoblepharus, demografia histórica, coalescência, Pleistoceno.
O período mais marcante para a diversificação da maioria da fauna Neotropical foi o Quaternário, com destaque
para o Pleistoceno e suas grandes glaciações. Foram obtidas sequências de 54 amostras para 914 pb do gene mitocondrial cytb e de 48 amostras para 512 pb do íntron nuclear bFIB5 de 12 localidades dos estados brasileiros RJ,
MG, SP, PR, SC, RS e 2 localidades da Argentina para o pássaro endêmico da Mata Atlântica (MA) Basileuterus leucoblepharus. Para o cytb foram observados 33 haplótipos e p = 0,00563. Para o bFIB5, 34 haplótipos e p = 0,00621. A
reconstrução filogenética Bayesiana e a rede de haplótipos (realizados no MrBayes 3.1 e no Network 4.5, respectivamente) indicaram ausência de estruturação entre as localidades analisadas para ambos loci. A AMOVA (Arlequin
3.11) mostrou ausência de estruturação para os dois loci, com o maior percentual de variação dentro das localidades (68,38% no cytb e 92,26% no bFIB5). Os testes de neutralidade (D = -1,672ns, -1,835*; Fs = -25,471*, -24,925**;
R2 = 0,051*, 0,038*) e a mismatch distribution (unimodal), implementados pelo DnaSP 5.0, evidenciaram expansão
demográfica recente em ambos loci. A data da expansão foi obtida pela estatística Tau (t = 2mt; t = 3,791 para o cytb;
t = 2,76 para o bFIB5). Assumindo-se uma taxa de mutação de 2,1% m.a. para o cytb (Weir & Schluter, 2008), 0,72%
m.a. para o bFIB5 e um tempo de geração de 1 ano (Cabanne et al., 2009) obteve-se t = 98.728 anos A.P. e t = 374.389
anos A.P., respectivamente. A diferença no tempo coalescência dos dois marcadores concorda com estudos prévios
(Palumbi et al., 2001). Esse período coincide com eventos paleoclimáticos ocorridos na MA durante o final do
Pleistoceno. Entretanto, o padrão observado aqui discorda de padrões recorrentes para diferentes grupos animais
observados na MA, nos quais foram observados eventos vicariantes associados com refúgios pleistocênicos. Além
disso, a expansão datada aqui não coincide com o fim da última glaciação, quando o recuo das geleiras ocorreu
entre 20.000 e 14.000 anos A.P. Foram realizadas simulações coalescentes no Simcoal 2.1.2 para verificar o efeito do
último máximo glacial na MA sob diversos cenários demográficos. As assinaturas de expansão populacional (p, D e
Fs) observadas para o evento de expansão desde 100.000 anos A.P. são congruentes com os resultados obtidos aqui
e com estudos com outros pássaros da MA que também mostram ausência de estruturação. Isso indica que houve
expansão demográfica recente dessas espécies, mas não resultante do último ciclo glacial. Uma hipótese seria que
o último ciclo glacial não teria afetado essas espécies de pássaros estudadas, e o seu tamanho efetivo populacional
teria ficado estável durante a expansão das geleiras entre 18.000 e 48.000 anos A.P.
Apoio: FAPESP, CNPq e CAPES.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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148
Isolamento e caracterização de marcadores
microssatélites a partir de biblioteca genômica
parcial do passeriforme Dendrocincla turdina
(Dendrocolaptidae)
Fazza, AC1; Galetti Jr, PM1
Departamento de Genética e Evolução - Universidade Federal de São Carlos.
[email protected]
1
Palavras-chave: genética da conservação, aves, Passeriformes
A Mata Atlântica é um bioma notável pela sua megadiversidade e alta taxa de endemismo. No entanto, encontrase altamente fragmentado, restando apenas aproximadamente 7,5% de sua formação original, isto implica em
uma grande perda de sua biodiversidade e urgência de planos efetivos de conservação. Este bioma possui 75,6%
das espécies de aves do Brasil que estão ameaçadas e são endêmicas. A revisão de 2008 acerca das espécies de
aves ameaçadas de extinção coloca o Brasil em primeiro lugar, com 121 espécies sob ameaça. Considerando tal
situação, a Mata Atlântica é considerada internacionalmente uma área prioritária de conservação. Alguns grupos
de aves têm demonstrado uma baixa tolerância à perda de habitat e áreas degradadas, como espécies da família
Dendrocolaptidae (Passeriformes). Dencrocincla turdina, desta família neotropical, foi considerada como criticamente ameaçada no Rio Grande do Sul, e foi localmente extinta na região de Viçosa (Minas Gerais) e uma das possíveis razões é a alta especialização ecológica dessa ave. É possível propor políticas conservacionistas por meio de
estudos genéticos populacionais que permitem inferências diretas acerca da diversidade e estrutura genética de
uma população. Para este propósito um marcador molecular amplamente utilizado têm sido os microssatélites,
que são regiões genômicas altamente polimórficas capazes de fornecer dados sobre os processos genéticos que
estão atuando em uma determinada população. Os objetivos foram isolar e caracterizar locos de microssatélites
específicos, inexistentes na literatura, avaliar a variação genética na população de Caraguatatuba (SP) e contribuir com planos de conservação na Mata Atlântica. Analisamos uma população de 27 indivíduos do passeriforme
Dendrocincla turdina do Parque Estadual da Serra do Mar, núcleo Caraguatatuba, região de Mata Atlântica do
Estado de São Paulo. Foi construída uma biblioteca genômica parcial enriquecida de microssatélites a partir de
DNA genômico extraído de um indivíduo; 96 clones positivos desta biblioteca foram seqüenciados e 21 apresentaram microssatélites, todos perfeitos, dos quais um era dinucleotídeo, 19 tetranucleotídeos e um pentanucleotídeo.
Dezenove pares de “primers” foram desenhados e dez foram testados, dos quais oito apresentaram locos polimórficos para a população após a genotipagem. Não foram detectados desvios de Hardy-Weinberg nem desequilíbrio de
ligação entre os locos, após a correção seqüencial de Bonferroni. O número de alelos encontrados variou de 2 a 16 e
a diversidade gênica variou de 0,141 a 0,914. Os marcadores produzidos neste trabalho tornam possíveis as análises
da estrutura de outras populações da espécie ou de espécies relacionadas, fornecendo dados robustos acerca de
sua diversidade genética e possibilitando a proposta de programas de conservação e manejo, capazes de assegurar
a manutenção da variabilidade genética na Mata Atlântica.
Apoio Financeiro: CNPq.
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149
Isolation and characterization of microsatellite loci for
Neothraupis fasciata, (Emberizidae, Passeriformes)
with widely cross amplification in neotropical
passerines
Corrêa, CL1; Collevatti, RG2; Caparroz, R2
Pós-Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília, Brasília, SGAN 916 Norte Av. W5, 70790160, Brasília, DF, Brazil
2
Pós-graduação em Ecologia & Evolução, Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Goiás, Campus Samambaia, Caixa Postal 13, 74001-970, Goiânia, GO, Brazil.
[email protected]
1
Keywords: Cerrado, Emberizidae, Microsatellite, Neothraupis fasciata, Passeriformes.
The white-banded Tanager (Neothraupis fasciata) is an Neotropical bird species typical of the Cerrado (savanna
vegetation), occurring in central Brazil, eastern Bolivia and northeastern Paraguay. This species is generally scarce
within its range, and is likely to be declining moderately as a result of habitat loss and degradation for agricultural
development. Furthermore, this species has cooperative mating systems, but it’s never was investigated using molecular markers. Here we described the isolation and characterization of 16 microsatellite loci that can be useful
to address population genetics, kinship and conservation assessment studies in this species. We also evaluated
the cross-species amplification of these loci in eight Neotropical passerines: Sicalis flaveola, Ammodramus humeralis (Emberizidae), Thraupis sayaca, Gypsnagra hirundinacae, Paroaria capitata, Ramphocelus carbo (Thraupidae),
Casiormis rufus (Thiranidae) and Xiphorhynchus picus (Dendrocolaptidae). The genomic library was constructed
using the plasmid vector pCRÒ4Blunt-TOPO using the TOPO shotgun subcloning kit. The purified inserts were
sequenced using T3 and T7 primers, and the Dyenamic ET terminator kit on a MegaBACE 1000 automated sequencer. Fragments containing microsatellite loci were selected with Staden 1.6, and primers were designed using
the software Primer 3. Characterization of all loci was performed in 5% denaturing polyacrylamide gel in an ABI
377 DNA using GenesScan and Genotyper 2.1 programs. The number of alleles per locus, the observed and expected heterozygosity, the paternity exclusion and the genetic identity probabilities were estimated using Identity
1.0 and deviation from Hardy-Weinberg expectations and linkage disequilibrium were analyzed using Genepop
4.0. From the genomic library were sequenced 278 inserts and 51 (18%) contained microsatellite motifs consisting
of at four repeats. From these, we designed 16 primer pairs for microsatellite loci. The number of alleles detected
per locus range from two to 18, with an average of 5.3 alleles/locus. The observed heterozygosity range from 0.083
and 1.0, while the mean paternity exclusion and the mean genetic identity probabilities were 0.999 and 1.72x10-10,
respectively. Cross-species amplifications revealed that all passerines tested showed amplification of similar size
fragment using at least five primer pairs and the species from Emberizidae and Thraupidae families showed more
cross-success amplification than species from Thiranidae and Dendrocolaptidae families. The microsatellite markers described here showed moderate to high levels of genetic diversity and they will enable ecological and reproductive studies in N. fasciata, as well as in other Neotropical passerines, topics that have rarely been addressed in
this birds group using high-resolution markers.
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Incidência de Giardia spp. na avifauna do Distrito
Federal inferida por diagnóstico molecular
Guedes, LBS1; Cavalcante, WS2; Caparroz, R1
Laboratório de Genética e Biodiversidade - Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de
Goiás, Campus II. [email protected], [email protected]
2
Programa de pós-graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília.
1
Palavras-chave: Giardia, parasitologia veterinária, diagnóstico molecular, Aves
Giardia é um gênero de protozoário flagelado, binucleado e piriforme, comumente encontrado infectando o intestino delgado de aves, anfíbios e mamíferos, inclusive o homem. A presença do parasito interfere na absorção da
mucosa intestinal e causa doença clínica moderada à severa, podendo provocar diarréia intermitente, acarretando
em desidratação e perda de peso, inclusive podendo levar à morte. O contágio se dá pela ingestão acidental dos
cistos de Giardia que estão presentes nas fezes de animais infectados. Além de ser uma zoonose, essa parasitose
também é responsável por elevados prejuízos na produção de animal. O diagnóstico molecular vem se mostrando
mais eficiente que os métodos tradicionais na detecção da presença do parasito em amostras de fezes, contribuindo de forma relevante para a parasitologia veterinária, particularmente em aves. Contudo, poucos estudos
vêm investigando a incidência dessa parasitose em condições naturais, especialmente na região Neotropical. O
objetivo do presente trabalho foi identificar a incidência de Giardia spp. na avifauna silvestre do Distrito Federal
por meio de diagnóstico molecular. Amostras de fezes foram coletadas de aves capturadas com redes de neblina
instaladas em duas unidades de conservação do Distrito Federal (Estação Ecológica de Águas Emendadas e a
Reserva Ecológica do IBGE). Foram coletadas amostras de 31 aves de oito espécies diferentes (Elaenia cristata, E.
chiriquensis, Neothrauphis fasciata, Turdus leucomelas, Saltator similis, Arundinicola leucocephala, Polioptila dumicola, Columbina passerina). A extração de DNA foi feita com o QIAamp DNA stool kit (Qiagen) e o diagnóstico foi
baseado na amplificação de um fragmento de 163 pb do gene heat shock protein do protozoário, visualizado em
gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídeo. Das 31 amostras fecais analisadas, 30 (93,8%) foram positivas,
evidenciando elevada incidência de Giardia nas comunidades estudadas. Todas as oito espécies apresentaram
incidência do parasito, indicando amplo espectro de ocorrência na avifauna do Distrito Federal. As causas dessa
elevada incidência devem ser mais bem investigadas, tanto para auxiliar no controle sanitário da população humana do DF, como para avaliar os possíveis fatores que estão influenciando a disseminação desse parasito nas
comunidades estudadas.
Apoio Financeiro: FapDF.
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Microsatellite markers for paternity determination,
sexual behavior and sperm analyses in Japanese
quail Coturnix japonica: implications for understanding
mating strategies
Gomes, ML1; Hatanaka, T2; Campos, WN2; Nishida, SM3; Wasko, AP1*
UNESP - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Departamento de Genética, Botucatu, SP, Brazil
UFSCar - Universidade Federal de São Carlos, Departamento de Genética e Evolução, São Carlos, SP, Brazil
3
UNESP - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Departamento de Fisiologia, Botucatu, SP, Brazil
[email protected]
1
2
Keywords: microsatellites, paternity, Coturnix japonica, quail
Birds comprehend one of the most important animal groups on mating systems and reproductive success studies,
and several recent data have evidenced that multiple paternity is extremely common in natural populations.
One of the Galliformes that presents several advantages in studies concerning these topics is the Japanese quail
(Coturnix japonica), due to several peculiar characteristics, as fast growth, early sexual maturity, high rate of egg
production and short generation interval. Moreover, its economic importance has been increasing in the last years
in several countries, including Brazil, due to its egg and meat production. The present study intent to perform a
multidisciplinary strategy in order to analyze the Japanese quail mating behavior in relation to the reproductive
success of males, as established through a genetic marker-based paternity assessment and a sperm traits analysis.
Data on a behavioral analysis using animal triplets composed by one female and two males evidenced that, despite
the observation of common stereotyped sexual behaviors, some male behaviors denominated as female’s guard,
attempt to a copula interruption, and attempt to a male-male copulation, were also identified. Although females
tend to firstly associate to males that they had already copulated, the presence of a competitor male did not reduced
the total number of female’s inseminations and no difference in the copulation success was evidenced between
both males. The average percentage number of fertilized eggs was around 55%, probably as a result of multiple
copulas. Five microsatellite markers were analyzed in the species, through the use of two different genotyping
methodologies, in order to evaluate their use in paternity testing. Data generated by the use of fluorescent labeled
and tailored primers in PCR and further automated genotyping were more robust. Paternity genetic inference was
performed for 96.87% of the embryos generated from ten animal triplets, through the use of three microsatellite
markers (Na = 5-8, mean HE = 0.75). No significant difference was evidenced on the contributions of the two
potential male parents to the offspring (P=0.755) and the paternity results could not be correlated to the average
sperm concentration, sperm vitality, or spermatozoa motility. The offspring paternity was not also influenced by
the number of copulas of each male or by the male that performed the first or the last copula, evidencing that,
apparently, the mechanism of sperm competition of last-male sperm precedence does not occur in C. japonica. The
potential occurrence of a polyandric mating system in Japanese quail can be associated to a higher probability of
egg fertilization, and to genetic benefits as the acquisition of “good genes” and an increase in genetic diversity of
clutches.
Apoio financeiro: FAPESP
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152
Caracterização genotípica de populações recíprocas
brasileiras da galinha usando marcadores
microssatélites no cromossomo 5
Silva, FEJ1; Packer, IU2; Silva, NA1; Coutinho, LL1; Ledur, MC3; Rosário, MF1
Laboratório de Biotecnologia Animal, Departamento de Zootecnia, ESALQ/USP. 2Departamento de Zootecnia, ESALQ/USP. 3Embrapa
Suínos e Aves.
[email protected]
1
Palavras-chave: conteúdo de informação polimórfica, genômica, heterozigosidade, melhoramento genético e QTL
O Projeto Genoma Brasileiro da Galinha, uma iniciativa entre EMBRAPA Suínos e Aves e ESALQ/USP, desenvolveu
duas populações experimentais F2 de galinha a partir de cruzamentos recíprocos entre linhagem de corte (TT) e
de postura (CC). Assim, originaram-se as populações designadas TCTC e CTCT para mapear QTLs associados
ao desempenho e carcaça. A caracterização das gerações parentais e F1 através da estimação de parâmetros
genotípicos (conteúdo de informação polimórfica - PIC, heterozigosidade e número de alelos) pode aumentar o
poder de detecção de QTLs e a redução dos custos de genotipagens, já que permite selecionar parentais, famílias
ou marcadores moleculares informativos. O objetivo deste trabalho foi estimar os parâmetros genotípicos das
gerações parentais e F1 das populações TCTC e CTCT no cromossomo 5 da galinha (GGA5). Um total de 28
parentais (14 TT e 14 CC) e 55 F1 (27 CT e 28 TC) de ambos os sexos foram genotipados para 10 marcadores
microssatélites no GGA5. Os parâmetros estimados foram: número de alelos por loco, heterozigosidade observada
e esperada, assumindo-se equilíbrio de Hardy-Weinberg e PIC, todos expressos como média dos 10 locos. Os
genótipos foram obtidos em seqüenciador ABI 3100 com o auxílio dos programas GeneScan Analysis e Genotyper
e os parâmetros foram estimados pelo programa Cervus 3.0, no modo Allele Frequency Analysis. As estimativas
mostraram-se similares entre TT e CC, com número de alelos por loco de 3,30 (TT) e 3,10 (CC) e heterozigosidade
observada de 0,50 (TT) e 0,57 (CC) enquanto que a esperada foi 0,51 e 0,54 para TT e CC, respectivamente, e o
PIC foi de 0,42 (TT) e 0,43 (CC). Nos F1 também se verificou similaridade entre TC e CT, com número de alelos
por loco de 4,60 em TC e 4,50 em CT e freqüências alélicas variando entre 0,01 a 0,71 em TC e 0,02 a 0,63 em CT. A
heterozigosidade observada (esperada) foi de 0,80 (0,64) e 0,84 (0,65) para TC e CT, respectivamente, com PIC de
0,57(TC) e 0,58 (CT). Destaca-se que a composição genética de TT foi baseada nas raças New Hampshire, White
Cornish e White Plymouth Rock, enquanto que CC foi baseado em White Leghorn, abrindo a possibilidade para
que novos QTLs possam ser mapeados devido a diferenças de composição genética entre as diversas populações
referência desenvolvidas para esta finalidade. Demonstrou-se neste trabalho que cruzamentos entre linhagens
fenotipicamente divergentes produziram gerações F1 que apresentam parâmetros genotípicos superiores aos de
seus parentais. Isso indica que suas gerações F2 possam apresentar variabilidade genotípica adequada para que o
mapeamento de QTLs no GGA5 possa ser conduzido com sucesso, visto que este cromossomo, onde 45 QTLs já
foram mapeados para diversas características, corresponde a 5,2% do genoma da galinha.
Apoio Financeiro: FAPESP (2008/56681-8) E CNPq (480074/2008-9).
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153
Mapa Consenso Brasileiro do cromossomo 4 da
galinha associado a intervalos de confiança de
distâncias e ordens de locos microssatélites
Rosário, MF1; Margarido, GRA2; Ledur, MC3; Moura, ASAMT4; Garcia, AAF2; Coutinho, LL1
Laboratório de Biotecnologia Animal, Departamento de Zootecnia – ESALQ/USP. 2Departamento de Genética – ESALQ/USP. 3Embrapa
Suínos e Aves. 4Departamento de Produção Animal - FMVZ/UNESP.
[email protected]
1
Palavras-chave: Gallus gallus, genômica, mapa genético, microssatélite e QTL
Duas populações F2 recíprocas (TCTC e CTCT) oriundas do cruzamento entre linhagens de corte (TT) e de postura
(CC) foram desenvolvidas pela EMBRAPA Suínos e Aves e ESALQ/USP para realizar estudos genômicos relacionados
ao desenvolvimento muscular. O mapa genético do cromossomo 4 (GGA4) foi construído previamente para cada
população separadamente. Entretanto, a construção de um mapa consenso associado a intervalos de confiança,
trará maior confiabilidade na estimação das ordens e distâncias entre locos, permitindo mapear QTLs com maior
precisão da posição e dos efeitos. O objetivo deste trabalho foi construir o Mapa Consenso Brasileiro (MCB) para o
GGA4 de TCTC e CTCT e compará-lo com o Mapa Consenso Internacional (MCI) e com a Sequência do Genoma
da Galinha (SGG), associando intervalos de confiança às distâncias e ordens de locos microssatélites do MCB
para facilitar tais comparações. Para TCTC, cerca de 520 F2 foram genotipados para sete locos microssatélites do
GGA4 enquanto para CTCT foram 360 F2 para nove locos. Os genótipos de todos os F2 foram combinados para a
construção do mapa consenso empregando o programa CRI-MAP com LOD>3. O MCB foi comparado com MCI do
ArkDB e com a posição de cada loco na SGG através do MapViewer/NCBI. Os mapas apresentaram comprimento
de 191,0, 167,5 e 174,1 cM para TCTC, CTCT e MCB, respectivamente. As distâncias entre locos apresentaram
média de 27,3 (TCTC), 18,6 (CTCT) e 17,4 (MCB) cM, não sendo observadas inversões na posição dos locos.
LEI0063 e MCW0174 em TCTC apresentaram-se fora dos intervalos das distâncias de MCB, sugerindo alteração na
posição. Já com os intervalos das ordens, pôde-se concluir que as ordens inicialmente propostas para o MCB foram
parcialmente confirmadas nas reamostragens bootstrap. A comparação entre MCB e MCI mostrou duas inversões
(LEI0100 e LEI0078) enquanto que entre MCB e SGG não foi observada inversão. Com os intervalos das distâncias
observou-se que entre MCB e MCI apenas LEI0063 não estava contido em tais intervalos e entre MCB e SGG os
locos LEI0100, LEI0076, LEI0063, LEI0062, LEI0085 e MCW0174 apresentaram-se na mesma condição, sugerindo
novamente alteração na posição desses locos em MCB. Este estudo apresenta o primeiro mapa consenso do GGA4
construído a partir de cruzamentos recíprocos entre linhagens de corte e postura da galinha doméstica, o que
poderá permitir estudar o efeito de imprinting. Outro aspecto inédito foi a estimação de intervalos de confiança
para as distâncias e as ordens de locos microssatélites. Esta medida de acurácia facilitou as comparações uma vez
que diversos fatores, entre eles tamanho da população, número de marcadores, erros de genotipagem, número de
genótipos perdidos e sexo dificultam a comparação entre mapas oriundos de trabalhos distintos. Mapas genéticos
cada vez mais saturados e acurados continuam sendo essenciais para mapeamento de QTLs.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP e PRODETAB/EMBRAPA.
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Seleção de genes referência para RT-PCRq durante o
desenvolvimento da musculatura esquelética de galinhas
Ninov, K1; Mourão, GB1; Andreote, APD1; Jorge, EC1; Villela, PMS1; Ledur, MC2; Coutinho, LL1
Departamento de Zootecnia - ESALQ/USP, Piracicaba, SP - Brasil. 2Embrapa Suínos e Aves, Concórdia, SC - Brasil.
[email protected]
1
Palavras-chave: Normalização, Genes referência, PCR quantitativa em tempo real, Desenvolvimento muscular, Genética animal
O sucesso na aplicação da técnica de RT-PCR quantitativa está na normalização adequada dos dados mensurados.
Logo, atenção especial deve ser dada a aspectos como: utilização da mesma quantidade inicial de amostra,
padronização da síntese de cDNA, escolha do gene de referência e do modelo matemático para a análise dos dados.
Os genes referência, ou normalizadores, são genes constitutivos também conhecidos como housekeeping, ou seja,
genes responsáveis por funções essenciais para a manutenção do funcionamento celular. Um gene referência ideal
deve ter expressão constante nos diversos estádios de desenvolvimento, em diferentes tipos celulares e em condições
fisiológicas distintas. No entanto, vários estudos utilizam genes referência sem prévia validação da estabilidade de
sua expressão, o que pode levar a interpretações errôneas dos resultados obtidos. No presente estudo, foi investigada
a estabilidade da expressão de cinco genes referência potenciais: EEF1 (Eukaryotic translation elongation factor 1,
alpha 1), GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase), MRPS27 (Mitochondrial ribosomal protein S7), RPL5
(Ribosomal protein 5) e ß-actina na musculatura peitoral de duas linhagens de galinhas de composições genéticas
distintas: uma de corte (TT) e outra de postura (CC), desenvolvidas pela Embrapa Suínos e Aves. Foi avaliado
um total de 90 animais distribuídos nas duas linhagens e cinco estádios de desenvolvimento: 9 e 17 dias da fase
embrionária e 1, 21 e 42 dias da fase pós-eclosão. Neste estudo empregou-se a técnica de RT-PCRq em tempo real
e os resultados da expressão gênica foram gerados e registrados como valores de Cp (Crossing point). Os valores
de Cp de cada gene foram analisados pelo programa Bestkeeper para auxiliar na escolha dos pares de genes ideais.
O programa Bestkeeper detectou altas correlações entre os pares MRPS27-RPL5 (0,903), ß-actina-RPL5 (0,875),
ß-actina-MRPS27 (0,809) e GAPDH-RPL5 (0,701), que são indicativos da aplicabilidade da média geométrica destes
pares como fator de normalização. Adicionalmente, testaram-se os genes isolados e as médias geométricas das
combinações utilizando-se análises de variância, que incluíram os efeitos fixos de idade, linhagem e interação
idade x linhagem. Houve efeito significativo (P<0,05) da idade sobre os valores de Cp para todos os genes testados
individualmente e para as combinações das médias geométricas. Houve efeito significativo (P<0,05) da interação
para o gene GAPDH e MRPS27 e para as combinações das médias geométricas de MRPS27-RPL5 e ß-actinaMRPS27. Os resultados da análise de variância dos genes individuais ou agrupados pelo programa Bestekeeper são
demonstrativos de que esses genes e a técnica utilizada pelo programa têm limitações quanto a sua aplicabilidade
na normalização de dados da expressão relativa, pois no presente estudo apresentaram variação tanto entre
linhagens quanto entre idades. Com base nesses resultados, outras metodologias para a seleção e utilização de
genes referência deverão ser testadas.
Apoio Financeiro: CAPES
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Associações genéticas entre características de
qualidade do ovo e produção de ovos em uma
linhagem de aves de postura
Savegnago, RP1; Ramos, SB2; Caetano, SL3; Ledur, MC4; Schmidt, GS4; Munari, DP5
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento Animal, Curso de Mestrado, FCAV/UNESP, Bolsista CAPES. 2Programa de
Pós-Graduação em Genética e Melhoramento Animal, Curso de Mestrado, FCAV/UNESP, Bolsista FAPESP. 3Programa de Pós-Graduação
em Genética e Melhoramento Animal, Curso de Doutorado, FCAV/UNESP, Bolsista CAPES. 4Embrapa Suínos e Aves, Concórdia, SC,
Brasil. 5Departamento de Ciências Exatas, FCAV/UNESP. e-mail: [email protected]
1
Palavras-chave: Produção parcial, peso do ovo, modelo animal, herdabilidade, correlação genética
Características de qualidade do ovo devem ser consideradas no processo de seleção atendendo as exigências do
mercado consumidor em relação ao produto final. Dados referentes ao desempenho de 1.617 fêmeas oriundas
de uma linhagem de aves de postura, pertencente à EMBRAPA Suínos e Aves, Concórdia, SC, foram utilizados
para estudar as associações genéticas entre produção parcial de ovos (P1740), idade à maturidade sexual (IMS)
e características de qualidade de ovo tais como peso, relação altura–largura e densidade do ovo, medidas às 40
semanas de idade (PE40, REL40 e DENS40, respectivamente). Na estruturação dos dados, foram excluídas as aves
com taxa de postura total (entre a 17ª e 70ª semana de idade) menor do que 25%. O método dos quadrados mínimos
foi utilizado no estudo da influência de efeitos fixos sobre a variação das características. A distribuição dos resíduos,
a retirada de outliers e demais pressuposições para validação das análises de variância foram verificadas. As análises
para a estimação dos componentes de variância foram efetuadas pelo método de Máxima Verossimilhança Restrita
em um modelo animal bi-característica. O modelo proposto incluiu o efeito aleatório genético aditivo e o efeito fixo
resultante de três incubações. As médias e os respectivos desvios-padrão para P1740, IMS, PE40, REL40 e DENS40
foram 77,04 ± 8,52%, 138,38 ± 8,67 dias, 59,03 ± 4,40g, 137,09 ± 5,57 e 4,15 ± 1,61, respectivamente. As herdabilidades
estimadas foram de 0,21 ± 0,05 para P1740, 0,54 ± 0,07 para IMS, 0,33 ± 0,06 para PE40, 0,15 ± 0,04 para REL40 e
0,22 ± 0,05 para DENS40. Entre as características de qualidade de ovo, PE40 seria aquela que melhor responderia
à seleção, seguido pela DENS40. As correlações genéticas negativas estimadas foram de -0,56 ± 0,12 entre P1740 e
IMS, -0,20 ± 0,16 entre P1740 e PE40, -0,02 ± 0,19 entre P1740 e DENS40, -0,15 ± 0,18 entre IMS e REL40, -0,06 ± 0,17
entre PE40 e DENS40, -0,06 ± 0,20 entre REL40 e DENS40. As correlações genéticas foram positivas entre P1740
e REL40 (0,03±0,21), IMS e PE40 (0,10±0,13), IMS e DENS40 (0,14±0,15) e PE40 e Rel40 (0,66±0,12). Com base nas
correlações genéticas, apenas a seleção para peso do ovo poderia resultar em mudança nos valores genéticos para
a qualidade do ovo, expressa pela Rel40. Maior quantidade de observações seria necessária para a obtenção de
estimativas de correlações genéticas mais precisas.
Apoio Finamceiro: CAPES; FAPESP
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
Comparação de modelos não lineares para o ajuste da
produção de ovos de aves selecionadas para postura
Ramos, SB1; Savegnago, RP2; Zuin, RG2; Ledur, MC3, Figueiredo, EAP3; Munari, DP4
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento Animal, Curso de Mestrado, FCAV/UNESP, Bolsista FAPESP. 2Programa
de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento Animal, Curso de Mestrado, FCAV/UNESP, Bolsista CAPES. 3Embrapa Suínos e Aves,
Concórdia, SC, Brasil. 4Departamento de Ciências Exatas, FCAV/UNESP. [email protected]
1
Palavras-chave: Gompertz, Logístico, Compartimental Modificado, Modelos não lineares
A avaliação de modelos de produção de ovos tem particular importância na predição da produção total e
conseqüentemente o quanto isso implicará economicamente. O presente trabalho teve o objetivo de testar o ajuste
de modelos não lineares para a produção de ovos e verificar qual destes se ajustou melhor aos dados. Os registros de
produção de ovos de 17 a 70 semanas de idade foram oriundos de 1693 fêmeas de uma linhagem de aves de postura,
mantida pela EMBRAPA Suínos e Aves, em Concórdia, SC. A linhagem foi submetida à seleção para aumento da
produção de ovos e demais características reprodutivas de importância econômica. Os modelos testados foram
a
o Compartimental y = a(1 - e[-c(t-d)])e(-kt) , Compartimental modificado y =
e-kt , Gompertz curvilinear
-c(t-d)
1+e
-ct
y = aebe e-kt e Logístico y = a(1 + e-ct)-d e-kt , sendo “y” a produção de ovos em porcentagem, em “t” semanas de
postura, “a” uma estimativa assintótica da taxa de postura, “k” a taxa de persistência de postura e “b”, “c” e “d”
parâmetros sem interpretação biológica. Os critérios utilizados para a escolha do modelo que melhor se ajustou
foram os valores dos parâmetros encontrados, o coeficiente de determinação (R2) e o erro predito EP = PO - PE
PE
, em que PO e PE são, respectivamente, a produção observada e esperada de ovos. Os parâmetros encontrados e
respectivos R2 foram a=1,0196, c=0,2771, d=1,257, k=0,00843 e R2=0,9619 para o modelo Compartimental, a=0,9452,
c=0,9684, d=3,9196, k=0,00647 e R2= 0,9783 para o Compartimental modificado, a=0,9586, b=-8,2057, c=0,6444,
k=0,00682 e R2= 0,9834 para o Gompertz curvilinear e a=0,9625, c=0,6696, d=9,5192, k=0,00679 e R2= 0,9831 para o
Logístico. Todos os valores de R2 foram altos, o que indicou que todos os modelos se ajustaram bem aos dados. Os
EP indicaram que os modelos não explicaram corretamente a produção de ovos apenas nas 4 primeiras semanas.
Mas, a partir deste período, todos os modelos se ajustaram de forma satisfatória. Dentre os parâmetros, as taxas de
persistência (“k”) estimadas nos modelos foram semelhantes. Quanto ao valor assintótico (“a”), apenas o modelo
Compartimental apresentou medida maior que um, ou seja, superou o limite biológico da característica. Os demais
modelos estudados foram eficientes no ajuste da produção de ovos ao longo do ciclo de postura.
(
156
)
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Parâmetros genéticos para produção de ovos medida
em períodos parciais e total em aves de postura
Caetano, SL1; Savegnago, RP2; Zuin, RG2; Ledur, MC3, Figueiredo, EAP3; Munari
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento Animal, Curso de Doutorado, FCAV/UNESP, Bolsista CAPES.
Programa de Pós-Graduação em Genética e Melhoramento Animal, Curso de Mestrado, FCAV/UNESP, Bolsista CAPES.
3
Embrapa Suínos e Aves, Concórdia, SC, Brasil. 4Departamento de Ciências Exatas, FCAV/UNESP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: herdabilidade, idade à maturidade sexual, correlação genética
A seleção baseada em registros parciais de produção de ovos poderá indicar os melhores indivíduos para a
produção total e contribuir para diminuir o intervalo de gerações. Assim, o objetivo do presente trabalho foi estimar
parâmetros genéticos para a taxa de postura total (da 17ª a 70ª semana de idade) e parcial (da 17ª a 30ª semana e da
30ª a 70ª semana de idade, respectivamente P1730 e P3070) e idade à maturidade sexual (IMS). Foram analisados
dados de 1.617 fêmeas de uma linhagem de aves de postura, mantida pela EMBRAPA Suínos e Aves, em Concórdia,
SC. Na estruturação dos dados, foram excluídas as aves com taxa de postura total (TPT) menor do que 25%. O
estudo da influência de efeitos fixos sobre a variação das características consideradas foi realizado utilizando-se
o método dos quadrados mínimos. A distribuição dos resíduos, exclusão de outliers e demais pressuposições para
validação das análises de variância foram verificadas. As análises para a estimação dos componentes de variância
foram efetuadas pelo método de Máxima Verossimilhança Restrita, em um modelo animal bi-característica. O
modelo proposto incluiu o efeito aleatório genético aditivo e o efeito fixo resultante de três incubações. As médias
e os respectivos desvios-padrão para TPT, P1730, P3070 e IMS, foram 76,46±12,28%, 67,11±12,21%, 75,85±10,87% e
138,32±8,75 dias, respectivamente. As estimativas de herdabilidade (h2) foram de 0,14 ± 0,04 para TPT, 0,30 ± 0,06
para P1730, 0,10 ± 0,04 para P3070 e 0,51 ± 0,06 para IMS. A maior estimativa de h2 para P1730, comparada aos
demais períodos, pode ser atribuída à maior expressão dos genes aditivos por volta da 30ª semana de idade, o que
coincide com o pico de produção de ovos. As correlações genéticas foram de 0,67 ± 0,13 entre TPT e P1730, 0,94 ±
0,03 entre TPT e P3070, 0,37±0,20 entre P1730 e P3070, -0,25 ± 0,17 entre TPT e IMS, -0,85±0,05 entre P1730 e IMS e
0,06±0,19 entre P3070 e IMS. A alta associação genética entre P1730 com TPT e com IMS evidenciou a possibilidade
de se realizar a seleção baseada neste período parcial, com conseqüente redução no início da postura. No entanto,
a moderada magnitude da correlação genética entre P1730 e P3070 indica que o ganho genético esperado pela
seleção para P1730 poderá não ocorrer no período complementar. Além disto, com a redução da IMS, as aves
poderão por ovos menores.
Apoio Financeiro: CONVÊNIO CAPES PROAP
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Variabilidade dos genes β-Lb do MHC da galinha
(Gallus gallus domesticus) em aves caipiras brasileiras
Paludo, E1; Pertille, F1; Herkenhoff, ME1; Fonteque, GV1; Lima-Rosa, CAV1
Laboratório de Análises Genéticas – DNA/UDESC, Departamento de Produção Animal e Alimentos, UDESC, Lages, SC.
([email protected])
1
Palavras-chave: Genes B-Lβ, Galinha Caipira, Variabilidade Genética
Grande parte das doenças que atacam as galinhas é de origem bacteriana, sendo os genes B-Lβ (genes de classe
II-β do MHC destas aves) os maiores responsáveis pelo desencadeamento da resposta imune a estes agentes, assim
como, a outros agentes exógenos. A galinha apresenta dois principais genes B-Lβ: denominados B-LβI e B-LβII,
que estão localizados no mesmo cromossomo, o microcromossomo 16, numa região muito próxima um do outro.
Para obter-se um melhor conhecimento sobre a imunidade aos agentes exógenos, possibilitando medidas que
incrementem esta imunidade, são necessárias investigações na seqüência destes genes. Tais investigações ainda
não foram realizadas em galinhas caipiras brasileiras, as quais apresentam uma variabilidade mais acentuada que
raças ou linhagens comerciais (que sofreram uma forte seleção na busca do aumento de produtividade). Com as
finalidades de investigar o polimorfismo dos genes B-LβI e B-LβII, através das técnicas de PCR e de seqüenciamento
de DNA, foram coletadas e analisadas amostras de 25 aves caipiras de ovos azuis provenientes do município de
Dois Lajeados, RS. Galinhas caipiras de ovos azuis são uma variedade de galinhas caipiras, que são o resultado
de cruzamentos aleatórios entre diversas raças inclusive das Araucanas chilenas, única raça de galinhas que
originalmente põe ovos azuis. Dez diferentes seqüências nucleotídicas (alelos) B-Lβ foram detectadas na amostra
acima indicada. Sete destas seqüências encontradas foram similares as já descritas para aves comerciais, mas
três foram inéditas. Este resultado demonstra uma significante variabilidade nestas aves o que torna as galinhas
caipiras um reservatório de alelos B-Lβ, os quais, potencialmente, podem representar diferenças na resposta imune
a patógenos exógenos.
Apoio Financeiro: FAPESC
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Análise de três locos de microssatélites em uma
amostra de galinhas caipiras brasileiras de ovos azuis
Lima-Rosa, CAV1; Fonteque, GV1; Herkenhoff, ME1; Paludo, E1; Pértille, F1
Laboratório de Análises Genéticas – DNA/UDESC, Departamento de Produção Animal e Alimentos, UDESC, Lages, SC.
([email protected])
1
Palavras-chave: Microssatélites, STRs, Galinha Caipira, Ovos Azuis, Variabilidade Genética
Os microssatélites são DNAs moderadamente repetitivo que estão presentes em abundância e igualmente
distribuídos nos genomas de eucariotos, tais como vertebrados, insetos e plantas. Eles consistem de unidades
de repetições em tandem de 1-6pb, sendo os dinucleotídeos os mais freqüentes. Os alelos dos microssatélites
são identificados principalmente pelo número de unidades de repetições que apresentam. Nos últimos anos, os
microssatélites têm provado ser uma potente ferramenta para análises de genética de populações, bem como
para investigações de variabilidade genética. As galinhas, originárias da Ásia, habitam as terras brasileiras desde
o seu descobrimento, por volta de 1500. Raças mediterrâneas e do sul da Europa foram aqui introduzidas e o que
se conhece hoje por galinha caipira é o resultado de cruzamentos aleatórios entre estas raças. Galinhas caipiras
diferem das raças ou linhagens comerciais de aves por não terem sofrido uma seleção severa na busca do aumento
de produtividade. Existe uma variedade de galinhas caipiras que colocam ovos azuis. Com o objetivo de analisar
o polimorfismo de três locos de microssatélites (LEI217, LEI221 e LEI248), do tipo tetranucleotídico, em uma
população de aves caipiras de ovos azuis, foram coletadas e analisadas amostras de 82 animais, provenientes
do município de Dois Lajeados, RS. Este objetivo foi alcançado através da técnica da PCR, com a utilização de
iniciadores marcados com fluorescência, e genotipagem em seqüenciador automático. Para o loco LEI217 foram
encontrados 13 alelos (178-252pb) na amostra, sendo os três alelos mais freqüentes o 242 (representado em 24,0%
da amostra), o 178 (22,5%) e o 218 (14,5%), com freqüências inferiores a 10,0% para os demais; para o loco LEI221
foram detectados 17 alelos (169-233pb), o alelo mais freqüente foi o 185 (27,3%), e distribuições que variaram
entre 7,5 a 0,5% para os outros alelos; e para o loco LEI248 foram observados 10 alelos (222-258pb), o alelo 238
apresentou freqüência em torno de 44,0%, seguido pelo alelo 250 (22,5%) e pelo alelo 234 (14,0%), o restante dos
alelos deste loco apresentou freqüências abaixo de 9,0%. Os resultados demonstraram-se relevantes, pois mostram
um polimorfismo considerável, tendo em vista ser o número amostral analisado reduzido, e por ainda não terem
sido descritos trabalhos populacionais com estes microssatélites.
Apoio Financeiro: FAPESC
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Variabilidade genética da região controladora do
mtDNA (alça-D) de galinhas caipiras brasileiras
Pertille, F1; Paludo, E1; Herkenhoff, ME1; Fonteque, GV1; Freitas, LB2; Salzano, FM2; Lima-Rosa, CAV1
Laboratório de Análises Genéticas – DNA/UDESC, Departamento de Produção Animal e Alimentos, UDESC, Lages, SC.
Departamento de Genética, UFRGS, Porto Alegre, RS.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: mtDNA, alça-D, Galinha Caipira, Variabilidade Genética
O DNA mitocondrial (mtDNA) é um tipo de DNA celular não nuclear e caracteriza-se por ser de herança materna
em aves. A região controladora (alça-D) do mtDNA é uma região de grande variabilidade. Devido a este grande
polimorfismo, a análise da alça-D é recomendada para investigações de variabilidade genética não nuclear. Este
trabalho analisou a variabilidade genética não nuclear de galinhas caipiras. Galinhas caipiras são o resultado de
cruzamentos aleatórios entre diversas raças de galinhas, cuja característica principal é ter grande diversidade
alélica devido ao fato de ter sofrido pouca seleção artificial que, em geral, torna as populações mais homogenias.
Acredita-se que a introdução das galinhas no Brasil se deu pelos colonizadores portugueses, que na época da
colonização trouxeram raças européias de galinhas. Recentemente, tem se cogitado a possibilidade de que a
introdução da galinha no continente americano tenha se dado com raças orientais pelos chineses, bem antes dos
colonizadores portugueses e espanhóis terem aqui desembarcado. O DNA de 105 galinhas caipiras de ovos azuis
provenientes de propriedades da região rural do município de Dois Lajeados, RS, foi utilizado como amostra. Para
esta análise a amplificação dos fragmentos desejados foi realizada pela técnica da PCR. Estes fragmentos, depois
de amplificados, foram seqüenciados em um seqüenciador automático. As seqüências obtidas foram alinhadas
pelo programa Clustal W e comparadas com as já publicadas para aves de outras regiões mundiais. Dois haplótipos
mitocondriais foram detectados na amostra. Noventa e oito animais (93,33%) apresentaram o haplótipo 4, um
haplótipo mitocondrial de aves européias, e sete aves (6,67%) apresentaram o haplótipo 3d, haplótipo mitocondrial
de aves chinesas. Nota-se uma baixa variabilidade genética em aves caipiras para o mtDNA (quase 94% da população
possui o mesmo haplótipo). Existem sete haplótipos diferentes para a alça-D descritos para galinhas. Os resultados
também indicam que, pelo menos para as aves caipiras brasileiras, a origem destas galinhas no Brasil é européia,
com pouca mestiçagem com raças orientais.
Apoio financeiro: CNPq/PRONEX; FAPERGS
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Evolução molecular dos genes ZFX e ZFY em
mamíferos: uma análise filogenética e da estrutura
primária do polipeptídeo
Martinelli, AB1,2; Moraes-Barros, N 3; Fagundes, V1
1 Laboratório de Genética Animal (LGA), Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo
2 Programa Institucional de Iniciação Científica (PIBIC/CNPq-UFES)
3 Laboratório de Biologia Evolutiva e Conservação de Vertebrados (LABEC), Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
[email protected], [email protected], [email protected]
Palavras-chave: Evolução molecular, ZFX, ZFY, cromossomos sexuais, zinc finger genes, Mamíferos
Em placentários (Eutheria) os genes ZFY/ZFX estão nos cromossomos sexuais, enquanto que em marsupiais (Metatheria) um
ortólogo encontra-se em autossomos. Analisamos 46 seqüências de ZFX/ZFY (~400pb) de um casal/espécie de oito marsupiais
e 14 placentários (Primates/Artiodactyla/Xenarthra). Dezesseis seqüências de marsupiais e seis de Xenarthra foram geradas
(primers P1-5EZ/P2-3EZ) enquanto oito seqüências de Artiodactyla, 14 de Primates e duas do grupo externo foram retiradas
do GenBank. Seqüências foram alinhadas manualmente e as relações filogenéticas inferidas (MEGA4.0 e PAUP*4.0b) com os
critérios de otimização de Distância (NJ), Máxima Parcimônia (MP) e Máxima Verossimilhança (ML), com o apoio estatístico
do bootstrap (1000 replicações). Obteve-se um haplótipo por espécie em Metatheria, independente do sexo, 98-99% similar
ao ortólogo de Monodelphis domestica localizado no autossomo 7 (via BLAST). Em Eutheria, obteve-se dois haplótipos por
espécie: ZFX (machos e fêmeas) e ZFY (machos). As topologias das árvores (NJ, MP e ML) foram congruentes, revelando
dois clados (Metatheria e Eutheria), a monofilia das ordens de Eutheria, e a separação de clados internos correspondentes
a ZFX e ZFY que divergiram entre si de 5-8%. Em Eutheria, a comparação da seqüência de ZFX e ZFY por espécie mostrou
12-24 sítios variáveis (3-6tv/9-19ts) em Primates, 27-33(2-4tv/23-29ts) em Artiodactyla e 21-24(5-7tv/14-18ts) em Xenarthra. A
filogenia gerada pelo ZFY em primatas coincidiu com a organização mais aceita para o grupo, com o filograma indicando que
as taxas evolutivas de ZFY são maiores do que o ZFX. A análise dos RNAm de ZFX e ZFY (comparado ao ortólogo humano)
mostrou um polipeptídeo com 131 aminoácidos (aa). Observou-se que toda a variação do ZFX de Eutheria foi resultado
de mutações silenciosas, sem alteração da estrutura primária do polipeptídeo do ZFX. Comparando a estrutura primária
do ZFX entre Metatheria/Eutheria, 4/131 aa foram substituídos (ASN/SER, THR/ALA, ASP/GLU, ASP/GLU), todos com
características químicas similares. Em contrapartida, em Eutheria, os polipeptídeos do ZFY apresentaram diferenças em 23
de 131aa, enquanto a comparação entre Eutheria/Metatheria manteve-se a relação 23/131aa. Sugerimos que ZFX/ZFY de
Eutheria e Metatheria compartilham um único gene ancestral que se diferenciou em Eutheria, principalmente no ZFY, Assim,
propomos a seqüência nucleotídica ancestral do gene ZFX/ZFY para Eutheria/Metatheria. É necessário avaliar a hipótese da
duplicação e diferenciação do gene ancestral em Eutheria ou a transposição desse gene ancestral de autossomo (Metatheria)
para cromossomos sexuais (Eutheria). A evolução mais rápida do ZFY seria explicada ao efeito maior da deriva genética, já
que seu tamanho efetivo é reduzido (haplóide e uniparental), ou porque o ZFX sofre alta pressão seletiva (codificaria fatores
de transcrição de genes relacionados à características reprodutivas). O gene ZFY mostrou-se um bom marcador filogenético, e
o estudo da estrutura terciária desses polipeptídeos parece essencial no avanço dos conhecimentos da evolução desses genes.
Apoio Financeiro: FACITEC/ES, FAPES/ES, CNPq, CAPES, FAPESP e CEPF/Conservation International.
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Patterns and trends in barcoding brazilian atlantic
forest mammals
farro, APC1, Loss, AC1, Agrizzi, J1, Campello, LGB1, Santos, LC1, Zanchetta, LS1, Costa, LP1, Ditchfield, AD1,
Fagundes, V1, Leite, YLR1.
Laboratório de Mastozoologia e Biogeografia, Depto de Ciências Biológicas, CCHN, Universidade Federal do Espírito Santo (UFES).
[email protected]
1
Keywords: biodiversity; COI; DNA barcode; genetic diversity; Mammalia.
DNA barcode is a standard system for fast and accurate species identification based on short mitochondrial DNA
sequences. This method allows an efficient evaluation for high number of taxa, increasing our knowledge of existing
biodiversity. The Atlantic Forest is one of the top biodiversity hotspots, harboring about 260 mammal species, 70
of them endemic and 20 threatened with extinction. Our aim is to establish a DNA barcode library for the Atlantic
forest mammals using the citochrome c oxidase I (COI) gene. We have sequenced 229 specimens belonging to
69 species, 56 genera and 15 families. We selected 72 specimens of rodents, bats, and carnivores for comparative
analyses of sequence divergences. The averages differences among sequences were for Rodentia, Chiroptera, and
Carnivora were, respectively: 1.31%, 0.32%, 0.61% within species; 11.63%, 14.03%, 10.89% within genus; 21.6%, 21.26%,
21.1% within family. These data indicate a general trend toward significantly higher interspecific divergences when
compared to the intraspecific divergences, as observed in other studies using the same gene (the so-called “barcode
gap”). Rodents show higher genetic diversity within species, which could be explained considering their lower
dispersal ability, compared to bats and carnivores. In addition, rodent species usually occupy smaller geographic
ranges, and congeneric species often replace each other across geography. Besides detecting general patterns of
genetic divergences, this kind of molecular tool is helpful in identifying species from this highly diverse biome.
Apoio Financeiro: Fundação de Apoio à Ciência e Tecnologia do Espírito Santo (FAPES), Critical Ecosystem
Partnership Fund (CEPF), Fundo de Apoio Financeiro à Ciência e Tecnologia do Município de Vitória (FACITEC).
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Caracterização de “primers” taxon-específicos para
otimizar a amplificação da região denominada “DNA
barcode” em marsupiais neotropicais
Barban, JV1; Carmignotto, AP1; Lessinger, AC1
1Universidade Federal de São Carlos – campus Sorocaba
[email protected]
Palavras-chave: “DNA barcodes”, COI, marsupiais, “primers”, Cryptonanus
Estudos taxonômicos recentes baseados em evidências morfológicas e moleculares envolvendo espécies de
marsupiais que ocupam domínios abertos resultaram na delimitação do gênero Cryptonanus Voss et al., 2005
da família Didelphidae. A análise de espécimes oriundos da Argentina, Paraguai e Bolívia, propõe que o gênero
Cryptonanus seria constituído por cinco espécies (Cryptonanus agricolai, C. chacoensis, C. guahybae, C. ignitus e C.
unduaviensis), entretanto estudos mais amplos sobre a fauna brasileira de ambientes abertos, como nos biomas
Cerrado, Caatinga e Pantanal, sugerem que Cryptonanus agricolai pode representar um complexo de espécies.
Este cenário torna-se mais complicado quando a análise morfológica não é suficientemente informativa para o
diagnóstico preciso das espécies, o que torna a integração de dados moleculares uma abordagem estratégica. Com
relação à obtenção de marcadores moleculares, a análise de “DNA barcodes” tem sido amplamente utilizada para
promover a identificação de espécies e auxiliar a descrição de novas espécies a partir da análise de uma região
de ~650pb da extremidade 5’ do gene da subunidade I da Citocromo Oxidase (COI) do genoma mitocondrial.
Aliado aos esforços de identificação morfológica e caracterização de padrões de distribuição geográfica, pretendese caracterizar o potencial informativo da análise de “DNA barcodes” para esclarecer o status taxonômico das
espécies do gênero Cryptonanus. Com auxílio de ferramentas de bioinformática (http://amiga.cbmeg.unicamp.br),
“primers” universais descritos anteriormente (LCO1490 e HCO2198) foram localizados nas seqüências nucleotídicas
do gene COI das quatro espécies de Didelphidae com genoma mitocondrial completo descrito (Thylamys elegans,
Monodelphis domestica, Metachirus nudicaudatus e Didelphis virginiana). Com base na análise das divergências
entre estes “primers” e seus respectivos sítios de hibridação e no alinhamento das seqüências de COI destas
espécies, foram identificadas regiões conservadas úteis para orientar a seleção dos “primers” táxon-específicos
baseados principalmente nas seqüências de T. elegans e M. domestica, considerados filogeneticamente mais
próximos de Cryptonanus. A reação de PCR foi padronizada para as seguintes condições: 200mM de dNTPs, 3mM
de Mg+2, 1mM de cada “primer”, 1,25unid. de Taq DNA Polimerase e ~40ng de DNA de cada amostra. O programa
do termociclador inclui 35 ciclos com desnaturação a 94ºC por 1 min., uma etapa de hibridação de “primers” a
45ºC por 1 min. e extensão a 72ºC por 2 minutos, precedido por uma etapa inicial de desnaturação e finalizado
com uma etapa de extensão a 72ºC por 10min. Neste trabalho demonstramos que os “primers LCO1490mod e
HCO2288d recuperaram eficientemente um amplicon de ~800pb de 42 amostras de DNA, incluindo 33 amostras
de Cryptonanus, além de amostras de Gracilinanus agilis (7), Thylamys karimii (1) e Marmosops noctivagus (1). O
sequenciamento está sendo conduzido com a finalidade de avaliar o potencial informativo desta região em conferir
identidade taxonômica às espécies do gênero Cryptonanus.
Apoio financeiro: PIBIC/CNPq.
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Uso de DNA mitocondrial na diferenciação de espécies
crípticas e simpátricas de Monodelphis (Marsupialia:
Didelphidae)
Duda, RC1,2 & Costa, LP1
1
2
Laboratório de Mastozoologia e Biogeografia, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, ES
[email protected]
Palavras-chave: Monodelphis, citocromo b, sequenciamento, diferenciação específica, Espírito Santo.
O gênero Monodelphis é representado atualmente por cerca de 20 espécies e apresenta uma das maiores divergências
genéticas inter-específicas dentre os marsupiais didelfídeos. No sudeste do Espírito Santo há registros de ocorrência
de espécies de Monodelphis, todos apresentando listras negras dorsais. Entretanto, estudos recentes realizados na
Reserva Biológica de Duas Bocas, Cariacica, feitos com uma amostra de 50 espécimes, revelaram a formação de
dois morfogrupos a partir de dados qualitativos de crânio e pelagem, e a alocação dos mesmos em M. americana ou
M. iheringi com base na literatura. Visando verificar se há a existência de duas espécies de Monodelphis no Espírito
Santo, foi feito um estudo com sequências de 801 pb do gene mitocondrial citocromo b. Ainda, foram utilizadas
sequências adicionais de Monodelphis de outras espécies e localidades a título de comparação. A divergência
genética foi calculada com o uso do teste de Kimura 2-Parâmetros, e os métodos de análise empregados foram
a máxima parcimônia (MP) e a máxima verossimilhança (MV), com o suporte para os clados dado por meio
de bootstrap. Dentre a amostra obtida, quarenta e seis sequências foram designadas como M. americana, e a
divergência genética intra-específica obtida foi de 0.01%. As demais quatro amostras, designadas como M. iheringi,
exibiram variação intra-específica de 0.02%. A divergência entre os dois morfogrupos identificados é relativamente
alta, alcançando um total de 10%. Entretanto, nas análises de MP e MV, houve ambiguidade em relação à formação
de clados-irmãos. Levando-se em consideração a dificuldade na distinção morfológica entre as catitas de listras, os
dados genéticos foram essenciais ao adicionar informações relevantes para a diferenciação específica no gênero.
Esse auxílio corroborou os dados morfológicos previamente obtidos e indica a provável existência de duas espécies
no sudeste do Estado.
Apoio financeiro: FACITEC/ES, FAPES/ES, CEPF/Conservation International.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Relações Filogenéticas e Biogeografia do gênero
Monodelphis Burnett, 1830 (Didelphimorphia:
Didelphidae) com ênfase no domínio da Floresta
Atlântica
Vilela, JF1,2,3; Oliveira, JA3; Russo, CAM2
Programa de Pós Graduação em Genética – IB – UFRJ
Laboratório de Biodiversidade Molecular – Depto. Genética – IB – UFRJ
Setor de Mastozoologia – Depto. de Vertebrados – Museu Nacional – UFRJ
[email protected]
Palavras-chave: sistemática, didelphidae, filogenia molecular, tempo de divergência, morfometria
Monodelphis é o mais diverso gênero de didelfídeos no Novo Mundo, com distribuição desde o Panamá até a
Argentina, ocorrendo nas florestas dos Andes, da Amazônia e da Floresta Atlântica, podendo ser encontrado
também no Cerrado, Caatinga e Chaco. Apesar de sua ampla distribuição e do número elevado de espécies
reconhecidas (20), este é um gênero pouco conhecido em se tratando dos limites de espécies, particularmente na
Floresta Atlântica que abriga cerca de 10 espécies. Com base em estudos moleculares (genes citocromo b e GHR) e
morfológicos (padrões de coloração e morfometria craniana) pretende-se: 1) identificar e definir unidades evolutivas
distintas no gênero Monodelphis no domínio da Floresta Atlântica através das análises moleculares; 2) definir os
limites morfológicos e geográficos entre estas unidades; 3) relacionar essas unidades aos nomes disponíveis; 4)
propor uma hipótese de relacionamento filogenético para as espécies do gênero, finalmente, 5) correlacionar as
cladogêneses e as estimativas de tempo de divergência, com eventos geoclimáticos possivelmente envolvidos
na evolução das fitofisionomias da Floresta Atlântica. As análises moleculares até o momento foram baseadas
nas sequências de citocromo b, e incluem estimativa das distâncias genéticas, Neighbor-Joining, Parcimônia e
Verossimilhança máximas além de inferência Bayesiana. Resultados preliminares das análises moleculares de 13
espécies de Monodelphis permitiram o reconhecimento de ao menos cinco espécies relacionadas com a Floresta
Atlântica: M. kunsi, M. scalops, M. americana, M. iheringi e M. dimidiata. As relações filogenéticas recuperadas por
verossimilhança e parcimônia máximas e inferência bayesiana foram parcialmente congruentes possivelmente
devido ao fraco suporte de alguns ramos ocasionado pela presença de sequências incompletas. Não foi possível
recuperar a monofilia para o grupo formado por estas cinco unidades “Floresta Atlântica” sugerindo mais de
um evento de colonização do bioma. Análises morfométricas multivariadas (variáveis canônicas) realizadas
com indivíduos de M. dimidiata mostraram a formação de dois grupos: um composto por formas associadas a
localidades de topos de serra (Itatiaia – RJ, Urubici – SC e Cambará do Sul – RS) e outro formado por indivíduos
de localidades menos elevadas (municípios de Boa Vista da Aparecida, Fênix e Três Barras do Paraná– PR). Estes
resultados reforçam o padrão encontrado para alguns gêneros de roedores sigmodontíneos endêmicos da Floresta
Atlântica como Brucepattersonius, Delomys e Juliomys.
Apoio Financeiro: CNPq
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Diversidade haplotípica de Dasypus novemcinctus
(Cingulata)
Costa, JF1; Fraga E1; Schneider, H2; Barros, MC1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular - CESC/UEMA, Caxias – MA,
Instituto de Estudos Costeiros/UFPA Bragança PA
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Cingulata, Haplótipos, Dasypus novemcinctus, Citocromo B, Meio-Norte
Os tatus a pertencem à ordem Cingulata e estão incluídos na superordem Xenarthra, à qual pertencem também
as preguiças e os tamanduás, membros da ordem Pilosa, sendo restritos à região Neotropical e ocorrem
predominantemente na América do Sul. D. novemcinctus, é conhecido popularmente como tatu-galinha, tatuverdadeiro, tatu-preto. A espécie mede cerca de 50 cm e pesa em média 4 kg, sua carapaça é lisa, brilhante e de
coloração marrom, com faixas mais claras, a cabeça é alongada, as orelhas grandes e cauda comprida, apresenta
uma grande distribuição, ocorrendo na América do Sul com ampla distribuição no Brasil e sul dos Estados
Unidos. Estudos de análises genéticas para esta espécie são bastante incipiente o que justifica estudos de análises
populacionais ou filogenéticas que venham a corroborar as propostas tradicionais de taxonomia o objetivo deste
trabalho. A presente análise molecular envolveu representantes de D. novemcinctus de uma ampla área geográfica
do Brasil (estados do Maranhão, Piauí e Pará - região Meio-Norte) a extração de DNA foi realizada a partir do tecido
muscular, utilizando-se o protocolo de fenol-clorofórmio. A amplificação do gene codificador da citocromo b do
genoma mitocondrial foi realizada via PCR e seqüenciado usando-se o método didesoxiterminal com o Kit Big Dye.
Foram seqüenciados 458 pb do gene codificador da citocromo b do genoma mitocondrial para 23 espécimes. As
seqüências foram editadas e alinhadas no programa Bioedit 5.0.9. O Dambe 5.0.32 mostrou a ausência de saturação;
DnaSP 4.0 e Mega 4.0. foram usados para estimar as diversidades haplotípicas e nucleotídicas, divergência e
reconstrução filogenética. Foram incorporadas ao nosso banco de dados seqüências do Genbank (AF493815 AF493839; DQ243718PA; NC001821; Y11832). Para as 45 seqüências analisadas foram encontrados 54 sítios
polimórficos, 29 haplótipos, diversidades haplotípica de 0,9172 e nucleotídica de 0,01127. Quando foi considerada
apenas a população brasileira foram encontrados 22 sítios polimórficos, 12 haplótipos, diversidade haplotípica (h)
de 0,75720 e nucleotídica de 0,00576. A divergência nucleotídica variou de zero a 2,2% para as amostras do Brasil,
enquanto as amostras do Paraguai de zero a 1,1%. No entanto verificou-se uma divergência máxima de 6,9% para
o grupo. A magnitude das diversidades somada a divergência indicam diferenças entre as populações analisadas.
Estudo desta natureza com maior representação amostral poderá apontar para uma origem de dispersão desta
espécie.
Apoio financeiro: UEMA/UFPA
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Caracterização citogenética de Carollia perspicillata
(Chiroptera phyllostomidae) procedente de um
fragmento de Mata Atlântica do estado do Espírito Santo
moreira, VM1; Selvatici, LS1; Boa, MQ1; Santos, AB1; Ditchfield, AD2; Pagnozzi, JM1.
1. Faculdade Salesiana de Vitória, FSV.
2. Universidade Federal do Espírito Santo, UFES.
[email protected]
Palavras-chave: citogenética, chiroptera, Ag-RON, banda CBG, Carollia perspicillata.
A Mata Atlântica do Estado do Espírito Santo sofreu desde a época colonial uma redução de 90% de sua área
original, apresentando atualmente remanescentes altamente fragmentados. Foram coletados exemplares de
Carollia perspicillata (2 machos e 2 fêmeas) em um fragmento urbano de Mata Atântica localizado no Parque
Estadual da Fonte Grande - PEFG, Vitória (ES). Os indivíduos foram coletados utilizando-se redes de neblina, e
as preparações cromossômicas foram obtidas a partir de medula óssea ou baço, após injeção sub-cutânea in vivo
de colchicina. As lâminas foram submetidas às técnicas de coloração convencional com Giemsa, de Banda C com
hidróxido de bário, e das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs) com nitrato de prata. A espécie apresentou
2n=20/21, XX/XY1Y2 e NF=36. O cariótipo possui 9 pares autossômicos meta/submetacêntricos, o cromossomo X
é submetacêntrico médio, e o cromossomo Y1 é puntiforme e o Y2 acrocêntrico médio. O padrão de banda CBG
obtido, indica a presença de heterocromatina constitutiva na região pericentromérica de todos os autossomos. Nos
cromossomos do par 1 foi detectado também uma banda heterocromática na região intersticial do braço curto.
O cromossomo X apresentou uma banda heterocromática tênue na região pericentromérica. Os cromossomos
Y1 e Y2 não apresentaram bandas conspícuas de heterocromatina constitutiva. A coloração com nitrato de prata,
permitiu a localização de RONs na região intersticial do braço longo do cromossomo X. As fêmeas estudados
apresentaram duas RONs em 116 metáfases analisadas e apenas uma RON ativa em 14 metáfases. Os machos
apresentaram apenas uma RON localizada no único cromossomo X presente em 95% das metáfases observadas.
Apesar dos estudos citogenéticos de morcegos brasileiros serem abundantes, não são encontrados na literatura
dados citogenéticos de espécies de morcegos coletados no estado do Espírito Santo.
Apoio financeiro: FSV, FACITEC e FAPES.
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Avaliação molecular das populações de Artibeus
obscurus (Chiroptera, Mammalia) da Amazônia
Ferreira, WAS1; Rodrigues, S1; Andrade, FA2; Marques-Aguiar, S2; Silva Jr, JS2; Anselmo, NP1; Harada, ML1
Laboratório de Biologia Molecular Mauro Salzano, Instituto de Ciências Biológicas, UFPA.2Museu Paraense Emílio Goeldi.
[email protected]
1
Palavras-chave: Chiroptera, Citocromo b, filogenia molecular, Artibeus obscurus.
A família Phyllostomideae possui a maior diversidade de espécies dentre os mamíferos em termos de morfologia
e estratégias alimentares, sendo a família mais estudada dentre os morcegos. A espécie Artibeus obscurus
(Phyllostomideae: Stenodermatinae), endêmica à América do Sul, ocorre na Venezuela, Colômbia, Guianas,
Equador, Bolívia, Peru e Brasil, onde é encontrada em pelo menos 18 estados. Possui hábitos frugívoros, embora
sejam escassos os registros na literatura de sua dieta, assim como sobre suas estratégias reprodutivas. Esta espécie
está associada à ambientes úmidos e florestas primárias, além de ser observada em pequenas áreas urbanas. Este
trabalho teve como objetivo avaliar as relações filogenéticas de Artibeus obscurus de diferentes localidades do estado
do Pará e do estado do Amazonas baseadas nas seqüências do gene mitocondrial da Citocromo b. As sequências
foram alinhadas no programa BioEdit Sequence Aligment Editor e posteriormente analisadas no programa
PAUP*4.0b10, pelo método de máxima parcimônia, com 1.000 réplicas de bootstrap. As análises haplotípicas foram
realizadas no programa DnaSP 4.0. As análises resultaram em um arranjo filogenético que apóiam a monofilia
da espécie. Os valores de divergência nucleotídica e de booststrap sugerem a formação de pelos menos quatro
filogrupos. Dois destes são formados pelas amostras da região de Bragança, um por amostras da RDS Amanã e
um por aquelas de São Geraldo do Araguaia. Os resultados das análises haplotípicas sugerem o compartilhamento
de haplótipos entre algumas localidades analisadas, justificado pela grande capacidade de vôo do gênero. Estes
dados revelam considerável heterogeneidade de A.obscurus, sugerindo a existência de subespécies, concordando,
portanto, com a literatura. No entanto, é necessário aumentar o número amostral para melhor esclarecimento das
relações intra específicas.
Apoio Financeiro: FAPESPA E CNPq.
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Caracterização citogenética de duas espécies da
família Phyllostomidae e uma espécie da família
Noctilionidae (Chiroptera) procedente de um fragmento
de Mata Atlântica do estado do Espírito Santo
Boa, MQ1; Moreira, VM1; Selvatici, LS1; Ditchfield, AD2; Pagnozzi, JM1
1. Faculdade Salesiana de Vitória, FSV. 2. Universidade Federal do Espírito Santo, UFES.
[email protected]
Palavras-chave: citogenética, chiroptera, Ag-RON, Phyllostomidae, Noctilionidae.
A Mata Atlântica está entre os três hotspots mais importantes do planeta e, apresenta-se atualmente no Espírito
Santo em remanescentes altamente fragmentados. Foram estudados citogeneticamente 4 exemplares da família
Phyllostomidae, Lonchorhina aurita (1 macho e 1 fêmea) e Glossophaga soricina (2 machos); e um exemplar da família
Noctilionidae, Noctilio leporinus (1 macho) de um fragmento urbano de Mata Atlântica em estágio sucessional de
mata secundária localizado no Parque Estadual da Fonte Grande, Vitória (ES). Os indivíduos foram coletados
utilizando-se redes de neblina, e as preparações cromossômicas foram obtidas a partir de medula óssea ou baço, após
injeção sub-cutânea in vivo de colchicina. Foram empregadas as técnicas de coloração convencional com Giemsa
e das Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs) com nitrato de prata. A espécie Lonchorhina aurita apresentou
2n=32, XX/XY e NF=60. O cariótipo é composto por 15 pares autossômicos meta/submetacêntricos, cromossomo
X metacêntrico médio e o Y puntiforme. A coloração com nitrato de prata, permitiu a identificação da atividade
de genes ribossomais ativos na região intersticial do par 15. A espécie Glossophaga soricina apresentou 2n=32,
XY e NF=60, sendo todos os 15 pares autossômicos meta/submetacêntricos, o cromossomo X submetacêntrico
médio e o Y puntiforme. A coloração com nitrato de prata revelou marcação na região intersticial do cromossomo
15 coincidente com a constrição secundária observada no par 15 de cariótipos estudados em coloração
convencional. A espécie Noctilio leporinus apresentou 2n=34, XY e NF=62. O cariótipo é formado por 15 pares de
cromossomos autossomos meta/submetacêntricos e um par autossômico acrocêntrico menor. O cromossomo X é
submetacêntrico médio e o Y acrocêntrico pequeno. A coloração com nitrato de prata revelou marcação na região
intersticial do braço curto no par 12. A posição da Ag-RON é coincidente com a constrição secundária observada
no par 12 dos cariótipos estudados em coloração convencional. Os resultados obtidos para Glossophaga soricina,
quando comparados aos descritos na literatura, indicam haver ocorrência de variação geográfica para esta espécie.
Nenhum artigo científico foi publicado até então com dados citogenéticos para Lonchorhina aurita coletados
no Brasil. Uma comparação dos exemplares de Lonchorhina aurita do Município de Vitória entre exemplares do
Brasil (dissertação de mestrado) e de Trinidade e Suriname indica variação intraespecífica quanto à morfologia do
cromossomo X. Os dados obtidos para o espécime de Noctilio leporinus estão de acordo com os dos exemplares
de Trinidade e diferem no NF de exemplares do Brasil (NF=62). Essa diferença pode ser devido à dificuldade na
classificação de alguns cromossomos. Dados de Ag-RON em metáfases de Noctilio leporinus nunca foram descritos
na literatura. Não são encontrados na literatura dados citogenéticos de espécies de morcegos coletados no estado
do Espírito Santo.
Apoio financeiro: FSV, FACITEC e FAPES.
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Diversidade genética em seis espécies de felinos
Grisolia, AB1; Moreno-Cotulio, VR2; Aoki, SM3; Garcia, JF4; Souza, EB5
¹Faculdade de Ciências Biológicas e Ambientais/UFGD – Dourados – MS
2
Universidade Federal de Alfenas - UNIFAL - MG
3
DNAPTA Biotecnologia Ltda - São José do Rio Preto-SP
4
Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal/LBBMA - UNESP - Araçatuba – SP
5
Departamento de Ciências Biológicas – Faculdade de Ciências e Letras, UNESP/Assis – SP
[email protected]
Palavras-chave: microssatélites, PIC, heterozigosidade, árvores filogenéticas, Felidae
Microssatélites, devido ao seu alto nível de polimorfismo, são marcadores moleculares úteis no mapeamento de
genes e estudos de populações. A utilização desses marcadores oferece a oportunidade de determinar a variabilidade
e a relação filogenética de populações selvagens ou cativas. O objetivo do presente estudo foi comparar a diversidade
genética e realizar análises nas relações filogenéticas em seis espécies cativas de felinos. Amostras de sangue das
espécies de felinos (Puma concolor N=18, Puma yagouarondi N=36, Panthera onca N=39, Leopardus pardalis N=64,
Leopardus wiedii N=23 e Leopardus tigrinus N=47), foram coletadas em diferentes cativeiros. Para a realização
das análises foram utilizados 4 marcadores microssatélites (FCA08, FCA45, FCA77 e FCA96). Após a realização
de PCR, as amostras foram submetidas a eletroforese capilar em ABI PRIM 310 e os resultados da eletroforese
capilar (variação alélica) foram analisados em Programa CERVUS. As árvores filogenéticas foram construídas das
matrizes de distância utilizando algorítimo neighbour-joining no programa PHYLIP. Para cada espécie e cada locus
microssatélite foi determinado o número de alelos, a heterozigosidade e o PIC (do inglês, Polymorphic Information
Content) e posteriormente realizadas as comparações. Os animais que apresentaram maior e menor valor de
PIC, respectivamente foram Leopardus wiedii (0,85) e Panthera onca (0,59). As árvores filogenéticas dos felinos
estudados revelaram agrupamentos entre as espécies do gênero Leopardus e outros de gêneros Puma e Panthera.
Embora essas espécies estejam em cativeiro, notou-se a existência de variabilidade genética. Análises moleculares
da diversidade genética e relação filogenética podem fornecer informações importantes nas técnicas utilizadas em
o manejo de espécies ameaçadas.
Apoio Financeiro: CAPES
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Cytogenetic studies on natural transmissible venereal
tumour in dogs (Canis familiaris)
Mota, LSLS1; Bassani-Silva, S2; Santiloni, V1; Fonseca, LS2; Rocha, NS2
Department of Genetics, Instituto de Biociências de Botucatu – UNESP, Brazil. 2 Department of Veterinary Clinics, Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia de Botucatu – UNESP, Brazil.
[email protected]
1
Keywords: karyotype, TVT, centric fusion, neoplasia, chromosomal banding
Transmissible venereal tumour (TVT) is a round-cell neoplasia that has awakened great interest in oncology
researchers due to its diverse characteristics, including its controversial origin; furthermore, it constitutes an
excellent investigative model for comparative neoplasia. In completed studies at FMVZ-UNESP, plasmocytoid
TVTs shown to be more aggressive than lymphocytoid ones. This study aimed to analyze cytogenetically TVTs of
plasmocytoid and lymphocytoid morphology. For this, 30 dogs attended at the Veterinary Hospital of the School
of Veterinary Medicine and Animal Husbandry (FMVZ-UNESP, campus at Botucatu) were utilized. The C and
G chromosomal banding techniques as well as conventional Giemsa staining were realized in TVT cells and in
samples of peripheral blood. Due to the low incidence of lymphocytoid TVT (5.91%) in the region, it was not possible
to make correlations between plasmocytoid and lymphocytoid types. In the analysis of metaphases obtained from
peripheral blood culture, normal diploid number (2n=78) were observed in the species. In 74.78% of the tumour
cells analysed 56 to 58 chromosomes were found, which presented, on average, 17 chromosomes of metacentric or
submetacentric morphology. The diploid number in tumor cells varied widely in relation to the normal chromosome
number for the species. It is suggested that centric fusions of acrocentric elements contributed to the numeric
increase of metacentric and submetacentric elements in TVT cells. Based on the analysis of metaphases obtained
from peripheral blood samples of canine TVT carriers as well as from their tumour samples, it can be verified that
the alterations found in the karyotype are limited to those around the tumour itself. The similarity of karyotypes
in canine TVTs in different countries indicates the stability of chromosomal alterations in these cells. Due to the
literature citations that, in most instances, report that the typical morphology of tumours is similar to that of the
lymphocytoid and given the similarity between these citations and the findings in the present study (where there
was predominance of the plasmocytoid pattern), it is suggested that there is a chromosomal difference between
the two TVT cell types.
Financial support: FAPESP.
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New genetic polymorphisms of CYP2D15 gene in wild
native canids species from Brazil
Rodriguez, MC¹; Uehara, CJS²; Mattos, BC3; Locatelli-Dittrich, R3; Cavalli, IJ¹; Ribeiro, EMF¹
¹Laboratório de Citogenética Humana e Oncogenética – Depto de Genética. 2Laboratório de Imunogenética e histocompatibolidade
- Depto de Genética. 3Laboratório de Patologia Clínica Veterinária– Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, UFPR.
[email protected]
Keywords: CYP2D, sequencing, wild canids, polymorphisms and amino acids
CYP2D15 is the ortholog of human CYP2D6, the most notable polymorphic CYP in humans. The P4502D (CYP2D)
subfamily plays an important role in the metabolism of over 30 clinically used drugs. Little is known about this
gene in wild canids. The objective of this study was to characterize CYP2D polymorphisms in captive wild canids
(crab-eating dogs, pampas foxes and bush dogs, respectively: Cerdocyon thous, Lycalopex gymnocercus and Speothos
venaticus) from several Brazilian states (PR, SC, RJ and DF). DNA was extracted from blood samples by salting out
method. The exons 6 and 7 were screened for single nucleotide polymorphisms (SNPs) using DNA sequencing in an
ABI Prism 3130 Avant Automatic Sequencer with ABI Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit and analyzed with
the software SeqScape v2.5. The gene primer sequence design was based on the female boxer genome sequence
using OligoAnalyzer 3.0 software. Three SNPs were found, two new resulting in a synonymous and a nonsynonymous
substitutions, and another synonymous already documented in Canis familiaris. The synonymous SNP in exon
6 of the CYP2D15 gene was identified in Speothos venaticus and Lycalopex gymnocercus, 703G>A. The Exon 7 of
the CYP2D15 gene presented two SNPs, one synonymous, 883G>A in Cerdocyon thous and Lycalopex gymnocercus
already documented in 1999 in beagle dogs and a new nonsynonymous SNP in Speothos venaticus, 883G>C that
results in a V307L amino acid substitution. The genome from Canis familiaris showed to be useful for the CYP2D15
gene primer sequence design in Cerdocyon thous, Lycalopex gymnocercus and Speothos venaticus. Possible clinical
implications of the SNP identified in this study must be searched since the alteration in amino acid sequence may
alter the metabolism of compounds detoxified by these pathways, and there is a possible risk of adverse reactions
when treating both captive and free-ranging animals.
Financial Support: CAPES and CNPq.
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173
Comparação entre alguns citótipos de Mazama
americana (Artiodactyla; Cervidae): quão grande é a
diferença entre eles?
Sarria-Perea, JA; Duarte JMB
Núcleo de Pesquisa e Conservação de Cervídeos (NUPECCE), Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), Universidade
Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP).
Endereço: Via de acesso Professor Paulo Donato Castellane s/n. Jaboticabal (SP)-Brazil. CEP 14884-900.
Telefone: (55) 16 3209 2678, fax: (55) 16 3209 2684/2685
[email protected]
Palavras-chave: Mazama americana, Cervidae, evolução cromossômica, polimorfismo cromossômico, rearranjos cromossômicos,
cromossomos sexuais
O veado-mateiro Mazama americana (Artiodactyla; Cervidae) possui uma extensa variabilidade cariotípica, tendo
sido descritas na literatura variantes que vão de 2n=42+3B até 2n=68. No Brasil foram identificados sete citótipos:
Rondônia (2n=42/45), Manaus (2n=43/44), Alto Rio Negro (2n=44), Acre (2n=46/47), Norte do Pará (48/50), Carajás
(2n=48/51) e Paraná (2n=51-53). Isto denota um processo intenso de evolução cariotípica no grupo, além da
existência muito provável de várias espécies dentro dos veados-mateiro. O presente trabalho objetivou comparar
citogeneticamente três citótipos: Paraná, Rondônia e Carajás. Para tal fim, foram analisados os cariótipos de dois
machos e duas fêmeas do citótipo Paraná, um macho e uma fêmea do citótipo Rondônia e quatro machos e quatro
fêmeas do citótipo Carajás, pelas técnicas de bandas G, C e RON. Os resultados indicam que os três citótipos
compartilham duas características comuns: um sistema de cromossomos sexuais do tipo XX/XY1Y2 envolvendo
a fusão X-autossômica e quatro grandes cromossomos, produtos de sucessivas fusões em tandem. Pela análise
comparativa deduziu-se que o citótipo Paraná é o mais próximo do ancestral comum, porque apresentou o maior
2n dos três citótipos e todas as suas unidades cromossômicas estão representadas nos cariótipos dos outros dois
citótipos. Em contraste, os citótipos Carajás e Rondônia, os que ocupam a região amazônica, têm acumulado
distintos rearranjos cromossômicos de maneira independente, levando a conformações cromossômicas bem
diferenciadas. O citótipo Carajás, ao leste da Amazônia, difere do citótipo Paraná em apenas uma fusão em tandem
que originou um novo grande elemento. Em contraste, o citótipo Rondônia, ao oeste da Amazônia, possui dois
grandes cromossomos exclusivos, produto de sucessivas fusões em tandem e uma translocação Robertsoniana e
difere do citótipo Paraná em cinco pares cromossômicos. Estes resultados mostram a existência de duas linhagens
evolutivas independentes nesta espécie, uma que reúne os citótipos Paraná e Carajás e outra o citótipo Rondônia.
Isto é de grande importância para a conservação dos veados-mateiro no Brasil, uma vez que sugere a existência de
mais espécies, que hoje seriam consideradas como M. americana. Esforço extra deve ser realizado no sentido de
descrever adequadamente cada uma dessas variantes e avaliar o grau de ameaça que cada uma sofre.
Agradecimentos: CNPq, IUCN Deer Specialist Group/Wildife Trust Small Grants Program, Companhia Vale do Rio
Doce, IBAMA
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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174
Evolução cariotípica no veado-mateiro (Mazama
americana): Dados de citogenética clássica e
molecular.
Abril, VV1, 2; de Oliveira, EHC3; Duarte, JMB2
1 Núcleo de Pesquisa e Conservação de Cervídeos (NUPECCE), Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), Universidade
Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP), Jaboticabal - SP;
2 Programa de Pós-graduação em Genética e Melhoramento Animal, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV), Universidade
Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP), Jaboticabal - SP. [email protected];
3 Laboratório de Citogenética, Universiade Federal do Pará (UFPA), Belém – PA.
Palavras-chave: Mazama americana, Cervidae, evolução cromossômica, bandeamentos, hibridização in situ fluorescente.
A citogenética tem sido indicada como uma importante ferramenta no estudo taxonômico da família Cervidae. Os
cervídeos neotropicais são pouco estudados cromossomicamente e os poucos trabalhos se restringem às análises
baseadas em citogenética clássica. Atualmente, a citogenética molecular tem se mostrado uma importante
ferramenta para o estudo citotaxonomico e comparação genômica ao nível cromossômico. A evolução cariotípica
de Mazama americana no Brasil gerou grandes diferenças cromossômicas entre populações (2n=42/43 com NF=46
até 2n=52/53 com NF=56) e estas variantes populacionais são classificadas como citótipos. Neste trabalho, as
técnicas de citogenética clássica e molecular foram utilizadas conjuntamente buscando entender o processo
de evolução cromossômica que levou à diferenciação dos citótipos. Para isto, as regiões heterocromáticas e as
seqüências teloméricas (TTAGGG)n foram analisadas nos cromossomos de M. americana através do bandeamento
C e da hibridização in situ fluorescente (FISH), respectivamente. Além disto, experimentos de hibridização com
algumas sondas cromossômicas de M. gouazoubira, cariótipo mais basal dos cervídeos com 2n=70 e NF=70, foram
realizados buscando entender a evolução cromossômica da espécie. Blocos de heterocromatina pericentromérica
foram encontrados em todos os cromossomos enquanto bandas intersticiais foram detectadas apenas nos grandes
cromossomos (grupos A e D). Os sinais teloméricos foram detectados nos cromossomos autossômicos, sexuais e
cromossomos B, não só nas extremidades de todos os cromossomos, mas também em regiões intersticiais dos
maiores autossomos dos grupos A e D. As diferenças entre os citótipos analisados por bandeamento C e FISH
telomérica corroboram as informações sobre a origem dos maiores cromossomos principalmente por meio de
fusões em tandem. O uso das sondas dos cromossomos sexuais de M. gouazoubira em M. americana comprovou
a existência do sistema sexual múltiplo (XY1Y2). A hibridização das sondas dos cromossomos B mostrou que
provavelmente estes cromossomos sejam constituídos de seqüências repetitivas nas duas espécies e, por fim,
a hibridização de duas sondas de cromossomos autossômicos de M. gouazoubira em parte do braço longo de
autossomos de M. americana corroboraram a teoria de que os cromossomos se organizaram a partir do cariótipo
ancestral através de fusões.
Apoio: FAPESP, CAPES, CNPq
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Comparação de dois métodos de extração de DNA
fecal em cervídeos
Souza, JN1; Peres, PHF1; Mantellatto, AMB1; Oliveira, ML1; Duarte, JMB1
Núcleo de Pesquisa e Conservação de Cervídeos – Depto de Zootecnia. Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP
[email protected]
1
Palavras-chave: DNA Fecal, Extração, Sílica, Cervidae, QIAmp® DNA Stool Mini Kit
Entre metodologias não invasivas para o estudo de espécies crípticas e/ou ameaçadas de extinção, o uso do DNA
fecal tem se mostrado bastante promissor. Uma etapa chave para esta metodologia é a extração do DNA advindo
das fezes, uma vez que nelas estão presentes inúmeros inibidores que dificultam a PCR e uma pequena quantidade
de DNA, que pode estar degradado. A grande maioria dos trabalhos publicados utiliza, para esta etapa, um Kit
comercial (QIAmp® DNA Stool Mini Kit, Qiagen), que apresenta o custo aproximado no Brasil de U$ 4,70 por
amostra. Uma alternativa de baixo custo (U$2,00/amostra) seria a utilização de um protocolo baseado em sílica
(BOOM et al. Journal of Clinical Microbiology, v. 28, n.3, p. 495-503, 1990). O presente trabalho comparou o sucesso
de amplificação de um loco microssatélite de 230pb (GT)21 em 20 amostras fecais advindas de três diferentes
espécies de cervídeos: Blastocerus dichotomus (n=10), Mazama americana (n=5) e Ozotocerus bezoarticus (n=5).
As amostras possuíam idades variadas e foram conservadas em etanol absoluto (n=15) ou por congelamento a
-20o C (n=5). Foram realizadas reações de polimerase em cadeia com o iniciador RT30 (já testado anteriormente
para as espécies desse estudo); o resultado foi corado com GelRedTM (Biotium), submetido à eletroforese em gel
de agarose 2% e visualizado e fotodocumentado sob transiluminador com luz ultravioleta. Obteve-se um sucesso
na amplificação de 94% e 85% para as amostras extraídas com sílica e kit comercial, respectivamente. Apesar dos
resultados das amplificações serem próximos, levando em consideração o custo do kit comercial, o método da
sílica mostrou-se mais vantajoso para análises de DNA fecal em cervídeos.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq
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Método de seleção de iniciadores de marcadores
microssatélites de diversos artiodactyla para as
espécies brasileiras de Mazama
Mantellato, AMB, Duarte, JMB
Departamento de Zootecnia – Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Câmpus de Jaboticabal.
[email protected]
Palavras-chave: microssatélites, primers heterólogos, Mazama.
As populações de cervídeos sul-americanos estão em acentuado declínio, efeito direto da fragmentação de suas áreas
de ocorrência. Esta condição tem levado à queda na variabilidade genética, tornando-os ainda mais susceptíveis
às mudanças ambientais. Para detecção das flutuações da variabilidade genética, os locos microssatélites têm
sido prioritariamente utilizados. O fator limitante para sua utilização em larga escala é o trabalhoso e alto custo
de desenvolvimento de iniciadores para cada espécie de interesse. Porém, observa-se a conservação de sítios de
hibridação de iniciadores para locos de microssatélite em espécies filogeneticamente próximas, o que permite
empregar iniciadores desenvolvidos para uma determinada espécie em outras relacionadas. Devido à ampla
variedade de locos microssatélite descritos na literatura para Artiodactylas, foi desenvolvido um método para a
escolha de marcadores que identificassem regiões homólogas para as cinco espécies brasileiras de cervídeos do
gênero Mazama, que ainda não possuem iniciadores descritos. O método foi fundamentado na análise de seis
critérios: a.Número de alelos (média do número de alelos encontrados nas diferentes espécies de cervídeos a
partir de publicações em que o iniciador foi utilizado); b.Distância evolutiva com a espécie original (número de
milhões de anos de divergência da espécie para a qual o iniciador foi descrito para com a espécie em que o iniciador
será testado, sendo o mínimo de 1 milhão para esse tempo de divergência); c.Número de espécies de cervídeos
em que o primer a ser utilizado apresentou transferabilidade (quantidade de espécies que amplificaram a região
microssatélite a partir do iniciador em questão); d.Distância evolutiva com a espécie mais próxima (número de
milhões de anos de divergência da espécie mais próxima em que o iniciador foi utilizado com sucesso para com a
espécie em que o iniciador será testado, sendo o mínimo de 1 milhão para esse tempo de divergência); e.Estrutura
de repetição do microssatélite (microssatélites com estrutura de repetição simples apresentam vantagens em
relação aos outros tipos de estruturas de repetição – composta e interrompida); f.Ano de publicação do trabalho
(iniciadores descritos em trabalhos mais antigos foram, em geral, testados em um maior número de espécies do que
aqueles recém publicados). Os iniciadores receberam uma nota para cada critério, que foram somadas chegandose a uma nota final. Os quinze iniciadores classificados com as maiores notas foram considerados potencialmente
indicados para a aplicação nas espécies brasileiras de Mazama e foram testados. Através da visualização em gel
de agarose 2% foi possível verificar a amplificação da região microssatélite esperada de quatorze iniciadores
heterólogos selecionados, demonstrando que o método de seleção proporciona alta probabilidade de encontro de
regiões homólogas em espécies distintas. A comprovação da homologia foi realizada por meio do sequenciamento
das regiões amplificadas, corroborando a conservação do microssatélite da espécie para a qual foi desenvolvido.
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Polimorfismos mitocondriais com potencial de
utilização na análise forense visando o combate à caça
do peixe boi no Brasil
Ferreira, PB1; Torres, RA2; Garcia, JE3
1. Programa de Mestrado em Saúde Humana e Meio Ambiente, Centro Acadêmico de Vitória – UFPE, Vitória de Santo Antão.
2. Laboratório de Genômica Evolutiva e Ambiental – Depto de Zoologia. Centro de Ciências Biológicas – UFPE, Recife.
3. Núcleo de Biologia, Centro Acadêmico de Vitória – UFPE, Vitória de Santo Antão.
[email protected]
Palavras-chave: Trichechus inunguis, Trichechus manatus, caça predatória, Citocromo b.
Duas espécies de peixes-boi são encontradas no Brasil: Trichechus inunguis (amazônico) e Trichechus manatus
(marinho) e ambas são classificadas como “vulneráveis’’ à extinção segundo a IUCN. Tal patamar de ameaça tem
a caça como uma de suas principais causas. O objetivo deste trabalho foi o reconhecimento de polimorfismos
no gene mitocondrial citocromo b capazes de diagnosticar amostras de material biológico dos peixes-boi
brasileiros. Para tanto, seqüências parciais e completas de citocromo b dos peixes-boi e aquelas provenientes de
animais domésticos (bovino, suíno, caprino e ovino), foram recuperadas no GenBank e analisadas pelos pacotes
computacionais Sequencher 4.9 (Gene Codes) e BioEdit 6.0.7, para a eliminação das sequências redundantes e
detecção dos polimorfismos. Sítios de restrição discriminantes foram identificados pelo programa CLEAVER. O
banco de dados foi formado com fragmentos de 615pb, a partir de quatro sequências polimórficas de T. inunguis,
cinco de T. manatus e sete das espécies domésticas. Os alinhamentos demonstraram a ocorrência de 8 sítios
polimórficos capazes de distinguir as espécies de peixes-boi daquelas domésticas. Quatro outros sítios polimórficos
foram capazes de diferenciar ambas as espécies de peixe-boi. Todas as variações nucleotídicas identificadas estão
associadas à criação de sítios de restrição, o que faz com que esses polimorfismos possam ser utilizados para o
diagnóstico rápido baseado na digestão de produtos de PCR (PCR/RFLP). Espera-se, a partir desses resultados
poder prover às autoridades brasileiras um conjunto de marcadores moleculares diagnósticos úteis no combate à
caça predatória dos peixes-boi.
Apoio Financeiro: FACEPE (APQ-0402-2.01/08) e CNPq.
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178
Polimorfismo na região D-Loop do DNA mitocondrial de
suínos e qualidade da carne
Cesar, ASMI; Silveira, ACPI; de Freitas, PFAI; Meirelles, FVII; Balieiro, JII; Vieira, GI; Antunes, RCI
I
II
Universidade Federal de Uberlândia - UFU, Faculdade de Medicina Veterinária – Programa de Pós-Graduação.
Universidade de São Paulo – USP, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Departamento de Ciências Básicas.
Palavras-chave: mtDNA, suíno, qualidade de carne, linhagem, cruzamento
O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito do cruzamento e do conhecimento de SNPs da região D-loop do
mtDNA que caracterizam a origem citoplasmática Asiática ou Européia de uma população de suínos sobre suas
características da qualidade de carne (análise de pH após 24 horas (pH24h), espessura do toucinho (ET), perda por
gotejamento (drip loss), porcentagem de carne magra (%CM), cor e gordura intramuscular (GIM)). Foram utilizadas
meias-carcaças direitas de 288 suínos híbridos comerciais provenientes de quatro diferentes cruzamentos (A, B, C
e D) para avaliação das características de qualidade e extração do DNA genômico do músculo Semimenbranosus.
Para caracterização do polimorfismo na região D-Loop do DNA mitocondrial (mtDNA) foi utilizada a técnica
de PCR-RFLP utilizando os seguintes primers específicos: F- 5’ - CCAAAAACAAAGCAGAGTGTAC - 3’ e R – 5’
CCATCTAGGCATTTTCAGTG 3’ (Gen bank AF276928), amplificando um fragmento de 290 pb. Reação da PCR:
volume final de 25 µL com tampão enzima 10X (200 mM Tris-HCl, pH 8,4, 500 mM KCl), 2,5 mM de MgCl2, uma
unidade de Taq DNA polimerase, 0,2 mM de cada DNTP, 10 pMol de cada primer e 60 ng de DNA genômico.
Condições de amplificação: um ciclo de 94 ºC por 2 minutos, seguido por 39 ciclos a 94 ºC por 30 segundos, 65 ºC
por 30 segundos e 72 ºC por 45 segundos, e finalmente para a extensão final a 72 ºC por 5 minutos. O produto de
PCR foi digerido com a enzima ApoI por 3 horas a 37 ºC numa solução contendo 11,9 µL de água ultrapura, 1,3 µL
de tampão da enzima, uma U de ApoI e 6,65 µL do produto amplificado, e posteriormente submetido à eletroforese
(90 V) em gel de agarose 2% contendo brometo de etídeo. As bandas foram visualizadas e gravadas em scanner
laser FLA 3000G (Fuji Film Co.), as quais foram comparadas ao marcador de peso molecular (100 pb – leader).
Os resultados foram analisados pelo pacote PROC MIXED do Software SAS (1999). As características ET, %CM,
pH24h e drip loss apresentaram diferença significativa (p<0.01) entre os cruzamentos, porém não houve efeito da
origem citoplasmática. No entanto, para a característica cor foi encontrada diferença significativa (p<0,01) para
a origem segundo o estudo do mtDNA, tendo sido atribuído um maior valor para a cor da carne de animais que
apresentaram o mtDNA característico de origem asiática. Finalmente, não houve diferença significativa entre os
cruzamentos e a origem citoplasmática ao se avaliar GIM. Com os resultados obtidos pode-se concluir que houve
efeito de cruzamento para as características ET, %CM, pH24h e drip loss, e efeito de origem citoplasmática sobre a
característica cor. Resultados estes que podem ser importantes num programa de melhoramento genético suíno.
Apoio Financeiro: CAPES
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Uso de genótipos multilocus para alocação de
indivíduos de raças caprinas nativas e exóticas do
nordeste do Brasil
Rocha1, LL; Ribeiro2, MN; Martinez3, AM; Delgado3, JV; Menezes4, MPC; Pimenta Filho4, EC
Aluna do Programa de Doutorado Integrado em Zootecnia. - Universidade Federal Rural de Pernambuco – Recife-PE
Professora do DZ/UFRPE. Bolsista de prdoutividade do CNPq
3
Departamento de Genética – Universidade de Córdoba – Espanha
4
Universidade Federal da Paraíba
1
2
Palavras-chave: Marcadores Microssatélites, conservação animal, análise bayesiana
As investigações na área da conservação de recursos genéticos vêm utilizando a tecnologia molecular de forma
rotineira e disponibiliza grande número de marcadores de DNA que vem sendo utilizados em estudos de variabilidade
genética de populações e estrutural, bem como para detectar possíveis introduções. Vários métodos estatísticos
que utilizam genótipos multilocus, podem detectar imigrações e as mestiçagens, podendo designar/excluir um
indivíduo de uma determinada população. Visando averiguar possíveis introduções em populações caprinas, as
quais 6 pertencentes a rebanhos nativas, 4 exóticas e um grupo Sem padrão racial definido (SPRD), utilizou-se
amostras de 421 animais, e as análises moleculares foram realizadas através de 23 marcadores microssatélites
(BM1329, BM6506, BM6526, BM8125, CSSM66, ETH225, CSRM60, TGLA122, SPS115, MM12, ILSTS011, MAF209,
MAF65, SRCRSP8, HSC, McM527, BM1818, CSRD247, OarFCB11, OarFCB48, OarFCB304, ETH10 e INRA63). Utilizouse o princípio bayesiano para a designação dos indivíduos a possível população de origem, pelo programa Geneclass
v.2, além de avaliar a coancestralidade molecular através do programa Molkin v.3.0 e, através do programa Genetix
v. 4.03 realizou-se uma análise fatorial de correspondência sur population. Através da análise bayesiana observouse que 91,2% dos indivíduos foram alocados a seu real rebanho, onde se constatou a designação e/ou alocação de
todos os indivíduos das raças exóticas Boer e Anglonubiana ao seu rebanho origem e de valores elevados nas raças
Alpina (93%) e Saanen (95%). O mesmo foi observado para o SPRD (92%). Nos rebanhos nativos, a Marota teve
alocação correta para a maioria dos indivíduos (89%), quando comparadas com as demais, Azul (69%), Repartida
(69%), Moxotó (71%), Graúna (78%) e Canindé (79%). Para o coeficiente de coancestralidade molecular houve
variação de 0,292 na ALP até 0,435 na Azul dentre rebanhos. Entre os pares de rebanhos, os nativos apresentam
maior estimativa de coancestralidade entre eles. Pela análise fatorial de correspondência foi possível verificar uma
distinção entre os rebanhos nativos e exóticos, demonstrando que, apesar de estarem em constante ameaça, ainda
possuem padrão genético distinto dos rebanhos exóticos, principalmente da Boer e Anglo-Nubiana. A utilização
de genótipos multilocus com técnicas estatísticas sofisticadas pode ser uma ferramenta de grande utilidade para
monitoramento de programas de conservação e melhoramento.
Apoio: CAPES; UFRPE, UCO.
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180
Genetic diversity of MHC associated microsatellite
markers in six indigenous goat breeds from Africa, Asia
and Europe
Salles, PA1; Santos, S2; Rondina, D1; Weller, M2
Universidade Estadual do Ceará, (UECE), Departmento da Medicina Veterinaria, Avenida Parajana 1700, Ceará, Fortaleza, Brazi;. Rede
Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO)
2
Universidade Estadual da Paraíba (UEPB), Núcleo de Biotecnologia; Departamento da Biologia, Campus Universitário do Bodocongô,
Campina Grande, Paraíba, Brazil.
[email protected]
1
Keywords: Goat, conservation genetics, microsatellite marker, MHC, population genetics.
Native goat breeds (Capra hircus) are often well adapted to harsh local environmental conditions and therefore
represent important genetic resources for breeding programs. We applied analysis of molecular variance (AMOVA)
and F statistics (FIS, FIT and FST) to estimate the genetic diversity of the major histability complex (MHC) - associated
microsatellite markers BF1, DYMS1, BM1818, BM1258 and SMHCC1, in six indigenous goat breeds: The Xuhuai
breed from China, the Kaghani and Paschmina breeds from India, the Small East African (SEA) and the Galla
breeds from Kenya, and the Vendi goat breed from Albania. Alltogether 563 goats were genotyped. The number
of alleles ranged from four (BF1) in the Galla and Xuhuai breed to 16 (BM1258, DYMS1) in the Vendi breed with
an average of 10.25 alleles in all five markers. The AMOVA showed that 92.78% of the genetic variance resulted
from differences between individual goats within the single breeds while. The remaining 7.22% of genetic variance
were found between the different breeds. Results indicated significant (p ≤ 0.001) differences between the values
of observed (HO) and expected heterozigosity (HE). The HO values ranged from 0.273 (BF1) in the Kaghani and
SEA breeds, to 0.796 (BM1818) in the Xuhuai and Galla breeds. In all cases the values of HE were higher than the
corresponding HO value due to a general loss of heterozigosity. This may be due to inbreeding. Significant loss of
heterozigosity (p ≤ 0.01) was confirmed by high mean FIS values in the range between 0.248 (BM1818) and 0.516
(BF1). Mean FST and FIT values were 0.070 and 0.419, respectively. The SEA goat breed showed a closer proximity
to the European Vendi goat breed than to the African Galla breed due to a high number of exclusive alleles in two
markers (BF1 and DMSY1). Results suggest that the marker BM1818 (Mean value of HO= 0.657) could be useful in
future conservation and breeding programs,whereas the other markers have to be tested in other populations.
This work was financially supported by the “CNPq” and the “Fundação Cearence de apoio a pesquisa (FUNCAP)”.
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Protocolo reduzido para genotipagem do gene da αS1caseína em caprinos
Namba, V1; Soares, MAM1*; Rodriges, MT2; Gasparino, E3; Rodrigues, LPGD1; Souza, MF1; Garcia, OSR1
Laboratório de Genética – Universidade Estadual do Oeste do Paraná
Setor de caprinocultura – Universidade Federal de Viçosa
3
Laboratório de Biologia Molecular – Universidade Estadual de Maringá
*
Autor correspondente: [email protected]
1
2
Palavras-chave: leite de cabra; caseína; polimorfismo; alelo F; genotipagem
Dentre as principais proteínas coagulantes do leite, a αs1-Cn torna-se importante por influenciar o rendimento da
fabricação do queijo, bem como por desencadear reações alérgicas em algumas pessoas. O gene da αs1-Cn (CSN1S1)
apresenta um complexo polimorfismo, com mais de 18 alelos caracterizados, os quais variam no nível de expressão:
alto (3,6g/L), compreendendo os alelos A, B1-4, C, H, L e M; médio (1,6g/L), alelos E e I; baixo (0,6g/L), alelo F e N, e
alelos nulos (ausência de proteína), alelo O1-3. O alelo F possui três mutações, que compreende a deleção da citosina
no exon 9 e duas inserções no intron subseqüente, uma de 3 pares de base (pb) e outra de 11pb sendo que nem
sempre estas mutações ocorrem simultaneamente e algumas combinações entre elas podem ser relacionadas a
outros alelos. Em estudos anteriores, realizados pela mesma equipe de trabalho, foi elaborada uma série de análises
para conhecer a freqüência dos principais alelos do lócus CSN1S1 em um rebanho da região Sudoeste do Brasil.
Baseado em dados literários, nos conhecimentos adquiridos ao longo dos estudos e perante ao grande número
de análises para identificar os 18 alelos, com o presente trabalho objetivou-se obter um protocolo minimizado,
voltado para as variações existentes no exon e intron 9, e adaptado às condições locais para o conhecimento do
genótipo de animais caprinos com aptidão para produção de leite. Foram utilizadas 79 cabras, anteriormente
genotipadas para o lócus CSN1S1, das quais foram isoladas amostras de DNA genômico, a partir dos leucócitos,
utilizando-se o reagente brometo de cetiltrimetilamônio (CTAB). As técnicas utilizadas foram a da reação em
cadeia da polimerase (PCR) e a análise de restrição dos fragmentos após a PCR, denominada de PCR-RFLP. Para
este propósito empregou-se a enzima de restrição XmnI (BioLabs), e posterior avaliação em gel de poliacrilamida,
corado por nitrato de prata. A simples amplificação dos fragmentos com longas corridas eletroforéticas permitiu
observar fragmentos baixos, intermediários e altos, sendo que aos fragmentos baixos foram relacionados os alelos
altos, ao alelo O e outros alelos de baixa freqüência; os intermediários, ao alelo F; e, os fragmentos altos, aos alelos
B ou E. As análises de PCR-RFLP foram mais conclusivas e possibilitaram identificar com maior precisão os
principais alelos, sendo que para diferenciar o alelo B do E, é necessário realizar a amplificação do exon 19 apenas
para estes casos. Este procedimento reduz o número de testes e pode ser empregado na determinação do genótipo
de matrizes e reprodutores de rebanhos voltados para a produção de leite caprino.
Apoio financeiro: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG)
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182
Estudo do polimorfismo no éxon 3 do gene da alphas1caseína em caprinos leiteiros
Souza, MF1; Soares, MAM1*; Rodrigues, MT2; Gasparino, E3; Rodrigues, LPGDA1; Weber, LD1; Garcia, OSR1
Universidade Estadual do Oeste do Paraná – Colegiado de Ciências Biológicas – Cascavel – Paraná
Universidade Federal de Viçosa – Departamento de Zootecnia – Viçosa – Minas Gerais
3
Universidade Estadual de Maringá – Departamento de Zootecnia – Maringá - Paraná
*[email protected]
1
2
Palavras-chave: αs1-caseína, alelo C, Capra hircus, polimorfismo, proteínas do leite
As caseínas correspondem a 80% das proteínas do leite, sendo que a αs1-caseína é responsável pela regulação e
estabilidade das outras caseínas (as2, b e k-caseína), influenciando diretamente na coagulação do leite, sendo que
variações no seu nível são importantes para a indústria de queijos e derivados. O gene da αs1-caseína é bastante
polimórfico, com 18 alelos já descritos, divididos em quatro grupos de expressão da proteína no leite: alto (3,6g/L),
representado pelos alelos A, B1-4, C, H e L; médio (1,6g/L) com os alelos E e I; baixo (0,6g/L), alelo F e G; e alelos
nulos, devido a ausência da expressão desta proteína, representado pelos alelos N e O1-3. O alelo C do gene da αs1caseína difere dos demais alelos altos por uma mutação no éxon 3 gerando substituição de um único aminoácido na
proteína, histidina8 por isoleucina. A ausência de dados literários a respeito de protocolos para identificar o alelo
C motivou este estudo, visto que a região gênica apresentou-se mais variável do que se supunha inicialmente. Com
este trabalho objetivo-se avaliar o polimorfismos na região do éxon 3 do gene da αs1-caseína em caprinos leiteiros
já genotipados para verificar possível associação com outros alelos. A extração do DNA genômico foi realizada
com brometo de cetil-trimetilamônio (CTAB) a partir de amostras de sangue de 40 cabras das raças Saanen e
Alpina. Para a amplificação da região gênica de interesse utilizou-se a técnica da Reação de Cadeia da Polimerase
(PCR). Os primers foram desenhados a partir da seqüência AJ504710, disponível no GenBank e flanqueaim a
região do éxon 3, gerando fragmentos de 723 pares de base (pb). A visualização dos fragmentos foi realizada pela
técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) 12% e corado com nitrato de prata. As amostras avaliadas
corresponderam a animais com genótipos BB, EE, FF, AB, AF, AE, EF, BF cujas mutações (excluindo os alelos A e
B), encontram-se em outras regiões do mesmo gene. Foram observados animais homozigotos e heterozigotos,
apresentando dois fragmentos com pequena diferença de tamanho entre eles. O fragmento superior parece estar
associado com o alelo A, os fragmentos menores parecem estar associados aos alelos B, E ou F. Se confirmadas,
estas observações possibilitarão identificar o alelo A dos demais alelos pela simples associação ao fragmento
maior, reduzindo assim o tempo e os custos dos testes, visto que para a confirmação deste alelo é necessário o uso
de enzima de restrição. Serão necessários estudos de sequenciamento na região investigada em diferentes alelos
do gene da αs1-caseína para verificar a natureza deste polimorfismo. Teste com maior número de animais garantirá
a eficácia desta associação.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Caracterização genética da raça ovina Santa Inês
pertencente a rebanhos de Alagoas através de
marcadores microssatélites
Melo, BLB1; Oliveira, FA1; Silva, RMO1; Fraga, AB2; Silva, IHEF3; Souza, GRB3; Azevedo,DA3; Silva, LAF3;
1 Estudantes de graduação da Universidade Federal de Alagoas
2 Prof. Drª. De Melhoramento Animal da UFAL
3 Laboratório de DNA Forense da UFAL
[email protected]
Palavras-chave: caracterização genética, STRs, conservação, Santa Inês, variabilidade genética.
As técnicas de genética molecular baseada no DNA são as mais utilizadas para caracterização de raças, sendo
os microssatélites (STRs) os marcadores mais utilizados. As características que garantem seu êxito nessa área
são: ampla distribuição no genoma, herança codominante e alto grau de polimorfismo. A caracterização genética
de uma raça possibilita o conhecimento da sua variabilidade genética, que é fundamental para os programas de
conservação genética de rebanhos em situação de risco. A raça Santa Inês adquiriu grande importância sócioeconômica ao longo dos últimos anos, tornando-se destaque na ovinocultura nordestina. Em contrapartida, essa
raça sofre cada vez mais ação de cruzamentos indiscriminados com raças comerciais, colocando em risco seu
patrimônio genético, devido à diluição de seus genes. Portanto, este trabalho propõe-se a estudar a variabilidade
intra/interpopulacional de rebanhos, utilizando STRs, com objetivo de auxiliar futuros programas de conservação.
Amostra consistiu em 169 animais, raça Santa Inês, pertencentes a cinco rebanhos distintos, localizados em
Alagoas. DNA foi obtido a partir de sangue venoso e extraído através do método Chelex 100. Foram utilizados
os primers HSC, CSSM66 e OarFCB304 para amplificação do DNA, os quais estão entre os recomendados pela
FAO. As reações de PCR foram feitas em volume final de 20µl contendo 1,5mM de cloreto de magnésio, 1U de
Taq Polimerase, 200mM de dNTPs, 10µM dos primers HSC e OarFCB304 e 5µM do primer CSSM66. Foi utilizado
o seguinte protocolo de termociclagem: 10 minutos a 94°C, seguidos de 35 ciclos de 94°C por 30 segundos,
55°C por 45 segundos e 72°C por 30 segundos, e extensão final por 30 min a 72°C. Os produtos amplificados
foram submetidos à eletroforese capilar e detectados por fluorescência em seqüenciador automático ABI 310.
Parâmetros estatísticos foram calculados nos programas ARLEQUIN ver 3.11 e PowerStats v12. Foram observados
14 alelos para o marcador CSSM66, 15 alelos para HSC, e 17 alelos para OarFCB304. Obteve-se para o Conteúdo
de Informação Polimórfica (PIC) valores acima de 65%; o marcador que apresentou maior heterozigosidade (Ho)
foi OarFCB304 (81,7%), seguido de HSC (80,5%) e CSMM66 (71,6%). Verificou-se conformidade com o Equilíbrio
de Hardy-Weinberg apenas um dos marcadores estudados, OarFCB304 (P=0,10973), os outros dois marcadores
(HSC e CSSM66) apresentaram desvio do EHW mesmo após a correção de Bonferroni. Realizou-se estratificação
da amostra por fazenda de origem verificando-se por meio da Análise de variância molecular (AMOVA) que 97,4%
da variação genética detectada é intrapopulacional, enquanto apenas 2,96% é interpopulacional (FST=0.02959). O
desvio do EHW observado está de acordo com o observado em outros estudos e possivelmente seja resultado de
endogamia, sugerindo a necessidade de melhor manejo de cruzamentos. Os valores de PIC e Ho indicam que os
marcadores estudados são informativos para caracterização da raça.
Apoio financeiro: CNPq e PIBIC
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Variabilidade e estrutura genética da raça ovina
(Ovis aries) morada nova por meio de marcadores
microssatélites
Oliveira, FA1; Melo, BLB1; Silva, RMO1; Fraga, AB2; Silva, IHEF3; Souza, GRB3;Azevedo,DA3; Silva, LAF3;
Estudantes de graduação da Universidade Federal de Alagoas
Prof. Drª. De Melhoramento Animal da UFAL
3
Laboratório de DNA Forense da UFAL
1
2
Palavras-chave: microssatélites, variabilidade genética, ovinos, raça morada nova, caracterização genética.
Os ovinos introduzidos no Brasil na época da colonização ficaram sob forte influência da ação da seleção natural,
sendo reconhecidos como raças “crioulas”, “locais” ou “naturalizadas”. Os grupos genéticos, oriundos do processo
descrito, apesar de apresentarem índices de produção inferiores com relação aos genótipos especializado, se
destacam pela adaptabilidade aos trópicos. A origem da raça Morada Nova no Brasil é incerta, sua descrição foi
baseada nos primeiros relatos de sua ocorrência na cidade de Morada Nova – CE, pelo Professor e Zootecnista
Otávio Domingues em 1937. Hoje esta raça é reconhecida pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
como localmente adaptada e está inserida no Programa Nacional de Conservação coordenado pela Embrapa e
parceiros. A aptidão dessa raça é para produção de carne e, principalmente, pele de ótima qualidade. São muito
prolíferas, com habilidade materna, importante para utilização em sistemas de cruzamento para produção.
Os cruzamentos indiscriminados causam a rápida substituição e erosão das raças locais, a endogamia, pode
reduzir a heterozigosidade e aumentar a freqüência de genes deletérios recessivos, diminuindo a viabilidade e
desempenho fenotípico nas características, tornando-as suscetíveis à extinção. A caracterização genética de
populações, raças e espécies diferentes permite o estudo da variabilidade genética, fundamental para os programas
de conservação genética de rebanhos em situação de risco. Para isso, utilizam-se marcadores moleculares,
conhecidos como microssatélites, que apresentam características detectáveis que diferenciam os indivíduos de
determinada população, demonstrando variações entre indivíduos e grupos de animais. O objetivo desse trabalho
foi caracterizar e analisar a variabilidade genética de três populações de ovinos da raça Morada Nova por meio
de marcadores microssatélites. Foram utilizados três microssatélites (recomendados pela FAO e ISAG), em 124
amostras sangüíneas, provenientes de três diferentes rebanhos da região nordeste. Esses foram amplificados
em reação triplex através da técnica de PCR, a eletroforese capilar foi realizada em analisador genético ABI310.
Em termos de variabilidade total dos rebanhos, o número de alelos, conteúdo de informação polimórfica (PIC) e
heterozigosidade observada (Ho) para os locos estudados, foram de 11 alelos, PIC de 86% e Ho de 0,7903 para o locos
HSC; 11 alelos, PIC de 76% e Ho de 0,6371 para CSSM66 e 14 alelos, PIC de 76% e Ho de 0,8387 para OarFCB304. Para
as proporções de Hardy-Weinberg, apenas o locos OarFCB304 mostrou-se em equilíbrio (p= 0,055), para os demais
locos foi aplicada a correção de Bonferroni, no entanto continuaram apresentando desvios significativos. A Análise
de Variância Molecular (AMOVA) foi utilizada para estimar a estrutura populacional, demonstrando uma variação
de 5,49% inter populacional e de 94,51% intra populacional. Essas diferenças foram quantificadas a partir do Índice
de Fixação (Fst) de 0,05489. Os locos microssatélites confirmaram ser uma ferramenta eficiente em identificar a
variabilidade e estrutura genética da raça.
Apoio Financeiro: PIBIC – CNPq.
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Detecção de polimorfismo no gene da calpastatina
em ovinos da raça santa inês em um rebanho
experimental
Garcia, OSR1; Soares, MAM1*; Gasparino, E2; Macedo, FAF2; Bagatoli, A2; Rodrigues, LPGDA1; Souza, MF1;
Ferreira, L1; Weber, LD1
Universidade Estadual do Oeste do Paraná – Colegiado de Ciências Biológicas – Cascavel – Paraná
Universidade Estadual de Maringá – Departamento de Zootecnia – Maringá – Paraná
*
Autor correspondente: [email protected]
1
2
Palavras-chave: calpastatina, ovinos, Santa Inês, maciez de carne, polimorfismo
A ovinocultura, por ser rentável, vem ganhando destaque no cenário agropecuário mundial e brasileiro. Estudos
mostram uma tendência de crescimento desse mercado no país, sendo que só no estado São Paulo há um déficit
de 3 milhões de cabeça, que são importadas para atender a demanda de consumo anual. Em paralelo ocorre um
aumento das exigências do consumidor por melhor qualidade da carne. A calpastatina foi relacionada com a
maciez da carne, pois é um inibidor endógeno das calpaínas. Sua principal função é modular a ação proteolítica
destas enzimas responsáveis pelo enfraquecimento miofibrilar post-mortem, assim dependendo do grau de inibição
da função das calpaínas resultará em uma alteração da rigidez muscular originando uma carne dura ou mole. O
gene da calpastatina é altamente polimórfico em ovinos apresentando cinco alelos, cujas variações podem ser
detectadas ao se amplificar um fragmento que varia de 253 pares de base (pb), para os alelos 3 e 5, e 254 pb para
os alelos 1, 2 e 4. Nos rebanhos nacionais não se conhece a freqüência alélica deste gene. Com o presente estudo
objetivou-se avaliar a existência de polimorfismo no gene da calpastatina em ovinos da raça Santa Inês de um
rebanho experimental do Norte do Paraná. Foram coletadas amostras de sangue periférico de 38 animais, para a
extração de DNA genômico a partir de células brancas. O isolamento do DNA foi realizado com o reagente brometo
de cetil trimetil amônio (CTAB) e a região gênica de interesse foi amplificada por intermédio da Reação em Cadeia
da Polimerase (PCR), utilizando primers baseados na seqüência do mesmo gene em bovino (GenBank: AY38477).
O produto da PCR foi analisado por intermédio de longa corrida de eletroforese em gel de poliacrilamida 12% e
corado com nitrato de prata. Pelo simples tamanho das bandas amplificadas foi possível separar os animais em
grupos, sendo que dos 38 animais analisados, 15 apresentaram bandas altas, correspondendo aos alelos 1, 2 e/ou 4;
seis animais apresentaram bandas baixas, correspondendo aos alelos 3 e/ou 5; sete apresentaram o fragmento alto
e o fragmento baixo (heterozigotos); em dez animais não foi possível classificar visualmente pela simples altura
das bandas. Estudos de seqüenciamento destes fragmentos ou o uso de enzimas de restrição poderão auxiliar na
precisa identificação destes alelos nos rebanhos. O estabelecimento da relação entre genótipo e dados de maciez
de carne será necessário para praticar o uso desta ferramenta nos programas de melhoramento.
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Investigation of BMPR-1B gene in sheep of the “Santa
Inês” and “Morada Nova breeds in the semi-arid region
of northeast Brazil
Holanda, GML1; Adriao, M2; Silva, DMF2; César, CNR2; Santana, VLA3; Souza, DMB2; Santos Filho, AS1;
Wischral, A4
Instituto Agronômico de Pernambuco – IPA. 2 Laboratório de Fisiologia Animal Molecular Aplicada – FAMA/Departamento de Morfologia
e Fisiologia Animal – DMFA – Universidade Federal Rural de Pernambuco - UFRPE. 3 Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento –
LANAGRO/PE. 4 Departamento de Medicina Veterinária – UFRPE.
[email protected]
1
Keywords: Booroola, prolificity gene, sheep, PCR-RFLP.
This study was carried out with the aim of investigating Booroola mutations (FecB) related to the prolificity of
“Santa Inês” and “Morada Nova” breeds of sheep in the semi-arid region of northeastern Brazil. A total of 293 blood
samples were collected from ewes with a history of multiple offspring per delivery (181 Santa Inês; 112 Morada
Nova) and another 563 samples were collected from females without a history of multiple births (393 Santa Inês;
170 Morada Nova). Twenty-three “Santa Inês” rams were also studied. The PCR-RFLP technique only identified
six animals (3,31%) with mutant genotypes for the Booroola gene among the group of “Santa Inês” females with
a history of prolificity. No mutations were found in “Morada Nova” ewes. All ewes with the FecB mutation were
heterozygous (B+) and had 190 and 160 pb fragments. Although the FecB gene was identified in this study in “Santa
Inês” sheep, its occurrence cannot be considered expressive if frequency is taken into account. It is possible that
the intense selection that has taken place over the years to consolidate the characteristics of the breed (especially
extensive exploitation for meat) did not favor fixation of the Booroola gene. The small proportion of animals found
with the Booroola mutation may also discourage the use this gene as a commercial tool for genetic improvement
in terms of prolificity among the “Santa Inês” and “Morada Nova” breeds. As this polymorphism has been detected
in some sheep of Indian and Mongolian origin (neither which originated the breeds studied here), more in-depth
phylogenetic studies should be carried out in order to determine the source of this gene, including analyses of the
breeds from which “Santa Inês” sheep derived.
Financial support: FACEPE and CAPES.
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Seleção de genes referência para estudos de PCR
em tempo real em ovinos infectados por nematódeos
gastrintestinais
Zaros, LG1; Coutinho, LL2; Medeiros, HR3; Sider, LH1; Vieira, LS1
Embrapa Caprinos e Ovinos, Sobral, CE
Laboratório de Biotecnologia Animal - Depto de Zootecnia - Universidade de São Paulo - USP/ESALQ – Piracicaba/SP
3
Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias da Universidade Federal do Rio Grande do Norte– UFRN – Natal/RN
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Somalis, normalização, expressão gênica, genes controle, geNorm
Para obtenção de resultados confiáveis em ensaios de expressão gênica, é necessária a utilização de genes
referência para normalização. Três genes referência mais utilizados, proteína ribossomal L0 (RPL0), gliceraldeído
3-fosfato desidrogenase (GAPDH) e complexo succinato desidrogenase subunidade A (SDHA), foram avaliados
no abomaso, nódulos linfáticos abomasais e intestino delgado de ovinos Somalis resistentes e susceptíveis a
nematódeos gastrintestinais. Nessa avaliação foram consideradas a especificidade e a eficiência de amplificação
dos primers, os valores médios de Ct (Cycle Threshold), seguidos pela análise de estabilidade dos genes através
do programa geNorm. A especificidade dos primers foi confirmada através da análise da curva de melting e do
seqüenciamento dos produtos amplificados em Seqüenciador Automático ABI 3100. A eficiência de amplificação
foi calculada através da geração de curvas de diluições seriais, cujos resultados foram 1,92, 1,96 e 1,98 para GAPDH,
SDHA e RPL0, respectivamente, indicando eficiente amplificação, próximo ao valor ideal 2. A expressão de RPL0
permaneceu constante entre os grupos resistente e susceptível no abomaso (Ct médio de 20,43 e de 20,06 - P>0,05)
e nos nódulos linfáticos abomasais (Ct médio de 18,11 e de 18,23 - P>0,05), sendo eleito, pelo programa geNorm,
o gene mais estável nesses tecidos. Em contraste, no intestino delgado, SDHA e GAPDH foram eleitos os genes
referência mais estáveis. Os valores médios de Ct entre os grupos resistente e susceptível para SDHA foram de
25,71 e 25,95 e para o GAPDH foram de 23,38 e 24,63, respectivamente (P>0,05). Assim, estes resultados ilustram
a importância da escolha correta de genes referência antes de qualquer ensaio de quantificação relativa, uma vez
que não há nenhum gene referência universalmente válido, e que candidatos a genes referência podem estar sob
regulação em condições específicas em diferentes tecidos, como observado no presente trabalho.
Apoio financeiro: FUNCAP, CNPq, Embrapa Caprinos e Ovinos
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Divergência genética entre touros Indubrasil
Silva, CMS1; Ferraz Filho, PB1
Laboratório de Genética Biométrica - Departamento de Ciências Naturais, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS) Campus de Três Lagoas, E-mail: [email protected] e [email protected]
1
Palavras-chave: análise multivariada, bovinos, diferenças esperadas nas progênies, distância genética, similaridade.
O estudo da divergência genética entre progenitores pode constituir-se em uma ferramenta de grande valia
nos programas de melhoramento genético, pois auxiliam na identificação de combinações com máximo efeito
heterótico, e possibilita também a recuperação dos genótipos superiores através das gerações segregantes. O
objetivo deste trabalho foi de avaliar a divergência genética entre touros da raça Indubrasil, por meio de técnicas
multivariadas. Foram avaliados dados de 31 reprodutores relacionados no Sumário Nacional de Touros das raças
Zebuínas, Indubrasil. Para o estudo foram utilizadas as características produtivas e reprodutivas relacionadas às
diferenças esperadas nas progênies dos referidos touros. A diversidade genética foi avaliada por procedimentos
mulltivariados, sendo as estimativas de similaridade obtidas pela distância euclidiana média padronizada, no
qual a maior dissimilaridade entre os reprodutores alcançou a distância de 3.0059 e o menor intervalo foi de
0.3262 de distância. Pelo método de agrupamento de otimização de Tocher, houve a formação de oito grupos de
similaridade, havendo quatro touros divergentes com relação aos demais. Gráficos de dispersão foram obtidos
através dos escores dos componentes principais, possibilitando avaliar visualmente as distâncias genéticas entre
os reprodutores. Três dos componentes principais explicaram 74,75 % da variância total, o primeiro foi de 36,69%,
o segundo respondeu por 21,63% e o terceiro por 16,43% da variância. Os genótipos estudados apresentaram
divergência genética, fornecendo parâmetros para a escolha de progenitores dissimilares, cujas progênies ao
serem cruzadas apresentem alta produtividade na descendência devido ao vigor híbrido e identificar reprodutores
similares que induziriam altos índices de consangüinidade.
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Detecção de uma indel na região 3’ UTR do gene
DGAT1 em animais das principais raças bovinas do
Brasil
Steinberg, RS1; Teixeira, OM1; Figueiredo, PO1; Machado, MA2; Peixoto, MGCD2; Verneque, RS2; Carvalho,
MRS1
1. Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brasil.
2. Embrapa Gado de leite, Juiz de Fora, MG, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Marcadores moleculares, QTL, Seleção assistida por marcadores, Bovinos, DGAT1
O gene DGAT1 codifica a enzima microssomal acilCoA:diacilglicerol aciltransferase. Um QTL (QuantitativeTtrait
Locus) com efeito principal sobre a produção e composição de leite em Bos taurus foi identificado na região do
cromossomo BTA14 em que se encontra esse gene. O polimorfismo DGAT1(K232A) é responsável pela maior fração
da variância nestas características. Estudos recentes com animais Bos indicus apontam baixa freqüência do alelo
‘232A’, variando de 0 a 0.04 em raças zebuínas leiteiras. Outro polimorfismo identificado nessa região é uma VNTR
(Variable Number Tandem Repeats) na posição 5’ UTR, para a qual já foram identificados cinco alelos. O único
estudo conduzido até o momento com este marcador, não identificou associação com características da produção
leiteira. Portanto, com o objetivo de identificar novas variantes alélicas no gene DGAT1, foram sequenciados 600
nucleotídeos na região 3’ UTR (Untranslated Region) em animais zebuínos da raça Guzerá. Utilizou-se primers
anelando no final do éxon 17 e na região 3’ UTR, englobando o sinal de poli-adenilação e 502 nucleotídeos dessa
região. Foi identificada uma indel (inserção-deleção) de 15 nucleotídeos. Para averiguar a presença e a freqüência
da indel em outras raças, foram genotipadas amostras de animais taurinos (Holandês: 53, Jersey: 72, Pardo-suiço:
70) e zebuínos (Sindi: 60, Gir: 54, Nelore de corte: 59, Nelore leiteiro: 46 e Guzerá: 63). O DNA foi obtido do Banco
de DNA de Bovinos de Leite do consórcio entre os Laboratórios de Genética Humana e Médica do ICB-UFMG e
de Genética Molecular da Embrapa Gado de Leite. A região foi amplificada por PCR e os produtos separados por
eletroforese em gel de poliacrilamida 6% e corados com nitrato de prata. Não foi observada a presença da inserção
em nenhum animal B. taurus. A freqüência da inserção foi de 0,11 no Sindi, 0,27 no Gir, 0,33 no Guzerá, 0,52 no
Nelore leiteiro e 0.63 no Nelore de corte. Todas as freqüências encontram-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg
(p>0,05). Essa foi a primeira indel identificada em genes envolvidos com vias de metabolização de lipídios. Já foi
relatada relação entre indels na 3’ UTR e a estabilidade do mRNA. Diante da perspectiva de relação desse tipo de
polimorfismo com a variância em características de interesse à produção de leite em zebuínos, faz-se necessária
a condução de estudos de associação, para verificar o potencial desse marcador para a seleção assistida por
marcadores moleculares em raças zebuínas.
Apoio financeiro: FAPEMIG e Cnpq
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Certificação Genealógica em animais do Programa
Nacional de Melhoramento de Gir Leiteiro por meio de
exames de DNA
Pinto1,2, ISB; Gasparini, K1; Cestaro, LS1; Domingues, R1; Azevedo, ALS1; Campos, MGCD; Verneque, RS¹;
Euclydes, RF²; Machado, MA1.
¹ Laboratório de Genética Molecular - Embrapa Gado de Leite
² Departamento de Zootecnia - Universidade Federal de Viçosa
[email protected]
Palavras-chave: marcadores, microssatélites, paternidade, PCR multiplex
A Embrapa Gado de Leite vem desenvolvendo há 23 anos o Programa Nacional de Melhoramento de Gir Leiteiro –
PNMGIL – que tem como objetivo promover o melhoramento genético da raça Gir por meio da seleção de touros
geneticamente superiores. O Programa utiliza informações das progênies dos touros em teste, sendo importante a
precisa informação de paternidade, uma vez que erros de identificação de filiação podem afetar o ganho genético.
O objetivo deste trabalho foi utilizar marcadores moleculares para verificar a genealogia dos animais pertencentes
ao PNMGIL. Para isso foram coletadas amostras de sangue de 303 filhas de 55 touros diferentes em 75 fazendas,
sendo 14 fazendas de Gir puro e 61 de mestiços - Gir x Holandês. Foram analisados 11 marcadores pertencentes
ao Kit StockMarks for Cattle® Bovine Paternity PCR Typing recomendados pela ISAG. Os produtos de PCR foram
analisados no seqüenciador de DNA Megabace 1000, a análise dos fragmentos foi feita no software Fragment Profiler
e os valores de heterozigosidade esperada e observada, freqüência alélica e número de alelos foram calculados com
o aplicativo POPGENE 1.32. Os valores de PIC foram calculados no programa PowerStats v1.2. O marcador que
apresentou o maior número de alelos foi o ETH3 com 19 alelos e os marcadores com menor número foram BM1824
e TGLA126, com 10 alelos cada um. As médias da heterozigosidade esperada e observada dos marcadores foram
de 0.7423 e de 0.6559, respectivamente. O valor médio de PIC para todos os marcadores foi de 0,61, variando de
0,59 (ETH3) a 0,8 (INRA23 e TGLA122), valores que demonstram o alto índice de polimorfismos dos marcadores.
A exclusão de paternidade foi considerada quando dois ou mais marcadores não foram compartilhados entre
pai e filha. Foi encontrado um total de 20% de erros de paternidade em todos os casos analisados. Erros de 18%
e 20% foram encontrados nas fazendas de gado puro e mestiços, respectivamente. Analisando o percentual de
erros por touros foi encontrado que 49% dos touros apresentaram de 0-20 % de erros, 29% tiveram de 20-40%
e 21% dos touros apresentaram de 40-60% de erros de genealogia. Os 11 marcadores utilizados demonstraram
eficiência para verificação de paternidade, no entanto mais marcadores ainda estão sendo testados para aumentar
a confiabilidade dos testes. A correta informação de pedigree é importante para o sucesso de um programa de
melhoramento.
Apoio Financeiro: Capes, Embrapa
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
Centro de Convenções do Hotel Monte Real Resort • Águas de Lindóia • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
191
Análise das frequências alélicas e genotípicas do gene
OPN em animais da raça Girolando
Paiva, DS1,2; Fonseca, I2; Mello, F3; Siqueira, TR2,4; Antunes, GR1,2; Cobuci, JA3; Nápolis, CC5; Freitas, AF5;
Silva, MVGB5; Guimarães, MFM2
Universidade Federal de Juiz de Fora
Laboratório de Genética Molecular Mário Luiz Martinez - Embrapa Gado de Leite
3
Departamento de Zootecnia - Universidade Federal do Rio Grande do Sul
4
Centro de Ensino Superior de Juiz de Fora
5
Embrapa Gado de Leite
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Equilíbrio de Hardy-Weinberg, Osteopontina, Proteína e Gordura no Leite.
A Osteopontina (OPN) é uma proteína altamente fosforilada expressa em vários tecidos. Em camundongos que
expressam RNA anti-senso de OPN, observa-se a falta de estruturas alveolares, levando a redução na síntese de Betacaseína e proteínas acídicas do soro do leite, além de serem deficientes em lactação. A associação deste gene com
características de produção de leite foi alvo de estudo em diversos trabalhos com bovinos. Um porlimorfismo no
íntron quatro do gene da OPN foi associado ao aumento nos percentuais de proteína e de gordura no leite. Foram
identificados dois alelos: o alelo C, associado com o aumento na porcentagem de proteína e gordura no leite e o alelo
T, associado a um aumento na produção de leite. A validação do gene OPN como marcador molecular para produção
e percentual de gordura e proteína no leite em animais Girolando é de grande contribuição para o melhoramento
genético desta raça. Por isso, o objetivo deste trabalho foi estimar as freqüências alélicas e genotípicas do gene
OPN e verificar se o mesmo está em Equilíbrio de Hardy-Weinberg em uma população de animais Girolando. Para
isso, 71 amostras de sêmen de todos os touros pertencentes ao Teste de Progênie da Raça Girolando e 76 amostras
de sangue de vacas filhas destes touros foram coletadas. A extração do DNA foi feita utilizando um kit comercial,
seguindo as recomendações do fabricante e a quantificação feita por espectrofotometria (Nanodrop®Thermo
Fisher Scientific). O genótipo dos animais foi determinado pela técnica de PCR-RFLP e uma região do gene OPN
foi amplificada utilizando-se um par de primers descrito por Leonard et al. (2005). O produto da reação de PCR
foi digerido utilizando a enzima BsR I (New England Biolabs, Inc.). Dois padrões de bandas foram observados,
caracterizando os dois diferentes alelos: o alelo T é identificado pela presença de uma banda não digerida de 290
pb enquanto o alelo C é identificado por duas bandas (200 e 90 pb).A partir da observação de dois padrões (C e T)
de bandas em gel de agarose 1,5% corado com Brometo de Etídeo, o genótipo foi estabelecido para cada animal.
Para calcular as freqüências gênicas e genotípicas e verificar se a população está em Equilíbrio foi utilizado o
programa GENEPOP web version 1.2. As freqüências genotípicas foram 86% (CC), 56% (CT) e 12% (TT). Já os alelos
C e T apresentaram as freqüências de 74,03% e 25,97%, respectivamente. A análise das freqüências observadas e
esperadas para cada genótipo não diferiram ao nível de significância de 5%, sugerindo que a população, nestas
condições encontra-se em Equilíbrio. No entanto, a alta freqüência do alelo C evidenciaria que este está se fixando
nesta raça.
Apoio Financeiro: Embrapa e FAPEMIG
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Caracterização de polimorfismo no éxon 1 do gene da
grelina em búfalos da raça murrah (Bubalus bubalis)
Gil, FFM¹; Souza, FRP1; Stefani, G1; Tonhati, H2; Albuquerque, LG2
¹Laboratório de Genética Molecular – Departamento de Zootecnia – FCAV – UNESP - Jaboticabal. 2Departamento de Zootecnia - FCAV UNESP – Jaboticabal.
[email protected].
Palavras-chave: marcadores moleculares, grelina, SSCP, búfalo, produção de leite
A grelina é um hormônio gastrintestinal e possui ação como liberador do hormônio do crescimento e exerce
influência no metabolismo geral do organismo. Os genes do hormônio do crescimento estão associados à
porcentagem de gordura, proteína e à produção de leite em bovinos e têm sido estudados em bubalinos. Assim,
a caracterização do gene bubalino da grelina torna-se imprescindível, sendo este gene proposto como gene
candidato para identificação de marcadores genéticos relacionados a características de crescimento, carcaça e
produção de leite. Nesse contexto, objetivou-se verificar a existência de polimorfismos no éxon 1 do gene da grelina
em búfalos (Bubalus bubalis). Foram analisadas por PCR-SSCP, amostras de DNA provenientes de 122 búfalas da
raça Murrah pertencentes a três fazendas localizadas no estado de São Paulo, nos municípios de Sarapuí, Dourado
e Bocaina. Os fragmentos amplificados pela técnica de PCR apresentaram 400 pb e, através da técnica de SSCP,
pôde-se visualizar 3 padrões de migração diferentes, denominados AA, AB e BB. As freqüências destes 3 padrões
foram de 0,23 para o padrão AA, 0,47 para o padrão AB, e 0,30 para o padrão BB. Considerando que os três padrões
representem a segregação de um SNP (Single Nucleotide Polymorphism), as freqüências alélicas foram estimadas
em 0,47 para o alelo A, e 0,53 para o alelo B. Por meio do teste do qui-quadrado pôde-se concluir que a população
estudada encontra-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg e que a seleção para aumento da produção de leite que é
realizada neste rebanho, não tem ocasionado alteração na freqüência gênica da população.
Apoio Financeiro: CNPq.
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Polimorfismos nos genes cast e GHR associados à
características de interesse comercial em bovinos de
corte
Leão, V1; Portapilla, GB1; Matheucci Jr, E1,3; Medaglia, A1,3; Cervini, M1,2
DNA Consult Genética & Biotecnologia Ltda.
Departamento de Genética e Evolução, UFSCar.
3
Programa de Pós Graduação em Biotecnologia, UFSCar
leã[email protected]
1
2
Palavras-chave: Bovinos, SNP, calpastatina, maciez, GHR.
A utilização de marcadores moleculares associados a características de interesse econômico em bovinos são
de grande importância para o desenvolvimento da cadeia produtiva da carne brasileira. A possível associação
de marcadores com características fenotípicas influenciadas por vários genes e fatores ambientais possibilita o
direcionamento de um manejo mais eficiente na produção animal. Dessa forma, a associação de marcadores com
características de qualidade de carne e ganho de peso em bovinos estão sendo estudados. Dentre esses polimorfismos,
pode-se destacar o SNP (Single Nucleotide Polymorphism) localizado no gene da calpastatina (CAST – c.2959 A>G
- AF159246), enzima inibidora da atividade das calpaínas (principais proteínas envolvida no processo de maciez
da carne bovina) e um microssatélite localizado próximo ao gene GHR (receptor do hormônio de crescimento),
relacionado com ganho de peso em algumas raças de bovinos. Nesse contexto, esse trabalho tem como objetivo
estimar as freqüências dos alelos desses polimorfismos em 100 bovinos, originários de cruzamentos industriais,
abatidos em frigoríficos brasileiros. Para o SNP localizado no gene CAST, foram observadas as freqüências dos
alelos: G-(78%), A-(22%), sendo que apenas dois animais apresentaram o genótipo AA (associado a maior maciez
em alguns estudos). Para o microssatélite localizado próximo do gene GHR, foram observadas as freqüências: alelo
S (79%), alelo L (21%), sendo que a freqüência dos alelos S ( fragmentos com até 102pb – menor ganho de peso)
e os alelos L ( fragmentos maiores que 102pb – maior ganho de peso) estão de acordo com os valores obtidos
na literatura para animais Bos indicus, os quais são a grande maioria dos animais abatidos no Brasil. Estudos
de associação dos alelos observados nesse trabalho com suas respectivas características fenotípicas indicarão a
possível eficiência desses marcadores para a utilização no manejo dos rebanhos de corte brasileiros, podendo
auxiliar nos programas de melhoramento tradicionais já desenvolvidos por todo o Brasil.
Apoio Finceiro: PIPE/FAPESP
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Análise das frequências alélicas de SNP localizados no
gene CAPN1 em bovinos de corte pela técnica ARMSPCR
Portapilla, GB1; Leão, V1; Matheucci Jr, E1; Medaglia, A; Cervini, M1,2
DNA Consult Genética E Biotecnologia Ltda.
Departamento de Genética e Evolução, UFSCar.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Bovinos, SNP, CAPN1, maciez, frequências alélicas.
O Brasil é um dos maiores produtores e exportadores de carne bovina do mundo. Em 2008, o país exportou cerca de
2 milhões de toneladas de carne para mais de 120 países. Neste contexto, a utilização da biologia molecular aplicada
no melhoramento animal é de grande importância no aumento da produtividade dos produtos brasileiros de
origem animal. Estudos de associação entre características de interesse econômico e marcadores moleculares são
importantes para futuros programas de melhoramento assistido por marcadores (MAS). A maciez da carne é um
dos critérios exigidos pelo mercado externo na importação da carne, esta característica, influenciada por inúmeros
fatores genéticos, fisiológicos e ambientais, dificulta a seleção de animais com o fenótipo desejado. Entretanto,
foram relatados na literatura, alguns marcadores moleculares associados à maciez da carne, destacando-se os
SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) localizados no gene CAPN1 o qual expressa a enzima µ-calpaína, uma
das principais enzimas envolvidas no processo de maciez da carne. Esse trabalho tem como objetivo estimar as
frequências alélicas de seis SNPs (CAPN530, CAPN316, CAPN4751, CAPN4753, CAPN5331 e CAPN14) localizados no
gene CAPN1, pela técnica ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation Systems - PCR), em 100 bovinos industriais
brasileiros. As frequências observadas foram: Loco CAPN530: alelo G (77%) – alelo A (23%); loco CAPN316: alelo G
(90%) – alelo A (10%); loco CAPN4751: alelo T (93%) – alelo C (7%); loco CAPN4753: alelo C (72%) – alelo A (28%);
loco CAPN5331: alelo T (62%) – alelo A (38%); loco CAPN14: alelo C (82%) – alelo T (18%). Tais frequências estão
de acordo com as encontrados na literatura para animais zebuínos e cruzados, os quais são os principais grupos
genéticos abatidos nos frigoríficos brasileiros. Esses resultados, associados a medidas de força de cisalhamento,
poderão auxiliar na identificação de quais desses marcadores serão utilizados como informativos de maciez. Dessa
forma, a genotipagem dos SNPs pela técnica de ARMS – PCR é uma importante ferramenta de genotipagem de
SNPs, possibilitando uma maior agregação de valor aos animais que apresentarem esses marcadores favoráveis.
Apoio Financeiro: PIPE/FAPESP
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Frequências alélicas e genotípicas do polimorfismo TG/
MBOI em bovinos de diferentes grupos genéticos
Freitas, COM1; Blecha, IMZ²; Siqueira, F³; Torres Junior, RAA³; Medeiros, SR4; Souza, ARDL5; Oshiro, MM6
¹Ciências Biológicas, UFMS, Campo Grande/MS. ²Ciências Biológicas, UNIDERP, Campo Grande/MS
³Melhoramento Genético Animal, Embrapa Gado de Corte, Campo Grande/MS. 4Nutrição Animal, Embrapa Gado de Corte, Campo
Grande/MS, 5Doutoranda ESALQ-USP. 6Professor UEMS - Campus de Aquidauana/MS.
[email protected]
Palavras-chave: bovino, cruzamento, marcador molecular, melhoramento animal e tireoglobulina
Apesar do Brasil ser o líder mundial em tonelagem de carne bovina exportada, o País tem uma renda relativamente
baixa, já que não exporta para os mercados de maior valor agregado, pois, além de questões sanitárias, a carne
brasileira não é considerada de boa qualidade por alguns importadores. Para atender aos nichos de mercado de
alta qualidade e valor agregado é de fundamental importância aplicar uma estratégia que envolva desde a escolha
de material genético, a adequação do sistema de produção até a padronização da oferta de matéria prima (animais)
às indústrias, principalmente quanto ao peso, idade e grau de acabamento. Uma opção que vem sendo utilizada
para o melhoramento genético do rebanho é o cruzamento das subespécies Bos taurus taurus e Bos taurus indicus,
resultando em animais com melhor qualidade de carne e adaptação ao clima, como conseqüência da heterose e
efeito aditivo das raças. Vários genes candidatos foram identificados como possíveis responsáveis pela deposição
de gordura em bovinos de corte, como os genes: DGAT1, FABP3, GH1, LEP e TG. Contudo, a magnitude relativa aos
efeitos e a importância de cada um destes genes no controle de variações fenotípicas permanecem desconhecidas.
Neste trabalho, foram avaliadas as frequências alélicas e genotípicas do polimorfismo TG/MboI em 53 animais
de sete grupos genéticos criados em confinamento, com o objetivo de verificar se o efeito desse polimorfismo,
que já foi identificado em rebanhos de outros países, mantém-se nos diferentes grupos genéticos e em condições
brasileiras. Os grupos genéticos estudados foram: Nelore; Caracu; cruzamentos de touros Caracu e Canchim com
vacas Angus x Nelore; touros Angus com vacas Caracu x Nelore; touros Canchim e Caracu com vacas Simental x
Nelore. Os animais foram abatidos com idade entre 16 e 20 meses e foram avaliados quanto à maciez de carne,
deposição de gordura intramuscular e de cobertura e área de olho de lombo. Os mesmos foram genotipados por
meio da técnica de PCR-RFLP (Polymorphism Chain Reaction – Restriction Fragment Lenght Polymorphism) e as
frequências alélicas e genotípicas foram comparadas utilizando o teste de Qui-quadrado. O alelo designado de T,
favorável para marmoreio, foi identificado por três fragmentos de 74, 193 e 278 pares de bases e o alelo designado
de C, desfavorável, por quatro fragmentos de 17, 74, 176 e 278 pares de bases. Não houve diferença significativa
nas frequências alélicas e genotípicas entre os grupos genéticos, ao nível de 5% de significância. Posteriormente,
será genotipada uma amostra maior de animais e realizados estudos de associação entre genótipos e fenótipos
utilizando o procedimento GLM do programa estatístico SAS. Se confirmada a associação desse polimorfismo
com grau de marmoreio, esse marcador poderá ser viável para seleção de animais com potencial para produção de
carne de melhor qualidade.
Apoio Financeiro: EMBRAPA, FUNDECT e CNPq/PIBIC
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Polimorfismos no íntron 1 e região promotora do gene
prnp bovino na raça Caracu
Galvão, CEC1; Soares, CO²; Sanches, CC³; Elisei, C4; Araújo, FR²; Siqueira, F²; Regitano, LCA5; Rosinha,
GMS²
Mestrado em Ciência Animal, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul (UFMS), Campo Grande, MS.
Embrapa Gado de Corte, Campo Grande, MS.
3
Mestre em Ciência Animal.
4
Bolsista DCR/CNPQ.
5
Embrapa Pecuária Sudeste, São Carlos, SP.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Encefalopatia Espongiforme Bovina, prnp, príon, indel, Caracu
A Encefalopatia Espongiforme Bovina (EEB) é uma zoonose que faz parte do grupo das Encefalopatias
Espongiformes Transmissíveis (EETs). O agente etiológico é denominado de príon scrapie (PrPSc) que é a proteína
anormal. A proteína normal, príon celular, é representada por PrPC. A proteína priônica é sintetizada a partir do
gene prnp. Uma das mudanças que ocorre neste gene, em bovinos, é a inserção e/ou deleção (indel) de sequências
de bases, em regiões específicas, sendo as mais estudadas atualmente a indel de 12 pares de bases (pb) no íntron 1 e
de 23pb na região promotora. Sequências variantes podem ter um impacto sobre a formação da proteína priônica e,
portanto, sobre a suscetibilidade ou resistência à EEB. Neste estudo foi genotipada a variabilidade de nucleotídeos
de regiões específicas do íntron 1 e região promotora do gene prnp em bovinos da raça Caracu para posterior
indicação de animais geneticamente suscetíveis ou resistentes à EEB. Foi realizada a extração de DNA genômico
de sangue e sêmen de 27 reprodutores da raça Caracu com baixo ou nenhum grau de parentesco. As regiões alvo do
gene prnp foram amplificadas através da PCR utilizando-se primers específicos. Essas regiões amplificadas foram
submetidas à eletroforese em gel de agarose 3% para determinar as frequências alélicas, genotípicas, dos haplótipos
e diplótipos. Os produtos das PCRs foram purificados e sequenciados para visualização da indel de 12pb e 23pb
no íntron 1 e região promotora respectivamente. A conformação das bandas formadas no gel de agarose aplica-se
tanto para indel 12 pb como para indel 23 pb onde, os animais heterozigotos apresentaram o genótipo ins/del, ou
seja, um alelo com inserção e o outro com deleção de pares de bases; o genótipo del/del apresenta deleção nos dois
alelos e são homozigotos, característico de suscetibilidade à doença; o genótipo ins/ins apresenta inserção nos
dois alelos e também são homozigotos, característico de resistência à EEB. No sequenciamento confirmaram-se
os polimorfismos nas regiões estudadas, anteriormente relatadas em outros estudos. Os animais da raça Caracu
apresentaram alta frequência alélica característica de resistência à EEB para as duas regiões polimórficas estudadas
com porcentagem de 76% para íntron 1 e 69% para região promotora. A frequência do haplótipo característico de
resistência (12ins-23ins) foi 48%, com 26 alelos possuindo as duas inserções. O diplótipo 12ins-23ins/12ins-23ins
teve uma frequência de 41%, classificando 11 animais com grau 0 de suscetibilidade de acordo com as duas regiões
em estudo. Outros 11 animais com o diplótipo 12ins-23ins/12del-23del, foram classificados com grau moderado
de suscetibilidade e apenas 1 animal obteve alto grau de suscetibilidade (12del-23del/12del-23del). Estas análises
são de grande importância na seleção de reprodutores com perfil genético de resistência, pois os animais com esta
característica poderão ser inseridos em programas de melhoramento animal.
Apoio Financeiro: EMBRAPA, FINEP e FUNDECT.
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Teste de associação do hormônio liberador de
corticotrofina (CRH) com espessura de gordura em
bovinos da raça Canchim
Veneroni, GB; 2Meirelles, SL; 3Mello, SS; 1Ibelli, AMG; 1Tizioto, PC; 4Oliveira, HN; 5Alencar, MM; 5Regitano,
LCA
1
Programa de pós graduação em Genética e Evolução – UFSCAR, 2Departamento de Genética e Melhoramento Animal - UNESP
Jaboticabal/SP, 3Graduanda em Ciências Biológicas, UNICEP; 4Departamento de Melhoramento e Nutrição Animal - UNESP Botucatu/SP,
5
Embrapa Pecuária Sudeste - São Carlos/SP.
[email protected]
1
Palavras-chave: gene CRH, raça Canchim, espessura de gordura subcutânea, teste de associação, SNP
Canchim é uma raça sintética que tem sido usada na indústria de gado de corte. Entre os objetivos do melhoramento
dessa raça está a seleção para maior deposição de gordura. O estudo de marcadores moleculares que possam
auxiliar a identificação de animais com maior potencial genético para a característica tem sido realizado. QTLs
para espessura de gordura subcutânea (EGS) e/ou marmoreio têm sido descritos no BTA14, inclusive na raça
Canchim. Nesse cromossomo (a 30,4 cM) foi mapeado o gene para o hormônio liberador de corticotrofina (CRH).
SNPs desse gene já foram associados com deposição de gordura subcutânea em uma população F2 de Wagyu x
Limousin, sugerindo ser esse gene um candidato a influenciar a variação da deposição de gordura em bovinos. O
objetivo desse estudo foi testar a associação do SNP g.9657C>T, contido no promotor do gene para o hormônio
liberador de corticotrofina, com espessura de gordura subcutânea em bovinos da raça Canchim. Um total de 641
animais da raça Canchim (5/8 Charolês + 3/8 Zebu), compreendendo machos e fêmeas, nascidos de 2003 a 2006,
criados em regime de pastagem em sete fazendas localizadas nos estados de SP e GO, foi avaliado para espessura
de gordura subcutânea aos 18 meses de idade. Para mensuração da espessura de gordura (EG) foi utilizado um
equipamento de ultra-som. As imagens foram obtidas na região entre a 12a e 13a costela do animal. O DNA foi
extraído de amostras de sangue utilizando um método de desproteinização com sal. O polimorfismo g.9657C>T,
contido no promotor do gene CRH, foi genotipado por PCR-RFLP utilizando a enzima HhaI. O teste de associação
entre os genótipos dos marcadores e as medidas de espessura de gordura subcutânea foi realizado utilizando
um modelo animal pelo método de máxima verossimilhança restrita. A característica não foi significantemente
associada com o polimorfismo em CRH estudado, sugerindo ser outro gene que influencie a variação da espessura
de gordura na população em estudo.
Apoio financeiro: Embrapa, CNPq, FAPESP
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Associação entre polimorfismos de única base (SNP)
dos genes PPARGC1A e PSMC1 com espessura de
gordura subcutânea em animais da raça Canchim
Tizioto, PC1; Veneroni, GB1; Meirelles, SL2; Gasparin, G3; Ibelli, AMG1; Oliveira, HN4; Alencar, MM5; Regitano,
LCA5
Programa de pós graduação em Genética e Evolução – UFSCAR.
Departamento de Genética e Melhoramento Animal - UNESP Jaboticabal/SP.
3
Bolsista DTI CNPq
4
Departamento de Melhoramento e Nutrição Animal - UNESP Botucatu/SP
5
Embrapa Pecuária Sudeste - São Carlos/SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: SNP, PPARGC1A, PSMC1, carne, espessura de gordura.
O Brasil é um grande produtor de carne bovina, e para manter-se consolidado no mercado é necessário
comercializar carne de qualidade, com características requeridas pelos frigoríficos e consumidores. Um dos fatores
que afeta a qualidade da carne é a deposição de gordura subcutânea (EGS). O Canchim é uma raça composta (5/8
Charolês 3/8 Zebu), que vem sendo cada vez mais incorporada como opção para produção de carne à pasto, no
entanto, esta apresenta pouca gordura de cobertura. Diversos SNPs localizados em genes candidatos têm sido
descritos e associados com características de deposição de gordura em bovinos. Dessa forma, o objetivo deste
trabalho foi associar SNPs dos genes candidatos peroxisome proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1
alpha (PPARGC1A) e proteasome 26S subunit, ATPase, 1 (PSMC1) com deposição de gordura em bovinos da raça
Canchim. Foram calculados os valores genéticos (VG) para EGS de 113 touros, pais de uma população de meioirmãos constituída de 987 animais avaliados para EGS no músculo Longissimus lumborum, na região entre a 12a
e 13a costela, com um equipamento de ultra-sonografia. Seis touros com maior VG e maior acurácia e 6 touros
com menor VG e maior acurácia foram escolhidos para análise de DNA. Dos 987 animais avaliados para EGS
foi obtido o resíduo de um modelo, através do método de máxima verossimilhança restrita, que incluía ano de
nascimento, fazenda de nascimento, sexo, grupo genético, idade do animal na data da mensuração da EGS e
não incluía informações de genótipos. Os animais foram organizados em ordem crescente segundo o resíduo,
escolheu-se 15 animais com maior resíduo e 15 com menor resíduo. Assim, foram genotipados 42 animais para os
SNPs localizados no intron 9 dos genes PPARGC1A e PSMC1 através da técnica PCR-RFLP. Após a amplificação,
foram utilizadas as enzimas de restrição BsuRI e MvaI, respectivamente. Um teste exato de Fisher foi aplicado
para checar a distribuição de frequência alélica entre os extremos de cada SNP estudado. Adotando um nível de
significância de 10%, para o SNP do gene PPARGC1A não foi observada associação significativa com espessura de
gordura (P< 0.15), porém observou-se uma associação sugestiva (P< 0.09) entre o SNP no gene PSMC1 e espessura
de gordura subcutânea.
Apoio financeiro: FAPESP, CAPES, CNPq, EMBRAPA.
55º Congresso Brasileiro de Genética
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Efeito da nutrição e da leptina sobre a expressão de
genes hipotalâmicos em novilhas nelore (Bos taurus
indicus)
Diniz-Magalhães, J¹; Carvalho, MV¹; Bodini, AP²; Oliveira, NS²; Donato, DCZ¹; Garcia, PDSR¹; Silva, LFP³
¹Estudantes de Mestrado do Departamento de Nutrição e Produção Animal - FMVZ – USP/Pirassununga.
²Iniciação Científica do Laboratório de Genômica Funcional do CEPBOV - FMVZ – USP/Pirassununga.
³Professor doutor do Departamento de Nutrição e Produção Animal - FMVZ – USP/Pirassununga.
e-mail: [email protected]
Palavras-chave: fisiologia, neuropeptídeo Y, puberdade, qPCR, reprodução
A raça Nelore (Bos taurus indicus) compõe a base da pecuária de corte nacional. O Nelore possui lenta maturação
sexual, o que limita a taxa de desfrute do rebanho. O estudo do mecanismo fisiológico estimulando a puberdade
não é bem entendido, porém diversos estudos apontam a leptina como seu principal limitante em novilhas mal
alimentadas. A sinalização do neuropeptídeo Y (NPY) no hipotálamo regula os efeitos da leptina na atividade
reprodutiva. A elucidação do mecanismo regulando a precocidade sexual de fêmeas Nelore é imprescindível para
o desenvolvimento de um protocolo terapêutico de indução da puberdade ou em programas de seleção genética
mais eficazes visando aumentar a eficiência da produção de novilhos de corte. Trinta e seis novilhas zebuínas não
púberes, e com idade entre 18 e 20 meses, foram divididas em três grupos experimentais: baixa energia (BAIXA),
alta energia (ALTA), baixa energia com administração de leptina recombinante ovina (BAIXA+LEP), totalizando 55
dias de tratamento. Vinte e quatro novilhas foram selecionadas para o abate ao apresentarem sinais de puberdade,
são eles: concentração de progesterona no soro superior a 1 ng/ml por duas amostras seguidas, acompanhado pela
presença de corpo lúteo detectável por ultra-sonografia. As novilhas foram abatidas e o hipotálamo foi colhido. As
amostras de hipotálamo foram submetidas à extração do RNA total pelo método do Trizol, tratadas com DNAse
I e submetidas à síntese de cDNA. Os primers para quantificação da expressão gênica foram delineados segundo
a região codificante das sequências de três genes candidatos reconhecidamente envolvidos com a sinalização
hipotalâmica da leptina em bovinos: NPY, NPY-Y1 e NPY-Y4. A quantificação relativa da expressão gênica foi feita
utilizando-se aparelho de Real Time PCR StepOne e o corante SYBR Green® (Applied Biosystems). Não houve efeito
da administração de leptina sobre a expressão do NPY (p=0,70), ou de seus receptores: NPY-Y1 (p=0,72) e NPY-Y4
(p=0,96) no início da puberdade. Porém, em novilhas alimentadas com dieta de alta energia, a expressão do NPY-Y1
foi reduzida (p=0,02), o que indica que o hipotálamo estaria menos sensível à ação do NPY, permitindo a entrada
em puberdade precocemente. Os resultados encontrados com o NPY-Y1 nesse experimento corroboram com
resultados encontrados por Vaiciunas et al. (2008) de menor expressão desse receptor no hipotálamo de novilhas
precoces. Estudo mais abrangente do efeito da nutrição e da administração de leptina será realizado através de
hibridização em microarranjos de DNA.
Apoio Financeiro: FAPESP
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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200
Associação dos marcadores moleculares de IGF1, GH e
PIT1 com os valores genéticos para perímetro escrotal
em bovinos da raça canchim
Munari, DP1; Grossi, DA1,2; Grupioni, NV1,3; Alencar, MM4; Regitano, LCA4; Paz, CCP5
Departamento de Ciências Exatas – FCAV/UNESP – Jaboticabal/SP. 2Aluna de Doutorado do Programa de Genética e Melhoramento
Animal da FCAV/UNESP – Jaboticabal/SP, bolsista FAPESP. 3Aluna do curso de Zootecnia da FCAV/UNESP – Jaboticabal, bolsista
FAPESP/IC. 4Embrapa Pecuária Sudeste – São Carlos/SP. 5APTA/SAA, Ribeirão Preto/SP.
[email protected]
1
Palavras-chave: associações genéticas, QTL, seleção assistida por marcadores, correlação genética, características reprodutivas
Na espécie bovina, os genes do fator do crescimento semelhante à insulina tipo 1 (IGF1), do hormônio do
crescimento (GH) e do fator de transcrição da pituitária (PIT1) podem estar associados com características de
crescimento e reprodutivas, pois estão envolvidos em processos de regulação do desenvolvimento animal. Desta
forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos dos marcadores moleculares de IGF1 (225, 227, 229 e 231),
GH (L e V) e PIT1 (+ e -) sobre as estimativas dos valores genéticos para perímetro escrotal medidos aos 12 (PE12)
e 18 (PE18) meses de idade. Os dados utilizados são provenientes do rebanho de bovinos da raça Canchim da
Embrapa Pecuária Sudeste. As análises para estimação dos valores genéticos de PE12 (VGPE12) e PE18 (VGPE18)
foram efetuadas pelo método de máxima verossimilhança restrita, em modelo animal bi-característica de idade ao
primeiro parto (IPP) com PE12 e com PE18. O modelo animal de IPP, PE12 e PE18 incluíram os efeitos aleatórios,
aditivo direto e residual e o efeito fixo de grupo de contemporâneo (GC) e de grupo genético do pai. Além destes
efeitos, foi considerada para IPP a co-variável idade da mãe como efeito linear e quadrático e para PE12 e PE18 a
idade em que foi mensurada a observação como co-variável linear. Estas análises foram realizadas com 1916, 2538 e
2538 animais que possuíam informações de IPP, PE12 e PE18, respectivamente. As estimativas de herdabilidade de
IPP, PE12 e PE18 foram iguais a 0,09, 0,48 e 0,51. Apesar de PE18 ter apresentado maior estimativa de herdabilidade,
a correlação genética de PE18 com IPP teve menor magnitude (-0,11) do que a correlação genética de PE12 com
IPP (-0,16). Análises pelo método dos quadrados mínimos foram efetuadas para verificar o efeito do genótipo dos
animais quanto aos marcadores de IGF1, GH e PIT1 sobre VGPE12 e VGPE18. O modelo estatístico incluiu os efeitos
fixos de sexo e da classe de genótipo de IGF1, GH ou PIT1, considerando 1393, 756 e 516 animais que possuíam
informações de IGF1, GH e PIT1, respectivamente. Quando houve efeito significativo dos genótipos, as médias
foram comparadas pelo teste de Duncan a 5%. Apenas o IGF1 apresentou efeito significativo (P<0,05) sobre VGPE12
e VGPE18. A comparação de médias de VGPE12 indicou que os animais com genótipo 231/231 apresentaram menor
média (P<0,05) do que os animais 225/225. Para VGPE18, os animais 231/225 apresentaram menor média (P<0,05)
do que os 225/227 e 227/229, que foram estatisticamente iguais aos 225/225. Considerando que o alelo 225 esteve
presente nos melhores animais geneticamente tanto para PE12 quanto para PE18, a seleção a favor de animais
portadores deste alelo e sem o alelo 231, seria indicada para obter maiores perímetros escrotais nestas idades.
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201
Marcadores moleculares para produção de queijo:
freqüências alélicas e genotípicas do polimorfismo no
lócus da β-lactoglobulina na raça Guzerá
Figueiredo, PO1; Steinberg, RS1; Machado, MA2; Peixoto, MGCD2; Verneque, RS2; Carvalho, MRS1
Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brasil.
Embrapa Gado de leite, Juiz de Fora, MG, Brasil.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: melhoramento genético, marcadores moleculares, Guzerá,polimorfismo,β - lactoglobulina.
A combinação do desenvolvimento científico e tecnológico permitiu a utilização de marcadores moleculares,
para detectar diferenças na seqüência do DNA, possibilitando a seleção indireta baseada em alelos de interesse.
Variações na estrutura molecular das lactoglobulinas, proteína mais abundante no soro do leite, estão relacionadas a características da produção leiteira. Dentre as lactoproteinas, a β-lactoglobulina influencia o rendimento e
composição do leite bovino. Em um dos polimorfismos deste locus, o alelo A tem sido relacionado a uma maior
produção de leite, concentração de proteínas e a menores concentrações de caseínas. Já o alelo B está associado a
uma maior retenção de gordura e de caseínas no coágulo, características importantes para a produção de queijo.
O Guzerá é uma raça de dupla aptidão, uma vez que é usada tanto para produção de leite como de carne, e está
bem adaptada às condições climáticas do Brasil. Tendo em vista a importância econômica da produção de diferentes tipos de queijo no Estado, é de interesse o melhoramento do rebanho, visando características produtivas e
rendimento da produção queijeira. Com o objetivo de estimar a freqüência alelica do locus da β-lactoglobulina na
raça Guzerá, foi genotipada uma amostra representativa da população do Nordeste e Sudeste do país. O DNA foi
extraído a partir do sangue periférico e a genotipagem foi feita pelo método PCR-RFLP com o uso da enzima HaeIII.
A frequência do alelo B foi 0, 808 e as freqüências genotípicas foram: AA 0,03, AB 0,26 e BB 0,71. De acordo com
estudos anteriores, o alelo B aparece nas raças Sindi, Nelore e Gir nas respectivas freqüências: 0,955; 0,559; 0,638.
Os resultados observados e esperados são compatíveis com a hipótese de equilíbrio de Hardy-Weinberg, para todas
as raças citadas. Esse marcador poderá vir a ser utilizado na especialização do rebanho para produção de queijo.
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202
Avaliação da diversidade genética em rebanhos da
raça Guzerá por meio de dados moleculares
Gasparini, K1; Cestaro, LS¹; Bernardo, KB¹; Pinto, ISB¹; Steinberg, RS²; Domingues, R¹; Palla, PC; Carvalho,
MRS²; Azevedo, ALS¹; Machado, MA¹; Peixoto, MGCD¹
¹ Embrapa Gado de Leite-Laboratório de Genética Molecular
² Universidade Federal de Minas Gerais-UFMG
Palavras-chave: Bos indicus, endogamia, heterozigosidade, melhoramento, microssatélite
A raça Guzerá (Bos indicus) equivale na Índia a Kankrej, sendo criada principalmente em terras baixas e secas,
em solos arenosos e sem árvores. Desta forma, a rusticidade do Guzerá foi desenvolvida ao longo dos séculos nas
condições adversas da região de origem, o que favoreceu sua adaptação a várias regiões do mundo. No Brasil, o Guzerá veio com as primeiras importações de zebu, em torno de 1870 e se adaptou de forma satisfatória às condições
climáticas brasileiras, revelando sua alta capacidade para produção de carne e leite. O Guzerá foi a raça indiana
mais utilizada até 1930 para formação de raças indu-brasileiras. Devido a sua dupla aptidão e rusticidade a raça
vem sendo intensamente utilizada em cruzamentos o que leva a redução no tamanho efetivo da população. Essa
redução, em conjunto com o valor biológico da raça, fizeram com que a FAO (Food and Agriculture Organization)
incluísse, em 1991, o Guzerá como recurso genético a ser preservado. A implementação do Programa Nacional de
Melhoramento do Guzerá para leite em 1994 fez aumentar a preocupação em torno da preservação dos recursos
genéticos da raça, pois as metodologias nele empregadas (seleção baseada em teste de progênie e núcleo MOET)
aumentam a endogamia, reduzem a introgressão de novas variantes genéticas e aumentam a utilização de touros
ou linhagens de maior valor econômico. Com o objetivo de avaliar e monitorar a variabilidade genética na raça
foram selecionados 11 marcadores microssatélites baseados na heterozigosidade e número de alelos dos marcadores. Foram amostrados 10% do total de animais mais representativos da raça, localizados em Minas Gerais e Espírito Santo, totalizando 384 animais. Amostras de sangue foram submetidas à extração de DNA. O produto da extração foi quantificado e qualificado por nanoespectrofotometria. As amostras foram amplificadas pela PCR sendo
seu produto submetido à eletroforese capilar no aparelho MegaBACE 1000 (GE Healthcare). Análises dos genótipos
foram feitas usando o programa Fragment Profiler (GE Healthcare). O equilíbrio de Hardy-Weinberg foi testado por
meio do programa GENEPOP versão 3.4 e a heterozigosidade calculada pelo programa FSTAT. Um total de 150
alelos foi encontrado na população obtendo uma média de 13,6 alelos por marcador. O menor número de alelos
encontrados foi 8 e o maior 21, nos marcadores NRDIKM004 e DIK5183 respectivamente. A elevada heterozigosidade observada (0,708) e a esperada (0,745), sugerem a existência de alta diversidade genética na população em
estudo. A maioria dos locos microssatélites encontra-se em equilíbrio de Hardy-Weinberg, exceto o loco DIK4513.
Tal fato sugere a associação desse marcador com alguma característica de interesse econômico que possivelmente
está sendo selecionada nos programas de melhoramento. Outros 10 marcadores microssatélites serão analisados
visando obter um maior poder de discriminação.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPEMIG
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Investigação e variabilidade genética de polimorfismos
no gene da oxitocina bovina em animais da raça Guzerá
Rosse, IC¹; Steinberg, RS¹; Sandes, SHC ¹; Machado, MA²; Peixoto, MGCD²; Verneque, RS²; Carvalho, MRS¹
Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG, Brasil
Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: ejeção do leite; Guzerá; marcadores moleculares; oxitocina; SNPs.
O gene da oxitocina, localizado por mapeamento físico no cromossoma 13 de bovinos, codifica um neuropeptídeo
liberado pela neuro-hipófise em resposta à estimulação tátil das tetas pelo bezerro, manualmente ou através de
máquinas de ordenha. A oxitocina é responsável pela ejeção do leite a qual é importante durante a amamentação
ou ordenha para obtenção do leite alveolar que pode representar mais que 80% do leite estocado no úbere de vacas leiteiras. Ela está envolvida também na formação de vínculo materno e é fundamental no estabelecimento do
cuidado parental, sendo este um importante fator na determinação da sobrevivência e viabilidade da prole. Além
disso, esse hormônio é também importante no processo de contração muscular durante o parto. Visto que existem
poucos estudos para validação de marcadores moleculares em Bos indicus (espécie predominante no Brasil) e com
o objetivo de investigar a existência de variantes neste gene em animais da raça Guzerá, amplificamos e sequenciamos a região do gene em 12 touros oriundos do núcleo MOET do Programa Nacional de Melhoramento do Guzerá
para leite de diferentes rebanhos brasileiros. O DNA foi obtido do banco de DNA da EMBRAPA Gado de leite. A
amplificação do gene foi feita por PCR e o seqüenciamento foi realizado pelo método de Sanger com kit ABI Prism
Big Dye Terminator v3.1 em um sequenciador ABI3130. A análise de qualidade e a edição das sequências foi realizada utilizando o pacote PhredPhrap/Consed. Os polimorfismos de nucleotídeo-único (SNPs) foram identificados
usando alinhamento múltiplo (MEGA 4.0). A sequência de referência usada foi da espécie Bos taurus depositada
no NCBI. Foram identificados 8 SNPs correspondentes a regiões intrônicas do gene, observando-se: na posição
390 da sequência referência, substituição T→G ( freqüência do alelo G: 0,92); posição 423, substituição G→T ( freq.
alelo T: 0,58); posição 459, substituição C→T ( freq. alelo T: 0,42); posição 515, substituição C→T ( freq. alelo T: 0,08);
posição 527, substituição A→G ( freq. alelo G: 0,17); posição 648, substituição G→T ( freq. alelo T: 0,33); posição 658,
substituição T→C ( freq. alelo C: 0,25); posição 890, substituição T→C ( freq. alelo C: 0,17); sendo os sete primeiros
presentes no íntron 1 e o último no íntron 2. Estimamos a fase de ligação dos haplótipos através do PHASE 2.1.1 e
com isso montamos a árvore filogenética enraizada por uma sequência de Ovis aries depositada no NCBI pelo método de Neighbor-Joining. Com a árvore foi possível observar que os 12 haplótipos formados se separam em duas
linhagens haplotípicas (uma com 7 e outra com 5). Esse estudo fornece os primeiros SNPs identificados na região
do gene da oxitocina em animais da raça Guzerá. Nosso próximo passo será estabelecer uma correlação entre os
polimorfismos e variações observadas na ejeção do leite e na viabilidade da prole.
Apoio Financeiro: CNPQ, FAPEMIG E CAPES
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204
Variabilidade genética do gene da Prolactina (PRL) na
raça Guzerá (Bos indicus)
Sousa, GE1; Steinberg, RS1; Rosse, IC1; Figueiredo, PO1; Peixoto, MGCD2; Machado, MA2; Carvalho, MRS1
Universidade Federal de Minas Gerais – Departamento de biologia Geral – Instituto de Ciências Biológicas – Av. Antônio Carlos, 6627 –
Pampulha, Belo Horizonte – MG 31770-901
2
Embrapa Gado de Leite – Rua Eugênio do Nascimento, 610 – Bairro Dom Bosco, Juiz de Fora, Minas Gerais – 36038-330
1
Palavras-chave: Guzerá, prolactina, melhoramento genético, PCR-RFLP, seleção assistida.
A prolactina (PRL) é um hormônio polipeptídio, secretado pela glândula pituitária anterior, com múltiplas funções,
tais como a regulação do desenvolvimento da glândula mamária, inicio e manutenção da lactação e também a
produção de leite. Além disso, a PRL influencia a atividade dos genes das proteínas do leite. Por isso, o gene da
PRL bovina é visto como um excelente candidato para análise de ligação com loci de características quantitativas
(QTL) que afetam a quantidade de produção do leite. A raça Guzerá é tradicionalmente considerada de dupla
aptidão, leite e corte, se destacando por sua rusticidade, ou seja, termotolerância, resistência aos ecto e endoparasitas, boa adaptação a terrenos irregulares e capacidade de utilização de forrageiras grosseiras; características que
a qualificam como raça adaptada às condições tropicais. O objetivo desse trabalho é genotipar os animais da raça
Guzerá (Bos indicus) e determinar a frequência dos alelos A e B para o gene da PRL bovina. A amostra é composta
por 500 animais pertencentes ao Programa Nacional de Melhoramento do Guzerá para Leite da Embrapa Gado de
Leite. A detecção da variabilidade genética do gene da PRL foi feito através de PCR-RFLP, onde fragmentos do éxon
três foram amplificados e o produto da PCR foi digerido com a endonuclease de restrição Rsa1, sendo analisados
por eletroforese em gel de poliacrilamida a 8%, corados com nitrato de prata. O alelo B apresenta o sitio de restrição
e gera dois fragmentos, um de 74pb e outro de 82pb, já o alelo A, que não tem o sitio de restrição, gera um fragmento
de 156pb. Nos animais avaliados a freqüência do alelo A é 0,337 e o alelo B é 0,663, sendo 66 (13,2%) animais com
genótipo AA, 205 (41,0%) com genótipo AB e 229 (45,8%) com genótipo BB. Todas as frequências encontram-se em
equilíbrio de Hardy-Weinberg (p>0,05). O genótipo BB da PRL bovina está relacionado a uma menor quantidade
de gordura no leite em algumas raças. Alguns estudos demonstram que vacas com genótipo AB apresentam uma
maior produção de leite, enquanto vacas AA apresentam maior teor de gordura no leite. O presente projeto abre
caminho para estudos de associação entre os genótipos encontrados e os dados de produção, fornecendo, assim,
uma ótima ferramenta para seleção assistida por marcadores moleculares da raça Guzerá no Brasil.
Apoio financeiro: Embrapa, Fapemig e CNPq
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Caracterização molecular de uma amostra de touros
da raça Nelore
Regitano, LCA1; Tizioto, PC2; Siqueira, F3; Rosa, AN3; Silva, LOC3; Torres Júnior, RAA3; Cervini, M2; Veneroni,
GB2; Ibelli, AMG2; Alencar, MM1.
Embrapa Pecuária Sudeste - São Carlos/SP.
Programa de pós-graduação em Genética e Evolução - UFSCAR.
3
Embrapa Gado de Corte - Campo Grande/MS.
1
2
Palavras-chave: Nelore, variabilidade, SNP, qualidade de carne
A raça Nelore é de procedência indiana e em seu país de origem é utilizada exclusivamente para produção de leite.
No Brasil, sofreu intenso melhoramento genético para produção de carne e representa hoje a principal raça de
corte do País. A genética é um dos fatores determinantes nas características de qualidade da carne. Polimorfismos de base única (SNPs) têm sido elencados para associação com estas características, porém a maioria destes
trabalhos diz respeito à populações e condições de criação do hemisfério Norte, focalizando raças de bovinos Bos
taurus. Estudos de avaliação da segregação destes polimorfismos em bovinos Bos indicus são incipientes. O presente trabalho teve por objetivo avaliar a variabilidade de uma amostra de 30 touros, representativa das principais
genealogias de Nelore comercializadas no País, quanto à polimorfismos em genes candidatos para qualidade de
carne, investigando a viabilidade de estudos de associação nesta raça. Foram genotipados 7 SNPs previamente
determinados para populações de Bos taurus localizados nos genes candidatos Tireoglobulina (TG - C/T - região
5´ líder), Proteasome 26S subunit ATPase 1 (PSMC1- G/A - intron 9), Leptina (Lep - C/T - intron 2), Peroxisome
proliferator-activated receptor gamma, coactivator 1 alpha (PPARGC1A - C/T - intron 9), Corticotropin releasing hormone (CRH - C/T - região promotora), Development and differentiation enhancing factor 1 (DDEF1 - G/A - intron
13) e m-Calpaína (CAPN - G/A - exon 14 codon 53). Os SNPs dos genes DDEF1 e CAPN foram genotipados pela
técnica ARMS-PCR, todos os demais por PCR-RFLP. Foi utilizada a versão do software Genepop disponível na Web
para estimar as freqüências alélicas e genotípicas de cada marcador. Os SNPs dos genes TG, PSMC1A e Lep, não
foram polimórficos nesta amostragem. Para o SNP no CRH, o alelo T foi encontrado em uma freqüência muito
baixa (3,3%). Os polimorfismos dos genes PPARGC1A, DDEF e CAPN se mostraram mais informativos. Os alelos de
maior ocorrência apresentaram freqüência de 80% (alelo C - PPARGC1A), 90% (alelo G - DDEF1) e 91,7% (alelo G
- CAPN). A frequência de heterozigotos dos SNPs avaliados variou de zero a 33,33%, indicando que polimorfismos
descritos para raças taurinas não são adequados para estudos de segregação na raça Nelore. O desenvolvimento de
um projeto de identificação de polimorfismos especificamente para a raça Nelore deverá contribuir para a efetiva
aplicação da genética molecular ao melhoramento dessa raça no Brasil.
Apoio Financeiro: Embrapa, FAPESP, CAPES e CNPq.
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Identificação do polimorfismo IGF2/MboII em
populações bovinas da raça Nelore
Martins da Silva, A; Renzi, A; Rios, AFL; Galerani, MAV; Vila, RA; Ramos, ES; Lôbo, RB; de Freitas, MAR
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: IGF2 (Insulin-like growth factor 2), imprinting genômico, polimorfismo
O gene IGF2 (Insulin-like growth factor 2) é responsável pela proliferação e diferenciação celular e participa de várias
etapas do desenvolvimento embrionário e fetal dos mamíferos e está localizado no cromossomo 29 em bovinos.
O gene IGF2 é regulado pelo mecanismo epigenético denominado imprinting genômico. O objetivo deste estudo
foi verificar a ocorrência do polimorfismo IGF2/MboII (substituição C/T) em 81 animais participantes de um teste
de touros jovens, pertencentes da raça Nelore, considerada de grande importância econômica para a produção de
carne no país. A partir da genotipagem de um fragmento de 193 pb localizado no exon 6 do gene IGF2 bovino foi
identificado o polimorfismo IGF2/MboII. A região estudada foi amplificada por PCR com iniciadores específicos
para esta região e digeridos com a enzima MboII para análise da presença do segmento polimórfico. Os produtos de
PCR foram genotipados e estimadas as freqüências para os alelos C e T com os valores de 0,4320 e 0,5680, respectivamente. A freqüência genotípica observada foi 0,1975 para CC, 0,3333 para TT e 0,4691 para CT. A partir desta
pesquisa, a investigação de uma possível correlação desse polimorfismo com caracteres fenotípicos de importância econômica. A genotipagem de poderá auxiliar também na consolidação desse modelo animal para estudos
futuros da influência da expressão alelo específica do IGF2 e o padrão não mendeliano de herança sobre caracteres
fenotípicos associados a esse gene.
Apoio financeiro: PRONEX, FAPESP, CNPq, ANCP e CAPES.
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Identificação do polimorfismo do gene TG no sêmen de
touros da raça Nelore
Renzi, A; Martins da Silva, A; Elias, FP; Vila, RA; Galerani, MAV; Lôbo, RB
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: TG (tireoglobulina), polimorfismo, marmoreio
O uso de marcadores moleculares surgiu como uma ferramenta para auxiliar o melhoramento genético bovino
tradicional de forma mais precisa. Características de interesse econômico, como o conteúdo de gordura intramuscular, também conhecido como marmoreio da carne, podem ser analisadas através destes marcadores. O
gene codificando a tireoglobulina (TG) está localizado no cromossomo 14 bovino e seu produto é precursor de
hormônios tireoidianos que afetam o metabolismo de lipídios, tendo um papel na diferenciação de adipócitos, e
também na deposição de células de gordura nos músculos. O objetivo deste estudo foi verificar a ocorrência de um
polimorfismo (substituição C/T) na região 5’ não traduzida (5’UTR) deste gene em 74 touros jovens pertencentes a
um programa de melhoramento genético, da raça Nelore. A ocorrência de polimorfismo nesta região pode indicar
diferenças na deposição de gordura muscular.
Um fragmento de 548 pb foi amplificado por PCR com iniciadores específicos para esta região a partir de DNA extraído do sêmen destes touros, seguido por digestão com a enzima de restrição PsuI para a identificação de alelos
distintos. Dos 74 touros analisados nessa região, somente um apresentou a presença de dois alelos diferentes (CT).
Os outros 73 animais apresentaram o genótipo CC e nenhum apresentou o genótipo TT. Através da análise destes
dados verificamos que a freqüência genotípica observada foi de 0,9864 para CC, 0 para TT e 0,0135 para TC, sendo
que as freqüências alélicas foram de 0,9932 para o alelo C e 0,0068 para o alelo T. Este estudo poderá contribuir para
o melhoramento da raça Nelore, considerado de grande importância econômica na produção de carne deste país.
Apoio financeiro: PRONEX, FAPESP, CNPq, ANCP e CAPES.
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Análise da expressão gênica da Leptina e sua
associação com a puberdade em novilhas Nelore
Savalio, FRH1; Ambo, M1; Campos, RLR1; Silva, LFP2; Pires, AV1; Coutinho, LL1
Departamento de Zootecnia. ESALQ/USP
Departamento de Nutrição e Produção Animal. FMVZ/USP
Email: [email protected]
1
2
Palavras-chave: leptina, expressão gênica, novilhas, Bos indicus, puberdade
Nos últimos anos a leptina, conhecido como o gene da obesidade, vem sendo objeto de intensa investigação em
bovinos, possivelmente pela sua importante associação com características econômicas. Em Bos taurus a leptina
está associada com a regulação do metabolismo energético, eficiência e consumo alimentar, deposição de gordura
na carcaça e características reprodutivas. Estudos anteriores apontam também que ela possa estar influenciando
o início da puberdade tanto em animais como em humanos. Acredita-se que esse gene tenha a mesma função em
Bos indicus, todavia, os estudos nesta espécie ainda são escassos. Tendo em vista a importância desse gene para a
pecuária e sendo o rebanho nacional constituído principalmente por animais zebuínos, o objetivo do presente trabalho foi testar a hipótese de que a entrada mais cedo na puberdade em nelores está associada com uma maior expressão desse gene nas novilhas. Foram feitas análises por RT-PCR em tempo real utilizando-se cDNA sintetizado
a partir de RNA total extraído de amostras de tecido adiposo de 28 novilhas nelores, com idade em torno de 24 meses, sendo 14 púberes e 14 pré-púberes. Foi desenhado um par de primer em região de exon para a amplificação do
RNAm e realizado o método da quantificação relativa para a análise da expressão gênica, empregando-se o RPL19
como gene referência. Os dados obtidos foram analisados pelo programa REST 2008 e mostraram que a expressão
da leptina foi maior (p<0,03) nas novilhas que estavam ciclando, sugerindo que essa possa estar influenciando o
início da puberdade nestes animais.
Apoio Financeiro: FAPESP E CAPES.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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209
Expressão de genes das proteínas de choque térmico
em bovinos Nelore, Senepol X Nelore e Angus X Nelore
após estresse térmico
Ribeiro, ARB1; Alencar, MM2; Ibelli, AMG 3; Carvalho, FM4; Souza, JRT5; Regitano, LCA2
Pós-doutoranda da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Centro de Pesquisa Pecuária do Sudeste, São Carlos – SP. Bolsista
FAPESP
2
Pesquisador da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Centro de Pesquisa Pecuária do Sudeste, São Carlos – SP. Bolsista CNPq
3
Aluna de doutorado do Programa de Pós-Graduação em Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, Bolsista CAPES
4
Aluno de doutorado do Programa de Pós-Graduação em Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, Bolsista CNPq
5
Centro Universitário Central Paulista (UNICEP), São Carlos, SP, Bolsista CNPq-PIBIc
1
Palavras-chave: bovinos, expressão gênica, HSP, qPCR, estresse térmico
A utilização de raças taurinas de corte em sistemas de cruzamento com raças zebuínas tem sido amplamente
difundida no Brasil, tendo como principal objetivo o aumento da produção e da qualidade do produto final, a
carne. Todavia, a maioria das raças taurinas altamente produtivas possui menor adaptação à ambientes tropicais,
sendo que pouco se sabe sobre a adaptabilidade dos produtos de seus cruzamentos às condições brasileiras. As
“proteínas de choque térmico” (Hsps – “Heat shock proteins”) foram assim nomeadas por terem sido identificadas
primeiramente como aquelas cuja expressão era significativamente aumentada pela exposição ao calor, sendo que
células desprovidas ou com baixos níveis dessas proteínas toleram menores níveis de estresse do que outras com
níveis normais. Com base no exposto, o objetivo deste estudo foi avaliar a expressão de três genes da família das
heat shock proteins, HSPA6, HSPA1A e HSF1 em 15 fêmeas de cada um dos grupos genéticos Nelore (NX), Senepol x
Nelore (SN) e Angus x Nelore (AN) submetidas a um teste de tolerância ao calor realizado em três dias quentes, de
céu aberto, nos meses de verão. Nessas datas os animais foram levados para o curral aproximadamente às 6 horas
da manhã e mantidos com acesso à água até as 8 horas, quando foram tomadas as primeiras medidas (manhã). Em
seguida, os animais permaneceram no curral sem acesso à água e à sombra até às 13 horas, quando foram realizadas novas medidas (tarde). Nas duas medidas foram coletadas amostras de sangue para as análises da expressão
dos genes alvo. A quantificação dos genes foi realizada pela técnica de RT-PCR em tempo real, utilizando o gene
constitutivo RPL-19, como controle e SYBR Green, como fluoróforo. As análises referentes às quantificações relativas foram realizadas utilizando o programa REST 2008 (Relative Expression Software Tool), específico para análises
de PCR quantitativo. Quanto aos resultados dos genes analisados, apenas os animais AN apresentaram indução da
expressão do gene HSF1 no período da tarde em relação ao período da manhã. Para as diferenças entre os grupos
genéticos no período da manhã, o grupo AN apresentou menor abundância de mRNA do que o grupo controle
(NX). Na análise de todos os grupos genéticos em conjunto, entre os horários manhã x tarde, houve efeito significativo para o gene HSF1 (P<0,05) e tendência para o gene HSPA6 (P=0,08) de maior expressão destes na medida da
tarde. Não foram observadas diferenças para o gene HSPA1A. Com base nesses resultados, pode-se concluir que, o
gene HSF1 apresentou maior resposta ao estresse térmico imposto, e, entre os grupos genéticos estudados, o AN,
foi o grupo menos adaptado.
Apoio Financeiro: FAPESP
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210
Expressão gênica de bovinos Nelore e cruzados Canchim
X Nelore, Simental X Nelore e Angus X Nelore infestados
com carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus
Ibelli, AMG1; Souza, JRT2; Gasparin, G3; Oliveira, MCS4; Alencar, MM4†; Coutinho, LL5†; Veneroni, GB5;
Tizioto, PC5; Regitano, LCA4†
Programa de Pós-Graduação em Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, Bolsista CAPES. [email protected]
Centro Universitário Central Paulista (UNICEP), São Carlos, SP, Bolsista CNPq-PIBIc
3
Bolsista DTI-CNPq
4
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária, Centro de Pesquisa Pecuária do Sudeste, São Carlos – SP. †Bolsista CNPq
5
Universidade de São Paulo, ESALQ, Piracicaba. †Bolsista CNPq
6
Programa de Pós-Graduação em Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos, Bolsista FAPESP
1
2
Palavras-chave: bovinos, expressão gênica, citocinas, qPCR, carrapato
O carrapato Rhipicephalus (Boophilus) microplus é considerado um dos maiores causadores das perdas produtivas de bovinos no Brasil e no mundo. Estimativas sugerem que as perdas anuais, apenas no Brasil, sejam de dois
bilhões de dólares (GRISI et al, 2002). Considerando essa perspectiva, muitos são os estudos visando entender
os mecanismos de resistência de bovinos ao carrapato, assim como a interação parasita-hospedeiro. Dentre os
mecanismos propostos, o sistema imune parece ser o fator mais importante na regulação desta resistência. Desta maneira, o objetivo deste projeto foi verificar a abundância de RNA mensageiro (mRNA) das citocinas IL-2,
IL-4, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, MCP-1 e TNF-α em linfonodos de bovinos submetidos a infestação com carrapato
Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Cinco animais resistentes e cinco animais sensíveis de cada um dos grupos
genéticos Nelore, Canchim x Nelore, Simental x Nelore e Angus x Nelore foram submetidos à infestação artificial
com carrapato. No nono dia da infestação foi feita a coleta dos linfonodos e então foi realizado o isolamento do
RNA total e síntese de cDNA por transcrição reversa. A quantificação das citocinas foi avaliada pela técnica de
RT-PCR em tempo real, utilizando o gene constitutivo RPS-9, como controle e SYBR Green, como fluoróforo. As
análises referentes às quantificações relativas foram realizadas utilizando o programa REST 2008 (Relative Expression Software Tool), específico para análises de PCR quantitativo. Os resultados comparando os animais resistentes
e sensíveis dentro de cada grupo genético mostram que a expressão de IL-2 (p <0,05) em Nelore, parece conferir
resistência, pois esta citocina foi aproximadamente cinco vezes mais expressa em animais resistentes. Os animais
sensíveis tiveram uma tendência de aumento de IL-12 (p<0,10) de cerca de cinco vezes e de cinco vezes de IL-13
(p <0,05). Já no grupo genético Canchim x Nelore, os animais sensíveis apresentaram super expressão de IL-4 (p
<0,05) quando comparados aos resistentes. Os animais sensíveis Simental x Nelore apresentaram uma tendência
de maior expressão de cinco vezes para IL-8 (p < 0,10), enquanto que não foi possível encontrar diferenças significativas de expressão gênica entre os animais Angus x Nelore resistentes e sensíveis. Apesar de ter-se observado
importante variação racial, pode-se concluir que os genes IL-2, IL-4, IL-8, IL-12 e IL-13 são importantes na resposta
a infestação por carrapatos nesse período da infestação, e que a expressão de IL-2 deve estar relacionada a mecanismos de proteção contra o carrapato.
Apoio Financeiro: CNPq, CAPES
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211
Identification of cattle-tick interaction-related genes by
means of transcript co-expression analysis
Giachetto, PF1; Santos, EH1; Kuser-Falcão, PR1; Yamagishi, MEB1
Laboratório de Bioinformática Aplicada – Embrapa Informática Agropecuária
[email protected]
1
Keywords: microarray, bioinformatics, cattle, Riphicephalus (Boophilus) microplus, co-expression
Microarray-based assay technology provides investigators with the ability to measure the mRNA levels of thousands of genes in a single experiment. In the last years, a large number of laboratories has generated microarray
data. Once the results are analyzed, by means of bioinformatics and statistical analysis procedures, biological information is inferred and scientific papers are published. However, the analysis are conducted within a context
limited to the question to be answered by the researcher at that time, leaving behind a richness of data to be explored. Through an effort led by the MGED Society, the raw data obtained from these experiments have been made
available in public repositories, providing a potential source for new analysis and findings. Effective access to these
data and, in particular, efficient comparison and integration of data obtained in related biological systems provide
researchers with an opportunity to address complex questions in an effective way. Furthermore, a combination of
data from related studies could mean a methodological advance, since it can mitigate a negative aspect often associated with the microarray technique - the limited number of samples, face the complexity of biological issues to
be assessed. Given the existence of microarray data obtained from cattle exposed to the tick Riphicephalus (Boophilus) microplus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo), this study used a co-expression based analysis in search for new
genes that may be involved in the host-parasite resistance mechanism. This approach is based on the assumption
that co-expressed genes may be involved in the same biological pathway, with similar or related function. Two bovine microarray data sets (Affymetrix platform) were included in this study. Raw data were processed using the Affy
package developed for the R programm. The background was corrected by RMA and normalization made by the
quantile method. Summarization was performed using the medianpolish algorithm. After processing, data were
divided into two matrices, called I (infested animals) and NI (non-infested). A group of genes related to immune
response, and reported in previous studies with animals subjected to infestation by ticks was used in the analysis.
These genes served as drivers to find new co-expressed target genes. For co-expressed genes identification, a Ndimensional vector was created for each chip present gene, and co-expression was calculated using Pearson correlation coefficient. The results revealed transcripts co-expressed with the selected genes, which differed between
groups I and NI. Most of the genes were related to cell signaling associated with immune response. These findings
allowed us to conclude that the strategy used may contribute to the discovery of new participants in pathways that
may be involved in the mechanism of cattle resistance to R. Microplus.
Financial support: Embrapa
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212
Produção de anticorpos específicos para os hormônios
GDF9 e BMP15 de bovinos
Araujo, VGB1,3; Paulini, F1,2; Oliveira, GS1,3; Rua, PJS1; Franco, MM1; Melo, EO1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília-DF
Faculdade de Agronomia e Veterinária, Universidade de Brasília.
3
Instituto de Biologia, Universidade de Brasília
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Reprodução, Desenvolvimento folicular, TGF-ß, Expressão protéica, Fatores de crescimento intraovariano
Os genes GDF9 (Growth differentiation factor 9) e BMP15 (Bone morphogenetic protein 15) são membros da superfamília TGFβ (Transforming growth factor - beta) e são importantes fatores de crescimento intraovariano. O GDF9
e BMP15 são produzidos pelos ovócitos e possuem ações diversas em diferentes espécies de mamíferos, podendo,
por exemplo, estimular a proliferação das células da granulosa. As proteínas Gdf9 e Bmp15 estão intimamente
ligados ao processo de desenvolvimento do folículo ovariano, sendo que ambos têm a estrutura peptídica muito
semelhante e são compostos por um peptídeo sinal, um pré-peptídeo e o peptídeo maduro. A região do peptídeo
maduro é extremamente conservada nessas duas proteínas, o que faz com que anticorpos policlonais produzidos
para essa região sejam inespecíficos, apresentando reação cruzada entre Bmp15 e Gdf9. Com o objetivo de possibilitar o estudo preciso desses fatores de crescimento e suas funções no sistema reprodutivo feminino, uma região
com maior grau de diferenciação entre os fatores, contida no pré-peptídeo, foi clonada em vetor de expressão a
partir do DNA de bovinos. Parte da seqüência codificadora do pré-peptídio de cada gene foi amplificada por PCR
a partir do DNA genômico extraído de leucócitos. Os amplicons foram clonados no vetor pGEM-Teasy e posteriormente transferido para o vetor de expressão pET21b. Para expressão dos fatores foi utilizada a linhagem BL-21 de E.
coli. Os peptídeos expressos foram analisados em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), purificados por cromatografia
de troca iônica e injetados em coelhos para que estes respondessem imulogicamente, produzindo anticorpos específicos. Futuramente esperamos isolar anticorpos que não apresentam reações cruzadas entre os epítopos de
cada fator, sendo esses, utilizados como marcadores específicos para as proteínas Gdf9 e Bmp15, possibilitando
um melhor conhecimento sobre a síntese e expressão desses hormônios.
Apoio financeiro: Embrapa, CNPq, IFS.
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213
Expressão da proteína fluorescente verde (EGFP) em
fibroblastos de bovinos adultos da raça Junqueira
Moura, MT1,2; Paulini, F1,2; Oliveira, GS1,3; Melo, EO1; Rumpf, R1,2,3
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília-DF
Faculdade de Agronomia e Veterinária, Universidade de Brasília
3
Instituto de Biologia, Universidade de Brasília
[email protected]
1
2
Palavras-chave: conservação animal, raça naturalizada, transferência nuclear, transgênese, lipofecção
A conservação das raças bovinas naturalizadas tem grande importância por permitir preservar estes genótipos
para sua melhor caracterização e possível utilização em nichos específicos da cadeia produtiva. No entanto, estes
animais possuem baixa capacidade produtiva, devido ao baixo rigor seletivo ao qual foram submetidos. Uma alternativa seria introduzir alelos ou genes de interesse que possam, em um curto período, incrementar seu potencial
produtivo e valor agregado. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a possibilidade de transformar cultivos
primários de fibroblastos de bovinos adultos da raça Junqueira com um plasmídio contendo o gene Enhanced
green fluorescent protein (EGFP), que possa servir como um marcador e ferramenta na clonagem por transferência
nuclear (TN). Foram descongeladas células bovinas da raça Junqueira e cultivadas em garrafas de cultivo por duas
passagens em meio DMEM acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB) e antibióticos, em estufa a 37º C com 5%
de CO2. Atingida a confluência na quarta passagem, uma parte das células foi transferida para uma placa de 24
poços até a obtenção de 80-90% de confluência, momento no qual as células foram transfectadas durante 3 horas
através de lipofecção com o vetor pCi-Neo, contendo o gene repórter EGFP e o gene neo que confere resistência ao
antibiótico G418. Após 24 horas da transfecção, as células foram transferidas para garrafas de cultivo com DMEM e
10% SFB acrescido de 500mg ml-1 do antibiótico G418, para seleção das células transgênicas. A eficiência da transfecção foi avaliada paralelamente por meio da detecção da atividade do gene repórter β-Galactosidase, utilizando
condições experimentais semelhantes e o vetor pCMV-bGal. Células não transfectadas cultivadas com e sem G418
foram utilizadas como controle positivo e negativo da seleção, respectivamente. Após 16 dias nestas condições de
cultivo todas as células da garrafa do controle positivo haviam morrido, indicando o término da seleção. A possibilidade de morte por senescência foi descartada devido à sobrevivência do cultivo do grupo não tratado com G418.
Em seguida, a concentração de G418 foi reduzida para 250mg ml-1 com o intuito de manter a pressão seletiva. No
entanto, no final da seleção, as células apresentavam um ritmo muito lento de crescimento, o que dificultava a recuperação da linhagem. Para contornar este fato as células foram supridas temporariamente com meio sem G418,
o que resultou numa recuperação bastante significativa e rápida da proliferação celular. A exposição das células à
luz ultravioleta confirmou a expressão da EGFP nas células transgênicas. É possível produzir células transgênicas
a partir de cultivos primários de fibroblastos adultos de bovinos da raça naturalizada Junqueira. Posteriormente,
estas células poderão ser utilizadas para produção de animais clones por TN contendo um gene de interesse.
Apoio financeiro: Embrapa, CAPES e GENEAL biotecnologia animal.
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214
Sexagem fetal de bovinos a partir do DNA isolado de
plasma materno
Da Cruz, AS1,2; Silva, DC1; Costa, EOA1; da Cruz, AD1
Núcleo de Pesquisas Replicon, Depto. de Biologia, Universidade Católica de Goiás
Depto de Zootecnia, Universidade Católica de Goiás
1
2
Palavras-chave: DNA, PCR, sexagem fetal, plasma
Na última década, têm sido freqüentes as proposições e o melhoramento constante de técnicas laboratoriais voltadas para a identificação do sexo fetal. Recentemente, a da reação em cadeia da polimerase (PCR) tem sido usada
para a identificação do sexo do concepto em humanos, utilizando-se plasma materno a partir da 6a semana gestacional. Não é conhecimento da equipe a publicação de um teste semelhante para bovinos. Por outro lado, a identificação do sexo fetal em bovinos é importante porque viabiliza o descarte dos improdutivos e contribui para minimizar os custos de produção. O objetivo geral do presente estudo foi avaliar a presença de DNA fetal em plasma
materno por PCR. O grupo amostral foi constituído de 4 vacas em estágios adiantados de prenhez, com gestações
variando entre 6o e 8o mês, confirmadas por palpação retal. As vacas doadoras não apresentavam à época da colheita das amostras biológicas sintomas de doenças e não estavam em uso de medicamentos, tendo sido colhidos
10mL de sangue periférico para o isolamento do plasma. Como controles internos masculino e feminino foram
utilizadas amostras de DNA genômico isolados de sangue periférico de uma novilha e de um touro. No presente
estudo, amostras de DNA foram isoladas usando-se o kit comercial DNA Ilustra Blood GenomicPrep Mini Spin®.
Foram usados primers autossômico e Y-específico para bovinos para a amplificação por PCR. As amostras de DNA
total submetidas à PCR apresentaram a amplificação correspondente a 3 conceptos do sexo feminino e 1 concepto
masculino. O sexo dos conceptos foi confirmado ao nascimento com 100% de exatidão. Portanto, a metodologia,
semelhante ao que ocorre em humanos, pode ser usada para a detecção precoce do sexo do concepto em bovinos a
partir de DNA fetal isolado de plasma materno. Assim, o método torna-se uma ferramenta importante para o correto manejo dos animais envolvidos nos processos produtivos, sob o ponto de vista do melhoramento do rebanho.
Apoio financeiro: FP/PROPE/UCG.
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215
Efeito da reclonagem na metilação de DNA do receptor
do fator de crescimento semelhante à insulina 2
(IGF2R) em bovinos
Michalczechen-Lacerda, VA1; Driessen, K2; Fagundes, NS3; Sousa, RV4; Melo, EO5; Rumpf, R5; Franco, MM5
Mestranda, Departamento de Biologia Celular, Pós-graduação em Biologia Molecular, bolsista CAPES-Universidade de Brasília – UnB,
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
2
Mestranda, FAV-Universidade de Brasília -UnB, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
3
Mestranda, Pós graduação em ciências veterinárias, bolsista CAPES-Universidade Federal de Uberlândia –UFU
4
M.Sc., Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia; 5-PhD, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
[email protected], [email protected]
1
Palavras-chave: epigenética, transferência nuclear, genes impriting
A transferência nuclear (TN) é uma biotécnica de reprodução utilizada na multiplicação de animais de alto mérito
genético e em risco de extinção. Entretanto, ela ainda apresenta baixos índices de eficiência, sendo a compatibilidade entre núcleo e citoplasma e a reprogramação epigenética do genoma doador pontos determinantes. Para
gerar um embrião, o ovócito enucleado deve ser capaz de realizar a reprogramação do núcleo da célula doadora
diferenciada, que pode ser de vários tipos celulares. Trabalhos da literatura indicam forte relação entre uma incorreta reprogramação e alterações no controle de genes imprinted. Uma forma de regulação desses genes ocorre por
metilação do DNA, em ilhas CpGs nos promotores ou em regiões controladoras de impriting (ICR). Um exemplo é o
gene do receptor do fator de crescimento semelhante à insulina 2 (IGF2R) que, em bovinos, possui o alelo materno
expresso e o paterno silenciado. No íntron 2 existe uma ICR que origina um RNA anti-sense, não traduzido, que
auxilia no silenciamento do gene. No alelo materno, essa ICR está metilada, enquanto que no paterno está demetilada. O objetivo do trabalho foi analisar a metilação do DNA genômico para a ICR2 do gene IGF2R entre linhagens
celulares de fibroblastos adulto e fetal de um mesmo animal. Em um estudo prévio realizado no Laboratório, as
células fetais, originadas de um feto de 53 dias, geraram uma maior taxa de produção de embriões do que as células adultas. Uma alíquota de DNA extraído foi tratada com bisulfito de sódio, seguindo amplificação por PCR. Os
amplicons foram submetidos à eletroforese em gel de agarose, purificados, quantificados e clonados utilizando o
kit pGem-T easy Vector System (Promega). Os produtos clonados foram seqüenciados e analisados pelos programas
DNAMAN 4.0 e CHROMAS. Observou-se que o DNA das células fetais possui menos metilação (56,25%) em relação
às células adultas (72,11%). Esse resultado mostra o efeito do processo da reclonagem sobre o padrão epigenético
da ICR2 do gene IGF2R, que apresentou um padrão menos metilado nas células fetais. Isso provavelmente favorece
o processo de reprogramação epigenética a ser realizado pelo ovócito e contribui para a regeneração da linhagem
celular. Como o processo da reclonagem pode estar relacionado a um aumento do sucesso da TN, esta região da
ICR2 do IGF2R pode ser usada como um marcador molecular para o potencial de uso de linhagens celulares a
serem usadas na Transferência nuclear.
Apoio Financeiro: CAPES, GENEAL, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
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216
A new model to study bovine ovarian follicular
development in vitro
Salles, LP1,2; Vasconcelos, RB1; Silva, IO1; Gulart, LVM1; Torres, FAG2; Silva, AAMR1
Laboratory for The Study of Reproduction. Institute of Biological Sciences - UnB
Molecular Biology Laboratory - Cellular Biology Department. Institute of Biological Sciences - UnB
[email protected]
1
2
Keywords: bovine ovarian follicle, theca cells, granulosa cells, RT-PCR, steroidogenic enzymes
The ovarian follicular development, necessary for the production of steroid hormones and viable gamete, is directly
related to physiological interactions between theca (TC) and granulosa cells (GC). However, the molecular basis of
the mechanisms involved in TC-GC interactions that controls follicular growth still remains to be fully understood.
Thus the main objective of the present work was to standardize a co-culture system with bovine follicle TC and
GC suitable to study ovarian follicle development. In order to achieve this goal, a new serum-free culture defined
medium, DM, was elaborated at the Laboratory of Reproduction Studies of University of Brasilia. Bovine ovaries
were obtained from a local slaughterhouse and transported to the laboratory in saline solution. A total of 84 follicles were selected according to healthy characteristics and size (4-6 mm), then they were halved and the sections
were separated in 7 groups: fresh follicle sections, sections to be cultivated for 24, 48 or 72 hours in DM and sections to be cultivated for the same times in a non defined medium, NDM (TCM-199). For each culture time in both
mediums, progesterone and 17 b-estradiol levels were measured by radioimmunoassay (RIA). Fresh and cultured
cells were submitted to HE microscopy morphology analysis and the potential to maintain steroidogenic activity
was evaluated by RT-PCR of the following genes: bovine 3-b-hydroxysteroid dehydrogenase (HSD3B1), cholesterol
side-chain cleavage cytochrome P450 (CYP11A1), 17 b-hydroxylase (CYP17), aromatase cytochrome P450 (CYP19),
steroidogenic acute regulatory protein (STAR) and follicle stimulating hormone receptor (FSHR). Microscopic
analyses showed that cells cultured in the new defined system kept their normal morphology while cells cultured
in NDM lost their polyhedral shape and cytoplasm:nucleus ratio. Moreover, the cells showed lower progesterone
production after 24h in defined environment. Gene expression of steroidogenic enzymes by somatic follicle cells
cultured in DM was the same or enhanced when compared to fresh ones by, in particular, aromatase. GC and TC
seemed to behave as developing follicle cells in this new culture system and their phenotype was in agreement with
the observed gene expression patterns. Thus the culture of bovine follicle tissue in DM can represent an excellent
model to study many aspects of the ovarian physiology.
Financial support: FAPDF-PRONEX.
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Avaliação da expressão gênica dos transcritos das
proteínas BAX, BCL-2, HSP-70 e GPX-1 em oócitos
submetidos a pré-maturação e maturação in vitro
Rochetti, R1,2; Adona, PR1; Mesquita, LG1; Meirelles, FV1; Leal, CLV1
Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos – FZEA/USP, SP
Fundação Hermíneo Ometto – Uniararas, SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Maturação in vitro, Bloqueio meiótico, BAX, BCL-2, HSP-70 e GPX-1
A produção in vitro de embriões favorece projetos de melhoria genética em rebanhos. Os mecanismos pelos quais
os oócitos adquirem a competência para desenvolver até blastocistos ainda não são totalmente compreendidos.
Há evidencias de que a expressão de certos genes está relacionada com a aquisição oocitária. O objetivo do presente estudo foi avaliar o transcrito pró-apoptótico (BAX), anti-apoptótico (BCL-2), associados ao estresse (HSP-70
e GPX-1) e o desenvolvimento embrionário in vitro em oócitos bovinos submetidos à pré-maturação e a maturação
in vitro. Os oócitos foram pré-maturados por 24h em meio de cultivo com 10mM de butirolactona (BVG). Após a
pré-maturação, parte dos oócitos foram submetidos à maturação in vitro (BMII) em meio de cultivo com soro, hormônios e antibiótico por 22h em estufa de cultivo. Um grupo de oócitos foi avaliado logo após aspiração folicular
(VG) e outro foi submetido somente à maturação in vitro (MII). Os oócitos foram submetidos à extração de RNA,
a transcrição reversa e a quantificação relativa por PCR em tempo real. Para a avaliação do desenvolvimento embrionário foram usados oócitos em BMII e MII. Após 18h de fecundação in vitro, os oócitos foram transferidos para
o meio de cultivo in vitro e no sétimo dia foi feita a avaliação das taxas de formação de blastocisto. Os resultados
do desenvolvimento embrionário não diferiram (p>0,05) quanto à taxa de blastocistos entre os tratamentos BMII
(40,3%) e MII (41,7%). A quantificação dos transcritos (BAX e BCL-2) nos tratamentos BVG (0,85 e 0,94), BMII (0,93
e 0,78), VG (1,0 e 1,0) e MII (1,0 e 0,78) não diferiram na avaliação da expressão gênica, respectivamente. Houve diferença (p<0,05) somente entre os oócitos imaturos (BVG, 0,70 e 0,73 e VG, 1,0 e 1,0) em relação aos maturados (BMII,
0,19 e 0,20 e MII, 0,20 e 0,25) para o gene HSP-70 e GPX-1, respectivamente. O tratamento in vitro de pré-maturação
não afetou o desenvolvimento embrionário e nem a concentração dos transcritos nos oócitos. A redução de alguns
transcritos é inerente ao processo de maturação do oócito, não influenciando a competência oocitária.
Apoio financeiro: FAPESP
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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218
Expression of genes involved in the control of apoptosis
and cellular stress in bovine embryos cultured with
CLA (trans-10, cis-12)
Batista, RITP1,*; Barbosa, NR1; Camargo, LSA2; Gama, MA2.; Carvalho, BC3; Campos Jr, PHA4; Pereira, MM1;
Miranda, FM4; Viana, JHM2
Universidade Federal de Juiz de Fora, Juiz de Fora, MG. 2.Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG. 3EPAMIG (Empresa de Pesquisa
Agropecuária de Minas Gerais). 4CES/JF (Centro de Ensino Superior de Juiz de Fora)
*[email protected]
1.
Keywords: Blastocysts, Real-Time PCR, Free Radicals, Bcl-2, Hsp70.1
The use of the trans-10, cis-12 isomer of the conjugated linoleic acid (CLA) is an important alternative for the control of excessive lipid accumulation in bovine embryos produced in vitro, once the lipid content negatively affects
the post-cryopreservation survival rate. However, the metabolism of this fatty acid in peroxisomes can increase the
intracellular levels of free radicals, with detrimental effects on embryo quality. The aim of this study was to evaluate the effect of the trans-10, cis-12 CLA isomer during in vitro culture of bovine embryos on expression of genes
involved on apoptosis control (Bax and Bcl-2) and cellular stress (Hsp70.1 and PRDX). Cumulus-oocyte complexes
(CCOs) obtained from slaughterhouse ovaries were matured and fertilized in vitro. Presumptive zygotes were randomly distributed into two groups (control group: without CLA; and CLA group: culture medium supplemented
with 100 μL of CLA trans-10 cis-12 [Matreya, ref. 001249]). The basic media for all treatments was CR2aa plus 10%
fetal bovine serum. For analysis of the target transcripts, 60 blastocysts (control group: 30 and CLA group: 30) divided into three pools were used. After RNA extraction, reverse transcription was performed. The cDNA obtained
was subjected to Real-Time PCR using the gene β-actin and GAPDH as endogenous controls for the subsequent
analysis of expression by REST® software. The relative abundance of Bax (0.76 ± 0.23), Bcl-2 (1.25 ± 0.26), Hsp70.1
(0.77 ± 0.39) and PRDX1 (0.86 ± 0. 55) transcripts in embryos cultured with CLA did not differ from control embryos
(P> 0.05). In conclusion, supplementation with CLA trans-10, cis-12 in the medium does not affect the expression
of these genes in bovine embryos.
Financial support: CNPq and Fapemig.
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219
Expressão de receptores do gene GDF9 e BMP15 em
células da granulosa bovina cultivadas in vitro
Rua, PJS1; Paulini, F1,2; Oliveira, GS1,3; Moura, MT1,2; Araújo, VGB1,3; Franco, MM1; Rumpf, R1,2,3; Melo, EO1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília-DF
Faculdade de Agronomia e Veterinária, Universidade de Brasília
3
Instituto de Biologia, Universidade de Brasília
[email protected]
1
2
Palavras-chave: ALK5, ALK6, BMPRII, TGFβ, cultivo in vitro
O Gdf9 (Growth differentiation factor 9) e Bmp15 (Bone morphogenetic protein 15) são proteínas secretadas pelo
ovócito e pertencem à família de fatores de crescimento TGFβ (transforming growth factor - beta). Os fatores Gdf9
e Bmp15 têm como alvo as células somáticas do folículo ovariano (granulosa e teca), sendo capazes de induzir
mitose e, consequentemente, estimular o crescimento dos folículos ovarianos. O Gdf9 e Bmp15 são captados pelas
células da teca e granulosa por um tetrâmero composto por dois homodímeros de receptores de membrana do
tipo I e II, com atividade serino/trionina quinase. O mesmo receptor do tipo II (BMPRII) participa da sinalização
do Gdf9 e Bmp15, que se diferenciam pelo receptor tipo II, sendo o Alk6 responsável pela sinalização do Bmp15 e o
Alk5 do Gdf9. Sabe-se que o cultivo in vitro de células primárias é capaz de provocar mudanças morfológicas, assim
como alterar o perfil de expressão gênica. O objetivo desse trabalho foi avaliar a expressão dos genes ALK5, ALK6
e BMPRII em sistemas in vitro de cultivo primário de células da granulosa bovina. Folículos ovarianos obtidos de
ovários de abatedouro foram puncionados com agulha, para obtenção das células da granulosa. Os ovócitos foram
retirados do líquido folicular, que foi centrifugado e ressuspendido em PBS para lavagem das células. As células
da granulosa isoladas foram cultivadas in vitro com meio DMEM a 39ºC em garrafas de 25cm². Após confluência,
as células foram descoladas da garrafa com Tripsina-EDTA, lavadas com PBS e ressuspendidas em Trizol para
a extração de RNA. O RNA extraído foi quantificado, tratado com DNase, e submetido a síntese de cDNA. Para
confirmação da qualidade do cDNA foi feita reação em cadeia polimerase (PCR) com primers desenhados para
amplificar o gene constitutivo GAPDH. Primers específicos foram desenhados, com base nas seqüências depositadas no GeneBank, para detectar a expressão dos genes ALK5, ALK6 e BMPRII. Os amplicons foram submetidos
à eletroforese em gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo para confirmação da expressão gênica. Todos
os receptores analisados foram expressos pelas células em cultivo. O presente trabalho demonstra que as células
da granulosa cultivadas in vitro, mesmo durante o processo de luteinização, continuam expressando os receptores
ALK-5, ALK-6 e BMPRII. Portanto, essas células mantêm a capacidade de reconhecer e responder ao estímulo dos
fatores GDF9 e BMP15 durante o cultivo in vitro.
Apoio financeiro: Embrapa, CNPq, IFS.
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220
Influência da transfecção e seleção na senescência do
cultivo in vitro de células da granulosa transgênicas
Paulini, F1,2; Oliveira, GS1,3; Moura, MT1,2; Araújo, VGB1,3; Rua, PJS1; Franco, MM1,2; Rumpf, R1,2; Melo, EO1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília-DF
Faculdade de Agronomia e Veterinária, Universidade de Brasília.
3
Instituto de Biologia, Universidade de Brasília
[email protected]
1
2
Palavras-chave: lipossomos, β-Galactosidase, G418, células bovinas, transgênese
O crescimento e o desenvolvimento das células somáticas e germinativas do folículo ovariano ocorrem de uma
maneira mutuamente dependente e coordenada, no qual camadas de células da teca e granulosa que cercam o
ovócito são formadas e desenvolvidas durante o crescimento folicular. Os sistemas de cultivo de células da granulosa vêm se desenvolvendo com o intuito de investigar a fisiologia dos processos de crescimento e diferenciação
que ocorrem in vivo no folículo ovariano. Em tais sistemas, é conhecido o fato de que as células mantêm a forma
esférica, característica da parede do folículo e se organizam em grumos, semelhantes às células fibroblásticas. Processos como transfecção e uso de antibioticoterapia podem acelerar o processo natural de senescência de células
primárias em cultivo in vitro, acarretando perdas precoces do cultivo. O objetivo desse trabalho foi verificar a interferência da transfecção e seleção com antibióticos na senescência das células da granulosa bovinas em sistemas de
cultivo in vitro. Ovários obtidos de abatedouro foram puncionados com seringa de 10 mL para obtenção do fluido
folicular contendo as células. Os ovócitos foram retirados e o líquido centrifugado. O pellet foi lavado com PBS e
as células cultivadas em meio DMEM. Uma vez o cultivo primário estabelecido, a garrafa foi repicada para placa
de 24 poços até a obtenção de 80% de confluência, no qual as células foram transfectadas com o vetor pCi-Neo,
contendo o gene repórter β-Galactosidase e o gene que confere resistência ao antibiótico G418. Após 48 horas as
células foram transferidas para garrafas de cultivo com DMEM acrescido de 500mg/mL do antibiótico G418, para
seleção das células transgênicas. O sucesso da transfecção foi avaliado por meio da detecção da atividade do gene
repórter. Células não transfectadas selecionadas com G418 e células transfectadas e cultivadas sem G418 foram
usadas como controles do experimento. Passados 20 dias, todas as células da garrafa controle selecionadas com
G418 haviam morrido, indicando o término da seleção. É conhecido que a etapa mitótica cessa na senescência
celular na qual há o encurtamento dos telômeros das células, resultando em divisões celulares finitas. Além do aspecto proliferativo, as células senescentes em cultura são maiores e achatadas, o que é acompanhado pela deficiência das células em replicar seu DNA sob estímulos de crescimento. A senescência envolve perdas progressivas e
irreversíveis das funções celulares, o que aumenta a probabilidade de morte. Entretanto, os resultados observados
nesse estudo indicam que a senescência não foi estimulada ou induzida nas células da granulosa pela transfecção
e seleção com G418 e sim pela multiplicação natural das células.
Apoio financeiro: Embrapa, CNPq, IFS.
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221
Marcadores moleculares para células da granulosa e
da teca em sistema de cultivo in vitro
Oliveira, GS1,3; Paulini, F1,2; Moura, MT1,2; Araújo, VGB1,3; Rua, PJS1; Franco, MM1; Rumpf, R1,2,3; Melo, EO1
Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília-DF
Faculdade de Agronomia e Veterinária, Universidade de Brasília
3
Instituto de Biologia, Universidade de Brasília
[email protected]
1
2
Palavras-chave: CYP17A1, StAR, células bovinas, luteinização, aromatase
O desenvolvimento dos folículos ovarianos é um processo dinâmico envolvendo uma proliferação altamente coordenada e diferenciação dos compartimentos foliculares (teca interna, células da granulosa e ovócito). Sabe-se
que são expressos em células da granulosa e da teca genes envolvidos na biossíntese de esteróides como a P450
aromatase CYP17A1 e o StAR, entre outros. O CYP17A1 é expresso exclusivamente nas células da teca e o gene
StAR está envolvido com o processo de luteinização das células da granulosa, atuando no transporte de colesterol do exterior para o interior da membrana mitocondrial. A expressão do CYP17A1 é induzida pelo hormônio
luteinizante (LH) e está relacionada com a diferenciação das células da teca interna. O objetivo deste trabalho foi
selecionar marcadores moleculares para o cultivo in vitro de células da granulosa e da teca em bovinos. As células
da granulosa e da teca foram obtidas por punção de ovários de abatedouro, utilizando agulha acoplada a seringa
de 10 mL. As células foram cultivadas em garrafas de 25cm² com meio DMEM, suplementado com piruvato de
sódio e 10% de soro fetal bovino, e mantidas em incubadoras com CO2 (5%) a 39°C. Após a confluência, as células
foram descoladas da garrafa com tripsina-EDTA e o RNA celular extraído utilizando Trizol. O RNA extraído foi
tratado com DNase antes da síntese de cDNA. O cDNA foi submetido à reação em cadeia da polimerase (PCR) para
amplificação de um amplicon de 135 pares de base para o gene StAR e de 109 pares de base para o P450 aromatase
CYP17A1. Os amplicons foram analisados utilizando eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com brometo de
etídio. Foi observado que nas células da granulosa estava expresso apenas o gene StAR e nas células da teca apenas o P450 aromatase CYP17A1. No presente trabalho foi possível identificar marcadores moleculares específicos
tanto para células da granulosa, quanto para as da teca. Esses marcadores poderão ser utilizados em cultivo celular
in vitro sendo importantes ferramentas para o estudo individualizado desses dois tipos celulares, que se encontram
fisicamente associados dentro do ambiente intra-folicular.
Apoio Financeiro: CNPq, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, IFS
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222
Transcript analysis of maternal effect and oxidative
stress genes in oocytes matured either in vivo or in vitro
Pereira, MM1; Assunção, CM1; Serapião, RV2; Campos Jr, PHA2; Costa, FQ2; Viana, JHM2; Machado, MA2;
Camargo, LSA2
Universidade Federal de Juiz de Fora, Juiz de Fora, MG.
Embrapa Gado de Leite, Juiz de Fora, MG.
[email protected]
1
2
Keywords: maturation, fertilization, nuclear transfer, embryos, real time PCR
The efficiency of in vitro production (IVP) and somatic cell nuclear transfer (SCNT) is low, probably caused by an
inadequate oocyte in vitro maturation and nuclear reprogramming. The oocyte cytoplasmic environment contains transcripts and proteins necessaries for embryonic genomic activation as well for nuclear reprogramming of
cloned embryos. The aim of this study was to evaluate the relative abundance (RA) of TEA domain 2 (TEAD2), High
Mobility Group N1 (HMGN), Zygotic Arrest 1 (ZAR1) and Peroxiredoxin 1 (PRDX1) transcripts in bovine oocytes
matured in vivo or in vitro. In vivo matured oocytes, obtained from ovum pick-up from superstimulated donor
cows, and in vitro matured oocytes, obtained from slaughterhouse animals, were used in three pools of 10 oocytes
for each experimental group. Reverse transcription was performed after RNA extraction and the cDNA obtained
were submitted to real-time PCR, using the β-actin gene as endogenous reference. Results were analyzed by REST
software© using the pair wise fixed reallocation randomization test. Data from in vivo matured oocytes group was
used as calibrator. The PRDX1(0.34 ±0.28) was down-regulated (P<0.05) while TEAD2 (4.24±2.51) was up-regulated
(P<0.05) for in vitro matured oocytes. There was no difference (P>0.05) in RA to transcripts of HMGN1 (1.19 ±0.89)
and ZAR1 (0.28±0.23) between in vivo and in vitro matured oocytes. In conclusion, in vitro maturation can cause
alterations on gene expression, which suggests that in vitro matured oocytes may be less suitable for fertilization
or SCNT.
Financial Support: CNPq, FAPEMIG, CAPES.
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223
Comparação in silico da conservação do domínio de
ligação ao DNA da dupla paráloga PAX1/PAX9 em
vertebrados
Paixão-Côrtes, V; Santos, F; Salzano, FM; Bortolini, MC
PPGBM, Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade federal do.Rio Grande do Sul
Departamento de Biologia Geral, ICB, Universidade Federal de Minas Gerais
[email protected]
1
2
Palavras-chave: PAX9, PAX1 domínio paired, seleção purificadora, dN/dS, vertebrados
A maioria dos genes chaves do desenvolvimento fazem parte de grandes famílias gênicas, que compartilham
domínios ou motivos moleculares conservados entre os eucariotos. Uma destas famílias são os genes PAX, que se
diversificaram a partir de um gene ancestral comum, através de duplicação e subseqüente divergência. Entre os
nove genes deste grupo uma dupla de genes parálogos: PAX1 e PAX9 são descritos como os mais similares (≈ 70%
identidade nucleotídica, ≈ 80% similaridade ao nível de aminoácidos). Portanto, a investigação conjunta da dupla
de genes parálogos, que compartilham padrões de expressão espaço/temporal tanto no embrião, quanto na fase
adulta, poderá fornecer dados para uma análise apurada das forças evolutivas que atuaram nesse processo. No
presente estudo, foram analisadas seqüências do exon 2 (696 pb) dos genes PAX1 e PAX9, onde está localizado o
motivo de ligação ao DNA (domínio paired), de vinte espécies de mamíferos, duas espécies de aves e uma de réptil, retiradas dos bancos de dados do Ensembl (www.ensembl.org) e do NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) e alinhadas
através do algoritmo ClustalW. Utilizando-se do programa o programa CODEML, parte do pacote PAML_3.15, que
estimou-se as taxas de substituições sinônimas e não-sinônimas (dN/dS ou ω).Valores das taxas de substituição ω
< 1 e ω > 1 indicam respectivamente seleção purificadora (ou negativa), ou positiva (Darwiniana). Já valores de ω =
1 estariam indicando que a hipótese de neutralidade não poderia ser descartada. Quando os modelos de substituição são comparados (M0 - M3, M1a - M2a e M7 e M8), o que melhor se adapta aos dados é o M3 (p < 0,001), que
admite variação nas classes de ω. A taxa de substituições sinônimas e não-sinônimas (dN/dS= ω = 0,0061) é um
valor significativamente menor que zero, sinalizando que a principal força agindo no exon 2 da dupla de genes é a
seleção purificadora. Além disso, como o modelo M3 permite ramos com valores diferentes, encontramos que 65%
dos sítios dentro do exon 2 estão sujeitos a uma taxa substituições sinônimas e não-sinônimas muito pequena (ω0
=0,00003). Portanto, apesar destes genes terem divergido a pelo menos 500 milhões de anos, no início da evolução
dos vertebrados, uma esmagadora seleção purificadora mantém a seqüência de aminoácidos quase que inalterada
por todas as linhagens dos animais estudados até momento. Análises posteriores da divergência funcional das
proteínas poderão esclarecer a intricada relação da evolução destes genes.
Apoio Financeiro: CNPq, Capes e FAPERGS.
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224
Evaluation of anxiety and depression-related behaviors
in a semi-congenic rat strain for a chromossome 4 locus
De Medeiros, GF¹; Pereira, E¹; Izídio, GS¹; Wehrmeister, TD¹; Vendruscolo, LF²; Ramos, A¹.
¹Laboratório de Genética do Comportamento - Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética, UFSC, Brazil – ²The Scripps
Research Institute, USA
Keywords: Anxiety, Ofil1 locus, Semi-congenic strain, LEW, SHR, Behavioral genetics
An intercross between the inbred rat strains Lewis (LEW) and spontaneously hypertensive rats (SHR) allowed the
identification of a quantitative trait locus (QTL) named Ofil1 (on chromosome 4) influencing locomotion in the
central area of the open field (OF) test, an experimental index of anxiety. In order to further investigate the effects
of this locus on behavior, the construction of congenic strains derived from a cross between LEW (donor) and SHR
(receptor) rats is currently underway. The present study was designed to verify the influence of Ofil1 on anxiousand depressive-like behaviors through the use of a semi-congenic rat strain. Rats from the third generation of backcross (N3) were genotyped for two microssatelites markers (D4Mgh6 and D4Rat76) flanking the locus Ofil1. Males
and females homozygous LEW/LEW or SHR/SHR (control group) for the two markers were selected and tested in
three models of anxiety, the OF, black/white box (BWB) and elevated plus maze (EPM); and one model of depression, the forced swim test (FST). The behavioral data were analyzed by a two-way ANOVA (sex and genotype). Rats
carrying two LEW alleles displayed higher central (p<0.01) and peripheral (p<0.05) locomotion in the OF and made
more transitions (p<0.05) and spent more time in the white compartment (p=0.05) of the BWB, when compared to
SHR homozygous rats. No genotype differences were found in the EPM and FST. Moreover, females showed overall
lower levels of anxiety and higher locomotion in the OF, BWB and EPM tests, and showed less immobility time
in the FST, in comparison with males. The present results confirm and extend previous studies showing that the
locus Ofil1 on rat chromosome 4 has a consistent effect on anxiety-related behaviors, with LEW alleles increasing
exploration of aversive areas of the OF and BWB. Therefore, this genomic region may contain one or more genes
controlling these phenotypes. At the end of the congenic strain development (N10 generation), this new tool will
allow a detailed study of the molecular bases underlying anxiety-like behaviors.
Financial Support: CNPq, Fapesc.
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225
Avaliação de comportamentos relacionados à
ansiedade em uma linhagem congênica parcial para
um locus no cromossomo 4 do rato
Pereira, E; de Medeiros, DG; Ramos, A
Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética, Universidade Federal de Santa Catarina
Palavras-chave: ansiedade; locus Ofil1; teste do campo aberto; linhagem congênica; linhagens isogênicas
Um intercruzamento entre as linhagens isogênicas de ratos Lewis (LEW) e espontaneamente hipertensos (SHR),
possibilitou a identificação de um QTL (Quantitative Trait Locus) chamado Ofil1 (no cromossomo 4) com influência na locomoção central do campo aberto, um índice experimental de ansiedade (Ramos et al, 1999). Atualmente,
a construção de linhagens congênicas, a partir do cruzamento da linhagem LEW (doadora) e SHR (receptora),
está sendo realizada para refinar o estudo do locus Ofil1. Objetivo: Caracterizar o perfil comportamental da geração N8 da linhagem congênica em desenvolvimento, nos testes de ansiedade, campo aberto (CA) e caixa branca/
preta (CBP). Ratos da geração N8 foram genotipados para três marcadores moleculares microssatélites (D4Mgh6,
D4Rat76 e D4Mgh11), localizados na região genômica Ofil1. Machos e fêmeas heterozigotos (LEW-SHR) e machos
e fêmeas homozigotos/controles (SHR-SHR) para os três marcadores foram testados no CA e CBP e os dados
analisados por ANOVA de duas vias (sexo e genótipo).No teste do CA houve uma diferença significativa entre os
sexos (p<0,0001) sendo que as fêmeas de ambos os genótipos exibiram maior locomoção central (25,952±1,949)
e periférica (56,095±4,302) em comparação aos machos (13,857±1,236), (35,964±2,479), respectivamente. Para a
locomoção dos machos, no centro do CA, a ANOVA revelou um efeito do genótipo LEW-SHR, sendo marginalmente significativo (p=0,063) (21,318±2,001) em comparação ao genótipo SHR-SHR (17,185+1,868). No teste da
CBP, também ocorrem diferenças entre os sexos, sendo que as fêmeas realizaram maior número de transições
(p<0,01) (3,231±0,181) em comparação aos machos (2,464+0,181).A ANOVA também revelou um efeito do genótipo
(P<0,05) para o tempo no compartimento branco. Neste caso, os ratos (LEW-SHR) para Ofil1 permaneceram mais
tempo no compartimento branco (55,227 ± 6,608) em comparação aos ratos (SHR-SHR) (36,888±4,641). Os resultados sugerem que o alelo LEW para o locus Ofil1 induz aumento da locomoção no centro do CA, como de fato se
esperava. Ao final do desenvolvimento da linhagem congênica, espera-se que a obtenção de animais homozigotos
para o alelo LEW revelará uma diferença significativa entre os dois genótipos contrastantes (LEW-LEW e SHRSHR). Além disso, a utilização das linhagens congênicas permitirá avaliar os diversos efeitos comportamentais e
neurobiológicos do locus Ofil1 em processos relacionados à ansiedade.
Apoio Financeiro: Fapesc, Cnpq
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226
Investigating aggressive behavior against intruder
affecting maternal care in mice
Sucomine, VM123; Sauce, B12; Gallo, TCG12; Peripato, AC12
Laboratory of Populations Genetics and Evolution
Department of Genetics and Evolution (DGE) - UFSCar campus São Carlos
3
Paulista Central Universitary Center – Unicep campus São Carlos
[email protected]
1
2
Keywords: heritability, maternal behavior, aggressive behavior against intruders, variation, mice
Aggressive behavior against intruders is, in mammals, an offspring protection strategy and part of general maternal care. In females, aggressivity increases survival, memory and learning of the puppys, ensuring the reproductive
success over generations. In the cross between two inbred strains of mice SM/J and LG/J, we observed changes in
the aggressive behavior against intruders. This work verified whether there is genetic variation associated with
variation in aggressive behavior against intruders. For this, we observed the presence of aggression against human
invasive approach in the first two days post partum. We used the statistical test U (Mann-Whitney) to verify if there
are significant phenotype differences between strains. Then, we calculated the heritability in the F2 generation by
acquiring the environmental variance of F1 strain (isogenic) and tested the presence of heterosis. We found, as
expected, significant differences in aggressive behavior against intruders between SM/J (n = 22) and LG/J (n = 20)
(P <0.05), and between strains F1 (n = 29) and F2 (n = 142) (p <0.01). The mean value in F1 and the value of the mean
between the parents showed no significant difference (t69 = 1.79), suggesting that there is no effect of heterosis in
F1. The heritability found in F2 was 0.413. These results corroborate the hypothesis that there is genetic variability
involved in the aggressive behavior against intruders between strains SM/J and LG/J, although no heterosis was
detected. This may further contribute to the understanding of gene regions and genetic interactions that possibly
modulate the variations of this behavior, and ensure the successful survival of offspring.
Financial Support: Fapesp
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227
Heterosis on milk provision in the intercross of inbred
mice strains
Goes, CP12; Sauce, B12; Gallo, TCG12; Peripato, AC12
Laboratory of Populations Genetics and Evolution
Department of Genetics and Evolution (DGE) - UFSCar campus São Carlos
[email protected]
1
2
Keywords: Mice, Heterosis, Heritability, Variance, Maternal Behavior, Milk
The maternal behavior (MB) is regulated by complex interactions between central nervous and endocrine systems
and by sensorial stimulations modulated by the female relation with the offspring and environment. The biological
bases of MB are also influenced by genetic factors. The lactation (L) represents one of the main aspects that follow
MB and its product, the milk, through breast-feeding guarantees the survival in the first days of life and growth of
the lineage, beyond having a great direct effect in the performance of L. The milk absence in the puppies can be affected by several factors, being even hormonal or psychological, associated to the environment or to the simple bad
female development. We have been studying MB in the intercross of the inbred mice strains SM/J and LG/J. We had
observed a heterosis tendency in our F1 generation. Heterosis is an effect of deviation in hybrids phenotype mean
in relation on parental phenotype mean. The idea in this work was to test if milk provision had difference between
the parental strains and the two descendent generations, and then calculate heritability and heterosis. We used
phenotypic data of SM/J, LG/J, F1 e F2 females. Phenotypic analysis for negative or positive milk provision was made
by indirect evaluations through the absence or milk presence in the puppies’ stomach. This evaluation was made
during the first week of life, in which the offspring still doesn´t have pelage and its skin is quite thin, facilitating
the data collect. The data for this present work had been acquired by the first and second days of life. The milk lack
during these days causes the death of offspring and bad MB. We had no differences between F1 and F2 for heritability. The t test for heterosis was corroborated for F1 (t195=9,7819; p<10-7). For ours phenotype data, was used U test
(Mann-Whitney), resulting in a phenotypic difference between SM/J and LG/J (p<0,01) but no difference between
F1 and F2 for this same test. We expected heterosis loss in F2 generation, but it did not occur, since F1 and F2 are
both similar. These are preliminary results and we are increasing our F2 sample size, wich, then, we expect to see
the difference (because of heterosis) between F1 and F2.
Financial Support: FAPESP
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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228
Expressão in vitro - cell free do peptídeo wsp, antígeno
de superfície do endossimbionte Wolbachia
Nifoci, D1; Ramalho, JDS1; Mascara, D 1
Laboratório de Genética Aplicada a Hospedeiros e Simbiontes, Núcleo de Ciências Ambientais, Universidade de Mogi das Cruzes, Mogi
das Cruzes/SP, Brasil. [email protected]
1
Palavras-chave: DNA recombinante, Wolbachia, Expressão de Proteína, Wolbachia Surface Protein
Aplicações de sistemas de expressão de proteínas a partir de microorganismos tiveram início por volta de 1940,
a partir do organismo Penicillium sp. Todavia, a quantidade obtida foi inferior à demanda exigida, em virtude da
intervenção (biotecnológica) limitada no processo. Novas técnicas de manipulação genética foram desenvolvidas,
a partir de 1977 foi obtida a primeira proteína sintetizada através do DNA recombinante. Com o êxito desse método, a produção in vitro através de culturas celulares elevou-se consideravelmente, o que contribuiu para o melhor
entendimento da estrutura e função das proteínas. Além disso, permitiu a comercialização em larga escala de
peptídeos e anticorpos específicos. O objetivo do presente estudo foi a aplicação de metodologia de expressão in
vitro, cell free, do peptídeo wsp. Avaliamos parâmetros de eficiência e confiabilidade para o uso da presente técnica
de expressão. Adaptações de protocolos foram necessários durante o desenvolvimento deste estudo. Através de
iniciadores específicos para a sequência wsp (Wolbachia surface protein), cujo produto corresponde ao segmento
extracelular do peptídeo marcador do microorganismo endossimbionte Wolbachia sp. Através de amplificação
em sistema PCR, a seqüência parcial do gene wsp foi inserida em vetor (TOPOÒ Invitrogen) e em seguida clonada
linhagem E. coli Top10. As colônias foram analisadas segundo o grau de eficiência e multiplicidade de clonagem.
Primers foram desenhados para verificação do frame do inserto. A partir da metodologia do fabricante, a proteína
foi expressa em um kit de expressão cell free (Invitrogen) e encaminhada a fase de purificação. Além do presente
estudo metodológico, é a primeira vez que wsp-recombinante é obtida. Peptídeos marcadores de superfície de microorganismos podem ser úteis no desenvolvimento de anticorpos policlonais e monoclonais. O segmento extracelular do peptídeo wsp poderá auxiliar em estudos que pretendam discriminar a distribuição histológica do
microorganismo em hospedeiros, bem como na análise cristalográfica desse antígeno.
Apoio: FAEP/UMC
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229
Diversidade genética e estrutura populacional de
Alabama argillacea (Hübner) (Lepidoptera: Noctuidae)
no Brasil: bases para o manejo pró-ativo da resistência
ao algodão geneticamente modificado
Pavinato, VAC1; Zucchi, MI2; Pinheiro, JB 3; Omoto, C1
Lab. de Resistência de Artrópodes a Pesticidas - Departamento de Entomologia e Acarologia – ESALQ/USP
Lab de Biologia Molecular - Centro de Recursos Genéticos – Instituto Agronômico de Campinas
3
Laboratório de Diversidade Genética – Departamento de Genética - ESALQ/USP
1
2
Palavras-chave: Algodão GM, Alabama argillacea, microssatélites, diversidade e estrutura genética
As plantas geneticamente modificadas (GM) são as mais novas tecnologias para o controle de pragas e tem sido
utilizadas para o controle de Alabama argillacea Hüeb., no Brasil. Tem se sugerido o manejo pró-ativo da resistência à toxina Cry1Ac expressa pelo algodão GM, mediante a estratégia de alta dose associadas à área de refúgio. Estudos visando o fluxo gênico entre populações da praga e a estrutura e diversidade genética têm sido reconhecidos
como informações de grande importância. Como o fluxo gênico é uma das formas de surgimento de variabilidade
genética em uma população e é através desse fluxo que os alelos que conferem resistência são espalhados para
outras populações, conhecer esse fenômeno permite definir estratégias para o manejo pró-ativo da resistência.
Dentro desse contexto, o objetivo principal dessa pesquisa foi realizar um estudo de diversidade genética e estrutura populacional utilizando marcador molecular microssatélite. Com isso espera-se gerar informações que
fornecerão maior previsibilidade sobre possível evolução da resistência e subsídios para o manejo de A. argillacea.
Para isso foi desenvolvida uma biblioteca enriquecida de SSR, para obtenção dos primers específicos que acessam
locos microssatélites. Foram desenvolvidos 23 primers. Esses foram otimizados quanto à reação e temperatura
de anelamento, e destes, até o momento sete foram utilizados para a genotipagem, em gel de acrilamida 7%, de 5
populações, totalizando 91 indivíduos. Os dados referentes a frequências alélicas e genotipicas foram analisados
utilizando os programas GDA e TFPGA. O número médio de alelos por loco foi de 3,23, variando de dois a seis
alelos. O índice de fixação intrapopulacional (f^≈ FIS) foi de fˆ = 0,094, com variação de 0,002 a 0,217. O índice de
fixação da espécie (FIS) estimado foi de 0,089 e o FST foi de 0,003. Estas estimativas foram significativamente iguais a
zero, indicando a ausência de estruturação genética e endogamia intrapopulacional. As distâncias genéticas de Nei
calculadas entre as populações variaram de 0,904 a 0,960. Pode se concluir que existe baixa diversidade genética
e estruturação populacional entre as populações de A. argillacea coletadas nos diferentes estados produtores de
algodão, indicando a ocorrência de alta taxa de migração entre as populações. Dentro do contexto da evolução da
resistência, em se tratando de uma espécie monófaga, A. argillacea pode estar exposta continuamente a pressão de
seleção, e o aumento no número de resistentes em uma área, tem o potencial de dispersão dos alelos que conferem
resistência para em outras áreas por meio do processo de migração.
Financiamento: CNPq, FAPESP.
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230
Variabilidade da heterocromatina constitutiva em
espécies de Coprophanaeus (Coleoptera: Scarabaeidae)
Oliveira, SG¹; Xavier, C1; Moura, RC¹
¹Laboratório de Biodiversidade e Genética de Insetos – Departamento de Biologia - UPE
[email protected]
Palavras-chave: Cariótipo, Coleoptera, Coprophanaeus; evolução, heterocromatina
Os besouros da subfamília Scarabaeinae (Scarabaeidae), apresentam menor grau de conservação cariotípica quando comparados com os representantes das demais subfamílias. Sua variabilidade cromossômica deve-se principalmente a ocorrência de rearranjos cromossômicos que modificaram o cariótipo 2n=20,Xyp e a morfologia cromossômica meta-submetacêntrica, considerados modal e primitivo para o grupo. Neste trabalho foi realizada uma
análise citogenética comparativa entre os escarabeíneos Coprophanaeus (Coprophanaeus) acrisius Mcleay, 1819,
Coprophanaeus (Megaphanaeus) bellicosus (Oliver, 1789) e Coprophanaeus (Metallophanaeus) pertyi (d’Olsoufieff,
1924) oriundos de diferentes localidades do estado de Pernambuco. A análise foi realizada através da técnica clássica de esmagamento dos folículos testiculares, seguida da coloração convencional com orceína lacto-acética a 2%;
bandeamento C e tríplice coloração CMA3/DA/DAPI. A espécie Coprophanaeus (Coprophanaeus) acrisius apresentou número diplóide 2n=20,XY, enquanto C. (Megaphanaeus) bellicosus e C. (Metallophanaeus) pertyi apresentaram
2n=20,XYp. Os cromossomos das três espécies possuem morfologia meta-submetacêntrica e redução gradual de
tamanho. O padrão de distribuição da heterocromatina constitutiva (HC) nestas espécies revelou cromossomos
autossômicos difásicos. Coprophanaeus (Coprophanaeus) acrysius mostrou cromossomos sexuais difásicos, enquanto as espécies C. (Megaphanaeus) bellicosus e C. (Metallophanaeus) pertyi apresentaram blocos pericentroméricos grandes nestes cromossomos. A coloração CMA3/DA/DAPI evidenciou bloco heterocromático centromérico
CMA3+ em um bivalente autossômico de C. (Megaphanaeus) bellicosus e em dois de C. (Coprophanaeus) acrysius e C.
(Metallophanaeus) pertyi. O número cromossômico observado nessas espécies foi descrito em aproximadamente
65% dos representantes de Scarabaeinae. Os cromossomos X e Y envolvidos na formação do mecanismo sexual do
tipo XYp observado em C. (Megaphanaeus) bellicosus e C. (Metallophanaeus) pertyi possuem tamanhos similares,
sendo este mecanismo incomum para Coleoptera. Este mecanismo XYp pode ter se originado de duas formas: (1)
na fase inicial da origem do Xyp, no qual os cromossomos sexuais possuem tamanhos similares ou (2) a partir de
um Xyp por adição de HC no cromossomo y. O padrão cariotípico observado entre as espécies analisadas pertencentes aos subgêneros Coprophanaeus e Megaphanaeus demonstra que o cariótipo destas espécies, possivelmente,
diferiu posteriormente a diversificação dos subgêneros, ou o mecanismo sexual não está envolvido na diferenciação deste grupo. A presença de cromossomos difásicos nestas espécies difere do padrão pericentromérico de HC
predominante em Scarabaeinae. A quantidade e variabilidade de HC observada nos autossomos das espécies de
Coprophanaeus analisadas até o momento, pode ser explicada pela expansão de DNA repetitivo no genoma destas
espécies. Nossos resultados mostram que a ocorrência dos mecanismos sexuais XY e XYp e a significativa heterogeneidade na distribuição e composição da HC observada nas espécies de Coprophanaeus, torna estas espécies
candidatas a análises das seqüências de DNA satélite, possibilitando a compreensão dos mecanismos evolutivos
da heterocromatina constitutiva neste grupo de insetos.
Apoio Financeiro: FACEPE, UPE.
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231
Genetic variability of population of Aedes aegypti from
america using mitochondrial ND4 gene
Lima, MMO1; Almeida, SB1; Cruz, MFG1; Rodrigues, ACL1; Fraga, EC2; Barros, MC2
Universidade Federal do Piauí - UFPI
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
[email protected]; [email protected]
1
2
Palavras-chave: Aedes aegypti, Américas, gene ND4, Dengue, Haplótipos
O Aedes aegypti é o principal vetor responsável pela transmissão da febre amarela e do dengue que é uma arbovirose que causa grandes preocupações por ser um problema de saúde pública mundial. Este trabalho teve como
objetivo estimar a variabilidade genética do vetor da dengue Ae. aegypti nas populações das Américas através
do gene mitocondrial ND4, para tanto espécimes foram coletadas no Estado do Piauí em perímetro urbano com
armadilhas tipo APO e outras seqüências do Brasil e de outros países das Américas foram importadas do GenBank (AF334841-AF334865, DQ176828 - DQ176829, DQ176831, DQ176833 - DQ176835, DQ176839 - DQ176843,
DQ176845 - DQ176849, EU650405 - EU650417). O material coletado foi transportado ao Laboratório de Genética
e Biologia Molecular do CESC/UEMA (GENBIMOL) onde foi proporcionado condições para eclosão dos ovos e
desenvolvimento até o alado, na qual ocorreram os cruzamentos com posterior isolamento de fêmeas para a ovoposição e obtenção da geração F1. A partir desta geração foram aplicados os seguintes procedimentos moleculares: Extração do DNA; amplificação e sequenciamento do gene ND4. As seqüências geradas foram editadas e
alinhadas através do CLUSTAL W no programa BioEdit. Os sítios polimórficos e as diversidades haplotípicas (h)
e nucleotídicas (π) foram realizadas no programa DnaSP. Fragmentos do gene ND4 foram obtidos a partir de 22
espécimes de Ae. aegypti. Foi adicionado a estes dados 54 sequências do GenBank e o Ae. albopictus como grupo
externo. Quando as populações foram consideradas como um único grupo verificou-se 23 sítios polimórficos, 35
haplótipos e diversidades haplotípica (h) de 0,9298 e nucleotídica (π) de 0,02038. O haplótipo três (H3) foi o mais
freqüente (44,4%), seguido pelos haplótipos H33 (27,7%), H4 (16,6%) e H13 (13,8%). Quando a população do Piauí
foi individualizada verificaram-se dois haplótipos, sendo um deles compartilhado com outros estados do Brasil e o
outro compartilhado com populações do México. Os resultados da AMOVA mostraram que a maior parte da variação encontra-se dentro das populações (92,65%) com índice de diferenciação genética FST no valor de 0.07353 e P
significativo, evidenciando diferenças entre as populações analisadas. O polimorfismo de DNA juntamente com os
resultados da AMOVA são evidências da redução do fluxo gênico entre as populações indicando que estas podem
estar experimentando um processo de diferenciação resultando em maior habilidade da competência vetorial.
Fonte de financiamento: UEMA/UFPA.
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232
Análise da variabilidade genética de duas populações
de Aedes aegypti com bases em marcadores
microssatélites
Anjos-Lima, SF¹; Batista, JS2; Formiga-Aquino, K2; Maia, JF1; Tadei, WP1; Santos, JMM1
¹ Laboratório de Malária e Dengue - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
² Laboratório Temático de Biologia Molecular - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
[email protected]
Palavras-chave: Aedes aegypti, dengue, microssatélites, variabilidade genética
Aedes (Stegomyia) aegypti é o principal vetor do vírus da dengue, febre hemorrágica e febre amarela, em áreas tropicais e subtropicais. Esta espécie tem sido estudada sob diversos aspectos da genética de populações, na tentativa
de compreender a dinâmica populacional e fatores inter-relacionados, e assim, subsidiar a implementação de estratégias de controle. Neste contexto, os marcadores microssatélites (SSR) vêm sendo muito eficientes em estudos
populacionais por apresentar um elevado índice de polimorfismo. Apesar da importância epidemiológica de A.
aegypti, ainda são poucos os estudos utilizando esses marcadores em populações dessa espécie, no Brasil e especialmente, na região amazônica. Foram analisados 12 locos microssatélites com o objetivo de detectar os níveis de
variabilidade e divergência genética de duas populações da Amazônia. As amostras foram obtidas em Boa-Vista
(RO) e Porto Velho (RO). Os locos utilizados foram: 38/38, 34/72, C2A8, T3A7, AED19 e 9A89 (desenvolvidos por
Huber et al., 2001) e A10, G11, B07, B19, H08 e M201 (desenvolvidos por Chambers et al., 2007). A extração, quantificação e amplificação do DNA foram realizadas conforme Wilkerson et al. (1995). As condições de amplificação
foram: desnaturação inicial por dois minutos a 68 ºC, seguida por 30 ciclos de 94 ºC por 30 segundos, temperatura
de anelamento de 50 ºC a 63 ºC (de acordo com o gradiente para cada loco) por 30 segundos e extensão a 72 ºC
por 45 segundos, e uma extensão final de cinco minutos a 72 ºC. Os produtos amplificados foram corados com
brometo de etídio, em gel de agarose a 1,5%, e fotodocumentados em sistema de captura de imagens (Stratagene).
As genotipagens foram realizadas no seqüenciador de DNA MegaBace, utilizando-se o Programa Genetic Profiler.
Nas análises estatísticas foi utilizado o Programa Arlequin Versão 3.1 (Excoffier et al., 2005). Dos 12 locos testados,
dez mostraram polimorfismo (34/72, C2A8, T3A7, 9A89, A10, G11, B07, B19, H08 e M201), dos quais, seis (34/72,
C2A8, A10, G11, H08 e M201) foram selecionados para esse estudo por apresentarem melhor padrão de alelos. O
número de alelos variou de quatro a dez. A população de Porto Velho apresentou maior nível de variabilidade genética, considerando a heterozigosidade (Ho= 0,3872). Os dados de estrutura genética mostraram valores de Fis maior
que de Fst (Fis= 0,41 > Fst= 0,08), indicando diferenciação genética intrapopulacional, possivelmente de estruturação
microgeográfica, resultante de alguma barreira no acasalamento aleatório.
Financiamento: CAPES e INPA
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Filogenia de 10 espécies de Culicideos (Diptera:
Culicidae) baseado no espaçador ribossomal ITS1
Batista, E1; Costa Filho, ES1; Silva, SP1; Souza, RF1; Mascara, D1
Laboratório de Genética Aplicada a Hospedeiros e Simbiontes, Núcleo de Ciências Ambientais, Universidade de Mogi das Cruzes, Mogi
das Cruzes/SP, Brasil. [email protected]
1
Palavras-chave: Culicídeos; sequência ITS; filogenia; rDNA
Os mosquitos culicídeos (Diptera: Culicidae) devido à sua atividade hematofágica são vetores de agentes de doenças com caráter epidêmico, tais como a dengue, malária, febre amarela, filariose e encefalites. As dificuldades na
identificação morfológica dos culicídeos justificam o desenvolvimento de novas metodologias para a caracterização taxonômica e filogenética. O DNA ribossomal tem sido amplamente utilizado para essa caracterização,
sobretudo as seqüências espaçadoras ITS1 e 2. O objetivo do presente estudo propõe uma análise filogenética entre
10 espécies de culicídeos a partir do seqüenciamento do ITS1. Exemplares foram coletados em resíduos urbanos
de Mata Atlântica localizada no município de Mogi das Cruzes/SP, Brasil, e identificados segundo caracteres morfológicos. O DNA extraído pelo método fenol-clorofórmio, foi amplificado em sistema de PCR, a partir de primers
flanqueadores da região do ITS1 descritos para dípteros. Após o sequenciamento (ABI PRISM 3100 Analyzer) de
12 amostras para cada espécie, seqüências consenso (Sequentix 7.0) foram analisadas (Mega4) segundo ao nível
de similaridade (Neighbor-Joining) e sítios informativos (Máxima Parcimônia). Análises indicaram variação no tamanho da região ITS entre gêneros e algumas espécies, o que é promissor para o desenvolvimento de marcadores
para identificação taxonômica. Além disso, através do alinhamento e análise filogenética (NJ e MP) propomos uma
filogenia para o grupo, em relação a seqüências depositadas no GenBank.
Apoio: FAPESP, FAEP/UMC.
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Evidences for three species complex within the
subgenus culex of the genus Culex (Diptera: Culicidae)
using DNA sequence of the mitocondrial gene
cytochrome oxidase
Silva, BD¹; Vesgueiro, FT¹; Sallum, MAM¹; Marrelli, MT¹
¹Departamento de Epidemiologia, Faculdade de Saúde Pública, Universidade de São Paulo, São Paulo, Brazil
Keywords: Culex, molecular taxonomy, COI
Species of the genus Culex Linnaeus have been pointed out as the main vectors of lymphatic filariases. Furthermore, they are important vectors of viral encephalitis across the world, including the West Nile Virus. Although
being the major genus in Culicidae family, with approximately 763 nominal species, the genus Culex is one of the
least known group of mosquito in a taxonomic and phylogenetic sense. Considering the great species diversity
within this genus, and the fact that females of several species are morphologically very similar, the present study
aimed to: (1)estimate phylogenetic relationships among Neotropical species of the genus Culex; (2) evaluate the
use of COI sequences to recover phylogenetic relationships within the genus Culex; (3) to test the monophyly of
the subgenera Culex, Microculex, Melanoconion, Phenacomyia; (4) to test phylogenetic placement of Lutzia within
Culex. Sequences corresponding to a fragment of 478 base pair of the gene COI of 36 individuals of 16 different species of Culex genus - including four subgenera, Culex, Phenacomyia, Melanoconion and Microculex – and one species
of the genus Lutzia were analyzed. Phylogenetic analyses consisted of Maximum Parsimony and Bayesian analyses.
Culex dolosus, Culex mollis e Culex imitator showed high intraspecific divergence (3.1%, 2.3% and 3.5%, respectively)
when using the uncorrect p-distance, suggesting that these species may comprise complexes. All of three topologies showed that the genus and subgenus Culex are paraphyletic relative to Lutzia and Phenacomyia, respectively.
These results indicate that Lutzia may be subgenus of Culex and Phenacomyia synonymy of the subgenus Culex.
The molecular marker COI was easy to use and analysis, proving to be a useful tool in phylogenetic and taxonomic
studies on the genus Culex.
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235
Citocromo c Oxidase I em subespécies do complexo
Culex pipiens sul americano
Morais, SA¹; Marrelli, MT¹
¹ Departamento de Epidemiologia - Faculdade de Saúde Pública - Universidade de São Paulo. [email protected]
Palavras-chave: Citocromo c Oxidase I, Culex, COX1, DNA
A subunidade 1 da Citocromo c Oxidase (COI) do DNA mitocondrial é parte de um complexo gênico codante de
proteínas transmembranas, envolvidas no transporte elétrico e catálise da cadeia respiratória de organismos eucariotos. Este gene vem sendo alvo de estudos populacionais de variabilidade genética pela sua universalidade e
importância evolutiva. Neste trabalho foram analisados fragmentos do gene COI, com 1260pb, amplificados com
primers UEA3, Fly10 e desenhos internos, em subespécies do complexo Culex pipiens da América do Sul, como o
Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens e os híbridos destes. Foram processados 240 mosquitos originários de áreas urbanas situadas a 5, 9, 23, 24, 27, 31, 33 e 34°S. Constatou-se que a seqüência de bases deste fragmento apresenta alto
conteúdo A+T (70,5%), comum em genes mitocondriais de insetos. Os testes revelam três mutações de ponto por
transição, com troca de pirimidinas (A-G) e uma por purinas (C-T). Destas, dois sítios com transições A-G formam
clusters, tendo os mitotipos localização latitudinal entre 31 e 33°S, no extremo sul do Brasil, sugerindo relação com
a origem geográfica dos mosquitos. Em comparações por pares, esses dois sítios de transição são visualizados em
fragmentos COI de mosquitos pipiens de Ohio e Iran, sendo que essas áreas possuem variação climática semelhante, com quedas bruscas de temperatura. As seqüências gênicas COI sul americana apresentam 99,5 a 100% de
similaridade com subespécies do complexo Cx. pipiens de outras localidades do mundo, mostrando dinamismo
nos mecanismos de dispersão, com fluxo gênico mundial e consequente amplificação citoplasmática. Nenhum dos
mitotipos dados pelo gene COI foi confirmado como subespécie por testes com o intron nuclear ace2, mostrando
que o gene COI não discrimina subespécies. Uma análise de predição de proteínas responde 100% de similaridade
com enzimas Citocromo c Oxidase subunidade I (COX1, EC 1.9.3.1) de subespécies pipiens norte-americanas, indicando domínio funcional conservado. Somente uma das mutações de ponto (A-G) detectada no DNA de um dos
mosquitos processados resulta em modificação de aminoácido na estrutura primária (M-V), na região de domínio.
Igualmente ocorre modificação na estrutura secundária (H-C), com aumento na extensão de uma das hélices. Esta
é um tipo de mutação não-sinônima, podendo não ser positiva, ainda mais pela baixa freqüência na amostragem.
As outras três se caracterizam como mutações silenciosas, sem mudança de aminoácido, início ou parada de
códon. A subunidade 1 do complexo gênico da Citocromo c Oxidase no subgrupo pipiens sul americano é semiconservada e apresenta vestígios de divergência adaptativa, demonstrados por agrupamentos populacionais após
eventos de transição.
Apoio financeiro: FAPESP
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236
Evidência de duas linhagens de Aedes aegypti no
estado do Maranhão
Sousa, AA1; Fraga, EC1; Sampaio, I2; Barros, MC1
Laboratório de Genética e Biologia Molecular – CESC/UEMA
Instituto de Estudos Costeiros/UFPA Bragança PA
[email protected]/[email protected]
1
2
Palavras-chave: Aedes aegypti, Maranhão, ND4, haplótipos, linhagens
O Aedes aegypti é o principal vetor da febre amarela urbana e dos quatro sorotipos de vírus do dengue. A constante
presença deste vetor no Estado do Maranhão, bem como a circulação de pelo menos dois tipos dos sorotipos representa um risco potencial para ocorrência de epidemia do dengue no Estado. Neste contexto a presente análise
teve como objetivo estimar os índices de diferenciação molecular nas populações de Ae. aegypti que ocorrem no
Estado do Maranhão utilizando o marcador mitocondrial ND4 a fim de inferir sobre sua estrutura populacional.
As amostras foram obtidas em 11 municípios do Estado do Maranhão através de armadilhas para ovos (APO). No
Laboratório de Genética e Biologia Molecular do CESC/UEMA (GENBIMOL) as larvas foram alimentadas, quando
adultos transferidos para gaiolas entomológicas onde foram proporcionadas as condições de cruzamentos e obtenção da F1, onde as mesmas no 4º estádio foram submetidas aos procedimentos moleculares. As seqüências
geradas foram editadas e alinhadas através do programa Bioedit. Os sítios polimorficos, as diversidades haplotípica
(h) e nucleotídica (π) para cada população e a análise de variância molecular (AMOVA) em diferentes hierarquias
foram realizados nos programas DnaSP e Arlequin. Obteve - se um fragmento de 336 pares de bases em 119 espécimes de Ae. aegypti para o gene ND4 provenientes de 11 municípios do Maranhão. Quando os municípios foram
considerados como uma única população foi observado 12 sítios polimorficos, 9 haplótipos, sendo o haplótipo 2 o
mais freqüente, seguido pelos haplótipos 1 e 3, foram observados três haplótipos únicos. A diversidade haplotípica
encontrada foi de 0,674 e nucleotídica de 0,01633. A magnitude das diversidades haplotípica e nucleotídica das
populações é um indicativo da redução do fluxo gênico entre as populações de Ae. aegypti no Maranhão. Os resultados da AMOVA para os dois tipos de hierarquia testados, mostraram que a maior parte da variação encontra-se
dentro das populações, quando um único grupo (67,46%) e dois grupos distintos (66,85%). O índice de diferenciação genética entre as populações (FST) apresentou um valor de 0,32535 para um único grupo e de 0,33153 para dois
grupos com P significativo evidenciando diferenças entre as populações analisadas. A diferenciação molecular
evidenciada na presente análise pode ser reflexo dos tratamentos (inseticidas), pelo qual o vetor vem sendo submetido em razão da sua importância epidemiológica.
Apoio financeiro: CNPq/UEMA/UFPA
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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237
Isolamento e caracterização de locos microssatélites
de uma população de Anopheles (N.) darlingi
Lima, GN¹; Batista, JS2; Formiga-Aquino, K2; Tadei, WP 1; Santos, JMM 1
¹ Laboratório de Malária e Dengue - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
² Laboratório Temático de Biologia Molecular - Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
[email protected]
Palavras-chave: Anopheles darlingi, malária, microssatélites, biblioteca genômica, genética molecular
Anopheles darlingi é a mais importante vetora da malária humana no Novo Mundo e contribui para a endemicidade na sua área de distribuição geográfica. Esta espécie pertence ao subgênero Nyssorhynchus, sendo considerada
a mais antropofílica e endofágica das espécies de Anopheles nas Américas. Considerando sua importância epidemiológica f oram caracterizados 10 locos dos 29 polimórficos isolados a partir da construção de uma biblioteca
genômica enriquecida com regiões microssatélites de A. darlingi, conforme
o protocolo.de Billotte et al. (1999). As amostras de DNA genômico foram obtidas da população de Coari (AM),
utilizando um pool de DNA de 10 mosquitos adultos. O DNA genômico foi digerido com a enzima RsaI (10U/μl),
de sítio de restrição (5’)GT¯AC(3’). Para a seleção de fragmentos com microssatélites foram utilizadas as sondas (CT)8 e (GT)8 marcadas com biotina, e também micro-esferas magnéticas envolvidas com estreptavidina. Os
fragmentos selecionados foram ligados em vetor pGEM-T (ProMega) e a transformação bacteriana foi feita por
choque-térmico.,,Sequencias do DNA plasmidial extraído foram analisadas com os programas CHROMAS 2.23 e
BIOEDIT 7.0.0.9, e o WEBTROLL e PRIMER3 para caracterização da biblioteca e desenho dos primers. Foi obtida
uma biblioteca genômica, contendo 96 clones com inserto. Destes, 77 clones (80,2%) apresentaram sequências
nucleotídicas de boa qualidade, com 1,3% de redundância. 73 clones (94,8%), dos 77 selecionados apresentaram
seqüências com SSRs. Foi verificada a presença de 124 SSRs na biblioteca, sendo 1,7 a média do número de SSRs
por clone. A maioria dos motivos de repetição foi classificada como dinucleotídeos (56,5%), sendo GT/CA o mais
encontrado (42,8%). Quanto à natureza de origem a maioria dos SSRs foram classificados como perfeitos (85,5%).
Foi selecionada a seqüência nucleotídica de 63 clones recombinantes (81,8%) para o desenho dos primers, dos
quais foram desenhados 69 pares com a seguinte classificação: 56 perfeitos (81,2%), sendo 41 dinucleotídeos, 10
trinucleotídeos, 3 tetranucleotídeos e 2 compostos; 12 imperfeitos (17,4%), destes, 6 são dinucleotídeos e 6 compostos; e um interrompido (1,4%). Desse total de primers, 66 pares (95,6%) foram sintetizados. Destes, 44 locos
(66,6%) amplificaram a 60º C, sendo 29 locos (65,9%) polimórficos e com bom padrão de alelos. Até o momento
foram genotipados e caracterizados 10 locos polimórficos. Nos quais, o número de alelos variou de quatro a 10,
com média de 7,5 alelos por loco. A heterozigosidade observada variou de 0,174 a 0,781 e a esperada de 0,590 a
0,871. Foi verificado que dos 10 locos analisados, quatro não apresentaram Equilíbrio de Hardy Weinberg (p<0,005),
merecendo atenção especial em futuros estudos populacionais dessa espécie.
Apoio Financeiro: PROCAD/CAPES, FAPEAM e INPA.
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Expressão diferencial de genes de resistência a
inseticidas em Anopheles darlingi
Naice, MV1; Tadei, WP2; Loreto, ES3; Margis, R4; Rafael, MS2
Mestranda de Genética, Conservação e Biologia Evolutiva/INPA/FAPEAM
Laboratório de Vetores da Malária/Dengue,INPA, Manaus-AM
3
Universidade de Santa Maria-RS,4Universidade Federal do Rio Grande do SUL-RS
[email protected], [email protected]
1
2
Palavras-chave: ESTs, GST,Troponina,Temephos, malária
A malária ou impaludismo é uma das infecções que causa mais mortes no mundo e é um dos problemas mais
importantes de saúde pública. Cerca de 3,5 bilhões de pessoas que vivem nos trópicos estão expostas à infecção
pelos agentes etiológicos da malária, cuja taxa de incidência varia de 350 a 500 milhões de casos por ano, levando
a óbitos cerca de 1,5 a 2,7 milhões habitantes. O mosquito Anopheles darlingi é o principal vetor da malária na
Amazônia, onde ocorre a maioria dos casos da doença. Nos últimos anos, os casos de malária têm diminuído cerca
de 24,7% e um dos motivos é uso de inseticidas sintéticos. Porém, há registros sobre a resistência de A. darlingi ao
inseticida Temephos. Nesse sentido, utilizou-se os genes da Glutationa S-Transferase (GST) e Troponina Isoforma
3, para verificar a sua expressão diferencial em amostras de A. darlingi expostas ao Temephos em relação ao gene
da Actina. Larvas de A. darlingi foram expostas ao Temephos na concentração de 0,02% e larvas controle, em água
potável, foram monitoradas em intervalos de 1, 8 e 16 horas. As larvas foram mantidas a 80 oC negativos. Extraíramse o RNA total por meio do método do TRizol®, que foi quantificado em gel de agarose 0,8%, corado em brometo de
etídio e visualizado sobre luz ultravioleta. Sintetizaram-se a fita complementar de RNAm, com kit Super ScriptTM
Reverse Transcriptase. As amostras alvo (GST e Troponina Isoforma 3) e o gene constitutivo (Actina) foram amplificados e quantificados, com o sistema SYBR-Green® em aparelho de PCR em tempo real. Testaram-se três diferentes
pares de pares para os genes de Troponina. A expressão gênica medida por dois destes primers mostrou-se fortemente inibida pelo tratamento, sendo 6 e 8 vezes menores que nas larvas não tratadas. O outro par de primers não
mostrou diferença de expressão gênica entre os tratamentos. Porém um aumento na expressão do gene GST, de
aproximadamente 12 vezes, foi observada nas larvas tratadas. Estes resultados mostram que os genes de Troponina Isoforma 3 e GST apresentam um padrão inversamente proporcional em suas expressões gênicas e podem
estar envolvidos no processo de resistência de A. darlingi ao inseticida Temephos.
Apoio Financeiro: CAPES/PROCAD- Amazônia, PIPT/FAPEAM, CT-Biotecnologia/MCT/CNPq, PIATAM/Petrobrás.
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Utilidade do gene mitocondrial COII para testar relações
filogenéticas entre espécies dos subgêneros Simulium
(Thyrsopelma), S. (Trichodagmia) e S. (Hemicnetha)
Soares, FR1,3; Cunegondes, A1; Kaminski, AC2, Hamada, N1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Coordenação de Pesquisas em Entomologia, Av. André Araújo, 2936, Aleixo, Manaus, AM
Universidade Federal do Amazonas, Departamento de Biologia, Coari, AM
3
Bolsista PIBIC/CNPq. [email protected]
1
2
Palavras-chave: filogenia, COII, Simuliidae, DNA mitocondrial, Diptera
A validade de alguns subgêneros de Simuliidae na região Neotropical é controversa, sendo os subgêneros Simulium
(Thyrsopelma) e S. (Trichodagmia) considerados sinônimos por vários autores. O subgênero S. (Hemicnetha) é considerado grupo irmão desses dois subgêneros. Os dois primeiros subgêneros possuem algumas espécies altamente
antropofílicas e, pelo menos duas estão relacionadas com doenças que afetam o ser humano. Contrastando com o
grande número de estudos morfológicos e citotaxonômicos, os estudos moleculares sobre as relações filogenéticas
de Simuliidae ainda são escassos. O objetivo desse trabalho foi testar as relações entre algumas espécies desses
dois subgêneros utilizando um fragmento do gene do DNA mitocontrial citocromo oxidase subunidade II (COII)..
Foram analisados indivíduos das seguintes espécies do subgênero S. (Thyrsopelma): S. guianense, S. hirtipupa, S.
itaunense, S. scutistriatum, S. duodenicornium e S. perplexum; subgênero S. (Trichodagmia): S. nigrimanum; subgênero S. (Hemicnetha): S. cristalinum, S. lobatoi e S. rubrithorax. S. perflavum, do subgênero S. (Psilopelmia) foi incluído
nas análises como grupo externo. Os espécimes foram preservados em álcool 100%. O DNA total foi isolado pelo
kit “DNeasy Blood and Tissue” da Qiagen. As seqüências do gene COII foram amplificadas por “Polymerase Chain
Reaction” (PCR). Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1%, corado com brometo
de etídeo. As bandas de DNA foram visualizadas e fotografadas. Os fragmentos foram purificados com o kit “PCR
Clean Up System”, da PROMEGA. O seqüenciamento foi realizado em seqüenciador MegaBace 1000. As seqüências obtidas foram analisadas filogeneticamente no programa PAUP*. Três árvores foram geradas: máxima verossimilhança, neighbor-joining e parcimônia, todas apresentaram a mesma topologia. Simulium scutistriatum e S.
perplexum não se posicionaram no grupo formado pelas outras espécies do subgênero S. (Thyrsopelma) enquanto
que S. lobatoi foi inserida no grupo formado por espécies desse subgênero. Nossas análises preliminares sugerem
que a inserção de algumas espécies nos subgêneros S. (Thyrsopelma), S. (Trichodagmia) e S. (Hemicnetha) devem ser
reavaliadas uma vez que elas não representam um grupo monofilético.
Fontes financiadoras: CNPq/FAPEAM/INPA
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240
Dados preliminares sobre as relações filogenéticas
de espécies do grupo quadrifidum Simulium
(Psaroniocompsa) (Diptera, Simuliidae) pelo método de
“DNA barcoding”
Cunegondes, A1; Soares, FR2,3; Kaminski, AC3; Hamada, N4
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Programa de Pós-graduação em Biologia Tropical e Recursos Naturais Renováveis –
Curso de Genética, Conservação e Biologia Evolutiva
2
Bolsista PIBIC/INPA
3
Universidade Federal do Amazonas - UFAM
4
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Coordenação de Pesquisas em Entomologia
[email protected]
1
Palavras-chave: Filogenia, Simuliidae, DNA barcoding, gene mitocondrial, monofilia
Os simulídeos (Diptera: Simuliidae) apresentam diversas espécies com importância médica e econômica. No Brasil,
esses insetos são conhecidos como “borrachudos”, no centro e sul do país e “piuns”, nas regiões Norte e Nordeste.
Os adultos caracterizam-se por ter veias da asa pouco desenvolvidas, possuem, geralmente, coloração escura, asas
largas e aspecto corcunda. O grupo quadrifidum do subgênero Simulium (Psaroniocompsa) é composto por seis
espécies: S. goeldii, S. quadrifidum, S. cauchense, S. ulyssesi, S. cerradense e S. daltanhani. Os conhecimentos taxonômicos sobre simulídeos da região Neotropical têm avançado significativamente nos últimos 30 anos. Apesar
disso, estudos moleculares envolvendo filogenia de Simuliidae, no Brasil, ainda são escassos. Dentre as ferramentas moleculares, o seqüenciamento de fragmentos de genes permite a avaliação direta de polimorfismos de DNA,
fornecendo dados robustos para realizar inferências filogenéticas e determinação de relações de parentesco entre
indivíduos e populações. O método de “DNA barcoding”, sistema de identificação baseado na diversidade de uma
parte da seqüência do gene da subunidade I da citocromo oxidase (COI), um gene mitocondrial, representa um
método promissor para o diagnóstico da diversidade biológica. Este método apresenta como vantagens possibilitar a identificação de espécies em qualquer estágio de vida ou fragmento do organismo e facilitar a delimitação de
espécies crípticas. O objetivo desse trabalho foi realizar o seqüenciamento de um fragmento do gene COI, para inferir relações filogenéticas de espécies do grupo quadrifidum Simulium (psaroniocompsa), comparando estas com
espécies consideradas externas ao grupo. Os espécimes foram preservados em álcool 100%. O DNA total foi isolado
pelo kit “DNeasy Blood and Tissue” da Qiagen. As seqüências do gene COI foram amplificadas por “Polymerase
Chain Reaction” (PCR). Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1%, corado com
brometo de etídeo. As bandas de DNA foram visualizadas em um transiluminador de luz ultravioleta (UV) e fotografadas. Os fragmentos foram purificados utilizando o kit “Wizard SV Gel and PCR Clean-up System” da Promega.
O seqüenciamento foi feito em seqüenciador MegaBace 1000. As seqüências obtidas foram comparadas quanto à
distância entre espécies com o modelo Kimura-2-Parâmetros (K2P). A partir destas distâncias foi gerada uma árvore filogenética. Os resultados obtidos indicam fortes relações entre algumas espécies do grupo quadrifidum com
espécies de grupos externos, sugerindo que o grupo quadrifidum não é monofilético.
Fontes financiadoras: FAPEAM/CNPq/INPA
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241
Caracterização de elementos de DNA cromossômico
terminal enriquecidos com DNA homopolimérico em
Rynchosciara americana (Diptera: Sciaridae)
Fernandes, T; Madalena, CRG; Gorab, E
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, IB-USP, São Paulo, Brasil
Palavras-chave: Rhynchosciara americana, DNA homopolimérico (DA/DT), DNA repetitivo, Heterocromatina terminal, Sciaridae
Resultados de hibridação in situ com sonda de RNA poli-U em cromossomos politênicos de Rhynchosciara americana revelaram a existência de regiões genômicas ricas em DNA homopolimérico poli(dA).poli(dT) (Jones et al.,
1973). Este trabalho trouxe a tona vários aspectos do genoma dos eucariontes que, mesmo atualmente, podem
ser considerados surpreendentes. O trabalho foi também o primeiro a mostrar uma sonda não usual que hibridava preferencialmente em regiões cromossômicas terminais de um díptero. Além disto, foi também pioneiro em
mostrar a formação in situ de ácidos nucléicos de tripla hélice com RNA exógeno. Em relação ao enriquecimento
localizado de DNA homopolimérico, o seqüenciamento de genomas feitos recentemente, além de dados de hibridação in situ em muitas espécies, mostra que esta característica é incomum. Regiões cromossômicas ricas em
poli(DA/DT) foram posteriormente identificadas em outras espécies de Rhynhosciara por hibridação com sonda
de RNA poli-A. Entretanto, as seqüências de DNA presentes nestas regiões permaneceram descaracterizadas,
apesar de várias tentativas de clonagem possivelmente dificultadas pela natureza homopolimérica das mesmas.
Neste trabalho, desenvolvemos um método visando clonar e caracterizar estas seqüências. A partir de uma única
extremidade cromossômica microdissecada, uma PCR foi realizada utilizando uma sequência homopolimérica
como (DA)20 iniciador. Segmentos homopoliméricos complementares ao iniciador presentes em cadeias opostas
possibilitaram a amplificação do DNA de interesse. Duas rotinas de PCR distintas para temperatura de hibridação
do iniciador foram realizadas. A amostra obtida com temperatura de hibridação mais baixa (300C) foi marcada
com biotina e hibridou exatamente nas regiões cromossômicas que hibridam com RNA poli-U ou poli-A descritas
anteriormente. Já a segunda amostra, amplificada com temperatura de hibridação mais alta (450C), não hibridou
em regiões pericentroméricas dos cromossomos A, B, C e X, marcando apenas as regiões teloméricas além de
uma banda intersticial de cada cromossomo politênico. Estes dados sugerem a existência de famílias distintas de
elementos repetitivos compostos de DNA homopolimérico no genoma de R. americana. Os produtos de PCR da segunda amostra foram utilizados para a construção de um microbiblioteca. Insertos de 36 DNAs plasmidiais foram
analisados por hibridação em Southern-blot quanto à presença de DNA altamente repetitivo utilizando como
sonda DNA genômico total de R. americana. Dois insertos que mostraram intensidade esperada para segmentos
de DNA altamente repetitivo foram marcados com biotina e localizados in situ. A hibridação desses insertos nas
mesmas regiões observadas com a sonda do produto total de PCR obtido nos levou à caracterização molecular
desses clones. Uma unidade de repetição em tandem de fórmula (T6A2G2T2A2) foi encontrada abrindo novas perspectivas quanto ao papel de seqüências curtas compondo a região cromossômica terminal de R. americana.
Jones KW, Bishop JO, Brito da Cunha AB (1973 Chromosoma 43: 375-390.
Apoio Financeiro: FAPESP
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242
High-throughput gene discovery in the New World
Screwworm, fly Cochliomyia hominivorax (Diptera:
Calliphoridae) using the 454 sequencing technology
Carvalho, RA; Azeredo-Espin, AML; Torres, TT
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética – Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas
Keywords: Next-generation sequencing, Transcriptome, Insecticide resistance, Functional genomics, Ectoparasitism
The New World screwworm (NWS) Cochliomyia hominivorax (Coquerel) (Diptera: Calliphoridae), is an important
parasitic insect pest in Neotropical regions. This species has been successfully eradicated from North and most of
Central America by the sterile insect technique, but this pest continues to affect the development of the livestock
sector in South American and Caribbean economies. Screwworm myiasis is caused by the larval stage of the fly
infesting tissues of warm-blooded vertebrates, causing significant reductions in the quality of leather and in the
milk and meat production. This species has been controlled for decades by applying insecticides, especially organophosphate (OP)-based compounds. However, the improper and continuous use of these chemicals can lead to
the selection of OP-resistant strains. This problem is increased by a lack of understanding of the genes differentially
expressed in the resistant individuals and their physiological roles. Despite the importance of the NWS for livestock
productivity, little genomic or functional data are available for this species. Massive pyrosequencing is a fast and
efficient way of characterizing the transcriptome of nonmodel species. Hence, we have used massively parallel
pyrosequencing on the Roche 454-FLX platform to produce an EST dataset for C. hominivorax. Three libraries prepared from either larva, male or female adult flies were pooled prior to sequencing allowing the discovery of genes
expressed differentially among these samples. In total, 548,940 sequences were obtained which totals over 100 Mb
data. These reads were evenly distributed among the three samples. The assembly of the obtained reads generated
~24,000 contigs and singletons. Homology searches (BLASTx and BLASTn) of unique sequences and functional annotation are being performed remotely in the NCBI server. Our data represents the first large-scale EST project for
livestock ectoparasites by pyrosequencing. This transcriptome database will pave the way for further investigation
of genes involved in insecticide resistance. Furthermore, this effort holds a great promise for the identification of
genes expressed in specific life stages, including genes responsible for larval parasitism and olfactory perception of
flesh and blood in female flies.
Financial support: Fapesp.
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243
Distribuição espacial da variabilidade genética da
mosca da bicheira no Caribe e América do Sul
Fresia, P1,2; Lyra, ML1,2; Azeredo-Espin, AML2,3
Programa de Pós Graduação em Genética e Biologia Molecular, Instituto de Biologia, UNICAMP
Laboratório de Genética e Evolução Animal, CBMEG, UNICAMP
3
Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes, Instituto de Biologia, UNICAMP
[email protected]; [email protected]
1
2
Palavras-chave: Cochliomyia hominivorax, DNA mitocondrial, variabilidade genética, estrutura populacional e controle de pragas
A mosca da bicheira, Cochliomyia hominivorax, é um ectoparasita obrigatório de vertebrados de sangue quente
endêmico das Américas. A atual distribuição geográfica de C. hominivorax compreende algumas ilhas do Caribe e
América do Sul, tendo sido erradicada da América do Norte e Central-continental num programa de manejo integrado de pragas em áreas extensas baseado em SIT (Sterile Insect Technique). C. hominivorax parasita uma vasta
gama de hospedeiros, desde a fauna silvestre até o homem, mas é mais notória quando afeta animais domésticos
de interesse produtivo. Devido aos graves prejuízos econômicos causados por essa espécie na produção pecuária
das Américas, através da mortalidade de bezerros e cordeiros recém-nascidos, reduções na qualidade do couro
e diminuição na produção de leite e carne, é preciso haver um contínuo investimento em controle desta praga.
Existe um consenso internacional de que as campanhas de intervenção contra essa praga devem ser baseadas no
conceito de manejo integrado de pragas em áreas extensas. Um ponto crítico no desenho e implementação de um
programa de controle com essas características é a identificação e caracterização das populações das regiões alvo
do programa. Nesse sentido, a análise da variabilidade genética através de marcadores moleculares nos permite
estimar a diferenciação entre amostras das distintas populações e os fatores históricos ou atuais que influenciam
neste processo. Neste trabalho, seqüências parciais dos genes COI, COII e do domino B da região controle (região
A+T) do genoma mitocondrial de C. hominivorax foram usadas para acessar a diversidade e investigar o padrão
de distribuição desta em populações geográficas do Caribe e América do Sul. Foram analisadas amostras de 54
localidades totalizando 400 indivíduos. Para o gene COI foram identificados 79 haplótipos mitocondriais, 73 para
o gene COII, e 99 para a região A+T. Os índices de diversidade haplotípica foram hCOI=0,927, hCOII=0,897 e hA+T=0,940
e os valores de diversidade nucleotídica pCOI= 0,0043, pCOII=0,0049 e pA+T=0,0095. O padrão de estruturação populacional foi semelhante para os três marcadores moleculares utilizados. Na região do Caribe foi identificada maior
estruturação populacional com baixos índices de diversidade, enquanto que na América do Sul foi identificada
alta diversidade e baixa estruturação populacional. Os resultados sugerem que diferentes processos estão atuando
na formação e manutenção do padrão observado. Esses resultados têm implicações diferentes para o estabelecimento de programas de controle da praga nas diferentes regiões da atual distribuição da espécie.
Apoio financeiro: CAPES, FAPESP, IAEA.
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244
Variabilidade de proteínas esterásicas em linhagens de
Muscina stabulas Fállen (Diptera: Muscidae) em granjas de
galinhas Poedeiras do sudoeste do Estado de São Paulo
Bélo, M1 & Alves, SM2
Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2Universidade Federal do Mato Grosso, Câmpus de
Rondonópolis.
[email protected]
1
Análises eletroforéticas de linhagens de M. stabulans, realizadas em moscas capturadas em granjas de galinhas
poedeiras de sete localidades do Estado de São Paulo, foram estudadas através de isoenzimas esterásicas. As
coletas foram realizadas nesta região por favorecer a presença da espécie durante todo o período anual, devido
ao seu clima mais ameno que nas demais regiões do interior do Estado de São Paulo. De cada linhagem, foram
analisadas 120 moscas (60 machos e 60 fêmeas), dando um total de 840 indivíduos. Os membros dos sexos diferentes de cada linhagem não apresentaram diferenças nos padrões das bandas esterásicas. As moscas apresentaram vinte (20) tipos de bandas, que foram identificadas de acordo com as migrações no gel, espessura e coloração, como pertencentes a sete grupos ou zonas, de A até G. As bandas B,C, D e F apresentaram especificidade
de coloração para o α-naftil acetato, as bandas do grupo E, coloração com o β-naftil acetato, e as bandas A e G
mostraram-se indefinidas quanto ao tipo de corante. De acordo com as frequências das bandas apresentadas,
foi possível caracterizar cada linhagem de mosca analisada. As proximidades entre os sistemas das isoenzimas
esterásicas apresentadas pelas linhagens de moscas foram analisadas através do método UPGMA. As relações
filogenéticas dos sistemas das isoenzimas esterásicas mostraram que as linhagens foram reunidas em quatro
grupos: as moscas de Monte Mor apresentaram estar mais relacionadas com as moscas de Sumaré; as moscas
de Sarapuí, com as de Assis, e as de Sorocaba, com as de Ibiúna; as moscas da linhagem de Tatuí formaram um
grupo isolado. Deste modo, os indivíduos das localidades geográficas mais próximas mostraram estar mais
relacionados, ou seja, as proximidades genéticas entre linhagens estão relacionadas com as suas distâncias
geográficas. Assim, as localidades de Sumaré e Monte Mor são as mais próximas (29 km); o mesmo ocorre com
as localidades de Sorocaba e Ibiúna (30 km, de distância entre elas). Entretanto, o grupo formado pelas linhagens de Sarapuí e Assis, que são de todas as outras linhagens as mais distanciadas geograficamente (cerca de
300 km), estão próximas de acordo com as suas relações filogenéticas. Estas semelhanças devem-se, talvez, à
migração das moscas, a qual é facilitada pela existência da rodovia SP270, que liga estas duas localidades, e pelas
duas granjas pertencerem à mesma firma comercial. Assim, o transporte de fezes de um local para o outro, para
atender à demanda de compradores que as usam como adubo orgânico, facilitaria este mister. Desse modo, os
resultados indicam que, quanto mais próximas forem as granjas de origem das linhagens, há maior possibilidade
de fluxo gênico, entre elas e, consequentemente, maior semelhança genética.
FAPESP
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245
Análise de variação do gene Scarlet em três espécies
de moscas-das-frutas do gênero Anastrepha
Nogueira, V; de Brito, RA
Laboratório de Genética de Populações e Evolução, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
[email protected]
Palavras-chave: Anastrepha, Scarlet, diversidade genética, polimorfismo, genética evolutiva
Moscas da família Tephritidae, conhecidas comumente como moscas-das-frutas, incluem o gênero Anastrepha,
que configura o maior dentro dessa família. Possuem grande importância econômica, pois em sua fase larval se alimentam do endocarpo de frutos carnosos causando grandes perdas à fruticultura nacional. Anastrepha fraterculus
é um complexo heterogêneo de espécies muitas vezes morfologicamente indistinguíveis, sendo sua complexa distinção baseada em pequenas variações morfológicas do ápice do ovipositor, padrão de nervuras e faixas das asas. A
insatisfatória quantidade de trabalhos publicados a respeito desse gênero relativamente à sua grande importância
biológica e econômica motivou o presente trabalho. A ampla distribuição geográfica aliada à característica multivoltina de gerações anuais as tornam um organismo interessante para análises moleculares, buscando marcadores
que possam distinguir esse complexo de espécies crípticas e ao mesmo tempo traçar suas histórias evolutivas.
Com esse intuito, o objetivo deste trabalho foi identificar sequências do gene scarlet (st) nas espécies Anastrepha
fraterculus, Anastrepha obliqua e Anastrepha sororcula para possibilitar análises comparativas da diversidade genética intra e interespecífica. O gene scarlet (white) possui cerca de 670 aminoácidos e seu produto gênico participa
da biossíntese da pigmentação ocular. A amplificação de um fragmento de aproximadamente 850 nucleotídeos foi
realizada a partir de um pool gênico relativo a cada uma das espécies, a partir de amostras coletadas na natureza e
mantidas em laboratório. Os primers utilizados foram desenhados com base em espécies filogeneticamente próximas e verificados para a formação de possíveis estruturas secundárias internas na ferramenta IDT OligoAnalizer
3.1. O material amplificado das três espécies estudadas foi então purificado com PEG8000 e clonado usando o
kit T&A Cloning Vector Kit. Dezoito colônias bacterianas contendo o gene referente a cada espécie, totalizando
cinqüenta e quatro, foram então amplificadas por PCR direta, novamente purificadas e seqüenciadas. Os eletroferogramas foram visualizados, qualificados e posteriormente alinhados manualmente. O nível de diversidade nucleotídica mostrou-se elevado para as três espécies, valor de Pi próximo a 0.017. As sequências nucleotídicas foram
então avaliadas à procura de polimorfismos (SNPs), utilizando o software DNAsp. Os valores dos testes estatísticos
de Neutralidade (Tajima D, Fu e Li D e F, Fs) foram significativos, portanto há possibilidade da região não estar sob
seleção neutra. A inferência filogenética de um cladograma gerado no programa TCS mostrou-se confusa, com a
presença de loops e ramos compridos. A identificação de potenciais SNPs é de grande valia para análises que nos
permita encontrar regiões que configurem marcadores de distinção interespecíficos, a construção de mapas de
ligação e, concomitantemente, realizar estudos filogenéticos que nos possibilite entender um pouco mais sobre a
história evolutiva desse grupo.
Apoio financeiro: FAPESP CNPq, CAPES.
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Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Variações no gene Yolk na diferenciação do grupo de
moscas das frutas do complexo Fraterculus
Oliveira, GC1; de Brito, RA2
Laboratório de Genética de Populações e Evolução, Departamento de Genética de Populações e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
[email protected]
Palavras-chave: Mosca das frutas, yolk, diversidade, Filogeografia, fluxo gênico
Espécies do complexo fraterculus estão relacionadas com os maiores danos a culturas de frutas carnosas por
atacar frutos verdes e maduros indistintamente, o que as torna pragas de grande importância econômica. Contudo, estas espécies são de difícil distinção, com a existência potencial de diversas espécies crípticas. Dessa forma,
o entendimento da biologia e, particularmente, da estrutura populacional desses insetos-praga tem grande importância para o desenvolvimento de novas estratégias de manejo. Neste trabalho, investigamos a variação no
gene yolk em 37 indivíduos ao longo da distribuição do complexo no Brasil para conhecermos melhor o padrão
estrutural das espécies do complexo fraterculus. O gene amplificado apresentou 908 pb, porém, como os dados
indicaram a existência de eventos de recombinação, particionamos nossos dados em três regiões distintas: 5’,
mid e 3’. Essa partição minimizou os efeitos da recombinação e garantiu uma melhor acurácia na análise de nossos dados. Análises de polimorfismos nestas regiões apontaram para altos valores de diversidade nucleotídicas
intra e interespecíficas para as três regiões gênicas em questão, sendo estes valores maiores para a região 3’. A
metodologia da Análise dos Clados Aninhados (NCPA) foi utilizada para inferências de possíveis relações entre
a configuração das redes haplotípicas com o padrão de distribuição geográfica considerando estas três regiões
distintas. Na análise de nossos dados observamos dois eventos principais que podem estar influenciando a distribuição das espécies do complexo fraterculus no território nacional. A primeira inferência refere-se a expansão populacional no sentido Centro-Sul do Brasil, referente preferencialmente à espécie A. fraterculus. O segundo
evento de inferência indica fluxo gênico restrito com isolamento por distância em clados superiores ao longo
da distribuição global dos espécimes amostrados. A datação destes eventos indica uma congruência temporal,
o que pode indicar que a não ocorrência de fluxo gênico em clados inferiores possa estar associado à restrições
amostrais, uma vez que nossa amostragem é de fato restrita. Além disso, em populações mais próximas, o fluxo
gênico pode estar ocorrendo com freqüência suficiente para promover a homogeneização genética das populações. Os resultados obtidos acima através da análise das seqüências do gene yolk nos permitiu um melhor
conhecimento àcerca dos níveis de variação referentes à esse marcador, bem como determinar os princípios e
processos que possam estar envolvidos no padrão de distribuição atual das espécies do complexo fraterculus no
território nacional.
Apoio Financeiro: CAPES, FAPESP E CNPq.
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Análise da Variação Intra e Interespecífica em genes do
Aparelho Reprodutivo de Fêmeas de espécies moscasdas-frutas do grupo fraterculus
Fernandes, F; de Brito, RA
Laboratório de Genética de Populações e Evolução, Departamento de Genética de Populações e Evolução, Universidade Federal de São
Carlos.
[email protected]
Palavras-chave: Anastrepha, biblioteca cDNA, SNPs
No Brasil, o gênero Anastrepha tem importância por apresentar espécies responsáveis por danos de grandes
proporções às culturas de frutas carnosas. A utilização de defensivos agrícolas para a eliminação destas moscas
trazem grandes prejuízos ambientais, o que estimula a procura por métodos alternativos para o controle destas
moscas. A presença de grande número de espécies crípticas de difícil distinção torna ainda mais difícil a elaboração de programas que visem o controle dessas pragas. A existência de polimorfismos intraspecíficos bem como de
cruzamentos viáveis entre diferentes espécies do grupo sugere que estas espéceis do grupo fraterculus divergiram
há pouco tempo e possivelmente ainda não acumularam diferenças genéticas significativas independentemente
das advindas do processo de especiação. Com este intuito, este trabalho busca a amplificação a partir de uma
biblioteca genômica de cDNA, desenvolvida no Laboratório de Genética de Populações e Evolução na Universidade Federal de São Carlos, de genes que estão sendo expressos no aparelho reprodutivo de fêmeas de Anastrepha
fraterculus, bem como a identificação de potenciais SNPs nas regiões amplificadas. A amplificação destas regiões
foi testada para diferentes condições de amplificação em pools de DNA de Anastrepha obliqua, Anastrepha sororcula e Anastrepha fraterculus utilizando indivíduos de várias regiões do Brasil. As coletas de moscas destas espécies
são feitas pela retirada de frutos na natureza e que são levados para o laboratório, onde são mantidos até a eclosão
das pupas. Do conjunto de 29 primers desenhados para 29 genes diferentes, 20 forneceram bons produtos de
amplificação para estes pools que foram purificados através de precipitação com PEG8000 e clonados utilizando
o kit de clonagem T&A Cloning Vector Kit (RBC). Os clones derivados de cada amplificação representam cópias
distintas para cada uma das vinte regiões amplificadas. Desta forma estas cópias permitem a investigação do nível
geral de polimorfismo dentro e entre as espécies para estas regiões e portanto uma investigação de sua utilidade
não apenas em estudos filogeográficos mas também no potencial para o estabelecimento de marcadores SNPs
(Single Nucleotide Polymorphisms). Até o momento foram sequenciados 20 clones para cada uma das espécies
para os genes CG6503, CG7009 e CG9894, que possuem uma alta taxa de dN/dS, indicando grande quantidade de
mutações que levam a substituição de aminoácidos, tornando-se então genes potenciais para rápida identificação
de SNPs. Tais seqüências foram utilizadas para identificar SNPs com ampla distribuição que podem ser utilizados
para auxiliar em estudos sobre especiação em moscas-das-frutas, não apenas por permitir maior capacidade de
detecção da variação genética populacional, mas também porque o uso destes marcadores dispersos no genoma
pode ser de grande valia para o estudo de segregação familiar e estabelecimento de mapas de ligação.
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Isolamento de SNPs para o gene extra sex combs em
Moscas-das-Frutas do gênero Anastrepha
Nakamura, AM; Gonçalves, VR; de Brito, RA
Laboratório de Genética de Populações e Evolução, Departamento de Genética de Populações e Evolução, Universidade Federal de São
Carlos
[email protected]
Palavras-chave: Anastrepha, SNPs, genética de populações, diversidade genética
As moscas-das-frutas do gênero Anastrepha pertencem à família Tephritidae e são de grande importância
econômica por serem pragas agrícolas, causando grandes prejuízos à produção de frutos no país. Dentre as espécies endêmicas no Brasil estão A. fraterculus, A. obliqua e A. sororcula. Há grande dificuldade em identificar corretamente essas espécies devido à existência de poucos marcadores morfológicos claros. Assim, é de grande importância o isolamento de marcadores genéticos tanto para identificação de espécies, quanto para seu uso em estudos
filogenéticos e populacionais. Neste intuito, estamos buscando identificar regiões variáveis em genes razoavelmente conservados que permitam-nos o isolamento de SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) que podem ser
futuramente utilizados em estudos de mapeamentos de ligação. O gene extra sex combs (esc) é responsável por
codificar uma proteína de ligação ao DNA que tem participação em diversos processos biológicos como repressor
de genes homeóticos e, por isso, estima-se que seja em geral conservado. O objetivo deste trabalho foi seqüenciar
o gene esc para diversas populações das espécies A. fraterculus, A. obliqua e A.sororcula para posterior isolamento
de SNPs. Como não temos o genoma de espécies desse gênero, os primers para amplificação foram feitos a partir
de sequências de espécies filogeneticamente próximas ao gênero Anastrepha. Foram escolhidos dez machos e dez
fêmeas de diferentes localidades do Brasil para cada uma das espécies acima mencionadas com a finalidade de se
obter um pool que represente boa parte da distribuição desse gênero. O DNA foi extraído utilizando o protocolo de
precipitação diferenciada em Tiocianato de Guanidina fornecendo um pool para cada espécie. Depois de atingidas
boas condições de amplificação para o gene, as amostras foram purificadas através de purificação com PEG8000
e clonadas utilizando o kit de clonagem InsTAclone (Fermentas). Vinte clones foram purificados e seqüenciados
para cada espécie com o intuito de fornecer dados gerais de variação genética e polimorfismo intra e interespecífico. A idéia é que cada clone forneça cópia distinta para este alelo na espécie estudada. Os dados obtidos para tal
gene indicam que existe pouca variação genética para este gene, com uma variação quase exclusivamente restrita
a substituições sinônimas, que não levam a alterações de aminoácidos. Não obstante isso, pudemos identificar
duas regiões com polimorfismo genético com potencial para uso em análises de mapeamento. Tais possíveis SNPs
concordam com estudos anteriores que em geral não identificaram marcadores específicos de espécie para as
espécies deste grupo de grande importância. Estes SNPs serão utilizados em conjunto com outros para estudos de
mapeamento genético nestas espécies que poderão nos auxiliar no entendimento de sua biologia.
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Identificação de genes expressos no aparelho
reprodutor de fêmeas de Anastrepha obliqua
Gonçalves, VR; Malago, WJ; Henrique-Silva, F; de Brito, RA
Laboratório de Genética de Populações e Evolução, Departamento de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos
[email protected]
Palavras-chave: Anastrepha, Biblioteca cDNA
O grupo Anastrepha fraterculus pertencente à família Tephritidae (Trypetinae, Toxotrypanini) é de grande importância para o estudo de processos de especiação uma vez que é composto por 29 espécies que possivelmente divergiram entre si há pouco tempo. Algumas espécies deste grupo, dentre elas Anastrepha obliqua, possuem grande
importância econômica apesar dos estudos ainda serem escassos. Bibliotecas gênicas feitas a partir de cDNAs expressos em espécies ou tecidos específicos são essenciais para identificar novos genes que estão sendo expressos
em um determinado organismo, tecido e condição. Além da identificação de novos genes, as bibliotecas também
são importantes para a produção de novos marcadores que podem ser inclusive usados para gerar um mapa de
ligação para a espécie. Genes envolvidos com processos da reprodução muitas vezes mostram sinais de evolução
adaptativa. Este trabalho teve como objetivo construir uma biblioteca de cDNA a partir de um pool de tecidos
reprodutivos femininos de diferentes localidades de Anastrepha obliqua para produzir ESTs (Expressed Sequenced
Tags), que foram usados para identificar genes expressos nestes tecidos, buscando basicamente identificar regiões
que possuem alta taxa evolutiva nesta espécie. A biblioteca foi construída a partir de 2mg de mRNA isolado de
ovopositores e órgãos reprodutivos femininos de moscas com aproximadamente 10 dias, que é o tempo de maturação sexual. A clonagem e geração da biblioteca foi feita com o kit CloneMinerTM cDNA Library Construction KIT
(Invitrogen) em que a fita simples de mRNA é convertida para uma fita dupla de cDNA. As colônias obtidas através
de transformação bacteriana foram seqüenciadas, e então, identificadas através do ORF Finder (http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/gorf.html), que identifica todas as seqüências de aminoácidos possíveis dentro da seqüência de DNA
dada. Até o momento foram seqüenciados 600 clones e através das análises foi possível identificar uma grande variedade genética. Uma parte das colônias com o fragmento inserido foram tratadas com enzima de restrição, e os
fragmentos tiveram uma média de 1,1 Kb. Cerca de 75% das seqüências obtidas foram alinhadas logo no início com
seqüências de outras espécies, normalmente do gênero Drosophila,o que indica uma boa qualidade da biblioteca.
Cerca de 80% dos ESTs encontrados possui identidade superior a 50% a outros genes identificados no GenBank,
sendo boa parte destes de proteínas ribossomais. Os 20% restantes são compostos de proteínas com identidade
inferior a 50%, ou mesmo sem nenhuma outra seqüência similar no GenBank, ou seja, é possível que estes sejam
genes em que estejam ocorrendo grande pressão para a substituição de aminoácidos de forma a promover grandes
alterações na proteína resultante. Os resultados destas análises mostram a importância de se identificar novos
ESTs através desta metodologia que revelaram ser uma valiosa ferramenta para melhor entender o processo de
especiação neste gênero.
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Obtenção de seqüências completas do gene “fruitless”
em Anastrepha obliqua (Moscas-das-Frutas) através
da técnica de RACE-PCR
Szrajer, MR; De Brito, RA
Laboratório de Genética de Populações – Departamento de Genética e Evolução
Universidade Federal de São Carlos (UFSCar-SP)
[email protected]
Palavras-chave: Anastrepha, Moscas-das-frutas, Fruitless, RACE-PCR, Evolução molecular
As moscas-das-frutas (Anastrepha sp) representam uma das maiores ameaças à fruticultura nacional. A ausência
de conhecimento referente à biologia desse grupo e de dados moleculares desses organismos tem dificultado estudos de seus aspectos evolutivos e diferenciação entre populações. A expansão para estes tefritídeos é importante
não apenas pelo aspecto teórico, mas também por sua aplicação prática em estratégias quantitativas de identificação de genes. Nossos estudos têm revelado que certos genes, denominados “genes candidatos”, influenciam
diretamente o processo de divergência entre espécies por estarem ligados a regiões sob maiores pressões seletivas,
influenciado diretamente o tempo estimado de ocorrência do processo de especiação. Neste trabalho, visamos à
amplificação e posterior seqüenciamento de toda a região codificadora do gene fruitless (incluindo as regiões 5´e
3´flaqueadoras) em Anastrepha obliqua, o qual atua no reconhecimento e diferenciação sexual, sugerindo sua alta
taxa de evolução favorecida possivelmente pela intensa seleção sexual. A metodologia de RACE-PCR utilizada
consiste da construção de primers específicos baseados em pequenos fragmentos do gene já identificados, tendo
sido escolhida a região conhecida como “C1” anteriormente seqüenciada em nosso laboratório. Adicionalmente
construímos outros primers utilizando alinhamentos do gene fruitless para outras espécies proximamente relacionadas. A obtenção dos mRNAs ocorreu através da extração do RNA total com Trizol (Invitrogen) seguido da
utilização do Kit PolyATtract (Promega) para isolamento do mensageiro. Esse material foi então purificado e concentrado para a posterior utilização do Kit Marathon (Clontech) que nos permitiu a produção de cDNAs especiais
contendo “plugs” necessários para as reações de amplificação das regiões flaqueadoras de interesse. Após vários
testes as amplificações foram otimizadas e padronizadas visando obter os produtos esperados, os quais foram
submetidos aos procedimentos de clonagem usando o Kit de clonagem InsTAclone (Fermentas) e transformação
de bactérias competentes (cepa DH5α). Os resultados provenientes do seqüenciamento dessas regiões tem sido
satisfatórios e revelam até o momento um considerável grau de variação entre A. obliqua e os demais grupos próximos, já previstos de acordo com estudos antecedentes comparando partes menores desse gene. Pudemos identificar com sucesso a estrutura desse gene em sua porção codificante o que nos permitirá posteriormente mensurar
o nível de variação interespecífica para este gene, confirmando a potencial importância desse gene em processos
de diferenciação e especiação do grupo. A continuidade dessa pesquisa é particularmente importante para uma
maior disponibilidade de marcadores genéticos e identificação de SNPs, essenciais em estudos de genômica evolutiva e populacional.
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Horizontal transfer of transposable elements between
Zaprionus genus and melanogaster subgroup of
Drosophila genus (Drosophilidae)
Setta, N de1; Sluys, MAV2; Capy, P3; Carareto, CMA1
Department of Biology, IBILCE-UNESP, São José do Rio Preto, SP; 2GateLab, Department of Botany, USP, São Paulo, SP; 3Laboratoire
Évolution, Génomes et Spéciaton, CNRS – Gif-sur-Yvette, France. Mail to:[email protected]
1
Keywords: retrotransposon, horizontal transfer, evolutionary relationship, Zaprionus, Drosophila
The Zaprionus genus has been elected a good biological model for comparative analyses with the melanogaster
subgroup of Drosophila, due to their sharing of evolutionary and ethological features. Nevertheless, little genetic
information is available for this genus. For instance, while 96 transposable element families have been characterized
in D. melanogaster, only five have been already studied in Zaprionus genus. However, as repeatedly suggested for
the melanogaster subgroup, horizontal transfer seems to be a frequent way of transposable elements dispersion
in this genus, since among the five elements studied, three have been involved in that phenomenon. To study
transmission and evolution of transposable element in the Zaprionus genus, the distribution, transcriptional
activity and phylogenetic relationships of three retrotransposons (copy, gypsy and micropia) were surveyed in
seven species of this genus. To do so, PCR, RT-PCR and sequencing methods were employed, and the Zaprionus
sequences obtained were compared with the drosophilid sequences available in genomic databases. The copia
retrotransposon is present and transcriptionally active in seven species of the Zaprionus genus and represents a new
subfamily related to that occurring in the melanogaster subgroup, named as GBFDouble-gap subfamily. Gypsy and
micropia retrotransposons were identified only in species of the Zaprionus subgenus, which are transcriptionally
active and closely related to those of the melanogaster subgroup subfamilies. The evolutionary analysis showed
that the three retrotransposons could have been involved at least in 17 horizontal transfer events with species of
the melanogaster subgroup and at least one unknown donor regarding to the micropia retrotransposon. Moreover,
the time of divergence seems to indicate that these retrotransposons experienced waves of horizontal transfers,
the oldest involving the copia element followed by the gypsy and micropia retrotransposons. These results suggest
that the horizontal transfer phenomenon has happened repeatedly during the Zaprionus genus and melanogaster
subgroup evolution in the Afrotropical region.
Financial support: CNPq, CAPES-COFECUB and FAPESP
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Um fragmento do gene period revela dois haplótipos
compartilhados entre populações sul-americanas de
Zaprionus indianus (GUPTA) (Diptera: Drosophilidae).
Mendonça, MP1; Müller, MJ1,2; Valente, VLS2; Valiati, VH1.
Laboratório de Biologia Molecular, Universidade do Vale do Rio dos Sinos - UNISINOS, São Leopoldo, RS, Brasil.
Laboratório de Drosophila, Departamento de Genética, Instituto de Biociências Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS,
Porto Alegre, RS, Brasil.
1
2
Palavras-chave: period, repetição Thr-Gly, haplótipos, Zaprionus indianus.
Zaprionus indianus (Gupta) é um drosofilídeo afrotropical que rapidamente estabeleceu-se como um dos mais
abundantes membros das comunidades de Drosophilidae em diferentes regiões brasileira e de países vizinhos.
É uma espécie generalista com uma grande versatilidade em termos de sítio de alimentação e ovoposição e
considerável potencial de colonização, principalmente em diversos tipos de ambientes naturais e alterados. O
gene nuclear period (per) codifica a proteína PERIOD, um cofator de transcrição envolvida em interações proteínaproteína com TIMELESS, que levam à auto-regulação negativa da transcrição dos genes period e timeless no relógio
biológico. Também per determina, em Drosophila, os ritmos circadiano (24h), infradiano (>24h) e ultradiano (<24h),
além de afetar o som produzido pelos machos durante a corte sexual. A região deste gene que codifica uma repetição
do dipeptídio treonina-glicina (Thr-Gly) tem chamado atenção para sua alta variabilidade em termos do número
de repetições encontradas em diferentes espécies do gênero Drosophila, bem como em outros insetos. O objetivo
deste trabalho foi caracterizar geneticamente populações naturais de Z. indianus ao longo de sua atual distribuição
geográfica utilizando-se de um fragmento de 327 pb, homólogo a região de repetição Thr-Gly do gene period de
Drosophila melanogaster, amplificados com primers específicos. Até o momento foram caracterizados 32 indivíduos
de cinco populações (Recife-PE e São João do Cariri-PB, região Nordeste do Brasil; Valinhos – SP, região Sudeste;
Posadas – Argentina e Quarai-RS, região Sul da América) e somente dois haplótipos (1_ACTC e 2_GACT), com
substituições de bases nas posições 87, 195, 270 e 285, sendo todas mutações silenciosas. Com exceção de Valinhos,
que apresenta somente o haplótipo 1, as demais populações compartilham os dois haplótipos. Os valores de FST e
o teste exato de distribuição aleatória dos indivíduos entre as populações demonstraram que as freqüências dos
haplótipos não estão igualmente distribuídas e que há estruturação populacional. A análise de variância molecular
(AMOVA) mostrou que 49,5% da variabilidade genética estariam entre as populações pertencentes às regiões (FfSC
= 0,52876; P= 0,0000) e 44,1% dentro das populações de cada uma das regiões (FfST = 0,55858; P= 0,22678). Apesar de
apresentarem diferenças nas freqüências dos haplótipos e estas serem responsáveis pela estruturação por regiões,
o compartilhamento dos mesmos haplótipos entre as populações além de apontá-los como fundadores pode ser
um indicativo que a rápida expansão geográfica da espécie foi de indivíduos muito similares geneticamente. No
momento, estão sendo avaliadas novas populações de diferentes regiões do Brasil, Argentina e Uruguai.
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Microssatélites de Drosophila mediopunctata como
recursos genéticos para estudos em outras espécies
e ferramenta para avaliação da variabilidade genética
populacional
Laborda, PR1; Mori, GM1; Klaczko, LB2; Souza, AP1
Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética, UNICAMP
Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes, Instituto de Biologia, UNICAMP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Drosophila, marcadores moleculares, microssatélites, amplificação heteróloga, populações
Um dos grandes benefícios do aprimoramento das técnicas da genética molecular é a possibilidade de conhecermos
e estudarmos a biodiversidade. Sob essa ótica, os marcadores microssatélites mostram-se especialmente
úteis: revelam com facilidade a variabilidade genética de populações naturais, permitem inferências sobre os
processos biológicos que nelas acontecem e, muitas vezes, podem ser usados de forma heteróloga como recursos
genéticos em espécies aparentadas. Nossa espécie de interesse é Drosophila mediopunctata, que vem sendo usada
como modelo de estudo de diversos fenômenos evolutivos, porém sem dispor de uma estratégia molecular de
amostragem genômica. Neste contexto, os objetivos deste trabalho incluíram o desenvolvimento de marcadores
microssatélites para D. mediopunctata, a avaliação do seu uso heterólogo em outras espécies do gênero e o estudo
da variabilidade genética em duas populações naturais. Inicialmente, foi construída uma biblioteca genômica
enriquecida para microssatélites, que revelou 600 diferentes possíveis marcadores. Entre os dinucleotídeos, 73%
são compostos por combinações AC/GT, e em média possuem 8,7 repetições, o que corrobora dados da literatura
para composição e tamanho de microssatélites em Drosophila. Cento e setenta e sete locos foram isolados, dos
quais 134 foram avaliados com sucesso em treze estirpes de laboratório. Esses marcadores apresentaram média
de 4,6 alelos por loco e poder discriminatório médio de 0,72. Após a caracterização dos 134 locos, os mesmos
foram usados para amplificações heterólogas em outras trinta espécies dos subgêneros Drosophila e Sophophora.
Observou-se uma taxa da transferência de 48%, com dezenove locos amplificados em todas as trinta espécies. D.
unipunctata e D. roehrae apresentaram os melhores resultados (n=92 e n=80, respectivamente). A proximidade
filogenética com D. mediopunctata não implicou maior número de microssatélites amplificados com sucesso. No
estudo de variabilidade genética populacional, foram usados 48 indivíduos de D. mediopunctata, provenientes de
duas localidades, e 25 microssatélites. Os marcadores revelaram número médio de alelos de 8,5 e HO e HE médios
de 0,5 e 0,7, respectivamente. Foi observada ausência de estruturação genética tanto por meio da análise de FST
quanto pela abordagem bayesiana de pool gênicos. O desenvolvimento de microssatélites para D. mediopunctata
está possibilitando um novo cenário para o estudo desta espécie - por meio do avanço no entendimento de sua
diversidade genética - e de outras espécies de Drosophila, que agora também dispõem de ferramentas moleculares
que facilitarão a busca por respostas a diversas perguntas biológicas.
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Ocorrência e Frequência de Z. indianus (Gupta, 1970)
em Citrus sinensis no estado de Goiás, Brasil
Pires, DJ1; Rocha, LHO1; Ribeiro, AI1; Ávila, LR1
1
Departamento de Biologia, Universidade Estadual de Goiás – Unidade Universitária de Morrinhos
Palavras-chave: ambiente, drosofilídeos, espécie introduzida, plantação e umidade.
A espécie Zaprionus indianus é um drosofilídeo pertencente à família Drosophilidae. Ela é introduzida no Brasil
e vem sendo registrada sua presença em várias espécies frutíferas nas diferentes regiões do país. O conhecimento
da ocorrência desta espécie é importante tanto para estudos ecológicos e genéticos, fornecendo dados para o
entendimento das estratégias utilizadas na sua colonização. Portanto, este trabalho teve por objetivos verificar a
ocorrência e frequência de Z. indianus na espécie frutífera Citrus sinensis no Estado de Goiás. As coletas na plantação
de laranja foram realizadas de agosto de 2007 a junho de 2008. As iscas foram confeccionadas com os frutos
maduros da própria espécie frutífera, ficando um dia no local de coleta. Treze espécies de drosofilídeos (Zaprionus
indianus, Drosophila cardinoides, Drosophila immigrans, Drosophila mediostriata, Drosophila melanogaster,
Drosophila nebulosa, Drosophila paranaensis, Drosophila polymorpha, Drosophila simulans, Drosophila willistoni e
Scaptodrosophila latifasciaeformis) e mais duas não identificadas foram capturadas. Um total de 679 indivíduos
de Z. indianus foram coletados e identificados. Com exceção do mês de março/2008, em todos os meses foram
coletados exemplares desta espécie. Isto ocorreu porque estava chovendo no momento da coleta. A frequência
total de machos e fêmeas durante o período de coletas foi de 72,61% e 27,39%. No mês de janeiro/2008, 273 (40,21%)
moscas foram capturadas e nos meses de setembro, outubro/2007 e abril/2008 somente dois indivíduos foram
encontrados. Nestes três meses, a umidade foi a mais baixa (36%). Em relação, as outras espécies que estavam
competindo pelo mesmo substrato, nos meses de menor freqüência de Z. indianus, somente D. simulans teve uma
freqüência maior, mostrando ser uma espécie competitiva, quando as condições ambientais são variáveis.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
Centro de Convenções do Hotel Monte Real Resort • Águas de Lindóia • SP • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 978-85-89109-06-2
255
Filogenia molecular da família Drosophilidae
Mello, B1; Russo, CAM1.
Laboratório de Biodiversidade Molecular – Depto de Genética, Instituto de Biologia – UFRJ.
[email protected]
1
Palavras-chave: Drosophilidae, Drosophila, filogenia, métodos de distância, Adh.
A família Drosophilidae é dividida em duas subfamílias: Steganinae e Drosophilinae. Enquanto a primeira é pequena
e menos estudada, a segunda é bem conhecida e amplamente utilizada em pesquisas biológicas. Tendo em vista a
importância da família Drosophilidae como modelo em pesquisas, o objetivo do trabalho é fazer uma reconstrução
filogenética do grupo. Para isso, foram analisadas as relações filogenéticas de quarenta e nove espécies da família
Drosophilidae utilizando a região codificante da sequência gênica do Adh (álcool-desidrogenase) e suas duplicações,
com base no método de reconstrução filogenética “Neighbor Joining” (NJ) e no modelo de substituição nucleotídica
Kimura dois parâmetros (K2P). Como grupo externo foram usadas as espécies Bactrocera cucurbitae, Ceratitis
cosyra e Sarcophaga peregrina. Nossos resultados sugerem que a duplicação do Adhr ocorreu antes da evolução
dos drosofilídeos. As principais relações filogenéticas observadas foram as seguintes: os gêneros Scaptodrosophila,
Chymomyza e o subgênero Sophophora divergiram primeiro na subfamília Drosophilinae. O subgênero Sophophora
foi monofilético, com alto suporte. A radiação virilis-repleta, pertencente ao subgênero Drososphila, foi grupo irmão
de drosofilídeos do Havaí, formando um grupo monofilético, porém com baixo suporte. Drosophila do Havaí e
Scaptomyza compreenderam os drosofilídeos do Havaí, que foi monofilético com alto bootstrap. Lordiphosa
não apareceu como um gênero monofilético, visto que os grupos tenuicauda e denticeps/fenestrarum/miki não
foram proximamente relacionados. Zaprionus foi posicionado dentro do gênero Drosophila, que foi observado
como sendo parafilético. O subgênero Drosophila também foi parafilético. Hirtodrosophila apareceu relacionado à
Mycodrosophila, que foi monofilético com alto suporte. A radiação immigrans-tripunctata foi monofilética. Algumas
relações não foram resolvidas devido aos baixos valores de bootstrap nos ramos internos. Isso possivelmente se
deve ao fato dessa família possuir muitas radiações com rápidos eventos de especiação. Análises que incluam
mais genes e outros métodos de reconstrução filogenética podem corroborar para uma melhor resolução desses
nós internos, além de um aumento na disponibilidade de sequências do gene Adh para outros gêneros que não
Drosophila.
Apoio financeiro: Cnpq.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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256
Filogenia Molecular do Gênero Drosophila
Pinto, ESPL
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Palavras-chave: filogenia molecular, Drosophila, Drosophilidae, ADH, Neighbor Joining
Apesar de sua importância, a taxonomia do gênero Drosophila ( família Drosophilidae), é foco de grandes
controvérsias. O esclarecimento das relações filogenéticas desse grupo contribuirá para desenvolvimento de
uma taxonomia mais confiável e no entendimento de diversos mecanismos biológicos. Assim, neste trabalho, as
relações filogenéticas de 150 espécies da família Drosophilidae foram estudadas, utilizando como marcador o gene
Adh, que codifica a enzima álcool-desidrogenase. Este gene é bem caracterizado em Drosophila, portanto pode
prover um ótimo marcador para as relações filogenéticas entre as espécies do gênero. Duplicações desse gene AdhR, Adh1 e Adh2 - também foram incluídas no estudo. O método de distância Neighbor Joining foi utilizado para
a reconstrução filogenética. As espécies escolhidas foram determinadas pela disponibilidade das sequências do
gene Adh na literatura e nos bancos de dados. O gênero Drosophila foi representado por três subgêneros: Drosophila,
Sophophora e Dorsilopha. Três outros gêneros - Hirtodrosophila, Scaptomyza e Zaprionus – também foram incluídas
na análise, visto que estes possuem alta afinidade filogenética com Drosophila. O gênero Scaptodrosophila foi eleito
grupo externo. Ao observar a árvore resultante, a primeira divisão na árvore separou as sequências relativas ao
gene AdhR (‘Adh-related’), fruto de uma duplicação antiga do gene Adh. Dentro do gênero Drosophila, a primeira
grande divisão ocorre entre o subgênero Sophophora e o grupo que inclui os subgêneros Drosophila e Dorsilopha e
os gêneros Zaprionus, Hirtodrosophila e Scaptomyza. Outra grande divisão separa o grupo formado pela linhagem
immigrans do subgênero Drosophila, pelo subgênero Dorsilopha e pelos gêneros Hirtodrosophila e Zaprionus do
grupo formado pelas linhagens virilis e repleta do subgênero Drosophila e pelo clado monofilético dos drosofilídeos
do Havaí (drosófilas do Havaí e Scaptomyza). O subgênero Sophophora e o grupo das drosófilas do Havaí são
monofiléticos. É suportada a radiação immigrans-tripunctata basal em relação à virilis-repleta. Por outro lado, o
gênero Drosophila e o subgênero Drosophila não são monofiléticos.
Apoio Financeiro: CNPQ
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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257
Comparação entre dois métodos para descrever a
morfologia das asas de Drosophila
Corrêa, DM; Bitner-Mathé, BC
Laboratório de Genética de Populações de Drosophila – Departamento de Genética - UFRJ.
[email protected], [email protected]
Palavras-chave: elipse, morfometria, procrustes, seleção, variação fenotípica
As asas de Drosophila são um modelo importante para estudos de Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento.
Descrever com precisão suas variações morfológicas é essencial para a compreensão dos fatores genéticos e
ambientais que determinam nessas estruturas. O método da elipse (ME) disponibiliza uma caracterização de
forma da asa de Drosophila pelo ajuste de uma elipse ao seu contorno e pela determinação do posicionamento
de suas veias. Outra abordagem geométrica para descrição de forma é o método Procrustes (MP) que superpõe
os centróides da conformação de pontos de referencia e promove a rotação de cada espécime, orientando todos
no mesmo sentido. Ambos os métodos buscam descrever variações de forma independentes do tamanho. Neste
trabalho, apresentamos populações de D. melanogaster selecionadas por 64 gerações para formas de asas divergentes
(alongadas ou arredondadas) e que foram submetidas a duas temperaturas finais diferentes após o processo
seletivo. As linhagens são descritas pelos dois métodos mencionados e as facilidades e limitações de cada um são
avaliados. Ambos os métodos apontam para uma grande separação entre a morfologia das linhagens alongadas e
arredondadas e uma diferença em tamanho devido à temperatura. O ME permite uma análise univariada e intuitiva
da forma, facilitando a utilização desta variável em diversos modelos estatísticos. Através desse método, identificase que as variações de forma não são livres de influências de tamanho, fato que pode ser parcialmente corrigido
pela utilização de uma medida de forma não-alométrica. No entanto, as oscilações angulares que determinam a
posição das veias pelo ME podem mascarar dois tipos de movimentos que são facilmente separados em trajetórias
verticais ou horizontais pelo MP. Este último permite ainda uma visualização de regiões específicas da asa que
respondem mais ou menos aos efeitos da seleção. Ao diluir toda a variação pela elipse ajustada, o ME não permite
a visualização dessas regiões enquanto o MP identifica eixos e regiões que responderam mais acentuadamente à
seleção. Os dois métodos permitem descrições valiosas e complementares da forma, capturando informações que
seriam pouco precisas ou impossíveis de se obter com apenas um deles.
Apoio: CNPq, FAPERJ e CAPES.
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258
Levantamento taxonômico da fauna de Drosophila
(Diptera, Drosophilidae) em ambientes de Mata
Atlântica e caatinga do estado de Pernambuco
Silva, DMIO1; Oliveira, RDL2; Garcia, ACL2; Rohde, C1,2
Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular Aplicada, Universidade de Pernambuco
Laboratório de Genética, Centro Acadêmico de Vitória, Universidade Federal de Pernambuco
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Drosofilídeos, levantamento taxonômico, mata atlântica, caatinga e polimorfismo cromossômico
O gênero Drosophila (Diptera, Drosophilidae) compreende mais de 1.700 espécies de moscas pequenas, das quais
130 ocorrem no Brasil. Apesar de haver vários registros de drosofilídeos no território brasileiro, o Nordeste figura
como uma das regiões mais carentes no conhecimento taxonômico destes insetos. O objetivo deste trabalho é
investigar e comparar a diversidade de drosofilídeos em ambientes de Caatinga e Mata Atlântica do estado de
Pernambuco. Para tal, drosofilídeos adultos foram capturados com armadilhas confeccionadas com garrafas
pet, contendo banana como isca. As coletas foram repetidas em dois períodos distintos: junho a agosto/2008
e janeiro a março/2008. Até o momento, foram coletados 11.329 drosofilídeos, sendo a espécie mais freqüente
a Scaptodrosophila latifasciaeformis, que esteve presente em todas as coletas. Outras espécies coletadas foram
Zaprionus indianus, Drosophila ananassae, D. simulans, D. melanogaster, D. kikkawai e D. nebulosa. Estas foram
identificadas através da utilização de Chaves de Grupo. Representantes do subgrupo willistoni também foram
encontrados e identificados através da análise do polimorfismo cromossômico, feita a partir dos preparados dos
cromossomos politênicos presentes nas células da glândula salivar de larvas em terceiro estágio. O reconhecimento
do padrão dos cromossomos politênicos das diferentes isolinhagens foi feito com auxílio do fotomapa da espécie,
elaborado por Rohde e Valente. Espécies crípticas dos grupos repleta (D. serido em ambientes de caatinga e D.
buzzatti em ambientes de mata atlântica, conforme literatura), do grupo saltans (D. sturtevanti) e do grupo cardini (D.
polymorpha) foram identificados quanto à morfologia da genitália masculina, mais precisamente pela morfologia
do edeago. Em concordância com outros estudos, observou-se maior freqüência da espécie invasora Z. indianus
nos períodos mais quentes e em ambientes abertos, sendo a oscilação dessa espécie inversa à observada para D.
malerkotliana, D. ananassae e D. willistoni. As isolinhagens do subgrupo willistoni, do grupo cardini, a espécie Z.
indianus e a D. nebulosa estão sendo mantidas em laboratório e estudos citogenéticos estão em andamento. Este
projeto faz parte de um projeto maior que pretende estudar a ecologia e a genética da fauna de drosofilídeos da
região Nordeste.
Apoio Financeiro: FACEPE, PROPESQ-UFPE e CNPq.
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259
Análise da diversidade genética de uma população
natural da espécie cactofílica Drosophila antonietae
(Diptera; Drosophilidae) através de DNA microssatélite
Gustani, EC; Simão, DP; Machado, LPB; Mateus, RP
Laboratório de Genética e Evolução, Departamento de Ciências Biológicas, UNICENTRO, Guarapuava-PR.
[email protected]
Palavras-chave: DNA microssatélite, Drosophila antonietae, diversidade genética, polimorfismo ancestral, heterosigosidade.
Endêmica da América do Sul e associada principalmente ao cacto Cereus hildmaniannus, a espécie Drosophila
antonietae é pertencente ao cluster buzzatii do grupo repleta. A história evolutiva desta espécie vem sendo
analisada com uso de marcadores independentes em populações naturais e os dados indicam ocorrência de fluxo
gênico entre as populações amostradas, sem descartar a existência de polimorfismo ancestral. Considerando a alta
variabilidade que o DNA microssatélite apresenta, e por ser este marcador molecular amplamente utilizado em
estudos de populações naturais, este trabalho teve como objetivo analisar a diversidade genética de uma população
natural da espécie Drosophila antonietae na região do Rio do Poço, Guarapuava-PR (25o28’67’’S; 51o87’62’’W),
pertencente à Bacia do Rio Iguaçu. Os indivíduos foram coletados utilizando armadilhas abertas (latas) e iscas
contendo banana, laranja e fermento biológico fresco. Os machos da espécie D. antonietae foram identificados
através do edeago e as fêmeas foram colocadas para a formação de isolinhagens e posterior identificação. A
cabeça dos indivíduos coletados foi utilizada para extração do DNA, sendo o restante do corpo congelado a -20º
C para outros experimentos (isoenzimas). Sete locos de microssatélites previamente descritos para esta espécie
foram analisados e os dados foram processados utilizando o programa TFPGA. Todos os locos apresentaramse polimórficos. As heterozigosidades médias observada e esperada foram de 0,67 e 0,61, respectivamente. Estes
valores foram maiores do que os observados previamente em outras populações de Drosophila antonietae, e
também maiores do que para outras espécies cactofílicas e não-cactofílicas. A caracterização genética de Drosophila
antonietae em uma nova região de ocorrência pode ajudar a contribuir para o entendimento da história evolutiva
e processo de diferenciação entre as suas populações, que estão geograficamente isoladas, mas que apresentam
certo grau de homogeneidade.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, Fundação Araucária e UNICENTRO
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260
Análise isoenzimática de uma população natural de
Drosophila antonietae (Diptera; Drosophilidae) da bacia
do rio Iguaçu
Simão, DP; Heinz, NP; Gustani, EC; Rodrigues, PT; Mateus, RP; Machado, LPB
Laboratório de Genética e Evolução, Departamento de Ciências Biológicas, UNICENTRO, Guarapuava-PR.
[email protected]
Palavras-chave: isoenzimas, Drosophila antonietae, diversidade genética.
Drosophila antonietae é uma espécie cactofílica e endêmica da América do Sul, pertencente ao cluster buzzatii
do grupo repleta. Suas populações estão associadas a regiões xerofíticas com a presença do cacto Cereus
hildmaniannus. Estudos com marcadores independentes realizados em populações naturais desta espécie
evidenciaram homogeneidade genética e sugeriram a existência de fluxo gênico entre elas. Em vista disso, o
objetivo deste trabalho foi analisar o padrão isoenzimático de uma população natural de Drosophila antonietae
de ocorrência intermediária às áreas previamente estudadas a fim de obter um levantamento da variabilidade
genética nesta região. Coletas com armadilhas abertas (latas), contendo iscas compostas de banana, laranja e
fermento biológico fresco, foram realizadas em Cantagalo-PR (25°28’67”S; 51°87’62”W), na bacia do rio Cavernoso,
pertencente à bacia do rio Iguaçu. Os machos da espécie D. antonietae foram identificados através do edeago e
as fêmeas foram colocadas para a formação de isolinhagens e posterior identificação. A cabeça dos indivíduos
de D. antonietae coletados foi armazenada em álcool 70% à -20º C para utilização em posteriores experimentos
moleculares. O restante do corpo foi congelado individualmente a seco em tubos a -20º C e foram utilizados nas
análises isoenzimáticas. Foram avaliados três sistemas isoenzimáticos, IDH, MDH e 1-GPDH, em géis de amido
(Penetrose 30™) a 14%. A análise dos dados foi realizada através do programa TFPGA. Três locos isoenzimáticos
foram evidenciados, apresentando no máximo 2 alelos. Apenas 66% dos locos foram polimórficos. O locus Mdh foi
monomórfico. O loco Gpdh foi o único que apresentou heterozigotos. As heterozigosidades médias observada e
esperada foram de 0,037 e 0,122, respectivamente. A heterozigosidade média observada foi menor do que as obtidas
previamente para espécies de Drosophila cactofílicas (0,087) e não cactófilas (0,160). O levantamento de dados
sobre a diversidade genética de populações de uma região intermediária às populações previamente analisadas de
D. antonietae pode ajudar a evidenciar quais eventos evolutivos mantêm a homogenidade genética entre as suas
populações naturais, cuja dinâmica populacional ainda não esta completamente elucidada.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, Fundação Araucária e UNICENTRO.
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261
Interação de dados genéticos, morfológicos e
ecológicos no estudo de uma área de simpatria entre
duas espécies cactofílicas de Drosophila
Kokudai, CBS1; Sene, FM2; Manfrin, MH1
Programa de Pós-Graduação em Biologia Comparada, Departamento de Biologia, FFCLRP, USP.
Departamento de Genética, FMRP, USP.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Drosophila cactofílica, zona de contato secundário, introgressão, divergência morfológica, isolamento reprodutivo.
Análises populacionais prévias descreveram a localidade de Florianópolis-SC como área de contato secundário, com
populações das espécies cactofílicas Drosophila serido e Drosophila antonietae (grupo repleta, “cluster” D. buzzatii)
em simpatria. Com a finalidade de definir a localização e a dinâmica desta área, foram analisados indivíduos,
simultaneamente, através de análises morfométricas de asa e edeago, análises eletroforéticas da isoenzima
isocitrato desidrogenase (IDH) e análise haplotípica de DNA mitocondrial, que corroboraram as informações
sobre Florianópolis, SC como localidade de simpatria entre as duas espécies. As análises morfométricas das asas
e dos edeagos mostraram diferenciação interespecífica significativa, além de baixa diferenciação morfológica
interpopulacional em D. antonietae e politipia com relação às populações de D. serido, corroborando análises
prévias que sugerem fluxo gênico interpopulacional na primeira e isolamento geográfico na segunda, como
fatores responsáveis pelo padrão observado. De acordo com a IDH, foram identificados os alelos característicos,
em homozigoze, de D. serido (94%) e de D. antonietae (6%) e não foi observada a presença de híbridos para este
marcador. Através da análise haplotípica do DNA mitocondrial, foram geradas duas redes distintas de haplótipos
não enraizadas e algumas incongruências foram encontradas com relação aos demais marcadores, sugerindo
introgressão assimétrica de DNA mitocondrial ou manutenção de polimorfismo ancestral. Uma possível utilização
diferencial de cactos hospedeiros foi verificada através de registro e identificação de indivíduos que emergiram a
partir de cladódios em decomposição coletados em Florianópolis: espécimes de D. antonietae emergiram somente
do cacto C. hildmaniannus, em freqüência baixa, e a emergência de D. serido, em frequência alta, foi observada a
partir dos cactos Opuntia monacantha e Cereus hildmaniannus. As análises morfométricas mostraram que D. serido
apresenta consistente plasticidade fenotípica com relação ao tamanho, mas sem variação significativa na forma das
asas e dos edeagos, relacionada ao tipo de cacto hospedeiro utilizado. Nesta amostra, a maior frequência observada
de D. serido, diferentemente de dados anteriores, sugere influência da sazonalidade na dinâmica desta área de
contato, que pode estar relacionada à preferência e disponibilidade de cactos hospedeiros. A aparente utilização
diferencial de cacto hospedeiro pode ser compreendida com mais detalhes através de estudos adicionais, que
serão úteis na compreensão da base genética e ecológica da adaptação e da divergência morfológica. Os resultados
obtidos até o momento sugerem a existência de simpatria entre as populações de D. serido e D. antonietae, na
localidade de Florianópolis, SC, além de possíveis eventos ancestrais de introgressão de genes mitocondriais nesta
localidade, direcionando novas perguntas para um melhor entendimento da dinâmica complexa da presente área
de contato.
Apoio financeiro: Programa de Pós-Graduação em Biologia Comparada, FFCLRP-USP; FAPESP; CAPES; CNPq;
FINEP.
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262
Eventos de expansão populacional em espécies
cactofílicas do “cluster” Drosophila buzzatii e as
flutuações climáticas do Pleistocêno na América do
Sul.
Franco, FF1; Sene, FM1; Manfrin, MH2
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP; 2. Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto, USP.
[email protected]
1.
Palavras-chave: filogeografia, COI, Drosophila, arco Pleistocênico.
As Florestas Tropicais Sazonalmente Secas (FTSS) correspondem a uma unidade fitogeográfica coesiva, sendo
compostas por núcleos de vegetação seca e com distribuição fragmentada na América do Sul. No Brasil ocorrem
dois grandes núcleos de FTSS: o Domínio da Caatinga, no nordeste do Brasil, e o núcleo Missiones, na região
da bacia do Paraná-Paraguai. Diversos trabalhos sugerem que as áreas de FTSS tiveram uma distribuição mais
contígua durante os períodos glaciais do Pleistocêno, em que o clima na América do Sul supostamente tornou-se
mais frio e seco, favorecendo a expansão geográfica da vegetação xerófita. O “cluster” Drosophila buzzatii (grupo
D. repleta) é um grupo monofilético composto por sete espécies naturalmente endêmicas da América do Sul, e
cactofílicas, apresentando estreita relação com áreas de FTSS, do Domínio do Chaco e com redutos de cactáceas
em regiões de Cerrado e Mata Atlântica. No presente trabalho, a história filogeográfica e demográfica de quatro
espécies do “cluster” D. buzzatii: D. serido, D. gouveai, D. seriema e D. borborema, foi estabelecida através de análises
com 557pb do gene mitocondrial COI, provenientes de 362 indivíduos, distribuídos em 39 populações. Evidências de
expansão populacional durante a época do Pleistoceno foram identificadas para todas as quatro espécies, a partir
de diferentes abordagens estatísticas: Nested Clade Phylogeographical Analysis, testes de neutralidade, Mismatch
distribution e Bayesian Skyline Plot. As direções de expansão populacional observadas para as espécies corroboram
rotas migratórias históricas das FTSS. A espécie D. seriema apresentou um início de crescimento populacional
pronunciado há partir de 300 mil anos, pouco antes do início do período glacial Llinoian, enquanto D. borborema
apresentou um crescimento populacional acelerado há partir de 70 mil anos atrás, durante o Wisconsin. Entre 50
e 40 mil anos a.p., em que as FTSS atingiram seu máximo de extensão, foram detectados aumentos pronunciados
no tamanho populacional das espécies D. serido e D. gouveai. Apenas a espécie D. seriema apresentou uma
redução no tamanho efetivo populacional após o ultimo máximo glacial (18 - 12 mil anos a.p.). Tal resultado pode
estar relacionado a fatores ecológicos, pois enquanto D. borborema, D. serido e D. gouveai ocorrem em áreas de
Caatinga, a espécie D. seriema é restrita a ambientes de campo rupestre, cuja a área de ocorrência foi supostamente
aumentada durante os períodos glaciais e contraída durante os períodos interglaciais. CONCLUSÃO: Todas as
espécies do clado AB apresentaram indicativos de flutuações demográficas, podendo estar associadas à alteração
na distribuição das FTSS no Brasil e corroborando a hipótese do arco Pleistocênico.
Apoio Financeiro: FAPESP, FAEPA, CAPES, CNPq, FINEP, USP.
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Variabilidade isoenzimática em populações naturais de
Drosophila mediopunctata (Diptera, Drosophilidae)
Cavasini, R; Rodrigues, PT; Machado, LPB; Mateus, RP
Laboratório de Genética e Evolução, Departamento de Ciências Biológicas, UNICENTRO, Guarapuava-PR.
[email protected]
Palavras-chave: Variabilidade isoenzimática, populações naturais, Drosophila mediopunctata, Floresta Ombrófila Mista, conservação
biológica
Drosophila mediopunctata pertence ao grupo tripunctata do gênero Drosophila, é uma espécie restrita a florestas,
não está associada com habitats humanos, tem uma ampla distribuição geográfica (Brasil e El Salvador) e uma alta
abundância no Sul de sua distribuição ou em altas altitudes durante o inverno. No presente trabalho, espécimes
de D. mediopunctata, coletados em dois fragmentos de Floresta Ombrófila Mista – Mata de Araucária (Araucaria
angustifolia) no município de Guarapuava – Paraná, foram avaliados para oito sistemas isoenzimáticos (EST,
GPDH, HK, IDH, LAP, MDH, ME e PGM) em géis de amido a 14% (Penetrose 30™), com o objetivo de determinar
o nível de variabilidade genética desta espécie restrita a florestas nos dois fragmentos. Um destes fragmentos é
uma unidade de conservação denominada Parque Municipal das Araucárias, com 104 ha compostos por Mata de
Araucária, floresta de galeria, campo, várzea e áreas alteradas. O outro é uma propriedade particular denominada
Fazenda Brandalise, com 400 ha compostos por Floresta de Araucária e áreas alteradas. Os resultados das análises
eletroforéticas identificaram um total de 22 locos e 63 alelos, dos quais, apenas 15 locos e 55 alelos foram analisados
devido ao número representativo de amostras – EST-1, EST-2 e EST-3 com cinco alelos cada; IDH-2, MDH-4, ME e
PGM com quatro alelos cada; e GPDH-2, HK-1, HK-2, HK-3, LAP-1, LAP-2, MDH-1 e MDH-2 com três alelos cada.
Os indivíduos coletados no Parque Municipal das Araucárias apresentaram 54 alelos, destes, três foram exclusivos
para esta área (um alelo de MDH-2, um de MDH-4 e um de ME). Os coletados na Fazenda Brandalise apresentaram
52 alelos, destes, apenas um foi exclusivo desta área (alelo de HK-3). A heterozigosidade média observada no Parque
foi de 0,232 e na Fazenda foi de 0,202. Esses resultados indicam que a variabilidade isoenzimática nas populações
naturais de D. mediopunctata é maior no Parque do que na Fazenda, embora esta possua uma área florestal maior
(aproximadamente quatro vezes o tamanho do Parque). Os resultados observados podem ser explicados de duas
formas: (1) o Parque possui vários tipos diferentes de habitats na sua composição, sendo mais heterogêneo que
a Fazenda, podendo assim apresentar mais microhabitats que podem manter uma maior variabilidade genética
através de uma microestruturação da população; e/ou (2) o Parque é uma Reserva Ecológica desde 1991, portanto
é uma área que é efetivamente preservada e conservada, enquanto que na Fazenda existe uma grande atividade
antrópica extrativista (erva-mate e pinhão), o que poderia afetar a variabilidade genética de D. mediopunctata.
Estes resultados corroboram a necessidade de novas políticas de conservação dos remanescentes florestais, tendo
como objetivo a preservação da biodiversidade e a manutenção da variabilidade genética de populações naturais.
Apoio Financeiro: CNPq, CAPES, Fundação Araucária e UNICENTRO.
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264
Aspectos reprodutivos de três espécies do grupo
bromeliae de Drosophila
Schmitz, HJ; Müller, MJ; Valente, VLS
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Palavras-chave: Drosophila, isolamento reprodutivo, corte sexual, diversidade, Insecta
O grupo bromeliae de Drosophila compreende espécies de ecologia restrita a flores como sítio de ovoposição.
Coletas recentes realizadas em Porto Alegre, RS, revelaram a existência de quatro espécies crípticas deste grupo
ocorrendo na região, D. bromelioides e três espécies ainda não descritas (denominadas provisoriamente de tipo
III, tipo IV e tipo V). Desde então, uma análise comparativa de múltipla abordagem tem sido realizada com estas
espécies, além de D. bromeliae, uma espécie estreitamente relacionada da América Central, incluindo aspectos
morfológicos, ecológicos e genéticos. No presente trabalho, são apresentados os primeiros resultados referentes
ao comportamento reprodutivo de D. bromeliae, D. bromelioides e tipo III. Os ovos das duas primeiras espécies
apresentam dois filamentos reduzidos, enquanto nos ovos de tipo III, os filamentos estão virtualmente ausentes. A
redução dos filamentos é uma característica comum a espécies relacionadas a flores. O tipo III também apresenta
um ovopositor maior e mais forte que as outras duas espécies. D. bromelioides e, provavelmente, D. bromeliae,
são espécies bastante generalistas na utilização de flores como recursos, enquanto a espécie tipo III é um pouco
mais especializada. Testes de cruzamento interespecíficos foram realizados entre estas espécies, utilizando-se
10 machos e 10 fêmeas virgens em cada cruzamento. Não foram obtidas proles em nenhum dos cruzamentos,
considerando os dois sentidos, indicando um isolamento reprodutivo completo. Para se tentar compreender os
processos que levam a este isolamento, cruzamentos intra-específicos foram realizados para caracterizar o som de
corte do macho. Em cada cruzamento, um casal virgem co-específico foi colocado em uma câmara de cruzamento
sobre um aparato de gravação de som. Os oscilogramas foram visualizados com o software Audacity. D. bromeliae
apresentou som de corte constituído por bursts com número variável de pulsos, além de pulsos isolados. D.
bromelioides apresentou um padrão complexo, com seqüências de vários bursts curtos, com, em geral, quatro pulsos
cada, bursts longos, com 10-20 pulsos, zumbidos (sine song) e combinações de zumbidos seguidos por bursts com
9-13 pulsos. Já a espécie tipo III apresentou seqüências de bursts com cerca de 10 a 20 pulsos. Nossos resultados
sugerem, portanto, que as três espécies apresentam padrões diferenciados de padrão de corte. O som de corte do
macho é um caractere importante no reconhecimento espécie-específico de potenciais parceiros reprodutivos e
pode ser um fator essencial para a manutenção do isolamento reprodutivo. Isto pode ser especialmente importante
para espécies estreitamente relacionadas e que apresentam microssimpatria em relação aos sítios de ovoposição,
como é o caso, pelo menos, de D. bromelioides e tipo III.
Apoio Financeiro: CNPQ
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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Cariótipo mitótico, cromossomos politênicos e novas
inversões de populações sulamericanas de Drosophila
immigrans
Santos, JF1, 2*; Vera, GF2; Cunha, GL2; Rieger, TT1 e VLSalente 2
1
Departamento de Genética, CCB, UFPE; 2 Departamento de Genética, ICB, UFRGS; *Pós-doutorando, bolsista PDS do CNPq.
O grupo da Drosophila immigrans inclui mais de 50 espécies, e exceto as do subgrupo nasuta, a maioria tem apenas
o cariótipo mitótico descrito. Dois citotipos com 2n=8 foram encontrados em D. immigrans, sendo o citotipo I
denotado como 3R+1V e o citotipo II como 2R+1V+1J, este último descrito apenas em duas populações. Neste
trabalho foram examinados os cariótipos mitóticos em gânglio cerebral de linhagens de D. immigrans originadas
de quatro populações sulamericanas, uma da Argentina (AR), uma do Uruguai (UY) e duas brasileiras (POA e
IM-J). Todas possuem o citotipo I, composto pelo cromossomo X acrocêntrico médio (par I nas fêmeas), par II
submetacêntrico, par III acrocêntrico grande, par IV acrocêntrico pequeno com forte heteropicnose positiva e
Y submetacêntrico pequeno, satelitado no braço longo. Variações na morfologia dos cromossomos está descrita
na literatura, principalmente para os cromossomos IV e Y, provavelmente devida à presença de heterocromatina.
O complemento politênico confirma o cromossomo X como acrocêntrico, o cromossomo II submetacêntrico,
com o braço IIR menor que o IIL, o cromossomo III um grande acrocêntrico, menor que o II, e o cromossomo
IV como um pequeno acrocêntrico, bem diferenciado do cromocentro. Durante a análise duas novas inversões
foram encontradas no terço distal do braço 2R na linhagem AR. Com base no fotomapa politênico preparado, os
pontos de quebra destas inversões foram determinados e as duas inversões identificadas como Inv(IIR)A1-C3 e
Inv(IIR)C3-D4. Ambas compartilham um ponto de quebra na seção C3 e não correspondem a nenhuma das três
inversões de D. immigrans descritas na literatura para o cromossomo II, pois a inversão A é localizada na região
mediana do IIL, a inversão B na porção subterminal do 2R e a inversão C ocorre na região proximal do IIR. Outras
inversões neste cromossomo foram detectadas na linhagem POA e estão sendo analisadas. Apesar de D. immigrans
ser considerada uma espécie com baixa frequencia de inversões, a identificação de duas novas inversões em um
número relativamente pequeno de indivíduos pode indicar que este parâmetro está subestimado na literatura e
pode aumentar significativamente com a análise de outras populações.
Subvenção: Este trabalho é parte do Pós-doutorado de JFS, bolsista PDS do CNPq. O trabalho no Laboratório de
Drosophila da UFRGS é subvencionado pelo CNPq.
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Análise do padrão esterásico em espécies de
Drosophila do grupo guarani
Rodrigues, PR; Gustani, EC; Santos, K; Mateus, RP; Machado, LPB
Laboratório de Genética e Evolução, Departamento de Ciências Biológicas, UNICENTRO, Guarapuava-PR.
[email protected]
Palavras-chave: Drosophila, esterase, variabilidade genética, isoenzimas, loci
As esterases pertencem a um grupo de isoenzimas que preferencialmente catalisam a hidrólise de ésteres. Em
insetos, estas enzimas podem estar relacionadas com funções diversificadas no organismo, como a regulação dos
níveis de hormônio juvenil, processos digestivos, comportamento reprodutivo e degradação de inseticidas. Essas
enzimas têm sido detectadas em todas as fases do desenvolvimento deste grupo de organismos e em muitos dos
seus tecidos, o que demonstra a importância desta classe de enzimas no seu desenvolvimento normal. Dentre
os insetos, a família Drosophilidae é composta por 65 gêneros e cerca de 3500 espécies descritas. Constitui um
grupo de insetos amplamente estudado há mais de um século sobre aspectos de ecologia, sistemática, genética e
evolução. O grupo guarani do gênero Drosophila, até o presente momento, foi relativamente pouco estudado. Este
grupo é composto de 13 espécies, dentre as quais Drosophila maculifrons é amplamente distribuída pelo Brasil
e D. ornatifrons predomina a Mata Atlântica Paulista e campos abertos da Serra do Cipó (MG). Desta forma, o
objetivo deste trabalho foi analisar o padrão esterásico das espécies Drosophila ornatifrons e D. maculifrons do
Parque Municipal das Araucárias, Guarapuava-PR (25º23’36” S; 51º27’19” W; altitude de 1.200 m). As coletas foram
realizadas com armadilhas do tipo robot e iscas contendo banana, laranja e fermento biológico. Os indivíduos
foram identificados e congelados individualmente a -20º C para posterior análise eletroforética. As amostras foram
aplicadas em gel de poliacrilamida 10% e após eletroforese, o gel foi incubado em tampão fosfato 0,1 M pH 6,2. A
observação das esterases no gel foi realizada utilizando α- e β-naftil acetatos como substratos, e os produtos da
reação foram corados por Fast-Blue RR. Drosophila ornatrifrons apresentou seis locos de esterases, sendo quatro
a-esterases e dois b-esterases (EST-3 e EST-4). Todos os locos encontrados foram monomórficos, com exceção
de EST-1, o qual apresentou 4 alelos. Drosophila maculifrons apresentou 5 locos. EST-1 e EST-2 foram a-esterases
exclusivos uma vez que estes não foram evidenciados quando na presença de apenas β-naftil acetato. EST-3 e EST4 foram preferencialmente β-esterases e EST-5 foi preferencialmente a já que eles foram visualizados na presença
de apenas a-naftil acetato, apenas β-naftil acetato, e na presença de ambos cada qual corou preferencialmente por
um ou outro substrato. As análises do perfil de esterases destas espécies revelaram uma considerável diversidade
de locos, o que está de acordo com os padrões encontrados para outros grupos de insetos. Desta forma, os loci
esterásicos de D. maculifrons e D. ornatifrons são indicados para análise de variabilidade genética nas populações
destas espécies.
Apoio Financeiro: CNPq, Fundação Araucária e UNICENTRO.
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Variabilidade em caracteres de vida na espécie
Drosophila meridionalis (Diptera, Drosophilidae)
relacionada aos cactos hospedeiros
Santos, CG1; Mateus, RP2,3; Sene, FM2; Manfrin, MH1,2
Programa de Pós-Graduação em Biologia Comparada, 2Departamento de Biologia, FFCLRP/USP, Ribeirão Preto-SP.
Laboratório de Genética e Evolução, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Centro-Oeste-UNICENTRO,
Guarapuava-PR.
[email protected]
1
3
Palavras-chave: Drosophila meridionalis, Drosophila cactofílica, viabilidade, tempo de desenvolvimento, planta hospedeira
A associação inseto-planta é um importante sistema modelo para estudar as bases genéticas e ecológicas da
adaptação e divergência populacional, pois as plantas hospedeiras constituem um fator ambiental imediato,
podendo afetar o desenvolvimento dos indivíduos. A maioria das espécies do gênero Drosophila utiliza tecidos
vegetais em decomposição como sítio de desenvolvimento larval. O sistema cacto-levedura-Drosophila constitui um
excelente modelo para investigar o papel evolutivo da utilização de planta hospedeira no processo de diversificação
biológica. Drosophila meridionalis (complexo meridiana, subgrupo mulleri, grupo repleta) é uma espécie cactófila,
tendo sido documentada sua associação com os cactos Opuntia ficus-indica, O. vulgaris, O. monacantha, Cereus
fernambucensis, C. peruvianus e C. hildmaniannus. Nesse estudo foi investigado, através de ANOVA, o efeito de duas
plantas hospedeiras sobre características de história de vida (TD - tempo de desenvolvimento e VL - viabilidade
larval) de linhagens da espécie D. meridionalis provenientes de áreas onde somente um ou dois gêneros de
cactos ocorriam (Opuntia e Cereus). Larvas de 1º instar recém-eclodidas foram transferidas para meio de cultura
seminatural preparado com tecidos fermentados de O. monacantha e C. hildmannianus. Considerando todas as
linhagens, as diferenças na VL não foram significativas no componente ambiente (cacto) e na interação genótipo/
ambiente (linhagem/cacto), mas foram no componente genético (linhagens). Porém, houve diminuição significativa
da VL no cacto Cereus quando uma linhagem de Barra da Lagoa foi excluída da análise. Linhagens provenientes
de populações onde ocorre somente o cacto Cereus, e de populações onde os dois cactos ocorrem em simpatria,
apresentaram viabilidade nos dois cactos. Contudo, linhagens de populações onde somente o cacto Opuntia
ocorre apresentaram viabilidade zero no ambiente Cereus. Diferenças em TD foram significativas em relação ao
componente genético (linhagens), ao componente ambiente (cacto), e também em relação à origem populacional
das linhagens (região com Cereus, Opuntia, ou Cereus e Opuntia), mas não em relação ao sexo. Linhagens de regiões
com o cacto Opuntia e com os dois cactos em simpatria tiveram um tempo de desenvolvimento maior que as
linhagens de regiões com apenas Cereus. No geral, o tempo de desenvolvimento em Opuntia foi maior que em
Cereus. Os dados sugerem a existência de certa variabilidade genética na espécie D. meridionalis para os caracteres
de vida VL e TD quanto ao ajuste nos dois tipos de cactos. Linhagens de populações que na natureza só entraram
em contato com o cacto Opuntia são intolerantes ao cacto Cereus, sugerindo que esse ambiente é altamente
estressante para essas moscas. Por outro lado, linhagens de populações que na natureza entraram em contato
com Cereus se desenvolveram nos dois cactos. Nesse sentido, a distribuição e a composição química das plantas
hospedeiras podem estar envolvidas na diferenciação das populações da espécie D. meridionalis.
Apoio Financeiro: PPG Biologia Comparada, CAPES, CNPq, FINEP, FAPESP e USP
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Estrutura populacional e filogeografia de Drosophila
meridionalis (Diptera, Drosophilidae)
Silva-Bernardi, ECC1; Sene, FM1; Manfrin, MH2
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP
Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto - USP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: grupo D. repleta, subgrupo D. mulleri, DNA mitocondrial, morfometria geométrica.
Drosophila meridionalis (grupo D. repleta, subgrupo D. mulleri) é uma espécie cactofílica, endêmica da América
do Sul, cujas populações, geralmente, encontram-se geograficamente isoladas. Estudos citogenéticos revelaram
a existência de variação cariotípica entre suas populações, sendo descritos cinco cariótipos distintos. Embora
potencialmente adequada, D. meridionalis, até o momento, não foi utilizada como modelo em pesquisas sobre
os processos de diferenciação populacional e especiação. Neste trabalho, foram analisadas a morfologia da asa e
sequências de 640 pares de base do gene mitocondrial COI, objetivando descrever a estrutura populacional de D.
meridionalis e inferir eventos históricos e/ou recorrentes, que expliquem a distribuição geográfica atual da espécie
e, eventualmente, estejam envolvidos na diversificação de suas populações. Foram analisadas 189 asas esquerdas
de indivíduos machos provenientes de 24 populações de D. meridionalis. As asas foram analisadas utilizando a
técnica de morfometria geométrica, com dez marcos anatômicos. A análise discriminante mostrou a existência de
diferenciação morfológica significativa entre as populações analisadas. Para estimar as relações fenéticas entre as
populações foi utilizada uma matriz de distâncias de Mahalanobis, sendo construído um fenograma por UPGMA.
Os haplótipos mitocondriais foram obtidos a partir dos mesmos indivíduos cujas asas foram utilizadas nas análises
morfométricas. A rede de parcimônia estatística dos haplótipos foi construída pelo programa TCS 1.21. A Nested
Clade Analysis (NCA) foi feita utilizando o programa GeoDis 2.5 e a análise de variância molecular (AMOVA)
utilizando o programa Arlequin 3.11. Três redes de haplótipos foram geradas pelo programa TCS, sendo a rede A
separada por nove passos da rede B, e esta separada por 29 passos da rede C. A rede A é formada por haplótipos
das populações de Mucugê-BA, Mucuri-BA, Itaúnas-ES, Macaé-RJ, Arraial do Cabo-RJ, São Sebastião-SP, BertiogaSP, São Francisco do Sul-SC, Penha-SC, Camboriú-SC, Governador Celso Ramos-SC e Florianópolis-SC. A rede B
é formada por haplótipos das populações do Rio Grande do Sul (Arroio Teixeira-RS, Cornélios-RS, Osório-RS e
Viamão-RS), três haplótipos de Penha-SC, um haplótipo de Florianópolis-SC e um haplótipo de Governador Celso
Ramos-SC. A rede C é composta por haplótipos de Altinópolis-SP, Sertãozinho-SP, Porto Ferreira-SP, Itirapina-SP,
Itu-SP, Foz do Jordão-PR, Cantagalo-PR, um haplótipo de São Sebastião-SP, um de Bertioga-SP, um de Governador
Celso Ramos-SC e um de Florianópolis-SC. Os resultados obtidos a partir dos dados moleculares mostraram que
indivíduos identificados taxonomicamente como representantes da espécie D. meridionalis podem compor, no
mínimo, três grupos distintos. A análise morfológica da genitália masculina externa (edeago), o caráter diagnóstico
para as espécies do grupo D. repleta, irá contribuir para o entendimento do status taxonômico desses grupos.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq e USP
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História evolutiva da espécie Drosophila onca (Diptera,
Drosophilidae)
Fransak, RF1; Silva-Bernardi, ECC1; Sene, FM1; Manfrin, MH2
Depto de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.
Depto de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: grupo repleta; subgrupo fasciola; variabilidade; filogeografia; filogenia
Drosophila onca (grupo repleta, subgrupo fasciola) é uma espécie típica de áreas florestais úmidas e tem sido
amostrada ao longo dos estados de São Paulo, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul. Informações ecológicas
sobre os sítios de alimentação e oviposição desta espécie são escassas, mas sabe-se que D. onca se desenvolve
em cladódios em decomposição de cactáceas epífitas do gênero Rhipsalis e cactáceas do gênero Cereus. Estudos
citológicos e moleculares sugerem que D. onca, D. carolinae e D. senei são intimamente relacionadas, entretanto,
as relações entre as essas três espécies ainda não foram resolvidas. Neste contexto, objetivou-se com este trabalho
verificar a monofilia da espécie D. onca e sua relação com D. carolinae e D. senei; estudar a estrutura populacional
de Drosophila onca; e inferir eventos históricos e/ou recorrentes que expliquem a diversificação e distribuição
geográfica atual das populações de D. onca. Para isso foram realizadas análises populacionais utilizando um
marcador molecular, o gene COI, e dois marcadores morfológicos, asa e edeago, além de uma análise filogenética
por máxima verossimilhança com o marcador molecular. As análises filogeográfica e filogenética das sequências
do gene COI indicaram que D. onca não representa um grupo monofilético, sugerindo a existência de no mínimo
duas linhagens evolutivas distintas dentro da espécie. Além disso, na análise filogenética, a maioria dos indivíduos
de D. onca foi agrupada em uma politomia juntamente com um representante de D. carolinae e outro de D. senei,
o que poderia ser resultado da manutenção de polimorfismo ancestral, caso estas espécies tenham divergido a
partir do ancestral comum recentemente, ou devido a eventos de introgressão. As análises morfométricas de asa
e edeago dividiram as populações de D. onca em dois grupos que compartilham similaridades morfológicas; um
grupo formado pelas populações de Guartelá-PR e Arroio Teixeira-RS, e o outro pelas populações de CacondeSP, Cajuru-SP e Florianópolis-SC. A análise morfométrica da asa ainda sugeriu que a população de Guartelá-PR
apresenta maior diferença morfológica em relação às demais, podendo, eventualmente, ter maior isolamento.
Estudos futuros, acrescentando um maior número de espécimes de D. onca e de suas espécies irmãs, assim como
utilizando um gene nuclear como marcador genético, permitirão determinar as relações filogenéticas entre D.
onca, D. carolinae e D. senei, e o “status” taxonômico das linhagens evolutivas dentro de D. onca sugeridas pelo gene
COI.
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Screening de uma biblioteca subtrativa de Drosophila
koepferae criada em dois recursos
Corio, C; Soto, E; Betti, M; Hasson, E
Laboratorio de evolución, Dpto. de Ecológica genética y evolución, FCEN, UBA.
Palavras-chave: Cactófila, grupo repleta, hibridação subtrativa, EST, especiação ecológica.
Drosophila koepferae é uma espécie cactófila, pertencente ao grupo repleta, que na natureza se cria em dois tipos
de recursos alternativos, os tecidos necróticos de espécies dos gêneros Trichocereus e Opuntia, com uma marcada
associação com o primeiro. Estas cactáceas diferem tanto na sua composição química quanto na microfauna
associada à decomposição dos seus tecidos. As moscas de D. koepferae, emergidas em ambos os substratos,
demonstram diferenças de tipo fenotípico em vários caracteres. Algumas dessas diferenças, no nível de caracteres
relacionados ao fitness, fazem supor que D. koepferae faz um melhor aproveitamento do Trichocereus. Uma maneira
de investigar os mecanismos implicados no aproveitamento diferencial associado à utilização de cada recurso é o
estudo dos padrões de expressão gênica específica (ESTs). Para tal fim, geraram-se duas bibliotecas de ESTs, a partir
de larvas em terceiro estágio criadas em ambos recursos. Com o objetivo de enriquecer os transcritos próprios de
cada tratamento, utilizou-se a técnica de hibridação subtrativa de supressão da PCR. Deste modo, ao final da
subtração obtiveram-se duas bibliotecas, uma enriquecida em genes que se sobre-expressam em T. terschekii, e
uma biblioteca complementar enriquecida em genes sobre-expressados em Opuntia sp. Os produtos resultantes
da supressão forem clonados, e posteriormente sequenciados. As sequências obtidas foram comparadas com
bases de dados on-line de todas as proteínas conhecidas de Drosophila melanogaster. Identificaram-se doze genes
sobre-expressados nas larvas criadas em T. terschekii, e nove genes no caso de Opuntia sp. Os genes identificados
estão envolvidos em processos biológicos tão diversos como: oxidação de etanol, regulação da expressão gênica,
ciclo dos ácidos tricarboxílicos, atividade peroxidase, atividade metaloexopeptidase, desenvolvimento da glândula
linfática e manutenção da polaridade em células epiteliais. A grande variedade de processos biológicos afetados
pelos substratos de cria demonstra que a sua utilização é um caráter complexo, com uma intrincada arquitetura
genética. A informação obtida nos permite estudar como os mecanismos de regulação podem ser alvos da seleção
em processos de especiação ecológica. Como perspectiva futura, nós propusemos identificar, mediante o mesmo
ensaio experimental, os genes sobre expressados na espécie irmã D. buzzatii, que a diferencia desta, o seu substrato
preferido de cria é Opuntia. Assim, com esta informação, tentaremos responder perguntas sobre a ecologia
molecular e a utilização de recursos naturais na marcação de processos especiogênicos.
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Levantamento taxonômico preliminar do subgrupo da
Drosophila Willistoni (Diptera, Drosophilidae) no estado
de Pernambuco, Brasil
Cabral, WBM¹; Monteiro, AGF¹; Silva, DMIO¹; Montes, MA²; Rohde, C¹; Garcia, ACL¹
Laboratório de Genética, Centro Acadêmico de Vitória, Universidade Federal de Pernambuco, Vitória de Santo Antão, PE, Brasil.
Departamento de Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, PE, Brasil.
([email protected])
Palavras-chave: Drosophila, Subgrupo da D.willistoni, espécies crípticas, eletroforese, citogenética
O subgrupo da Drosophila willistoni é um dos principais integrantes da fauna de drosofilídeos do Brasil sendo
formado por seis espécies crípticas: D. willistoni, D. paulistorum, D. equinoxialis, D. tropicalis, D. insularis e D.
pavlovskiana. Embora em muitas amostragens este subgrupo de espécies represente até 80% dos drosofilídeos
coletados, a maioria dos trabalhos ecológicos generaliza a identificação de seus representantes como “subgrupo
da D. willistoni” devido a grande semelhança morfológica de suas espécies. A fim de suprir esta dificuldade, até o
momento o método mais eficiente e rápido para a distinção deste subgrupo ao nível de espécies é a técnica de
eletroforese desenvolvida por nosso grupo com a enzima Fosfatase ácida 1 para a qual cada uma das espécies
do subgrupo da D. willistoni apresenta alelos espécie-específicos que permitem sua correta identificação. Neste
estudo realizamos diversas coletas de drosofilídeos no Estado de Pernambuco, um dos territórios brasileiros mais
carentes no conhecimento taxonômico destes insetos. Foram avaliados três locais com formação de Mata Atlântica:
a Reserva Ecológica de Saltinho no município de Tamandaré, o Zoológico de Dois Irmãos em Recife e a Mata da
Ronda no município de Pombos. Dois ambientes característicos de Caatinga também foram amostrados: o Parque
Nacional do Catimbau no município de Buíque e o município de Serra Talhada. Em cada local foram realizadas
duas coletas anuais em 2008, uma no período de maior pluviosidade e outra no período de seca, de acordo com o
estabelecido para o domínio morfoclimático de Pernambuco. Foram coletados 13.780 indivíduos, dos quais 3.592
(26,1%) pertencentes ao subgrupo da D. willistoni. Até o momento duas espécies do subgrupo da D. willistoni foram
detectadas pela técnica de eletroforese nos diferentes locais de coleta: a D. willistoni e a D. paulistorum. Algumas
fêmeas do subgrupo da D. willistoni foram separadas em isolinhagens para a segunda etapa desta investigação
que inclui a caracterização das variantes cromossômicas (inversões) presentes em cada ambiente. A frequência
do subgrupo da D. willistoni foi maior nas localidades com formação de Mata Atlântica como a Mata da Ronda
(73,96%) e a Reserva Ecológica do Saltinho (40,72%). Em ambientes com formação de Caatinga, como Serra
Talhada, a representatividade do subgrupo da D. willistoni (1,12%) foi muito baixa em relação às demais espécies.
Como o estudo dos drosofilídeos é tradicionalmente ligado à genética, o conhecimento da ecologia e da taxonomia
desses insetos torna-se cada dia mais importante. Este estudo está inserido dentro de uma ampla proposta que
visa contribuir para o conhecimento taxonômico de drosofilídeos em diferentes fragmentos florestais do estado de
Pernambuco, através da análise genética e ecológica das populações residentes.
Apoio Financeiro: FACEP CNPQ
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Elemento transponível Galileo no genoma de
espécies do grupo Willistoni de Drosophila (Diptera:
Drosophilidae)
Gonçalves, JW1; Valiati, VH2; Valente, VLS1
Laboratório de Drosophila, Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Sul – UFGRS, Porto Alegre/RS.
Laboratório de Biologia Molecular, Universidade do Vale do Rio dos Sinos – UNISINOS, São Leopoldo/RS.
[email protected]
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2
Palavras-chave: Galileo, foldback, grupo willistoni, Drosophila, transposon.
Galileo juntamente com outros dois elementos estritamente relacionados, Kepler e Newton, foi classificado como
elemento tipo foldback devido a suas longas ITRs (repetições terminais invertidas). Quanto ao elemento Galileo,
observou-se que o mesmo é dotado de uma estrutura complexa e com alto grau de variabilidade nas regiões
correspondentes às repetições internas e ao domínio central entre as cópias. Em Drosophila buzzatii 14 cópias de
Galileo foram analisadas e apresentaram uma variação em tamanho de 20 a 2304 bp com regiões invertidas (IRs)
de 8 a 1115 pb. Recentemente através de análise in silico, cópias do elemento Galileo foram encontradas em seis
espécies de Drosophila: D. ananassae, D. pseudoobscura, D. persimilis, D. virilis, D. mojavensis e com 495 cópias D.
willistoni. Além das cópias pequenas não-autônomas a mais completa do elemento apresentou 4386pb, mas não
continha a transposase completamente funcional, assim como ocorre nas demais espécies. A partir das evidências
que apontam o Galileo como o responsável pela geração das inversões naturais em cromossomos de linhagens de
D. buzzatii e considerando que a D. willistoni e suas crípticas apresentam extenso polimorfismo cromossômico
para inversões paracêntricas, o trabalho tem como objetivo caracterizar a presença deste transposon no genoma
de espécies pertencentes ao grupo willistoni provenientes de diferentes populações naturais. Este trabalho
é extremamente oportuno e promissor, uma vez que a linhagem sequenciada de D. willistoni (GdH4), onde foi
detectada a presença de Galileo, é cromossomicamente monomórfica, extremamente endocruzada e produto de
cruzamentos irmão-irmã. Como tal, ela não representa as populações naturais, cromossomicamente polimórficas.
Para a investigação da presença de Galileo utilizou-se primers (construídos com base na seqüência de Galileo de
GdH4) que amplificam um fragmento do domínio central do elemento, assim como da inferida transposase e de seu
domínio THAP (domínio de ligação ao DNA). Até o momento foram investigadas, do subgrupo willistoni (críptico),
D. willistoni, D. tropicalis, D. equinoxialis e quatro semi-espécies de D. paulistorum (Amazônica, Andino, Interior e
Orinocana), e do subgrupo alagitans-bocainensis (não crípticas), D. nebulosa, D. capricorni e D. fumipennis pelas
técnica de PCR, Dot blot e Southern blot. Em todas as espécies observou-se a presença de Galileo com fragmentos
de tamanhos distintos. Os fragmentos polimórficos foram clonados e estão sendo sequenciados. Dessa forma, com
base nas variantes de Galileo e de outros elementos foldback já depositadas em bancos de dados, será realizada
a caracterização molecular das seqüências nucleotídicas, assim como de possíveis transposases funcionais nos
fragmentos amplificados. Apoio financeiro: CNPq
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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273
Polimorfismo do gene Cyp6g1 (exonS 1 e 2) em
linhagens resistentes e suscetíveis de Drosophila
melanogaster e D. simulans
Madi-Ravazzi, L¹; Gomes, MO¹; Carnelossi, EAG²; Carareto, CMA²
¹Laboratório de Genética, Ecologia e Evolução de Drosophila ²Laboratório de Evolução Molecular de Insetos – Depto de Biologia Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas – UNESP. [email protected]
Palavras-chave: família P450, resistência a inseticidas, Drosophila
Evidências consideráveis na literatura apóiam a hipótese que a resistência ao DDT baseada no metabolismo é
poligênica em Drosophila e está parcialmente associada a superexpressão de genes da família citocromo P450, em
particular do gene Cyp6g1, embora alguns estudos mostraram altas expressões de Cyp6g1 em linhagens suscetíveis
de D. melanogaster. Adicionalmente análises da seqüência codificante desse gene, não possibilitaram identificar
variações que pudessem agrupar diferencialmente linhagens resistentes e suscetíveis. Com o objetivo de estender
este estudo para outras linhagens de D. melanogaster e também analisar D. simulans, sua espécie irmã, o presente
trabalho investigou o polimorfismo dos exons 1 e 2 de Cyp6g1, de linhagens resistentes e suscetíveis de laboratório,
e resistentes recém-coletadas destas espécies, correlacionando os resultados com o nível de suscetibilidade ao
DDT. Foram amplificadas seqüências dos dois exons, a partir de DNA extraído de linhagens das duas espécies,
por meio de iniciadores específicos, bem como, foram obtidas seqüências dessas regiões depositadas no GenBank
de linhagens de D. melanogaster, D. simulans, D. sechellia, D. yakuba e D. erecta. As seqüências foram alinhadas
(programa BioEdit 7.0.5.3) e analisadas quanto aos números de substituições sinônimas e não-sinônimas e a
ocorrência de restrições seletivas nos dois exons, por meio do Teste D de Tajima (programa DNASP 4.50). No
exon 1, foram observadas 2 substituições intra-espécies, sendo 1 sinônima em D. simulans e 1 não-sinônima em D.
melanogaster. No exon 2, foram observadas 5 substituições intra-espécies sendo 2 sinônimas (1 em D. melanogaster
e 1 em D. simulans) e 3 não-sinônimas (2 em D. simulans e 1 em D. melanogaster). Ocorreram entre as espécies 17
substituições sinônimas e 3 não sinônimas no exon 1, e 22 substituições sinônimas e 11 não sinônimas no exon
2. Os valores de D de Tajima, respectivamente -0,189 (p>0,10) e -0,581 (p>0,10) para os exons 1 e 2, indicam que a
hipótese de mutação neutra pode explicar os polimorfismos observados. Não foram observadas associações entre
os diferentes níveis de suscetibilidade ao DDT das linhagens e o polimorfismo das seqüências dos exons 1 e 2 do
gene Cyp6g1. Um fato interessante é que 81% das 55 substituições observadas entre D. simulans e D. melanogaster
foram compartilhadas entre D. simulans e uma ou mais das outras espécies do grupo melanogaster (D. sechellia,
D. yakuba e D. erecta) indicando que a maior parte das substituições ocorreu em D. melanogaster e foram fixadas.
Esses dados corroboram relatos da literatura de maior plasticidade evolutiva para D. melanogaster em relação às
demais espécies do grupo melanogaster, também para este gene.
Apoio financeiro: FUNDUNESP, FAPESP, CAPES
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274
Efeito do tratamento de Drosophila melanogaster com
o inseticida imidaclopride no padrão de esterases de
gerações subsequentes
Patarro, TF1; Bicudo, HEMC1
Laboratório de Vetores - Departamento de Biologia - Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas de São José do Rio Preto UNESP
[email protected]
1
Palavras-chave: toxicidade, inseticida, resistência.
O imidaclopride é um inseticida sintético, da classe dos neonicotinóides, que vem sendo crescentemente
utilizado em culturas de grãos e na saúde pública. Esse inseticida mostra toxicidade seletiva para os insetos, em
parte, atribuída à maior afinidade pelos receptores acetilcolína nicotínicos (nAChR) dos insetos do que pelos
correspondentes dos vertebrados. As enzimas da família citocromo oxidase P450 e a aldeído oxidase (AOX) já
demonstraram ser importantes no metabolismo do imidaclopride. Estudos em outros organismos têm apontado
o envolvimento de esterases no processo de detoxificação, quer pela superprodução destas enzimas, quer pela
mutação dos genes correspondentes. No presente trabalho, foi avaliado o efeito do imidaclopride sobre o padrão
de esterases em Drosophila melanogaster no decorrer de 15 gerações. As análises foram efetuadas nas gerações
F0, F5, F10 e F15, para o tratado (no qual as moscas foram submetidas a 5 μg de imidaclopride/ml de meio de
cultura banana-agar) e para o controle. Os resultados mostraram que, em fêmeas, das nove bandas detectadas,
alterações mais pronunciadas foram observadas nas bandas EST-1, EST-3 e EST-7 (esta em menor grau). Para os
machos, a alteração mais pronunciada ocorreu na banda EST-1, seguindo-se as bandas EST-4, EST-7 e EST-8. Além
dessas alterações no grau de expressão, houve redução da freqüência de expressão da banda EST-6 nos machos.
Observa-se também que, em geral, houve nos resultados, um envolvimento do processo utilizado na fundação das
novas gerações, selecionando indivíduos de desenvolvimento mais precoce, e que isso atingiu ambos os tipos de
experimento, controle e tratado. Se considerarmos apenas a geração F15, as bandas que aumentaram o grau de
expressão nas fêmeas foram EST-3 e EST-4, e as que diminuíram foram EST-5 e EST-6. Para machos, houve aumento
no grau de expressão nas bandas EST-1, EST-6, EST-7 e EST-8, e diminuição em EST-4 e EST-5. Quanto à freqüência
das bandas na geração F15, observou-se, em fêmeas, aumento significativo apenas para a banda EST-8. Para machos,
o aumento na freqüência ocorreu para as bandas EST-1 a EST-4 e EST-8. Os dados observados mostram diferenças
de resposta dos padrões de esterase em relação ao tratamento com imidaclopride. As alterações observadas
abrangem, especialmente as bandas EST-4 e EST-8 nos machos, que são classificadas como carboxilesterases, e
nas fêmeas a EST-3, que também pertence à mesma classe. Estas alterações estão de acordo com as observações
na literatura, para outros organismos, nas quais predomina o envolvimento de carboxilesterases nos processos de
detoxificação de substâncias exógenas.
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275
Visualização da estrutura da cromatina dos genes
ribossomais nos dípteros inferiores e em Drosophila
melanogaster, através da técnica de incorporação do
psoraleno na cromatina in vivo
Madalena, CRG1; Díez, JL2; Sogo, JM3; Gorab, E 1
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo, São Paulo, SP, Brasil.
Departamento de Biologia Celular y del Desarrollo, Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, Espana.
3
Institute for Cell Biology, ETH, Zurich, Switzerland.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: psoraleno, cromatina, genes ribossômicos, dípteros inferiores e Drosophila melanogaster
O nucleossomo é a unidade básica da cromatina, e é formado por 147pb de DNA enroladas em torno de um
octâmero de proteínas histônicas. Cromatina organizada em nucleossomos é geralmente vista como um entrave
à processos tais como transcrição e replicação. A cromatina dos genes ribossomais pode apresentar formas
estruturais diferentes e/ou diferentes estados transcricionais, detectados através de técnicas de fotorreação com um
intercalante de DNA denominado psoraleno. Nos eucariotos, a cromatina dos genes ribossomais está organizada
de duas formas, que podem ser distinguidas entre si através dessa técnica. Genes ativos em transcrição não
estão organizados em nucleossomos e, consequentemente, incorporam mais psoraleno do que os genes inativos,
organizados em nucleossomos. Esta incorporação diferencial pode ser observada em fragmentos de restrição de
alguma região codificante da unidade do rDNA, correspondendo a duas bandas distintas numa eletroforese em
gel de agarose: uma banda que migra vagarosamente, denominada “s” (do inglês, “slow”) e uma segunda banda,
que migra mais rapidamente, denominada “f ” (do inglês, “fast”). Dessa forma, experimentos de hibridação em
“Southern-blot” podem identificar fragmentos de restrição que contém cromatina livre de nucleossomos (banda
“s”), e cromatina organizada em nucleossomos (banda “f ”). Neste trabalho, a estrutura da cromatina dos genes
de rRNA de dípteros inferiores e de Drosophila melanogaster foram estudados usando a técnica descrita acima.
Em Chironomus thummi e em C. tentans (Diptera: Chironomidae), foram observados genes ribossômicos ativos
e inativos em células da glândula salivar e em outros tecidos larvais. Os organizadores nucleolares nesses dois
chironomídeos estão aparentemente localizados em regiões eucromáticas. Sugeriu-se que a proporção de genes
ribossomais ativos fosse dependente do tipo de tecido estudado e, dessa forma, a quantidade de genes ribossomais
ativos em cada tipo celular de C. thummi seria estabelecida durante a diferenciação celular. Quando comparamos
as células embrionárias e células da glândula salivar de D. melanogaster; as células da glândula salivar de Sciara
coprophila e outros tipos celulares de Rhynchosciara americana com os demais eucariotos estudados, observamos
que esses insetos não apresentam a distribuição bimodal da cromatina ribossomal, observada por exemplo em
Chironomus. Resultados de hibridação em “Southern blot” após o “crosslink” do DNA com o psoraleno mostraram
uma única banda, representativa do DNA ribossômico organizado em nucleossomos. Esses dados sugerem um
número muito baixo de genes ribossomais ativos nesses Sciarídeos e em D. melanogaster, provavelmente pelo
fato de se encontrarem em uma proporção abaixo do limite de detecção deste método. Estes resultados podem
relacionados com a localização heterocromática do organizador nucleolar nesses organismos.
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276
Occurrence of transposable elements in flanking
regions of Cyp genes in six species of the Drosophila
melanogaster group.
Carareto, CMA1; Lopes, FR1; Ricci, J1
Laboratório de Evolução Molecular - Departamento de Biologia. Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. UNESP campus de
São José do Rio Preto.
1
Palavras-chave: Cyp genes, transposable elements, insecticide resistance, melanogaster group, DNAREP1_DM, transcription factors
binding sites
In this study we analyzed the sequenced genomes of the six species of the group melanogaster of Drosophila
regarding to the occurrence transposable elements (TEs) in the 5’ and 3’ flanking regions of 13 genes of the Cyp
family, eight associated with the metabolism of insecticides (Cyp6a2, Cyp6a8, Cyp6a9, Cyp6g1, Cyp6w1, Cyp4e2,
Cyp12a4, Cyp12d1) and five with the ecdisona biosynthesis (Cyp302a, Cyp307a, Cyp314a1, Cyp315a, Cyp306a1).
The main objectives were: 1) evaluating the hypothesis that the genes Cyp associated to insecticide resistance are
enriched by TEs, based on previous analysis done in D. melanogaster (Chen and Li, 2007) and in D. melanogaster
and D. simulans (Ricci et al., 2008); and 2) investigating if exists any relationship between the genome proportion
of TEs, that is variable among the species, and the proportion of TEs flanking the genes Cyp. The identification
of TEs was accomplished in the extracted Cyp sequences through the program RepeatMasker against Repbase.
Practically all the TE insertions occurred in the flanking regions of the Cyps associated to insecticide resistance.
Although the differences were not significant, it was verified that TEs insert preferentially in 5’ Cyp flanking regions,
in agreement with the findings of Ricci et al. (2008). It was also shown that the TE insertion is differential between
the species and it does not follow the genome proportion of TEs in each species. As example, D. ananassae, the
species with the largest genome proportion of TEs (24.93 %), presented the smallest TE proportion per Cyp (1) and,
D. simulans, the species with the smallest proportion (2.73 %) presented the second largest number of TEs per Cyp
(4.67 %). The same was observed regarding the DNAREP1_DM, the most abundant TE in the Drosophila genome.
Since the DNAREP1_DM fragments inserted in the flanking regions of the Cyp genes harbor transcription factors
binding sites and the distribution of TEs in these regions is differential among the six species of the D. melanogaster
group, we can hypothesize that these fragments could play an adaptive role in these species. However, detailed
experimental studies are necessary to corroborate that hypothesis.
Apoio Financeiro: FAPESP e CNPq.
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277
Elementos transponíveis mariner-like em
Drosophilideos neotropicais
Wallau, GL1; Capy, P2; Loreto, ELS1 PPG Biodiversidade Animal, UFSM. 2Laboratoire Evolution, Génomes et Spéciation, CNRS, França.
[email protected].
1
Palavras-chave: transposon, mariner, Drosophila, evolução genômica.
O elemento de transposição mariner é um membro da superfamília Tc1-Mariner amplamente distribuído entre os
filos, sendo encontrado em protozoários, fungos, nematelmintos, artrópodes e cordados (peixes e humanos). Esta
ampla distribuição é marcada por uma significativa diversidade de sequências de elementos relacionados à mariner
(mariner-like elements - MELs), que são classificados em 6 subfamílias de acordo com o grau de similaridade de
aminoácidos. Apesar deste elemento transponível já ser descrito em vários organismos, em drosofilídeos existem
poucos estudos com seqüências relacionadas à mariner. Neste trabalho propomos uma busca por sequências
relacionadas à mariner em 49 espécies de drosofilídeos. Para a análise molecular, foram utilizadas buscas por PCR
(polimerase chain reaction) no DNA genômico com primers degenerados que anelam nos sítios catalíticos, sendo
que na presença desses elementos amplificam um fragmento de 491pb. A similaridade das sequências obtidas a
partir dos clones foi analisada com o uso da ferramenta BLAST P no banco de dados do GENBANK. Empregouse também o RepatMasker para confirmação de seqüência relacionada à mariner. Posteriormente, as sequências
deduzidas das proteínas foram alinhadas com o uso do Clustal X2 e analisadas filogeneticamente por máxima
parcimônia (bootstrap 1000), Neighbor-Joing (bootstrap 1000), máxima verossimilhança (bootstrap 1000) e análise
bayesiana (1000000 de gerações) em conjunto com seqüências já descritas para a identificação das subfamílias de
mariner. O modelo de substituição de aminoácidos utilizado na análise filogenética foi determinado por análise de
verossimilhança pelo programa ProTest. Para a análise filogenética foram utilizados dois elementos da família Tc1:
Bari de D. melanogaster e Tc1 de Ceanorabidits elegans como grupo externo. As buscas com os primers degenerados
já foram realizadas em 39 espécies, sendo que 17 apresentaram o fragmento de tamanho esperado. Destas 17
espécies 11 (D. ornatifrons, D. maculifrons, D. mediosignata, D. mediopunctata, D. mediostriata, D. paramediostriata,
D. cardini, D. neocardini, D. pallidpennis, D. buskii e Scaptodrosophila latifasciformes) apresentaram clones com
sequencias relacionadas à mariner. Com esse dados podemos visualizar que a subfamília mellífera é a mais
amplamente distribuída estando presente em 8 das 11 espécies que possuem clones de mariner. Já a subfamília
mauritiana está presente em 5 destas espécies e a subfamília irritans em 4 espécie. Das 11 espécies que possuem
clones de mariner 3 (D. mediopunctata, D. paramediostriata e D. buskii) apresentaram clones provavelmente
provenientes de elementos ativos, pois possuem um quadro aberto de leitura intacto. A análise filogenética dos
elementos relacionados à mariner demonstra a coexistência das subfamílias em algumas espécies além de algumas
incongruências comparada com a filogenia das espécies. Esta distribuição pode ser decorrente de múltiplos casos
de transmissão horizontal, diferentes taxas de evolução dos genomas, polimorfismo ancestral ou perda estocástica,
sendo que essas hipóteses não são mutuamente exclusivas.
Órgão Financiador: CAPES-COFECUB; CNPq
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278
Polimorfismo cromossômico e o elemento de
transposição micropia no grupo cardini do gênero
Drosophila (Diptera: Drosophilidae)
Cordeiro J1; De Toni DC2; Silva GS1,3;Valente VLS1
Programa de Pós Graduação em Genética e Biologia Molecular; UFRGS
Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Genética; UFSC
3
Universidade La Salle; Rio Grande do Sul
1
2
No gênero Drosophila, evidenciou-se o envolvimento de elementos de transposição (TE) na geração de rearranjos
cromossômicos. O retroelemento micropia parece estar potencialmente ativo em espécies do grupo cardini,
porém ele não está relacionado à geração de mutação. Este trabalho analisa a distribuição do TE micropia em seis
espécies deste grupo, com distribuição no sul do Brasil. Para atingir nosso objetivo, construímos o fotomapa dos
cromossomos politênicos de duas espécies estudadas, D. cardini e D.parthenogenetica. Para isso, sete populações
de D. cardini e três populações de D. parthenogenetica foram analisadas com a finalidade de conhecer o padrão
de bandas e o polimorfismo de inversões. Para as demais espécies estudadas (D. cardinoides, D..neocardini, D.
neomorpha e D. polymorpha) utilizamos os fotomapas já publicados. Para analisar o padrão de distribuição do TE
micropia, utilizamos a técnica de hibridação in situ (HIS) sobre cromossomos politênicos. Nossos dados apontam
para um baixo polimorfismo cromossômico nas espécies D. cardini (inversão 3A) e D. parthenogenetica (inversão
2RA e 3RA). O sul do Brasil representa o limite austral da distribuição de ambas as espécies. Comparando-se os seus
cromossomos com os das demais espécies do grupo, verificamos que ocorreram vários rearranjos cromossômicos
durante o processo evolutivo, conservando-se somente as regiões de base e ponta dos cromossomos. Os dados de
HIS indicam a presença de seis sinais de hibridação em D. cardini, 14 em D. cardinoides, 12 em D. neocardini, cinco
em D. neomorpha, seis em D. parthenogenetica e 18 em D. polymorpha. Os cromossomos 3R de D. cardini, X de D.
neomorpha e 2L de D. parthenogenetica não apresentaram sinal de hibridação. Estas três espécies são as menos
polimórficas para inversões heterozigotas. D. cardinoides e D. polymorpha são as mais polimórficas e, juntamente
com D. neocardini, apresentam mais sinais de hibridação em seus braços cromossômicos polimórficos (3L para
D. cardinoides e D. neocardini, 2R para D. polymorpha). Apenas três sinais de hibridação coincidiram com pontos
de quebra de inversões, um em D. cardinoides (seção 64a) e dois em D. polymorpha (seções 44a e 48a). Nossos
dados, analisados juntamente com os de outros autores, indicam que micropia parece estar sendo regulado por
um mecanismo de repressão da atividade transposicional e potencialmente atuando com invasor secundário de
regiões de ponto de quebra para inversões.
Apoio financeiro: CNPq, CAPES, FAPERGS
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279
Elemento But2 e seus MITEs em Drosophila
Rossato, DO1; Ludwig, A2; Deprá, M2; Loreto, ELS2,3; Valente, VLS2,4
Curso de Ciências Biológicas – UFRGS
PPGBM – UFRGS
3Departamento de Biologia da UFSM
4Departamento de Genética da UFRGS
[email protected]
12-
Palavras-chave: Drosophila, elemento de transposição, But2, MITEs, evolução genômica
Elementos de transposição são sequências de DNA móveis que desempenham importante função na evolução dos
genomas. O elemento But2 pertence à superfamília hAT da ordem TIR (terminal inverted repeat) e foi descoberto
em locais de pontos de quebra cromossômica em Drosophila buzzatii. Nossos dados preliminares, de buscas in
silico, indicaram a presença de But2 em D. mojavensis a qual, juntamente com D. buzzatti, pertence ao grupo repleta
do subgênero Drosophila. Inesperadamente, uma sequência com 93% de similaridade ao But2 foi encontrada em
D. willistoni, subgênero Sophophora. Posteriormente, investigamos a presença desse elemento através de PCR em
62 espécies de Drosophila. Fragmentos com tamanhos distintos e menores que o esperado foram amplificados
em diversas espécies. Através de PCR in silico e também clonagem e sequenciamento confirmamos que esses
fragmentos são sequências relacionadas a But2. Essas sequências apresentam similaridade com But2 nas regiões
5’ e 3’. Vários trabalhos mostram que elementos curtos e altamente repetitivos (MITEs - Miniature inverted repeat
transposable elements) podem surgir por degeneração de elementos autônomos, dessa forma, acreditamos que
essas sequências relacionadas ao But2 estão presentes nos genomas possivelmente por degeneração. Apesar de
não serem sequências codificadoras, encontramos evidências de recente mobilização desses MITEs de But2.
Provavelmente elementos But2 completos fornecem a transposase, enzima necessária para a transposição. A fim
de investigarmos a fonte de transposase e a distribuição e evolução do But2 completo, primers específicos estão
sendo usados. O estudo do elemento But2 é uma importante oportunidade de investigar o comportamento dos
elementos de transposição nos genomas, a dinâmica evolutiva gerada pela coexistência de cópias completas e
MITES e as implicações da presença dos MITEs nos genomas.
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280
O elemento genético egoísta Spiroplasma poulsoni em
quatro espécies de Drosophila
Ventura, IM¹; Martins, AB¹; Klaczko, LB¹
¹Laboratório de Biodiversidade Genética e Evolução de Drosophila
Departamento de Genética, Evolução e Bioagentes, Instituto de Biologia, UNICAMP
[email protected]
Palavras-chave: elementos genéticos egoístas, Spiroplasma, sex-ratio, male-killing, Drosophila
Elementos genéticos egoístas disseminam-se nas populações distorcendo o padrão de herança mendeliana. Um
caso especial são os elementos citoplasmáticos egoístas (ECEs), endossimbiontes transmitidos verticalmente que
aumentam sua freqüência nas populações através da manipulação da proporção sexual de seus hospedeiros. Em
Drosophila, bactérias do gênero Spiroplasma causam mortalidade precoce de machos (male-killing). Alguns estudos
demonstraram que o efeito fenotípico causado por ECEs pode depender do background genético do hospedeiro.
Neste trabalho, analisamos os efeitos que o ECE Spiroplasma poulsoni, que naturalmente infecta D. melanogaster, é
capaz de induzir em outras quatro espécies de Drosophila. A bactéria foi transferida para as novas espécies através
da microinjeção de hemolinfa proveniente de uma mosca infectada na junção entre o tórax e o escutelo de uma
fêmea receptora. Essa metodologia foi padronizada utilizando D. melanogaster, e sua eficiência foi aumentada de
16% para 100% ao longo dos ensaios. A seguir, a confirmação da presença de Spiroplasma nas espécies receptoras
foi realizada através de PCR com primers específicos. A contagem da prole das fêmeas injetadas demonstrou
que as espécies D. simulans, D. ornatifrons e Zaprionus indianus exibiram o fenótipo male-killing semelhante a
D. melanogaster, com alta taxa de transmissão e proles atingindo 100% de fêmeas. Por outro lado, a espécie D.
ananassae não exibiu qualquer efeito fenotípico induzido por Spiroplasma e sua proporção sexual permaneceu
equilibrada. Esses resultados demonstram que o efeito fenotípico induzido pelo Spiroplasma em seus hospedeiros
nem sempre pode ser previsto, mesmo entre espécies próximas. Além disso, a tolerância exibida por D. ananassae
é intrigante e merece investigações futuras.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP, CAPES, FAEPEX-Unicamp.
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281
Changes in gene expression can contribute to a rapid
morphological divergence in Drosophila melenogaster
wings
Matta, BP1; Alves-Ferreira, M2; Bitner-Mathé, BC1
Laboratório de Genética de Populações de Drosophila – Departamento de Genética, Instituto de Biologia, UFRJ.
Laboratório de Genética Molecular Vegetal – Departamento de Genética, Instituto de Biologia, UFRJ.
[email protected], [email protected], [email protected]
1.
2.
Palavras-chave: shape, size, morphological evolution, gene expression, microarray
Laboratory experiments using well established model organisms might help to elucidate how the genetic
variation can change in response to selective pressures and how it might ultimately generate the great range of
adaptive morphological variation found in nature. The Drosophila wing has been used as a model for the study of
morphological evolution in quantitative traits. Among other reasons, its natural variation has been largely analyzed
and the genetic control of its development is relatively well known. The shape of the wing outline can be described
through a width-to-length ratio: the higher this ratio, the rounder will be the wing contour and vice-versa. A
program of bidirectional artificial selection was previously applied to a wild-type line of Drosophila melanogaster.
Divergent selection lines, with rounder outline shape (R line) or longer outline shape (L line), were rapidly established
and no correlated response of wing size to the shape selection was observed. Here, we performed a microarray
analysis to evaluate whether gene expression changed in response to this selection program and which genes
could be accounted for at least part of the resulting morphological variation. For each selection line, four biological
replicates of total RNA were obtained, each from 100 imaginal wing discs of third instar wandering larvae. Twocolor microarray hybridizations between R x L samples were performed using four slides, one for each replicate.
After hybridization, each slide was scanned at four different photomultiplier settings (PMT), so that high and low
expressing genes could be represented in at least one scan. Signal intensities across PMT scans were calibrated
using AROMA. Calibrated signals of each slide were then used in filtering and normalization steps. Differential
expression was tested through moderated t-tests generated by Limma, P-values were adjusted for multiple testing
by fixing the false discovery rate to 1%, and the cutoff for the significance level of adjusted P-values was set to
1%. 233 genes were found to be differentially expressed (DE) between these divergent lines during the third instar
of larval development; being the highest absolute log of fold-change of 4.24. Preliminary gene ontology analyses
showed that genes involved in glutathione transferase activity are overrepresented within DE genes and they might
contribute to the molecular and cellular processes that generate the quantitative variation between the selection
lines. The changes in gene expression of at least 11 genes, representing 5% of the DE genes, will be tested with realtime quantitative RT-PCR, for an independent validation.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPERJ.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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282
Bases celulares da variação no eixo antero-posterior
em linhagens de Drosophila melanogaster divergentes
para forma das asas
Torquato, LMS¹; Bitner-Mathé, BC².
Instituto de Biologia, Departamento de Genética - UFRJ
¹[email protected]; ²[email protected]
Palavras-chave: asa, Drosophila, número de células, seleção artificial, variação morfológica.
Estudos morfogenéticos mostraram que a proliferação, a competição e os rearranjos celulares ocorrem durante
desenvolvimento embrionário, sendo responsáveis por determinar e orientar o tamanho e a forma final de órgãos. Em
nosso laboratório, através de seleção artificial por 64 gerações, foram obtidas linhagens de Drosophila melanogaster
com forma das asas divergentes: linhagens com asas alongadas (L) e linhagens com asas arredondadas (R). O
objetivo desse trabalho é investigar a influencia do eixo ântero-posterior da asa na determinação das variações
de forma e relacionar essas variações às variações de número e de tamanho das células. Para isso, a medida da
largura da asa foi tomada nas linhagens L e R e o número de células presente nessa largura foi estimado pela
contagem dos tricomas. Isso é possível porque na asa de Drosophila existe a relação de um para um entre células
e tricomas. Também é possível estimar o diâmetro das células através da razão entre a largura da asa e número
total de células ao longo dessa largura. Sabemos que parte da estimativa de forma está relacionada ao tamanho
total da asa, sendo assim o valor da forma foi dividido em dois componentes: alométrico ( forma dependente de
tamanho) e não alométrico ( forma independente de tamanho). Não foi possível identificar diferença significativa
para o número de células entre as duas direções de seleção. No entanto, a análise de componentes principais
mostrou que parte da variação na largura das asas está relacionada ao tamanho geral da asa e também a variações
no número de células. Por outro lado, grande parte da variação na largura das asas está relacionada à variação de
forma e ao diâmetro das células. Ou seja, asas mais arredondadas têm largura maior por apresentar células com
maior diâmetro nessa direção, embora não haja diferença significativa no número de células distribuídas ao longo
do eixo ântero-posterior nas asas das linhagens L e R.
Apoio financeiro: CAPES, CNPq e FAPERJ
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283
Seleção direcional sobre a forma das asas em
espécies de Drosophila
Menezes, BF & Bitner-Mathé, BC
Instituto de Biologia, Departamento de Genética, Universidade Federal do Rio de Janeiro. [email protected]; [email protected]
Palavras-chave: asa, Drosophila, evolução fenotípica, herdabilidade realizada, seleção.
Experimentos de seleção artificial em Drosophila melanogaster têm sido utilizados com sucesso para estudar
aspectos relacionados aos processos evolutivos, em parte, devido à facilidade do manuseio dessa espécie e ao
grande volume de conhecimentos acumulados sobre a biologia do gênero. Em nosso laboratório, foram obtidas
linhagens de Drosophila melanogaster com grandes variações na forma das asas através de seleção artificial e diversos
enfoques dessa resposta intra-específica estão sendo analisados. O objetivo deste trabalho é estender esses estudos
para o nível interespecífico, através da comparação da resposta à seleção para divergência na forma das asas entre
3 espécies do gênero Drosophila, além de D. melanogaster. A escolha das espécies foi orientada por suas relações
filogenéticas e por suas características de tamanho e forma das asas: uma espécie do subgênero Sophophora, D.
willistoni e duas espécies do subgênero Drosophila, pertencentes a grupos diferentes, D. mediopunctata e D. hydei.
A seleção está sendo realizada à temperatura de 22oC. A cada geração até 30 fêmeas são medidas e aplicada seleção
com 20% de intensidade. Por apresentarem diferentes tempos de desenvolvimento, o número de gerações varia
dependendo da espécie. Resultados preliminares demonstram a capacidade de resposta à seleção para forma da
asa em todas as espécies analisadas, mesmo em gerações iniciais. Coeficientes de regressão significativos foram
obtidos nas duas direções de seleção, sendo essa resposta inicial mais intensa na seleção para asas longas. Também
foi realizada seleção em linhagens de Drosophila willistoni altamente endocruzadas (estirpe genômica), que até a 7ª
geração apresentou resposta significativa apenas na direção de seleção para asa longa.
Apoio: Bolsa CNPq, FAPERJ, CAPES
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284
Normas de reação em Drosophila mediopunctata: nãolinearidade e interação genótipo-ambiente
Rocha, FB1; Klaczko, LB1
Laboratório de Biodiversidade Genética e Evolução de Drosophila, Departamento de Genética e Evolução, Instituto de Biologia,
Unicamp.
[email protected]
1
Palavras-chave: plasticidade fenotípica; ambientes heterogêneos; interação genótipo-ambiente.
A influência do ambiente sobre o fenótipo de um caráter é reconhecida pela genética quantitativa como um dos
componentes da variância fenotípica e como parte do termo de interação genótipo-ambiente. Tal fator, porém,
é considerado como um desvio ambiental que, na média da população, torna-se zero, e a interação tende a ser
interpretada como ruído. O efeito fenotípico do ambiente pode ser descrito por normas de reação, em que a
interação genótipo-ambiente é representada pelo cruzamento entre curvas de diferentes genótipos. A maioria
dos trabalhos neste campo baseia-se na resposta de diferentes genótipos a até três ambientes e, em geral, revelam
que a interação genótipo-ambiente pode ser um componente significativo da variância fenotípica, podendo fazer
o genótipo com maior valor fenotípico num ambiente apresentar o menor em outro. Assim, a interação genótipoambiente tem se tornado sinônimo de imprevisibilidade das respostas fenotípicas de diferentes genótipos, ou
relegada ao lugar de ruído. Neste trabalho, utilizamos oito estirpes de Drosophila mediopunctata, com diferentes
inversões no cromossomo II e background genético homogêneo, para descrever detalhadamente as normas de
reação de um conjunto de caracteres (comprimento do tórax; número de cerdas esternopleurais; número de pintas
abdominais; número de ramos das aristas e tempo de desenvolvimento) em relação a um gradiente térmico com
onze temperaturas, de 14°C a 24°C. As normas de reação de cada estirpe foram descritas como funções polinomiais
da temperatura, cujo grau foi determinado pelo teste, em ordem crescente, do termo determinante do grau de cada
polinômio, obtendo um valor de R2>0,8 em 27 de 40 curvas. O método utilizado permitiu a constatação de três
aspectos relevantes das normas de reação: a) a não-linearidade como regra, não exceção (29 das 40 curvas foram
não-lineares); b) a possibilidade de sua descrição como funções do ambiente de desenvolvimento, com variação
genética dos parâmetros; c) a complexidade da variação de forma das normas de reação entre e dentro de cada
caráter (polinômios de primeiro a quarto grau). Tais aspectos são reforçados pelos poucos estudos detalhados de
normas de reação em outras espécies (porém com interpretações distintas) e apontam para a possibilidade de que
a interpretação tradicional dada à interação genótipo-ambiente tenha surgido como consequência da utilização
de poucos pontos de ambientes diferentes. Para verificar essa possibilidade, repetimos a análise apenas com três
temperaturas típicas para experimentos com D. mediopunctata (16°C, 18°C e 20°C), produzindo o tradicional
quadro de interação genótipo-ambiente como artefato do método: a variação dentro e entre normas de reação
tornou-se imprevisível (é impossível testar modelos não-lineares), impossibilitando a detecção dos padrões antes
evidentes; e a interação genótipo-ambiente tornou-se resultado mais do erro da estimativa de cada ponto do que
de diferenças consistentes entre normas de reação.
Apoio financeiro: FAPESP; CNPq, CAPES, Faepex-Unicamp.
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285
Identificação molecular de vírus em Apis mellifera no
estado de Minas Gerais
Almeida, FC¹; Amaral, IMR¹; Sousa, CS¹; Moreira-Neto, JF; Bonetti, AM¹; Kerr, WE¹; Vieira, CU¹
Universidade Federal de Uberlândia, Instituto de Genética e Bioquímica, Laboratório de Genética.
[email protected]
1
Palavras-chave: vírus, Apis mellifera, epidemiologia molecular, RT-PCR, desaparecimentos
A mortalidade de abelhas Apis mellifera é um dos vários problemas que os apicultores têm enfrentado no mundo
todo. Vários fatores contribuem para esse fato, tais como a presença de Varroa destructor (ácaro) e Nosema apis
(protozoário) e exposição à inseticidas usados na agricultura. A mortalidade é agravada pela presença de retrovírus
que infectam abelhas provocando deformações indesejáveis. Esse trabalho descreve a primeira detecção molecular
de vírus em abelhas no estado de Minas Gerais, corroborando o registro já feito no estado de São Paulo. Foi feita a
RT-PCR com primers específicos para os vírus da paralisia aguda em abelha (ABPV), vírus da deformação da asa
(DWV) e vírus da célula branca de rainha (BQCV) em pool de 15 abelhas retiradas de 2 colméias (15 abelhas de
cada) de um apiário na região do Triângulo Mineiro (MG). A análise por eletroforese em gel de agarose 1,5% revelou
a presença de dois diferentes tipos de vírus, o DWV e o ABPV, em ambas as colméias, indicando co-infecção.
Nas amostras de A. mellifera analisadas não foi detectada a presença do vírus BQCV, porém não foi descartada a
circulação desse vírus no Estado de Minas Gerais; a não detecção pode ser devida ao limitado número de amostras
(30 abelhas no total). Os resultados parciais desse trabalho sugerem que a circulação desses vírus nas colônias
possa estar relacionada com o desaparecimento e morte inesperada de abelhas A. mellifera, relatadas por apicultor
da região do Triângulo Mineiro (MG). Essa análise faz parte de um novo Programa de Estudo de Epidemiologia
Molecular de vírus em abelhas no Brasil.
Apoio financeiro: CNPq, FAPEMIG, CAPES, UFU
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286
Is GFP-derived double-stranded RNA an effective
control for honeybee RNAi approaches?
Nunes, FMF1; Barchuk, AR2; Bomtorin, AD3; Cristino, AS4; Simões ZLP1
Departamento de Biologia - Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
Departamento de Ciências Biomédicas - Universidade Federal de Alfenas
3
Departamento de Genética - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo
4
Departamento de Física e Informática - Instituto de Física de São Carlos, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
2
Keywords: RNAi, Apis mellifera, microarrays, GFP
The use of RNA interference (RNAi)-mediated gene silencing is a powerful tool for genomic studies in non-model
organisms. A green fluorescence protein (GFP)-derived double-stranded RNA (dsRNA) has been used in virtually
all the Apis mellifera RNAi published articles to date. Its sequence does not share homology with any honeybee
gene and samples treated with GFP-dsRNA are considered as an exogenous control group. Although GFP-dsRNA
is not expected to trigger an RNAi response in treated bees, undesirable effects on gene expression, pigmentation
or developmental timing are usually observed. Is GFP-dsRNA a good control for RNAi assays? To address this
question, we used microarray approach to compare global gene expression differences between untreated
versus GFP-dsRNA-treated adult workers. Second instar larvae received 500ng of GFP-dsRNA mixed with larval
food deposited in the worker brood cells, and other same-aged bees were left to develop without treatment for
experiment control. Treated and untreated larvae were maintained in the colony until adult emergence. The newlyemerged workers were maintained in an incubator at 34ºC and a relative humidity of 80%, and were provided with
water, pollen and sucrose syrup for seven days. Total RNA was extracted from the abdomen (with adhering fat body
and epidermis tissues) and used to synthesize aRNA probes for microarray slides hybridization. Changes in gene
expression (between untreated versus GFP-dsRNA-treated) greater than 1.5 fold were reported. Ten transcripts
were overexpressed in GFP-dsRNA group, being four sequences with no matches when searched against protein
databases. These results suggest that non-coding regulatory sequences were activated. A noteworthy observation
was the differential expression of an intronic transcript, which an in silico analysis indicated a potential microRNA
cluster. Other 33 transcripts were inhibited by GFP-dsRNA, including 24 with well-defined orthologs. The downregulated transcripts are related to protein folding or degradation (4), carbohydrate (3) and lipid (1) metabolism,
transcriptional regulation (3), immune response (2) and general enzymatic activity (5, mainly oxireductase). In
general, the list encompasses gene functions previously described as involved in cell growth, oxidative damage,
infection and stress response. In particular, we highlight two inhibited genes (epoxide hydrolase and esterase) which
products are involved in the degradation of juvenile hormone. This hormone has pleiotropic effects on a wide range
of aspects regarding the social life during the entire life cycle. The number of genes up- or down-regulated by GFPdsRNA is much smaller than we previously expected. Our data indicate that GFP-dsRNA is an effective control and
show the genes that should be avoided as targets for functional experiments using RNAi approach in the honeybee.
Financial support: FAPESP 2005/03926-5 (ZLPS) and 2007/07594-2(FMFN); CNPq 473748/2008-8 (ARB) and UnifalMG (ARB).
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287
Organização e perfil de expressão de genes associados
à neurogênese em castas de abelhas Apis mellifera
Bonatti, V¹*; Bomtorin, AD²; Laure, MAB2; Simões, ZLP3; Barchuk, AR1
Depto. Ciências Biomédicas, Universidade Federal de Alfenas, Unifal-MG. 2Depto. Genética, Universidade de São Paulo-FMRP. 3Depto.
Biologia, Universidade de São Paulo-FFCLRP. *[email protected]
1
Palavras-chave: diferenciação de castas, cérebro, fax, shot, EphR
As abelhas Apis mellifera são insetos eussociais cuja determinação de castas é decorrente da alimentação
diferencial oferecida às larvas. Esta promove diferenças nos títulos de hormônio juvenil entre as larvas que
originarão rainhas e operárias, o qual conduz ao estabelecimento de diferentes redes de expressão gênica próprias
de cada casta. Dentre as diversas diferenças morfológicas entre operárias e rainhas adultas podemos citar as
relações de tamanho total do cérebro/tamanho do corpo e volume dos corpos cogumelares/volume do cérebro
que são notavelmente maiores em operárias. Os corpos cogumelares são estruturas envolvidas com o aprendizado
e a memória, e responsáveis por processar e armazenar a informação olfatória. Nosso objetivo foi identificar
genes potencialmente responsáveis pela neurogênese diferencial em castas de A. mellifera. A partir de estudos de
hibridação de microarrays de cDNA de diversas fases do desenvolvimento de A. mellifera, foram encontrados 240
genes diferencialmente expressos no período crítico da diferenciação das castas (Barchuk et al., BMC Dev Biol, 2007).
Destes, sete genes participam do desenvolvimento neural de Drosophila e de vertebrados e se mostraram mais
expressos em corpo todo de larvas de operárias: ataxin-2 (atx2), cryptocephal (crc), dachshund (dac), Eph Receptor
(ephR), failed axon connection (fax), short stop (shot) e tetraspanin 5D (tsp5D). Análises in silico revelaram que as
proteínas Atx-2, EphR e Tsp5D possuem peptídeo sinal e EphR, Tsp5D e Shot são proteínas transmembrana. Os
perfis de expressão dos genes correspondentes foram analisados por RT-PCR quantitativa utilizando-se amostras
de RNA de cérebros de operárias e rainhas do terceiro ao quinto estágios larvais. Três grupos de perfis de expressão
puderam ser observados: Os que possuem um aumento contínuo de transcritos, representado pela expressão de
dac e fax; os que possuem um maior nível de transcritos em larvas de quarto estágio, como atx-2, EphR e shot; e
o que possui um declínio no nível de transcritos ao longo do desenvolvimento, como tsp5D. shot, cuja expressão
é crucial para a extensão de axônios, é mais expresso em rainhas no quarto estágio larval, o que pode explicar a
existência de uma área maior ocupada por neuroblastos em rainhas no quinto estágio larval do desenvolvimento
em relação a operárias de mesma fase. Estes resultados sugerem que shot é um elemento chave na neurogênese
diferencial em castas de A. mellifera. Ensaios de avaliação de função mediante RNAi dar-nos-ão informações sobre
os alcances da participação deste gene no desenvolvimento do cérebro em abelhas melíferas comuns.
Apoio Financeiro: CNPq Processo No 473748/2008-8; Unifal-MG; Fapesp
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288
Expressão dos genes codificadores do neurohormônio Bursicona em Apis mellifera e relação com a
diferenciação do exoesqueleto.
Costa, CP¹²; Elias-Neto, M¹; Bitondi, MMG¹
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP
²[email protected]
1
Palavras-chave: Apis mellifera; bursicona; exoesqueleto.
O sucesso evolutivo dos insetos está intimamente relacionado com o exoesqueleto (cutícula), o qual confere
suporte, proteção e em associação com a musculatura propicia a movimentação e locomoção do corpo. O rígido
exoesqueleto, formado principalmente por quitina e proteínas, é ciclicamente substituído para acomodar o
crescimento dos insetos. Este processo, denominado “muda”, envolve intensa síntese de componentes estruturais
da cutícula, organização em camadas e maturação, e sua periodicidade é regulada por uma complexa cascata
endócrina. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho consiste em investigar a contribuição do cérebro para a
diferenciação do exoesqueleto definitivo (adulto) de abelhas Apis mellifera. Como um primeiro passo nesta direção,
determinamos o perfil de expressão por RT-PCR semi-quantitativa e quantitativa dos genes codificadores das
subunidades α e β do neuro-hormônio Bursicona. Os perfis transcricionais gerados mostraram que a expressão
destes genes, denominados Amburs α e Amburs β, aumenta em correlação com eventos marcantes do processo
de diferenciação do exoesqueleto, tais como, deposição de pigmentos na cutícula e intensificação do processo de
esclerotização. A quantificação da expressão de Amburs α e Amburs β através de RT-PCR em tempo real confirmou
que a transição entre a síntese e a diferenciação do exoesqueleto da abelha adulta é caracterizada por um aumento
significativo dos respectivos transcritos (p<0,05) corroborando, assim, a idéia de que em A. mellifera, a atividade dos
genes codificadores de Bursicona é importante na cascata de eventos que induzem a diferenciação, ou maturação,
do exoesqueleto definitivo.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP.
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289
Análise da transcrição de genes candidatos
relacionados à diferenciação de castas em Apis
mellifera
Mori, MC*; Hartfelder, K.
Departamento de Biologia Celular e Molecular e de Bioagentes Patogênicos, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de
São Paulo – USP/SP.
*[email protected]
Palavras-chave: Apis mellifera, genes, expressão, desenvolvimento, castas.
A organização social entre as abelhas é bem caracterizada em Apis mellifera, observando-se a diferenciação
de castas a qual é induzida pela alimentação diferencial no início da terceira fase larval, que desencadeia uma
cascata de reações endógenas, influenciando sobre a expressão gênica. Através do seqüenciamento do genoma
de Apis mellifera, foi possível identificar e anotar genes associados ao processo de diferenciação das castas.
Dois grupos funcionais, genes associados com a regulação do metabolismo e genes envolvidos em processos de
desenvolvimento, foram encontrados em conjuntos de ESTs (Expressed Sequence Tags). Estudos de bioinformática
em bancos de dados experimentais geraram inferências sobre conjuntos de genes co-expressos e a sua possível
interação. Desses genes, os cinco mais divergentes em termos de níveis de expressão em duas determinadas fases
do desenvolvimento de operária e rainha, e com maior número de motivos potencialmente regulados nas suas
regiões a montantes (5’-URL), foram explorados, através da análise da transcrição. Neste trabalho buscamos validar
a expressão de três genes inseridos nestas redes gênicas através de Real Time PCR (qRT-PCR). Como referencia
foram coletadas larvas de rainha e operaria em dois estágios do desenvolvimento. Os resultados obtidos por qRTPCR, foram analisados no programa REST (Relative Expression Software Tool 2008, V2.0.7), utilizando o fenótipo de
rainha como referência. No quarto estágio larval de operária verificou-se uma expressão significativa de 13,5 vezes
maior em relação ao controle para o gene predito GB19006 (a arquitetura protéica demonstrou similaridade com o
domínio DM9 em Drosophila). O gene sesB (stress sensitive B) apresentou uma expressão de 3,5 vezes mais alta no
quinto estágio larval de operária. Entretanto, o gene zeelin1 não mostrou resultados estatísticos significantes. Os
resultados sugerem que especialmente um gene predito (GB19006), mas funcionalmente não conhecido, possam
estar envolvidos na diferenciação de castas.
Apoio financeiro: CNPq e FAPESP.
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290
Expressão gênica diferencial nos ovários de larvas
de Apis mellifera L na fase de desenvolvimento
caracterizada pela morte celular programada
(Hymenoptera: Apidae)
Humann, FC; Hartfelder, K
Departamento de Biologia Celular e Molecular e de Bioagentes Patogênicos, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de
São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil
[email protected]
Palavras-chave: Representational Difference Analysis; morte celular programada; polifenismo; desenvolvimento de castas; micro RNA
A diferença entre os ovários de rainhas, com cerca de 200 ovaríolos, e de operárias, com somente 1-12, é resultante
de morte celular programada que ocorre em ovários de operárias a partir do início da última fase larval. Com
objetivo de elucidar mecanismos moleculares participantes dos processos de diferenciação dos ovários em
ambas as castas, utilizamos a técnica de Representational Difference Analysis (RDA), para identificar genes
diferencialmente expressos. As etiquetas de sequências expressas (ESTs) foram analisadas e, por análises BLAST
agrupadas em ortólogos à Drosophila, genes preditos específicos de Apis, genes similares à miRNAs, além de ESTs
com anotação genômica mas ainda sem produtos preditos em Apis mellifera. Essa última categoria era muito mais
representada em bibliotecas de operárias do que em rainhas, sugerindo uma divergência maior desta casta em
relação às fêmeas típicas de insetos. Informações funcionais relativas aos genes ortólogos de Drosophila e similares
à microRNAs foram atribuídas por análise através do Gene Ontology, mostrando uma distribuição quantitativa
diferente referente aos processos biológicos dos quais participam. Um conjunto de genes mais representativos
tiveram a sua expressão diferencial validada por PCR em tempo real (qRT-PCR). Nessa análise inicial encontramos
quatro sequências diferencialmente expressas que foram mapeadas no genoma, entretanto não estão preditas
como genes ou não apresentam similaridade à qualquer outra sequência disponível em bancos de dados nãoredundantes. Tal situação indica que podemos ter identificado genes novos e possivelmente específicos para
abelhas melíferas.
Apoio financeiro: FAPESP
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291
O gene jazigo e a morte celular programada nos
ovários de abelhas Apis mellifera
Martins, JR1; Dallacqua, RP2; Araújo, LA3; Simon, CR4; Bitondi, MMG2
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP
3
Departamento de Biologia Celular e Molecular e Bioagentes Patogênicos, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP
4
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Triângulo Mineiro – UFTM
[email protected]
1
2
Palavras-chave: gene jazigo, formina, ovário, ecdisteróides, hormônio juvenil
A família de proteínas formina participa na remodelagem do citoesqueleto através da polimerização dos
monômeros de actina. Desta forma, as forminas estão envolvidas no estabelecimento da polaridade celular,
citocinese, tráfego vesicular e sinalização nuclear. Um tipo particular de formina, jazigo, descrita primeiramente em
glândulas salivares de larvas de Drosophila melanogaster, é expressa em resposta ao pico de ecdisona que precede
a muda metamórfica e, aparentemente, tem função na indução da morte celular programada destas glândulas.
Em abelhas Apis mellifera, a morte celular programada tem sido principalmente estudada em relação ao processo
de diferenciação dos ovários. Como consequência da alimentação diferencial recebida durante o desenvolvimento
larval, que sinaliza títulos hormonais casta-específicos, os primórdios de ovaríolos são preservados em rainhas
e são reabsorvidos em cerca de 90% das operárias. Para avaliar a participação do gene jazigo na morte celular
programada dos ovários de larvas de operárias, um fragmento de cDNA que codifica o ortólogo deste gene em
Apis mellifera foi isolado e sequenciado. Este cDNA foi utilizado para identificar uma sequência de 18 éxons no
genoma de A. mellifera, a qual codifica um polipeptídio predito de 1157 aminoácidos (130,89 kDa) que apresenta o
domínio FH2 (formin homology 2), além dos domínios GBD/FH3 (Rho GTPase-binding/formin homology 3) e NLS_
BP (bipartite nuclear localization signal) típicos de forminas. Perfis de expressão estágio-específicos obtidos por
RT-PCR semiquantitativa, revelaram que o mRNA de jazigo é abundante em ovários de larvas e pupas de operárias
em desenvolvimento. Por outro lado, a expressão em ovários de rainha mostrou-se restrita aos estágios pupal e
adulto, com um aumento nos ovários de rainhas ovipositoras. A resposta à variação hormonal foi checada através
do tratamento de pupas de rainhas com hormônio juvenil (HJ) e ecdisteróides. A expressão do mRNA de jazigo foi
suprimida nos ovários de rainhas tratadas com HJ e, em contraposição, estimulada nos ovários de pupas injetadas
com ecdisteróides. Em conjunto, estes dados sugerem participação do gene jazigo na morte celular programada
dos ovaríolos de operárias em resposta à variação hormonal, sugerindo participação deste gene no estabelecimento
das diferenças entre os ovários das castas.
Suporte Financeiro: FAPESP
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292
Regulação hormonal da expressão de genes de morte
celular e relação com a diferenciação dos ovários de
abelhas rainhas (Apis mellifera)
Dallacqua, RP1; Martins, JR2; Araújo, LA3; Simon, CR4; Bitondi, MMG1
Departamento de Biologia – Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Genética – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
3
Departamento de Biológica Celular, Molecular e Bioagentes Patogênicos – Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
4
Departamento de Ciências Biológicas – Universidade Federal do Triângulo Mineiro
[email protected]
1
2
Palavras-chave: hormônio juvenil, ecdisona, ovário, ovaríolos, Apis mellifera
O hormônio juvenil (HJ) tem papel central na sobrevivência dos ovaríolos de larvas de abelhas A. mellifera. Baixos
títulos deste hormônio induzem a morte celular da grande maioria dos primórdios de ovaríolos nas operárias
presuntivas, ao passo que nas rainhas presuntivas, os elevados títulos de HJ impedem a degeneração destes
componentes estruturais dos ovários. O papel do HJ, assim como da ecdisona, na ativação de morte celular tem
sido estudado principalmente nos ovários larvais desta abelha. O presente trabalho tem por objetivo investigar
a influência destes hormônios na atividade dos genes de morte celular e sua relação com a diferenciação dos
ovaríolos durante o estágio pupal. Com esta finalidade, pupas de rainhas foram submetidas a tratamento com HJ
ou ecdisteróides e a expressão dos genes de morte celular programada, assim como os efeitos sobre a estrutura
dos ovários, foram analisados. Algumas horas após a ecdise larval-pupal, 25 pupas de rainhas foram separadas
em 5 grupos, os quais receberam os seguintes tratamentos: aplicação tópica de HJ III (20μg) ou de seu diluente
(acetona); injeção de ecdisteróides (10μg) ou de seu diluente (etanol em ringer, 1:3). O grupo controle não recebeu
qualquer tratamento. Os ovários foram dissecados 48 horas após o tratamento e utilizados para análise da
expressão de 7 genes de morte celular (genes ark, bruce, buffy, jazigo e genes codificadores de duas caspases e
de lisozima) por RT-PCR semiquantitativa e por microscopia confocal (rodamina-faloidina/DAPI). O tratamento
com ecdisteróides promoveu atraso no desenvolvimento dos ovários associado a mudanças estruturais na rede de
actina e ao aumento da expressão de ark, bruce, jazigo e dos genes codificadores de caspases. Em contrapartida,
as pupas tratadas com HJ não apresentaram alteração morfológica dos ovários, embora o desenvolvimento pupal
tenha sido acelerado. Todavia, houve redução de transcritos dos genes ark (ativador de apoptose) e jazigo ( formina
associada à morte celular) nos ovários, sugerindo supressão de morte celular. Estes resultados confirmam o papel
de HJ e de ecdisteróides na repressão/ativação da maquinaria de morte celular e sugerem que diferentemente do
que ocorre nas larvas, onde a morte celular hormônio-dependente causa a redução do número de ovaríolos, nas
pupas, afeta o desenvolvimento, a diferenciação e a estrutura dos ovaríolos.
Suporte Financeiro: FAPESP (05/03926-5 e 05/01974-2)
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CRC e RfaBp na determinação do padrão de
desenvolvimento de operárias de Apis mellifera
Teles, ACAS1; Barchuk, AR2; Simões, ZLP3.
Depto. Genética, FMRP -Universidade de São Paulo-. 2Depto. Ciências Biomédicas, Universidade Federal de Alfenas, Unifal-MG. 3Depto.
Biologia, FFCLRP - Universidade de São Paulo.
1
Palavras-chave: CRC, RFABP, determinação de castas, operárias, expressão gênica diferencial.
As abelhas Apis mellifera são insetos sociais que apresentam dimorfismo e divisão de castas entre as fêmeas. Nesta
espécie, as características casta-específicas são determinadas por alimentação diferencial. A diferenciação entre
rainhas e operárias ocorrerá a partir larvas que seguem duas trajetórias de desenvolvimento distintas, marcadas
por expressão gênica diferencial entre as castas, apesar de terem o mesmo genótipo. Recentemente foi proposto
um modelo para a determinação de castas baseado em dados de expressão diferencial obtidos por hibridação de
microarrays de cDNA durante o período crítico do desenvolvimento pós-embrionário. Para este modelo foram
sugeridos alguns genes determinantes de casta que se mostraram diferencialmente expressos, entre eles usp,
cryptocephal (crc) e retinoid- and fatty acid-binding protein (RfaBp), mais expressos em uma fase do desenvolvimento
de operárias (Barchuk et al., BMC Dev Biol, 2007). Destes genes, crc e RfaBp foram estudados neste trabalho. A
sequência de nucleotídeos de crc, praticamente em sua totalidade, foi obtida através de sequenciamento e se
mostrou idêntica à sequência predita no genoma desta espécie, exceto pelas regiões terminais que não foram
sequenciadas. Além disto, mostrou similaridades com as sequências de CRC e seu homólogo ATF-4 em outras
espécies de insetos, invertebrados e até mesmo em vertebrados, o que provavelmente está relacionado com a
presença de um domínio nesta proteína que é altamente conservado na maioria dos eucariotos, o domínio bZIP, e
também com a função semelhante desempenhada por crc/atf-4, como fatores de transcrição. Para o RfaBp, apenas
um pequeno fragmento foi sequenciado. Este fragmento mostrou alta similaridade com a sequência predita e
alinhamentos mostraram que apenas quando comparado ao RfaBp de outro Hymenoptera, Nasonia vitripennis,
mostrou alto grau de identidade. Apesar disto, a sequência deste gene mostrou grande similaridade com a
sequência de RFABP de Drsosophila, sugerindo que, como na mosca, este gene em abelhas possa desempenhar
papéis no transporte de lipídeos, como, por exemplo, o hormônio juvenil. Com a determinação do perfil de
expressão dos dois genes foi possível confirmar a expressão diferencial casta específica de ambos, com operárias
apresentando níveis de transcritos significativamente maiores que em rainhas em fases posteriores ao período
crítico de determinação de castas, no 5º estágio larval. Além disto, o perfil de expressão de crc mostra claramente
uma correspondência com os títulos de ecdisteróides, o que sugere sua possível regulação por estes hormônios.
Contrariamente, uma influência de maneira clara destes hormônios sobre RfaBp não foi observada. Tais resultados
sugerem crc e RfaBp como determinantes de castas em abelhas, particularmente reguladores de características
próprias de operárias. Ensaios de avaliação de função mediante RNAi nos darão informação sobre a participação
destes genes no desenvolvimento de operárias de abelhas melíferas.
Apoio Financeiro: Fapesp – Processos Nº 2005/03926-5, 2008/01446-4; FAEPA; CNPq Processo Nº 473748/2008-8,Unifal-MG.
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Amftz-f1 é induzido por hormônio juvenil e seu produto
regula a transcrição de yellow-like e genes cuticulares
em Apis mellifera
Mello, TRP1; Barchuk, AR2; Simões, ZLP1
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo. 2 -Universidade Federal de Alfenas
[email protected]
1-
Palavras-chave: knockdown, microarray, vitelogenina, desenvolvimento pupal, cutícula
β-FTZ-F1 é um fator de transcrição membro da superfamília de receptores nucleares que, em Drosophila
melanogaster, atua no controle da metamorfose. O gene ortólogo em Apis mellifera (Amftz-f1) é expresso em
momentos de baixos títulos de ecdisteróides e tem sua expressão inibida por esses hormônios – características
de genes que codificam fatores de aquisição de competência a hormônios. Além disso, β-FTZ-F1 está envolvido
no controle da expressão de vitelogenina (vg) em Aedes aegypti. A vitelogenina é foco de muitos estudos sobre a
diferenciação de castas em abelhas, pois é precursora do principal componente do vitelo. Nossos estudos anteriores
mostraram que Amftz-f1 é quase 10 vezes mais expresso em rainhas do que em operárias no final do período
pupal, momento em que se observam um discreto aumento nos títulos de hormônio juvenil (HJ) e a retomada da
expressão de vg. Ademais, o knockdown de Amftz-f1 leva a uma menor expressão de vg. Para testar a hipótese de
que AmFTZ-F1 seria o mediador da ação do HJ na ativação da expressão de vg no final do período pupal, foram
testados os efeitos do HJ sobre sua expressão. 10μg de HJ aumentam significativamente a expressão de Amftz-f1
1h, 12h e 24h após o tratamento. Paralelamente, com o objetivo de encontrar alvos adicionais de AmFTZ-F1, foi
feita uma análise por microarray de amostras de RNA total de pupas injetadas com dsRNA de Amftz-f1 (dsAmftz-f1
– knockdown de Amftz-f1), bem como de amostras controles de pupas injetadas com dsGFP. Foram encontrados
48 genes cuja expressão é mais alta nos controles e 57 cuja expressão é mais alta nas abelhas knockdown. Sete
genes diferencialmente expressos são codificadores de componentes estruturais da cutícula. β-FTZ-F1 também
participa da ativação da expressão de genes de proteínas cuticulares em D. melanogaster e Bombyx mori. Além disso,
foi observada a maior expressão de um gene similar a yellow-d no grupo controle. Juntamente com as proteínas
da geléia real, as proteínas yellow formam uma família ainda pouco estudada em insetos, mas com várias funções
sugeridas. Em D. melanogaster, membros da família yellow influenciam na pigmentação e melanização da cutícula,
no comportamento sexo-específico e na formação do ovo. Nossos resultados indicam que Amftz-f1 é um gene
sensível aos níveis de HJ e que seu produto regula a expressão de genes cuticulares e, pela primeira vez, de yellowlike no desenvolvimento pupal de Apis mellifera.
Apoio financeiro: FAPESP (No. 2005/03926-5) e FAEPA.
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Ultrabithorax e a definição do padrão de cerdas nas
pernas posteriores em castas de Apis mellifera
Barchuk, AR1; Bomtorin, AD2*; Cristino, ADS3; Moda, LMR2; Soares, MPM4; Laure, MAB2; Faccioli, RA5;
Bitondi, MG4; Simões, ZLP4
Depto. Ciências Biomédicas, Universidade Federal de Alfenas, Unifal-MG; 2Depto. Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo; 3IFSC, Universidade de São Paulo, 4Depto. Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto, Universidade de São Paulo, 5EESC, Universidade de São Paulo.
[email protected]
1
Palavras-chave: diferenciação de castas, abelhas, microarray, Abd-a, RfaBp
A diferenciação morfo-fisiológica entre rainhas e operárias de Apis mellifera decorre da alimentação recebida
durante o desenvolvimento larval, que estimula o aumento da produção de Hormônio Juvenil (HJ) nas larvas que
originarão rainhas. Dentre as diversas diferenças morfológicas entre operárias e rainhas encontram-se as estruturas
especializadas para a coleta de pólen e própolis modeladas por arranjo diferencial de cerdas. Estas estruturas,
localizadas na região da tíbia e do basitarso das pernas posteriores de operárias, já estão formadas na fase de pupa
de olho marrom. Análises de microarrays de oligonucleotídeos utilizando-se pernas de pré-pupas de operárias e
rainhas revelaram 50 genes preferencialmente expressos em operárias, dos quais 45 possuem ortólogos conhecidos
em Drosophila; em rainhas foram encontrados 89, sendo que 71 possuem ortólogos em Drosophila. Os perfis de
expressão de genes relacionados ao desenvolvimento de pernas e de cerdas dos insetos [abdominal-A (abd-A),
ataxin-2, cryptocephal, dachshund, distal-less, grunge, Retinoic and fat acid Binding Protein (RfaBP) e ultrabithorax
(ubx)] foram analisados por RT-PCR quantitativa em tempo real em operárias e rainhas. Destes, ubx e abd-A são
mais expressos em operárias ao final do desenvolvimento larval e início do desenvolvimento pupal. Por outro lado,
o gene RfaBp, assim como nos resultados de hibridação de lâminas de microarrays, é mais expresso em pernas
de pré-pupas de rainhas. Imunolocalizações de Ubx em pernas posteriores de pré-pupas de operárias e rainhas
revelam a presença desta proteína na tíbia e no basitarso de operárias e apenas no basitarso de rainhas. Em pupas
de olho branco, Ubx concentra-se na tíbia de operárias e no basitarso de rainhas. Entretanto, em pernas de prépupas de operárias e no basitarso de pupas de rainhas há grupos de células que não expressam Ubx. Estes grupos
de células possuem arranjos semelhantes aos das cerdas das pernas do adulto. Estes resultados indicam que abd-A
e RfaBp estão envolvidos no desenvolvimento diferencial das pernas em castas de A. mellifera e sugerem que ubx
define o padrão de cerdas nas estruturas coletoras de pólen destes apêndices.
Apoio Financeiro: FAPESP No. 05/03926-5; Unifal-MG
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Amplificação de um gene precursor de hormônio
juvenil em abelha Melipona interrupta (Hymenoptera,
Apidae)
Brito, DV1; Viana, LS1; Nunes-silva, CG2; Bonetti, AM3; Torres, EC M2; Carvalho-Zilse, GA1
1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia; 2Centro Universitário Nilton Lins; 3Univesidade Federal de Uberlândia
Palavras-chave: hormônio juvenil; ácido farnesóico o-metiltransferase; Melipona interrupta; determinação de castas; abelhas sem
ferrão.
Hormônios juvenis regulam diversos aspectos da fisiologia, embriologia e reprodução de insetos. Em organismos
sociais da ordem Hymenoptera, esse hormônio tem particular importância nos processos do desenvolvimento
que levam a determinação de castas. Nas abelhas sem ferrão, cuja determinação de castas é de origem genéticoalimentar, a condição limiar de hormônio juvenil permite o surgimento de rainhas (em uma proporção de até
25%), o qual é condicionado pela heterozigose de dois genes. O estudo de aspectos moleculares referentes à rota
metabólica de formação do hormônio juvenil pode auxiliar o esclarecimento dos mecanismos envolvidos na
determinação de castas nessas abelhas. Dessa forma, o presente trabalho objetivou verificar a expressão de um
dos precursores do hormônio juvenil (o ácido farnesóico o-metiltransferase) em diferentes estágios, sexos e castas
de Melipona interrupta. O RNA total de larvas de ultimo estádio ( fases pré-defecante e pré-pupa) e de indivíduos
adultos (macho, rainha e operária) foi extraído com o kit Trizol Reagent (Invitrogen). A partir do RNA total extraído
foram sintetizadas as primeiras fitas de cDNA com o kit M-MuLV Reverse Transcriptase (Fermentas). O gene famet,
que codifica para o ácido farnesóico o-metiltransferase, foi amplificado utilizando-se iniciadores desenvolvidos
para Melipona scutellaris. O fragmento amplificado foi inserido no vetor de clonagem pGEM®-T easy e transformado
em Escherichia coli Mos blue. Os clones classificados como recombinantes foram selecionados por PCR de colônia.
O DNA plasmidial dos clones escolhidos foi extraído pelo kit Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System e
usado como molde para uma reação de seqüenciamento com os iniciadores específicos para o vetor. A amplificação
de um fragmento com o tamanho esperado (aproximadamente 400 pb) ocorreu somente nas rainhas indicando
uma expressão diferencial deste hormônio na produção de rainhas também para esta espécie de Melipona.
Financiamento: CNPq, FAPEAM, FINEP
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297
Quantificação relativa da expressão gênica de rainhas,
operárias, machos haplóides e diplóides de Melipona
quadrifasciata (Hymenoptera: Apidae).
Borges, AA1; Humann, FC2; Hartfelder, K2; Judice, CC3; Campos, LAO1; Tavares, MG1
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa – UFV/MG.
Departamento de Biologia Celular e Molecular e de Bioagentes Patogênicos, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – Universidade de
São Paulo – USP/SP.
3
Laboratório de Fisiopatologia Cardiovascular. Faculdade de Ciências Médicas – Universidade Estadual de Campinas – UNICAMP.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Melipona quadrifasciata, abelhas, machos diplóides, Real Time PCR, expressão gênica.
Em Melipona quadrifasciata, assim como na maioria dos Hymenoptera, ovos fertilizados dão origem a fêmeas,
ovos não fertilizados originam machos haplóides e ovos fertilizados que apresentam homozigose no loco da
determinação sexual se desenvolvem em machos diplóides. A base genética da determinação do sexo nos
organismos haplodiplóides é variada, mas geralmente envolve a complementaridade de alelos em um ou mais
locos sexuais, iniciando uma cascata gênica que culmina na diferenciação fenotípica dos sexos. Machos diplóides,
gerados como produto de endogamia, geralmente, apresentam fertilidade reduzida. Neste trabalho, investigamos
de forma comparativa a expressão gênica de rainhas, operárias, machos haplóides e diplóides de M. quadrifasciata.
Clones de ESTs gerados a partir de bibliotecas subtrativas (RDA - Judice et al., 2006) foram utilizados para gerar
microarranjos e os genes que nestes apresentaram maior diferença em seus níveis de expressão entre rainhas
e operárias foram selecionados para compor um estudo mais detalhado por análise de RT-PCR em tempo real.
Amostras de rainhas, operárias e machos haplóides recém-emergidos e com cinco dias de idade da fase adulta e,
machos diplóides obtidos através de cruzamentos endogâmicos foram coletadas. Estas amostras foram utilizadas
para extração de RNA e amplificação com primers gene-específicos. Inicialmente focalizamos em quatro genes
associados à regulação de desenvolvimento larval ou pupal e atividade transportadora de aminoácidos. A
quantificação de transcritos foi realizada por meio da incorporação do fluoróforo SYBRGreen. Para a quantificação
relativa da expressão gênica foi empregado o método comparativo Ct (Pfaffl, 2002), tendo a amplificação do
gene rp49 como controle endógeno. Para a fase de abelhas adultas recém emergidas não encontramos diferença
estatisticamente significativa entre machos diplóides e os demais fenótipos. No entanto, ao atingir cinco dias de
idade da fase adulta, diferenças de expressão estatisticamente significativas foram encontradas entre machos
diplóides e haplóides (p=0,025), onde os machos haplóides em média apresentaram expressão relativa 2,17 vezes
menor para o conjunto de genes estudados, em relação aos machos diplóides. Diferenças entre machos diplóides
e rainhas também foram observadas (p=0,005), com expressão 3,05 vezes aumentada para as rainhas comparado
aos machos diplóides. Verificou-se, ainda que a expressão gênica relativa dos machos diplóides é estatisticamente
similar à de operárias de cinco dias de idade adulta, considerando os quatro genes analisados. Este resultado
preliminar corrobora os dados de que a diferença entre machos diplóides e operárias pode estar associada a
homozigose do loco sexual nos machos diplóides.
Apoio financeiro: CNPq, FAPESP e FAPEMIG.
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Análise da variabilidade genética de populações
naturais de Melipona quadrifasciata (Hymenoptera:
Apidae) através do uso de marcadores microssatélites
Durvale, MC; Reis, EP; Fernandes-Salomão; TM, Campos, LAO; Tavares, MG
Palavras-chave: Hymenoptera, Melipona, microssatélites, variabilidade genética, conservação
Melipona quadrifasciata é uma espécie de abelha nativa desprovida de ferrão, amplamente encontrada ao longo
de grande parte do território brasileiro. Seus hábitos alimentares a torna importante agente polinizador de várias
espécies vegetais características da Mata Atlântica, sendo que algumas destas podem ter sua sobrevivência
comprometida na falta dessas abelhas. Atualmente são reconhecidas duas subespécies: Melipona quadrifasciata
anthidioides Lep. e Melipona quadrifasciata quadrifasciata Lep. Elas se distinguem tanto pela distribuição
geográfica quanto por aspectos morfológicos. No entanto, híbridos das duas subespécies são encontrados em
regiões intermediárias às áreas ocupadas por cada uma. Este trabalho teve como objetivo analisar, através da
análise de regiões microssatélites, a variabilidade genética intra e interpopulacional de M. quadrifasciata coletadas
em Domingos Martins/ES, Urucuia/MG, Januária/MG, Rio Vermelho/MG, Itaiópolis/SC, Içara/SC e Porto Alegre/
RS. Ao todo foram estudados 118 indivíduos, cada um proveniente de uma colônia localizada em uma das sete
cidades citadas. O DNA genômico destas amostras foi extraído conforme metodologia descrita por Waldschmidt
et al. (1997) e amplificado utilizando-se sete primers microssatélites especificamente desenhados para M.
quadrifasciata. Os produtos de PCR foram separados em gel de poliacrilamida 8%, corados por impregnação com
nitrato de prata e analisados com uso do software PopGen1.32. Os resultados permitiram a detecção de quatro
locos polimórficos, os quais apresentaram três alelos cada. Os valores de diversidade genética de Nei (1973) para
os diferentes locos variaram de 0,05 a 0,59 (média: 0,27) e as distâncias genéticas entre as sete populações variaram
de 0.005 a 0.227. As populações analisadas apresentaram alta diferenciação genética (FST = 0,25). A análise de
agrupamento demonstrou a formação de dois grupos. As populações provenientes de Domingos Martins, Urucuia
e Içara formaram o primeiro grupo, enquanto o segundo agrupou as populações de Rio Vermelho, Itaiópolis e
Porto Alegre. A população de Januária foi a mais distante de todas as outras populações analisadas, permanecendo
isolada nesta análise. Segundo os resultados obtidos, para um melhor entendimento da variabilidade genética
destas duas subespécies de M. quadrifasciata serão necessárias análises envolvendo um maior número de locos e
populações.
Apoio Financeiro: FAPEMIG (CRA-APQ-00376-08), UFV
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Transcriptoma parcial de Corpora allata de melipona
scutellaris (Hymenoptera, Meliponini)
Amaral, IMR1; Ueira-Vieira, C1; Redondo, RAF1, Serrão, JE2; Sousa, CR1; Laure, MB3, Goulart, LR4; Kerr, WE1,
Bonetti, AM1
Universidade Federal de Uberlândia, Instituto de Genética e Bioquímica, Laboratório de Genética.
Universidade Federal de Viçosa, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Departamento de Biologia Geral.
3
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP, Laboratório de Genética.
4
Universidade Federal de Uberlândia, Instituto de Genética e Bioquímica Laboratório de Nanobiotecnologia.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: transcriptoma, abelha sem ferrão, determinação de castas.
Em abelhas do gênero Melipona, a determinação de casta se processa por mecanismo peculiar, que envolve genética
e condições ambientais (alimento). As glândulas endócrinas corpora allata (CA) são responsáveis pela produção
do Hormônio Juvenil, principal hormônio que regula a determinação de casta e o polietismo etário em abelhas.
Para construção de uma biblioteca de cDNA de CA foram utilizados indivíduos nas fases de Larva L3 e Larva PréDefecante de Melipona scutellaris. A extração de mRNA foi feita utilizando Micro-FastTrack™ 2.0 mRNA Isolation Kit
(Invitrogen) e o banco de cDNA de corpora allata foi construído utilizando CloneMiner™ cDNA Library Construction
Kit (Invitrogen). As bactérias foram eletroporadas e plaqueadas para avaliar a eficiência. A biblioteca apresentou
uma eficiência de 6,9x105 clones. Os clones já sequenciados e analisados por bioinformática revelaram novos genes
expressos em CA de M. scutellaris. Um desses genes corresponde ao gene codificador de heat shock protein (HSP 90)
com similaridade de 92% com Bombus terrestris e de 90% com Apis mellifera. A identificação de genes expressos nos
CA de M. scutellaris acrescentará dados às análises das vias de biossíntese de Hormônio Juvenil e de mecanismos
moleculares relacionados aos processos biológicos de determinação de castas.
Apoio financeiro: FAPEMIG, CAPES, CNPq, UFV e UFU.
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300
Quantificação do conteúdo de dna nuclear de espécies
do gênero Melipona (Hymenoptera: Apidae)
Soares, FF¹; Tavares, MG²; Carvalho, CR¹
¹Laboratório de Citogenética e Citometria, DBG, UFV.
²Laboratório de Biologia Molecular, DBG, UFV.
¹[email protected]
Palavras-chave: Hymenoptera, Melipona, citometria de fluxo, quantificação de DNA, valor 1C
As abelhas sem ferrão do gênero Melipona representam um grupo de cerca de 40 espécies neotropicais que
possuem grande diversidade, abundância, importância ecológica e econômica, devido à polinização de plantas
nativas e cultivadas. Estudos citogenéticos demonstraram que a maioria das espécies deste gênero possui
número cromossômico igual a 2n = 18. A distribuição e o conteúdo de heterocromatina, entretanto, variam entre
as diferentes espécies e tem permitido a divisão destas abelhas em dois grupos. Este padrão de distribuição da
heterocromatina pode contribuir para variações de conteúdo de DNA total e consequentemente inferir dados
para o estudo da filogenia do gênero Melipona. O conhecimento do tamanho do genoma das espécies deste gênero,
também pode fornecer dados comparativos em vários níveis taxonômicos, estudos filogenéticos e para uso em
projetos de sequenciamento genômico. O presente trabalho teve como objetivo quantificar o conteúdo de DNA
nuclear de espécies do gênero Melípona e verificar se esses dados podem ser correlacionados com a classificação
citogenética dessas espécies em dois grupos, realizada com base no conteúdo de heterocromatina das mesmas.
As amostras de pupas de Melipona foram preparadas a fim de se obter núcleos para análise no citômetro de fluxo
(Partec®) e assim mensurar o DNA. Os gânglios cerebrais foram retirados em solução fisiológica e celularizados em
pistilo. A suspensão nuclear foi centrifugada, corada com iodeto de propídeo e processada em citômetro de fluxo.
Os resultados parciais para 17 espécies possibilitaram diferenciar 6 espécies com baixo e 11 com alto conteúdo de
DNA (valor 1C = 0,29 pg e 0,98 pg em média, respectivamente). Esses dados parciais fazem parte de um projeto de
estudos filogenéticos e prospecção dos indivíduos do gênero Melipona sobre a diversidade do tamanho do genoma
no gênero.
Apoio financeiro: FAPEMIG
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301
Variação populacional em Melipona mondury no estado
da Bahia, utilizando caracteres morfométricos
Viana, MVC1; Nunes, LA2; Sampaio, RF1; Santana, PS; Vivas, CV1; Siqueira, S1; Waldschmidt, AM1;
Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia – UESB, Jequié – BA
Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz – ESALQ, Piracicaba - SP
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Melipona mondury, Morfometria e Divergência genética
A espécie Melipona mondury, conhecida como uruçu amarela, está distribuída ao longo da Mata Atlântica
nos estados da Bahia, Espírito Santo, Rio de Janeiro, Minas Gerais, São Paulo, Paraná e Santa Catarina. Dados
morfométricos são muito utilizados em estudos de variação geográfica e estrutura genética em populações de
abelhas. Este trabalho teve como objetivo estudar a divergência genética entre colônias de M. mondury, utilizando
caracteres morfométricos das asas anterior e posterior de operárias, oriundas das localidades de Jequié, Itabuna,
Camamu, Apuarema, Itacaré, Teixeira de Freitas, Posto da Mata, Igrejinha e Uruçuca, do estado da Bahia. Foram
utilizados 10 indivíduos de 12 colônias. As asas anterior e posterior foram retiradas, fixadas em lâminas com
cola branca diluída em água destilada, e sobrepostas por outra lâmina, tendo as laterais fixadas com massa para
modelar. As lâminas foram escaneadas na resolução de 1200dpi, por um scanner modelo HP Scanjet 2400. As
medidas morfométricas foram realizadas com o auxílio do software Image-Pro Plus (versão 4.5.0.29). As medidas
utilizadas foram: maior comprimento da asa anterior e posterior (CA e CP), maior largura da asa anterior e posterior
(LA e LP), maior comprimento da nervura radial das asas anterior e posterior (AR e PR), maior comprimento da
nervura medial + cubital da asa anterior (M+Cu), maior comprimento da nervura medial da asa anterior (AM),
maior comprimento da nervura anal anterior (AA), maior comprimento da nervura radio sectar + medial - 1º
(RS + M), maior comprimento da nervura radio sectar + medial - 2º (RS + M), maior comprimento da nervura
cubital das asas anterior e posterior (ACu e PCu), comprimento da nervura medial-cubital (M-Cu) e comprimento
da nervura radial sectar da asa posterior (PRs). Utilizando-se o programa SAS (2007), foram realizadas análises
multivariadas (MANOVA), apresentando significância (p<0.01) e análises das Variáveis Canônicas (AVC). Para AVC
foram necessárias as três primeiras variáveis canônicas para acumular cerca de 80% da variação total disponível,
distribuídas da seguinte forma: 53% para a primeira, 18% para a segunda e 9% para a terceira variável canônica,
viabilizando o estudo da divergência genética entre as colônias. Foi possível observar a formação de um grande
grupo constituído por Jequié, Uruçuca, Apuarema, Itabuna, Itacaré, Igrejinha e Teixeira de Freitas e separado dos
municípios Camamu e Posto da Mata que também divergiram entre si. Os resultados apresentados corroboram a
hipótese que há fluxo gênico entre populações locais. Entretanto, Teixeira de Freitas e Igrejinha, apesar de serem
regiões mais próximas geograficamente, a proximidade de Igrejinha com Itacaré e distante de Teixeira de Freitas
provavelmente ocorreu pelo transporte de colônias por meliponicultores, prática comum em diversas localidades
na Bahia. Posteriormente, serão realizadas análises moleculares para observar se há variação no genótipo assim
como observada no fenótipo.
Apoio Financeiro: UESB
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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302
Variação genética entre populações de Melipona
scutellaris Lep. (Hymenoptera: Meliponini)
no estado da Bahia por ISSR
Almeida, BS1; Miranda, EA1; Batalha-Filho, H2; Alves, RM3; Fernandes-Salomão, TM4; Tavares, MG4;
Campos, LAO4; Waldschmidt, AM1
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia;
2
Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Universidade de São Paulo; 3Escola Agrotécnica Federal de Catu.
4
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa;
[email protected]
Palavras-chave: Estrutura genética, Melipona scutellaris, ISSR, Conservação, Abelha.
Melipona scutellaris, popularmente conhecida como uruçu verdadeira ou uruçu do nordeste, foi uma das primeiras
espécies de abelhas indígenas sem ferrão a ser domesticada. Sua área de ocorrência é da Bahia até o Rio Grande
do Norte. O presente trabalho estimou a diversidade genética em Melipona scutellaris utilizando marcadores ISSR
(Inter Simple Sequence Repeat). As amostras foram oriundas de 52 colônias das localidades de Rui Barbosa, Mundo
Novo, Andaraí, Lafaiete Coutinho e Pojuca, no Estado da Bahia. O DNA genômico total foi extraído e amplificado
pela técnica de PCR-ISSR, utilizando-se cinco primers (UBC-808, UBC-807, UBC-809, UBC-11, UBC-841). Para
a estimativa da diversidade genética foram realizadas as seguintes análises: percentual de locos polimórficos,
diversidade gênica (He), AMOVA, ΦST e análise de agrupamento (UPGMA) utilizando-se o índice de DICE. Para
as análises foram utilizados os programas TFPGA 1.3, ARLEQUIN 3.11 e GENES. Os primers analisados geraram
um total de 42 bandas e um percentual de locos polimórficos de 0,4762 (critério de polimorfismo de 99%). Os
primers UBC-811 e UBC-807 apresentaram o maior número de bandas (11) e o primer UBC-857 apresentou o
menor (6). O reduzido valor da diversidade gênica não-viesada (He) (Nei, 1978) de 0,2137 concorda com estudos
prévios para outras espécies de Melipona, e possivelmente está relacionado com sistema reprodutivo da espécie.
Na análise de agrupamento não foi observada estruturação genética entre as localidades analisadas. A AMOVA
mostrou que o maior percentual de variação está dentro das localidades (82,4%) e o valor de ΦST foi de 0,1759 (p
< 0,00001), também evidenciando ausência de estruturação entre as localidades. O valor de ΦST observado pode
ser considerado reduzido quando comparado com valores obtidos em outros estudos com Melipona onde foi
observada estruturação genética. Nunes et al. (2007) analisando populações de M. scutellaris no estado da Bahia
por meio de morfometria das asas observou estruturação entre as populações em função do gradiente altitudinal.
Entretanto, os dados deste estudo não corroboram essas observações. A incongruência entre estes estudos pode
estar relacionada à ausência de neutralidade do caráter morfológico (nervuras das asas), o que formaria grupos
em função da seleção entre diferentes altitudes. Os resultados do presente estudo são preliminares e uma análise
mais detalhada da variabilidade e estrutura genética desta espécie serão realizados para se entender o padrão de
estruturação geográfica.
Apoio Financeiro: FAPEMIG, UESB, CNPq.
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Construção de primers microssatélites para a espécie
Melipona Scutelaris (Hymenoptera: Apidae)
Passamani, PZ; Pietrani, NT; Benevenuto, J; Resende, HC; Salomão, TMF; Campos, LAO; Tavares, MG.
Departamento de Biologia Geral, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Federal de Viçosa (UFV).
[email protected]
Palavras-chave: Melipona, variabilidade genética, microssatélites, Hymenoptera, conservação.
Melípona scutellaris, popularmente conhecida como uruçu é uma abelha sem ferrão nativa do Brasil. Ela se destaca
pelo seu tamanho relativamente grande (semelhante ao de Apis), pela alta produção de mel entre os meliponinos
e pela facilidade de manejo. Esta abelha é encontrada em todo o nordeste brasileiro, principalmente, no estado da
Bahia. Estudos sobre a variabilidade genética deste inseto poderão fornecer dados relevantes para a manutenção
da variabilidade genética e do fluxo gênico entre colônias de diferentes localidades e poderão contribuir para o
desenvolvimento de estratégias que visem a preservação e exploração racional dessa espécie. Assim, este estudo
teve como objetivo a construção de primers microssatélites específicos para esta espécie. Para isso, o DNA extraído
de um indíviduo de M. scutellaris foi amplificado utilizando-se 28 primers ISSR e analisado em gel de agarose
1,5%. Destes, 13 primers (808, 815, 816, 825, 827, 834, 841, 844, 848, 874, 880, 889 e C) foram selecionados por
apresentarem um maior número de bandas amplificadas. Os fragmentos amplificados foram ligados no vetor de
clonagem pGEM-T Easy (Promega), seguindo instruções do fabricante. Depois de transformação em Escherichia
coli DH5α, insertos de 35 clones positivos foram seqüenciados. Verificou-se que os fragmentos seqüenciados
apresentavam regiões microssatélites e, a partir de algumas destas seqüências, foram desenhados 24 primers
microssatélites específicos para a espécie M. scutellaris. Até o momento, cinco destes primers já foram testados em
vinte indivíduos de uma população de M. scutellaris para se verificar o número de alelos presentes nesta população
e a heterozigosidade observada de cada loco. Destes cinco primers, apenas um foi polimórfico, apresentando dois
alelos. Análises futuras, envolvendo os demais primers construídos serão realizadas, a fim de se determinar quais
deles poderão ser utilizados em estudos populacionais, envolvendo esta e outras espécies de abelhas sem ferrão.
Apoio financeiro: FAPEMIG (EDT-522/07), PIBIC/FAPEMIG, CNPq.
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304
Inferências taxonômicas sobre abelhas do grupo
Rufiventris com base em seqüências do DNA mitocondrial
Pires, CV; Lopes, DM; Tavares, MG; Campos, LAO; Fernandes-Salomão, TM
Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa, MG.
[email protected]
Palavras-chave: grupo rufiventris; DNA mitocondrial.
O grupo rufiventris atualmente engloba seis espécies que: Melipona rufiventris (presente em Minas Gerais, Goiás,
Mato Grosso do Sul e São Paulo); M. flavolineata (Amazonas, Maranhão, Pará e Tocantins), M. brachychaeta (Mato
Grosso), M. paraensis (Amapá e Pará), M. dubia (Acre, Amazonas e Rondônia) e M. mondury (Minas Gerais, Bahia,
Espírito Santo, Paraná, Rio de Janeiro, São Paulo e Santa Catarina) (Silveira et al., 2002; Melo, 2003). A identificação
de espécies do gênero Melipona baseada apenas nos caracteres morfológicos é difícil. Análises morfológicas e
moleculares têm sugerido que populações de abelhas de algumas regiões do Brasil, classificadas como Melipona
rufiventris, podem, na verdade, representar um complexo de espécies. Nesse sentido, seqüências parciais dos genes
COICOII e cytB do DNA mitocondrial, de abelhas do complexo rufiventris foram utilizadas para determinar o nível
de diferenciação genética dessas espécies, provenientes de diferentes regiões do Brasil. Além disso, avaliar o status
taxonômico destas abelhas. Para isso, árvores filogenéticas foram obtidas ou inferidas por meio de análises de
Neighbor-Joining, Máxima Parcimônia, Máxima Verossimilhança e por Inferência Bayesiana, utilizando seqüências
das regiões COICOII e cytB de Melipona mondury como grupo externo. Árvores obtidas ou inferidas pelas diferentes
análises utilizadas apresentaram a mesma topologia. Os resultados obtidos sugerem a existência de novas espécies
dentro do grupo rufiventris.
Apoio Financeiro: FAPEMIG
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Construção de primers microssatélites para
Melipona Capixaba (Hymenoptera: Apidae)
Benevenuto, J; Passamani, PZ; Resende, HC; Fernandes-Salomão, TM; Campos, LAO; Tavares, MG
Laboratório de Biologia Molecular
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa.
[email protected]
Palavras-chave: Hymenoptera, Melipona, variabilidade genética, microssatélites e clonagem.
Melipona capixaba, popularmente conhecida como uruçu negra ou pé-de-pau, é uma abelha sem ferrão restrita à
Mata Atlântica. Atualmente, esta espécie é encontrada somente em formações florestais de áreas montanhosas
de alguns municipios do Estado do Espírito Santo. Em 2003, foi considerada uma espécie em extinção pelo
IBAMA. Devido à importância comercial e ecológica destes insetos, estudos sobre a variabilidade genética de
suas populações poderão contribuir para o desenvolvimento de estratégias de conservação que mantenham o
fluxo gênico entre colônias e permitam a exploração racional da espécie. Assim, o objetivo do presente estudo
foi desenhar primers microssatélites espécie-específicos para posterior análise da variabilidade genética de M.
capixaba. Para construção destes, o DNA extraído de um indivíduo de M. capixaba foi amplificado utilizando-se
seis primers ISSR (866, 827, 834, 841, 890 e C). Os produtos de amplificação foram inseridos em vetor pGEM T-easy
e, posteriormente transformados utilizando-se células competentes de Escherichia coli DH5α. Foram selecionados
29 transformantes-recombinantes. O DNA plasmidial foi, então, extraído e sequenciado. Como resultado, verificouse que os fragmentos sequenciados apresentavam regiões microssatélites, permitindo a confecção de 19 primers
específicos para M. capixaba. A temperatura ótima de anelamento destes primers, determinada através de testes
de gradiente de temperatura, variou de 55,0 - 75,5ºC. Estes testes demonstraram ainda que três destes primers
não apresentavam o fragmento do tamanho esperado, observando-se bandas inespecíficas. Análises futuras,
envolvendo os 16 primers selecionados deverão ser realizadas para detecção de polimorfismos populacionais.
Apoio financeiro: FAPEMIG, CNPq, SESU-MEC
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Variabilidade genética e filogeografia de Melipona
capixaba Moure & Camargo (1994) espécie
ameaçada de extinção
Cristiano, MP1; Resende, HC1; Yotoko, KSC1; Tavares, MG1; Campos, LAO1; Fernades-Salomão, TM1
Departamento de Biologia Geral – Universidade Federal de Viçosa – UFV.
[email protected]
1
Palavras-chave: Filogeografia, Genética da Conservação, Citocromo Oxidase I, Variabilidade Genética, Meliponini.
A espécie Melipona capixaba, também conhecida popularmente como “pé de pau” ou “uruçu negra”, é uma
espécie de abelha sem ferrão pertencente à subfamília Meliponinae. Esta espécie é endêmica da região serrana de
Domingos Martins (Espírito Santo), e devido a sua restrita distribuição geográfica e à fragmentação de seu habitat,
esta espécie já se encontra na lista de espécies ameaçadas a extinção do IBAMA desde 2003. O objetivo deste
trabalho foi caracterizar a variabilidade genética e a estrutura populacional de Melipona capixaba, utilizando uma
abordagem filogeográfica com base em polimorfismos do gene mitocondrial COI. Operárias de M. capixaba foram
coletadas em sete municípios do estado do Espírito Santo abrangendo toda a região de ocorrência desta abelha.
O gene COI de 61 indivíduos (um por colônia) foi parcialmente amplificado e seqüenciado. As sequências foram
alinhadas pelo método ClustalW utilizando o programa MEGA 4. Uma rede haplotípica foi construída por meio de
median-joining (Network), e uma árvore filogenética foi estimada com inferência bayesiana. Também foi realizado
uma Análise de Variância Molecular (AMOVA) entre colônias proximamente localizadas. Os testes de neutralidades
Fs de Fu e D de Tajima foram aplicados ao conjunto de dados para avaliar processos populacionais históricos.
Sequências COI com 841 pb foram obtidas, alinhadas e o alinhamento analisado. Foram identificados 814 sítios
conservados, 27 sítios variáveis, 18 sítios parcimoniosamente informativos e nove singletons. A alta quantidade
de A+T (77.97%) observada, condiz com o esperado para DNA mitocontrial de insetos. Os 27 haplótipos obtidos
mostraram diversidade haplotípica (h) de 0,901 (±0,025) e diversidade nucleotídica (π) de 0,00597 (±0,0004). Os
testes de neutralidade mostraram eventos de expansão populacional histórico para M. capixaba (Fs = -11,17165,
p=0,00120; D= -0,41689, p=0,39130). Por meio da rede haplotípica e da inferência bayesiana, três clados distintos
foram evidenciados. Porém, apenas parte destes clados inclui indivíduos geograficamente próximos. A AMOVA
mostrou uma variação dentro dos grupos de 69,55%, indicando que toda a variação genética existente está contida
dentro da população de M. capixaba. Os dados obtidos indicam que a população de M. capixaba ainda mantém
alguma variabilidade genética. No entanto, a manutenção desta variabilidade ainda preservada, requer, como
meio de evitar a extinção desta população, a implementação de programas de manejo, educação ambiental, e uso
sustentável dos recursos naturais desenvolvidos em parceria com os meliponicultures.
Apoio Financeiro: CAPES, CNPq e FAPEMIG
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Melipona capixaba (Hymenoptera: Apidae, Meliponini):
variabilidade genética por PCR-RFLP do rDNA e do mtDNA
Ramos, JC; Dutra-Valente, D; Resende, HC; Tavares, MG; Campos, LAO; Fernandes-Salomão, TM
Centro de Ciências Bológicas e da Saúde, Departamento de Biologia Geral, Setor de Biologia Celular e Biofísica, Universidade
Federal de Viçosa.
[email protected]
Palavras-chave: PCR-RFLP, Hymenoptera, Melipona capixaba, COI e rDNA
A abelha indígena Melipona capixaba, popularmente conhecida como ‘’uruçu preta’’, é endemica das regiões
motanhosas do estado do Espírito Santo no Brasil e está incluída, desde 2003, na lista de espécies ameaçadas
do IBAMA. Com o objetivo de obter subsídeos moleculares que possam ser utilizados na elaboração de plano
de manejo voltado para a conservação dessa espécie, foram realizados estudos de diversidade genética de M.
capixaba coletadas em diferentes localidades abrangendo os municípios de Afonso Cláudio, Alfredo Chaves,
Castelo, Conceição do Castelo, Domingos Martins, Marechal Floriano, Santa Maria de Jetibá, Santa Tereza, Vargem
Alta e Venda Nova do Imigrante. Empregando primers específicos, o DNA genômico de 12 operárias adultas foi
utilizado para amplificar fragmentos de 1850 pb do gene mitocondrial citocromo oxidase subunidade I (COI) e de
3600 pb da região do rDNA nuclear compreendendo os espaçadores intergênicos 1 e 2 e o gene 5.8S (ITS-1/5.8S/
ITS-2). Ambos os produtos PCR COI e ITS-1/5.8S/ITS-2 foram digeridos com 50 enzimas de restrição. O produto
da digestão foi separado por eletroforese em gel de agarose 2% (p/v) ou poliacrilamida 12% (p/v) e os padrões
de restrição foram anotados. As análises posteriores foram realizadas utilizando DNA genômico de 93 operárias.
Os produtos PCR COI foram digeridos com 5 enzimas de restrição (DraI, HinfI, KspAI, MspI e SspI) e ITS-1/5.8S/
ITS-2 com 3 enzimas (HinfI, MspI e TasI), selecionadas entre as 50 endonucleases previamente testadas. Nenhum
polimorfismo foi identificado na região ITS-1/5.8S/ITS-2. A não detecção de polimorfismo nesta região mostra
a fragilidade da espécie em termos de variabilidade. Polimorfismos RFLP foram evidenciados nas sequências
COI e 8 haplótipos mitocondriais (ABABB, AAAAC, BBABB, AAAAA, BAAAC, AAAAD, BABAC e BAABC) foram
identificados. Haplótipos COI compartilhados entre amostras de diferentes localidades também foram observados.
Uma possível explicação para esse compartilhamento de haplótipos é a prática comum na região de transporte
de colônias entre as localidades conduzida por meliponicultores. Os resultados obtidos mostram que esforços no
sentido de conduzir o manejo de M. capixaba devem ser efetuados visando aumentar a diversidade e reintroduzir
colônias em áreas onde esta abelha foi extinta, contribuindo, assim, para a conservação da espécie.
Apoio: FAPEMIG e CAPES
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Estrutura genética entre populações da abelha sem
ferrão endêmica da Caatinga Melipona mandacaia
SMITH 1863 (Hymenoptera, Apidae) por ISSR.
Miranda, EA1; Almeida, BS1; Batalha-Filho, H2; Werneck, MV3; Campos, LAO3; Alves, RMO5; Waldschmidt, AM1
Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia; 2Departamento de Genética e Biologia Evolutiva,
Universidade de São Paulo; 3Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa; 4Escola Agrotécnica Federal de Catu.
[email protected]
Palavras-chave: Diversidade Genética, Estrutura, Melipona mandacaia, Caatinga, ISSR.
A abelha sem ferrão Melipona mandacaia, conhecida popularmente como mandaçaia, é endêmica do semi-árido
do Nordeste e ocorre nos estados da Bahia, Ceará, Paraíba e Pernambuco. Neste estudo foi analisada a estrutura
genética dessa espécie entre diferentes localidades no estado da Bahia. Foram coletadas amostras de 78 colônias
de seis localidades (Uibaí, São Gabriel, Juazeiro, Macururé, Uauá e Serra do Ramalho). Foi extraído o DNA genômico
total de uma operária por colônia e amplificado utilizando-se sete primers ISSR (UBC-807, UBC-889, UBC-855,
UBC-857, UBC-841, UBC-815, UBC-813). Para estimativa da diversidade genética entre as localidades amostradas
foram realizadas as seguintes análises: percentual de locos polimórficos, diversidade gênica (He) AMOVA, ΦST e
análise de agrupamento utilizando-se o índice de DICE. Para as análises foram utilizados os programas TFPGA
1.3, ARLEQUIN 3.11 e GENES. Os primers analisados geraram um total de 70 bandas com um polimorfismo 50%
(critério de polimorfismo de 99%). O primer UBC-889 apresentou o maior número de bandas (16) e o primer UBC813 apresentou o menor (6). A diversidade gênica não-viesada (He) (Nei, 1978) foi 0,1999. A análise de agrupamento
(UPGMA) entre as amostras analisadas mostrou ausência de estruturação entre as localidades. Na análise de
variância molecular (AMOVA) foi evidenciado um maior percentual de variação dentro das localidades (83,27%)
e um ΦST de 0.1673 (p < 0,00001). O valor de ΦST observado pode ser considerado reduzido quando comparado
com valores obtidos em outros estudos com Melipona onde foi observada estruturação genética. Os resultados
indicam reduzidos valores de diversidade genética e ausência de estruturação entre as localidades analisadas.
Estudos prévios com outras espécies de Melipona também mostram reduzidos valores de diversidade genética.
Esses valores podem ser justificados pelo sistema reprodutivo da espécie, sendo que a rainha virgem que dará
origem a um novo ninho copula com um único macho, e a mesma não fundará o ninho a longas distâncias, pois
dependerá do ninho mãe para se estabelecer. A ausência de estruturação observada na análise de agrupamento,
AMOVA e ΦST pode ser resultado de fluxo gênico natural (através dos machos) ou artificial (troca de colônias
entre meliponicultores). Os resultados do presente estudo são preliminares e uma análise mais detalhada sobre a
variabilidade genética e a estrutura genética desta espécie no Estado da Bahia serão realizados visando contribuir
para programas de manejo e conservação desta espécie endêmica do semi-árido nordestino.
Apoio Financeiro: FAPESB, UESB e CNPq.
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Grau de parentesco em colônias naturais
e manipuladas de Melipona bicolor (Apidae: Meliponini)
Reis, EP1; Campos, LAO1; Tavares, MG1
Laboratório de Biologia Molecular
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Departamento de Biologia Geral, Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais, Brasil - UFV.
[email protected]
1
Palavras-chave: Hymenoptera, Melipona, Microssatélites, Parentesco, Variabilidade Genética
Melipona bicolor é a única espécie de Meliponini (Hymenoptera, Apidae) que apresenta poliginia facultativa e
duradoura. Assim, o presente trabalho investigou como se distribuiu o grau de parentesco entre as operárias de
M. bicolor de colônias de ninhos naturais e de colméias manipuladas, em diferentes épocas do ano. As colônias
foram amostradas nos meses de março, maio, julho, setembro, novembro/2007 e janeiro/2008. O DNA extraído
dos indivíduos de todas as colônias (n=14) foi amplificado utilizando-se quatro primers microssatélites (Mbi 11,
201, 233 e 278) conforme metodologia descrita por Peters et al. (1998). Calculou-se o grau de parentesco entre as
operárias, para cada colônia, em cada mês amostrado utilizando-se o programa Relatedness 4.2 (Goodnight e
Keller, 1999). O teste t1% de student foi utilizado para comparar as estimativas de parentesco encontradas à média
de 0,75 e assim classificar as colônias em monogínicas ou poligínicas. Todos os quatro locos foram polimórficos,
apresentando 5, 4, 5 e 5 alelos, respectivamente. As freqüências alélicas, juntamente com a análise dos genótipos
das operárias e os resultados do teste t, permitiram classificar as colônias em monogínicas ou políginicas, bem
como identificar casos de substituição de rainhas. A estimativa do parentesco variou de 0,42 ± 0,10 a 0,95 ± 0,04
em colônias monogínicas e de 0,08 ± 0,20 a 0,74 ± 0,13 nas poligínicas. O baixo parentesco (r=0,42) observado em
uma colônia monogínica deve-se, provavelmente, às combinações dos genótipos da rainha e do macho. Neste caso,
a fêmea, de acordo com os genótipos estimados, seria heterozigota e o macho teria um alelo diferente dos dela,
nos locos analisados. Por outro lado, o baixo parentesco nas colônias poligínicas pode ser explicado pela presença
e/ou adoção de rainhas não aparentadas. O alto parentesco em colônias monogínicas corrobora a teoria do
comportamento social proposto por Hamilton (1964). As operárias cuidam da progênie de uma rainha aparentada
ao invés de se reproduzir. Mesmo em colônias poligínicas a estimativa de um alto parentesco entre as operárias
indica a manutenção da estrutura social na colônia.
Apoio Financeiro: FAPEMIG (CBB-245/06), PIBIC/FAPEMIG
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310
Estudo da variabilidade genética (DNA mitocondrial)
numa área de transição entre as subespécies
de abelhas Tetragonisca angustula angustula
e Tetragonica angustula fiebrigi
Cristofolini, C1; Piaz, GK1; Damiani, M1; Dornel, RR1; Vieira, C1; Moretto, G1.
Laboratório de Genética, Departamento de Ciências Naturais, Universidade Regional de Blumenau.
[email protected]
1
Palavras-chave: mtDNA, PCR+RFLP, polimorfismo, Enzima de Restrição e Tetragonica angustula
Os meliponíneos são abelhas sem ferrão que ocupam grande parte das regiões de clima tropical. Uma das
espécies mais encontradas, a Tetragonisca angustula, comumente conhecida com Jataí, tem grande importância
por ser uma abelha higiênica, produzindo um mel de excelente qualidade. O objetivo deste trabalho foi verificar
a existências de polimorfismos do DNA mitocondrial entre populações de Tetragonisca angustula em áreas
geográficas limítrofes entre o Alto Vale do Itajaí e Planalto do estado de Santa Catarina. A técnica utilizada para
o trabalho foi a PCR+RFLP que consistem na amplificação de fragmentos do mtDNA e posteriormente clivá-los
com enzimas de restrição. Para verificar a existências de polimorfismos do DNA mitocondrial entre populações
de Tetragonisca angustula foram coletadas amostras de Lages, representado o Planalto Sul e amostras de Rio
do Sul e Pouso Redondo representando o Alto Vale do Itajaí. As regiões do mtDNA COII, ATPases 8 e 6 e COIII,
16S e 16S, 12S foram amplificadas e submetidas a cinco endonucleases: EcoR I, EcoR V, Hinf I, Hind III e Bcl I.
Foram constatados polimorfismos para a região ATPases 8 e 6 e COIII do mtDNA quando submetidas as enzimas
EcoR I e Hinf I. Também foram observados presença de fragmentos não esperados na amplificação região COI
do mtDNA, ocorrendo apenas nas abelhas da subespécie do Planalto Sul (Tetragonisca angustula fiebrigi). Sendo
assim os marcadores baseados em mtDNA considerados eficientes na detecção de polimorfismo nas subespécies
de Tetratonisca angustula, no presente trabalho mostraram variações entre as populações do Planalto Sul e Alto
Vale do Itajaí principalmente na região ATPases 8 e 6, COIII.
Apoio Financeiro: FAPESC e Pipe/FURB.
55º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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311
Cromossomos Supranumerários em Machos de
Tetragonisca fiebrigi (Hymenoptera: Apidae: Meliponina)
Fernandes, A1; Sampaio, W2; Barth, A3; Campos, LAO2.
Universidade do Estado de Mato Grosso-MT, Depto de Ciências Biológicas, Centro de Pesquisas, Estudos e Desenvolvimento AgroAmbientais – CPEDA.
2
Universidade Federal de Viçosa – MG, Depto de Ciências Biológicas.
3
Universidade Estadual de Santa Cruz-UESC, Programa de Pós Graduação em Genética e Biologia Molecular
[email protected]
1
Palavras-chave: citogenética, cromossomo B, Variabilidade genética e Mato Grosso.
As abelhas da subtribo Meliponina são consideradas importantes polinizadores, sendo responsáveis por até 80%
da polinização de plantas nativas e de várias espécies de plantas cultivadas. Estudos citogenéticos fornecem
dados para um melhor conhecimento da variabilidade genética e de eventos evolutivos das espécies. Uma
importante vertente da citogenética é o estudo dos cromossomos supranumerários que são cromossomos que
não apresentarem segregação mendeliana por apresentarem uma variedade de mecanismos que asseguram o
seu acúmulo no genoma hospedeiro e, em alguns casos são dispensáveis Neste sentido, este trabalho objetivou a
complementação da análise citogenética de cromossomos supranumerários encontrados em Tetragonisca fiebrigi.
Para tanto, foram estudados machos de uma colônia da região de Tangará da Serra – MT (14º 04’ 38’’ S, 57º 03’ 45’’
W). Os cromossomos metafásicos foram obtidos a partir da retirada do gânglio cerebral de larvas de último instar.
O número cromossômico encontrado para os machos mediante a coloração convencional foi de n=19 e a fórmula
cariotípica obtida foi de K = 14AM + 3AMc + 2B. Este resultado divergiu dos obtidos para outras colônias da mesma
área estudada que apresentaram 2n=35 e fórmula cariotípica de 2K = 32 AM + 2AMc + 1B. Na presente análise foram
encontradas diferenças tanto na morfologia quanto no número de cromossomos supranumerários, em relação
aos achados anteriormente. Estudos mais aprofundados utilizando tanto técnicas citogenéticas mais refinadas,
quanto técnicas de Biologia Molecular se fazem necessários para relacionar as diferenças encontradas aqui com a
evolução cariotípica e diversidade genética desta espécie.
Apoio: UNEMAT, UFV, FAPEMAT, FAPEMIG e CNPq.
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312
Diferenciação de duas espécies de Frieseomelitta
von Ihering, 1912 (Hymenoptera, Apidae, Meliponini)
por meio de PCR-RFLP
Carvalho-Filho, AF1; Costa, MA1
Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular - UESC.
[email protected]
1
Palavras-chave: Abelha, enzimas de restrição, mtDNA, polimorfismo.
O gênero Frieseomelitta (Apidae, Meliponini) apresenta uma ampla distribuição geográfica ocorrendo em 14 países
na região Neotropical. Estudos de diversidade genética neste grupo são raros. Análises do DNA mitocondrial
(mtDNA), sobretudo da região CO-I/CO-II, têm sido realizadas em estudos de genética populacional, biogeografia
e filogenia. Estes estudos têm subsidiado propostas conservacionistas, facilitando o conhecimento dos níveis
de preservação e de estrutura populacional de diferentes espécies. O objetivo do presente trabalho foi analisar a
divergência genética entre F. dispar e F. francoi, duas espécies morfologicamente semelhantes e de distribuição
simpátrica, pela técnica de PCR/RFLP na região dos genes CO-I/CO-II do DNA mitocondrial. Estudos citogenéticos
anteriores desenvolvidos com ambas as espécies demonstraram que as mesmas compartilham uma inversão
pericêntrica em um par de cromossomos, destoando do padrão cariotípico encontrado nas demais espécies do
gênero, sugerindo uma divergência evolutiva recente. Os espécimes amostrados foram coletados em seis ninhos
naturais no campo e em ninhos artificiais. O DNA foi extraído do tórax de cinco indivíduos adultos de cada
ninho, seguindo o método por fenol: clorofórmio: álcool isoamílico. Os fragmentos foram amplificados por PCR
e as digestões foram realizadas utilizando as enzimas de restrição HaeIII, SspI e DraI. A visualização das bandas
provenientes da digestão enzimática foi realizada em gel de agarose a 2,0% e corado com brometo de etídeo. Como
controle positivo foi utilizado o produto de PCR da formiga Dinoponera lucida. O tamanho do fragmento CO-I/COII amplificado nas espécies F. dispar e F. francoi se mostrou-se conservado, correspondendo a aproximadamente
630pb. Foi registrada uma diferença interespecífica nos padrões de restrição gerados com as enzimas SspI e DraI. As
análises realizadas indicaram que a técnica de PCR-RFLP da região CO-I/CO-II é uma ferramenta apropriada para
estudos comparativos em grupos de espécies próximas no gênero Frieseomelitta. A utilização de outras enzimas
de restrição poderá revelar outros marcadores moleculares importantes para a identificação destas e de outras
espécies com grande similaridade morfológica.
Apoio financeiro: FAPESB, CAPES, FINEP e UESC
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Caracterização de locos microssatélites na espécie
Frieseomelitta varia (Hymenoptera, Apidae, Meliponini)
Gonçalves, PHP1; Arias, MC1
Laboratório de Genética e Evolução de Abelhas, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo
[email protected]
1
Palavras-chave: microssatélite, primers, variabilidade genética, abelhas sem ferrão
Nos últimos anos devido à devastação das florestas, as abelhas sem ferrão estão sendo seriamente ameaçadas,
pois a maioria delas utiliza ocos de árvores para nidificação. Essas abelhas apresentam grande importância
ecológica, uma vez que são os principais polinizadores de vários ecossistemas. Frieseomelitta varia é uma abelha
sem ferrão caracterizada pela grande corbícula, o que a torna uma grande coletora de pólen. Sua distribuição
natural abrange os estados brasileiros da Bahia, Minas Gerais, São Paulo, Goiás, Tocantins, Mato Grosso e partes
da Bolívia. Acessar a variabilidade genética das populações de abelhas é o principal desafio para a elaboração de
estratégias de conservação, porém a avaliação da estrutura genética dessas populações depende da disponibilidade
de marcadores polimórficos. Portanto, o objetivo deste estudo foi o isolamento e caracterização do primeiro
conjunto de primers para uma espécie de abelha sem ferrão da América do Sul. Através da construção de uma
biblioteca genômica enriquecida para microssatélites foram desenhados primers para a amplificação de 17 locos.
Contudo apenas 9 locos tiveram sucesso de amplificação e um nível de polimorfismo satisfatório. Uma população
de 19 indivíduos de diferentes localidades foi analisada com esses 9 locos. A Ho variou de 0,105 a 0,833 sendo que
a Ho média foi de 0,405. O número de alelos variou de 3 a 16, sendo que o número médio de alelos foi de 9, 80.
A porcentagem de locos polimórficos foi de 100%. Estes primers foram testados em amplificação cruzada em 6
espécies de Meliponini (Paratrigona sp, Scaptotrigona postica, Frieseomelitta flavicornis, Frieseomelitta doederleine e
Schwarziana quadripunctata). Oito locos foram amplificados com sucesso. Os resultados deste estudo demonstram
que este conjunto de primers é bastante promissor e será extremamente útil no estudo genético dos meliponíneos,
visto que até a realização deste trabalho, apenas três espécies (Melipona bicolor, Scaptotrigona postica e Trigona
carbonaria) tiveram locos microssatélites isolados e caracterizados por grupos de pesquisa no exterior.
Apoio financeiro: FAPESP, CAPES
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Múltiplos acasalamentos e diversidade genética
em abelhas indígenas Nannotrigona testaceicornis
Fonseca, AS1; Oliveira, EJF1,2; Assis, AF1; Souza, CCM1; Oliveira, RG3; Contel, EPB1; Soares, AEE1.
Departamento de genética – FMRP-USP
LENT - Departamento de Ciências Biológicas-UEFS (Bahia)
3
UNEC – Centro Universitário de Caratinga - MG
[email protected]
1
2
Palavras-chave: abelhas sem ferrão, microssatélites, sistema de cruzamento, meliponíneos, genética de população
As abelhas são insetos da ordem Hymenoptera e taxonomicamente estão reunidas na superfamília Apoidea. Os
Meliponini, da subfamília Apinae (que inclui outras tribos como Euglossini, Bombini e Apini), são popularmente
chamados abelhas indígenas sem ferrão. Algumas espécies são essenciais para a polinização de grande parte
da flora da Floresta Atlântica, outras plantas selvagens e lavouras. Segundo alguns estudos genéticos, um único
acasalamento parece ser a regra entre as abelhas da tribo Meliponini em contraste com o muito bem conhecido
múltiplo acasalamento das rainhas melíferas. Múltiplos acasalamentos foram relatados para três espécies
de meliponíneos, mas estes não foram suportados em estudos posteriores ou foram limitados o bastante para
manterem o número efetivo de acasalamentos próximos a um. As abelhas Nannotrigona testaceicornis, utilizadas
neste trabalho, são pequenas, possuem o tórax marrom escuro e opaco e não são agressivas. No Brasil, elas são
encontradas na Bahia, Espírito Santo, Goiás, Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo. Foram coletados indivíduos
de ninhos de N. testaceicornis no Campus da USP de Ribeirão Preto (SP), Campinas (SP), Bonfim Paulista (SP),
Uberlândia (MG) e Caratinga (MG). Dez indivíduos (operárias) de cada um dos 32 ninhos foram macerados e
tiveram seu DNA extraído. Foram utilizados dois locos de microssatélites de N. testaceicornis para o estudo de
múltiplos acasalamentos (Ntes50 e 59) e quatro locos para o estudo de diversidade alélica (Ntes34, 41, 50 e 59). Os
resultados estatísticos com o RELATEDNESS software indicaram uma forte associação dos locos estudados com
múltiplos acasalamentos em N.testaceicornis (r = 0.79, p < 0,05). A diversidade genética para os quatro locos foi de
Ĥe = 0,72 (0,64 – 0,89) indicando uma alta variabilidade da espécie. Diferentemente do que é apresentado como um
sistema padrão de acasalamento para abelhas sem ferrão, nossos resultados sugerem que múltiplos acasalamentos
são comuns em N. testaceicornis, pois a troca de rainha não é suficiente para justificar estes resultados.
Apoio Financeiro: BIOTA-FAPESP (2004/15801-0), CNPq, CAPES e FAEPA.
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Variabilidade genética da população de Nannotrigona
testaceicornis (Hymenoptera, Apidae Meliponini)
do campus da USP Ribeirão Preto através de análise
do DNA mitocondrial
Assis, AF 1; Souza, CCM1; Fonseca, AS1; Oliveira, EJF1; Freitas, GS1; Soares, AEE1
Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto USP
[email protected]
1
Palavras-chave: Nannotrigona testaceicornis; Meliponini; mtDNA; Genética de População; RFLP
Nannotrigona testaceicornis é uma abelha eussocial sendo que seus ninhos são largamente encontrados na zona
urbana. Os meliponíneos estão entre os principais polinizadores da flora brasileira, no entanto, muitas espécies estão
seriamente ameaçadas de extinção em conseqüência da perda do habitat e isolamento causados principalmente
pelo desmatamento, uso indiscriminado de defensivos agrícolas e grandes queimadas, pois tais alterações resultam
em ecossistemas fragmentados, formando mosaicos de vegetação remanescente, mergulhados numa paisagem
antropizada. Nesse processo, grandes populações são reduzidas e subdivididas, o que pode acarretar alterações
ecológicas e genéticas tais como na composição de espécies, no comportamento de polinizadores e dispersores,
no sistema de reprodução e no fluxo gênico. Neste contexto percebe-se que acumulo de informações acerca da
genética de populações é importante porque nos permitirá predizer alterações no tamanho populacional bem
como ampliar nossa compreensão do modo de ocorrência e migração entre as localidades. Isto é muito válido
para as abelhas porque elas são sensíveis as alterações ambientais e porque sua informação biológica será útil para
comparação com futuras populações em resposta às mudanças ambientais. O objetivo deste trabalho foi verificar a
variabilidade que genética da população de N. testaceicornis que ocupa o campus da Universidade de São Paulo em
Ribeirão Preto com subseqüentes inferências sobre a colonização da área. O DNA total foi extraído de operárias em
42 ninhos do campus da USPRP, 02 ninhos em RP e 14 em Bonfim Paulista, totalizando 58 indivíduos. Cinco regiões
do genoma mitocondrial (COI/COII; ATPase 8 e 6/COIII; COIII/ND3; CytB/ND1; 16S) foram amplificadas através
de primers heterólogos e digeridas pelas seguintes enzimas de restrição: Alu I, Dra I, Bam HI, Bgl II, Hind III, EcoR V,
Hinf I, Taq I, Rsa I, Ssp I. Os resultados obtidos permitiram delinear as regiões mitocondriais que acumularam mais
trocas de bases e as enzimas mais efetivas em detectá-las. Entre os ninhos amostrados não foram encontrados
polimorfismos. Este fato nos indica que este agrupamento de populações possui uma origem comum.
Apoio Financeiro: CNPq e FAEPA
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Caracterização de locos microssatélites
em Scaptotrigona aff depilis para estudos
de agregações de ninhos
Souza, CCM1; Freitas, GS1; Baptistela, ARTO2; Assis, AF1; Fonseca, AS1; Contel, EPB1; Soares, AEE1.
Departamento de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo.
Departamento de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo.
[email protected]
Palavras-chave: Scaptotrigona, microssatélite, abelhas sem ferrão, agregação de ninhos, genética de população.
As abelhas indígenas são abelhas eusociais que estão abundantemente distribuídas nas regiões subtropicais e
tropicais do globo e constituem um dos mais diversos e importantes grupos de insetos. Estas abelhas desempenham
um importante papel ecológico, especialmente como polinizadoras das plantas que compõem as florestas
brasileiras. O gênero Scaptotrigona é um dos que possui indivíduos mais robustos dentre as abelhas indígenas,
produz um mel de boa qualidade e em quantidade significativa para a comercialização. Os ninhos de Scaptotrigona
são encontrados em cavidades de troncos de grandes árvores, por isso a necessidade de preservar a vegetação nativa
e áreas verdes em regiões urbanizadas. No campus da USP em Ribeirão Preto, as espécies de Scaptotrigona fazem
agregações de ninhos em troncos de árvores, principalmente em abacateiros (Persea americana) e sibipirunas
(Caesalpinia peltophoroides). No entanto, ainda não é possível entender como está estruturada a divisão destes
ninhos no espaço de um tronco, ou seja, se dois tubos de entrada próximos em um tronco significa que é de um só
ninho ou se são dois ninhos diferentes formados a partir da mesma colônia mãe ou se têm origem independentes.
Para o estudo da dinâmica dessas agregações estão sendo usados marcadores microssatélites por apresentar alta
confiabilidade nas informações geradas e por serem de fácil aplicação. Foram utilizados cinco locos microssatélites:
T4171, T840, Tc3302, T332, T75, heterólogos, altamente variáveis, em 24 ninhos de 5 agregações de Scaptotrigona
spp. Como resultado, até o momento, dois locos, T4171 e Tc3302, foram amplificados, padronizados e mostraram
polimorfismo confirmando a eficiência destes marcadores para este estudo. Para o loco T4171 foram encontrados
cinco alelos e para Tc3302 três alelos. Os demais locos estão sendo padronizados e análises estatísticas revelarão a
dinâmica das agregações de ninhos de Scaptotrigona spp.
Apoio financeiro: CAPES/CNPq/FAEPA/FAPESP
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Análise do cromossomo B em Partamona helleri
(Friese, 1900) (Hymenoptera-Apidae) utilizando
microdissecção e pintura cromossômica
Martins, CCC1; Duarte, OMP1; Sobrinho, PE2; Diniz, D2; Foresti, F2; Campos, LAO3; Costa, MA1.
Depto de Ciências Biológicas- Universidade Estadual de Santa Cruz,
Depto de Ciências-Biológicas- Universidade Estadual Paulista, 3Depto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Viçosa.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Abelha, Diversidade, Cromossomo supranumerário, DOP-PCR, Microdissecção cromossômica.
A espécie Partamona helleri apresenta, além do número cromossômico regular de 2n=34, um número variável de
um a sete cromossomos B. Os tipos e o número de cromossomos B variam ao longo da distribuição da espécie,
constatando-se uma maior diversidade no estado da Bahia. Nas populações do Sudeste do Brasil foram encontrados
somente diminutos cromossomos B classificados como B1, submetacêntrico e B2, acrocêntrico. Este trabalho teve
como objetivo desenvolver a microdissecção e a pintura cromossômica visando investigar a origem citológica do
cromossomo B2. Amostras de Partamona helleri foram coletadas de um ninho no apiário da Universidade Federal de
Viçosa, MG. As preparações citológicas foram obtidas a partir do gânglio cerebral de larvas no último instar larval,
em lâminas e lamínulas e posteriormente coradas com Giemsa a 5%. O material microdissectado foi transferido
para um tubo contendo o mix para DOP-PCR. Após a amplificação inicial dos produtos microdissectados,
a segunda PCR foi realizada. Finalmente, uma terceira reação de PCR foi conduzida com objetivo de marcar o
produto microdissectado a ser utilizado como sonda na FISH (Fluorescent In situ Hybridization). Os produtos de
PCR foram submetidos a uma eletroforese em gel de agarose 1% onde foram verificados fragmentos com cerca de
300 a 600 pb. Em seguida procedeu-se a hibridização in situ (FISH) sobre as lâminas utilizando-se este DNA como
sonda. A sonda hibridizada marcou apenas com o cromossomo B2 nas metáfases, não sendo constatado nenhuma
hibridização nos cromossomos do complemento regular. A falta de homologia das seqüências do cromossomo B
microdissectado com os cromossomos do complemento A pode estar relacionado com uma origem independente
do restante do genoma regular ou a uma perda dessa região de homologia no processo de evolução do cariótipo.
Estudos posteriores estão sendo desenvolvidos com ampliação da amostragem ao longo da distribuição da espécie.
Apoio: UESC e CAPES
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Número de cópulas e paternidade em Plebeia remota
Vaquero, AR¹; Arias, MC¹
¹Laboratório de Genética e Evolução de Abelhas - Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo
[email protected]
Palavras-chave: conservação ecológica, Meliponini, microssatélite, amostras temporais e dois ninhos
As abelhas sem ferrão apresentam larga distribuição, grande diversidade, contribuição muito significante como
agentes polinizadores além de possuir um valor econômico e médico. Apesar de sua importância biológica e
econômica, aspectos básicos sobre sua biologia e evolução ainda não estão elucidados. A múltipla cópula em
Himenóptera é relativamente comum, entretanto em Meliponini (abelhas sem ferrão) apenas alguns estudos
sobre esse assunto foram publicados. A fim de aumentar nosso entendimento sobre esse comportamento a
espécie Plebeia remota foi escolhida como modelo experimental. Esta espécie possui um pequeno tamanho
corporal e um pequeno número de indivíduos por ninho. Foi postulado na literatura que as rainhas de P. remota
copulam apenas uma vez, entretanto todos estes estudos são baseados em apenas uma amostra temporal e em
um ninho. O conhecimento do número de cópulas das rainhas e o grau de relação entre operárias permitem
inferências na evolução social e nos conflitos entre rainhas e operárias na produção de machos. Para realizar
este trabalho, operárias e machos de duas colônias foram coletados a cada mês durante um ano, totalizando
118 (cento e dezoito) indivíduos. O DNA total foi extraído e usado para amplificação de lócus de microssatélite
através de PCR. Quatro lócus foram selecionados através do uso de primers heterozigotos derivados de Melipona
bicolor (Mbi33, Mbi215, Mbi259 e Mbi278). Os lócus Mbi215, Mbi259 e Mbi278 apresentaram dois alelos cada.
Pela análise dos machos podemos inferir os genótipos das rainhas, as quais eram heterozigotas para os três lócus.
A maioria das operárias era também heterozigota, entretanto em amostras de épocas diferentes encontramos
operárias homozigotas para ambos alelos. Desse modo, os dados indicaram que as rainhas provavelmente foram
copuladas por pelo menos dois machos.
Apoio Financeiro: FAPESP
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Caracterização de locos microssatélite
de Scaura latitarsis (Hymenoptera, Apidae, Meliponini)
Domingues-Yamada, AMT1; Mateus, S2, Arias, MC1
Instituto de Biociências, Departamento de Genética e Biologia Evolutiva, Universidade de São Paulo;
Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Microssatélite, biblioteca genômica, polimorfismo, Meliponini e Scaura
As espécies do gênero Scaura caracterizam-se por apresentar o basitarso das pernas posteriores entumescido e
um pouco mais largo que a tíbia. Scaura latitarsis, uma das espécies do gênero, é conhecida popularmente como
‘pegoncito’, ‘sharabata’ ou ‘txashku-mexupa’. Tendo em vista que S. atlantica foi descrita recentemente, cerca de
cinco anos atrás, e que pertencia ao grupo latitarsis, acredita-se que esse grupo compreenda um número maior
de espécies, e, portanto, pode ser considerado como um ‘complexo de espécies’. Embora tenha sido estudado sob
diversos aspectos de sua biologia, são raros os dados genéticos para este gênero. Dentre os diversos marcadores
genéticos existentes, os microssatélites vêm sendo apontados como a classe de marcadores mais informativa em
estimativas de parâmetros genético-populacional. Vários marcadores microssatélites foram desenvolvidos para
insetos, o que tem permitido a realização de estudos de estrutura de populações e diversidade genética. Sendo
assim, o objetivo do presente trabalho foi isolar e caracterizar locos microssatélites para a espécie S. latitarsis.
Uma biblioteca genômica enriquecida para microssatélites foi construída. No total 48 clones foram seqüenciados
e primers para 15 locos foram desenhados. Doze colônias de 7 localidades diferentes foram analisadas. Dos 15
locos analisados, 8 foram amplificados com sucesso, e destes 7 tiveram nível de polimorfismo satisfatório. O
número de alelos variou de 4 a 14, com uma média de 8.71 alelos/loco. Os valores de heterozigose observada (Ho)
variaram de 0.0 a 0.417, enquanto que da heterozigose esperada (He) variou de 0.725 a 0.972. Cabe ressaltar que
de todos os locos analisados, nenhum estava em Equilíbrio de Hardy-Weinberg e em desequilíbrio de ligação. Os
primers de microssatélites foram testados também em 7 espécies: S. atlantica, S. longula, S. tenuis, Schwarzula
timida, Schwarziana quadripunctata, Plebeia droryana e Plebeia remota. Os resultados das análises sugerem que a
variabilidade dos locos microssatélites isolados de S. latitarsis será muito útil em estudos populacionais para esta
espécie e para outros Meliponini.
Apoio Financeiro: CNPq e FAPESP
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320
Estrutura genética de Euglossa carolina
(Hymenoptera, Apidae) de dois fragmentos urbanos
do norte do Paraná
Andrade, LN1; Suzuki, KM1; Sofia, SH1
Departamento de Biologia Geral - Universidade Estadual de Londrina
[email protected]
1
Palavras-chave: Euglossini; Euglossa carolina; Área urbana; microssatélites
Euglossa carolina Nemésio, 2009 é uma espécie de abelha da tribo Euglossini que mostra ampla distribuição em
território brasileiro, sendo comumente encontrada em ambientes degradados ou urbanos. Até o momento, pouco
se conhece sobre a estrutura genética de populações desta e de outras espécies de Euglossini em áreas urbanas.
Estudos sobre a estrutura e variabilidade genética de populações são de grande importância, pois podem fornecer
informações para futuros programas de manejo e conservação de espécies e ecossistemas ameaçados. No presente
trabalho marcadores moleculares microssatélites foram empregados na análise da diversidade genética de amostras
de populações de E. carolina de dois fragmentos de mata, de tamanhos diferentes, distantes cerca de 5 km entre
si, localizados na cidade de Londrina, PR, são eles: Parque Municipal Arthur Thomas (AT), com 66 ha e fragmento
Água Fresca (AF) de 18,5 ha. Machos de abelhas desta espécie foram coletados com rede entomológica durante
visita à iscas-odores. O mesmo esforço de coleta (24 horas) foi empregado para amostrar as abelhas em ambas as
áreas. Foram analisados 48 machos de E. carolina, 24 de cada fragmento. O DNA total foi extraído da cabeça, tórax
e pernas e quantificado em fluorímetro. Para as análises, nove locos de microssatélites foram amplificados com
primers desenvolvidos, por outros autores, especificamente para esta espécie de abelha. Nas amplificações foram
utilizados 10 ng de DNA em um volume final de 15 mL de reação. Para a análise dos dados obtidos foi utilizado
o programa computacional ARLEQUIN 3.1. Os nove locos amplificados (Egc17, Egc 18, Egc 24, Egc 26, Egc 30a,
Egc 30b, Egc 35, Egc 37 e Egc 51) se mostraram polimórficos, com um número de alelos variando de 9 a 18 entre
os diferentes locos. Em ambas as amostras analisadas, o alelo 205-pb-Egc 24 foi o mais frequente: 83,3% (AF) e
50% (AT). De um total de 122 alelos identificados, 64 foram alelos exclusivos; destes, 28 alelos ocorreram apenas
em AF e 36 apenas em AT. A Análise de Variância Molecular (AMOVA) revelou uma variação genética de 97,1%
dentro das amostras e de 2,99% entre as duas amostras, com um valor de FST =0,029, estatisticamente diferente
de zero (p<0,05). Estes resultados indicam uma baixa diferenciação genética entre os dois grupos de abelhas, e a
ocorrência de uma única população de E. carolina para ambas as áreas. Apesar de estar ocupando áreas urbanas,
a população estudada desta espécie está sendo capaz de manter valores elevados de variação genética. Devido à
elevada diversidade alélica encontrada para os vários locos e sendo os machos de abelhas haplóides, recomendase que para estudos populacionais envolvendo marcadores microssatélites, um maior número de machos seja
utilizado em estudos futuros.
Apoio Financeiro: Fundação O Boticário de Proteção a Natureza (FBPN), Klabin S.A. e CAPES.
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Resumos do 55º Congresso Brasileiro de Genética • 30 de agosto a 02 de setembro de 2009
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321
Polimorfismos cromossômicos em populações
da espécie de abelha sem-ferrão Scaptotrigona
Xanthotricha
Duarte1, OMP; Martins1, CCC; Waldschmidt2, AM; Costa1, MA.
Depto de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Santa Cruz;
Depto de Ciências Biológicas, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia;
[email protected].
1
2
Palavras-chave: Cromossomos; fluorocromos; Ag-NOR; abelha sem-ferrão; Scaptotrigona.
A espécie de meliponíneo Scaptotrigona xanthotricha, apresenta distribuição geográfica ampla, se estendendo do
estado do Paraná à Bahia. Uma população do sudeste e duas do nordeste do país foram analisadas e apresentaram
polimorfismos cromossômicos diferenciados entre as regiões geográficas amostradas. Os cromossomos metafásicos
foram obtidos a partir do gânglio cerebral de pré-pupas, macerados sobre lâmina utilizando três fixadores a base
de etanol e ácido acético. Em seguida, foram aplicadas diferentes técnicas citogenéticas como o bandeamento
C, a coloração com fluorocromos e bandeamento NOR. Foram amostradas duas colônias de Valença e Camacan
no estado da Bahia e uma de Viçosa em Minas Gerais. O número cromossômico encontrado 2n=34 mostrou-se
conservado entre as populações analisadas, entretanto foram observadas variações nos padrões morfológicos,
de distribuição de heterocromatina, no número e na posição da região organizadora de nucléolo e no padrão de
coloração por fluorocromos base-específicos. Além disso foi detectada a ocorrência de NORs múltiplas, o que
constitui um dado inédito dentro do grupo das abelhas. A presença de pares heteromórficos juntamente com as
variações cariotípicas observadas sugerem que essa espécie provavelmente está em processo de diferenciação
cromossômica intra-específica. Tal processo, pode estar sendo acentuado em virtude da recente fragmentação do
bioma Mata Atlântica, hábitat natural dessa espécie.
Apoio Financeiro: FAPESB; CAPES
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Análise citogenética comparativa de quatro espécies
do gênero Odontomachus (Hymenoptera: Formicidae)
Santos1, IS; Costa1, MA; Mariano2, CSF; Delabie2, JHC; Silva1, JG
Laboratório de Citogenética e Marcadores Moleculares; Departamento de Ciências Biológicas. Universidade Estadual de Santa Cruz UESC, Rodovia Ilhéus/Itabuna, km 16.
2
Laboratório de Mirmecologia. Centro de Pesquisa do Cacau (CEPEC). - Convênio UESC-CEPEC. CEPLAC. Rodovia Ilhéus/Itabuna, km 22.
[email protected]
1
Palavras-chave: Ponerinae, cariótipo, evolução cariotípica, Hymenoptera.
O gênero Odontomachus pertence à tribo Ponerini e possui 23 espécies descritas na região Neotropical, com
distribuição do sul dos Estados Unidos até o norte da Argentina. No Brasil, são conhecidas aproximadamente
12 espécies de Odontomachus, das quais pelo menos sete estão presentes no Corredor central da Mata Atlântica.
Este gênero é representado por formigas relativamente grandes (em média 8 mm de comprimento) que podem
ser facilmente observadas na serrapilheira ou em árvores. Apresentam mandíbulas alongadas, com um ângulo de
abertura de até 180°, cujo rápido fechamento produz um estalido característico. Alguns grupos são considerados mais
basais (grupo hastatus) e outros derivados (grupo haematodus). Algumas espécies também podem apresentar tanto
características consideradas ancestrais como derivadas. Uma análise filogenética molecular mostrou, entretanto
que a espécie Odontomachus chelifer, inserida no grupo haematodus, é mais basal. O objetivo desse trabalho foi
comparar os cariótipos de O. chelifer com duas espécies do grupo haematodus (Odontomachus haematodus e
Odontomachus bauri) e uma espécie do grupo hastatus (Odontomachus hastatus). As metáfases mitóticas foram
obtidas a partir do gânglio cerebral de pré-pupas e as lâminas coradas com Giemsa e coloração seqüencial com
fluorocromos base específicos CMA3 e DAPI. Foi observado que essas espécies apresentam cariótipo conservado,
com 2n = 44 cromossomos. As fórmulas cariotípicas determinadas foram: O. chelifer (2K= 4SM + 40 T), O. bauri (2K=
6SM + 6ST + 32T), O. haematodus (2K= 10SM + 6ST + 28T) e O. hastatus (2K= 4SM + 2ST + 38T). A marcação CMA3
está localizada em um par cromossômico de morfologia telocêntrica em todas as espécies. A as espécies O. chelifer
e O. bauri apresentaram marcação CMA3 positiva no par nº11, O. hastatus apresentou marcação no par n° 10, e O.
haematodus apresentou marcação CMA3+ no par cromossomo n° 12. O cariótipo de O. chelifer é mais diferenciado
em relações às demais espécies, devido à ausência de cromossomos subtelocêntricos. O. hastadus, apresentou
um cariótipo intermediário, com uma menor quantidade de cromossomos submetacêntricos e subtelocêntricos.
O. haematodus e O. bauri, consideradas filogeneticamente próximas, apresentaram cariótipos mais semelhantes
em relação às demais espécies. O padrão de marcação CMA3 positiva observado indica uma provável homologia
cromossômica entre as espécies para este par. O modelo de evolução cariotípica desse gênero parece ser
congruente com a filogenia molecular, observando-se uma tendência de aumento no número de cromossomos
submetacêntricos e subtelocêntricos em espécies mais derivadas. A inclusão de novos táxons poderá dar maior
consistência a esses dados e permitirá testar se os padrões evolutivos observados nessas espécies estendem- se a
outras espécies do gênero.
Apoio: CAPES, CNPq, CEPEC/CEPLAC, FAPESB.
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Filogenia molecular das espécies de abelhas do gênero
Bombus (Hymenoptera, Apidae) presentes no Brasil:
análise de seqüências de DNA mitocondrial
e ordem gênica
Françoso, E ; Arias, M.C.
Laboratório de Genética e Evolução de Abelhas – Instituto de Biociências – USP
[email protected]
Palavras-chave: Filogenia molecular, Bombus, DNA mitocondrial, tRNAlys.
No Brasil, encontramos apenas seis espécies do gênero Bombus: Bombus morio, B. atratus, B. brasiliensis, B.
transversalis, B. brevivillus e B. bellicosus, um número muito baixo em comparação com os países do Hemisfério
Norte e com uma sistemática dificultada pela extrema variabilidade e paralelismo na coloração, que foi
inicialmente o caráter mais utilizado para separá-las. Os dados moleculares, principalmente utilizando DNA
mitocondrial parecem ser os mais promissores para tentar esclarecer as relações no gênero. Assim, os objetivos
deste trabalho são fazer uma filogenia molecular a partir de genes mitocondriais das espécies brasileiras, comparar
com os eventos paleoclimáticos e geológicos do passado e, a partir disso, levantar hipóteses alternativas sobre a
evolução e a especiação dentro do gênero, empregando o método de sequenciamento parcial dos seguintes genes
mitocondriais: subunidade maior do RNA ribossônico (16S), citocromo b (CytB) e citocromo c oxidase I (COI). Além
disso, sequenciar no cluster 4 o tRNAlys, que apresenta fortes evidências de constituir um pseudogene, e verificar
se ele é comum `as espécies brasileiras e se poderia servir como um marcador para o estudo da evolução dessa
tribo. Para tal análise, o DNA mitocondrial foi extraído a partir de tórax preservado em etanol ou perna seca de
espécimes de museus. Os fragmentos de DNA mitocondrial foram amplificados, clonados em vetor e seqüenciados
para a reconstrução das filogenias e busca de RNA`s transportadores. Como resultado, percebe-se que existe um
alto grau de correlação entre as espécies de Bombus do Brasil e suas áreas de distribuição. Uma hipótese que
explicaria a baixa riqueza de espécies no Brasil estaria relacionada ao hábito das abelhas. Em climas tropicais,
elas apresentam maior tempo de vôo, com maior distância percorrida e aumento do fluxo gênico, dificultando o
isolamento reprodutivo entre populações.
Apoio Financeiro: CNPq
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Uso de marcadores microssatélites no estudo das
relações de parentesco entre indivíduos de um ninho de
Euglossa melanotricha (Hymenoptera, Apidae, Euglossini)
Freiria, GA1; Augusto, SC2; Alves, AN1; Sofia, SH1
Departamento de Biologia Geral - Universidade Estadual de Londrina.
Instituto de Biologia - Universidade Federal de Uberlândia.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: Euglossini, marcadores microssatélites, Euglossa melanotricha, organização social e estrutura sociogenética
Em ninhos de algumas espécies de Euglossa ocorre divisão de trabalho, com a presença de fêmeas poedeiras ou
dominantes (FP ou FD) e fêmeas forrageadoras/poedeiras ou subordinadas (FFP). Enquanto as FFP/FS realizam
atividades de construção, aprovisionamento e oviposição de células, as FP/FD permanecem a maior parte do
tempo no ninho, realizam oofagia nas células ovipositadas pelas FFP/FS e, em seguida, a oviposição. Estudo sobre
o grau de parentesco entre indivíduos produzidos e as fêmeas associadas pode revelar se a FP/FD substitui todos
os ovos postos pelas FFP/FS ou se existe algum grau de compartilhamento na produção de descendentes por essas
fêmeas. Este trabalho investigou, por meio de marcadores microssatélites, as relações de parentesco genético entre
as fêmeas associadas e os indivíduos produzidos por essas fêmeas, durante um processo de reativação ocorrido em
um ninho de Euglossa melanotricha. Para as análises moleculares foram amplificados cinco locos de microssatélites
(Egc-17, Egc-26, Egc-30b, Egc-35 e Egc-37) e os alelos amplificados foram separados em gel de poliacrilamida 8%. O
peso molecular destes alelos variou de 98 pb (Egc-30b) a 228 pb (Egc-17). Foram analisados sete indivíduos: duas
fêmeas adultas que participaram da reativação, uma exibindo comportamento de fêmea poedeira (FP) e outra de
forrageadora e poedeira (FFP); e, cinco indivíduos produzidos por essas fêmeas: uma fêmea (F1) e quatro machos
(M2, M4, M9 e M10). A F1 e o M2 eram filhos da fêmea FFP, pois as células de onde estes indivíduos emergiram
foram ovipositadas em um período que esta fêmea estava sozinha no ninho; antes da emergência da suposta FP
que ocorreu no dia em que a célula de onde emergiu M4 foi ovipositada. Da mesma forma que M2, o macho
M4 compartilhou em dois locos (Egc-17; Egc-26) alelos exclusivos da fêmea FFP, sendo também filho dela. Os
outros dois machos (M9; M10) tiveram suas células construídas-aprovisionadas e ovipositadas pela fêmea FFP,
durante um período que a fêmea FP já estava presente no ninho. Nesse caso, o macho M10 apresentou para um
dos locos (Egc-17) um alelo exclusivo da fêmea FFP, indicando que ele era filho desta. Apesar de ter emergido de
uma célula ovipositada por FFP, o macho M9 apresentou para este mesmo loco (Egc-17) um alelo exclusivo da
fêmea FP, indicando ser esta sua mãe, confirmando que nessa célula houve oofagia por parte da FP. As fêmeas
FFP e FP compartilharam pelo menos um alelo para os cinco locos amplificados, sendo assim consideradas
irmãs. Os resultados obtidos confirmam o comportamento de FP para uma das fêmeas e que nem todos os ovos
botados pela FFP podem ser substituídos pela FP. Esse estudo reforça a importância de análises moleculares para
o entendimento das relações da estrutura sociogenética em estudos com abelhas Euglossini.
Apoio Financeiro: Fundação O Boticário de Proteção a Natureza (FBPN), Klabin S.A., CNPq e FAPEMIG.
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325
Distribuição tecido-específica de Esterases
de Abelhas Euglossinae (Hymenoptera: Apidae)
coletadas na Amazônia
Silva, IO1 e Del lama, MA2
Centro de Estudos Superiores de Tabatinga, Universidade do Estado do Amazonas.
Depto. de Genética e Evolução, Universidade Federal de São Carlos.
[email protected]
1
2
Euglossinae forma um grupo homogêneo e distinto dentro de Apidae, este é um dos grupos de abelhas
neotropicais mais estudados, utilizado como modelo biológico em trabalhos relacionados à fisiologia, coevolução
planta-polinizador, dinâmica de populações, mimetismo e muitos outros aspectos ecoetológicos (Roubik 1989).
Análise de aloenzimas é uma importante fonte de informação para a caracterização de populações de abelhas.
Esterases são um dos mais extensivamente sistemas isozímicos estudados, ocorrendo em numerosas isoformas
expressadas por distintos locus que costumam apresentar um alto grau de variabilidade genética. Distribuição
tecidual e temporal, diferenças na expressão de esterases, assim como a variabilidade aloenzimática, têm sido
estudadas em Apis mellifera, meliponas e trigonas brasileiras (Contel e Mestriner, 1974; Bitondi e Mestriner, 1983;
Ruvolo-Takasusuki et al, 1997; Ruvolo-Takasusuki et al, 1998; Ruvolo-Takasusuki et al 2006). Em dez anos de estudo,
padronização, análise e observação do comportamento das aloenzimas em Euglossinae do Brasil, nosso grupo de
pesquisa já analisou cerca de 24 sistemas enzimáticos em 25 espécies euglossíneas coletadas no Brasil. Esterase
mostrou-se a enzima de presença mais constante, polimórfica e informativa dentre os sistemas investigados. Esse
trabalho visa expor os resultados encontrados no estudo esterásico de Euglossinae coletadas na Amazônia Central.
As esterases foram designadas numericamente de acordo com sua mobilidade anódica, a de maior mobilidade
foi denominada Esterase-1 e as demais de acordo com a mobilidade decrescente. Neste trabalho, as esterases
apresentaram variantes eletroforéticas em 90% das espécies estudadas. Das dez espécies analisadas, apenas
Euglossa spp não apresentou variantes eletroforéticas para esta enzima. No entanto, em espécies como Euglossa
chalybeata, Eufriesea pulchra, Exaerete smaragdina e Eulaema mocsaryi, representou 100% dos locos polimórficos.
Foi possível observar distribuição tecidual diferenciada destas enzimas, especialmente nas espécies de Eulaema
analisadas (E. nigrita, E. Cingulata, E. meriana, E. Bombiformis e E. mocsaryi), com a detecção de esterase tecidoespecífica nos extratos de antena (Est-2) em todas as espécies analisadas. Em nosso estudo, Est-2 de Eulaema nigrita,
apresentou heterozigosidade intraloco (Hi) estimada em 0.82, com dez alelos. Nas demais espécies, a Hi desta
esterase também foi elevada, com um grande número de fenótipos: sete alelos em Eulaema bombiformis (Hi=0,82),
sete em Eulaema mocsaryi (Hi=0,78), cinco em Eulaema meriana (Hi=0,74) e três em Eulaema cingulata (Hi=0,58).
Entretanto, nos demais gêneros estudados nenhuma das espécies analisadas apresentou esta característica, o que
nos leva a acreditar que este traço, dentro de Euglossini seja pertinente apenas a este gênero. Esterase específica de
extratos de cabeça foi observado em Eulaema bombiformis (Est-3), Exaerete frontalis (Est-1) e Exaerete smaragdina
(Est-1), sem variantes. Enquanto Eulaema nigrita apresentou Est-4 como esterase específica de abdome, com três
variantes e Hi estimada em 0,43, Eulaema meriana apresentou Est-2 como específica deste tecido, sem variantes.
No gênero Euglossa, E. chalybeata apresentou 04 regiões de atividade, mas nenhuma se mostrou esterase-específica
e apenas Est-4 (Hi=0,04) apresentou-se polimórfica.
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Filogenia molecular de Atta sexdens
(Myrmicinae: Attini) baseada em genes mitocondriais
Martins Jr, J1; Solomon, SE2; Mueller, UG3; Bacci Jr, M1
Laboratório de Evolução Molecular, Centro de Estudos de Insetos Sociais, Instituto de Biociências, UNESP – Campus Rio Claro, Brasil
NSF International Research Fellow, Department of Entomology, Smithsonian Institution, Washington, DC, USA.
3
Section of Integrative Biology, Patterson Laboratories, University of Texas, Austin, USA.
*[email protected]
1
2
Palavras-chave: Atta sexdens, DNA mitocondrial, Filogenia, Sistemática, Seqüenciamento,
Atta sexdens é uma formiga cortadeira amplamente distribuída na América do Sul. Devido ao seu hábito de cortar
folhas, é considerada praga em várias culturas agrícolas, como citrus e cana-de-açúcar. Existem dúvidas se esta
formiga se trata de uma única espécie ou um complexo de espécies. Visando contribuir para a sistemática de Atta
sexdens, nós procedemos à análise filogenética molecular de indivíduos de 100 ninhos coletados ao longo das áreas
de ocorrência na América do Sul. Foram identificados 32 haplótipos mitocondriais a partir de seqüencias dos loci
adjacentes Citocromo Oxidase I, Espaçador Intergênico, RNA transportador de Leucina e Citocromo Oxidase II.
Análises através de métodos envolvendo Máxima Parcimônia, probabilidades a posteriori (análise Bayesiana) e de
Máxima Verossimilhança geraram quatro árvores filogenéticas cujo consenso indicou duas linhagens principais
de Atta sexdens: uma (bootstrap = 91; índice de Bremer= 5; probabilidade a posteriori = 0,88; bootstrap de Máxima
verossimilhança = 90) denominada Linhagem Norte, composta por três haplótipos presentes em 16 indivíduos do
Norte (Brasil e Venezuela) ou Oeste (Peru) da América do Sul; e a segunda (bootstrap = 82; índice de Bremer= 3;
probabilidade a posteriori = 0,86; bootstrap de Máxima verossimilhança = 0.90) representada por 29 haplótipos de
outros 80 indivíduos. Esta segunda linhagem apresenta-se dividida em duas outras: a Linhagem Sul (bootstrap =
94; índice de Bremer= 3; probabilidade a posteriori = 1,00; bootstrap de Máxima verossimilhança = 0,89), com seis
indivíduos (28 haplótipos) vivendo desde o Norte do Paraná até o sul do Rio Grande do Sul; e a Linhagem Central
(bootstrap = 73; índice de Bremer= 2; probabilidade a posteriori = 0,85; bootstrap de Máxima verossimilhança =
0.81), representada por 52 indivíduos (23 haplótipos) distribuídos nas regiões Nordeste, Sudeste, Centro Oeste e
Norte. A existência de três clados estruturadas geograficamente é compatível com a divisão de Atta sexdens em
três subespécies, mas com profundas alterações na distribuição geográfica dos seus componentes, notadamente
com a expansão da região geográfica ocupada pela Linhagem Central. A maior antiguidade da Linhagem Norte é
compatível com a proposta de Weber com relação à origem Amazônica destas formigas.
Financiamento: CAPES, FAPESP
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Desenvolvimento de Pipeline para análise
de sequências ESTs de formigas Attini
Ferro, M1; Batista, CC2; Fedel, F2; Kamimura, E2; Nascimento-Júnior, OS2; Scafi, R2; Rodovalho, CM1;
Bacci, M1; Guilherme, IR2
Laboratório de Evolução Molecular, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP/Rio Claro.
Grupo de Inteligência Artificial (GIA), Departamento de Estatística, Matemática Aplicada e Computacional, Universidade Estadual Paulista
“Júlio de Mesquita Filho” – UNESP/Rio Claro.
[email protected]
1
2
Palavras-chave: ESTs, formiga Attini, pipeline, pré-processamento, anotação
As formigas cortadeiras Atta laevigata (Hymenoptera: Attini) apresentam-se em várias castas com intenso
polimorfismo, são destacadas pragas agrícolas e invertebrados modelos para estudos de especiação e co-evolução
com microrganismos. As análises genéticas nestas formigas são fundamentais para caracterizar espécies crípticas,
castas ou evidenciar alvos moleculares para seu o controle como pragas agrícolas. Tais análises genéticas
envolvem a caracterização de ESTs, o que demanda a integração de diversos programas em um pipeline para o préprocessamento (limpeza de sequências de vetores, possíveis contaminantes, trimming e montagem de seqüências
com base em alinhamentos múltiplos) e anotação (comparação com homólogos armazenados em bancos de
dados) das sequências nucleotídicas. No presente trabalho, nós descrevemos a primeira fase da organização de um
pipeline dedicado a ESTs de formigas Attini. Para tanto, foram utilizados os programas Phred e EGene, para préprocessamento, o programa Annot8r, para a anotação. Esses programas foram integrados utilizando a linguagem
de programação Perl e disponibilizados no sistema operacional Linux. As informações geradas pelo Annot8r
(que realiza pesquisa através do aplicativo BLAST) foram armazenadas em um banco de dados (PostGree) do
próprio programa e recuperadas por um script, que gerou uma saída tabular denominada Gene Association. Esta
saída alimentou o programa map2slim.pl, que quantificou e apresentou os resultados de termos de Ontologia
Gênica (GO), classificando as sequências com base no seu envolvimento com processos biológicos, componentes
celulares e funções moleculares. O pipeline desenvolvido foi validado utilizando-se cerca de 300 sequências de EST
da formiga Atta laevigata e resultou uma interface gráfica amigável para executar a limpeza, montagem e anotação
de agrupamentos de EST.
Apoio financeiro: FAPESP, CAPES, CNPq
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Análise automatizada da expressão gênica de Atta
laevigata (Formicidae: Attini) utilizando-se pipeline
de pré-processamento e anotação de sequências
Rodovalho, CM1; Ferro, M1; Batista, CC2; Fedel, F2; Kamimura, E2; Nascimento-Júnior, OS2; Scafi, R2;
Guilherme, IR2; Bacci, M1
Laboratório de Evolução Molecular, Centro de Estudos de Insetos Sociais, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” –
UNESP
2
Grupo de Inteligência Artificial, Departamento de Estatística, Matemática Aplicada e Computacional, Universidade Estadual Paulista
“Júlio de Mesquita Filho” – UNESP
[email protected], [email protected]
1
Palavras-chave: expressão gênica, Atta laevigata, pipeline, pré-processamento, anotação
As formigas Attini são conhecidas pelo hábito de cultivar fungos para sua alimentação. Dentre estas, Atta e
Acromyrmex cortam e utilizam principalmente folhas como substrato para o fungo simbionte, sendo, por isso,
conhecidas como formigas cortadeiras. Distribuem-se pelo Novo Mundo e são consideradas os maiores herbívoros
dos tróp